Un peu d'histoire:

• 1970: 1ère greffe de moelle osseuse (GMO)

pour 1 déficit immunitaire

• 1983: GMO non HLA identique (déplétion T)

• 1990: auto greffe de cellules souches

périphériques

• 1998: sélection de cellules CD34+

Maladies génétiques

Traitement par cellule souche patient-spécifique

Cellule souchedu nerf

Cellule souchedu nerf

Cellule souche

du sang

Cellule souche

du sang

NerfNerf

TransplantationTransplantationBiopsieBiopsie

NerfNerfCoeurCoeurMuscl

eMuscl

eSangSangIsoler et multiplier les

cellules souches pluripotentes

Isoler et multiplier les cellules souches

pluripotentes

Développer des blastocytes in vitro

Développer des blastocytes in vitro

« Reprogrammation »

« Reprogrammation »

Transfert dans le noyau

Transfert dans le noyau

Moelle osseuse

Sang

Lymphocytes

T

NK

B

Polynucléaires

Monocytes

Globules rougesPlaquettes

Cellule souche

Thérapie géniqueUn défi

complexe• Insérer le "bon gène" dans "les bonnes cellules" • Niveau d'expression ni trop faible ni trop fort• Obtenir une expression prolongée si nécessaire

(ou régulée…)• Eviter la toxicité

- mutagènèse insertionnelle- réaction inflammatoire dirigée contre le vecteur ou le produit du transgène

Thérapie génique des maladies héréditaires

du système hématopoïétique Points clé

• Identification du gène responsable

• Compréhension de la maladie : pourquoi cette mutation donne “ces signes cliniques”

• Durée de vie des cellules transduites

• Profil d’expression

• Une protéine mutée mais présente peut contrecarrer l’effet bénéfique du gène thérapeutique

Déficits immunitaires combinés sévères (DICS) : de bons modèles pour la thérapie

génique

• Maladies léthales dont le traitement n’est

que partiellement satisfaisant

• Bases génétiques connues

• Le produit génique confère un avantage

sélectif aux cellules des précurseurs

lymphoïdes transduites

• Grande capacité de prolifération des cellules

pro-T

• Les cellules T matures vivent longtemps ( >

années)

THYMUS

CLP

NK

CD8

B

Signaux c cytokine-dépendants cc, JAK-3, JAK-3, IL7Ra IL7Ra (53 %)

Recombinaison V(D)J Rag-1/-2, Artemis (30 %)

Prévention de l’apoptose cellulaireRéplication de l’ADN ADA ADA (11 %)

HSC

Compartiment myéloïde

SCID diseases

CD4

Signalisation Pre TCR/TCR CD45, CD3, (2 %)

Compatibilité donneur-receveur : probabilité cumulative de survie chez les

patients atteints de DICS après greffe de CSH

Registre Européen

. Rejet (cellules NK de l’hôte). Réaction du greffon contre l’hôte. Cellules T !

Survie sans événement (%)Survie sans événement (%)

Génotype identique n=89Génotype identique n=89

Apparentés, phénotype identique n=43Apparentés, phénotype identique n=43

Donneur non apparenté n=24Donneur non apparenté n=24

Quelle différence ?

Apparenté, HLA partiellement incompatible n=269Apparenté, HLA partiellement incompatible n=269

Temps après greffe de CSHTemps après greffe de CSH

MoisMois

Résultats à long terme

• Faible fonction des cellules T dans certains

cas

• Déclin à long des terme des fonctions des

cellules T

• Faible nombre de cellules NK

• Immunité des cellules B peu fréquente

Principe de la thérapie génique dans le DICS lié à l’X

Testé in vitro et in vivo(souris c KO)

.... ....

DICS T- B+

AR X-L

RIL2 /CD19

CD

3

CONTROLE PATIENT

CD19

DICS-X1. un défaut du récepteur c

le défaut en le défaut en cc

TTCD4CD4

NKNK

HSCHSC

BB

TTCD8CD8

CLPCLP

IL-15IL-15

IL-7IL-7

IL-2IL-2 IL-4IL-4 IL-7IL-7 IL-15IL-15 IL-21IL-21

cIL-2RIL-2R

IL-4R c c c cIL-7R IL-2RIL-15R

IL-9IL-9

cIL-9R IL-21R

Développement Développement de lymphocytes Tde lymphocytes T

Développement Développement de lymphocytes NKde lymphocytes NK

Absence de lymphocytes T et NK

Léthal en l’absence de traitement

La greffe de moelle allogénique guérit mais …

Absence de lymphocytes T et NK

Léthal en l’absence de traitement

La greffe de moelle allogénique guérit mais …

Probability of survival of SCID patients according to date of HSCT and to compatibility

2000: 73 %

< 2000: 61 %

Geno-id.: 83 %

URD: 66 %

Pheno-id.: 64 %

Haplo-id. : 50 %Haplo-id.: 50 %

Months

Su

rviv

al %

Months

Su

rviv

al %

What makes the difference ?

