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Utilisation de la spectrométrie de masse pour diverses études protéomiques

en 2007-2008

Anaïs AULAS, Alessandro BALLESTER, Joseph BAREILLE, Hannah BENISTY, Naciba DAHMANI, Emilie DELVERDIER,

Yoana DIMITROVA, Kevin DROMER, Karine JACQUET, Mathias MANGION, Paola MUNOZ, Thomas PRUDHOMME,

Sandrine RAZAFIMAHATRATRA, Karine ROTTIER, Farah ZMIRI,

Professeur référant : François COUDERC

Promotion EGPR 9

2

TABLE DES MATIERES INTRODUCTION 4 ETUDES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES 5 La glycosylation 5

• Généralités • Caractérisation des sites de glycosylation • Diagnostic par quantification de la glycosylation • Diagnostic par étude de la glycosylation • Études du profil de glycosylation

La phosphorylation 10

• Généralités • Techniques d’analyse de peptides phosphorylés • Indentification des sites de phosphorylation • La quantification • Présomption de sulfatation artefactuelle

Autres modifications 15

• Généralités • Sulfatation de la tyrosine • Acétylation de la lysine • Formation de déhydroalanine

QUANTIFICATION EN SPECTROMETRIE DE MASSE DES PROTEINES 20 Techniques de quantification protéique en MS 20

• Quantification absolue : AQUA • Marquage isotopique in vivo pour quantification relative: ISIS (Isobaric SILAC

with Immonium Ion Splitting) • Amélioration de la technique iTRAQ par fractionnement OFFGEL

Applications à l’environnement médical. 25

• Généralités • Détection et quantification du facteur létal de l’anthrax dans le sérum par

spectrométrie de masse • Mise au point d’un test de dépistage de la maladie de Wilson par LC-MS/MS.

3

APPLICATIONS 30 Applications médicales 30

• Modifications post-traductionnelles. • Recherche de biomarqueurs

Applications en protéomique végétale 34

• Généralités • Identification des changements du protéome dans des feuilles de blé, en réponse à

un stress salin par établissement de cartes peptidiques massiques • Identification des protéines des feuilles de riz dont l’expression est induite en

réponse au froid par séquençage peptidique par spectrométrie de masse en mode tandem.

• Etudes des modifications post-traductionnelles des histones par méthode classique.

• Identifications des protéines chloroplastiques et de leurs modifications. CONCLUSION 37 REFERENCES 38

4

INTRODUCTION L’analyse du protéome représente un enjeu majeur qui permet d’accéder à des données fondamentales. Les études en protéomique sont en effet en grand essor depuis le début des années 2000 et la spectrométrie de masse apporte un grand soutien dans la compréhension des mécanismes de régulation des protéines ainsi que dans les voies où elles sont impliquées. Elle est un outil indispensable dans cette approche d’étude et de caractérisation des protéines. En constante évolution, elle est souvent couplée à d’autres techniques d’analyse permettant d’augmenter la sensibilité de détection et donc d’analyse.

A travers cette revue nous avons essayé de donner un aperçu des capacités de la spectrométrie de masse dans des études touchant des domaines divers et variés. En effet, cette technique permet d’étudier les nombreuses modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, la glycosylation…

De part ces analyses en spectrométrie de masse, un aspect quantitatif des protéines et de leurs modifications peut être abordés.

Différentes applications dans le domaine médical ou végétal utilisables en routine ou non, sont également traitées dans cette étude.

5

ETUDES MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES

De façon générale, les modifications post-traductionnelles sont identifiées par MALDI-TOF MS/MS ou par ESI-TOF MS/MS. L’analyse des ions issus de la fragmentation met en évidence les modifications post-traductionnel006Ces caractérisées par un incrément de masse correspondant à l’ajout de groupement chimique. La glycosylation

Généralités Les protéines glycosylées sont généralement destinées à être sécrétées ou à être

intégrées à la membrane plasmique. Les chaînes de polysaccharides sont souvent ramifiées et font varier de 1 à 50% la masse de la protéine. Déterminer la structure des glycoprotéines est actuellement l'un des travaux les plus difficiles puisque chaque ose possède plusieurs hydroxyles libres pouvant interagir avec un autre ose ou un autre composé. Ainsi, la possibilité de former des différents de polysaccharides est immense. Par ailleurs, on distingue la N-glycosylation (sucre lié à l’Asn) et la O-glycosylation (Ser & Thr).

Ici nous étudierons la détermination les sites de glycosylation ainsi que des séquences consensus de ces sites. Egalement dans une autre optique nous étudierons la compréhension des mécanismes de certaines maladies et leur diagnostic ainsi que le dépistage de maladies (les troubles congénitaux) et la glycosylation d’anticorps thérapeutique recombinant.

Caractérisation des sites de glycosylation

Les expériences de la publication de Gross et al. visent l’étude de la glycosylation de

la protéine HMW1. L’Haemophilus influenzae HMW1 est une adhésine bactérienne possédant un ou plusieurs sucres N-liés par une glycosyltransférase. Cette adhésine est responsable du « Human Respiratory Tract Disease ».

Des études préliminaires de digestion à la PNGase F, clivant les N-glycosylations, ne

modifient pas la taille de la protéine suggérant une O-glycosylation ou une N-glycosylation non reconnue par l’enzyme. Des expériences de spéctrométrie de masse vont permettre

IINNIITTKK

y4 : ΣR + 162 +19

Peptide non modifié Peptide modifié

[M-162 + H]+ m/z= ΣR + 18 + 2

[M-162 + 2H]++

y4 -162

b2-162

Figure 1 : Exemple d’un spectre MS/MS du peptide. INITK m/z= 750.3 permettant l’identification du résidu portant la modification de 162Da portée par le y4 vert.

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d’étudier les différentes glycosylation. L’analyse des ions de MS après digestion trypsique révèle un incrément de masse de 162 Da par rapport aux masses attendues et ce, pour divers peptides trypsique. L’analyse des peptides trypsiques permet l’identification, grâce aux ions fragments, du résidu portant la modification de 162Da (fig. 1).

Afin d’identifier la modification supposée être un hexose, une expérience de

remplacement de protons échangeables en deutérium dans l’eau lourde est réalisée par MALDI-MS (fig. 2).

Cette expérience révèle un incrément de masse (ou nombre de protons échangés) permettant de le corréler au type d’ose soupçonné. La différence de masse de 32 Da, pour le peptide d’exemple correspond au nombre de protons échangeables pour un hexose. De plus, les auteurs indiquent que la perte d’une masse de 165Da en MS/MS correspond à un hexose deutéré alors qu’on s’attend à 4 OH libres soit 4H échangeables: 166 Da. Pour conclure, l’étude par spectrométrie de masse a permis d’identifier les sites de glycosylation ainsi que le type de saccharide N-lié.

Diagnostic par quantification de la glycosylation

Les troubles congénitaux de glycosylation (Congenital Disorders Glycosylation) sont

des maladies associées à des défauts de glycosylation. Les CGD de type I présente une diminution du taux d’occupation des sites de N-glycosylation des glycoprotéines. Dans le but de quantifier ce défaut de glycosylation une méthode de multiple reaction monitoring LC-MS/MS est mise au point afin par Hülsmeier et al. de remplacer la méthode actuelle basée sur la technique de focalisation isoélectrique.

La transferrine et l’α1-antitrypsine sont utilisées comme biomarqueurs de la maladie puisque les sites de N-glycosylation sur les asparagines sont connus. Les échantillons de personnes saines et atteintes de CDG de type I sont digérés avec de la trypsine et Asp-N. Afin de distinguer les peptides qui présentent ou non une asparagine N-glycosylées, une digestion à

Figure 2 : Remplacement au deutérium des protons échangeables du peptides NVTVNNNITSHK. Haut : Spectre MALDI-MS du peptide modifié avant et après deutération. Bas : Structure du peptide modifié par un hexose avec tous les protons échangeables (en rouge).

Héxose : 162Da 32 protons échangeables Héxose deutéré : 166Da

Δ32

7

la PNGase F est réalisée dans H218O. L’asparagine N-liée devient un aspartate marqué avec

18O (fig. 1) alors que les asparagines non N-glycosylée ne réagissent pas avec l’enzyme.

Les standards internes utilisés sont marqués isotopiquement comme décrit dans le tableau de la figure 2A. Pour la MRM, ils possèdent au site de N-glycosylation, soit une asparagine soit un aspartate, représentant ainsi les 2 possibilités de glycosylation des peptides (fig 2A).

Pour le standard interne et pour chaque peptide, un ion précurseur et. un ion fragment correspondant sont sélectionnés pour la transition MRM (fig. 2B). Les spectres LC-MS/MS permettent d’identifier les peptides (fig. 3). La quantification réalisée par MRM avec le standard permet de définir les variations de glycosylation pour chaque site. En effet le deuxième site de glycosylation de la transferrine a des variations de modification plus importantes alors que l’α1-antitrypsine présente des variations moins évidentes.

18

PNGase F dans H2

18O Aspartate

Figure 1 : schéma de l’action de la PNGase F sur une asparagine N-liée

Figure 2 : standard interne et ions choisis pour la MRM A) standards internes marqués utilisés pour la MRM. Peptides ATP de l’α1-antitrypsine et TFP de la transferrine, les acides aminés marqués sont en gras soulignés, les acides aminés des sites de glycosylation sont encadrés, et présentent une asparagine ou un aspartate (violet) correspondant aux peptides du sérum après l’action de la PNGase F. B) ions précurseurs Q1 et ions fragments correspondant Q3 suivis pour la MRM. Les numéros des peptides correspondent aux sites de glycosylation

A B

8

Les résultats permettent de déterminer que le deuxième site de glycosylation est un biomarqueur plus intéressant pour le diagnostic de CDG de type I étant donné que la technique de routine de focalisation isoélectrique ne permet pas de discriminer les sites de glycosylation.

