Version FINALE coquilles revues 26 10

TTHHÈÈSSEE

En vue de l'obtention du

DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE

Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline ou spécialité : NEUROSCIENCES

JURY

Pr. Jean-Michel LASSALLE Président Dr. Valérie DOYERE Rapporteur Dr. Bruno POUCET Rapporteur

Dr. Alain MARCHAND Directeur de thèse

Ecole doctorale : CLESCO

Unité de recherche : CNIC et CRCA Directeur(s) de Thèse : Alain MARCHAND et Martin GIURFA

Rapporteurs : Docteur Valérie DOYERE et Docteur Bruno POUCET

Présentée et soutenue par Frédéric ESCLASSAN Le 19/12/2008

Titre : NATURE ET SUBSTRAT NEUROBIOLOGIQUE DU CONDITIONNEMENT DE TRACE :

Etude en conditionnement de peur chez le rat

Remerciements

Je tiens à remercier les membres du jury, Dr Valérie DOYERE et Dr Bruno POUCET, présidé par le Pr Jean‐Michel LASSALLE. Ils ont donné de leur temps dans l’évaluation de ce rapport et ont manifesté un intérêt particulier à ce travail notamment le jour de la soutenance à travers un riche débat que j’ai personnellement beaucoup apprécié.

Il serait impardonnable de ma part de ne pas sincèrement remercier la personne qui a sûrement le plus souvent, durant ces quatre dernières années, fait les frais de mon sale caractère et de mon obstination j’ai nommé le Dr Alain MARCHAND aussi connu sous le nom de « Mon directeur de Thèse » ou encore « chef ». A titre personnel Alain je tenais vraiment à te remercier puisque tu as toujours répondu présent aux moments clefs pour m’apporter un soutien aussi bien scientifique que moral.

Je voulais aussi remercier le Dr Georges DI SCALA directeur du CNIC mais aussi chef de l’équipe au sein de laquelle j’ai effectué les travaux qui vont suivre. Une double casquette dure à porter et surement parfois bien ingrate que tu as pourtant su garder fermement attaché sur la tête. Georges, ton « souci », ton scepticisme et ton amour des mots précis m’ont poussé à évoluer et ; ne jouons pas sur la fausse modestie ; à sans cesse m’améliorer. Pour cela, je te suis redevable.

Comment ne pas remercier mon collègue de chaque jour, celui sans lequel ce travail ne serait certainement pas ce qu’il est aujourd’hui : le Dr Etienne COUTUREAU. Entre discours scientifique et séries d’opérations il est toujours bon de glisser une bière… ou un barbecue. Merci à toi d’avoir était aussi disponible. Ton humour (non non je ne vais pas donner d’exemple ne t’en fait pas) va énormément me manquer.

Je remercie aussi le dernier arrivé des titulaires de l’équipe le Dr Jean‐Rémi PAPE. Bien que tu sois arrivé tardivement dans l’équipe tu as su t’adapter à des thématiques de recherche pas forcément simple à maitriser lorsqu’on n’a pas une formation ES Psychologie Expérimentale. Pourtant je ne t’ai jamais vu baisser les bras à la vue d’un tableau rempli de X‐/AB+/A‐/Y+. Merci à toi aussi pour ton soutien.

Il est temps à présent que je remercie mes compagnons de galère, qui continuent encore à se réunir, mais à présent sans moi, au sein de notre sacro sainte « réunion d’équipe » du vendredi midi je veux bien sûr parler des thésards de l’équipe « Fonctions exécutives, circuits neuronaux et développement ».

Aurore la pro des X‐/AB+/A‐/Y+ (conf. plus haut). Le petit cœur avec un caractère de cochon. Il est difficile de trouver les mots justes pour te remercier tellement, les mots semblent insuffisants pour dire à quel point ton soutien et ta présence ont été pour moi indispensables durant tout ce temps. Ta force de caractère et de persévérance devrait être un exemple pour tous ceux qui t’entourent puisqu’après tout ce temps et toutes ces galères que tu as traversées c’est grâce à toi que demain nous pourront dire : « bien sûr que les rats sont capables de faire de la ré‐évaluation rétrospective, t’as pas lu le papier de San‐Galli et al. ?». J’aurais bien fait plus émouvant mais je sais

que ton cœur « russe » t’empêcherait de pleurer. Je te dirais juste que je t’aime puisque je sais à quel point tu adores ce simple mot ;‐)

Merci à Delphine et Fabien les derniers arrivant de l’équipe qui ont pourtant déjà largement fait leurs preuves. Je connais les épreuves que vous allez avoir à traverser et je sais que vous le ferez sans problème tant votre force de travail et votre attrait pour la science (et la rigueur qui va avec) sont fort. Bon courage et merci pour tout.

Enfin une petite pensée pour une petite espagnole du tonnerre la petite Maria qui a fait quelques temps partie de cette équipe avant de finalement partir réaliser sa thèse dans sa ville natale de Madrid (et oui je sais combien il est difficile de quitter le Sud). Ton accent et ta bonne humeur m’ont manqué et me manquent encore. Merci d’avoir été là.

Après avoir remercié les collaborateurs les plus proches de ce travail il me faut maintenant remercier tout les autres qui bien que menant leur propres barque on bien voulu m’accorder de leur temps et partager avec moi les nombreux moments inoubliable que j’ai passé à Bordeaux.

N’en déplaise à la bienséance je vais cette fois‐ci commencer par remercier les étudiants du CNIC (passé et présent).

Edith. Entre le thym et le Cumin se dégage une douce odeur de gâteau sucré attestant de la présence d’un « sexy dolup » qui reste toujours « fraiche comme un lardon ». Ce soir avec didit nous irons surement cocher les cases d’une grille d’euro million avant bien sûr d’aller descendre une Carlsberg. Nous gagnerons c’est sûr puisque nous avons garé la voiture sur notre place rituelle. Nous

pourrons donc acheter une île sur laquelle nous bâtirons ZANAX ® notre maison de 50 pièces. Edith

pourra alors enfin passer ses journées à faire le ménage pendant que je serai dans un hamac. Ed viendra me voir tout sourire je lui dirai alors «tu sais ma puce faudrait vraiment que tu fasses quelques chose pour tes cheveux»… Elle fera un sourire crispé et partira à la recherche d’une répartie cuisante qui arrivera… trop tard… Edith tu comprendras potentiellement tout ça et tout ce que ça veut dire pour moi/toi/nous quoi.

Au tour des trois anciens qui pour moi restent indissociables, Stéphane, Ludo et Pierre. Vous avez su nous montrer la voie à suivre et avez réussi à supporter nos plaintes et nos sauts d’humeur (j’écris « nos » par honte d’écrire « mes »). Les années passent et vous restez toujours pour moi l’objectif à atteindre. Pierre merci de m’avoir fait comprendre que la biologie moléculaire c’est l’ADN tout ça tout ça... Stéphane merci de m’avoir laissé croire que je pouvais dire des trucs pas trop con parfois. Ludo merci d’avoir été mon modèle tout simplement.

Je demande aux personnes dont le nom va suivre de s’avancer d’un pas : François (mon basque, ça serait le pied de pouvoir partager à nouveau mon bureau avec toi grand), Azza (ma azzazou, tes blagues et ta bonne humeur me manquent terriblement), Seb (le mec le plus spontané au monde, c’est quand que tu viens me voir parigot ???), Aurélie (la pile électriques aux 120 casquettes mais toujours disponible pour une bière), Stephanie G.B. (la petite maman, je te souhaite tout le bonheur du monde), Stephanie A.Q. (l’autre maman, je suis lié à toi pour la vie par la date du 19 Décembre 2008), Yves (le seigneur des terres de Castillon la bataille) et Maude (l’autre toulousaine, celle qui a partagé avec moi les affres du DEA).

Un grand merci à vous tous !

Je voulais aussi remercier Oli et Sylvain qui ont tout deux fortement participé à cette thèse tant leur soutien moral a été fort. Je vous dois beaucoup à tous les deux et puisque je me rends compte que je ne trouve pas la formule adéquate pour vous remercier comme vous le méritez je vous propose simplement qu’on se retrouve un de ces jours autour d’un verre (de bordeaux of course) ou plus simplement d’un pichet de bière !

Je tiens aussi à remercier du fond du cœur l’ensemble du personnel technique qui facilite et rend possible le travail au quotidien que cela soit dans les animaleries, les salles d’histologie, les locaux techniques et informatiques ainsi que l’intendance et le secrétariat. Un remerciement particulier à Maïté ROY qui avant de nous quitter a fortement contribué à la formation technique de nombreux étudiants dont j’ai eu la chance de faire partie.

Enfin merci à l’ensemble des chercheurs titulaires du CNIC trop nombreux pour être nommé individuellement mais qui par le biais de nombreuses discutions formelles et informelles ont participé a la construction de mon esprit critique durant ces 4 année.

Enfin je remercie aussi mes amis castrais, albigeois, toulousains, ruthénois, mazamétains, montpelliérains et autres qui malgré la distance restent auprès de moi.

Et bien entendu merci à ma famille qui n’a eu de cesse de croire en moi, je vous dédie ce manuscrit car sans vous il n’aurait jamais pu voir le jour. MERCI pour votre présence et pour vos encouragements. Merci tout d’abord à mes parents qui ont toujours cru en moi, même dans les moments où je perdais confiance. Merci à Mes sœurs Kinou et Zaza qui m’ont longtemps poussé vers l’avant. Sans vous je serais certainement encore en train de bosser mes verbes irréguliers. Merci a mes beaux‐fréres Dada et Jéjé, Médecins et Docteurs Je n’ai pas eu l’envie de vous surpasser mais votre proximité m’a poussé à me dépasser. « L'envie veut abaisser et l'émulation égaler. L'une s'afflige des succès, l'autre y aspire. Celle‐là est jalouse de tout mérite et l'autre en est ambitieuse. ».

Enfin Merci à mes six petits anges Lena, Emma, Elise, Colin, Cloé et Milan. Vous observer grandir est une de mes plus grandes joies. Merci pour ces moments passés avec vous et merci pour toutes vos preuves d’amour.

SOMMAIRE

INTRODUCTION GENERALE I- Cadre général du travail de thèse. 1 II- Conditionnement de Trace : Définition et aspects cognitifs. 3 II- Aspects théoriques du conditionnement de Trace. 10 III- Aspects neurobiologiques. 18 IV- Principaux objectifs de ce travail de thèse. 26

CHAPITRE I :

Sélection des paramètres du protocole expérimentaux INTRODUCTION I- Effets de manipulations de l’intensité du SI. 27 II- Les critères pris en comptes pour la mise en place du protocole de Trace. 28 III- Approche expérimentale. 30 Expérience 1: Effet de l’intensité du SI sur le conditionnement à un son. 31 Expérience 2 : Possibilité d’un conditionnement au contexte par un protocole non apparié. 40 Expérience 3 : Sélection d’un intervalle de Trace 46 DISCUSSION I- Intensité du SI et Réponse Conditionnée. 55 III- Conditionnement avec intervalle de Trace variable. 56 II- Nature du SC et Réponse Conditionnée. 57 CONCLUSION 62

CHAPITRE II : Composante contextuelle du conditionnement de Trace «Implication de l’hippocampe et de ses sous-régions»

INTRODUCTION I- L’hippocampe. 63 II- Approche expérimentale. 74 Expérience 1: Lésion totale de l’hippocampe. 75 Expérience 2: Inactivation des sous-régions hippocampiques. 84 DISCUSSION I- Aspects méthodologiques. 92 II- L’inactivation de l’hippocampe ventral reproduit les effets de la lésion totale. 93 III- Contribution de l’hippocampe dorsal au conditionnement de peur associé au contexte et de Trace. 97 IV- Relation entre conditionnement de trace et conditionnement contextuel. 98 V- L’hippocampe comme support de la « Trace ». 99 CONCLUSION 102

CHAPITRE III :

Conditionnement de Trace et Trace persistante «Rôle du cortex entorhinal et du cortex préfrontal médian»

INTRODUCTION I- Le Cortex Préfrontal. 103 II- Le cortex entorhinal. 112 III- Approche expérimentale. 116 Expérience 1:Lésion du Cortex Préfrontal médian. 118

Expérience 2: Lésion du cortex entorhinal. 124 DISCUSSION I- Effets de la lésion du CPFm. 131 II- Effets d’une lésion du CE. 134 CONCLUSION 138

CHAPITRE IV : Conditionnement de Trace et Trace persistante

«Implication du système cholinergique du cortex entorhinal lors du conditionnement de Trace»

INTRODUCTION I- Les neurones à activité persistante. 139 II- Système cholinergique du cortex entorhinal. 142 III- Approche expérimentale. 147 Expérience 1 : Déafférentation cholinergique du cortex entorhinal. 149 Expérience 2: Blocage des récepteurs muscariniques M1 du CE par la pirenzépine durant le conditionnement. 157 Expérience 3: Blocage des récepteurs muscariniques M1 du CE par la pirenzépine après le conditionnement. 164 DISCUSSION I- Absence d’effet de la déafférentation cholinergique. 169 II- Effets sélectifs du blocage des récepteurs M1. 171 III- Rôle de l’acétylcholine dans le conditionnement de Trace. 174 CONCLUSION 176

DISCUSSION GENERALE

I- Rappel des principaux résultats. 177 II- Nature et spécificité du conditionnement de Trace. 179 III- Structures et circuits impliqués. 184 IV- Nouveaux mécanismes proposés. 189

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ANNEXES

INTRODUCTION GENERALE


1


I- Cadre général du travail de thèse.

La totalité des travaux présentés dans ce travail de thèse concerne l’étude des

mécanismes impliqués dans la mise en place d’une forme particulière d’apprentissage

associatif : le conditionnement de Trace.

Les apprentissages associatifs reposent sur la capacité des animaux, des invertébrés

jusqu’aux mammifères supérieurs, à établir des associations entre divers éléments de leur

environnement et la survenue d’événement signifiants. Un exemple simple serait la capacité

qu’ont les abeilles à associer la présentation d’une odeur à l’obtention d’une solution sucrée

appliquée sur leur proboscis. L’association faite par l’abeille entre ces deux éléments induira

alors une modification comportementale et la simple présentation de l’odeur sera par la suite

capable d’induire à elle seule une extension du proboscis (Bitterman et coll., 1983; Vergoz et

coll., 2007).

