Utilisation du système CRISPR-dCas9

dans la reprogrammation cardiaque

Adélie Belin – Gabrielle Capin – Antoine Farnham

Master 2 EGPR

Université Paul Sabatier Toulouse

REMERCIEMENTS

Nous souhaitons dans un premier temps remercier particulièrement Mme Laurence Nieto pour

le temps qu’elle a su consacrer à notre projet ainsi que pour tous ses conseils avisés fournis tout

le long de ce semestre.

Nous remercions également M Rémy Poupot pour ses remarques et ses conseils apportés lors

des différentes présentations, ainsi que M Laurent Paquereau et M Vincent Ecochard pour leur

aide concernant la compréhension des vecteurs et du système CRISPR-Cas9.

Nous tenons à remercier tout particulièrement Mme Celine Galès de l’institut I2MC de

Toulouse pour le temps qu’elle nous a consacré et pour nous avoir apporté toutes les

informations nécessaires à la compréhension de la reprogrammation cardiaque.

Un grand merci à Mme Bettina Couderc pour nous avoir reçu et nous avoir éclairés sur

l’utilisation et la conception des vecteurs viraux.

Nous remercions également M Aurélien Olichon du centre CRCT de Toulouse pour nous avoir

aidé à mieux comprendre le système dCas9 couplé aux ARN guides.

Enfin, un grand merci au reste de l’équipe pédagogique du master EGPR pour leur aide et leur

soutien au cours de ce semestre particulièrement intense. Mais également à tous les étudiants

de la promotions 2016 / 2017 pour leur patience et leur bonne humeur au quotidien !

RESUME

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Elles

résultent le plus souvent d’une perte de cardiomyocytes, cellules contractiles indispensables à

la fonction cardiaque.

Des études en cours ont pour but de palier à ce problème, cependant elles souffrent d’un

manque d’efficacité. Certaines de ces études ont pour principe d’exprimer les facteurs de

transcription (MGT) exogènes, impliqués dans le développement cardiaque, permettant la

reprogrammation des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes induits (iCM). Cependant, des

barrières épigénétiques bloquent la reprogrammation cardiaque en empêchant l’expression des

gènes cardiogéniques endogènes. C’est pourquoi, notre projet de recherche consiste à

reprogrammer directement des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes induits par activation

de l’expression des facteurs de transcription MGT endogènes. Le fait d’activer les gènes

endogènes permettra de pallier la barrière épigénétique et donc d’augmenter l’efficacité de

reprogrammation.

Pour cela, le système CRISPR-dCas9-activateur sera utilisé. Le principe étant de fabriquer des

ARN guides (ARNg), capables de cibler spécifiquement les promoteurs proximaux des facteurs

MGT. Ces ARNg vont recruter une Cas9 délétée de sa fonction endonucléase (dCas9), qui sera

couplée à un activateur transcriptionnel. Ce système a fait ses preuves lors de la

reprogrammation directe sur des fibroblastes embryonnaires de souris en neurones induits. Afin

d’optimiser le système de reprogrammation, une dCas9 et des activateurs spécifiques vont être

choisis : Sa-dCas9 et l’activateur VPR. Les ARNg vont être fabriqués de manière à activer

spécifiquement les gènes cibles en évitant les effets non spécifiques.

La reprogrammation sera suivie grâce à des marqueurs spécifiques des cardiomyocytes (α-

MHC, cTnT, α-actinine sarcomérique…), des analyses de l’expression des gènes MGT mais

également d’autres gènes cardiogéniques impliqués dans la reprogrammation et différents

gènes cardiaques. Des études transcriptomiques et des analyses épigénétiques seront réalisées

en parallèle.

Listes des abréviations

-MHC : -myosin heavy chain

ADN : acide désoxyribonucléique

ARN : acide ribonucléique

ARNg : Acide ribonucléique guide

ARNt : ARN de transfert

BAM : Brn2, Ascl1 et Myt1l

Cas9 : CRISPR-associated protéin 9

CD31+ : cellules endothéliales 31+

CF : fibroblaste cardiaque

ChIP : chromatin immunoprecipitation

CM : cardiomyocyte

CRISPR : clustered regularly interspaced

palindromic repeats

cTnT : troponine T cardiaque

dCas9 : Cas9 déficiente

ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay

FACS : fluorescence-activated cell sorting

Gata4 : gata binding protein 4

GFP : green fluorescence protein

H2AK119ub : histone 2 A ubiquitinée sur la

lysine 119

H3K27me3 : histone 3 triméthylée sur la lysine

27

H3K4me3 : histone 3 triméthylée sur la lysine

4

iCM : cardiomyocytes induits

iNC : neurones induits

iPS : induced pluripotent stem cell

KRAB : kruppel associated box

MACS : magnetic-activated cell sorting

MEF : mouse embryonic fibroblast

Mef2c : myocyte enhancer factor 2c

MGT : Mef2c, Gata4, Tbx5

NC : negative control

ODNds : oligodéoxynucléotides double brin

OMS : organisme mondial de la santé

P16 / p19 : protéin16 / protéine 19

P65 : NF-kappa-B p65

PA cardiaque : Potentiel d’action cardiaque

PAM : protospacer adjacent motif

PRC1,2 : polycomb repressive complex 1, 2

qPCR : quantitative polymerase chain reaction

RT : transcription inverse

Rta : replication and transcription activator

Sa : Staphylococcus aureus

Seq : DNA sequencing

ShARN : short hairpin ARN

SP : Streptococcus pyogenes

TALE : transcriptional activator-like effectors

Tbx5 : T-box 5

TTF : tail-tip fibroblast

Tubules T : Tubules transverses

VP 16 : protéines virales 16

VP64 : protéines virales 64

VPR : VP64-p65-Rta

ZFP : zinc-finger protein

Table des matières

A- Introduction ______________________________ 1

B- Projet de recherche ________________________ 17

I- CHOIX DE L’ORGANISME ET DU TYPE CELLULAIRE ________________________________________ 17 1- Choix du modèle d’étude pour la reprogrammation cardiaque _____________________ 17 2- Isolation des CF et des CM de souris transgéniques α-MHC-GFP ____________________ 19

II- CONSTRUCTION DU SYSTEME « CRISPR-DCAS9 » _______________________________________ 19 1- Construction du lentivecteur Sa-dCas9-NLS-VPR _________________________________ 19 2- Conception des ARN guides _________________________________________________ 23 3- Transduction des fibroblastes cardiaques ______________________________________ 25 4- Analyse de la spécificité du système utilisé _____________________________________ 25 5- Optimisation du système en parallèle _________________________________________ 27

III- ANALYSE DE LA REPROGRAMMATION DES FIBROBLASTES CARDIAQUES EN ICM ____________________ 29 1- Suivi des marqueurs de reprogrammation cardiaque _____________________________ 29 2- Etudes transcriptomiques __________________________________________________ 31 3- Etudes épigénétiques ______________________________________________________ 31

C- Discussion et perspectives __________________ 35

1

A- Introduction

Selon l’organisation mondiale de la santé (OMS), les maladies cardiovasculaires

(cardiomyopathies, infarctus du myocarde, artériopathies, thromboses…) sont actuellement la

première cause de mortalité dans le monde. Les principaux facteurs de risque associés aux

maladies cardiovasculaires sont le tabac, l’alcool, l’obésité, l’âge et le sexe (OMS, 2015).

En 2015 le nombre de décès imputables aux maladies cardiovasculaires dans le monde est

estimé à 17,5 millions, dont 7,4 millions sont dus à une cardiopathie coronarienne.

Malheureusement, ces chiffres ne cessent d’augmenter chaque année (http://who.int/fr).

