UNE NOUVELLE MI THODE D'ETUDE DE LA SENSIBILISATION ANAPHYLACTIQUE

p

EXPERIMENTALE : LES ROSETTES DE MASTOCYTES

D. WALLACH et M.-L. RENOUX (*)

. . . . . . . . . . . RI~SUMI~

Les m ~ t h o d e s c lass iques d ' ~ t u d e de l ' a n a p h y l a x i e me- s n r e n t soit les IgE s~r iques , soil la d ~ g r a n u l a t i o n i m m u - n o l o g i q u e des basophi les , ou des mas tocy t c s t i ssu la i res . Les a u t e u r s p r o p o s e n t d e d~celer la f i xa t i on des ant i - corps a n a p h y l a c t i q u e s su r les m a s t o e y t e s de r a t p a r u n e t e c h n i q u e d e rose t tes u t i l i san t des h~ma t i c s de m o u t o n t ann~es et r ecouver t e s de Fan t ig~ne . Ce test p e r m e t de m e t t r e en ~vidence des r~cep teur s sp~eif i- ques de l ' a n t i g ~ n e chez 75 p. cen t des a n i m a u x i m m u - nis~s. La c in~ t ique des mas toey t e s f o r m a n t u n e rose t te lors d ' u n e i m m u n i s a t i o n p r i m a i r e sugg~re q u e des r~- eep teu r s s o n t des IgE . L e t i t re en IgE c i rcu lan tes , me- sur~ p a r anaph .y lax ie cu t an~e passive, n ' e s t p a s t o u j o u r s e n co r r e l a t i on avec l a f o r m a t i o n des rose t les mas toey - ta i res . La r e c h e r c h e des rose t tes mas tocy t a i r e s s e m b l e p l u s sens ib le q n e le d o s a g e d e s r~agines e l reu]an tes p o u r m e s u r e r la r~ponse i m m u n e a n a p h y l a c t l q u e .

SUMMARY

Mast cell rosettes in exper imental anaphylaxis. ~ Usual techniques for anaphylaxis study are based on serum IgE assay or specific degranulation .oE basophils o r tissue mast cells. The present work reports on a new test detecting mast cell bound anaphylaetic antibodies in rat by means of a rosette technique using antigen coated tanned sheep erythrocytes. This test demonstrates antigen specific receptors on the mast cells from 75 p e r cent of immunized experimental animals. The time course o f the phenomenon during primary immunization suggests that these receptors belong to IgE immunoglobulins. However, the serum IgE titers, as assayed by ]?CA, are not always correlated w i t h t h e formation of mast cell rosettes. Thus, the presence of rosette-forming mast cells seems to be a more sensitive sign of anaphylaetie type immune response than the appearance of circulating skin-sensitizing antibodies.

MOTS CLES MEDLINE : Anaphylaxte * lmmunoloqte - Mastocy- tes * i m m u n o l o g i e - I m m u n o - c y t o . a d h ~ r e n c e - IqE * a n a I y - e .

I N D E X T E R M S : Anaphylctxis * immunology . Mast cells * im- munology - Immune adherence reaction - IgE * a n a l y s i s .

L'&ude exp6rimentale do l'anaphylaxie, hypersen- sibilit6 imm6diate dite hurnorale, dolt 6tre en r6alitfi eentr6e sur des ph6nom~nes eellulalres.

De trbs nombreux travaux sont eonsaerds aux mas- toeytes et aux basophiles, eibles des antieorps ana- phylaetiques eytophiles ; e e s cellules sont riches en mddiateurs ehimiques, lib6rds par ]e conflit immu- nologique et responsables de l 'inflammation aUergi- ¢[UO.

Le rat est un des animaux de laboratoire los moins sensibles h l'anaphylaxie. Copendant, i l est aetuellernent tr~s 6tudi6 ; e n effet, des syst~mes d'immunisation effieaees ont dt~ mis au point, no-

tamment aprbs les travaux de MOTA [10] . D'autre part, l'extraetion des mastoeytes pfiritondaux £ournit des eellules, 6quivalents des basophiles eireulants, et partieulihrement faeries h 6tudier.