Afin de faciliter la compréhension et la généralisation de ces phénomènes, l’étude des

apprentissages associatifs a donné naissance à un champ lexical qui lui est propre. Ainsi, si on

reprend l’exemple précédemment cité, l’odeur présentée à l’abeille serait définie comme étant

le "stimulus conditionnel" (SC), c'est-à-dire un stimulus neutre préalablement à

l’apprentissage, alors que la solution sucrée ferait quant à elle office de "stimulus

inconditionnel" (SI), c'est-à-dire un stimulus ayant une pertinence biologique pour l’animal.

L’extension du proboscis après présentation de l’odeur à la suite du conditionnement

constitue la "réponse conditionnée" (RC) due à l’association faite entre le SC et le SI.

Selon les théories actuelles du conditionnement classique, il apparaît que la

présentation du SC suite à un conditionnement peut évoquer une représentation du SI et que

c’est alors cette représentation du SI qui provoquerait l’expression de la RC. En d’autres

termes, présenter l’odeur à l’abeille alors que l’abeille a déjà expérimenté que cette odeur

précédait l’obtention d’une solution sucrée va provoquer chez l’abeille un rappel de cette

solution sucrée, et ainsi entraîner la réponse d’extension du proboscis.


2

1) Un peu d’histoire.

Les bases théoriques du conditionnement classique ont été posées par Ivan P. Pavlov

(1849-1936). Physiologiste de formation, il est avec le psychologue américain John B.

Watson (1878-1958) un des fondateurs et piliers du mouvement behavioriste selon lequel la

psychologie repose sur l'étude du couple stimulus-réponse et l'adaptation à une situation

déterminée. Le behaviorisme, pour lequel les apprentissages font référence à un changement

dans le comportement de l’organisme, s’oppose alors au mouvement cognitiviste (Edward C.

Tolman 1886-1959) pour lequel les apprentissages reposent sur l’acquisition d’un savoir.

Au cours de ses travaux menés sur le chien et portant initialement sur la physiologie

des glandes gastrique et salivaire, Pavlov étudiait la mise en place du réflexe salivaire lors de

la présentation d’aliments. Or, au fur et à mesure de ces expériences, Pavlov s’aperçut

qu’après un certain nombre de présentations du stimulus alimentaire, ce dernier n’était plus le

seul à provoquer chez l’animal une salivation, mais que divers autres stimuli, tels que le bruit

induit par l’arrivée de l’expérimentateur apportant la nourriture, étaient eux aussi capables

d’induire ce phénomène. Pavlov en conclut qu’un réflexe appris avait été mis en place par

l’appariement d’un stimulus neutre et de la nourriture dans la bouche de l’animal. Pavlov,

conscient que ce phénomène constituait une forme simple d’apprentissage et que

l’apprentissage représentait un mystère scientifique, décida de concentrer ses efforts sur

l’étude de ce phénomène. Il réalisa alors rapidement qu’une approche purement

psychologique et descriptive se révélerait sujette à de nombreuses controverses. De plus, ce

type d’approche était totalement contraire à sa formation de physiologiste. Il décida alors de

mener son étude de façon plus expérimentale puisque, selon lui, le cerveau pouvait être

considéré et étudié comme n’importe quel autre organe. Ainsi l’apprentissage devrait pouvoir

être traité comme n’importe quel autre mécanisme biologique à l’aide de constatations

objectives et de protocoles expérimentaux contrôlés.

A partir de ce constat, Pavlov et ses collaborateurs conçurent un grand nombre

d’expériences simples afin d’étudier le phénomène d’apprentissage. Ses travaux, toujours

menés chez le chien, furent publiés sous le titre "Conditioned reflexes : an investigation of the

physiological activity of the cerebral cortex" (Pavlov, 1927). Ils constituent encore

aujourd’hui la base de la psychologie expérimentale comparée. Il est à noter que le


3

conditionnement de Trace qui est le sujet de ce manuscrit a été défini par Pavlov dans le cadre

de ces études.

2) Les règles gouvernant les associations Pavloviennes.

Dès 1927, un certain nombre de lois sous-tendant la mise en place et la force d’un

apprentissage associatif furent énoncées par I.P. Pavlov. Pavlov en énonça trois comme

prépondérantes : la contiguïté, la fréquence et l’intensité. Ces trois lois stipulent que

l’association entre un SC et un SI va pouvoir être réalisée à partir du moment où ces deux

stimuli vont être présenté de façon contiguë (loi de contiguïté) (Gormezano et Kehoe, 1981),

qu’ils vont être associés de manière répétée (loi de fréquence) et enfin que leur intensité

respective va déterminer la force de leur association (loi d’intensité).

Bien que ces lois soient restées d’actualité durant une trentaine d’années après la mort de

Pavlov, R. Rescorla les révisa dans les années 60. Deux des avancées majeures apportées par

Rescorla dans ce cadre furent l’ajout de la loi de contingence ainsi que la prise en compte de

la compétition entre divers SC dans le modèle formel d’apprentissage qu’il établit (Rescorla et

Wagner, 1972).

La loi de contingence stipule que la probabilité de survenue du SI doit être plus forte en

présence du SC qu’en son absence. En d’autres termes, il faut que le SC soit "prédictif" de

l’occurrence du SI. Ainsi, de manière pratique, il faut non seulement que l’appariement SC/SI

soit présenté de façon répétée (on retrouve ici la loi de fréquence), mais aussi que le SI ne soit

pas présenté indépendamment du SC. Pour Rescorla, c’est sur le facteur de contingence plus

que sur celui de fréquence que repose la capacité du SC à correctement induire un

conditionnement (Rescorla, 1968; Miller et coll., 1995).

II- Conditionnement de Trace : Définition et aspects cognitifs.

1) Définition.

Le conditionnement de Trace est une forme particulière de conditionnement Pavlovien

lors duquel la présentation du SC et du SI sont séparés par un intervalle de temps "vide"


4

généralement nommé intervalle de Trace. On oppose généralement le conditionnement de

Trace au conditionnement de Délai durant lequel les stimuli sont présentés de manière

contiguë. Très tôt, il a été reconnu que la capacité des animaux à établir une association entre

ces deux stimuli malgré la présence de cet intervalle de Trace allait à l’encontre de la loi de

contiguïté (Guthrie, 1930 ; Razran, 1930). Il était pourtant largement admis que l’existence de

la contiguïté entre stimuli est nécessaire à l’établissement de cette association. Ainsi, un des

enjeux majeurs quant à la compréhension du conditionnement de Trace consiste à

appréhender les mécanismes cognitifs et neurobiologiques qui permettraient de compenser

cette violation de contiguïté.

2) Les différentes formes de conditionnement de Trace.

Depuis la première description du conditionnement de Trace par Pavlov, les

caractéristiques de cet apprentissage associatif ont été décrites dans de nombreux autres

paradigmes expérimentaux parmi lesquels : le conditionnement du clignement palpébral chez

l’homme (Hansche et Grant, 1960), la réponse masticatoire conditionnée (Seager et coll.,

1999), le conditionnement de la membrane nictitante chez le lapin (Gormezano et coll., 1983)

le conditionnement de peur (Kamin, 1965) ou encore l’aversion gustative ou olfactive

conditionnée (Garcia et coll., 1966; Ferry et coll., 2006). Ces trois derniers paradigmes

expérimentaux sont particulièrement intéressants, tout d’abord parce qu’ils sont à l’origine de

la majorité de la littérature actuelle portant sur le conditionnement de Trace, mais aussi et

surtout parce qu’il existe une différence fondamentale entre eux en ce qui concerne la durée

de l’intervalle de Trace qu’ils autorisent.

a) Conditionnement de la membrane nictitante.

Le conditionnement de la membrane nictitante repose sur l’association d’un stimulus

élémentaire (SC) tel qu’un son ou une lumière avec la présentation d’un souffle d’air ou d’un

léger choc électrique (SI) au niveau de l’œil de l’animal (la plupart du temps le lapin). Cette

association se traduit par la mise en place d’une réponse conditionnée qui consiste en un

clignement de la membrane nictitante (une troisième paupière translucide que possèdent

certains animaux et qui permet de protéger et d’humidifier l’œil tout en conservant une

certaine vision). Il faut noter que, dans ce protocole, la RC quantifiée est identique à la


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réponse comportementale manifestée en présence du SI ou réponse inconditionnée (RI). De

plus, il a été largement démontré que lors d’un conditionnement de Trace de la membrane

nictitante, le pic de RC après présentation du SC se produit peu avant le moment prévu de

l’arrivée du choc (Gormezano et coll., 1983). Ceci met en évidence que la composante

temporelle du conditionnement de Trace fait partie intégrante de l’association acquise

(Marchand et coll., 2004). Ce phénomène représente une forte contrainte pour les modèles

d’apprentissage qui se sont appliqués à rendre compte de ce phénomène, comme nous le

verrons par la suite.

La mise en place d’un tel apprentissage nécessite généralement un grand nombre

d’appariement SC/SI, de l’ordre de 400 (Tableau O-1) que le conditionnement soit effectué en

protocole de Délai ou de Trace. De plus, les intervalles de Trace que peut supporter ce

conditionnement sont courts, de l’ordre de quelques centaines de millisecondes

(Tableau O-1).

Références Protocole Durée du SC en ms

Durée de l'intervalle de Trace en ms

Durée du SI en ms

nombre total d'appariements

Trace courte 100 300 150Trace longue 100 500 150

Nowak et Gormezano (1990) Délai 400 0 100 480Délai 350 0 100Trace 250 500 100

Thompson et coll. (1996) ; Griffin et coll. (2004) Trace 100 500 100 400

Chachich et Powell (1998) Délai 1000 0 250 450 maximum

Délai 400 0 150

Trace 100 500 150

Délai 250 0 100Trace 250 250 100Délai 650 0 50Trace 500 500 50

Délai 250 0 100

Trace courte 250 250 100Trace longue 250 500 100

Délai 1000 0 100Trace 500 500 100Délai 590 0 10Trace 280 300 10

Kim et coll. (1995) 90

McLaughlin et coll. (2002) 960

Tseng et coll. (2004) 300

Green et Arenos (2007) 540

Oswald et coll. (2006) 450

Kronforst-Collins et Disterhoft (1998) ; McEchron et

Disterhoft (1999)800

Weiss et coll. (1999) 750

Moyer et coll. (1990) entre 400 et 800

Tableau O-1 : Paramètres courants du conditionnement de la membrane nictitante. Dans le protocole de Délai, SC et SI se terminent au même instant (coterminent). Ces intervalles de trace n’excédent pas 500 ms.


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b) Conditionnement de peur.

L’intégralité de nos travaux se situe dans le cadre du conditionnement de peur. Dans le

conditionnement de peur, le SC va la plupart du temps être un son et le SI un choc électrique

appliqué au niveau des pattes d’un animal explorant un environnement. En raison de

l’appariement systématique entre ces deux stimuli, une association va se mettre en place.

Cette association se traduira par la suite par l’apparition d’une RC de peur lors des

présentations ultérieures du son. La peur conditionnée se manifeste par diverses réactions

comportementales et viscérales (Fanselow, 1984; LeDoux, 1998; Antoniadis et McDonald,

1999), mais la mesure la plus utilisée chez le rongeur est le comportement d’immobilité ou

freezing. Cette RC particulière se caractérise par une immobilisation totale de l’animal à

l’exception des mouvements respiratoires (Blanchard et Blanchard, 1969).

A l’inverse du conditionnement de la membrane nictitante, la spécificité temporelle de

la RC de peur suite à un conditionnement de Trace est peu documentée. Il semblerait tout de

même qu’il existe une sélectivité de la RC pour des intervalles de Trace inférieurs à 12s

(Burman et Gewirtz, 2004). Cependant cette sélectivité serait moindre lors d’utilisation

d’intervalles plus longs (Marchand et Kamper, 2000).

Cette forme d’apprentissage présente de multiples intérêts dans le cadre de l’étude du

conditionnement de Trace. Premièrement, ce type de conditionnement nous permettra

d’évaluer la relation entre conditionnement de Trace et conditionnement contextuel, comme

nous le verrons plus loin. Deuxièmement, le conditionnement à un stimulus élémentaire reste

possible avec des intervalles de Trace allant jusqu’à une minute (Kamin, 1965; McKinzie et

Spear, 1995). En particulier, des intervalles de Trace de 20 à 30 s sont couramment employés

(Tableau O-2), ce qui semble approprié dans le cadre de l’étude d’un phénomène concernant

des stimuli séparés dans le temps. Enfin ce conditionnement peut être obtenu en peu d’essais,

fréquemment moins d’une dizaine, qui peuvent être effectués au cours d’une même séance

d’acquisition.

c) Aversion gustative conditionnée.

Ce type de conditionnement consiste à associer un aliment ou une boisson peu

familière (SC) avec un malaise gastrique induit par l’expérimentateur (SI). L’association entre

ces deux stimuli se traduira par la suite par une réponse d’évitement de l’aliment conditionné

(RC) (Garcia et coll., 1966). Cette association reste possible même si l’intervalle entre le SC


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et le SI est de plusieurs heures. La possibilité d’obtenir un conditionnement malgré des

intervalles de Trace aussi longs semble inexplicable par toutes les formulations théoriques

basées sur la contiguïté (Rozin et Kalat, 1971), même si un intervalle de Trace de quelques

centaines de millisecondes est déjà en lui-même une violation de la contiguïté (Gormezano et

Kehoe, 1981).

Références Protocole Durée du SC en s

Durée de l'intervalle de

Trace en s

Durée du SI en s

nombre total d'appariements

Délai 15 0 0,5 10Trace 15 30 0,5 10Délai 15 0 0,5 10Trace 15 30 0,5 10Délai 5 0 0,5Trace 5 2 0,5Délai 30 0 1 2Trace 30 2,5 1 4Délai 16 0 2Trace 16 18 2Délai 10 0 0,7Trace 10 20 0,7Délai 15 0 0,5 8Trace 15 30 0,5 8

Délai 20 0 2 5

Trace 20 20 (maximum) 2 5

Gilmartin et McEchron (2005) Trace 5 20 0,8 24

Délai 30 0 2 1Trace 30 45 (maximum) 2 1Délai 20 0 1 5Trace 20 60 (maximum) 1 5

Blum et coll. (2006) Trace 10 20 0,7 7Long Délai 20 0 1 10

Trace 10 10 1 10Yoon et Otto (2007) Trace 20 30 2 10Quin et coll. (2008) Trace 16 28 2 10

Wanisch et coll. (2005)

Hunt et Richardson (2007)

Runyan et coll. (2004)a ; (2004)b 8

Weitemier et coll. (2004)

Chowdhury et coll. (2005) ; Wiltgen et coll.