. Rejection (host NK cells)

. GVHD

. T cells !

Thérapie Génique du DICS-XI : Etudes précliniques

In vitro: Lymphocytes B c(-) - faisabilité - Etude de l’expression et de la fonction

Cellules CD34(+) c(-) - Etude de l’expression dans les progéniteurs et à long terme - Différenciation cellulaire NK, T In vivo : Souris c(-) - Toxicité, faisabilité - Avantage sélectif

Voie de signalisation c / JAK / STAT

IL-2

JAK3

JAK1

PP

PP

JAK3

JAK1P

P

STA

T5

STAT3

Dimérisation de STATDimérisation de STAT

NoyauP

P

Fixation de STATs sur des sites spécifiquesde l ’ADN

15

STA

T5

Etudes pré-cliniques

Cellules EBV-B des patients DICS-X1 c+ 0%

c+ 100%

J180

c+50%

J30

Avant transduction

Après transduction

IL-2IL-2

PP

JAK3

JAK1JAK1P

P

P

P

STAT3

0 IL2 0 IL2 0 IL2

Contrôle c- c+

WBA

Transduction de cellules Sca1+ Rag ou Artemis-/-

(Rétrovirus dérivé de MFG)

Moelle Osseuse

Sélection positivede Sca1+

SCF, Flt-3 L,Tpo, Il-6, Il-11, Il-7

(3 Cycles, 5j)

RAG2-/- C57BL/6

3 GyIrradiation

RAG2-/- C57Bl/6

Transplantation (106 cellules)

Surnageant rétroviral

MFG- c ou RAG ou Artémis

Pourcentage de SurviePourcentage de Survie

SemainesSemaines

Recherche Translationnelle

Secteur spécifique de la thérapie cellulaire, chargé de traduire une expérience réalisée à l’échelle de laboratoire dans une expérience à large échelle utilisable pour l’homme

2 4 6 8 10 12

1. Selection of reagents,

materials and devices

Mois

2. Test grandeur nature

3. Scale-up

4. Rédaction des

procédures de laboratoire

Calendrier de la phase translationnelle

Manipulation cellulaire de grade cliniqueDescription du processus : depuis le concept

jusqu’à la transplantation

1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

Follow upSuivi

Année

Infrastructures

Transplantation

Contrôle qualité

Formation de l'équipe

Points réglementaires

Autorisation par les

autorités réglementaires

Sécurité et Réglementation (1)

• Laboratoire accrédité pour la production du vecteur

• Absence de micro-organismes dans les cellules de production du vector et dans le surnageant

• Absence de virus compétent pour la réplication dans les lots cliniques ainsi que dans les échantillons des patients

• Le laboratoire doit être accrédité par les autorités compétentes et doit recevoir l’autorisation du Ministère

Autorisation obtenue pour le protocole par :

1) Administration de l’AP-HP

2) Agence française du médicament:

Sécurité et Réglementation (2)

AFSSAPSAFSSAPS

3) CCPAP

Comité d’Ingéniérie Génétique

Comité de Génétique et deBiologie Moléculaire

Comité Essais Cliniques

Enfant

Purification decellules précurseurs(CD34)

J1 « Activation 

» J2

Injection I.V.