Pour mesurer le niveau de sensibilisation des ani- maux, les prineipales mdthodes utilisables sont de deux types :

1) Les unes dtudient les antieorps anaphylaetiques s6riques. Coux-ei peuvent ~tre dos,~s par anaphyla. xio eutanfie passive, scion la technique d'OvArt¢ [ 11 ]. Un dosage radio-immunologique de r IgE de rat a 6tfi mis au point r6ee'mment, en utillsant l 'IgE

(*) Laboratoire de Pathologic exp6rirnentale et d'Immunoloqle q6n6rale, Facult6 de M6decine Cochin-Port.Royal, 24, rue du Faubourg Saint-Jacques, 75014 PARIS (France).

Travail r6alis6 avec l'aide d'une subvention du Conseil Scten- tiflque de I'UER Cochin-Port-Royal (Universtt6 Paris V).

WALLACH D., RENOUX M.-L. - - Une nouvelle m6thode de sensibilisation anaphylactique exp6rtmentale : les rosettes de mastocytes. Roy. tranq. Allerqol., 1976, 16 (n ° 3), 123-128.

. . . . . . . . - . - - r ~ - , - - - - , , ~iVO.RIGE/VOLGENDE PAG. ZIJN/IS ADVERTENTIE,-:~,

1124 0 D. 1VALLAGH ET M..L. RENOUX/

Fro. 1 e t 2. - - Aspects des rosettes de mastoeytes en microsco. pie optique. Coloration par le bleu de toluidine h l'eau h 0,25 p. cent.

monoelonale de rat d~eouverte par BAzIN et eoU. [3] . Le dfifaut d e ees m~thodes est l'absence de corrdlation constante entre l e s anticorps circulants et les anticorps fixgs sup les cellules-cibles de l'or- ganisme. Seuls ces derniers sent impliquds direete- ment:dans l'allergie elinique. Une discordance entre anticorps eellulaires et antieorps sgriques a gtc; ob- servge expdrimentalement par de nombreux auteurs [7, 20]. Chez l 'homme, de m~me, une allergic eli- nique authentique, avee tests cutangs positifs, peut ne pas s'aceompagner d'une 6lgvation des IgE s~ri- qUeS.

2) Ainsi, l'~tude direete des antieorps fixds sur les eellules-eibles permct une approche plus fdconde de ]a physiopathologie de l'allergie. Lorsque les mastocytes~ sup lcsquels se sent fixds ces anficorps, sent mis en prgsence de l'antig~ne, ils d6granulent et lib~rent diffdrents :m6diateurs chimiques, dent l'histamine,: L'intensit~: d e ce ph~nom~ne peut ~tre ~tudide de plusieurs fa~ons : soit en observant au microscope optique la d6granulation, soit en dosant les mgcHateursl~b~r~s. L'his|amine peut ~ t r e dos~e biologiquement, ou par m~thode~fluorometrique. Cette d~granulation immunologique entralne une li- beration d'histamine de beaucoup infgrietire h celle obtenue ~par des s t imulants non immunologiques eomme le 4 8 / 8 0 ; de plus, cette dggranulation n'est qu 'une e0nsdquence trbs inconstantede l 'union an- tigbne-antieorps.: L a libe'.'ration de l 'histamine (et des autres mddiateurs) est en effet un processus sg- crdtoire actif, eonsommant de l'dncrgie, inerrant en jeu plusieurs rdaetions enzymatiques et ndeessitant des conditions biochimiques bien prdcises, eomme par exemple la prdsenee de calcium [ I ] et de phospha- tidylsdrine [2] .

I1 nous a done paru int~ressant de chercher h mettre en 6vidence les anticorps cytophiles directe- ment, sans faire intervenir les consequences de leur un ion h l'antig~ne. La technique de rosettes que nous pr0pos0ns dans ce but est bas~e sur l'utilisation d'hd- maties de mouton tanndes e t recouvcrtes d'antig~ne, selon une mdthode inspirge de celle de BOYDEN [5 ] . Lorsque des hgmat ies ainsi sensibilisges sent raises en prdsenee de mastocytes d'animaux immunisds; la formation de rosettes tc;moigne de la prgsence d'anti- corps spdcifiques, fixgs h la surface des mastocytes,

Ce t y p e d e rosettes, impliquant des anticorps non s6crSt~s par l a cellule qui les porte, mais passive- ment fiXeS sur elle, e s t h rapprocher des r0settes de macrophages d~erites par BORDEN [6] , et 6galement des rosettes de basophiles d~erites par WILSON et coll. ehez l e cobaye~ [ 1 7 ] et ehez:l 'homme [18, 19], et sup lesquelles nous rcviendrons.