(2005)

Misane et coll. (2005)

10

Huerta et coll. (2000)

Kinney et coll. (2002)

Han et coll. (2003) 6

McEchron et coll. (1998)

Baeg et coll. (2001)

Tableau O-2 : Paramètre courant du conditionnement de peur à un son.


8

3) Aspects cognitifs du conditionnement de Trace.

Si l’étude des mécanismes permettant la mise en place du conditionnement de Trace

présente un intérêt en soi, les recherches actuelles menées sur les mécanismes et les

spécificités de ce conditionnement suggèrent qu’il pourrait constituer un modèle d’étude d’un

grand intérêt dans le cadre de la compréhension de processus neurobiologiques majeurs tels

que ceux impliqués dans l’attention, la conscience ou encore le vieillissement cérébral.

a) Trace, attention, conscience.

Une des particularités du conditionnement de Trace par rapport aux conditionnements

effectués en protocole de Délai est qu’il semble nécessiter une capacité cognitive d’ordre

supérieur, la conscience. Il a effectivement été montré chez l’homme, à la suite d’un

conditionnement du réflexe de clignement palpébral, que le niveau de RC manifesté en

présence du SC était étroitement lié au degré de conscience qu’auraient les sujets du lien

d’appariement entre SC et SI. La conscience de cette relation n’influe sur les performances

que dans le cas d’un conditionnement de Trace et mais pas en protocole de Délai (Clark et

Squire, 1998). Ces résultats ont par la suite été reproduits à plusieurs reprises (Clark et Squire,

1999; Manns et coll., 2000b, 2000a, 2002).

Dans une étude de 1999, Robert Clark et Larry Squire ont mis en évidence que

l’insertion d’un stimulus distracteur ponctuel, présenté de façon régulière durant tout le

conditionnement, induisait chez l’homme une diminution de la conscience de la relation entre

SC et SI, que le conditionnement soit effectué en Délai ou en Trace. Cependant la présence du

distracteur n’induisait un déficit de RC que chez des sujets conditionnés en Trace. De plus, ce

déficit était similaire à celui observé chez les sujets conditionnés en Trace sans stimulus

distracteur, quand ces sujets n’avaient pas pris conscience de la relation entre SC et SI (Clark

et Squire, 1999). Il a été montré par la suite chez l’homme, dans le cadre d’un

conditionnement de peur, que le conditionnement de Trace, mais pas de Délai, représente une

charge attentionnelle (Carter et coll., 2003).

Les relations entre conscience et attention identifiées ainsi dans le conditionnement de

Trace sont d’une importance capitale en ce qui concerne la généralisation de ces concepts à

l’animal (Griffin et Speck, 2004). Il s’agit d’un point théorique difficile, mais le fait que, chez

la souris, la présentation d’un stimulus distracteur durant un conditionnement de peur interfère


9

là aussi sélectivement avec le conditionnement de Trace (Han et coll., 2003) suggère qu’un

processus analogue à la conscience pourrait également être requis pour l’établissement d’un

conditionnement de Trace chez le rongeur.

Ces résultats pourraient, selon les auteurs, rendre compte de l’implication dans le

conditionnement de Trace de structures cérébrales telles que l’hippocampe ou encore le cortex

cingulaire antérieur, en raison de leur rôle supposé dans les processus de mémoire déclarative

et attentionnels (Clark et Squire, 1998; Han et coll., 2003).

b) Vieillissement et Pathologies.

Le vieillissement cérébral s’accompagne un certain nombre de déficits mnésiques,

spécialement en ce qui concerne les tâches impliquant le lobe temporal médian (Rapp et

Amaral, 1991; Knuttinen et coll., 2001; Rosenzweig et Barnes, 2003). Une partie de ces

déficits semblent imputable à des troubles de l’attention chez les sujets âgés (Burke et coll.,

1987; Amenedo et Diaz, 1998; Kok, 2000). Par conséquent, il a été suggéré que l’âge pouvait

aussi induire des déficits de conditionnement de Trace. Cela semble effectivement être le cas

puisqu’il a été montré que des sujets âgés présentent un déficit sélectif dans leur capacité à

acquérir un conditionnement de Trace du réflexe de clignement palpébral (Weiss et

Thompson, 1992; Knuttinen et coll., 2001) alors qu’ils arrivent tout de même à acquérir ce

conditionnement en protocole de Délai, bien que la vitesse d’acquisition soit plus lente que

celle de sujets plus jeunes (Woodruff-Pak et Thompson, 1988; Weiss et Thompson, 1992;

Solomon et Groccia-Ellison, 1996; Knuttinen et coll., 2001). Plus récemment, des résultats

comparables ont été obtenus avec un conditionnement de peur effectué en Trace chez le rat

(McEchron et coll., 2004; Moyer et Brown, 2006). Le fait que les animaux âgés ne soient

déficitaires que dans le cas du conditionnement de Trace confirme que ce déficit est bien

d’ordre mnésique et non pas simplement lié à l’expression de la RC.

L’étude des mécanismes sous-tendant le conditionnement de Trace semble donc très

intéressante dans le cadre de la compréhension des perturbations neurobiologiques induites

par l’âge et dans la recherche de traitements visant à les compenser.


10

III- Aspects théoriques du conditionnement de Trace.

Le conditionnement de Trace doit son nom à la principale théorie visant à rendre

compte de la possibilité des animaux à établir une association Pavlovienne malgré la présence

d’un intervalle de temps. Il a en effet très rapidement été suggéré que si le SC n’était pas

présent au moment de l’arrivé du SI, il devait néanmoins avoir laissé une empreinte ou

"Trace" de son passage. Ce serait alors cette Trace du SC et non le SC lui-même qui serait

associé au SI.

Il est intéressant de noter que cette hypothèse peut être mise en parallèle avec la

théorie du philosophe anglais David Hartley (1705-1757) pourtant antérieur à Pavlov. Sa

théorie des vibrations, bien qu’incorrecte au niveau physiologique, postulait effectivement

déjà à l’époque l’existence « d’une vibration physiologique rendant compte d’une persistance

des sensations après arrêt de l’événement stimulant » (Gormezano et Kehoe, 1981).

Ainsi le problème majeur posé par le conditionnement de Trace consisterait à

comprendre quelle pourrait être la nature de la " Trace " laissée par le SC. Il existe à l’heure

actuelle deux théories majeures: la médiation contextuelle et la Trace persistante.

1) La Médiation contextuelle.

Lors de tout conditionnement, il existe un ensemble d’éléments présents en

permanence dans l’environnement du sujet qui eux aussi sont capables d’entrer en association

avec le SI. L’ensemble de ces éléments est regroupé sous le terme générique de "contexte".

Les théories actuelles du conditionnement contextuel supposent que, au contraire d’une

association avec un stimulus élémentaire, l’association entre le contexte et le SI nécessite

l’acquisition préalable par l’animal d’une représentation unifiée/configurale de cet ensemble

d’éléments (Rudy et O'Reilly, 1999).

L’hypothèse de la médiation contextuelle repose sur cette capacité de l’animal à

associer le contexte et le SI, car elle postule que c’est cette association qui permettrait à

l’animal d’établir une association entre le SC présenté en Trace et le SI (figure O- 1B).

L’hypothèse de la médiation contextuelle regroupe en fait trois hypothèses distinctes mais

ayant toutes trois comme point commun de donner un rôle central au contexte de

conditionnement lors du conditionnement de Trace.


11

Selon la première hypothèse, le conditionnement de Trace serait en fait la résultante

d’une association de second ordre entre le SC et le contexte (Quinn et coll., 2002). Le

conditionnement de second ordre est généralement mis en évidence à l’aide d’un protocole

particulier durant lequel une première phase consiste à présenter un premier SC (SC1) apparié

à un SI. Dans une seconde phase, on présente un deuxième SC (SC2) de manière appariée au

SC1. Après cette seconde phase le SC2 pourra évoquer une RC comme s’il avait été

directement associé au SI (Yin et coll., 1994). Dans le cas du conditionnement de Trace le

contexte jouerait le rôle de SC1 et le stimulus présenté en Trace celui de SC2. En outre les

deux phases d’association seraient effectuées simultanément (Kaplan et Hearst, 1982; Chang

et coll., 2004).

La deuxième hypothèse repose sur la nature même du conditionnement contextuel et

postule que le conditionnement de Trace résulterait d’une intégration du SC à la

représentation configurale du contexte. Le SC serait en fait considéré comme un élément à

part entière du contexte et associé au SI en tant que tel (Quinn et coll., 2002; Green et Arenos,

2007).

La troisième hypothèse reste relativement vague et postule que c’est en fait

l’intégralité de l’épisode de conditionnement qui serait rappelée par la présentation du SC lors

du test.

Le point commun entre ces trois hypothèses est qu’elles nécessitent toutes les trois que

l’animal soit capable d’établir un conditionnement au contexte pour pouvoir établir un

conditionnement de Trace.

Ainsi, il apparaît nécessaire de tenter d’élucider les relations entre le conditionnement

de Trace et le conditionnement contextuel en tentant pour cela de mettre en évidence

d’éventuelles dissociations entre ces deux types de conditionnement (Marchand, 2004).

2) La Trace persistante.

Une seconde classe d’hypothèses suppose que le SC serait capable à lui seul d’induire

une activité persistante qui constituerait le stimulus effectif entrant en association avec le SI.

La Trace du SC serait alors une sorte de "représentation" du SC au niveau neuronal, et c’est

cette "représentation" qui serait associée au SI (Figure O-1B). L’hypothèse de la trace

persistante rapprocherait ainsi le conditionnement de Trace du conditionnement de Délai en


12

rétablissant au niveau neuronal la contiguïté absente entre les stimuli. Une telle hypothèse ne

nécessite pas l’intervention d’indices autres que le SC lui-même.

La Trace du SC est définie comme le maintien, déclenché par la présentation du SC,

d’une information qui est propre à celui-ci. La question reste de savoir par quel processus ce

maintien de la Trace neuronale durant plusieurs dizaines de secondes serait rendu possible. Il

est possible d’envisager qu’un des processus requis serait la mémoire de travail.

La mémoire de travail peut être définie comme étant un système ayant une capacité de

stockage limitée et temporaire, et une capacité de manipuler les informations lors de tâches

cognitives (Hasselmo et Stern, 2006). Ce type de mémoire est actif et efficace uniquement

durant une courte période de temps, généralement de l’ordre de plusieurs dizaines de secondes

(Goldman-Rakic, 1995). Un exemple couramment utilisé d’utilisation humaine de ce type de

mémoire est la capacité de retenir un nouveau numéro de téléphone qui, une fois composé,

aura de forte chance d’être oublié. Chez l’animal, ce type de mémoire est généralement évalué

dans des paradigmes de reconnaissance différée (appariement ou non appariement retardé)

dans lesquels l’animal doit retenir durant quelques secondes la nature d’un item (objet, odeur,

emplacement) qui vient de lui être présenté, afin d’effectuer un choix au terme d’un délai

imposé.

Compte tenu de leurs définitions respectives, il semble possible que ce soit par le biais

de la mémoire de travail que la Trace du SC serait maintenue durant l’intervalle de Trace.

Pourtant, à notre connaissance, aucun auteur n’a encore démontré de façon probante

cette possibilité, même si elle a déjà été suggérée (Kesner, 2005). Ceci est probablement en

grande partie dû au fait que la mémoire de Travail est mise en jeu dans la réalisation de tâches

préalablement entraînées et que c’est la connaissance préalable de cette tâche qui induit le

maintien de l’information pertinente. Dans le conditionnement de Trace, à l’inverse,

l’information à maintenir est relativement nouvelle et ne devient pertinente qu’au cours de

l’association SC/SI.

Cependant, nous pouvons poser l’hypothèse que la mémoire de Travail et le

conditionnement de Trace sont étroitement liés. S’il existe une telle relation entre ces deux

processus, alors il devrait être possible d’observer un certain nombre de similitudes entre les

systèmes neurobiologiques qui les sous-tendent. Nous verrons que le travail présenté dans ce

mémoire met en évidence certaines de ces similitudes.


13

SC

SI

Contexte

SCSI

Contexte

SCSI

TRACE PERSITANTE DU SC

Temps

A

B C

3) Modèles Formels.

Il existe plusieurs modèles formels d’apprentissage pouvant être utilisés pour

expliquer le conditionnement de Trace. Nous ne ferons pas ici une liste exhaustive de ces

modèles mais nous parlerons de trois modèles présentant tous un intérêt particulier vis-à-vis

d’au moins une composante du conditionnement de Trace. Bien que ces modèles ne soient pas

discutés par la suite, ils sont en partie responsables du choix de certains de nos paramètres

expérimentaux ainsi que du choix des moments de réponse observée.

a) Le modèle de Rescorla-Wagner.

Le modèle de Rescorla et Wagner (1972) est un modèle formel d’apprentissage basé

sur les lois de contiguïté et de contingence que nous avons explicitées précédemment, mais

permettant aussi de prédire les niveaux de conditionnement observable en présence de

Figure O-1: Représentation schématique du mode d’association du SC et du SI. A : Lors d’un conditionnement de délai, le SC et le SI sont contigus. L’association s’effectue directement, il peut aussi y avoir une faible association du contexte avec le SI. B,C : lors d’un conditionnement de Trace. B : Selon l’hypothèse de la médiation contextuelle, le contexte va servir de support au SI et le niveau de conditionnement du SC sera alors dépendant de l’association préalable du contexte et du SI. C : Selon l’hypothèse de la Trace persistante, la présentation du SC va déclencher une activité neurobiologique persistant dans le temps et c’est cette Trace persistante qui sera le support effectif de l’association avec le SI.


14

plusieurs SC selon leur histoire. Il permet ainsi d’expliquer les phénomènes de compétition

tels que le masquage ou le blocking, mais aussi des phénomènes tels que l’extinction et

l’inhibition conditionnée. Cette théorie suppose que l’expression de la RC est directement

fonction d’une "force associative" acquise par un SC lors de son appariement avec un SI.

L’incrément de force associative lors d’un essai obéit à l’équation suivante :

ΔVX n

+

1 = αXβ (λ –Vn

total)

Cette équation décrit le changement ΔVX n

+

1 de la force associative (V) d’un CS X

après l’appariement avec un SI lors de l’essai n+1; αX est le potentiel d’association du CS X

(ou saillance, liée en grande partie à son intensité) ; β est le potentiel d’association du SI (lié

en grande partie à son intensité) ; λ est la force associative maximale que le SI peut assumer

dans une situation donnée ; Vntotal est la somme des forces associatives de l’ensemble des CS

présents lors de l’essai n+1.