Diagnostic par étude de la glycosylation

Le syndrome Peter Plus est induit par une enzyme inactive : la β1,3-

glucosyltransférase qui est impliquée dans la glycosylation des thrombospondines. Dans cette étude, Hess et al. ont étudié le défaut de glycosylation putatif d’une protéine faisant partie des thrombospondines étant impliquée dans le syndrome Peter Plus. La properdine, thrombospondine choisie pour l’étude est abondante, facilement purifiable et toutes les positions du disaccharide Glc-β1,3-fuc-O sont connues.

Après purification de la properdine du sérum des individus, la protéine est digérée par la trypsine. 4 peptides issus de la tryspinisation sont glycosylés (T7, T11, T17+T18, T23). Plusieurs glycoformes existent pour chaque peptide et nous prendrons le peptide T7 à titre d’exemple.

D’après la LC/MS, la masse de la glycoforme MMFG du peptide T7 est attendue à

3129.2 Da. Chez les patients malades ce peptide est absent, cependant un peptide de 2967.1 Da est retrouvé. Celui-ci présente une perte de 162 Da qui pourrait correspondre à une perte de glucose (glycoforme MMF0), mais également à une perte de mannose (glycoforme M0FG) ces deux glycoformes de même masse ne peuvent donc pas être distinguées par LC-MS.

Figure 3: spectre MS/MS du peptide TFP1DK correspondant au premier site de glycosylation de la transferrine du standard et de l’échantillon. LA : marquage isotopique du standard (+11Da) D : site de glycosylation présentant un aspartate 18O (+2) après digestion à PNGase F L’ion y9 est utilisé pour ce peptide comme ion fragment pour la transition en MRM et la quantification

M: mannose F: fucose G: glucose 0: pas de monosaccharide

WSLWmanSTWAPCSVTfuc-glcCSEGSQLR

WSLWmanSTWmanAPCSVTfuc-glcCSEGSQLR

WSLWmanSTWmanAPCSVTfucCSEGSQLR MMF0 (forme attendue chez les patients):

MMFG

M0FG

Peptide T7

Standard Échantillon

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Une analyse par LC-MS/MS est réalisée afin de discriminer ces 2 glycoformes en vérifiant la présence des mannoses et la nature de la modification portée par la thréonine (fucose ou fucose-glucose) (fig. 1).

Les 2 mannoses sont identifiés par les masses des ions b7 et b8. La modification sur la thréonine est identifiée par une perte de masse. En effet, après fragmentation le peptide perd les sucres O-liés sur la thréonine. Le spectre MS/MS du peptide de 2967.6 Da donne un fragment [M+2H-Fuc]2+ m/z =1412.3 donc M = 2822.6Da (fig. 1) soit une perte de 142 Da correspondant à une perte de fucose et non de glucose. Ce peptide trypsique possède donc 2 mannoses et un fucose : MMF0.

Après l’analyse de tous les peptides trypsiques glycosylés (T7, T11, T17+T18, T23) aucune glycoforme ne possédant la modification Fucose-Glucose n’est trouvée chez les personnes atteintes du syndrome Peter Plus confirmant que c’est une maladie congénitale de glycosylation .

Les auteurs ont par la suite mis au point une méthode de quantification relative par MRM (multiple reaction monitoring). Une normalisation est réalisée avec des peptides non glycosylées dont la quantité ne varie pas.

La fiabilité de cette technique n’est pas évidente puisque les peptides utilisés pour la normalisation ne co-migrent pas, ne permettant pas les mêmes conditions de fragmentation.

Études du profil de glycosylation

Les anticorps monoclonaux sont de plus en plus utilisés en thérapeutique. La N-glycosylation des anticorps monoclonaux a une influence sur leur efficacité, leur clairance, immunogénicité, ainsi que sur leur fonction. L’article de Lim et al. utilise une approche basée sur la LC-MS afin de déterminer le profil de glycosylation et la distribution des glycorformes en fonction de la lignée cellulaire.

Figure 1: spectre MS/MS du peptide T7 MMF0 d’un patient malade. Les lettres en rouges correspondent aux acides aminés déduits des ions présents sur le spectre. Les fragments indiqués en vert représentent les ions utilisés pour déterminer la présence des 2 mannoses. # :mannose sur tryptophane.

SVW GEADT

C

S

E

GS

Q/K

b7 b6

b8

W + mannose

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Les anticorps sont préparés pour libérer les fragments de chaînes légères et lourdes pour l’analyse en LC-MS (fig. 1).

Les sites de N-glycosylation ainsi que les différentes glycoformes sont connus. Le

spectre déconvolué est attribué, ce qui permet, par la mesure de l’air de chaque pic, de calculer l’abondance relative des glycoformes (fig 1B).

Les données obtenues sur la distribution des glycoformes dans la région Fab et Fc des anticorps monoclonaux des différentes lignées indiquent des profils de glycosylation différents. Cette modification post-traductionnelle semble être dépendante de la lignée cellulaire.

D’après les auteurs, cette méthode permet donc d’obtenir des informations sur le profil de glycosylation des anticorps monoclonaux et de définir l’impact des conditions de culture cellulaire sur la distribution des glycoformes et de s’assurer ainsi que la glycosylation est appropriée.

La phosphorylation Généralités

C'est une modification post-traductionnelle (PTM) des protéines indispensable qui intervient dans un très grand nombre de processus cellulaires (différenciation, division, prolifération, apoptose, ...) et en particulier dans les mécanismes de signalisation. On estime qu’un tiers des protéines voient leur activité régulée par une ou plusieurs phosphorylations.

Actuellement plus de 500 kinases ont été identifiées chez les eucaryotes. Ces enzymes peuvent ajouter un groupement phosphate sur les résidus de Serine, Thréonine et/ou de Tyrosine. L’ajout de ce groupement entraîne un incrément de masse de 80 (1 Phosphate (31) + 3 Oxygènes (3x16 = 48) + 1 Hydrogène (1)) (fig.1)

Figure 1 : (A) Schéma d’un anticorps avec les régions variables Fab et constante Fc. (B) Spectre déconvolué d’anticorps monoclonaux après traitement à la papaïne et au DTT avec les différentes glycorformes correspondant aux régions Fab et Fc.

A

B

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Figure 1 : La phosphorylation. Le cercle violet représente la phosphorylation sur un résidu de sérine. Les atomes d'oxygène sont en rouge, ceux de phosphore sont en orange, ceux de carbone en gris et l'azote en bleu. Les atomes d'hydrogène ne sont pas représentés.

Techniques d’analyse de peptides phosphorylés.

La plupart du temps la phosphorylation est une modification post traductionnelle qui régule l’activé protéique. Les protéines natives et celles ayant subi une ou plusieurs modifications post-traductionnelles ne vont pas avoir le même point isoélectrique et vont pouvoir être identifiée à l’aide d’un gel 2D. Ainsi Parker et al. ont voulu caractériser le phénotype des protéines sarcomériques de cœur de rat néonatal et adulte. Ces protéines sont impliquées dans la contraction musculaire et leur état de phosphorylation a un impact sur leur fonctionnement. Pour appréhender ces différences physiologiques un gel 2D est réalisé dans lequel les protéines sont séparées en fonction de leur taille et de leur point isoélectrique (pI). Les phosphorylations vont changer le pI de la protéine, et entraîner la présence de plusieurs spots de taille moléculaire identique. Des extraits de plusieurs cellules vont pouvoir être comparés sur un même gel. Ainsi des marquages différents sont effectués dans chaque type cellulaire ; vert pour les échantillons de rat néonatal et rouge pour les échantillons de rat adulte (fig. 2). Les états de phosphorylation de la tropomyosine (Tm), de la chaîne légère de la myosine (MLC2), de la protéine C liant la myosine (MyBP-C), de la troponine 1 (Tn1), de la troponine T (TnT) et de la chaîne lourde de la myosine (MHC) sont ainsi mis en évidence.

Figure 2: analyse des myofilaments protéiques de rat néonatals et adultes en gel 2D. Les protéines sont extraites à partir de 6 rats néonatal et de 6rats adultes marqués respectivement en vert (Cy3) et en rouge (Cy5). Les 12 échantillons sont mélangés avant séparation par une électrophorèse en deux dimensions. Les spots des protéines qui changent sont marqué, la tropomyosine (Tm), la chaine légère de la myosine (MLC2), la protéine C liant la myosine (MyBP-C), la troponine 1 (Tn1), la troponine T (TnT) et la chaine lourde de la myosine (MHC).

+

… NH – CH – CO

CHl

lOH

=

OH

Pl

l

… NH – CH – CO

CH l

l O

OH

P l

l OH

OH

O

OH O

_ =

_ =

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Seulement, cette méthode ne permet pas de savoir quelle modification est réalisée, quelle est sa position, ainsi que le nombre survenu. Pour répondre à ces questions, il faut réaliser une analyse en spectrométrie de masse.

Dans cette publication, un enrichissement au TiO2 a d’abord été réalisé, permettant d’augmenter la concentration en molécules phosphorylées (fig. 5). Le TiO2 est greffé sur une colonne, car il présente une forte affinité pour les groupements phosphate et permet ainsi la fixation des protéines phosphorylées sur la colonne. Les rendements d’enrichissement sont supérieurs à ceux obtenus avec d’autres techniques comme l’IMAC.

Ces analyses ont permis de mettre en évidence des états de phosphorylations différents

ce qui explique des états physiologiques variants d’une population à une autre. En effet les deux phénotypes sont différents et la réexpression d’un phénotype néonatal chez un rat adulte implique de graves conséquences pathologiques.