Dans une no te pr61iminaire [ 1 4 ] , la technique a ~t6 dderite et les premiers rdsultats rapport~s. Nous tenterons iei une interpr6tation de ce nouveau test,

TECHNIQUE

Des rats. femelles Sprague-Dawley sent immunis6s par injection in t ramuscula i re d e 0 , 2 " m l d e l b l a n c d'~euf et: de l 1 ml de vaccin contenant115 ,i 0 v i Hemo- pldlus pertt~sis (Vaxicoq ads0rbc;, Inst i tut M6rieux),

Les rats sent tuds pa r rupture du rachis cervical e t o n injeete dans la cavitd pdritondale 5 ml de mi- l i e u d e Hanks (Difeo Laboratories)additionn~ de NaC1 ~ 0,91:pi cent.: Le liquide recueilli aprbs mas- sage de l 'abdomen contient entre 40 000 et 200 000

Rev. fran~. AIIergol., 1976, 16, 3

/ROSETTES DE MASTOCYTES • 125

Mastocytes formant une rosette (%) 80

70

60

50

40

30

20

10

• i i | i I I g i I •

1 0 15 20 30 Jours apr~s I'immunlsation

F~g. 3. ~ Evolution d u pourcentage de mastoeytes formant une rosette au cours d 'une immunisat ioa primaire.

mastocytes par ml. La vitalit6 des cellules est con- tr61de par le test au bleu Trypan et leur rdactivit6 par la ddgranulation par le 48/80 sur lame.

La suspension de mastocytes est incub6e 5 mn h temp6rature ambiante avee un mfme volume d'une suspension de globules rouges de mouton tannds et recouverts d'ovalbumine. Le rapport GRM/mastocy. tes se situe entre 200 et 1 000.

Apr~s centrifugation lente, les cellules sont remi- ses en suspensmn et une goutte de cette suspension est d6posde sur une cellule de Malassez et color6e par le bleu de toluidine. Du fait de la coloration 61ective des mastocytes en violet, les rosettes mastoeytaires sons trks fortement reeonnues (fig. 1 et 2). Une ro- sette est d6finie par la pr6sence autour d 'un mastocyte d'au moins cinq hfmaties. Le rdsultat est exprim6 en pourcentage de rosettes par rapport au nombre de mastocytes examin6s. Pour ehaque expdrience, un eontrSle est effeetu6 avee des hdmaties tanndes mais non reeouvertes d'antig~ne.

Le dosage des r~agines s6riques est effeetu6 par une mdthode standard d'anapbylaxie eutande pas- sive (ACP) avee uue: p6riode de latence de 48 beu- res [11 ]. Une technique d ' A C P avee latence de trois heures a aussi dt6 utilis~e, pour la recherche des IgG eytophiles.

R~SULTATS

A e e jour, nos expdriences ont port6, apr~s raise au point de la technique, sur quatre-vingt-trois ani- maux , et pe rme t t en t une premiere approehe du ph~nom~ne des rosettes mastocytaires.

Rev. lran£. Allergol., 1976, .16, 3

ETUDE DES RATS NON IMMUNItieS

Vingt rats neufs ont 6t6 dtudi6s. L¢ hombre de mastoeytes formant une rosette est ehez ces animaux trbs faible, mais it n'~est p a s nul : 2,4 p. cent en moyenne. Douze animaux s u r vingt n 'ont aucune rosette. Les eontr61es sans ovalbumine o n t toujours ~t6 trbs bas : 1,7 p. cent en moyenne. Ces chiffres ne peuvent h notre avis ~.tre interprdtds comme des rosettes spontandes, mais plut6t comme un ~ bruit de fond ~ li6 aux conditions techniques.