Le problème majeur des maladies cardiovasculaires est conséquent à la perte de cardiomyocytes

(CM). Les CM sont les cellules contractiles composant le muscle cardiaque. Ils mesurent

environ 100 µm de long sur 50 µm de large chez l’homme et possèdent un noyau central unique

et allongé. Ils ont une forme cylindrique dont les extrémités présentent des bifurcations et des

systèmes de jonction cellule-cellule (traits scalariformes, disques et stries intercalaires…),

grâce auxquelles ils entrent en connexion pour former un réseau tridimensionnel complexe. Les

mitochondries y sont plus abondantes que dans d’autres cellules musculaires afin de fournir

l’énergie nécessaire à la contraction et à l’excitation du myocarde. Les CM sont spécialisés dans

l’initiation de l’excitation et dans sa conduction. Ils sont spontanément excitables et leur

dépolarisation et repolarisation est indépendante du système nerveux.

(http://www.chups.jussieu.fr).

La perte de cardiomyocytes, à la suite d’un infarctus du myocarde par exemple, peut conduire

à une insuffisance cardiaque : cela correspond à l’incapacité du cœur à pomper suffisamment

de sang pour répondre aux besoins de l’organisme, qui va être associée à de nouveaux risques

d’infarctus du myocarde, et dans les cas les plus dramatiques à la mort du patient. De plus, le

cœur souffre d’une très faible capacité de régénération (autour de 1% par an selon Bergmann

et al., 2009), ainsi l’ischémie causée par un infarctus ne pourra pas être réparée naturellement.

Selon l’OMS en 2015, environ 500 000 personnes souffrent d’insuffisance cardiaque et environ

18 000 décès dus à un infarctus du myocarde ont été recensés en France.

2

3

C’est pourquoi, il est primordial de trouver une solution pour régénérer les cardiomyocytes afin

de pallier les problèmes d’insuffisance cardiaque et baisser le taux de mortalité associé aux

maladies cardiovasculaires.

La transplantation cardiaque est à ce jour la seule méthode efficace mise en place pour résoudre

les problèmes liés à l’insuffisance cardiaque. Cependant, le manque de donneur et la faible

performance à long terme de la transplantation cardiaque due au rejet de la greffe, implique la

recherche de nouvelles alternatives de régénération du cœur (Chen J et al.; 2014). Des essais

cliniques se sont portés sur la transplantation de cellules souches dans le cœur (Doppler S.A et

al.; 2013), la stimulation de la prolifération des cellules cardiaques in situ (Doppler S.A et al.;

2013) ou encore la reprogrammation de fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes à partir des

« induced pluripotent stem cell (iPS) » (Takahashi K et al.; 2006). Cependant, les résultats

associés à ces différentes stratégies souffrent d’un manque d’efficacité quant à la régénération

des cardiomyocytes (Ieda et al.; 2010).

En 2010, une équipe de l’Université de Californie s’est intéressée à la reprogrammation directe

de fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes induits (iCM) (Ieda et al.; 2010). Contrairement

aux cardiomyocytes, les fibroblastes cardiaques possèdent une meilleure capacité de

régénération et de prolifération. Ainsi, leur conversion en iCM permettrait de combler le

manque de cardiomyocytes dans le cœur.

Sur le plan structural, les CF ont un corps cellulaire fusiforme avec de longs prolongements

cytoplasmiques, possèdent un noyau ovoïde et allongé, un cytoplasme peu visible, un réticulum

endoplasmique rugueux et un appareil de golgi étendu (Thèse Najat Benamer 2009).

Le principe de la stratégie de reprogrammation cardiaque directe consiste à récupérer des CF

d’un cœur de souris, qui représentent 50% des cellules cardiaques, et d’induire leur

reprogrammation directe en cardiomyocytes à l’aide de facteurs de transcription

cardiogéniques. Ces facteurs ont été mis en évidence en 2010, par l’équipe de Ieda et al., qui

ont recherché, parmi des facteurs de transcription impliqués dans le développement cardiaque,

ceux qui pourraient induire la reprogrammation des CF en iCM. Ainsi, le criblage de 14 facteurs

de transcription impliqués dans le développement cardiaque a mis en évidence les trois

principaux facteurs de transcription à l’origine du lignage cardiaque : Myocyte enhancer factor

2c (Mef2c), Gata binding protein 4 (Gata4) et T-box 5 (Tbx5) (Ieda et al., 2010). Ces facteurs

de transcription sont exprimés de manière exogène dans les fibroblastes cardiaques à l’aide d’un

vecteur polycistronique lentiviral, afin d’induire la reprogrammation de ces CF en iCM.

4

Figure 1 : Stratégie de reprogrammation des fibroblastes cardiaques (CF) en

cardiomyocytes induits (iCM).

Les CF sont extraits de cœurs de souris transgéniques dont le gène codant la GFP est mis sous

le contrôle du promoteur de l’-myosin heavy chain (-MHC). Les CF sont transduits par deux

types vecteurs : les retrovirus codant des facteurs de transcription MGT et des lentivecteurs

codant les shARN dirigés contre les 35 facteurs épigénétiques ou codant des shNT (contrôle).

La reprogrammation est suivie par la présence des marqueurs Troponine T cardiaque et -

myosin heavy chain (GFP) en cytométrie de flux.

MGT : gène Mef2c, Gata4, Tbx5 ; shNT : short hairpin ARN non targetting : ne possèdent pas

de cible spécifique.

Figure 2 : L’inhibition de Bmi1 augmente l’efficacité de reprogrammation cardiaque.

Des marqueurs de différenciation spécifiques des cardiomyocytes (cTnT et -MHC) sont

analysés par cytométrie de flux 10 jour après l’induction de la reprogrammation dans les

fibroblastes cardiaques.

Mock : CF non transduits ; MGT : facteurs de transcription induisant la reprogrammation ;

shBmi1 : shARN permettant l’inhibition de Bmi1.

5

Les facteurs de transcription Mef2c, Gata4 et Tbx5 (MGT) vont activer des gènes

cardiogéniques et cardiaques permettant la reprogrammation en cardiomyocytes induits.

La reprogrammation cardiaque est suivie par l’apparition des marqueurs spécifiques des

cardiomyocytes. Les cellules exprimant la troponine T cardiaque (cTnT) et les chaines lourdes

alpha de la myosine (α-MHC) sont analysées par cytométrie en flux.

Cette étude a permis d’observer une meilleure efficacité de reprogrammation en

cardiomyocytes que les stratégies de reprogrammation précédentes. Cependant, les résultats

obtenus pour la reprogrammation cardiaque directe sont peu convaincants quant à son

efficacité. Zhou et al. ont récemment proposé l’hypothèse selon laquelle une barrière

épigénétique pourrait bloquer la reprogrammation des cellules cardiaques. Afin de tester cette

hypothèse, un criblage de 35 facteurs impliqués dans le remodelage de la chromatine a été

réalisé, ce qui permettra d’évaluer leur influence sur l’efficacité de reprogrammation des

fibroblastes cardiaques en cardiomyocyte (Zhou et al., 2016) (Figure 1).

Le contrôle épigénétique de l’expression génique consiste au remodelage de la chromatine, au

niveau de gènes ou de promoteurs de gènes, par le biais de modifications post-traductionnelles

des histones (méthylations, acétylations ou ubiquitinylations), ou de méthylation de l’ADN. La

chromatine dans un état ouvert (euchromatine) ou fermé (hétérochromatine) régule l’activation

ou la répression des gènes, respectivement (Brookes et al. ; 2014). Il existe différents complexes

protéiques de remodelage de la chromatine tels que le complexe « trithorax » qui a la capacité

de triméthyler la lysine 4 de l’histone 3 (H3K4me3) ou les complexes polycombes 1 et 2 (PRC1

et PRC2). Le complexe PRC1 a la capacité d’ubiquitinyler la lysine 119 de l’histone 2A

(H2AK119ub) et le complexe PRC2 triméthyle la lysine 29 de l’histone 3 (H3K29me3). Les

modifications d’histones H2AK119ub et H3K27me3 sont majoritairement associées à un état

répressif de la chromatine, contrairement à H3K4me3 qui est associée à un état actif de la

chromatine (Vierbuchen T et al.; 2012 ; Zhou Y et al.; 2016).