Indentification des sites de phosphorylation

HSP27 est un marqueur de l’angiogenèse. Afin d’identifier les sites précis de

phosphorylation, Dai et al. vont avoir recours à des analyses de fragmentation de la protéine. Pour cela, ils effectuent des digestions enzymatiques (Lys-C, trysine, Glu-C) leur permettant d’avoir accès à un recouvrement de séquence de 96.1% après analyse en MALDI. Les échantillons sont séparés en chromatographie liquide (LC) puis analysés en MS, en MS2 et en MS3 (fig. 2). Cette triple fragmentation permet de mieux identifier les différents profils de phosphorylation de HSP27 Dans la première MS, les auteurs sélectionnent un massif qui correspond à la protéine d’intérêt chargée 3 fois. Lors de la MS2, ils étudient la fragmentation de ce pic pour s’assurer de la présence de la protéine d’intérêt. Lors de la MS3, ils étudient le peptide susceptible de porter la phosphorylation (mais non phosphorylé dans la figure).

HSP27 peut être mono- ou pluri-phosphorylée essentiellement sur au niveau des serines 78 et 82. De plus l’analyse en LC-MS a monté la présence d’autres modifications post-traductionnelles telle que le clivage de la méthionine en N-term ainsi que l’acétylation de la thréonine sub-terminale exposée.

Enrichissement au TiO2

Figure 5 : Enrichissement grâce au dioxyde de titane en peptides phosphorylés et analyse enspectrométrie de masse.

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Dans le spectre de la MS3, on fragmente l’ion correspondant à notre peptide d’intérêt ayant perdu ses phosphates. Les sérines, de masse 87, perdent une molécule d’eau lors du départ du phosphate et ont alors une masse de 69. Le spectre montre des fragments avec des phosphorylations de S78 ou S82. Les 2 positions doivent être phosphorylées dans le vivant, mais correspondent-elles à des activités et à des kinases différentes ?

La quantification La spectrométrie de masse est utilisée pour l’identification de protéines ou de

biomarqueurs présents dans des échantillons. Dai et al. ont cherché à évaluer une technique de quantification sans étalons interne.

Dans cette étude, les chercheurs souhaitaient trouver une corrélation linéaire entre la présence de peptide phosphorylés et leur détection. Pour faire cette étude ils ont utilisé 7 peptides synthétiques différents. Pour chacun ils ont fait varier le taux de phosphorylation, ils ont aussi analysé l’influence de la matrice ainsi que du mode sur la quantification (résultats montrés que pour un peptide). Le peptide TSTEPQ(p)YQPGENL est analysé sur la figure 1. Pour commencer, les résultats obtenus diffèrent d’un matrice à une autre (noir: CHCA, gris foncé: DHB, gris clair: THAP). La quantification est moins bonne avec la matrice CHCA pour les deux modes et présente généralement une grande sous-estimation de la présence de peptides phosphorylé. Les matrices DHB et THAP présentent aussi une sous-estimation de la quantification en mode positif alors qu’elle se rapproche des taux réel en mode négatif. Cependant après étude des sept peptides, aucune règle de quantification ne peut être tirée de ces expériences. La détection des peptides phosphorylés dépend de nombreux paramètres comme la nature du peptide (composition en acides aminés, nombre de résidus…) ainsi que d’autres paramètres comme la matrice de l’échantillon ou encore le mode d’ionisation (positif ou négatif). Cette étude confirme qu’il est impossible d’avoir une quantification de peptide sans étalon interne.

A

C

B

795.7603

Figure 2 : Identification du fragment 65-87 de HSP27 contenant une phosphorylation sur la Sérine 82par une analyse en LC-MS après traitement avec Glu-C. A) Spectre de FITC/MS, mesure de l’ion précurseur d’intérêt à 43.43 min. B) Spectre des ions fils obtenus après fragmentation (CID-MS2) de l’ion parent (m/z 795.7603 à 43.43 min). C) Spectre MS3 obtenu à partir d’un ion fragment de MS2 (m/z 966.7 =>

H PO )

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Présomption de sulfatation artefactuelle Avant analyse en spectrométrie de masse les protéines sont souvent soumis à une

séparation. Lors de la migration de protéines sur gel de polyacrylamide, la coloration est une étape indispensable avant l’analyse en spectrométrie de masse. Le colorant utilisé est souvent choisi en fonction de sa sensibilité. Cependant certaines de ces colorations peuvent induire des artéfacts de PTM et induire une mauvaise indentification des peptides ou des PTM qu’ils portent. La réaction thiosulfate/argent est montrée figure 1. Au bilan de la réaction une précipitation brune du nitrate d’Argent et une sulfatation du peptide sont obtenues.

Ainsi Gharib et al. comparent deux colorations, le nitrate d’Argent et le bleu de Coomassie. Ils constatent que certains peptides contenant une sulfatation ne sont colorés

Figure 1: mécanisme proposé pour la sulfatation des peptides par la coloration au nitrate d’argent. Le thiosulfate de sodium réduit l’ion argent en un intermédiaire métallique réactif qui va faire l’objet d’une attaque nucléophile par une paire d’électrons isolés d’un résidu hydrolylé; ici la sérine. L’intermédiaire formé par le thiosulfate peut réduire un second ion argent proche d’un résidu acide pour produire Ag2S nécessaire pour visualiser les protéines séparées par le gel et libère un peptide sulfaté

Figure 1: analyse du peptide TSTEPQ(p)YQPGENL. Calibration de la phosphorylation en MALDI-TOF du peptide en fonction du mode et de la matrice utilisée (noir: CHCA, gris foncé: DHB, gris clair: THAP)

Mode positif Mode négatif

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qu’au nitrate d’Argent (mécanisme de la coloration figure 1). La sulfatation est une modification post traductionnelle très peu retrouvée et qui présente de fortes similitudes avec la phosphorylation ; incrément de masse et ajout de charge identiques (fig. 2).

L’utilisation d’un système de MS orbitrap, capable de différencier les masses à 1/10000ème, est un des seuls moyens pour différencier ces deux modifications. Les auteurs se sont demandés si les sulfatations identifiées ne seraient pas un artefact dû à la coloration au nitrate d’argent. Pour vérifier cette hypothèse ils ont étudié l’effet du traitement de pré-coloration au thiosulfate de sodium, montrant qu’il induit une sulfatation artéfactuelle des protéines.

Le pré-traitement au thiosulfate de sodium qui intervient initialement pour augmenter la sensibilité de détection au nitrate d’argent. Bien qu’il induise une coloration de certains peptides sans modification, les auteurs montrent qu’il peut également induire des artéfacts de sulfatation. Cependant cette étude soulève un problème dans l’analyse des modifications post traductionnelles. En effet dans de nombreuses publications portant sur l’indentification de phosphorylation protéique, les analyses n’ont pas fait intervenir un système orbitrap. Aux vues des fortes similitudes entre la phosphorylation et la sulfatation, on peut se demander si toutes les phosphorylations identifiées en sont réellement… Autres modifications Généralités

En dehors des phosphorylations et de la glycosylation , il existe d’autres modifications post- traductionnelles caractérisées par l’ajout de petites molécules. Quelques exemples sont cités ci-dessous.

Sulfatation de la tyrosine

Nous avons vu que la sulfatation des tyrosines pouvait être une modification post-

traductionnelle importante pour la médiation des interactions protéine-protéine dans l’espace extracellulaire. Un groupement sulfuryl est transféré du PAPS (3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate) vers le groupement phénol de la tyrosine grâce au TPSTs (tyrosylprotein sulfotransferases) ; ceci résultant en un incrément de masse de 80 Da en SM (fig. 1).

Figure 2 : Comparaison des caractéristiques de la phosphorylation et la sulfatation.

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La sulfatation et la phosphorylation conduisent à des ions isobares. Ainsi, Yu et al. ont

appliqué une stratégie permettant de discriminer ces modifications. Les auteurs ont utilisé la propriété de labilité des sulfotyrosines dans les conditions de MS/MS (température élevée et pH faible). Tout d’abord, les groupements hydroxyl des tyrosines libres sont acetylés par du S-NHSAc (sulfosuccinimidyl acetate) en présence d’imidazole à pH 7 (fig. 2). Ensuite, l’analyse en MS permet la perte des groupements sulfuryl des résidus de tyrosine O-sulfatés. Enfin, les sites de sulfatation sont déduits à partir des résidus tyrosine libre après analyse MS/MS.

Les auteurs ont appliqué cette stratégie notamment sur un peptide modèle, la cholecystokinine (Tyr-CCK-8 ; (DY(SO3H)MGWMDFY). L’analyse MS a mis en évidence la présence de deux sites d’acétylation (fig.3a et b). Yu et al. ont déduit le site de sulfatation sur le résidu tyrosine 2 après analyse MS/MS à partir de l’ion parent m/z 1311.5 (fig. 3c et d).

1302.28 Da

Δ84=42*2 Da

1386.32 Da

1311.5-y8 = 157.1 = Asp (115)+42 y7-y8 = Tyr(163)

1311.5-b8 = 223.1= Tyr (163.17)+18+42

1302.28 Da

Δ84=42*2 Da

1386.32 Da

1311.5-y8 = 157.1 = Asp (115)+42 y7-y8 = Tyr(163)

1311.5-b8 = 223.1= Tyr (163.17)+18+42

PAPS

SO3-

TPST1ou TPST2

SO3-

Figure 1 : Schéma de la réaction de sulfatation d’un résidu tyrosine. Les TPSTs (tyrosylprotein sulfotransferases) catalysent le transfert d’un groupement sulfuryl à partir du PAPS (3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate).

Figure 2 : Stratégie de détermination de sites de sulfatation de tyrosine. Les résidus tyrosine non sulfatés sont acétylés par une réaction avec du S-NHSAc catalysée par de l’imidazole. L’analyse par MS permet d’éliminer les groupements sulfuryl des tyrosines sulfatées tandis que les tyrosines acétylées restent stables. Les sites de sulfatation sont ensuite déduits après analyse MS/MS à partir des tyrosines libres.