EVOLUTION DU NOMBRE DE MASTOCYTES FORMANT UNE ROSETTE AU COURS D~UNE IMMUNISA.TION PRI- MAIRE

Soixante-trois rats ont 6td immunisds selon le pro. tocole dderit plus haut ; ]es animaux sont examinds dans des d61ais variant de 5 h 30 jours aprbs l ' immu- nisation. Trois groupes d 'animaux doivent 6tre dis- tinguds ."

1) La plupart des rats ont des mastoeytes formant des rosettes avec les h6maties sensibilis~es, tandis que les eontrbles, effeetu6s avee des h~maties non sensibiHs6es , sont n6gafifs.

An 5 ~ jour, la moyenne des rosettes mastocytaires ne diff~re pas de eelle des animaux non immunis6s.

Le taux de rosettes s'dl~ve d~s le 8 ~ jour ; il atteint son maximum au 15 ~ jour, oh 60 p. cent des mastoeytes en moyenne form~nt une rosette. Le hom- bre de rosettes diminue ensuite ; au 30 ~ jour, 24 p. cent des mastoeytes en moyenne forment une ro- sette. La figure 3 indique les moyennes des valeurs trouv6es chez 4 9 animaux.

2) Sept des animaux examinds apr6s le 5 ~ jour, soit 12 p. cent de ee lot, ne poss~daient pas de mas- tocyte formant une rosette. On peut supposer que ees animaux ne se sont pas immunisds apr6s l 'in. jeetion d'antig~ne.

3) A l'oppos6, chez sept autres animaux, nous avons trouv6 des rosettes h la lois en pr6senee des h6maties sensibilisdes, et des h6maties-tdmoins, tan- ndes mais non reeouvertes d'antigSne. C e phdno. m~ne, qui sera diseut6 plus loin, n 'a pas re~u d'ex. plication.

SPECIFICIT]~ DES RI~CEPTEURS IMPLIQUI~S DANS Lk FORMATION DES ROSETTES MASTOCYTAIRES

Chez les rats ayant un taux 6]ev6 de rosettes au 15 e jour, nous avons tent6 d'inhiber la f o r m a t i o n d e s rosettes par incubation prdalab]e des mastocytes avee de l 'ovalbumine en solution. Apr~s ]avage et e']imi. nation du surnageant, ]a formation des rosettes est effeetu6e comme indiqu6 plus haut. Des tdmoins subissent le m~me traitement, mais sont incub6s sans ant igone. Les r~sultats des neuf exp6riences effec- tu6es sont rapport~es sur ]e tableau I, qui montre que l ' incubation des mastocytes avee l'antig~ne sup- prime ]eur capaeit6 de former des rosettes.

126 0 D. IVALLAGH ET M..L. RENOUX/

T A B L E A U I

INHIBI'~ION DE LA FORMATION DES ROSETTES IblMUNF, S PAR INCUBATION DES MASTOC~TES

EN PRI~fiENCE D'UNE SOLUTION: D'OVALBUMINE A 0,2 MG/ML PENDANT 30 MN, A 370 C

, , , 11 , - - . , _ • , , , = ,

POURCI~NTAGE DE ROSETTES APR~S ZNCUBA~rION

sans ovalbumine I avec ovalburnine

65 13 56 6 31 2 28 0 55 0 64 0 51 0 43 0 40 0

POURCI~NTAGE D'INHIBITION

80 89 93 100 100 100 100 100 100

Mastoc

70-8,0

60-70

50-60

40-50

30-40

2O-30

10-20

0 - 1 0

,tes formant une rosette (%)

O 0

O 0

o

e /

o / o

o o / / / /

p / /

O 0

/

/ /

/ ,/

/ /

/

/

/ /

Titre des s~rums en A C P

Ftc . 4. ~ Correlat ion ent re le taux de rosettes mastocyta l res et l e t l t re e n rdaglnes sdriques, chez 20 rats.

II a dtd possible d'effeetuer la m~me expdrience d'inhibition dans u n des sept eas d e rosette ~aon spd- cifiques,:Apr~s l ' incubation en prdsenee de l'anfig~ne, l e nombre de mastoeytes formant :une rosette dtait toujours.~i61eyd; etl n e ~ r a i t ~ras signitlcativement du-: hombre de rosettes avant l ' incubation~(ni du nombrede r0settes en prdsenee des hdmaties:t~moins).