Lavage des cellules

Infection par le rétrovirus

contenant le gène gc

J4

J3

Moelle osseuse

Essai Clinique de TG pour le DICS-XI (1er Janvier, 2012)

PatientSuivi

(années)

Expression

de c

T B

Etat cliniqueImmunité

1 10.6 +++ ++ ++ Vivant, va bien

2 10.4 +++ ++ + Vivant, va bien

3 .7 + - - Vivant, va bien (greffe de MO)

4 (4.9) +++ ++ ++ Décédé, "leucémie"

5 10.8 +++ ++ ++ Vivant, va bien ,"leucémie",chimio

6 9.8 +++ ++ + Vivant, va bien

7 9.6 +++ ++ + Vivant, va bien "leucémie",chimio

8 9.0 +++ ++ ++ Vivant, va bien

9 (3.1) ++ + - Décédé, infection (greffe de MO)

10 8.7 +++ ++ + Vivant, va bien,"leucémie",chimio

Moyenne du suivi = 11 ans, 8 patients vivants qui vont bien

Restoration of immune parameters

Correction of humoral function: normal serum Ig levels (except for 2 patients)

Full correction of T-cell immunodeficiency

months after gene therapy

P1100

1000

3000

5000

7000

00 10 20 30 40 50 60

P7

P9

P10

P4

P5P6.

*

**

70 80

9000

P8

90

*

*

P2

Phenotype, function, TCR repertoire diversity

Differentiation of functional NK cells but subsequent decrease = HSCT (Limited expansion capacity of NK cell precursors ?)

0

20

40

60

80

100

SC

ID d

isease-f

ree s

urv

ival (%

)

0 20 40 60 80 100 120

Time (months)

83.1%

Outcome of gene therapy trials in 20 patients with SCIDX1

(Paris-London data combined)

Transduction de progéniteurs multipotents (?)

CLP

HSC

CMP

T

NK

B

PMN

Monocyte

Sites d’intégrationpartagésProgeniteur

rs multipotents

- Nbre de copies de vecteur dans les cellules B < 0.1% 7 à 10 ans après TG- CD15+ négatives pour le transgène

- Nbre de copies de vecteur dans les cellules B < 0.1% 7 à 10 ans après TG- CD15+ négatives pour le transgène

Essai clinique TG SCID-X1: caractéristiques des 4 effets indésirables

graves (EIG)

P4 P5 P7 P10

Age au traitement (mois)

1 3 8 8

Survenue de l’EIG (mois)

30 34 68 33

Prolifération clonale T T

matures T matures

T Immatures

Thymocyte cortical

Oncogène LMO2 LMO2 CCND2 LMO-2, BMI-1

2ème modifications génétiques

t6:13SIL-TAL

notch mut, p16 del.

p16 del.notch mut,

p16 del.

Sensibilité au traitement - + + +

Un effet indésirable sévère chez 4 patients à Paris et chez 1 patient en

Angleterre• Prolifération monoclonale des lymphocytes T

provoquée par l'insertion du rétrovirus dans un oncogène

• Facteurs associés : infection virale, réponse immune, susceptibilité génétique…

• Quelle attitude adopter ?suspension de l'essai,analyse du risque confrontée au

bénéfice,changement du vecteurretour à la recherche fondamentale

autour du virus etautour de la maladie

Structure du gène LMO-2 et intégration du provirus

M. ery

thro

leukem

iaLMO-2 RNA Transcript

(Northern blot analysis)

LMO-2 Protein expression

(Western blot analysis)

LMO

-1

leukem

iaH

. ery

thro

leukem

ia

P4

T

CH

O

CH

O/L

MO

-2LM

O-1

le

ukem

iaM

-ery

thro

leuke

mi

a

TP4

LMO-2LMO-2 LMO-2LMO-2

11 22 33 44 55 66

11 22 33 44 55 66

MFG MFG cc

LMO-2 mRNA2. 3 kb

MFG MFG cc

P5 P4

Enhancer activity

MFG MFG cc

P10

Comment améliorer la Sécurité ?

• Sélection des patients ??

• Utilisation d’un LTR self-inactivé (SIN)

MoLV U5U5 Y

RSD SA

RQ

IL2RG

U5U5 Y

R RQ

MP ΔSD

PREProm. IL2RG

EF1(S)

RSV

Vecteur rétroviral LTR-dirigé: MFG c

Nouveaux vecteurs retroviraux SIN: Sin11 / SRS11

MoLV

Le promoteur EF1 est moins mutagénique

P<0.001

détection limite

SF EFS SF.HS4Etude de clonogenicité in vitro (C. Baum’s lab.)

Comment améliorer l’efficacité ?

•Pas indispensable pour le DICSIndispensable pour les maladies dans lesquelles le transgène ne fournit pas d’avantage sélectif

•Vecteurs lentiviraux : du taux de transduction des cellules souches: important pour les protocoles de TG pour ALD et -thalassémie

• Compétition avec les cellules non transduites

cytoréduction (+/- sélection) access to stem cell niches (anti c-kit

ab…)