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Acétylation de la lysine

L’acétylation des protéines histones est une modification post-traductionnelle

importante car elle permet l’activation de la transcription. Celles-ci sont acétylées sur les résidus lysine en position N-terminale ou au sein de la chaîne polypeptidique. Catalysée par une acétyltransférase, l’acétylation correspond à l’ajout d’un groupe acétyl à partir de l’acétyl-CoA (fig. 4). L’incrément de masse observé sur les spectres MS est donc de 42 Da.

La méthode basique pour la détermination des sites d’acétylation d’une protéine

consiste en une digestion enzymatique puis une analyse MS de certains peptides. Seuls les ions d’intensités les plus fortes sur le spectre MS sont ensuite soumis à une analyse MS/MS. Cette stratégie présente cependant un inconvénient puisque certains peptides portant une acétylation risquent de ne pas être sélectionnés pour l’analyse MS/MS. Une des méthodes existant pour repérer des peptides acétylés consiste à utiliser de l’acétyl-CoA marquée ([13CD3-13CO]-acetyl-CoA) qui apporte un incrément de masse de 5 Da au groupe acétyl. (Wu et al). Les auteurs ont synthétisé cette molécule et réalisé des réactions d’acétylation de protéines histones en présence d’acétyltransférase et d’un mélange équimolaire d’acétyl-CoA marqué et non marqué. Ce marquage résulte en un incrément de masse de 5 Da des peptides acétylés observable après une digestion enzymatique et une HPLC en phase inverse couplée à une ESI-MS. Le logiciel DeltaFinder permet de repérer sur les spectres MS les doublets ayant des différences de masse spécifiques de 5n-Da (n correspondant au nombre d’acétylations). Ainsi, les peptides potentiellement acétylés sont repérés et soumis à l’analyse MS/MS pour localiser les sites d’acétylation.

Figure 4 : Schéma descriptif de l’acétylation d’une lysine terminale ou dans la chaîne polypeptidique. Le groupe acétyle a un poids moléculaire de 42 Da.

Figure 3 : Détermination des sites de sulfatation du peptide modèle cholecystokinine (Tyr9-CCK-8 ; (DY(SO3H)MGWMDFY). a : spectre MS (mode négatif) de la cholecystokinine. b : spectre MS (mode négatif) de la cholecystokinine après traitement au S-NHSAc et à l’imidazole. c : spectre MS/MS de la cholecystokinine après acétylation et desulfatation. d : séquence du peptide après traitement et MS/MS.

18

Les auteurs ont analysé notamment le peptides histone H3 (acides aminés 1 à 20) (fig. 5).

Le spectre montre que le peptide histone H3 ne présente qu’un site d’acétylation. Ce site est ensuite localisé par analyse MS/MS à partir de l’ion précurseur m/z 466.48 du peptide H3 non marqué (fig. 6).

Les auteurs ont localisé l’acétylation sur le résidu de lysine 18. Après vérification, seuls les intensités obtenues pour les ions b18

4+ et b153+ permettent de confirmer ce résultat.

H3 natif: M= 2285,4 Da

H3 acétyléM= 2327,4 Da

Δm 5 Da

Δm = 42 Da

Δm/z= 9,40

Δm/z = 8,40

H3 acétylé*: M= 2332,4 Da

H3 natif: M= 2285,4 Da

H3 acétyléM= 2327,4 Da

Δm 5 Da

Δm = 42 Da

Δm/z= 9,40

Δm/z = 8,40

H3 acétylé*: M= 2332,4 Da

Figure 6 : Spectre MS/MS du peptide histone H3 (acides aminés 1 à 20) à partir de l’ion précurseur m/z 466.48. Masse attendue : MacK = 170 Da b18

4+ M=1965.56 Da b15

3+ M= 1542.24 Da y4-NH32+ M= 526.22 Da y3-NH3+ M= 362.11 Da

Figure 5 : Spectre MS du peptide histone H3 (acides aminés 1 à 20). L’incrément de masse entre le peptide H3 natif (M= 2285.4 Da) et le peptide acétylé (M= 2327.4 Da) est de 42 Da. L’incrément de masse entre le peptide non marqué et le peptide marqué (M= 2332.4 Da) est de 5 Da.

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Formation de déhydroalanine

La déhydroalanine se forme à partir d’une cystéine libre non impliquée dans un pont disulfure. L’équipe de Bar-Or et al. a essayé d’identifier la modification post-traductionnelle présente sur la cystéine libre (34éme) de la HSA (human serum albumin). Ils ont pu caractériser trois formes par LC-MS : la forme libre (R-SH), la forme cystéinylée (forme un pont disulfure avec une cystéine exogène) et la forme déhydroalanine (R=CH2) (fig. 7).

Afin d’identifier la présence d’une déhydroalanine, les auteurs ont réalisé un traitement au DTT pour réduire les ponts disulfures suivi d’une carboxyméthylation avec de l’acide iodoacétique afin d’ajouter un groupement acétyle (58Da) sur le soufre des cystéines libres. La protéine a été par la suite digérée à la Trypsine. Enfin, un spectre MS/MS a été réalisé sur le peptide contenant la 34éme cystéine (fig. 8). Deux formes ont été caractérisée, la forme carboxyméthylée et déhydroalanine. La forme carboxyméthylée correspondant a une cystéine libre dérivée par l’acide iodoacétique et la déhydroalanine provenant de la figure 7 montrent l’identification de ses deux acides aminés (résidu dha = 69 ; résidu Cys carboxyméthylé = 161) dans la séquence peptidique (RPCFSALEVDETYVPK) considérée. Les auteurs ont par la suite, interprété le spectre présenté dans la figure 8.

Figure 7 : Spectre LC-MS de la protéine HSA non traité. 3 formes : libre, déhydroalanine (DHA) et cystéinylée. 34,5 = perte du SH DHA 118,5= Cys exogéne Cystéinylée

Figure 8 : Spectre MALDI-MS/MS du peptide RPCFSALEVDETYVPK de la HSA. A : forme déhydroalanine (dha). B : forme carboxyméthylée (cm) cys libre.

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QUANTIFICATION EN SPECTROMETRIE DE MASSE DES PROTEINES Techniques de quantification protéique en MS

Quantification absolue : AQUA

Récemment des techniques impliquant la spectrométrie de masse ont été développées afin de permettre la quantification absolue de protéines. La méthode AQUA est une stratégie de quantification absolue de protéines. Elle utilise des peptides synthétiques marqués avec des isotopes lourds (13C, 15N), qui miment les peptides natifs formés lors de la protéolyse de la protéine, comme des standards internes. Ces standards internes AQUA permettent la quantification d’une protéine donnée après protéolyse par la technique de SRM (Selected Reaction Monitoring) en MS/MS. Li et al. ont mis au point une méthode qui permet la quantification d’une protéine membranaire MRP2 (Multidrug Resistance Protein), retrouvée à la membrane caniculaire, qui est supposée être responsable de grandes variations inter-espèces observées au niveau pharmacocinétique. La méthode développée pour sa quantification utilise la LC-MS/MS afin de retrouver un peptide « protéotypique» à partir d’un échantillon de MRP2 enrichie par immunoprécipitation et digéré à la trypsine (fig. 1). Un peptide protéotypique est un peptide généré par la digestion enzymatique (trypsine), d’une protéine donnée de façon reproductible et spécifique vis à vis de la protéine et qui est intense dans un spectre MS. Le peptide protéotypique identifié pour la MRP2 est -LTIIPQDPILFSGSLR-.

Un standard interne marqué avec des isotopes lourds (SIL) et un standard externe

non marqué, de même séquence que le peptide protéotypique, ont été synthétisés. Leur différence de masse est de 7 Da. Après une étude des spectres MS/MS des deux peptides synthétiques, les transitions a suivre lors de la SRM ont été déterminée (m/z 885,9>m/z1331,8 et m/z889,5>m/z1338,8). Il a été choisi de mesurer l’intensité du pic de m/z 1331,8 pour le peptide synthétique et de m/z 1338,9 pour le SIL.

Figure 1. Méthodologie employée par Na Li et al, dans le développement de la stratégie de quantification de la protéine membranaire MRP2. La protéine MRP2 humaine est surexprimée dans des cellules canines MDCK. L’échantillon est enrichie en MRP2 par immunoprécipitation et digéré à la trypsine. Un peptide protéotypique a été déterminé par LC-Q-TOF-MS. Un standard interne et externe, qui miment le peptide protéotypique ont été synthétisé et ont servi dans le développement de la méthode de quantification de MRP2 par LC-MS/MS en mode SRM (Selected Reaction Monitoring).

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Figure 2. A. Séquence du peptide protéotypique. Lors de la synthèse du peptide SIL une leucine marquée radioactivement a été icorporée et est responsable de la différence de 7Da entre le peptide SIL et le standard externe. B. Massif isotopique du peptide protéotypique C. Spectre de fragmentation du peptide synthétique non marqué (standard externe) D. Spectre de fragmentation du peptide synthétique marqué SIL (standard interne).

La sensibilité de la méthode a été estime par la LOQ à 31,25 pM. Cette méthode a été utilisée pour mesurer la quantité de MRP2 humain surexprimée dans des cellules MDCK canines (1ng MRP2 pour 1 μg de protéines totales).

Marquage isotopique in vivo pour quantification relative: ISIS (Isobaric SILAC with Immonium Ion Splitting)

Cette technique est basée sur la méthode SILAC (Stable Isotope Labeling with

Amino Acids in Cell Culture). C’est une méthode de marquage métabolique qui utilise des paires d’acides aminés marqués ou non avec des isotopes lourds afin d’introduire des différences de masse prédites dans les échantillons protéiques à comparer. Dans la méthode ISIS, les peptides des 2 échantillons ont la même masse nominale et le même spectre MS. Il y a donc co-fragmentation des précurseurs mais c’est lors de la génération d’ions immonium issus de cette fragmentation que l’on va observer une différence de masse et faire une quantification relative des protéines parentes.