COMPARAISON ENTRE TAUX DE ROSETTES ET ANTI-

CORPS ANAPHYLACTIQUES CIRCULANTS

Chez vingt animaux, nous avons effectual un do- sage de rdag ines i ( IgE)par :ACP ' sur ~le: s~rum prd- levfi te:j0ur d u test des rosettes: La figure 4 ~indique les r~sultats de ces dosages ainsi que leur eorrdla-

tion avec le taux de rosettes mastocytaJres. Dans un certain nomhre de cas, on ne trouve p'as de r~agines cireulantes, malgrd u n taux dlev$ de rosettes. Nous avons alors recherehd la prdsence dans ces sdrums d'anticorps eytophiles de type IgGa, par A C P avee latenee de t rois heures. Les huit dosages que n o u s avons effeetuds ont tous dtd ndgatifS.

Cinq sdrums d'animauX pr~sentant d e s rosettes spdeifiques ont dtd dgalement titrds en ACP avec latenee de 48 heures. Quatre de ces s~rums conte- naient des IgE.

DISCUSSION

A notre eonnaissance, la propridtd des mastoeytcs de rats de former des rosettes immunes n'avait ja- mais dtd ~ signalde ; cette propridtd permet, par une technique simple, l'dtude des rdeepteurs mastoeytai- res spdcifiques de l 'antig~ne. Ces rdcepteurs ne sont pas trouvds chez les rats non immunisds. Aprbs l'im- munisation on a pu distinguer trois groupes d'ani- ITI a u x !

* le groupe ]e plus important, qui comprend 75 p. cent des animaux, est celui des rats dont les masto- cytes £orment des rosettes spdcifiques. Cette spdei- fiCitd a ~td prouvde d e deux fagons : d'une part, des hdmaties non recouvertes d'antigbne ne permettent pas la formation de rosettes (ee contrble a d t d effec- tual dans tous les eas). D'autre par t , l 'incubation des mastoeytes avee rantigbne supprime l e a r capaeltd de former des rosettes (Tableau I). Ceci sugg~re que les rdeepteurs mastocytaires sont des anticorps cyto- philes. L e a r nature exaete, I g E ou IgGa [4] , n 'a pas dtd ddterminde direetement, mais la cindtique des rosettes lops de l ' immunisat ion primaire (fig. 3) est analogue h eelle d e : l a formation des IgE.

* Douze pour: cent des animaux examinds aprbs le 5" j o u r ne forment p a s d e rosette. Notre proto' cole d'immunisation n'a done pas rdussi ~ sensibiliser tou~ les animaux :; ceei n'est g u b r e surprenant, la difllcultd de l a sensibi]isation du: r a t a u x protdines dtrang~res est eonnue depuis longtemps [8] .

o Les rosettes non sp~cifiques que nous avons ob- serv~es ehez sept rats son t plus diffieiles h expliquer. Une erreur technique est toujo~rs possible, mais sa repetition p e u vralsemhlable. ]~ous n 'avons jamais observ~ de rosette non sp~eifique chez un r a t non immunis& Mais notre s~r ied 'animaux neufs est sans doute t rop eourte pour lpouvoir conelure:que de tel- les rosettes n'existent p a s spontam~ment, iPeut,6tre les mastocytes de eertains rats portent-ils h l e u r sur- face, ddeelables spontan~.ment ou aprbs une stimu- lation immunologique, des rdeepteurs pour les glo- bules rouges de mouton tannds.

C o m m e il a dtd dit plus haut, la eomparaison, h un moment d0nnd, du titre en r~agines eireulantes et des antieorps fixes s u r les maStocytes, est suscepti- ble de fournir des renseignements intdressants. Les

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/I~OSETTES DE MASTOCYTES @ 127

dosages que nous aeons effectuds montrent, confor- mdment aux donndes de la litt6rature, un certain degr~ de discordance entre ces deux grandeurs (fig. 4). En effet, si dans certains cas, on trouve il la lois des mastocytes formant des rosettes e t des IgE cir- culantes, ailleurs il n 'y a pas de rdagines circulantes, alors m~me que le taux de rosettes est dlevd. Par contre, tous les animaux ayant des IgE cireulantes ont des mastoeytes formant des rosettes. Ceei indi- que; ~ notre avis, que la mdthode des rosettes est plus sensible que l,anaphylaxie cutande passive pour mesurer l'~tat de sensibilisation d'un organisme ; lea IgE pourraient ne circuler dans le sang • qu,apr~s avoir saturd leurs sites cellulaires de fixation. La sensibilisation de rorganisme d~pend uniquement des anticorps fixds.