Le criblage de ces 35 facteurs épigénétiques a mis en évidence l’influence de diverses protéines

sur la reprogrammation cardiaque. L’utilisation d’un short hairpin ARN (shARN) dirigé contre

l’ARN messager codant la protéine Bmi1 (en supplément des facteurs de transcription MGT) a

notamment permis d’augmenter de manière considérable l’efficacité de reprogrammation en

iCM : environ 45% des cellules sont reprogrammées contre 15% de cellules reprogrammées à

l’aide des facteurs MGT seuls (Figure 2). Ces résultats mettent en évidence l’influence

6

Figure 3 : Les cellules reprogrammées en absence de Bmi1 présentent une architecture

structurale proche des cardiomyocytes.

Des immunocytochimies sont réalisées sur les fibroblastes cardiaques 10 jours après induction

de la reprogrammation. La présence des marqueurs de différenciation troponine T cardiaque

(cTnT), -actinine et -myosin heavy chain (-MHC) est révélée par immunofluorescence en

magenta, rouge et vert respectivement. Les noyaux sont marqués au DAPI (bleu).

MGT : vecteur codant les facteurs de transcription induisant la reprogrammation (Mef2c,

Gata4, Tbx5) ; shBmi1 : shARN permettant l’inhibition de Bmi1 ; shNT (non targetting) :

shARN ne possédant pas de cible spécifique.

Figure 4 : La stratégie de reprogrammation en cardiomycytes induits est valide sur

différents types cellulaires.

Les marqueurs de différenciation spécifiques des cardiomyocytes (cTnT et -MHC) sont

analysés par cytométrie de flux 10 jour après l’induction de la reprogrammation dans les

fibroblastes embryonnaires de souris (MEF ; gauche), les fibroblastes de queue de souris (TTF ;

milieu) et dans des cellules endothéliales (CD31+ ; droite).

Mock : MEF, TTF ou CD31+ non transduites ; MGT : vecteur codant les facteurs de

transcription induisant la reprogrammation (Mef2c, Gata4, Tbx5) ; shBmi1 : shARN

permettant l’inhibition de Bmi1 ; shNT (non targetting) : shARN ne possèdant pas de cible

spécifique.

7

primordiale de la régulation épigénétique sur l’efficacité de reprogrammation des fibroblastes

cardiaques en cardiomyocytes induits.

Le facteur épigénétique Bmi1 est une protéine du complexe polycomb PRC1. Elle permet son

assemblage et ainsi l’ubiquitinylation de l’histone H2A sur la lysine 119 (H2AK119ub). Cette

modification d’histone associée à un état fermé de la chromatine entraîne la répression du gène

cible, et dans le cas des fibroblastes cardiaques, la répression des gènes cardiogéniques. Ainsi

l’inhibition de Bmi1 et de la formation du complexe PRC1 permettrait de contrer ce phénomène

et de favoriser l’activation des gènes clés de la reprogrammation cardiaque (Zhou et al.; 2016).

Par la suite, une étude d’immunocytochimie est réalisée pour mettre en évidence les

caractéristiques structurales des cellules reprogrammées (Figure 3). Les cellules

reprogrammées en absence du shARN dirigé contre bmi1 (shBmi1) expriment un taux basal de

marqueurs de différenciation α-MHC et Troponine T, et l’-actinine, protéine structurale des

myocytes composant la ligne Z des sarcomères, ne présente pas un assemblage en fibrilles

ordonnées comme c’est le cas dans les cardiomyocytes.

En comparaison, les cellules reprogrammées en présence du shBmi1 expriment 5 fois plus les

marqueurs de différenciation α-MHC, Troponine T, et -actinine. On observe également la

formation de fibrilles ordonnées d’-actinine et de sarcomères qui sont des unités de base des

myofibrilles permettant la contractilité des myocytes.

De plus, une analyse des flux calciques présents dans les cardiomyocytes induits ainsi que leur

capacité contractile ont mis en évidence le caractère fonctionnel des cellules reprogrammées

lorsque Bmi1 est inhibé (shBmi1). Ainsi la reprogrammation avec shBmi1 permet l’obtention

de cardiomyocytes structuralement et fonctionnellement matures.

Par la suite, la reprogrammation en iCM à partir de types cellulaires d’origine non cardiaque a

permis d’étudier la reproductibilité de cette stratégie. Des fibroblastes embryonnaires de souris

(MEF), des fibroblastes de queue de souris (TTF) et des cellules endothéliales (CD31+) sont

reprogrammées à l’aide des facteurs MGT exogènes. En présence de Bmi1, un taux basal

d’expression des marqueurs de différenciation cardiaque est observé, tandis qu’en absence de

Bmi1 ce taux d’expression augmente jusqu’à 22% (Figure 4).

Ainsi cette stratégie de reprogrammation en absence de Bmi1 est valide sur différents types

cellulaires, cependant la réponse à l’induction est variable.

8

Figure 5 : Bmi1 et H3K4me3 sont présents au niveau des régions régulatrices des gènes

cardiogéniques (ici Gata4).

Les séquences cibles des protéines Bmi1 (bleu), H3K4me3 (vert), et H3K27me3 (rouge) sont

obtenues par immunoprécipitation de chromatine puis séquençage (ChIP-seq).

G1-G5 : régions régulatrices du gène Gata4 ; La localisation et le sens de transcription du gène

Gata4 sont représentés par le trait bleu et la flèche.

Figure 6 : Les protéines du complexe PRC1, Bmi1 et Ring1B, ainsi que l’histone

H2AK119ub sont présentes au niveau des régions régulatrices des gènes cardiogéniques

(ici Gata4) dans les fibroblastes cardiaques.

Les séquences cibles des protéines Bmi1 (bleu foncé), Ring 1B (vert), et H2AK119ub (bleu

clair) sont obtenues par immunoprécipitation de chromatine puis amplifiées par PCR

quantitative (ChIP-qPCR)

G1-G5 : régions régulatrices du gène Gata4 ; NC (negative control) : Locus non ciblé par Bmi,

Ring1B et H2AK119ub.

9

La protéine Bmi1 et le complexe PRC1 dont elle fait partie sont impliqués dans la régulation

épigénétique. En effet, le complexe PRC1 est composé des facteurs CBX, PHC, Ring1A,

Ring1B et Bmi1 et va permettre l’ubiquitinylation de l’histone H2A (H2AK119ub) et la

répression des gènes cibles. D’autre part, la triméthylation de H3 sur la lysine 27 (H3K27me3)

par le complexe PRC2 et sur la lysine 4 (H3K4me3) par le complexe trithorax sont associés

respectivement à la répression ou à l’activation des gènes cibles.

Afin d’identifier le rôle de Bmi1 dans la répression épigénétique des gènes cardiogéniques,

différentes études d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP) sont réalisées.

Dans un premier temps, dans les CF murins, des ChIP sur Bmi1 et sur les histones H3K27me3

et H3K4me3, suivies de séquençages de l’ADN cible (ChIP-seq) sont réalisées. Ces résultats

montrent que Bmi1 et H3K4me3 sont présents au niveau des régions régulatrices de gènes clés

du développement cardiaque (Gata4, Nkx2-5, Isl1, Pitx2, Tbx20) (Figure 5).

Dans un deuxième temps, dans les CF en reprogrammation, des ChIP suivies de PCR

quantitatives (ChIP-qPCR) mettent en évidence au niveau des loci cardiogéniques, d’une part,

la présence des partenaires du complexe PRC1 et des histones H2AK119ub en présence de

Bmi1 (Figure 6), et d’autre part, la présence de la modification d’histone H3K4me3 par le

complexe trithorax en absence de Bmi1. Ces résultats montrent la corrélation entre la répression

épigénétique et la présence de Bmi1 sur les régions régulatrices des gènes cardiogéniques.

En complément, des études d’expression des gènes cardiogéniques par RT-qPCR mettent en

évidence la répression de la transcription médiée par Bmi1, et à l’inverse l’activation des gènes

cardiogéniques en son absence.