Cette équation prédit qu’au fil des appariements, la force associative totale Vntotal tend

vers une asymptote λ déterminée par les caractéristiques du SI. Lorsque cette force associative

totale est déjà importante, un SC donné ne pourra gagner que peu de force associative lors

d’un essai. L’existence d’une force associative totale limitée qui doit se partager entre les

divers SC en présence est à la base des processus de compétition (Miller et coll., 1995).

Ce modèle met en évidence plusieurs points essentiels que nous aurons à prendre en

compte par la suite. Un SI donné ne peut pas s’associer à l’infini mais ne s’associera

préférentiellement qu’avec les éléments les plus saillants et les plus prédictifs de son

occurrence.

Cependant, dans le cadre de notre étude, ce modèle pose un problème car il est basé

sur la notion d’essai et ne considère que les SC présentés de façon contiguë avec le SI. Dans

sa forme de base, le modèle de Rescorla-Wagner ne tient pas compte de l’agencement

temporel des stimuli et n’est donc pas directement applicable au conditionnement de Trace.

b) Le modèle SOP

Un autre type de modèle peut prendre en compte la configuration temporelle des

stimuli, le SOP (Sometimes Opponent Process) de Wagner (Wagner, 1981; Wagner et

Brandon, 1989). Ce modèle est conçu comme une variation "en temps réel" du modèle de


15

Rescorla-Wagner. Le principe central de ce modèle est qu’il stipule que la représentation

cérébrale d’un stimulus consiste en un large ensemble d’éléments théoriques appelés nœuds.

Chaque élément d’un nœud peut assumer trois états dynamiques distincts : les états actifs A1

et A2 et l’état inactif I. La présentation d’un stimulus va faire passer le nœud de l’état inactif I

à l’état actif A1. Le nœud ne va pas rester dans cet état mais passer progressivement à l’état

A2 et enfin si le stimulus n’est plus présent, passer progressivement à l’état I. Dans le cadre

du conditionnement Pavlovien, il y a donc deux nœuds essentiels, le premier codant pour la

représentation du SC et le second pour la représentation du SI. Le SOP suggère que 2 nœuds

vont être associés lorsqu’ils sont dans un état actif identique. Ainsi pour qu’un

conditionnement associatif ait lieu, il faut que le nœud codant pour le SC soit encore dans

l’état A1 au moment de l’arrivée du SI. Lors de la phase de test, cette association se traduira

par le fait que la présentation du SC et le passage du nœud SC en état A1 induira un passage

du nœud SI de l’état I à l’état A2. C’est ce passage en état A2 du nœud SI qui induit

l’expression de la RC.

Le conditionnement de Trace serait donc explicable si l’on suppose que le passage de

l’état A1 à l’état A2 se fait très lentement (plusieurs centaines de millisecondes pour le

conditionnement de la membrane nictitante mais plusieurs dizaines de secondes pour le

conditionnement de peur) (Figure O-2).

Cependant, si le SOP permet d’envisager la possibilité d’établir un conditionnement de

Trace, il ne permet pas de comprendre la spécificité temporelle des réponses manifestées lors

de certains conditionnements de Trace tel que le conditionnement de la membrane nictitante.

En effet, la cinétique de passage des nœuds entre ces différents états est fixée dès le départ par

le modèle. Elle contraint à la fois les intervalles interstimuli pour lesquels le conditionnement

de Trace pourra être obtenu et les cinétique des réponses conditionnées. Ceci a conduit

Wagner et Brandon (1989) à envisager l’existence de deux systèmes de type SOP en parallèle.

Le premier avec une cinétique rapide rendrait compte des RC défensives ou d’évitement

comme le clignement de la paupière. Le second beaucoup plus lent rendrait compte des RC

affectives/émotionnelles comme dans le cas du conditionnement de peur.


16

SI

A1

A2

ISC

A1

A2

ISI

SC

A2A1A B

ITProp

ortion

totale

d’élém

ents SC

Prop

ortion

totale

d’élém

ents SI

Prop

ortion

totale

d’élém

ents SC et SI

A1A2

A1SCA1SI

c) Le modèle spectral.

Un certain nombre de modèles, dits modèles spectraux, visent à mieux rendre compte

de la spécificité temporelle de la réponse conditionnée. Le modèle spectral (Church, 1999)

postule que tout événement sensoriel va induire de nombreux patrons d’activité parallèles ou

Traces au niveau du système nerveux central. Chaque Trace a une cinétique et une durée de

vie qui lui est propre. Ainsi, le temps passé depuis la présentation du SC serait représenté par

le patron des Traces encore actives à ce moment là et c’est donc l’ensemble de ces Traces qui

serait associé au SI (Buonomano et Mauk, 1994). Ce modèle peut supposer de plus que les

Traces qui sont actives sans présentation du SI deviennent inhibitrices (Marchand et coll.,

2004). Ainsi, toute les Traces s’éteignant avant la présentation du SI et toutes celles persistant

après la présentation de ce dernier deviendraient inhibitrices comme l’indique la figure O-3.

Figure O- 2 : Modèle SOP. A : Représentation de deux nœuds dans le modèle d’apprentissage SOP, l’un étant activé par le SC et l’autre par le SI lors d’un conditionnement Pavlovien. Les cercles interconnectés représentent les trois états possibles de chaque élément des nœuds. Les flèches indiquent le sens de passage d’un état à un autre. Les nœuds sont reliés entre eux pour indiquer la possibilité d’une association excitatrice (flèche) ou d’une association inhibitrice (ligne en T). B : Représentation d’une simulation décrivant la proportion d’éléments du nœud SC (graphe du haut) et d’éléments du nœud SI (graphe du milieu) en état A1 ou A2 à un instant donné. Le graphe du bas met en évidence le fait qu’un certain nombre d’éléments des nœuds SC et SI peuvent se retrouver dans l’état A1 simultanément, même en présence d’un intervalle de Trace. Abréviation : A1 et 2, état Actif ; I, état Inactif ; IT, intervalle de Trace.


17

La cinétique de la RC évoquée refléterait alors une combinaison du profil des Traces

qui ont été associées au SI. Le maximum de RC évoqué correspondrait alors

approximativement au moment de survenue du SI. Ce modèle, qui existe sous plusieurs

formes (Desmond et Moore, 1991; Grossberg et Merrill, 1992; Young et coll., 1997; Buhusi

et Schmajuk, 1999) présente donc l’intérêt d’expliquer la sélectivité temporelle des RC

observées dans le cadre de certains conditionnements de Trace. Il faut cependant préciser que

cette spécificité temporelle est surtout observable pour des intervalles de Trace courts dans un

conditionnement de la membrane nictitante (Grossberg et Schmajuk, 1989). Il n’est donc pas

certain que ce modèle reste valable pour les intervalles de temps classiquement utilisés en

conditionnement de peur (Buhusi et Schmajuk, 1999; Marchand et Kamper, 2000; Marchand

et coll., 2004).

Figure O- 3 : Modèle Spectral. A : Niveau d’activation de plusieurs Traces déclenchées par le même SC en fonction du temps. Seule la Trace ayant un niveau maximum au moment de l’apparition du SI (courbe noire) va être associée au SI de façon activatrice, les autres Traces (en gris) vont être associées au SI de façon inhibitrice. Les barres noires représentent le niveau d’activation et les barres grises le niveau d’inhibition à un instant t. B : Cinétique du niveau de réponse conditionnée (RC) lors du Test (courbe noire pleine). La courbe grise représente la cinétique hypothétique de réponse sans les associations inhibitrices. On peut voir que c’est le cumul des associations activatrices et inhibitrices qui permet la mise en place d’une RC centrée autour du moment prédit de l’arrivée du SI (Ø). Abréviations : IT, intervalle de Trace ; SI, stimulus inconditionnel ; SC, stimulus conditionnel.


18

IV- Aspects neurobiologiques.

Nous présenterons ici principalement les circuits neurobiologiques sous-tendant les

conditionnements de la membrane nictitante et de peur lorsqu’ils sont effectués en protocole

de Délai, car la connaissance préalable de ces circuits est indispensable dans le cadre de

l’étude du conditionnement de Trace. Nous mentionnerons ici brièvement les principales

structures spécifiquement impliquées dans les versions "Trace" de ces paradigmes puisque les

mécanismes et les fonctions de ces structures seront par la suite plus précisément décrits dans

le corps de la thèse.

1) Conditionnement de la membrane nictitante en Délai.

Il est de nos jours admis que, lors d’un conditionnement de la membrane nictitante

effectué en Délai, le cervelet et les circuits qui lui sont associés sont essentiels (figure O-4)

(Thompson et Krupa, 1994; Woodruff-Pak et Disterhoft, 2008).

Ce circuit de base comprend deux voies parallèles responsables respectivement du

traitement du SC et du traitement du SI et concerne essentiellement des structures du tronc

cérébral et cérébelleuses.

Le traitement d’un SC de nature auditive serait effectué par un circuit partant des

noyaux auditifs et relayé au noyau interposé et au cortex cérébelleux via les fibres moussues

en provenance des noyaux du pont. Il a effectivement été montré que des lésions de ce noyau

induisaient un déficit de conditionnement à un stimulus auditif mais pas lumineux (Steinmetz

et coll., 1987). De plus, des stimulations électriques de cette régions peuvent faire office de

SC et se révèlent même plus efficaces qu’un stimulus sonore (Steinmetz et coll., 1986; Tracy

et coll., 1998). En outre, une lésion du noyau interposé empêche le conditionnement

(Steinmetz et coll., 1986).

La voie du traitement du SI serait en fait l’association de deux voies, l’une responsable

de l’émission de la réponse inconditionnée (RI) et l’autre responsable de l’association du SI

avec le SC et de la mise en place de la RC. Il est ici important de rappeler que la RI et la RC

sont de nature identique dans le cadre du conditionnement de la membrane nictitante.

Ces deux voies parallèles ont pour origine les noyaux trijumeaux qui reçoivent les

informations sensorielles (tactiles et nociceptives). Lors de la mise en place de la RI, les


19

informations vont être rapidement transmises aux noyaux moteurs du crâne par une voie

directe, mais aussi indirectement via la formation réticulée. Lors de l’association SC/SI, les

informations vont être transmises au noyau interposé et au cortex cérébelleux via les fibres

grimpantes en provenance de l’olive inférieure. Il a effectivement été montré qu’une lésion de

l’olive inférieure effectuée juste avant l’acquisition empêche la mise en place du

conditionnement (Mintz et coll., 1994). De plus, les neurones de cette aire ne répondent pas

au SC mais uniquement à la présentation du souffle d’air (SI) (Sears et Steinmetz, 1991).

L’olive inférieure est donc capitale dans le traitement du SI lors de l’apprentissage.

La quasi indépendance des voies de traitement du SI responsables de l’expression de

la RI et de l’association avec le SC a pu être mise en évidence par le fait qu’un certain nombre

de lésions du cervelet telle que celles des noyaux interposés abolissent totalement l’ensemble

des composantes de la RC sans affecter la RI, indépendamment de l’intensité du SI (Steinmetz

et coll., 1992; Ivkovich et coll., 1993). De plus, de façon encore plus surprenante, une

inactivation réversible de la formation réticulée par injection de muscimol juste avant la phase

d’acquisition abolit totalement la RI manifestée en présence du souffle d’air mais n’induit pas

de déficit de performance lors de la phase de test ultérieure (Zhang et Lavond, 1991). Ainsi,

l’association entre SC et SI peut être acquise alors même que la RI n’est pas exprimée.

Enfin il est supposé que c’est l’activation conjointe des voies traitant le SI et le SC et

leur convergence au niveau du cortex cérébelleux et du noyau interposé qui permet

l’association entre les deux stimuli (Christian et Thompson, 2003).


20

SI

Noyaux auditifs

Noyaux du pont

Olive inférieure

Noyau trijumeau

Formation réticulée

Noyau rouge

Noyaux moteurs du crane

Noyau Interposé

Fibres grimpantes

CORTEX CEREBELLEUX

SC

RC & RI

Fibres moussues

2) Conditionnement de Peur en Délai.

L’apparente simplicité du conditionnement de peur est à mettre en parallèle avec la

difficulté d’explication des processus opératoires sous-jacents. Pourtant, depuis quelques

années, des apports expérimentaux majeurs ont conduits à l’émergence d’un consensus sur ces

mécanismes. Il a ainsi été défini deux circuits du conditionnement de peur sous-tendant

respectivement le conditionnement à un stimulus élémentaire et le conditionnement au

contexte.

a) Conditionnement de peur à un stimulus élémentaire.

C’est principalement un circuit direct thalamo-amygdalien, ou "circuit rapide" en

provenance du corps genouillé médian et du noyau intralaminaire postérieur (LeDoux et coll.,

1990; Turner et Herkenham, 1991) qui permettrait la formation d’un conditionnement

Figure O- 4 : Schéma simplifié du circuit cérébelleux impliqué dans le conditionnement de la membrane nictitante en protocole de Délai. Deux voies parallèles sous-tendent le traitement du SC et le traitement du SI. Ces deux voies présentent des parties communes notamment au niveau du cortex cérébelleux et du noyau interposé.


21

élémentaire impliquant un SC sonore simple et unimodal. Les informations relatives au SI

transiteraient également par ce circuit court (figure O-5).

Lorsque le SC doit faire l’objet d’une discrimination sur la base de ses propriétés

perceptuelles, un second circuit, plus "long" incluant le cortex auditif semble s’avérer

nécessaire (Romanski et LeDoux, 1993). Le circuit rapide permettrait la mise en place de la

RC avant même que le SC ne soit reconnu, la reconnaissance de ce SC passant par le circuit

long.

L’intégration des données de ces deux circuits semble se faire au niveau du noyau

latéral de l’amygdale (LA). En effet, les projections thalamo-amygdaliennes et cortico-

amygdaliennes convergent sur les même neurones au sein de ce noyau (LeDoux et coll., 1991;

Li et coll., 1996). Des lésions ou des inactivations du LA provoquent d’importantes

perturbations du conditionnement de peur à un SC élémentaire sonore, ce qui confirme le rôle

de ce noyau dans ce type de conditionnement (Muller et coll., 1997; Wilensky et coll., 1999;

Amorapanth et coll., 2000; Nader et coll., 2001)). Il est maintenant largement accepté que le

LA serait un site clef de la plasticité synaptique nécessaire à l’association SC/SI (Maren,

2001; Ferreira et coll., 2008).