Les cellules sont mises en culture en présence des acides aminés Valine, Leucine et Isoleucine marqués soit par un 13C sur le carbone de l’acide carboxylique (culture A) soit par un 15N sur l’amine N-terminal (culture B, fig. 3A). Ces acides aminés ont été choisis pour leur grande abondance dans les protéines. Les cellules vont subir environ 6 divisions ce qui va permettre le marquage d’environ 98% des protéines totales. Les lysats cellulaires issus des 2 conditions testées sont ensuite mélangés et soumis à une digestion trypsique.

Δ7Da [13

C615

N1]

A B

DC

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A

Figure 3 : Schéma général de la méthode ISIS (A) 2 conditions sont testées : les cellules sont cultivées en présence de Leucine, Valine et Isoleucine marqués soit par un C13 soit par un 15N. (B) La formation d’ions immonium va conduire à la détermination de ratio reliés à la quantité de protéine dans les conditions testées

Les ions immonium sont spécifiques des résidus du peptide parent. Dans ce cas, on observe une différence de masse atomique de 1 unité entre deux ions issus de la même protéine mais des deux conditions différentes. Le même peptide dans les 2 conditions va avoir le même incrément de masse, soit du au carbone soit à l’azote (masses isobares), mais les ions immonium issus des Val, Leu et Ile auront des masses différentes (fig. 3B). Cette méthode a été utilisée par Colzani et al., afin de mesurer la différence d’expression protéique entre deux types de mélanomes à des stades différents.

Le peptide contrôle chargé 3+ contient une valine et une isoleucine. Ce peptide marqué au 13C subit une modification de masse conduisant à un décalage des pics de 0,33m/z vers la droite. Ce même phénomène est observé lors du marquage 15N avec une plus grande abondance des peptides lourds du à l’incorporation de l’azote lourd dans les autres acides aminés (A). On peut observer la détection des ions immonium légers sur des protéines non marquées avec une intensité fiable par rapport à la richesse isotopique naturelle (B). Lors de culture en 13C, il n’y a pas de modification du spectre MS/MS car pas de modification de masse des ions immonium. Au contraire en (B) H (marquage 15N), on a une modification de masse des ions immonium conduisant à une inversion du spectre.

Les auteurs arrivent ainsi à identifier 26 protéines dont l’expression est modifiée entre ces deux types cellulaires et donc potentiellement responsables du passage à l’état métastatique. A noter que chaque protéine est représentée par 2 peptides spécifiques identifiés via Mascot.

Sans incrément de masse

Avec incrément de masse

BA

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Figure 4 : Spectres et système reporteur (A) spectre MS d’un peptide contrôle, (B) spectre MS/MS de ce même peptide non-marqué (UN), marqué 13C (L pour light) ou marqué 15N (H pour heavy).

Amélioration de la technique iTRAQ par fractionnement OFFGEL

Le marquage iTRAQ (Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification) permet l’identification et la quantification de protéines in vitro dans 8 échantillons par MS/MS. Les échantillons protéiques subissent au préalable une étape de réduction et alkylation suivie d’une digestion trypsique. Les peptides ensuite sont marqués via le tag iTRAQ puis mélangés et subissent une étape de séparation avant d’être analysés en MS/MS (fig. 6).

A B

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En MS, les ions précurseurs d’intérêts seront isolés, quelque soit la

condition/marquage, puis co-fractionnés car ils possèdent la même masse. On compare ensuite les intensités des Reporters retrouvés sur le spectre MS/MS (fig. 6) dont le rapport conduira à la quantification des protéines parentes.

Les échantillons protéiques sont relativement complexes, ajouter à cela la digestion trypsique, il est nécessaire de procéder à une étape de fractionnement efficace avant le traitement en MS/MS. Ernoult et al. proposent une amélioration de la quantification par la méthode iTRAQ grâce à un fractionnement OFFGEL-IEF-IPG. Cette méthode consiste en une focalisation isoélectrique (IEF) via une électrophorèse en gradient de pH, ceci est fait à partir d’un gel de gradient de pH immobilisé (IPG) en OFFGEL.

Groupement Reporter

Peptide Reactive Groupe Carbonyl

Figure 5 : Marquage iTRAQ (a) Tag iTRAQ. Il possède une masse constante de 145 u. Le groupement Reporter diffère entre les différentes formes du réactif utilisé (masse de 114 à 117) grâce à un marquage isotopique. La Balance a pour rôle de compenser la différence de masse du Reporter. Sa masse varie de 28 à 31 u selon le Reporter qui lui est associé. Le Peptide Reactive Group (PRG) marque les peptides. (b) Structure du tag. Le groupement Reporter est formé par un groupe N-methylpiperazine. Il possède 2 amines tertiaires qui sont facilement ionisable par MALDI. La balance est composée d’un groupement carbonyle. Le PRG est formé par un groupe NHS-ester (N-Hydroxysuccinimide ester) et réagit avec les amines primaires des peptides (amines Nterm et des chaînes latérales des lysines). Lors de la liaison, on a perte du cycle NHS et formation d’une liaison amide.

(a (b)

Figure 6 : Illustration de la quantification du peptide ANIAILGFIK par iTRAQ Après isolation du précurseur 1347,8473 m/z par MS qui correspond au peptide d’interet, on procède à la MS/MS. On retrouve à gauche les groupes Reporter 117 et 114 qui vont servir à la quantification. Source ?

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Grâce à cette méthode de focalisation isoélectrique hors gel, les auteurs parviennent à identifier une grande proportion de protéines contenues dans un extrait protéique complexe issu d’une lignée de neuroblastome. En combinant marquage iTRAQ et fractionnement OFFGEL, la proportion de protéines identifiées de façon significative est multipliée par 5 par rapport à une méthode classique sans marquage et en fractionnement par SCX (Strong Cation eXchange). Ils identifient les protéines par au moins 2 peptides (recherche de séquence dans des bases de données) qu’ils recoupent avec les données de pI fournies par l’expérience. Enfin ils observent que le marquage iTRAQ améliore l’ionisation en MALDI, que la combinaison avec le fractionnement OFFGEL permet de diminuer le bruit de 6 fois environ, tout en diminuant la quantité de matériel soumis à l’analyse par 2. Applications à l’environnement médical.

Généralités Un des grands enjeux de la spectrométrie de masse est son potentiel d’application

clinique, du point de vue du dépistage et/ou du diagnostique, du à sa sensibilité, sa spécificité et sa rapidité de mise en oeuvre dans la détection et le dosage de protéines biomarqueurs de pathologies. Elle est généralement fondée sur la séparation des protéines contenues dans un mélange complexes d’un fluide corporel, par chromatographie liquide haute performance (HPLC), couplée à l’analyse par MS en tandem. La possibilité de synthétiser des protéines par génie génétique ainsi que la synthèse de peptides marqués, et l’incorporation d’isotopes lourds (15N, 13C, 2D), ont permis le dosage de tels marqueurs.

Bondar et al. ont par exemple pu mettre au point un système de détection et de quantification d’une glycoprotéine, la Zinc-alpha 2 (Zn-α2) ou peptide ZAG, biomarqueur du

Figure 7: Principe de la focalisation OFFGEL On applique un courant électrique sur un gel IPG créant ainsi un gradient de pH. L’échantillon protéique est mélangé à un tampon de focalisation contenant des espèces ampholytes puis déposé dans les micro-puits au-dessus du gel. Les protéines ou peptides vont se stabiliser dans la zone de pH correspondant à leur pI. Pour cela ils vont diffuser entre les micro-puits à travers le gel poussés par les ampholytes. A l’équilibre, le contenu des micro-puits est transféré en micro-tube puis concentré par speed-vac.

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cancer de la prostate. Pour celà, ils ont tout d’abord produit et purifié cette protéine de manière recombinante dans les cellules CHO (Chinese Hamster Ovaries). La protéine a ensuite été réduite, alkylée et digérée par la trypsine, les peptides séparés par HPLC et le processus de fragmentation étudié par MS/MS. Les ions précurseurs et fragmentés caractéristiques ainsi produits ont été sélectionnés, et l’ion fragmenté donnant la réponse la plus fiable suivi par SRM (Single Reaction Monitoring). Cette méthode, couplée à la synthèse d’un peptide utilisé comme étalon interne et correspondant à l’ion fragmenté sélectionné mais marqués par les isotopes 13C et 15N lui donnant un incrément de masse, a permis l’individualisation des pics correspondant aux deux peptides et la quantification du biomarqueur. La quantification a pu être réalisée directement sur les séra de patients et déterminée par une courbe de dose-réponse du ratio correspondant à l’abondance relative du peptide ZAG sérique et celle de l’étalon interne. Cette étude, selon les auteurs, a permis de baisser le seuil de détection obtenu en ELISA jusqu’alors, en obtenant une LOD (Limit Of Detection) d’environ 30% inférieure.