A l’issue de ces expériences, le rôle de Bmi1 est caractérisé comme facteur épigénétique de

répression de la transcription des gènes cardiogéniques, au cours de la reprogrammation.

Ainsi l’abolition de cette barrière épigénétique permettrait d’augmenter l’efficacité de la

reprogrammation des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes induits.

L’inhibition de la protéine Bmi1, telle qu’elle est présentée dans cette publication (Zhou et al.;

2016), semble apporter une solution à la faible efficacité de la reprogrammation cardiaque.

Cependant, cette inhibition pourrait poser problème concernant son application in vivo dans les

cœurs malades. En effet, Bmi1 est une protéine impliquée dans le maintien de la

10

11

balance senescence / prolifération et régule ainsi les gènes codant les protéines p16 et p19arf,

qui sont des inhibiteurs du cycle cellulaire (Alkema et al. ; 1994). Une étude a mis en évidence

en 2015 que Bmi1 serait sous-exprimée dans les cardiomyopathies dilatées et dans les cœurs

ischémiés après infarctus (Gonzales-Valdes et al.; 2015). L’inhibition de l’expression de Bmi1

aurait pour conséquence d’augmenter la sénescence des cellules cardiaques in vivo, ce qui aurait

l’effet inverse à celui recherché. C’est pourquoi l’inhibition de Bmi1 n’apparaît pas comme une

stratégie de choix pour la suite du projet.

Comme présenté précédemment, la reprogrammation cardiaque directe induite à partir des

facteurs de transcription exogènes MGT souffre d’une faible efficacité, et l’implication d’une

barrière épigénétique au niveau des gènes cardiogéniques a été mise en évidence. C’est

pourquoi il est crucial de trouver des solutions alternatives, notamment à l’aide d’outils

biotechnologiques qui permettraient une reprogrammation directe efficace, via l’activation de

gènes endogènes, afin de s’affranchir de la barrière épigénétique présente au niveau des gènes

cardiogéniques.

Différents outils de ciblage permettent de réguler spécifiquement la transcription des gènes. Ces

stratégies sont basées sur l’utilisation de «zinc-finger protein», de «transcriptional activator-

like effectors» ou encore du système de «clustered regularly interspaced palindromic repeats

(CRISPR)» couplé aux «CRISPR-associated protéin 9 (Cas9)», plus communément appelé

système CRISPR-Cas9 (Thakore et al.; 2016). Ces trois outils permettent de cibler une

séquence spécifique d’ADN, et ont été principalement conçus dans un but d’édition du génome.

Cependant, d’autres applications sont possibles. Ces outils peuvent notamment être couplés à

un ou plusieurs régulateurs transcriptionnels, permettant à la fois le ciblage précis et la

régulation de gènes cibles. Ces effecteurs peuvent être des répresseurs ou des activateurs

transcriptionnels tels que KRAB ou VP64 respectivement (Thakore et al.; 2016 ; Polstein et

al.; 2015). Le système « CRISPR-Cas9 » comporte plusieurs avantages : une facilité de

construction, une grande efficacité et spécificité, ainsi qu’un faible coût (Perez-pinera et al.;

2013). Ce système a été initialement mis en évidence chez les bactéries, où il participe à

l’immunité adaptative. En particulier chez Streptococcus pyogenes, il a pour fonction la

détection et l’élimination d’un ADN étranger inséré dans son génome (Barrangou et al. ; 2007).

Par la suite la présence de ce système a été mise en évidence chez d’autres souches bactériennes,

telles que Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis et Treponema denticola

12

Figure 7 : Activation (gauche) ou répression (droite) d’un gène par la méthode CRISPR-

dCas9-effecteur.

dCas9 (orange), ARN guides (violet), gène cible (bleu) ; VP64 = activateur de transcription ;

KRAB = répresseur de transcription

Tableau 1 : Différents effecteurs couplés à dCas9, ZFP et TALE permettent l’activation

ou la répression des gènes cibles par recrutement de facteurs spécifiques et/ou remodelage

épigénétique.

13

(Ran et al. ;2015). En 2012, Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier ont adapté ce système

pour développer l’outil biotechnologique CRISPR-Cas9, permettant l’édition précise du

génome. Le principe de cet outil est basé, d’une part, sur l’utilisation d’ARN guides qui

permettent de reconnaitre et hybrider spécifiquement des séquences génomiques de 20

nucléotides, et d’autre part le recrutement de l’endonucléase Cas9 par les ARN guides à

proximité d’une séquence « protospacer adjacent motif » (PAM). Le recrutement de Cas9 va

engendrer une coupure double-brin de l’ADN ciblé par les guides, entraînant l’édition du

génome (Jinek et al.; 2012).

Une variante de cet outil repose sur un système « CRISPR-defficient Cas9 » communément

appelé CRISPR-dCas9. Le site catalytique de Cas9 est muté sur 2 résidus spécifiques, ce qui

entraîne l’abolition de l’activité endonucléase de l’enzyme. La dCas9 couplée à un ou plusieurs

effecteurs sera recrutée par les ARN guides (ARNg) au niveau d’un locus spécifique, ce qui fait

de ce système un outil de ciblage génomique puissant (Gilbert et al. ; 2013) (Figure 7).

Dans l’objectif d’activer les gènes cardiogéniques en levant les barrières épigénétiques qui

empêchent leur expression, l’outil de ciblage CRISPR-dCas9 est un candidat de choix.

En effet, la reprogrammation cardiaque directe est dirigée par l’expression des facteurs de

transcription Mef2c, Gata4 et Tbx5 à l’origine du lignage cardiaque. Afin de s’affranchir des

barrières épigénétiques réprimant l’expression de ces gènes et par conséquent la

reprogrammation cardiaque, l’activation des facteurs MGT endogènes à l’aide de l’outil

CRISPR-dCas serait une solution de choix. En ciblant les promoteurs de ces gènes

cardiogéniques à l’aide d’ARNg spécifiques, le recrutement de dCas9 couplée à un activateur

transcriptionnel permettrait leur expression, induisant ainsi la reprogrammation cardiaque.

Comme présenté précédemment, différents activateurs sont disponibles (Tableau 1). Par

exemple, l’activateur VP64, composé de 4 copies des protéines virales 16 (VP16) provenant de

l’herpès simplex virus, et le facteur nucléaire NF-kappa-B p65 (p65), permettent le recrutement

de facteurs de transcription et induisent l’expression des gènes cibles. De plus, l’activation des

gènes par VP64 est associée à des modifications de l’état de la chromatine, telles que la

(tri)methylation de H3 sur la lysine 4 (H3K4me, H3K4me3), qui correspondent à un état actif

de la chromatine, ainsi que la déméthylation de l’ADN (Thakore et al., 2016).

14

Figure 8 : Les gènes endogènes neuronaux

Brn2, Ascl1 et Myt1l (BAM) sont fortement

exprimés à l’aide du système CRISPR-

dCas9-VP64

Mesure de l’expression par RT-qPCR des gènes

endogènes BAM après transfection des

fibroblastes embryonnaires de souris par pBAM

(bleu), pLuc (gris) ou CR-BAM (rouge).

pLuc : plasmide contrôle négatif d’expression et de transfection normalisation.

pBAM : plasmide codant les gènes BAM exogènes ; CR-BAM : plasmide codant les ARN

guides ciblant les promoteurs de BAM.

Figure 9 : Les iNC (neurones induits)

possèdent un phénotype de neurone

mature.

Une Immunohistochimie des iNC est

réalisée 10 jours après induction de la

reprogrammation par CRISPR-dCas9-VP64.

Les marqueurs de différenciation neuronale

Tuj1 (rouge ou vert) et Map2(vert) sont

observés par immunofluorescence.

Figure 10 : La transcription des gènes

neuronaux (ici Ascl1) est associée à un

état actif de la chromatine

Des expériences de ChIP-qPCR sur

l’histone H3K4me3 sont réalisées dans

des fibroblastes embryonnaires de souris

transfectés avec pLuc (gris), pBAM

(bleu), ou CR-BAM (rouge).

pLuc : plasmide contrôle négatif d’expression et de transfection normalisation ; pBAM :

plasmide codant les gènes BAM exogènes ; CR-BAM : plasmide codant les ARN guides ciblant

les promoteurs de BAM.