Enfin, c’est le noyau central de l’amygdale (CN) qui assurerait l’expression de la

réponse conditionnée, qu’elle soit de nature viscérale, du fait de ses connexions aux régions

hypothalamiques, pontine et médullaire impliquées dans la régulation du système nerveux

autonome, ou comportementale par l’intermédiaire de la substance grise périaqueducale. Il a

effectivement été montré qu’une atteinte du CN interfère avec l’expression des réponses

conditionnées (Kapp et coll., 1979; Gentile et coll., 1986; Hitchcock et Davis, 1986; Nader et

coll., 2001). Dans un modèle révisé, le CN reste central dans l’expression de la réponse de

peur, mais aurait aussi un rôle prépondérant dans les phases d’acquisition et de consolidation

de ce type de conditionnement (Pare et coll., 2004; Wilensky et coll., 2006), ce qui a conduit à

une remise en cause du modèle classique (LeDoux, 2000) dans lequel le CN n’était pas un site

de plasticité.


22

SC/SI

THALAMUS SENSORIEL

AMYGDALE

LA

BLA

CN

CORTEX AUDITIF

RC

b) Conditionnement de peur au contexte.

Que le choc soit présenté de manière appariée ou non appariée avec le SC ou encore

en l’absence de SC, d’autres stimuli présents dans l’environnement peuvent être associés avec

ce SI. Ces éléments, présents de manière continue durant le conditionnement (Rudy et

O'Reilly, 1999; Fanselow, 2000) sont généralement regroupés sous le terme générique de

"contexte". Si nous venons de voir que la structure centrale du conditionnement élémentaire

était l’amygdale et plus précisément le complexe LA/CN, il n’en est pas de même en ce qui

concerne le conditionnement contextuel (Selden et coll., 1991; Phillips et LeDoux, 1992).

En effet, de nombreuses études du conditionnement contextuel ont mis en évidence un

rôle prépondérant de l’hippocampe et ont abouti à l’idée générale que l’intégrité de cette

structure était nécessaire lors de ce conditionnement (Holland et Bouton, 1999; Rudy et coll.,

2004). Les hypothèses actuelles supposent que cette structure serait nécessaire à la formation

d’une représentation unifiée du contexte (Sutherland et Rudy, 1989; Rudy et coll., 2004).

Cette hypothèse est particulièrement étayée par les données observées dans les études de

déficit de choc immédiat. Le protocole de déficit de choc immédiat consiste à soumettre

l’animal à un seul choc électrique immédiatement après l’avoir introduit dans le contexte de

conditionnement et de le retirer immédiatement après. Lors de la phase de test, on s’aperçoit

Figure O-5: Circuit responsable de la peur conditionnée à un stimulus élémentaire. Le Thalamus sensoriel (circuit court) transmet à l’amygdale à la fois les informations concernant le SC et le SI. Les traitements plus complexes du SC sont effectués par le circuit long qui inclut le cortex auditif. Abréviations : BLA, noyau basolatéral ; CN, noyau central ; LA, noyau latéral ; RC, réponse conditionnée ; SC, stimulus conditionnel ; SI, stimulus inconditionné. Adapté de Wilensky et coll. 2006.


23

généralement que l’animal ne manifeste que très peu de peur associée au contexte. En

revanche si l’animal a pu préalablement explorer le contexte pendant quelques minutes on

s’aperçoit qu’à la suite du même conditionnement il manifeste beaucoup plus de RC au

contexte (Kiernan et Westbrook, 1993; Wiltgen et coll., 2001). Il est supposé que la pré-

exposition permet à l’animal d’établir une représentation configurale du contexte et que cette

représentation est nécessaire à la mise en place de l’association (Rudy et O'Reilly, 1999,

2001; Rudy et coll., 2002). Il a en parallèle été montré qu’une inactivation de l’hippocampe

durant la phase de pré-exposition perturbait par la suite l’établissement du conditionnement,

confirmant ainsi le rôle de l’hippocampe dans la mise en place de la représentation du

contexte (Matus-Amat et coll., 2004; Stote et Fanselow, 2004).

Les projections de l’hippocampe vers le complexe amygdalien et spécialement le BLA

semblent capitale dans la mise en place du conditionnement de peur associée au contexte

(LeDoux, 2000). Il a de plus récemment été montré que des inactivations du BLA

préalablement au conditionnement induisait un déficit spécifique de la réponse de peur

associée au contexte, confirmant l’implication sélective de ce noyau lors de ce type

d’apprentissage (Nader et coll., 2001) (figure O-6). A l’inverse, l’inactivation du LA

conduisait à une augmentation de la réponse au contexte en parallèle d’une diminution de la

réponse au SC lors d’un conditionnement à un son (Calandreau et coll., 2005).

CORTEX ENTORHINAL

HIPPOCAMPE

THALAMUS SENSORIEL

AMYGDALE

LA

BLA

CN RC

Stimuli contextuels

Figure O-6: Circuit de la peur conditionnée contextuelle. Abréviations : BLA, noyau basolatéral ; CN, noyau central ; LA, noyau latéral ; RC, réponse conditionnée. Adapté de LeDoux 2000.


24

3) Mécanismes spécifiques des conditionnements de Trace.

Lors de l’utilisation d’un protocole de Trace, les circuits simples de conditionnement

élémentaires ne seraient plus suffisants. Ainsi, aux voies "tronc cérébral-cervelet" pour le

conditionnement de la membrane nictitante et "thalamo-amygdalienne" pour le

conditionnement de peur s’ajouterait une étape de traitement du SC supplémentaire réclamant

la mise en jeu d’une structure majeure dans les processus mnésiques : l’hippocampe.

En effet, il a été montré que des lésions de cette structure perturbaient fortement la

mise en place d’un conditionnement de Trace sans perturber le conditionnement de Délai,

aussi bien dans le cas du conditionnement de la membrane nictitante (Solomon et coll., 1986;

Moyer et coll., 1990) que dans celui du conditionnement de peur (McEchron et coll., 1998;

Burman et coll., 2006; Rogers et coll., 2006).

Il semblerait cependant que l’hippocampe soit impliqué de façon différente dans les

deux types de tâches puisque dans le cadre du conditionnement de la membrane nictitante les

substrats neurobiologiques sous-tendant l’acquisition des conditionnements de Trace et de

Délai semblent pouvoir faire l’objet d’une double dissociation. L’hippocampe contribuerait

spécifiquement au conditionnement de Trace, alors que le cortex cérébelleux ne serait

indispensable que pour un conditionnement de Délai (Woodruff-Pak et coll., 1985; Gerwig et

coll., 2008; Woodruff-Pak et Disterhoft, 2008). Ces auteurs émettent l’hypothèse que, dans le

cadre d’un conditionnement de Trace mais non de Délai, le traitement effectué par

l’hippocampe pourrait se substituer en partie à celui du cervelet pour fournir l’information

concernant le SC aux noyaux du pont. Ce serait donc uniquement la voie du traitement du SC

qui serait modifiée, alors que les mécanismes sous-tendant l’association et le traitement du SI

resteraient les mêmes.

A l’inverse, dans le cadre du conditionnement de peur, il n’a jamais été possible, à

notre connaissance, d’obtenir une telle dissociation entre Trace et Délai puisque toutes les

manipulations affectant le conditionnement de Délai abolissent également le conditionnement

de Trace. Ceci pourrait être dû en grande partie à la simplicité du circuit nécessaire au

conditionnement de Délai et laisse supposer que l’intégralité du circuit impliqué dans ce type

de conditionnement serait aussi nécessaire au conditionnement de Trace.


25

Il semblerait toutefois que le traitement supplémentaire nécessaire au conditionnement

de Trace réclame la mise en jeu d’autres structures du lobe temporal médian dont le cortex

entorhinal pour le conditionnement de la membrane nictitante (Ryou et coll., 2001) et le

cortex périrhinal pour le conditionnement de peur (Kholodar-Smith et coll., 2008), puisque

des lésions de ces structures avant le conditionnement ont des effets comparables à ceux

induit par les lésions hippocampiques.

Enfin, pour ces deux types de paradigmes expérimentaux, il a été montré que le cortex

préfrontal semblait lui aussi essentiel. Les régions du cortex préfrontal médian recrutées

seraient cependant différentes en fonction du type de conditionnement. Le conditionnement

de la membrane nictitante nécessiterait une mise en jeu de la région caudale du cortex

préfrontal (Kronforst-Collins et Disterhoft, 1998; Weible et coll., 2000) alors que le

conditionnement de peur dépendrait davantage des régions Pré- et Infralimbique (Baeg et

coll., 2001; Runyan et coll., 2004; Quinn et coll., 2008). Il faut cependant noter que cette

dissociation n’est que partielle, puisqu’il a été montré que le conditionnement de Trace en

peur conditionnée pouvait lui aussi faire intervenir le cortex cingulaire (Han et coll., 2003).

Si le rôle de structures telles que les cortex entorhinal, périrhinal et préfrontal dans le

conditionnement de Trace reste encore à éclaircir, il n’en est pas moins clair que la

"dépendance hippocampique" de cet apprentissage n’est pas en mesure de rendre compte à

elle seule des processus différenciellement mis en jeux lors du conditionnement de Trace et

du conditionnement de Délai, indépendamment du paradigme expérimental employé. Ainsi il

reste encore à déterminer quel serait véritablement le rôle de l’hippocampe, mais aussi celui

de ces autres structures, dans les processus permettant de compenser la perte de contiguïté

temporelle.


26

IV- Principaux objectifs de ce travail de thèse.

Ce travail de thèse a pour but de tester les deux hypothèses visant à rendre compte de

la possibilité des animaux à établir une association entre deux stimuli présentés de façon

temporellement discontiguë.

Ces hypothèses reposent sur des mécanismes neurobiologiques distincts. Nous

tenterons donc de déterminer laquelle, de la médiation contextuelle ou de la Trace persistante,

contribue au conditionnement de Trace, en effectuant pour cela des manipulations ciblées des

structures cérébrales que nous supposons impliquées dans l’un ou l’autre de ces deux

processus.

Ainsi, après la mise au point préalable d’un protocole de conditionnement de peur à un

son présenté en Trace, nous tenterons, dans un premier temps, de déterminer s’il reste possible

d’observer un conditionnement de Trace sans conditionnement contextuel. Pour cela, notre

action se portera sur une des structures cérébrales majeures du conditionnement contextuel,

l’hippocampe.

Dans un second temps, nous essayerons de déterminer si le conditionnement de Trace

pourrait être effectué grâce à l’existence d’une Trace persistante. Cette partie de l’étude se

focalisera sur le rôle de deux structures impliquées dans les processus de maintien de

l’information nécessaire à la mémoire de travail, le cortex préfrontal médian et le cortex

entorhinal.

Enfin, nous approfondirons le rôle du cortex entorhinal dans l’acquisition du

conditionnement de Trace. Cette dernière approche repose sur des hypothèses précises

concernant la dépendance cholinergique des activités que nous supposons responsables du

maintien de la Trace.

CHAPITRE I

Sélection des paramètres du protocole expérimental

CHAPITRE I : INTRODUCTION

27

INTRODUCTION

Le but de l’ensemble de ce travail est de caractériser les substrats neurobiologiques

spécifiques au conditionnement de Trace, ainsi que de clarifier la nature de ce

conditionnement. Les expériences présentées dans ce chapitre sont essentiellement

méthodologiques. Elles ont pour but de mettre au point un protocole de conditionnement

adapté, en montrant les diverses étapes ayant servi à fixer les paramètres du protocole de

conditionnement de peur qui sera utilisé dans le reste de cette étude. Nous avons donc évalué

l’effet de l’intensité du stimulus inconditionnel (SI) ainsi que de l’intervalle de Trace séparant

le SC et le SI. Ces expériences nous apportent en outre un certain nombre d’informations sur

les caractéristiques des réponses conditionnées obtenues.

I- Effets de manipulations de l’intensité du SI.

Notre objectif est d’obtenir lors du conditionnement des réponses conditionnées

réellement associatives, c’est à dire imputable à l’association faite entre le SC, qu’il s’agisse

du son ou du contexte, et le SI. Il est effectivement possible que la simple présentation de

chocs électriques induise une sensibilisation des réponses à divers stimuli de manière non

associative (Mackintosh, 1974, p 26-27). De même, lorsque l’intensité du SI est élevée (p. ex.

1 mA, Garcia et Jaffard, 1996; Maes et coll., 1996; Maren et coll., 1997; Westbrook et coll.,

1997; Radulovic et coll., 1998), le conditionnement de peur peut induire des réponses

généralisées non spécifiques du SC. Nous recherchions donc une intensité de SI qui induise la

mise en place de réponses conditionnées spécifiques et modulables par les conditions

expérimentales.

Nous avons énoncé précédemment les hypothèses actuelles expliquant la possibilité

d’une association entre deux stimuli discontigus (Marchand et coll., 2004). L’hypothèse de la

médiation contextuelle reposant sur une étroite relation entre conditionnement au contexte et

conditionnement de Trace, notre protocole devait permettre de comparer ces deux types de


28

conditionnement lors des mêmes manipulations. Ainsi dans un premier temps il était

nécessaire de choisir une intensité de SI suffisante pour permettre la mise en place d’un

conditionnement à un stimulus élémentaire, mais aussi d’un conditionnement au contexte.

L’intensité du SI devrait en particulier déterminer le niveau de conditionnement au contexte,

puisque ce dernier semble plus sensible à ce facteur que le conditionnement au son (Phillips et

LeDoux, 1992; Baldi et coll., 2004).

L’un de nos critères était de pouvoir mettre en évidence des changements dans les

réponses conditionnées lors de l’utilisation de protocoles Apparié ou non Apparié qui sont

connus pour favoriser respectivement le conditionnement au son ou le conditionnement

contextuel (Calandreau et coll., 2005).

Bien entendu, le choix de l’intensité du SI reposait aussi sur des critères d’ordre

éthiques, nous poussant à choisir l’intensité minimum pour laquelle l’ensemble de ces

conditions étaient réunies.

II- Les critères pris en compte pour la mise en place du protocole de Trace.

Pour la mise en place du protocole de Trace, nous voulions pouvoir observer chez un

même animal des niveaux comparables de réponses conditionnées au contexte et au son

présenté en Trace. De cette manière, l’évolution des deux types de conditionnement vis à vis

des manipulations envisagée devrait être liée à leur sensibilité respective plutôt qu’à des

niveaux de réponse initialement différents.