D’une façon analogue, Singh et al. , ont pu quantifier l’albumine urinaire dans le cadre de la détection de la microalbuminurie. La levure Pichia pastoris a été utilisée pour synthétiser une HSA (Human Serum Albumin) marquée complètement à l’azote 15 (15N). Les fragmentations de la HSA marquée et non marquée ont été étudiées et caractérisées par Q-TOF, et les ions donnant les meilleures intensités ont été sélectionnés. Cependant comme la Q-TOF n’est pas adaptée pour l’analyse clinique, la MS (triple quadrupole) a été choisie pour l’analyse en routine. Les ions non marqués b24

4+ (m/z = 685.1) et b243+(m/z = 693.6)

correspondant au fragment N-terminal ont été sélectionnés pour la quantification de la HSA en utilisant les ions 15N35-b24

4+(m/z = 913.2) et 15N35-b243+ (m/z = 924.1) de la 15N-HSA

comme étalon interne. Les LOD et LOQ (Limit Of Quantification) obtenues par les auteurs sont plus basses (de l’ordre de 20%) que celles des méthodes immunochimiques et chromatographiques utilisées pour ce marqueur. Cependant les mesures de répétabilité (CV intra-day ; n = 20, 12.6% (17 mg/L), 10.1% (70 mg/L), et 4.0% (210 mg/L)) et de reproductibilité (CV inter-day ; n = 10, 12.2% (19 mg/L), 11.0% (80 mg/L), et 7.1% (230 mg/L)) limitent la précision de la méthode. Deux études ont été sélectionnées pour illustrer de façon plus détaillée les potentialités qu’offre la spectrométrie de masse dans le domaine du dépistage clinique.

Détection et quantification du facteur létal de l’anthrax dans le sérum par spectrométrie de masse

La bactérie Bacillus Antracis constitue une arme biologique lorsqu’elle est inhalée sous sa forme sporulante. L’infection doit être détectée de façon précoce mais les techniques de diagnostic existantes, bien que sensibles, sont longues (plus de 8 jours). Le léthal-factor (LF) est une protéine enzymatique entraînant l’apoptose des cellules en ciblant les MAP kinases.

Boyer et al. ont quantifié le LF plasmatique en observant son activité sur un substrat peptidique synthétique. Dans un premier temps l’enzyme a été purifiée par capture à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-LF. Puis différents substrats peptidiques (fig. 8) pour LF ont été synthétisés par alignement de ses substrats naturels (MAPK) et le meilleur substrat a été sélectionné (meilleur m/z des fragments clivés produits, rapidité de la réaction, etc), à savoir le LF4 (fig. 9).

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Figure 8 : Séquences des peptides synthétisés. LF clive les peptides synthétiques en 2 parties N-term et C-term.

Figure 9 : Spectre de masse du peptide LF-4 en présence de LF. On observe une diminution de la quantité LF-4 et une augmentation de la quantité des fragments peptidiques C-term et N-term produits.

Après avoir déterminé le meilleur substrat et montré que l’activité enzymatique du facteur létal était constante en fonction du temps, la quantification du facteur a été réalisée à l’aide d’un standard interne marqué chimiquement. Ici l’isotope utilisé est la partie N-terminale du peptide LF-4 comprenant trois 13C, trois 2D et un 15N donnant un incrément de masse de 7 Da (fig. 10).

Figure 10 : Spectre de masse du fragment N-terminal de LF-4 et de son homologue peptidique marqué.

Ainsi, ce test apporte une triple spécificité, à savoir la reconnaissance et la purification du factor létal par un anticorps, le dosage par l’activité de clivage de l’enzyme, et la spécificité de l’analyse MALDI-TOF. Il permet de détecter le LF en 4h, avec un seuil de détection de 0,05 ng/ml, soit 400 fois moins qu’en ELISA (20 ng/mL).

Mise au point d’un test de dépistage de la maladie de Wilson par LC-MS/MS.

La maladie de wilson est une maladie rare et est provoquée par une mutation dans le

gène ATP7B qui code un transporteur ATPase du Cu2+ localisé dans le réticulum endoplasmique. Cette protéine permet au cuivre de se complexer à l’Apocéruloplasmine pour former la Céruloplasmine, qui est sécrétée. La mutation entraîne une perte de fonctionnalité de la céruloplasmine qui transporte et régule 90% du Cu2+ sérique, ce qui provoque une accumulation de ce dernier entrainant un tableau clinique chez le patient pouvant conduire à la mort. Comme toutes les maladies rares, un dépistage systématique n’est pas recherché, et

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c’est dans le but de palier à ce problème que deWilde et al. se sont intéressés à une technique permettant un dépistage précoce, simple et fiable chez le nouveau-né.

La méthode utilisée pour le dépistage est basée sur la quantification par UPLC-MS/MS du biomarqueur sérique de la maladie de Wilson, la Céruloplasmine (132kDa), à partir d’une goutte de sang sêchée (DBS, Dried Blood Spot).

Dans un premier temps les ions utilisés pour la quantification ont été sélectionnés par une analyse Q-TOF et trappe à ions d’un digestat trypsique de la Céruloplasmine, séparé par chromatographie liquide ultra-haute performance. Les ions précurseurs et les ions fils produits ont été sélectionnés sur l’intensité des pics obtenus, sur l’absence de résidu Cystéine (formation de ponts disulfures pouvant masquer certains sites de clivage à la trypsine et entrainant une digestion incomplète), sur leur « ion score », ainsi que sur la base du rapport m/z. A partir de ces résultats, trois peptides ont été synthétisés chimiquement, dont deux ont été choisis comme étalons internes pour la quantification. Ce sont des peptides marqués de P-1 et P-2 (respectivement P-1-IS et P-2-IS, tableau 1) conférant un incrément de masse de +8 Da pour P-1-IS et +10 Da pour P-2-IS qui ont été utilisés pour la quantification par LC/MS-MS.

Tableau 1 : Séquences des peptides P-1, P-2, P-1-IS et P-2-IS. La masse moléculaire de chaque peptide, le m/z de leurs ions précurseurs et des 4 ions utilisés pour la MRM sont indiqués.

De plus, l’étape de digestion trypsique a été optimisée, de sorte à ce la Céruloplasmine soit totalement digérée pour ne pas sous-estimer sa quantité. Pour se faire, il y a eu nécessité de dissocier les complexes éventuels, de solubiliser la protéine (surtout si elle est hydrophobe) et de la dénaturer. L’utilisation de PPS comme détergent compaptible avec la MS-MS, et l’acétonitrile comme solvant solubilisant à permis la réalisation de ses étapes

L’étape de séparation des peptides issus de la digestion trypsique a également été optimisée en diminuant les temps de rétention de ces peptides en chromatographie liquide ultra-haute-performance (fig. 11). Cette optimisation s’est accompagnée d’une perte de signal du peptide P-2, résultant d’une mauvaise rétention par la phase stationnaire et donc d’une élution prématurée.

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Figure 11 : La séparation est effectuée par UPLC sur une colonne C-18 dans un gradient linéaire d’ACN de 0 à 25% .Les 3 chromatogrammes présentés correspondent à des temps de séparation différents : 50 min, 10 min, 7min.

Ainsi la quantification des peptides trypsiques de la céruloplasmines a seulement été effectuée avec P-1-IS (fig. 12). La détermination de la quantité effective de Céruloplasmime dans les extraits de sang d’enfants malade et sains a été permise par l’établissement d’une courbe de calibration des peptides P-1 d’une Céruloplasmine produite par génie génétique.

Figure 12 : Spectre de masse de P-1-IS avec son ion précurseur à m/z=600.7 sur le premier spectre et ces 4 ions fils analysés en MRM sur le second.

Les résultats obtenus, selon les auteurs, pemettent à partir d’une faible quantité de matériel de départ (3,2 µL de sang séché) de quantifier la Céruloplasmine plasmatique à partir de 7 ng/µL en un minimum de temps (7 min). Ces données laissent entrevoir une utilisation à plus grande échelle sur d’autres biomarqueurs dans le dépistage de maladies chez les nouveaux-nés.

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APPLICATIONS Applications médicales

Modifications post-traductionnelles.

Analyse des modifications post-traductionnelles par ECD : La dissociation par capture d’électron est une nouvelle technique de fragmentation utilisée dans la spectrométrie de masse FT-ICR. L'un des grands attraits de l'ECD repose sur sa capacité à rompre des liaisons amides dans des peptides tout en laissant généralement intactes des liaisons plus "faibles", que ce soient celles de glycosylations, phosphorylations et même certaines liaisons hydrogène intra et intermoléculaires.

Les polypeptides doivent être initialement au moins doublement chargés positivement pour pouvoir être détectés en spectrométrie de masse. En effet, la capture électronique provoque la perte d’une charge positive et l’obtention d’un ion radicalaire. Ces polypeptides capturent un électron ce qui est suivi d’une neutralisation de charge provocant un clivage rapide des radicaux. Cette fragmentation va se faire sur la liaison N–Cα, donnant préférentiellement des fragments c’ en N-terminal (le simbole ‘ indique le transfert de H˙ avant la fragmentation) et des fragments z˙ en C-terminal (Fig. 1). Dans tous les cas, les fragments obtenus par ECD semblent retenir plus de groupes labiles (modifications post-traductionnelles) que la CID MS/MS.

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Figure 1: Formation des fragments c’et z· par le mécanisme ECD. La capture de l’électron se fait par un site chargé, donc normalement les résidus His, Arg, Lys, ou groupes N-term. L’électron célibataire va rapidement cliver la liaison N-H ce qui va créer un atome d’hydrogène de haute énergie. Le groupe carbonyl amide va être le site préferentiel pour la capture de l’atome d’hydrogène, et cela va provoquer la formation d’un radical de haute énergie qui va alors provoquer un clivage de la liaison N-Cα. Le peptide N-term fragmenté va représenter les ions de type c, et le C-term les ions de type z. Un exemple de détection de modification sur une protéine avec ECD est présenté pour l’oxydation de l’enzyme hBAT par le lipide électrophile 4HNE (lipide présent en grandes quantités dans les tissus animaux pendant le stress oxydatif) (Barnes et al.). La modification sur la protéine apporte la formation d’une addition de Michael (+m/z = 156,1105).

Figure 2: Étude ECD LTQ-FT-MS/MS du peptide hBAT A335H*AEQAIGQLKR346 ; Produit lors d’une addition de Michael sur une Lysine. Observation de la modification de l’Histidine 336 par addition de Michael. L’ion c2 correspond à ΣRA-H +18 = 226.130 + 138,104 (ce qui correspond à une addition de Michael deshydratée : 156,1105 – H20 = 138,104). Les fragments z correspondent à la ΣR + 2 + 1 (z˙ + H˙ = ion z˙ + 1).