Chiffres en abscisse : position par rapport au site d’initiation de la transcription du gène Ascl1,

ces chiffres correspondent aux régions promotrices de ce gène.

15

Récemment, le système « CRISPR-dCas9 » a été utilisé pour la reprogrammation directe de

fibroblastes embryonnaires en cellules neuronales induites (iNC) sur modèle murin (Black et

al.; 2016). Cette reprogrammation nécessitant l’expression des facteurs de transcription

neuronaux Brn2, Ascl1, Myt1l (BAM) endogènes a été induite par l’utilisation d’ARNg ciblant

leurs promoteurs respectifs. Le recrutement de CRISPR-dCas9-VP64 en découlant a permis de

multiplier par 1000 l’expression des gènes neuronaux, par rapport à des expériences

d’expression exogènes de ces gènes, via la transfection de plasmides ou la transduction de

lentivecteurs (Figure 8).

De plus, cette stratégie permet aux facteurs BAM endogènes d’être exprimés non seulement

plus fortement mais aussi plus durablement qu’à partir des gènes exogènes. Les auteurs ont par

la suite vérifié que les fibroblastes reprogrammés en iNC possédaient un phénotype neuronal

mature (Figure 9) et étaient fonctionnellement comparables aux neurones in vivo.

Enfin, les modifications épigénétiques induites lors de l’activation des gènes BAM endogènes

ont été étudiées par ChIP-qPCR (Figure 10). Les résultats obtenus mettent en évidence la

présence d’un état actif de la chromatine (H3K4me3 notamment) au niveau des promoteurs des

gènes neuronaux dans les iNC. Ainsi, la stratégie d’activation des gènes endogènes, par le biais

de CRISPR-dCas couplé à un activateur, permet de lever les barrières épigénétiques bloquant

la reprogrammation.

Cette méthode de reprogrammation directe via l’activation des gènes cibles endogènes semble

très prometteuse.

Notre projet de thèse aura pour but principal de l’adapter afin de reprogrammer des fibroblastes

cardiaques en cardiomyocytes induits. Pour cela, nous devrons activer l’expression des gènes

cardiogéniques endogènes. Les tests seront réalisés in vitro sur modèle murin, à l’aide de l’outil

CRISPR-dCas9 couplé à un activateur. Les ARNg que nous concevrons permettront le ciblage

spécifique des régions promotrices des facteurs de transcription endogènes Mef2c, Gata4 et

Tbx5. L’activation de ces facteurs de transcription clés du remodelage cardiaque permettra de

reprogrammer les fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes induits, de phénotype fonctionnel

et mature (Figure 11).

16

Figure 11 : Stratégie de reprogrammation des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes

à l’aide de l’outil CRISPR-dCas9 couplé à un l’activateur VPR.

Les ARNg ciblent spécifiquement les régions promotrices des facteurs de transcription

endogènes Mef2c, Gata4 et Tbx5.

Sa-dCas9 : defficient Cas9 de Staphylococcus aureus ; VPR (VP64-p65-Rta) : Activateur

transcriptionnel.

17

B- Projet de recherche

I- Choix de l’organisme et du type cellulaire

1- Choix du modèle d’étude pour la reprogrammation cardiaque

Afin d’étudier la reprogrammation cardiaque, nous devons définir l’organisme modèle que nous

allons utiliser. Le modèle murin semble le plus adapté à nos recherches car il possède de

nombreux avantages : peu couteux, temps de gestation court, petite taille et facile à manipuler.

De plus, de nombreuses souris génétiquement modifiées sont disponibles.

Les fibroblastes cardiaques serviront de modèle cellulaire pour effectuer la reprogrammation

cardiaque. En effet, les CF sont présents en grande quantité dans le cœur (50% des cellules

cardiaques totales) (Xin et al. ; 2013) et possèdent des caractéristiques particulières du fait de

leur localisation. De plus, ils sont intriqués au sein d’un réseau compact de CM et participent

aux interactions cellule-cellule avec ces derniers. Les CF ont un temps de génération de 22h,

ainsi leur prolifération permettra d’augmenter le rendement des cellules obtenues initialement

à partir d’un cœur de souris.

Des modèles murins ont été élaborés précédemment afin de suivre la reprogrammation

cardiaque (Ieda et al.; 2010). Ces souris transgéniques α-MHC-GFP possèdent le gène codant

la GFP sous le contrôle du promoteur α–MHC. Ainsi le promoteur est activé spécifiquement

chez les CM, ce qui permet de suivre la reprogrammation par cytométrie de flux ou

immunohistochimie grâce à l’émission de fluorescence de la GFP (Ieda et al.; 2010). Afin

d’avoir une quantité de matériel suffisante durant l’étude, nous ferons l’acquisition de 3 couples

de souris transgéniques α-MHC-GFP.

18

Figure 12 : Culture d’explants cardiaques et isolation des fibroblastes cardiaques.

L’isolation des fibroblastes cardiaques sera effectuée selon le protocole utilisé dans l’étude Ieda

et al. (2010). Les cœurs de souris trasngéniques α-MHC-GFP possédant le gène codant la GFP

sous le contrôle du promoteur α–MHC et âgées de quatre semaines (D28) sont isolés et des

explants sont mis en culture. Les cellules présentant une propriété migratoire (CF

exclusivement) seront récupérées. Les fibroblastes cardiaques seront purifiés par magnetic-

activated cell sorting (MACS) grâce à des anticorps couplés à la biotine et dirigés contre la

protéine Thy (spécifique des fibroblastes).

19

2- Isolation des CF et des CM de souris transgéniques α-MHC-GFP

L’isolation des fibroblastes cardiaques se fera selon le protocole utilisé dans l’étude Ieda et al.

(2010). Les cœurs de souris α-MHC-GFP âgées de quatre semaines sont isolés et des explants

sont mis en culture. Les cellules présentant une propriété migratoire (CF exclusivement) seront

récupérées. Afin d’améliorer la pureté de nos préparations, des anticorps anti-Thy, protéines

spécifiques des CF, seront couplés à des billes magnétiques. Les FC seront ainsi isolés par

magnetic-activated cell sorting (MACS) (Figure 12).

D’autre part, la GPF sous le contrôle du promoteur de α-MHC sera exprimée exclusivement

dans les cardiomyocytes. Ainsi, les cardiomyocytes des souris âgées de 4 semaines (D28) seront

isolés par FACS.

II- Construction du système « CRISPR-dCas9 »

Dans une étude récente, le système CRISPR-dCas9 a été utilisé pour reprogrammer des

fibroblastes en neurones induits (Black et al.,2016). Un lentivecteur codant la Streptococcus

pyogenes deleted Cas9 (Sp-dCas9-VP64) ainsi qu’un autre lentivecteur codant les ARNg

ciblant les régions régulatrices BAM sont transduits dans fibroblastes embryonnaires de souris.

Les ARNg vont s’hybrider spécifiquement sur les promoteurs proximaux des gènes cibles,

permettant ensuite le recrutement de la Sp-dCas9-VP64 et l’activation des gènes cibles

endogènes par le biais de l’activateur VP64.

1- Construction du lentivecteur Sa-dCas9-NLS-VPR

La dCas9 provenant de Streptococcus pyogenes (Sp-dCas9), couramment utilisée, possède une

faible spécificité de liaison à l’ADN. En effet, la Sp-dCas9 se fixera sur une séquence cible à

proximité d’une séquence PAM courte -NGG-, qui n’est pas suffisamment stringente et favorise

les effets non-spécifiques de liaison de l’enzyme. Dans le but d’optimiser ce système de ciblage

génomique, nous avons choisi d’utiliser la dCas9 provenant de Staphylococcus aureus (Sa-

dCas9)dont le site catalytique est muté au niveau de 2 résidus (D10A et N580A). En effet, la

Sa-dCas9 reconnait des séquences PAM plus complexes -NNGRRT- (où N

20

21

représente une base azotée quelconque et R représente A ou G), ce qui diminuera les effets non

spécifiques quant à la reconnaissance et à l’activation de cibles non spécifiques.