Tout au long de notre travail, des mastoeytes de rats sensibilisds out dtd mis a u contact de l'antig~ne, et nous aeons cru pouvoir affirmer que ces mas- tocytes dtaient por teurs d'anticorps, probablement de elasse IgE ; eependant, ces mastocytes n'ont pas ddgranul~. Nous pensons que ee fait peu t fitre ex- pliqud par les caractdristiques du milieu que nous aeons employd : il s,agit d'un milieu hyperosmolaire, et qui ne contient pas de phospholipide. Darts ce milieu, nous aeons vdrifid que les mastocytes restent viables, et qu'ils ddgranulent tout h fait <c normale- ment )) sous l'aetion du 48/80 ; mais l a ddgranula- tion immunologique est moins facile h obtenir.

La question d'une dventuelle application du test des rosettes mastocytaires ~ la clinique dolt fitre envisagde avec prudence. On peut eoncevoir deux types d'applications :

1) Les mastoeytes de rats peuvent fitre utilisds comme support d'IgE humaines, dont la prdsence se- rait ensuite rdvdlde par la formation de rosettes. 17 est maintenant dtabli qu'il est possible expdrimentale. merit de fixer des IgE humaines sur des mastoeytes de rats [ 13]. Un test de ddgranulation des mastocy- tes de :rats a dtd eniployd comme moyen de ddtection des IgE humaines sdriques par diffdrents auteurs qui s'en sont montrds satisfaits [9, 12, 15] tandis

que pour d'autres [16] la valeur de ce test est dis- cutable. Un test de rosettes basd sur le mfime prin- eipe n'aurait sans doute pus une valeur supdrieure.

2) Un test analogue ~ celui des rosettes mastocy- taires a dtd dde.rit par A.-B. WtLSON et coll. I1 con- siste h mettre en dvidenee, par une technique de rosettes, les IgE fixdes sur les basophiles humains. Aprbs une premiere ~tude sur les basophiles de co. baye [ 1 7 ] , deux techniques o n t ~td ddcrites : darts la premiere [ I 8 ] , des basophiles de sujets normaux, passivement reeouverts d'IgE ~riques d'allergiques, forment des rosettes en prdsence de globules rouges humains recouverts d e rantig~ne. Une deuxi~me technique utilise lea propres basophiles des sujets allergiques [19] . A.-B. WIt.SON et coll. ont montrd, par une technique de rosettes, la prdsence d ' IgE spdcifiques (anti-pollen) a la surface de ces baso. philes.

L'intdr~t thdorique de ce dernier test est considd- rable, puisque 1~ encore on recherche les anticorps qui, fixds aux cellules-cibles, ddcleneheront les mani- festations allergiques. Ces anticorps ne sont pus su- perposables aux antieorps sdriques. De tels tests ~ n t cependant difliciles ~ utiliser en pratique ; en effet, les basophiles eireulants sont rares et leur isolement ddlieat. La fixation des antig~nes sur les hdmaties constitue une autre diflleultd.

Quoi qu'il e n soit, nous pensons qu'en expdri- mentation le test des rosettes mastoeytaires peut rendre de grands services. It permet d'explorer les premieres dtapes de la rdaetion d'hypersensibilitfi im- mddiate, c'est-h-dire la production d'anticorps homo- cytotropes, leur fixation sur les mastocytes, et leur union avec l'antig~ne. Si un certain nombre de md- eanismes r~gulateurs s'exercent sur les ~tapes ultd- rieures de cette rdaetion (activation membranaire, sder~tion et libdration des mddiateurs, activitd bio- logique de ces m$diateurs), il est dvident que tout dd- pend de rinteraetion mastoeyte-IgE-antig~ne. I1 est done tr~s important de disposer h la lois d'un proto- cole d'immunisation, rdguli~rement efficace, et d'un moyen simple d'objectiver cette immunisation, avant de pouvoir en dtudier les mdeanismes intimes.

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