Il a déjà été montré à plusieurs reprises que le conditionnement au contexte pouvait

être moins important lorsque les chocs étaient signalés par un son que lorsqu’ils ne l’étaient

pas (Fanselow et coll., 1994; LoLordo et coll., 2001). Ce phénomène traduit un masquage du

conditionnement au contexte par le son, processus décrit plus généralement de la façon

suivante : lors d’un conditionnement Pavlovien, le conditionnement conjoint de SC1 et SC2

peut résulter en un conditionnement plus faible de SC2 que si ce dernier avait été conditionné

seul (Kamin, 1969). Le modèle formel d’apprentissage établi par Rescorla et Wagner (1972)


29

explique le processus de masquage en postulant que les divers SC présents vont entrer en

compétition pour l’association avec le SI (Rescorla, 1968, voir Miller et coll., 1995 pour

revue et commentaires sur le modèle). Sous réserve que l’intensité du SI ne soit pas trop

importante, le niveau total de conditionnement de l’ensemble des SC présents sera limité. En

outre, le niveau de conditionnement (ou force associative) acquis par chaque SC dépendra de

sa valeur prédictive ainsi que de son intensité. C’est ce même phénomène de masquage qui

explique que le conditionnement au contexte soit moins important dans le cas d’un protocole

Apparié (conditionnement de Délai) que dans un protocole non Apparié, où sons et chocs sont

présentés à des moments bien distincts (Odling-Smee, 1975; Desmedt et coll., 1998; Hall et

coll., 2001). En effet, la valeur prédictive du son dans le protocole non Apparié est très faible,

ce qui empêche son conditionnement et permet au contexte d’acquérir toute la force

associative.

Nous avons recherché une situation où la présentation du son en protocole de Délai

(apparié) donne lieu à un masquage du conditionnement contextuel, afin de déterminer si ce

masquage persiste quand le son est présenté en protocole de Trace. En effet, on ignore encore

en grande partie si le conditionnement de Trace est capable de masquer le conditionnement

contextuel (Marlin, 1981) et si la mesure du freezing comme réponse conditionnée est assez

sensible pour mettre en évidence un tel masquage (LoLordo et coll., 2001).

Ces expériences préliminaires ont également pour but d’évaluer la spécificité

temporelle de la réponse des animaux conditionnés avec un intervalle de Trace comparée à

celle d’animaux conditionnés avec un protocole de Délai. En effet, il a été montré que le

conditionnement de Trace de la membrane nictitante conduisait à une réponse conditionnée

apparaissant au moment prévu de l’arrivée du SI, et non dès la présentation du SC

(Gormezano et coll., 1983). Au contraire, dans le conditionnement de Trace, la spécificité

temporelle de la réponse conditionnée ne semble pas si évidente, même si la réponse

conditionnée en protocole de Trace semble retardée d’une dizaine de secondes par rapport a la

réponse observée après un conditionnement de Délai, que la peur conditionnée soit évaluée

par la réponse cardiaque (Marchand et Kamper, 2000), le comportement de freezing

(Marchand et coll., 2003) ou la réponse de potentialisation du sursaut (Burman et Gewirtz,

2004). Il est à noter que ce décalage n’est pas observé avec des intervalles de Trace courts (3


30

s), ce qui laisse supposer qu’il existerait une différence fondamentale dans les processus

gouvernant le conditionnement de Trace avec des intervalles courts et des intervalles long

(Misane et coll., 2005).

III- Approche expérimentale.

Les deux premières expériences de ce chapitre ont pour but de déterminer l’intensité

de SI minimal permettant d’obtenir un niveau de réponse conditionnée (RC) approprié à la

fois au contexte et au son en fonction du protocole de conditionnement.

La première expérience permet de comparer les réponses au son après un

conditionnement apparié en fonction de l’intensité du SI et du type de SC utilisé.

La deuxième expérience permet de comparer la réponse au son mais aussi au contexte

en fonction du protocole de conditionnement (apparié ou non apparié), de l’intensité du choc

électrique ainsi que du type de SC utilisé.

La dernière expérience permet de tester les paramètres ainsi sélectionnés afin de

déterminer s’ils permettent aussi d’observer la mise en place d’un conditionnement de Trace.

Pour cela nous observons les réponses au son et au contexte chez des animaux conditionnés

avec des intervalles de Trace croissants. Cette expérience a pour but de nous permettre de

sélectionner un intervalle de Trace approprié ainsi que de caractériser les RC obtenues.

CHAPITRE I : EXPERIENCE 1

31

Expérience 1:

Effet de l’intensité du SI sur le conditionnement à un son.

Cette expérience a pour but de comparer les niveaux de conditionnement des rats en

conditions de Délai en fonction de l’intensité du SI (0,2 ou 0,4 ou 0,6 mA). Par ailleurs, deux

types de SC (Tone et Clicker) vont être comparés.

I- Matériel et méthodes.

1) Sujets.

Un total de 24 rats naïfs de souche Long-Evans, provenant du centre d’élevage et de

recherche Janvier (Le Genest-St-Isle) constitue l’effectif de cette expérience. A leur arrivée au

laboratoire, les rats âgés d’environ 8 semaines sont placés par deux dans des cages standards

d’élevage (polycarbonate 49 x 26 x 20 cm) avec un accès à la nourriture et l’eau ad libitum.

L’ensemble des cages est installé dans une animalerie climatisée (22-23-C) et ayant un cycle

jour/nuit contrôlé de 12/12 h (allumage à 7h). Après leur arrivée à l’animalerie, tous les rats

sont laissés au repos dans leur cage d’élevage pour une période d’acclimatation d’au moins

une semaine avant d’entamer la procédure comportementale. Les animaux sont manipulés

pendant deux minutes durant les trois jours précédant le début de l’expérience afin de les

familiariser au contact avec l’expérimentateur. L’ensemble des phases expérimentales

(conditionnement et test) a lieu durant la journée.

Le choix de rats de la souche Long-Evans repose sur le fait qu’un grand nombre de

données concernant les capacités d’apprentissage et l’effet de manipulations affectant les

structures cérébrales sont disponibles sur cette souche ainsi que sur une souche voisine

(Lister-Hooded).


32

2) Dispositif expérimental.

Le conditionnement et les tests sont effectués dans 8 boîtes de conditionnement

rectangulaires identiques (40 x 35 x 30 cm) conçues et fournies par Imetronic (Pessac,

France). Les boîtes comportent trois parois en PVC gris ainsi qu’une face en plexiglas

transparent pouvant se rabattre pour accéder à l’intérieur de la boîte. Le plancher des boîtes

est constitué d’une grille de 27 barreaux en acier inoxydable de 0,5 cm de diamètre disposés

parallèlement les uns aux autres et espacés de 1,5 cm. Cette grille est elle-même placée au

dessus d’un tiroir extractible contenant de la sciure. Chaque boîte est placée dans un

compartiment permettant une isolation sonore et pourvu d’un haut-parleur disposé en hauteur

ainsi que d’un ventilateur produisant un bruit de fond continu d’approximativement 55 dB.

La grille constituant le sol peut délivrer un choc électrique modéré constituant le

stimulus inconditionnel. Ce choc est constitué d’impulsions rectangulaires multiplexées entre

les barreaux et d’intensité régulée. Le haut parleur dans chaque compartiment permet de

diffuser un son pur ou "Tone" (10 s, 5000 Hz, 70 dB) et un relais électromécanique permet de

produire des cliquetis ou "Clicker" (10 s, 6 Cycles/s). Ces deux stimuli sonores font office de

stimuli conditionnés dans cette expérience. Le moment de distribution des stimuli est contrôlé

à l’aide d’une interface informatique (Imetronic). L’éclairage des boîtes de conditionnement

(10 lux) est assuré par 4 diodes électro-luminescentes situées sur le plafond de chaque

compartiment.

Chaque jour, avant le début des expériences, 8 rats ne participant pas à l’expérience

sont placés dans les boîtes de conditionnement durant 15 minutes afin de saturer les cages en

indices olfactifs. Pour l’ensemble des phases, le plancher des boîtes est nettoyé avec de l’eau

puis séché entre chaque sujet.

Chaque boîte de conditionnement est équipée d’une caméra vidéo noir & blanc

miniature (SK-2005, Optovision, Toulouse) qui permet l’analyse comportementale en direct

ou en différé de l’ensemble des phases expérimentales. La caméra placée au plafond de

chaque boîte permet une prise de vue de l’ensemble de la boîte de conditionnement avec un

grand-angle de 2,45 mm de focale. Chaque groupe de 4 caméras est connecté par


33

l’intermédiaire d’un muliplexeur de type Quad (Ganz QD-04C) à un microordinateur de type

PC (AMD Athlon XP 2600+, 512 Mo RAM) muni d’une carte d’acquisition vidéo (Matrox

"Orion"). L’image à la sortie des multiplexeurs est également enregistrée sur deux

enregistreurs DVD pour des traitements éventuels en différé.

Le niveau de conditionnement est évalué par la quantification du comportement de

"Freezing", c'est-à-dire une immobilisation totale de l’animal hormis la présence de

mouvements respiratoires (Blanchard et Blanchard, 1969). Le pourcentage de temps où le

Freezing est observé sera dénommé pourcentage de Réponse Conditionnée (RC).

L’acquisition des données expérimentales est effectuée à l’aide d’un programme

rédigé sous le logiciel TestPoint®. L’analyse de la RC est effectuée grâce à un ensemble de

procédures rédigées sous Exel® Visual Basic® mises au point et validées par Alain Marchand

(Marchand et coll., 2003). Pour ce traitement, l’ensemble de la séance est échantillonné à

raison d’une image/s. Une image de la boîte vide (constituant le fond) acquise avant le

conditionnement est soustraite à chacune des images acquises au cours de la séance avant

toute analyse. Cette étape va permettre que seuls les pixels de l’image correspondant au rat

soient pris en compte. Une fois cette étape effectuée, le programme effectue un calcul de la

déviation standard des pixels (contraste) sur chaque image. La déviation standard du contraste

sur 3 images consécutives correspond à un mouvement de l’animal. Un animal est considéré

comme effectuant une RC si le mouvement calculé reste en dessous d’un certain seuil

préalablement déterminé (0,075 pour une image codée sur 8 bits) durant au moins 2 secondes

consécutives (Anagnostaras et coll., 2000). Une analyse préalable a montré une excellente

correspondance, instant par instant, entre cette mesure et une quantification manuelle de la RC

chez des rats actifs (Marchand et coll., 2003).

3) Procédure comportementale.

Le protocole comprend trois phases, le conditionnement, le test au contexte et le test

au son, qui sont effectuées sur trois jours successifs. Le protocole de conditionnement et de

test est détaillé sur la figure I-1. Préalablement à la phase de conditionnement, les animaux

sont divisés en trois groupes d’effectif équivalent en fonction de l’intensité du choc électrique


34

qui constitue le SI (0,2, 0,4 ou 0,6 mA). Chacun de ces groupes est subdivisé en deux selon la

nature du stimulus conditionnel, Tone ou Clicker. L’effectif des groupes est présenté dans le

tableau I-1.

INTENSITE SI TONE CLICKER0,2 mA n=4 n=40,4 mA n=4 n=40,6 mA n=4 n=4

Stimulus conditionel

• Conditionnement :

La séance de conditionnement a une durée totale de 30 minutes et comporte 5

appariements SC/SI. Les appariements sont présentés avec des intervalles inter-essais

irréguliers afin d’éviter un possible conditionnement temporel (LoLordo et coll., 2001). Un

appariement consiste à présenter le SC durant 10 s, immédiatement suivi du SI de 1 s. A la fin

de la séance de conditionnement, les animaux sont replacés dans leur cage d’élevage et

ramenés dans l’animalerie.

• Test au contexte :

Le test au contexte est effectué le lendemain de la séance de conditionnement. Ce test

dure 5 minutes et consiste à re-placer les animaux dans la boîte de conditionnement dans

laquelle ils ont reçu les appariements SC/SI la veille. A la suite de ces 5 minutes de test, les

animaux sont laissés dans les boîtes durant 25 minutes supplémentaires afin d’éteindre la

réponse de peur associée au contexte. A la fin de la séance de test au contexte, les animaux

sont replacés dans leur cage d’élevage et ramenés dans l’animalerie.

• Test au son :

Le test au son est effectué le lendemain de la séance de test au contexte. Ce test dure

30 minutes et a lieu dans les boîtes dans lesquelles les animaux ont reçu le conditionnement et

le test au contexte. Le test consiste en 6 présentations à intervalles irréguliers du son de 10 s

auquel les animaux ont été préalablement conditionnés.

Tableau I-1 : Effectifs des groupes de conditionnement dans l’expérience 1.


35

4) Analyse statistique.

Pour l’ensemble des phases du protocole, le niveau de conditionnement est évalué

grâce à la mesure du pourcentage de RC. Cette réponse est moyennée pour des périodes de

temps spécifiques. Pour le test au contexte, les 5 premières minutes du test sont analysées afin

d’éviter des problèmes liés à l’extinction de la réponse. Pour le test au son, le pourcentage

moyen de RC sur les 3 premières présentations de 10 s du SC est mesuré. Une analyse de

variance (ANOVA) à deux facteurs est utilisée pour traiter l’ensemble de ces données, avec

pour facteurs l’intensité du SI (0,2, 0,4 ou 0,6 mA) ainsi que la nature du SC (Tone ou

Clicker). Des ANOVA partielles et le test post-hoc de Student-Newman-Keuls (SNK)

viennent compléter les analyses. Le seuil de rejet de l’hypothèse nulle est de 0,05.

Figure I-1 : Déroulement temporel du protocole expérimental dans l’expérience 1. Chaque phase du protocole est réalisée sur une seule séance. La durée des séances ainsi que les moments de présentation des SC sont indiqués.

0s300s

1800s

TEST EXTINCTION

Jour 1

Cond

itionn

emen

t

0s

SC

180s 652s 840s 1260s 1392s 1710s1800s

0s300s 550s 975s 1145s 1665s

1800s

SCSI

Jour 2

Test au Co

ntexte

Jour 3

Test au Son

0s300s

1800s

TEST EXTINCTION

Jour 1

Cond

itionn

emen

tJour 1

Cond

itionn

emen

t

0s

SC

180s 652s 840s 1260s 1392s 1710s1800s0s

SC

180s 652s 840s 1260s 1392s 1710s1800s

0s300s 550s 975s 1145s 1665s

1800s

SCSI

0s300s 550s 975s 1145s 1665s

1800s

SCSI

Jour 2

Test au Co

ntexte

Jour 2

Test au Co

ntexte

Jour 3

Test au Son

Jour 3

Test au Son


36

II- Résultats.

1) RC au contexte.

a) Indépendamment du type de SC.

La RC des animaux durant le test de peur associée au contexte est présentée sur les

figure I-2A et B. Les animaux ayant reçu les chocs de 0,6 mA présentent un niveau moyen de

RC alors que les deux groupes conditionnés avec des intensités de choc plus faibles présentent

une quasi-absence de RC (spécialement pour le groupe conditionné avec une intensité de choc

de 0,2 mA). De plus, il est à noter sur la figure I-2A que dans le groupe ayant reçu l’intensité

de choc élevée (0,6 mA) la RC au contexte diminue rapidement après 5 min (extinction).