Concernant, les activateurs de transcription couplés à l’enzyme, VP64 qui est composé de 4

copies des protéines virales 16 (VP16) provenant de l’herpès simplex virus, et le facteur

nucléaire NF-kappa-B p65 (p65) sont couramment utilisés (Tableau 1).

VP64 et p65 permettent le recrutement de facteurs de transcription et induisent l’expression des

gènes cibles. De plus, l’activation des gènes par VP64 est associée à des modifications de l’état

de la chromatine, telles que la (tri)methylation de H3 sur la lysine 4 (H3K4me, H3K4me3), qui

correspondent à un état actif de la chromatine, ainsi que la déméthylation de l’ADN.

Cependant, plusieurs études ont mis en évidence une efficacité variable de ces activateurs, et la

nécessité d’utiliser plusieurs ARN guides par gène cible afin de recruter plusieurs complexes

dCas9-effecteurs et obtenir un effet synergique sur l’activation des gènes (Maeder et al., 2013 ;

Perez-pinera et al., 2013).

L’effecteur VPR consiste en un assemblage de trois activateurs de transcription : VP64, p65 et

Rta (replication and transcription activator) qui provient du -herpes virus. Cet effecteur est

répertorié comme un activateur puissant et ainsi l’utilisation d’un seul ARN guide hybridé à la

région régulatrice est nécessaire pour induire l’expression du gène cible (Thakore et al., 2016 ;

Chavez et al., 2015).

Par conséquent, nous utiliserons lors de la reprogrammation une Sa-dCas9 couplée à

l’activateur VPR (Sa-dCas9-VPR), afin d’augmenter d’une part la spécificité du système et

d’autre part son efficacité.

Cette construction sera exprimée sous le contrôle du promoteur cytomégalovirus (CMV) dans

les fibroblastes cardiaques par le biais de vecteurs lentiviraux.

22

Figure 13 : Conception d’un vecteur polycistronique codant 3 ARNg séparés par des

séquences d’ARN de transfert selon Xie et al., 2015

Ce système est mis sous le contrôle d’un seul promoteur U6 (promoteur de l’ARN polymérase

III). L’ARN polycistronique transcrit est pris en charge par les ribonucléases P et Z qui clivent

les ARNt et libérent les 3 ARNg.

23

2- Conception des ARN guides

Un ARN guide est classiquement constitué de deux parties : une séquence de 20 nucléotides est

complémentaire à la région du gène cible et permet l’hybridation spécifique sur le génome, et

une seconde séquence appelée « scaffold ARN » de 80 nucléotides permet le recrutement de la

Cas9 (ici Sa-dCas9).

Le logiciel CRISPR/Cas9 Target online predictor (http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)

développé par Stemmer et al. (2015) a été élaboré de manière à concevoir des séquences

d’ARNg s’hybridant spécifiquement sur une séquence d’ADN donnée. Ce logiciel prédit la

localisation des cibles d’ARNg en fonction du type de Cas9 utilisée (ici par rapport à la

séquence PAM correspondant à la Sa-Cas9) ainsi que le score des potentielles cibles non

spécifiques.

Notre stratégie est basée sur le ciblage de régions promotrices par l’intermédiaire d’un ARNg

par gène. Chaque ARNg sera spécifique d’une région du promoteur proximal pour chacun des

gènes Mef2c, Gata4 et Tbx5.

A partir du logiciel CRISPR/Cas9 Target online predictor, quatre ARNg pour chaque gène ont

été sélectionnés et seront testés indépendamment. Les fibroblastes cardiaques seront transduits

d’une part avec le lentivecteur codant la Sa-dCas9-VPR et d’autre part avec un lentivecteur

codant un de ces ARNg. Cette expérience sera réalisée pour les 12 ARNg (4 ARNg testés pour

chaque gène) et l’expression des gènes cibles MGT sera mesurée par RT-qPCR. La transduction

des CF en parallèle avec un lentivecteur « vide » servira de contrôle.

A l’issue de ces tests, l’ARNg permettant la meilleure transcription sera déterminé pour chaque

gène. Les 3 ARNg identifiés (1 pour chaque gène) seront utilisés par la suite dans les études de

reprogrammation.

Afin de réduire la taille de l’insert et de contrôler la stœchiométrie des transcrits, nous

utiliserons un système polycistronique codant les 3 ARNg, sous le contrôle d’un seul promoteur

U6. Les ADNc (codant chaque ARNg) seront séparés par une séquence codant un ARN de

transfert (ARNt). Une fois transcrit, l’ARN polycistronique sera pris en charge par le système

endogène de traitement des ARNt de la cellule. Les RNAses P et Z pourront cliver les ARNt et

ainsi libérer les 3 ARNg (Xie et al., 2015) (Figure 13).

24

Figure 14 : La méthode du « GUIDE-seq » permet d’évaluer la spécificité du système

Cas9/ARN guide utilisé (Shengdar et al., 2014).

L’incorporation d’oligonucléotides de 34 paires de base (ODNds) au niveau des coupures

double-brin puis la ligation d’adaptateur seront suivis d’une amplification par le biais d’une

amorce se liant spécifiquement aux ODNds et d’une autre amorce se liant spécifiquement aux

adaptateurs. Les fragments amplifiés seront ensuite séquencés et analysés par bio-informatique.

25

3- Transduction des fibroblastes cardiaques

Pour les études de reprogrammation, différents lentivecteurs destinés à la transduction des

fibroblastes cardiaques seront conçus puis produits dans des cellules embryonnaires humaines

de rein (HEK 293T).

En premier lieu, le lentivecteur codant la Sa-dCas9-VPR ainsi que les lentivecteurs codant

chacun des 12 ARN guides à tester seront produits. En parallèle un lentivecteur sera produit à

partir d’un plasmide « vide » et servira de contrôle de transduction lors des essais de

reprogrammation.

Avant la transduction des CF, il est nécessaire de déterminer le titre viral de chaque vecteur

lentiviral. Le lentivecteur n’étant pas lytique, nous devrons effectuer des tests d’ELISA contre

la protéine de capside p24 ou encore analyser l’expression des ARN codant les protéines du

lentivecteur par RT-qPCR. La détermination du titre viral de chaque lentivecteur nous indiquera

la quantité adéquate à mettre en présence des CF pour la transduction.

A la suite des tests d’efficacité des ARN guides, le vecteur lentiviral polycistronique portant les

3 ARNg d’intérêt sera également produit puis transduit dans les fibroblastes cardiaques. La

conception d’un lentivecteur supplémentaire codant la Sa-Cas9 active servira à l’étude de la

spécificité du système.

4- Analyse de la spécificité du système utilisé

Avant de déterminer l’efficacité de la reprogrammation à partir du système Sa-dCas9-VPR et

des ARN guides, il est primordial d’analyser les effets non-spécifiques potentiels qui lui sont

associés. Pour cela, des études de « GUIDE-seq » seront effectuées (Figure 14).

Des expériences de ChIP de dCas9 suivis de séquençage, de RNA-seq ou la recherche de

similarités dans les séquences hybridant les ARN guides peuvent prédire les effets non

spécifiques. Cependant ces approches manquent de précision. Le GUIDE-seq est une méthode

qui permet l’identification des coupures double brins sur l’intégralité du génome (Shengdar et

al., 2014). L’incorporation d’oligonucléotides de 34 paires de base (ODNds) au niveau des

26

27

coupures double-brin va permettre l’identification par séquençage des fragments ciblés.