Recherche de biomarqueurs

L’apport de la spectrométrie de masse pour l’étude des biomarqueurs devient de plus en plus important. En effet, la détection de profils protéiques d’utilité pronostique et diagnostique dans les sérums et les tumeurs de patients suscite depuis peu un intérêt considérable et devrait permettre à terme une amélioration de la prise en charge du malade. Les analyses protéomiques reposent principalement sur des méthodes de comparaison de profils protéiques d’échantillons sains et malades en vue de détecter des différences de précense de certaines protéines provoquées par la pathologie. L’avantage de ces études protéomiques et qu’il n’y a besoin que du sérum et ce n’est donc pas une méthode invasive.

Un exemple est la recherche de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer de pancreas (Kojima et al.). Pour ces études, des échantillons de sérum sont utilisés. Le problème qui se pose est qu’ils contiennent certaines protéines sérologiques qui sont très abondantes. Pour éliminer les protéines les plus abondantes et permettre une analyse plus précise, une colonne d’immunoaffinité se réalise avec IgY12. L’échantillon obtenu est alors désalé et concentré avec C18 Macrotrap et ensuite fractionnés avec une colonne HPLC C4. Les fractions sont alors analysées par MALDI-TOF. Dans cette étude, les profils de MALDI-TOF obtenus pour des patients atteints de cancer, de pancreatites et sains, sont comparés. Un des pics qui

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présente des intensités différentes pour chacun des trois cas (m/z = 9713), est récupéré sur gel et trypsinisé pour une étude MALDI-MS/MS (fig. 3).

Figure 3: MALDI-MS de la protéine d’intérêt. Les pics obtenus correspondent à des fragments c. L’analyse du spectre montre une séquence avec une modification sur la thréonine 74 (GalGalNAC-Sia-Sia). La comparaison avec base de données montre que les résultats correspondent au profil de l’apolipoprotéine CIII2.

Donc Apo CIII2 pourrait constituer un biomarqueur pour distinguer entre la pancreatite et le cancer de pancréas. Par contre il serait nécessaire de confirmer cette étude avec un plus grand nombre d’échantillons (seulement 24 patients atteints de cancer sont analysés). De plus on trouve dans la littérature beaucoup d’études qui se basent dans la comparaison de profils MS, comme celui-ci. Ceci est bien une erreur, puisque ces profils ne peuvent pas être comparés sans standard interne, sachant qu’il y a toujours de variations entre les expériences (expérimentateur et machine).

Une nouvelle méthode utilisée dans le but de pouvoir faire des études comparatives entre différents profils protéiques et peptidiques de cas cliniques, est le SELDI-TOF (Surface-Enhanced Laser Desorption Ionisation). Il s’agit d’une approche adaptée aux stratégies de « profiling » protéique. Cette technique consiste à fixer les protéines de manière sélective sur de petites surfaces chromatographiques (échangeuses d’anions dans le cas présent), les protéines retenues sont ensuite analysées en MALDI-TOF. Il a été utilisé pour identifier des biomarqueurs caractéristiques de patients schizophrènes afin d’aider à la compréhension des mécanismes pathologiques de cette maladie. (Jeffrey et al.). Pour cela les auteurs ont récupéré des échantillons de liquide céphalo-rachidien de 50 patients sains et 51 patients schizophrènes.

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Figure 4: Comparaison des spectres SELDI-MS de protéines/peptides du liquide céphalo-rachidien des patients malades et sains. Les auteurs s’intéressent au pic correspondant à m/z= 3958,90, puisqu’il présente une différence d’intensité pour les deux cas comparés. Ensuite les protéines des mêmes échantillons sont sélectionnées à nouveau sur les barrettes de SELDI et analysées par nanoLC-ESI-MS/MS (Q-TOF) en sélectionnant le pic correspondant à m/z= 3958,90 (fig. 5).

Figure 5 : Spectre partiel en nanoLC-ESI-MS/MS (Q-TOF) du peptide 3959,90 Da. Observation de fragments y et b, mais aussi de fragmentations internes notées biyj. Par exemple b24y30 correspond à : PPLSSEHKEPVAGD ΣR + 1 (1 qui provient du proton ajouté dans la partie N-term du fragment interne obtenu)= 1444,64.

En SELDI, les échantillons sont traités en même temps et de la même façon permettant, selon les utilisateurs des comparatifs. Mais le problème est la reproductibilité réelle des données générées. En effet, si la variabilité intra-essai de cette méthode reste moyennement acceptable, la variabilité inter-essai dans le temps semble plus problématique.

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Applications en protéomique végétale

Généralités L’extrême dilution des ressources nutritives dans l’environnement (CO2, ions

minéraux, et souvent eau) fait que la plupart des cellules d’une plante sont directement confrontées aux conditions environnementales, contrairement à leurs homologues du monde animal, protégées par l’homéostasie du milieu intérieur. Les cellules des plantes supportent les conditions agressives d’un milieu extérieur continuellement fluctuant, grâce à des adaptations aux stress environnementaux variés et fréquents (carences en nutriments, stress hydrique, excès ou défaut de lumière, fluctuations brutales de la température, agressions par une grande diversité d’agents pathogènes, etc.). Ces adaptations sont une marque distinctive du métabolisme végétal. Dans toutes ces conditions, l’expression du génome varie considérablement, conduisant à une grande diversité des protéomes cellulaires et subcellulaires en réponse à ces modifications de l’environnement. L’analyse protéomique est un outil puissant qui peut être utilisé dans de très nombreux domaines, tant au niveau d’études fondamentales qu’au niveau d’études appliquées en particulier en biologie végétale et pour l’agriculture. Le but d’une approche protéomique consiste à avoir une vision plus globale et donc plus juste du fonctionnement de la cellule mais aussi de caractériser les protéines d’un compartiment subcellulaire ou d’identifier de nouvelles protéines et donc de nouveaux gènes, en particulier pour les organismes dont le génome n’a pas été séquencé. Enfin, il faut préciser que si l’intérêt manifesté actuellement pour la protéomique n’est pas propre aux modèles végétaux, de nombreuses équipes de cette discipline ont contribué de manière significative à son développement résultant en des applications «classiques» de MS.

Identification des changements du protéome dans des feuilles de blé, en réponse à un stress salin par établissement de cartes peptidiques massiques.

L’excès de sel dans les sols est un des principaux stress abiotiques pour l’agriculture. Partout dans le monde, respectivement 20 et 50 % des zones cultivées et irriguées sont concernées par ce problème, qui, en affectant la croissance et le développement des plantes, représente une véritable limite à une productivité agricole optimale. Dans ce cas, le but de l’analyse protéomique comparée, entre une culture témoin et une culture test, va être d’identifier les protéines impliquées dans la tolérance au stress, avec, comme enjeux, la caractérisation des variétés de blé les plus résistantes et ainsi l’amélioration des rendements de production. Cette étude a été réalisée par Giuseppe Caruso et al., De façon classique, la protéine est digérée par une protéase spécifique (la trypsine), les masses des peptides obtenus sont mesurées avec une grande précision par spectrométrie de masse MALDI-TOF, l’ensemble de ces masses constituant sa carte peptidique massique et qui s’avère être une véritable empreinte digitale de la protéine (fig.6). Cette protéine peut ensuite être identifiées en comparant la carte peptidique obtenue expérimentalement aux cartes théoriques présentes dans les banques de données.

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Identification des protéines des feuilles de riz dont l’expression est induite en réponse au froid par séquençage peptidique par spectrométrie de masse en mode tandem.

Une basse température est un autre des principaux facteurs environnementaux limitants pour les plantes, qui génèrent dans ce cas des ROS (anion superoxyde, peroxyde d’hydrogène, oxygène singulet) entraînant la dégradation des composants de la cellule, d’ou des diminutions significatives de croissance et donc de rendements des cultures agricoles. L’enjeu de Dong-Gi Lee est donc de pouvoir générer des plantes transgéniques plus résistantes au froid, par la découverte de nouvelles protéines impliquées dans cette résistance.

Dans le cas de protéines inconnues, c’est à dire non répertoriées dans les banques de données, l’identification par carte peptidique est inopérante. On utilise la MS/MS permettant de sélectionner un à un les peptides provenant de la digestion trypsique de la proteine étudiée. Chaque peptide est alors fragmenté et l’analyse de ces fragments permet de déterminer des éléments de la séquence en acides aminés du peptide, séquence qui sera utilisée pour chercher à identifier la protéine dans les banques de données. Ici, la recherche d’une petite partie (PEGLAEW) de la séquence totale d’un peptide (m/z = 859.57) d’une des 14 protéines sur-exprimées lors d’une exposition au froid, a ainsi permis l’identification de la NDPK1 (Nucléoside Di-phosphate Kinase1).

La spectrométrie de masse est très utilisée pour l’étude des modifications post-traductionnelles chez les plantes. En effet, ces modifications sont très nombreuses dans le domaine végétal. Diverses études ont été publiées dont le but est de lister les protéines retrouvées dans les plantes et les modifications qui leur sont associées. Nous allons ici vous développer deux exemples.

Etudes des modifications post-traductionnelles des histones par méthode classique. Parmi les protéines porteuses de modifications, on peut distinguer les histones. Les

variations apportées à ces molécules conditionnent l’état d’expression de l’ADN. Aussi, l’importance de caractériser les différentes modifications est capitale pour bien comprendre quelles sont les régions les plus transcrites.

Ainsi, une étude menée par K.Zhang et al, s’est elle proposée d’identifier les différentes modifications observées sur les histones de la chromatine des plantes. Le modèle choisi est Arabidopsis thaliana et la méthode sélectionnée est la LC-MS/MS.