L’ANOVA effectuée sur la RC moyenne durant les 5 minutes de test (Figure I-2B)

confirme cette différence de niveau de RC en fonction de l’intensité (F(2,18)=9,79, p<0,01). Le

test post-hoc de Student-Newman-Keuls (SNK) confirme que les animaux conditionnés avec

une intensité de choc de 0,6 mA présentent une RC significativement supérieure à celles des

deux autre groupes qui ne diffèrent pas l’un de l’autre.

b) En fonction du type de SC.

La RC moyenne des animaux en fonction du type de SC employé est présentée sur la

figure I-2C. Les animaux conditionnés avec le Clicker ou le Tone semblent avoir des niveaux

de réponse comparables et cela pour l’ensemble des intensités de SI. Ainsi, on retrouve dans

les deux groupes de faibles niveau de RC au contexte pour les deux intensités de SI les plus

faibles et un niveau moyen RC pour le groupe conditionné avec le choc de 0,6 mA.

Ces constatations sont appuyées par l’ANOVA qui ne détecte pas de différence

significative en fonction du type de SC employé (F(1,18)=0,41, p>0,1) ni d’interaction entre ce

facteur et l’intensité du choc électrique (F(2,18)=0,17, p>0,1).


37

B C

0

20

40

60

80

100

TONE CLICKER

0

20

40

60

80

100 0,2 mA0,4 mA0,6 mA

##

##

A

% RC

0

20

40

60

80

100

1 min 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min

0,2 mA0,4 mA0,6 mA

TEST EXTINCTION

% RC

2) RC au son.


La RC des animaux durant le test de peur associée au son est présentée sur la figure I-

3A. Les animaux ayant reçu les chocs de 0,6 et 0,4 mA présentent un fort niveau de RC alors

que le groupe conditionné avec l’intensité de choc la plus faible (0,2 mA) présente une faible

RC. L’ANOVA effectuée sur ces données confirme cet effet de l’intensité du SI

(F(2,18)=13,42, p<0,001) et le test SNK confirme que les animaux conditionnés avec des

intensités de choc de 0,6 et 0,4 mA présentent une RC significativement supérieure à celle du

groupe conditionné avec une intensité de choc de 0,2 mA.

Figure I-2 : Pourcentages moyens de réponse conditionnée (RC) lors du test au contexte dans l’expérience 1. A : Cinétique par minute et erreur standard de la RC durant les 5 minutes du test au contexte et les 25 minutes d’extinction, en fonction de l’intensité du SI. B : RC et erreur standard lors du Test au contexte en fonction de l’intensité du SI. C : RC et erreur standard détaillées selon la nature du SC. ## : Significativement différent (p<0,01) du groupe 0,6 mA.


38


La RC des animaux en fonction de l’intensité du SI ainsi que du type de SC employé

est présentée sur la figure I-3B. Que les animaux soient conditionnés avec le Tone ou le

Clicker, ils répondent fortement au son pour une intensité de 0,4 ou 0,6 mA et plus faiblement

pour une intensité de 0,2 mA. Cependant cette différence semble plus prononcée pour les

groupes d’animaux conditionnés avec le Tone comparativement aux animaux conditionnés

avec le Clicker.

L’ANOVA confirme que le niveau global de réponse n’est pas significativement

affecté par le type de SC employé (F(1,18)=0,50, p>0,1), mais elle détecte une tendance à

l’interaction entre le type de SC et l’intensité du SI (F(2,18)=2,99, p=0,076). En se basant sur

cette tendance, nous avons effectué des ANOVA partielles sur les deux groupes d’animaux

Clicker et Tone. Ces analyses détectent un effet significatif de l’intensité pour les groupe

conditionnés avec le Tone (F(2,9)=13,4, p<0,01), mais pas pour les groupes conditionnés avec

le Clicker (F(2,9)=2,40, p>0,1). Pour les animaux conditionnés avec le Tone, le test SNK

confirme que la RC est significativement plus importante avec des intensités de choc de 0,6 et

0,4 mA qu’avec une intensité de 0,2 mA.

0

20

40

60

80

100 0.2 mA

0.4 mA

0.6 mA** **

0

20

40

60

80

100

TONE CLICKER

** **

A B

% RC

Figure I-3 : Pourcentages moyens de réponse conditionnée (RC) lors du test au son dans l’expérience 1. A : RC et erreur standard durant les présentations du son en fonction de l’intensité du SI. B : RC et erreur standard détaillées selon la nature du SC. * * : Significativement différent du groupe 0,2 mA (p<0,01).


39

Cette expérience permet de mettre en évidence la possibilité d’obtenir un

conditionnement au son non négligeable à partir d’une intensité de 0,4 mA. Il

semblerait de plus que cette réponse soit plus spécifique lorsque le SC est un Tone.

En parallèle, la réponse contextuelle n’apparait qu’avec une intensité de 0,6

mA. Cependant l’utilisation d’un protocole de conditionnement de Délai ne devrait

pas favoriser la mise en place d’un tel conditionnement.

Il semblerait donc possible que l’intensité de 0,6 mA soit assez forte pour

induire la mise en place de réponses inadaptées au protocole de conditionnement et

induire une certaine généralisation de la réponse de peur.


40

Expérience 2 :

Possibilité d’un conditionnement au contexte par un

protocole non apparié.

Cette expérience a pour but de déterminer s’il est possible d’obtenir une RC au

contexte avec l’intensité de SI dont on sait qu’elle est suffisante pour obtenir un

conditionnement au son (0,4 mA). Pour cela, un groupe d’animaux conditionnés avec le SI et

le SC présentés de façon non apparié (NAP) est comparé à des animaux conditionnés avec le

SC et le SI appariés (AP). De plus, deux intensités de choc sont comparées (0,3 et 0,4 mA).

Comme dans l’expérience précédente, deux types de SC différents sont évalués (Tone et

Clicker).


1) Sujets et dispositif expérimental.

Un total de 24 rats naïfs constitue l’effectif de cette expérience, dans des conditions

identiques à celles présentées dans l’expérience 1. Le dispositif expérimental reste inchangé.

2) Protocole comportemental.

Le protocole, analogue à celui de l’expérience 1, est détaillé sur la figure I-4.

Préalablement à la phase de conditionnement, les animaux sont divisés en deux groupes en

fonction du protocole de conditionnement auquel ils vont être soumis, Apparié (AP) ou Non

Apparié (NAP). Chacun de ces deux groupes est subdivisé en quatre sous-groupes d’effectif

équivalent selon l’intensité du SI (0,3 ou 0,4 mA) et la nature du stimulus conditionnel qui va

leur être présenté, Tone ou Clicker. L’effectif des groupes est présenté dans le tableau I-2.


41

PROTOCOLE INTENSITE SI TONE CLICKER0,3 mA n=4 n=40,4 mA n=4 n=40,3 mA n=4 n=40,4 mA n=4 n=4

Stimulus conditionel

AP

NAP

Pour les groupes d’animaux AP (protocole de Délai), le protocole de conditionnement

est identique à celui décrit dans l’expérience 1, excepté quelques légères différences quant

aux moments de présentation des sons. Pour les groupes d’animaux NAP (Non Appariés), les

moments de présentation des chocs sont identiques à ceux du groupe AP, mais les moments

de présentation des sons sont modifiés de façon à ce qu’ils soient bien séparés du moment de

l’administration des chocs (intervalle minimum de 99 s).


La RC est quantifiée et analysée de façon comparable à celle décrite dans l’expérience

1 de ce chapitre. Une analyse de variance (ANOVA) à trois facteurs est utilisée pour traiter

l’ensemble de ces données, avec pour facteurs le protocole de conditionnement utilisé (AP ou

NAP) ainsi que l’intensité du SI (0, 3 ou 0,4 mA) et la nature du SC (Tone ou Clicker).

0s180s 462s 926s 1122s 1699s

1800s

SCSI

1800s0s325s 571s 739s 1305s 1488s

SCSI

Pro

toco

leN

AP

Protocole

AP

Cond

itionn

emen

t

Tableau I- 2 : Effectifs des groupes de conditionnement dans l’expérience 2.

Figure I- 4 : Déroulement temporel de la phase de conditionnement de l’expérience 2. AP : conditionnement apparié (Délai) ; NAP : conditionnement non apparié.


42

II- Résultats.

1) RC au contexte.



figure I-5A et B. Comme dans l’expérience précédente, on peut constater que les animaux des

groupes AP ne présentent pas de réponse au contexte pour l’intensité de choc de 0.4 mA et

celle plus faible de 0.3 mA. Les animaux du groupe NAP conditionnés avec une intensité de

SI de 0,3 mA ne semblent pas non plus présenter de RC au contexte, alors que le groupe

conditionné avec une intensité de 0,4 mA présente une plus forte RC.

Ces observations sont partiellement confirmées par l’ANOVA qui met en évidence un

effet significatif de l’intensité du choc (F(1,24)=10,58, p<0,01) ainsi que du protocole de

conditionnement (F(1,24)=11,06, p<0,01). Cependant l’interaction entre le protocole de

conditionnement et l’intensité du choc électrique n’apparaît que sous la forme d’une forte

tendance (F(1,24)=3,97, p=0,0578).


La figure I-5C présente la RC des animaux durant le test de peur associée au contexte,

en fonction du protocole de conditionnement, de l’intensité du SI ainsi que du type de SC

employé. Les animaux conditionnés avec le Clicker ou le Tone semblent avoir des niveaux de

réponse comparables, indépendamment de l’effet du protocole de conditionnement et de

l’intensité du SI. L’ANOVA va dans le sens de ces constatations puisqu’elle ne détecte aucun

effet significatif du type de SC employé (F(1,24)=0,05, p>0,1) ni d’interaction de ce dernier

avec les deux autres facteurs (plus grand F(1,24)=0,01).

c) Extinction de la réponse au contexte.

La cinétique minute par minute de la RC des animaux durant les 5 minutes du test au

contexte et les 25 minutes d’extinction est représentée sur la figure I-5A. Seul le groupe

conditionné en protocole NAP avec une intensité de SI de 0,4 mA présente une réponse au

contexte. Cette réponse s’éteint complètement en 10 minutes environ. Nous avons effectué

une ANOVA en mesures répétées par blocs de 5 minutes sur les 30 min de réponse au


43

contexte du groupe 0,4 mA/NAP. L’ANOVA confirme l’effet significatif des blocs

(F(5,35)=4,69, p<0,01). Le test SNK précise cette différence en indiquant que la RC durant les

5 premières minutes de la séance diffère significativement de la RC des animaux de la 11eme à

la 30eme minute.

0

20

40

60

80

100

CLICKER/0,3 mA CLICKER/0,4 mA TONE/0,3 mA TONE/0,4 mA

*#

*#

%RC

B C

A

0

20

40

60

80

100

1 min 5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min

0,3 mA/AP0,3 mA/NAP0,4 mA/AP0,4 mA/NAP

TEST EXTINCTION

%RC

Figure I-5 : Pourcentages moyens de réponse conditionnée (RC) lors du test au contexte de l’expérience 2. A : Cinétique par minute et erreur standard de la RC durant les 5 minutes du test au contexte et les 25 minutes d’extinction, en fonction de l’intensité du SI et du protocole de conditionnement. B : RC et erreur standard lors du Test au contexte en fonction de l’intensité du SI et du protocole de conditionnement. C : RC et erreur standard détaillées selon la nature du SC. AP : protocole apparié ; NAP : protocole non apparié. # : Significativement différent (p<0,05) du groupe 0,3 mA ; * : Significativement différent (p<0,05) du groupe AP.


44

2) RC au son.


La RC des animaux durant le test de peur associée au son est présentée sur la figure I-

6A. Comme dans l’expérience précédente, on peut constater que les animaux des groupes AP

présentent une forte réponse au son, et ce plus particulièrement pour le groupe d’animaux

conditionné avec l’intensité de choc de 0,4 mA. Les animaux des groupes NAP présentent eux

aussi une RC en présence du son, mais cette dernière semble inférieure à celle observée chez

les groupe AP, indépendamment de l’intensité du SI. L’ensemble de ces constatations est

confirmé par l’ANOVA qui révèle un effet significatif de l’intensité du SI (F(1,24)=7,15,

p<0,05) ainsi que du protocole de conditionnement (F(1,24)=9,93, p<0,01) mais pas

d’interaction entre ces deux facteurs (F(1,24)=0,33, p>0,1).

0

20

40

60

80

100

0,3 mA 0,4 mA

APNAP

#

*

0

20

40

60

80

100

CLICKER/0,3 mA CLICKER/0,4 mA TONE/0,3 mA TONE/0,4 mA

*%RC


Le détail des réponses au son en fonction de la nature du stimulus est présenté sur la

figure I-6B. Pour une intensité de 0,3 mA, les animaux conditionnés au Clicker présentent un

niveau de réponse moyen lorsqu’ils ont reçu le protocole de conditionnement NAP et plus fort

avec un protocole AP. Pour cette même intensité, les animaux conditionnés avec le Tone

présentent un niveau de réponse relativement faible, indépendamment du protocole de

Figure I-6 : Pourcentages moyens de réponse conditionnée (RC) lors du test au son dans l’expérience 2. A : RC et erreur standard durant les présentations du son en fonction de l’intensité du SI et du protocole de conditionnement. B : RC et erreur standard détaillées selon la nature du SC. AP : protocole apparié ; NAP : protocole non apparié. # : Significativement différent (p<0,05) du groupe 0,3 mA ; * : Significativement différent (p<0,05) du groupe AP.

A B


45

conditionnement. Pour une intensité de 0,4 mA, les animaux conditionnés au Clicker

présentent une forte réponse au son aussi bien pour les animaux conditionnés avec protocole

AP que ceux conditionnés avec le protocole NAP. Au contraire, les animaux conditionnés

avec le Tone répondent plus fortement au son lorsqu’ils ont été conditionnés avec un

protocole AP que lorsqu’ils ont subi un protocole de conditionnement NAP.