Cette méthode nécessite l’utilisation d’une Cas9 non mutée (lentivecteur Sa-Cas9) qui va

générer des coupures double brin, ainsi que du vecteur polycistronique codant les ARN guides

d’intérêt. Les fibroblastes cardiaques seront transduits par ces deux vecteurs et en parallèle avec

les vecteurs vides contrôles, puis les séquences d’ODNds seront transfectées. Dans la première

étape les coupures double brins seront marquées par l’incorporation des ODNds. Dans la

seconde étape les sites d’intégration seront analysés grâce à une amplification et un séquençage.

Les ODNds sont optimisés pour s’intégrer : en effet ils portent deux groupements

phosphothiorates sur leurs extrémités 5’ et 3’ qui va stabiliser les ODNds dans la cellule et

favoriser leur intégration. Une fois l’ADN fragmenté par sonication, les fragments ayant intégré

les ODNds sont amplifiés sélectivement et séquencés. Pour cela des adaptateurs sont liés aux

fragments d’ADN, puis ces fragments sont amplifiés à l’aide d’une amorce se liant

spécifiquement aux ODNds et d’une autre amorce se liant spécifiquement aux adaptateurs. Les

adaptateurs ne sont couplés qu’à une seule extrémité de chaque brin, ce qui permet

l’amplification sélective des fragments comportant un ODNds. Ces fragments amplifiés seront

ensuite séquencés et l’analyse bio-informatique permettra d’identifier les sites de coupures

spécifiques et non spécifiques du système Cas9/ ARN guide.

5- Optimisation du système en parallèle

Après avoir identifié la combinaison d’ARNg donnant la meilleure efficacité de

reprogrammation, l’optimisation du système « Sa-dCas9-VPR – ARNg » sera effectuée en

parallèle des essais de reprogrammation. Ainsi, les modifications suivantes seront testées pour

leur efficacité :

- De nouvelles combinaisons d’ARNg (1 ARNg / gène)

- Des combinaisons de plusieurs ARNg par gènes (2 à 3 ARNg / gène) afin d’obtenir un

potentiel effet synergique (Maeder et al.;2013)

- Différents activateurs (VP64 ou P65 couplés en N-ter et en C-ter de l’enzyme ou en

plusieurs exemplaires…) (Thakore et al. ; 2016)

28

Figure 15 : Chronologie de l’étude de reprogrammation des fibroblastes cardiaques en

iCM. Sa-dCas9 : defficient Cas9 de Staphylococcus aureus ; NLS : signal de localisation

nucléaire ; VPR (VP64-p65-Rta) : Activateur transcriptionnel

29

III- Analyse de la reprogrammation des fibroblastes cardiaques en

iCM

1- Suivi des marqueurs de reprogrammation cardiaque

Après transduction des fibroblastes cardiaques, l’efficacité de la reprogrammation sera suivie

au cours du temps par l’étude des marqueurs structuraux et fonctionnels spécifiques des

cardiomyocytes (Tableau 2). Des résultats antérieurs ont montré que la meilleure efficacité de

reprogrammation était observée au bout de 10 jours (Zhou et al., 2016 ; Black et al., 2016) mais

ces résultats dépendent du type cellulaire et du système de reprogrammation utilisé. Par

conséquent, l’efficacité de reprogrammation sera évaluée aux jours 1,3,5,7,10 et 14 après

transduction des CF, à l’aide des marqueurs de reprogrammation structuraux α-MHC, et

troponine T cardiaque, ainsi que par l’expression des gènes cibles MGT par RT-qPCR (Figure

15). Cette étude nous permettra également d’évaluer l’efficacité du système de

reprogrammation quant à la stabilité des cellules reprogrammées au cours du temps.

La meilleure efficacité de reprogrammation sera observée pour un jour donné, et les cellules

reprogrammées seront caractérisées par la présence d’autres marqueurs structuraux tels que l’α-

actinine sarcomérique et les sarcomères, ainsi que les tubules T. Une analyse complémentaire

des potentiels d’action membranaires permettra d’évaluer l’excitabilité des membranes

plasmiques nécessaire à la propagation de l’influx électrique, et entraînant le battement des

cardiomyocytes. Dans la même optique, la proportion de cellules battantes sera évaluée.

La morphologie cellulaire et la prolifération sont également des caractéristiques déterminantes

pour valider la maturité du phénotype obtenu. En effet les cardiomyocytes possèdent une

morphologie cylindrique en « brique » très caractéristique, et ces cellules différenciées

prolifèrent très peu.

Les résultats des essais de reprogrammation seront normalisés par rapport au contrôle de

transduction (lentivecteur vide) et comparés aux profils des fibroblastes cardiaques et des

cardiomyocytes matures.

30

Marqueur Abréviation Fonction Méthode d’analyse

Chaine lourde alpha

de la myosine α-MHC

Rôle fondamental dans la

contraction musculaire

Cytométrie de flux

Immunohistochimie

Troponine T

cardiaque cTnT

Responsable de la liaison

avec la tropomyosine

Cytométrie de flux

Immunohistochimie

α -actinine

sarcomérique -

Permet l’intéraction actine-

myosine ; composant de la

ligne Z du sarcomère

Immunohistochimie

Sarcomères - Unité de base des

myofibrilles Immunohistochimie

Potentiel d’action

cardiaque PA cardiaque

Activité électrique du

myocarde

Système d’électrodes :

différences de potentiel

Tubules transverses Tubules T

Invagination du

plasmalemme, permet de

conduire le potentiel d’action

Immunohistochimie

Microscopie électronique

Morphologie

cellulaire -

Forme cylindrique

caractéristique Microscopie électronique

Prolifération - Faible chez les cellules

différenciées

Cytométrie de flux

(iodure de propidium

cellules en phase S)

Tableau 2 : Les marqueurs structuraux et fonctionnels spécifiques de cardiomyocytes

sont étudiés chez les cellules reprogrammées (iCM) à l’aide de différentes méthodes

d’analyse.

31

2- Etudes transcriptomiques

Dans le but d’étudier l’efficacité de la reprogrammation en iCM, l’expression des gènes cibles

MGT sera analysée tout au long des essais de reprogrammation par RT-qPCR. A la suite de

cette étude, les profils transcriptomiques des iCM présentant la meilleure efficacité de

reprogrammation seront étudiés.

Ainsi, l’expression des gènes totaux des iCM obtenus par RNA-seq seront comparés aux profils

transcriptomiques des fibroblastes cardiaques et des cardiomyocytes matures de souris (D28).

Le rapprochement de ces profils transcriptomiques nous permettra d’estimer la proximité de

notre modèle iCM en terme d’expression génique par rapport au modèle de cardiomyocytes

matures (D28).

En parallèle, afin d’approfondir l’analyse de l’activation des gènes cardiogéniques par la

méthode CRISPR-dCas9-VPR, l’expression des gènes sous-effecteurs de MGT (Nkx2-5, Tbx20,

Isl1 et Pitx2) sera également étudiée par RT-qPCR.

3- Etudes épigénétiques

L’influence de facteurs épigénétiques sur la reprogrammation cardiaque a été caractérisée dans

diverses études (Zhou et al.,2016 ; Wang et al. ; 2015). En effet dans les fibroblastes cardiaques

en reprogrammation, comme démontré précédemment, l’état compacté et répressif de la

chromatine au niveau des loci cardiogéniques serait une barrière majeure à la reprogrammation

des CF en iCM. La présence de l’histone H2AK119 ubiquitinylée par le complexe polycomb

PRC1 est associée à un état chromatinien fermé et à la répression des gènes cardiogéniques,

alors que la présence de l’histone H3K4 triméthylée par le complexe thritorax est associée à un

état chromatinien ouvert et à l’activation des gènes cardiogéniques (Zhou et al., 2016 ; Liu et

al., 2016 ;Vierbuchen T et al.; 2012).

D’autre part, la triméthylation de l’histone H3K27 par le complexe polycomb PRC2 est

impliquée de manière courante dans la répression des gènes mais son rôle n’a pas été déterminé

dans la régulation des gènes cardiogéniques.