Dans un premiers temps une chromatographie liquide est faite pour séparer les différentes protéines histones entre eux. Puis chaque histone est indépendamment étudiée par spectrométrie de masse.

Figure 6 : MALDI-TOF M/S : Cartographie peptidique massique d’une des 38 protéines dont l’expression est modifiée suite à l’exposition à un stress salin. Corrélée au pI et à la masse moléculaire déterminés expérimentalement, cette carte permet, via l’interrogation des banques de données (MSDB et NCBInr), l’identification de la protéine « RuBisCo subunit binding protein béta subunit ».

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Ils ont ainsi mis en évidence, des acétylations (Δm=42) et méthylations (Δm=14) sur des lysines, des phosphorylations (Δm=80) sur les sérines. Ils ont également noté que la majorité des modifications sont situées sur la région N-terminale.

Identifications des protéines chloroplastiques et de leurs modifications. L’étude menée par B.Zybailov et al, concernant les protéines chloroplastiques utilise

une technique récente de spectrométrie de masse qui permet une caractérisation fine et très résolutive, la LTQ-Orbitrap.

Cette méthode utilise un dispositif complexe mélangeant la technique de la trappe à ion et celle du quadrupole. Par cette technique, il est également possible de concentrer les ions avant la fragmentation ce qui permet l’étude d’ion de faible taille. Les avantages de l’orbitrap sont multiples mais les principales qualités sont l’augmentation de la résolution engendrée par le faible parcours des ions après la spectrométrie et la forte précision de la masse même pour de faible différence entre les ions obtenus.

Figure 2 : (a) spectre MS/MS du peptide AVSIKPEAGVEGLNIADNAAQLIGK on note un incrément de masse de 42Da soit un ajout une différence de masse correspondante à une acétylation, celle-ci est localisée sur

b

a

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l’alanine N-terminal. (b) ) spectre MS/MS du peptide VSIKPEAGVEGLNIADNAAQLIGK on remarque alors la disparition de la variations de la masse ce qui confirme l’acétylation de l’alanine.

Les auteurs ont ainsi pu caractériser 1 258 protéines de façon formelle et 22 groupes

de protéines homologues. Ils ont également couplés leurs résultats à ceux qu’ils obtiennent avec d’autres techniques de spectrométrie de masse et ont ainsi identifié par alignement de séquences plusieurs séquences consensus pour les signaux de translocation vers le chloroplaste. De même, par comparaison contre les banques de données, plusieurs modifications post-traductionnelles ont été mises en évidences dont des acétylations sur des alanines sur les régions N-terminales.

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CONCLUSION

Malgré les perspectives très intéressantes de la spectrométrie de masse, il est à noter

que certaines limites existent. En effet la préparation des échantillons reste une étape critique, il faut obtenir une protéine la plus pure possible dans le solvant adéquat. C’est pourquoi actuellement de nombreuses publications sont axées sur les techniques de séparation des échantillons en amont. Elle sera choisie en fonction du type d’appareil utilisé et des protéines étudiées. Le solvant doit lui aussi être sélectionné avec soin afin de ne pas interférer avec les peptides présents en solution. Une fois ces conditions fixées, il faut chercher à obtenir la meilleure sensibilité. Celle-ci peut passer par l’utilisation d’appareil à haute sensibilité comme le LTQ ORBITRAP capable de différencier les masses au 1/10000ème. Ceci nous permet d’avoir des informations extrêmement précises pour les analyses en protéomique. La spectrométrie de masse n’est pas utilisée en première ligne pour la quantification. En effet le besoin d’étalon interne peut présenter quelques inconvénients lors des analyses. Cependant elle reste une technique de choix en protéomique.

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BIBLIOGRAPHIE

Bar-Or R., Rael L.T. and Bar-Or D. (2008). Dehydroalanine derived from cysteine is a common post-translational modification in human serum albumin. Rapid Commun. Mass spectrum, 22: 711-716. Stephen Barnes, Erin M. Shonsey, Shannon M. Eliuk, David Stella, Kerri Barrett, Om P. Srivastava, Helen Kim and Matthew B. Renfrow. High-resolution mass spectrometry analysis of protein oxidations and resultant loss of function, 2008. Biochemical Society Transactions Volume 36, part 5. Bondar, O.P., Barnidge, D.R., Klee, E.W., Davis, B.J. & Klee, G.G. LC-MS/MS quantification of Zn-alpha2 glycoprotein: a potential serum biomarker for prostate cancer. Clin Chem 53, 673-678 (2007). Boyer, A.E. et al. Detection and quantification of anthrax lethal factor in serum by mass spectrometry. Anal Chem 79, 8463-8470 (2007). Colzani, M., Schutz, F., Potts, A., Waridel, P. and Quadroni, M. (2008). Relative Protein Quantification by isobaric SILAC with immonium ion splitting (ISIS). Molecular and Cellular Protoemics 7, 927-937. Dai S, Jia Y, Wu SL, Isenberg JS, Ridnour LA, Bandle RW, Wink DA, Roberts DD, Karger BL.(2008) Comprehensive characterization of heat shock protein 27 phosphorylation in human endothelial cells stimulated by the microbial dithiole thiolutin. J. Proteome Res. 7(10):4384-95. deWilde, A., Sadilkova, K., Sadilek, M., Vasta, V. & Hahn, S.H. Tryptic peptide analysis of ceruloplasmin in dried blood spots using liquid chromatography-tandem mass spectrometry: application to newborn screening. Clin Chem 54, 1961-1968 (2008). Dong-Gi Lee An approach to identify cold-induced low-abundant proteins in rice leaf ; C. R. Biologies 330 (2007) 215–225 Ernoult, E., Gamelin, E., Guette, C.(2008). Improved proteome coverage by using iTRAQ labelling and peptid OFFGEL fractionation. Proteome Science 6, 27. Gharib M, Marcantonio M, Lehmann SG, Courcelles M, Meloche S, Verreault A, Thibault P. (2008) Artifactual sulfation of silver-stained proteins: Implications for the assignment of phosphorylation and sulfation sites. Mol Cell Proteomics. Giuseppe Caruso et al.; Identification of changes in Triticum durum L. leaf proteome in response to salt stress by two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry ; Anal Bioanal Chem (2008) 391:381–390. Gross J., Grass S., Davis A.E., Gilmore-Erdmann P., Townsend R. R., St. Geme J. W. (2008) The Haemophilus influenzae HMW1 Adhesin Is a Glycoprotein with an Unusual N-Linked Carbohydrate Modification. J.of Biol. Chem, 283(38): 26010–26015

40

Hess D., Keusch J. J., Lesnik Oberstein S.A., Hennekam R. C. M., Hofsteenge J., (2008) Peters Plus syndrome is a new congenital disorder of Glycosylation and involves defective O-glycosylation of thrombospondin type 1 repeats. J.of Biol. Chem. 283(12): 7354–7360 Jeffrey T.-J. Huang, F. Markus Leweke, David Oxley, Lan Wang, Nathan Harris, Dagmar Koethe, Christoph W. Gerth, Brit M. Nolden, Sonja Gross, Daniela Schreiber, Benjamin Reed, Sabine Bahn. Disease Biomarkers in Cerebrospinal Fluid of Patients with First-Onset Psicosis, 2006. PLoS Medicine Volume 3 Issue 11. Hülsmeier A. J., Paesold-Burda P., Hennet T., (2007) N-Glycosylation Site Occupancy in Serum Glycoproteins Using MRM LC-MS. Mol Cell Proteomics (12):2132-8 Kyoko Kojima, Senait Asmellash, Christopher A. Klug, William E. Grizzle, James A. Mobley, John D. Christein. Applying Proteomic-Based Biomarker Tools for the Accurate Diagnosis of Pancreatic Cancer, 2008. J. Gastrointest Surg 12:1683-1690. Dong-Gi Lee; An approach to identify cold-induced low-abundant proteins in rice leaf ; C. R. Biologies 330 (2007) 215–225 Lim A., Reed-Bogan A., Harmon B. J. (2008) Glycosylation profiling of a therapeutic recombinant monoclonal antibody with two N-linkedglycosylation sites using liquid chromatography coupled to a hybrid quadrupoletime-of-flight mass spectrometer. Anal. Biochem. 375:163–172 Na, L. (2008). Absolute quantification of multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2/ABCC2) using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry 380, 211-222. Parker L, Engel-Hall A, Drew K, Steinhardt G, Helseth DL Jr, Jabon D, McMurry T, Angulo DS, Kron SJ. (2008) Investigating quantitation of phosphorylation using MALDI-TOF mass spectrometry. J Mass Spectrom. 43(4):518-27 Singh, R. et al. A liquid chromatography-mass spectrometry method for the quantification of urinary albumin using a novel 15N-isotopically labeled albumin internal standard. Clin Chem 53, 540-542 (2007). Youri O. Tsybin, Magareta Ramstrom, Matthias Witt, Gökhan Baykut and Per Hakansson. Peptide and protein characterization by high-rate electron capture dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, 2004. Journal of Mass Spectrometry 39: 719-729. Wu H.Y., Huang F-Y., Chang Y-C., Hsieh M-C, Liao P-C (2008). Strategy for determination of in vitro protein acetylation sites by using isotope-labeled acetyl coenzyme A and liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem., 16: 6178-6189. Yu Y., Hoffhines A.J., Moore K.L. and Leary J.A. (2007). Determination of the sites of tyrosineO-sulfation in peptides and proteins. Nature, 4: 583-588. Yuan C, Sheng Q, Tang H, Li Y, Zeng R, Solaro RJ. (2008) Quantitative comparison of sarcomeric phosphoproteomes of neonatal and adult rat hearts Am J Physiol Heart Circ Physiol. ;295(2):H647-56.