32

33

Ainsi des études épigénétique seront réalisées afin d’étudier l’état de la chromatine dans les

différents modèles étudiés (CF, iCM, et cardiomyocytes matures à D28). Cela nous permettra

de comparer le profil épigénétique des iCM avec ceux des CM matures (D28), dans la même

démarche que l’étude transcriptomique, afin de s’assurer de la proximité épigénétique de notre

modèle iCM avec celui des CM matures.

D’autre part, il est essentiel de valider la stratégie CRISPR-dCas9-VPR quant aux modifications

épigénétiques liées à l’activation des gènes cardiogéniques cibles MGT, mais également

d’étudier l’état chromatinien au niveau des gènes sous-effecteurs Nkx2-5, Tbx20, Isl1 et Pitx2.

Cette étude est capitale dans la détermination de l’influence épigénétique de la méthode de

reprogrammation basée sur l’utilisation de CRISPR-dCas9-VPR. Plus précisément, ce système

doit permettre l’abolition de la barrière épigénétique au niveau de ses cibles directes MGT et

des gènes cardiogéniques qui doivent être activés en aval.

Par conséquent, ces résultats nous permettront de déterminer si l’activation de gènes endogènes

entraîne l’apparition de modifications épigénétiques sur les gènes en aval et l’induction de la

cascade de facteurs de transcription cardiogéniques aboutissant à l’obtention d’un phénotype

de cardiomyocytes matures.

Dans le cadre de cette étude, des expériences de ChIP sur les histones H2AK119ub, H3K27me3

et H3K4me3 seront effectuées dans les iCM, dans les CF, ainsi que dans les CM matures (D28).

Des PCR quantitatives multiplex seront réalisées sur plaques 96 puits commandées au préalable

avec les amorces destinées à l’amplification des gènes à analyser. Les gènes d’intérêt sont

Mef2c, Gata4 et Tbx5 mais également les gènes Nkx2-5, Tbx20, Isl1 et Pitx2 ainsi que d’autres

gènes cardiogéniques et cardiaques (au total une centaine de gènes), impliqués directement ou

indirectement dans le développement, les fonctions et dans la structure des cardiomyocytes. Par

ailleurs, l’étape de fragmentation du ChIP étant aléatoire, 3 couples d’amorces par gène étudié

seront utilisés.

Les résultats des ChIP-qPCR multiplex serviront à comparer les profils épigénétiques des

différents modèles cellulaires étudiés, le but étant de se rapprocher au maximum du profil

épigénétique des CM.

34

35

Ainsi, les études transcriptomiques et épigénétiques vont permettre d’évaluer plus précisément

l’efficacité de la reprogrammation et de valider le modèle iCM obtenu. A l’issue de ces résultats,

des étapes d’optimisation seront effectuées afin de pallier aux potentielles barrières de la

reprogrammation, et cela dans le but d’augmenter son efficacité, sa fiabilité et sa stabilité.

C- Discussion et perspectives

Selon l’OMS, les maladies cardiovasculaires sont actuellement la première cause de mortalité

dans le monde. Un des problèmes majeurs associé aux maladies cardiovasculaires est la perte

de cardiomyocytes. Ce sont des cellules contractiles, essentielles au fonctionnement du cœur,

mais souffrant d’une faible capacité de régénération. Il est donc primordial de trouver des

solutions pour pallier ce problème.

De nombreuses stratégies sont en cours de développement mais les résultats restent encore

insuffisants. La reprogrammation directe des fibroblastes cardiaques en cardiomyocytes est une

approche récente et très prometteuse. Cette approche est basée sur l’expression de trois facteurs

de transcription cardiogéniques : Mef2c, Gata4 et Tbx5, qui permettent la reprogrammation

cardiaque (Ieda et al.; 2010). L’expression de ces facteurs, apportés de manière exogène, ne

permet pas une reprogrammation efficace. Les expériences menées par l’équipe Zhou en 2016

montrent que cette faible efficacité de reprogrammation est due à une barrière épigénétique.

L’inhibition de Bmi1, protéine du polycomb PRC1, impliqué dans le remodelage de la

chromatine, entraine une hausse de l’efficacité de reprogrammation cardiaque. Cette inhibition,

associée à l’expression des facteurs MGT exogènes, permettent une décondensation de la

chromatine au niveau des gènes cardiogéniques, qui entraine la reprogrammation cardiaque.

Cette étude a donc montré qu’il existait des barrières épigénétiques à la reprogrammation des

fibroblastes cardiaques en iCM.

Afin de pallier la barrière épigénétique et permettre une reprogrammation cardiaque efficace, il

serait donc préférable d’activer directement les facteurs MGT endogènes. Pour cela l’utilisation

de CRISPR-dCas9 se révèle être un outil de choix. En effet, l’équipe de Black en 2016 a permis

36

37

la reprogrammation de fibroblastes en neurones induits grâce à l’outil CRISPR-dCas9 et des

ARNg (Black J et al. ; 2016). Dans ce projet, le système Sa-dCas9 couplée à l’activateur VPR

sera utilisé. Ce système est très spécifique et efficace (Thakore et al. ;2016). Les ARNg

correspondant au promoteur proximal de chaque facteur MGT seront conçus de manière à

hybrider ses cibles spécifiquement. Une fois les ARNg les plus efficaces choisis, ils seront

insérés dans un système polycistronique. Ces ARNg seront ensuite transduits dans les

fibroblastes cardiaques avec la Sa-dCas9-VPR et vont hybrider la séquence complémentaire

afin de permettre le recrutement de la Sa-dCas9-VPR. Le complexe promoteur-ARNg-dCas9-

VPR ainsi formé, va induire l’expression des gènes cardiogéniques endogènes en recrutant des

facteurs de transcription et de remodelage de la chromatine et ainsi permettre la

reprogrammation cardiaque.

La reprogrammation sera suivie grâce à différents marqueurs cardiaques (α-MHC, cTnT,

morphologie…). les iCM les mieux reprogrammés (à environ 10 jours (Zhou Y et al.; 2016) )

seront étudiés : des études transcriptomiques (RNA-seq, RT-qPCR) et épigénétiques (ChIP-

qPCR multiplex) seront faites sur les iCM et sur des CM (jour 28) afin de s’assurer de la

proximité transcriptionnelle et épigénétique des deux modèles.

En parallèle, des optimisations de la méthode seront réalisées. Notamment le criblage de

nouveaux ARNg proposés par le logiciel ccTop seront testés. De plus, des tests seront effectués

avec plusieurs ARNg par gènes sachant que des effets synergiques des ARNg ont été montrés

précédemment (Maeder et al. ; 2013). L’effet d’autres activateurs seront également évalué, tels

que VP64 ou p65 seuls, mais également le couplage de plusieurs activateurs tels que VPR-Sa-

dCas9-VPR ou encore VP64-Sa-dCas9-VP64.

Par ailleurs, les résultats des études transcriptomiques et des études épigénétiques pourront nous

amènerons à identifier de nouveaux gènes cibles à activer. Grâce aux ARNg correspondants et

au système CRISPR-dCas9, ces gènes pourront facilement être activés.

Ces optimisations auront pour but d’obtenir un modèle iCM mature, fonctionnel et stable.

Ce projet ayant pour but de pallier la perte de cardiomyocytes dans le cœur, de nombreuses

perspectives in vivo passant par la thérapie génique pourront être abordées dans un premier

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temps sur modèle murin, qui est peu coûteux et facile à utiliser mais également sur modèle

porcin car la morphologie et le fonctionnement cardiaque se rapprochent fortement du modèle

humain.

De plus, sachant que l’isolation des fibroblastes cardiaques des coeurs humains s’avère être

compliquée d’un point de vue médical et législatif, la possibilité d’une thérapie cellulaire devra

se baser sur la reprogrammation de cellules d’origine non cardiaque.

La méthode CRISPR-dCas9-VPR semble être une méthode adaptée à la reprogrammation

directe cardiaque. Nous attendons des résultats satisfaisants et prometteurs. La stratégie de

pallier la barrière épigénétique en activant les gènes cardiogéniques endogènes semble être la

solution la plus adéquate au manque d’efficacité de reprogrammation cardiaque.

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