Ces observations sont appuyées par l’ANOVA qui indique un effet du type de SC sur

le niveau de réponse de peur associée au son (F(1,24)=8,76, p<0,05), indépendamment de

l’ensemble des autres facteurs (Plus grand F(1,24)= 2,64). L’ANOVA partielle pour les groupes

ayant le Clicker comme SC ne montre aucun effet significatif du protocole (F(1,12)=3,24,

p>0,05) ou de l’intensité du SI (F(1,12)=3,24, p>0,05) ni même d’interaction (F(1,12)=0,34,

p>0,1) entre ces deux facteurs. A l’inverse, chez les animaux conditionnés avec le Tone

comme SC il est possible d’observer un effet significatif du protocole de conditionnement

(F(1,12)=7,12, p<0,05), et une tendance à l’effet de l’intensité du SI (F(1,12)=3,94, p=0,071) sans

interaction entre ces deux facteurs (F(1,12)=2,48, p>0,05).

Les résultats obtenus au cours de cette expérience mettent en évidence la

possibilité d’obtenir un conditionnement au contexte non négligeable avec une

intensité de 0,4 mA dont on avait pu voir précédemment qu’elle permettait aussi

d’obtenir une réponse au son.

De plus, nous remarquons que seul le Tone permet d’avoir une réponse au son

spécifique du type de conditionnement, ce qui suggère que seul ce stimulus permet

d’obtenir une réponse reflétant bien la force de l’association effectuée entre le SC et

le SI.


46

Expérience 3 :

Sélection d’un intervalle de Trace

Cette troisième expérience doit permettre de sélectionner un intervalle de Trace

approprié pour l’étude du conditionnement de Trace, puisque le protocole final doit permettre

à la fois d’évaluer le conditionnement au son et le conditionnement au contexte. Dans cette

expérience, nous allons donc manipuler la durée de l’intervalle de Trace (0 s, 10 s, 30 et 90 s)

et observer les modifications que ce facteur entraîne à la fois sur la réponse au son et sur la

réponse contextuelle.


1) Sujets.

Un total de 36 rats naïfs constitue l’effectif de cette expérience, dans des conditions

identiques à celles présentées dans l’expérience 1.

2) Dispositif expérimental.

Le dispositif expérimental utilisé lors de cette expérience est en partie identique à celui

décrit pour l’expérience 1. Toutefois, afin de bien distinguer la RC induite par le son et celle

induite par le contexte de conditionnement, le test au son est réalisé dans un contexte

préalablement modifié (figure I-7). L'environnement géométrique, visuel, tactile et olfactif de

chaque boîte peut être modifié par l'insertion de trois plaques en plastique selon la disposition

suivante: une plaque rugueuse présentant un motif à damiers sur le sol, une plaque présentant

un motif à pois sur la paroi gauche et une plaque blanche insérée en diagonale à l’intérieur de

la boîte. Selon la phase de l'expérience, les boîtes sont utilisées comme contexte normal ou

comme contexte modifié par l'insertion des plaques.


47

3) Procédure.

Le protocole utilisé est analogue à celui des expériences précédentes. Les animaux

sont divisés en quatre groupes qui diffèrent par l'intervalle de Trace séparant la fin du SC du

début du SI lors de la phase de conditionnement. Cet intervalle est de 0 seconde dans le

groupe Délai (D, n=9), de 10 secondes dans le groupe Trace 10 s (T10, n=9), de 30 secondes

dans le groupe Trace 30 s (T30, n=9) et de 90 secondes dans le groupe Trace 90 s (T90, n=9).

Il est à noter que ce dernier intervalle est supposé trop long pour permettre à un son présenté

en Trace d’être conditionné (Kamin, 1965). L’intensité du choc électrique est de 0,4 mA dans

tous les groupes. Les protocoles de conditionnement et de test sont détaillés sur la figure I-8.

Le choc électrique est délivré au même moment dans tous les groupes, seul change le moment

de présentation du son en fonction de l’intervalle de Trace.

Le test de réponse au contexte dure 5 minutes. Il est immédiatement suivi d’une

période d’extinction de la peur associée au contexte dont la durée a été ramenée à 5 minutes.

Figure I- 7 : Photographies d’un rat dans une boîte de conditionnement en configuration de conditionnement et de test au contexte à gauche, et en configuration de test au contexte modifié et test au son à droite.


48

Le test de réponse au contexte modifié et au son a une durée totale de 35 minutes. De

manière à favoriser la discrimination contextuelle entre la phase de conditionnement et cette

phase de test, un certain nombre de changements de procédure sont introduits. Afin de limiter

le rappel des indices de transport, les cages contenant les animaux sont placées sous un drap

puis transportées manuellement (et non sur un chariot). Afin de limiter le rappel des indices

de l'environnement, les boîtes sont aménagées en contexte modifié et les plateaux contenant la

sciure sont retirés. De plus, chaque animal est placé dans une des 8 boîtes qui n’est pas celle

utilisée pour le conditionnement. Les 5 premières minutes de la séance constituent le test au

contexte modifié. Le reste de la séance constitue le test au son avec 6 présentations à

intervalles fixes de 5 minutes du son utilisé lors de la phase de conditionnement.

0s180s 462s 926s 1122s 1699s

1800s

SCSI

Protocole

Trace 30s

Protocole

Trace 10s

1800s

SCSI

0s170s 452s 916s 1112s 1689s

1800s0s150s 432s 896s 1092s 1669s

SCSI

1800s0s90s 372s 836s 1032s 1609s

SCSI

Protocole

Délai

Protocole

Trace 90s

0s300s

600s

2100s0s

SC

300s 600s 900s 1200s 1500s 1800s

CX MOD

Cond

itionn

emen

tTest au Co

ntexte

Test au Son

TEST EXTINCTION

0s180s 462s 926s 1122s 1699s

1800s

SCSI

0s180s 462s 926s 1122s 1699s

1800s

SCSI

Protocole

Trace 30s

Protocole

Trace 30s

Protocole

Trace 10s

Protocole

Trace 10s

1800s

SCSI

0s170s 452s 916s 1112s 1689s

1800s

SCSI

0s170s 452s 916s 1112s 1689s

1800s0s150s 432s 896s 1092s 1669s

SCSI

1800s0s150s 432s 896s 1092s 1669s

1800s0s150s 432s 896s 1092s 1669s

0s150s 432s 896s 1092s 1669s

SCSI

1800s0s90s 372s 836s 1032s 1609s

SCSI

1800s0s90s 372s 836s 1032s 1609s

1800s0s90s 372s 836s 1032s 1609s

SCSI

Protocole

Délai

Protocole

Délai

Protocole

Trace 90s

Protocole

Trace 90s

0s300s

600s

2100s0s

SC

300s 600s 900s 1200s 1500s 1800s

CX MOD

Cond

itionn

emen

tCo

nditionn

emen

tTest au Co

ntexte

Test au Co

ntexte

Test au Son

Test au Son

TEST EXTINCTIONTEST EXTINCTION

Figure I-8 : Déroulement temporel de l’expérience 3. Les 4 groupes diffèrent uniquement par l’intervalle de Trace employé lors du conditionnement (0 s =Délai, 10 s, 30 s ou 90 s).


49


La RC est mesurée à divers moments selon la phase du protocole dans laquelle on se

trouve. Pour la phase de conditionnement, la RC est mesurée durant la minute faisant suite à

chaque présentation du SI. Pour le test au contexte, les 5 premières minutes du test sont

analysées. La RC manifestée durant les 5 premières minutes du test au son constitue la

réponse au contexte modifié. Pour le reste du test au son, le pourcentage moyen de RC est

relevé par blocs de 10 s à partir des 10 s précédant la présentation du son jusqu’à 90 s après

l’arrêt de ce dernier. Ces mesures sont moyennées sur les 3 premières présentations du son.

Une analyse de variance (ANOVA) à un seul facteur est utilisée pour traiter l’ensemble de ces

données, avec pour facteur l’intervalle temporel séparant le SC du SI (0, 10, 30 ou 90 s).

II- Résultats.

1) Réponse Post-choc.

La réponse de peur manifestée par les rats après chaque choc durant le

conditionnement est présentée sur la figure I-9, en fonction de l’intervalle de temps séparant

le SC et SI. On peut constater que la RC des animaux à la suite du premier choc est très faible.

Cette réponse augmente graduellement au fur et à mesure des essais jusqu’au quatrième essai

où elle atteint des valeurs proches de 80%, puis diminue à nouveau légèrement après le

cinquième choc. Il semble que ce profil de réponse lors du conditionnement ne soit pas

dépendant de l’intervalle de trace utilisé puisque l’ensemble des groupes présente des niveaux

et des profils de réponse très comparables.

Ces observations sont confirmées par l’ANOVA en mesures répétées qui indique un effet

significatif de la répétition des essais (F(4,128)=54,84, p<0,0001), mais pas d’effet principal de

l’intervalle de Trace (F(3,32)=1,54, p>0,1) ni d’interaction de ce dernier avec la répétition des

essais (F(12,128)=0,78, p>0,1).


50

0

20

40

60

80

100

ESSAI 1 ESSAI 2 ESSAI 3 ESSAI 4 ESSAI 5

DT10T30T90

% RC

2) RC au contexte.


figure I-10A et B, en fonction de l’intervalle de temps séparant le SC et SI. Comme

précédemment, les animaux ayant suivi un protocole de conditionnement apparié (groupe noté

Délai dans cette expérience), dans lequel aucun intervalle de temps ne sépare le SC et le SI, ne

manifestent que très peu de RC au contexte. Cependant, on peut remarquer les groupes ayant

suivi un protocole de conditionnement comprenant un intervalle de Trace manifestent une

réponse de peur associée au contexte plus importante. De plus cette RC semble d’autant plus

importante que l’intervalle de trace est long. L’essentiel de ces réponses se manifeste durant

les premières minutes de ré-exposition au contexte (test).

Ces observations sont en partie appuyées par l’ANOVA sur la RC moyenne lors des 5

minutes de test (Figure I-10B), qui confirme un effet significatif de l’intervalle de Trace

(F(3,32)=3,31, p<0,05). Le test SNK met en évidence la différence existant entre le groupe D et

le groupe T90, les autres groupes ne différant pas de façon significative les uns des autres.

Figure I-9 : Réponse post-choc lors de l’expérience 3. Evolution au cours des essais du pourcentage de réponse conditionnée (RC) et erreur standard au cours de la minute suivant la fin de chaque choc, en fonction de l’intervalle de Trace.


51

0

20

40

60

80

100 DT10T30T90

*

#

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

DT10T30T90

EXTINCTION

BA

% RC

3) RC au contexte modifié.

La RC des animaux durant les 5 minutes précédant la première présentation du SC lors

du test de peur associée au son est présentée sur les figure I-11A et C, en fonction de

l’intervalle de temps séparant le SC et SI. Cette figure permet de mettre en évidence le très

faible niveau de RC manifesté par les animaux en présence du contexte modifié et cela

indépendamment du groupe de conditionnement. Ce constat est appuyé par l’ANOVA qui ne

détecte pas d’effet significatif de l’intervalle de Trace sur cette RC (F(3,32)=1,47, p>0,1).

4) RC au son.

La RC des animaux durant le test de peur associée au son est présentée sur les figure I-

11B et C, en fonction de l’intervalle de temps séparant le SC et SI. On remarque que la

réponse des animaux durant la présentation du son semble être l’image en miroir de la RC du

test au contexte. Plus précisément, les animaux ayant le plus long intervalle de trace (T90) ne

manifestent qu’une très faible RC au son et semblent ainsi se comporter de la même façon que

les animaux conditionnés de façon non appariée lors de l’expérience précédente. Cependant

Figure I-10 : Pourcentages de réponse conditionnée (RC) et erreur standard lors du test au contexte lors de l’expérience 3. A : Cinétique par minute du pourcentage de RC des animaux durant les 5 minutes du test au contexte et les 5 minutes d’extinction en fonction de l’intervalle de Trace. B : Pourcentage moyen de RC lors du Test au contexte en fonction de l’intervalle de Trace. # : Significativement différent (p<0,05) du groupe T90 ; * : Significativement différent (p<0,05) du groupe D.


52

on peut remarquer les groupes ayant suivi des protocoles de conditionnement avec des

intervalles de trace plus courts manifestent une RC au son d’autant plus importante que

l’intervalle de trace est court.

L’ANOVA effectuée sur la RC lors du son confirme ces observations puisqu’elle met

en évidence un effet significatif de l’intervalle de Trace (F(3,32)=9,29, p<0,0001). De plus, le

test SNK permet de préciser cet effet puisqu’il détecte des différences entre les réponses de

l’ensemble des groupes hormis entre le groupe T10 d’une part et les groupes D et T30 de

l’autre.

5) RC au moment supposé de la survenue du choc en fonction du groupe.

La figure I-11C présente la cinétique de RC des animaux avant, pendant et jusqu’à

90 s après la présentation du son, en fonction de l’intervalle de temps séparant le SC et SI.

L’observation de cette cinétique permet de constater que l’amplitude globale de la RC durant

la durée représentée varie en sens inverse de la durée de l’intervalle de trace, comme pour la

RC durant la présentation du son. La RC des animaux augmente fortement au moment de la

présentation du son par rapport au bloc qui précède. Toutefois, cette réponse continue

d’augmenter et présente ainsi un pic de durant les 10 s qui suivent la présentation du son. Ce

pic de RC est présent au même moment pour l’ensemble des groupes et pas seulement pour le

groupe conditionné avec un intervalle de trace de 10 s. On remarque néanmoins que la RC

immédiatement après le son semble plus importante dans le groupe T10 que dans le groupe

Délai. Par la suite, la RC décroît et se stabilise pour l’ensemble des groupes, la réponse dans

le groupe T90 restant plus faible que dans les autres groupes. On note en particulier qu’il

n’existe aucune indication d’une augmentation de la RC au moment attendu du choc dans le

groupe T30.

Une ANOVA en mesures répétées sur l’ensemble de la réponse après le son montre une

évolution de la réponse avec le temps (bloc, F(5,160)=19,59, p<0,0001) et un effet du groupe

(F(3,32)=2,94, p<0,05), ainsi qu’une interaction entre ces deux facteurs (F(15,160)=2,48,

p<0,005), qui traduit uniquement le fait que les différences entre groupes s’atténuent au cours

du temps.


53

0

20

40

60

80

100 DT10T30T90

*

0

20

40

60

80

100 DT10T30T90

*#

*

##

##

0

20

40

60

80

100

CX MOD

Pre SC SC Post 10s

Post 20s

Post 30s

Post 40s

Post 50s

Post 60s

Post 70s

Post 80s

Post 90s

DT10T30T90

% RC

% RC

A B

C

Figure I-11 : Pourcentages de réponse conditionnée (RC) et erreur standard lors du test au son lors de l’expérience 3, en fonction de l’intervalle de Trace. A : Pourcentage moyen de RC durant 5 minutes de test au contexte modifié. B : Pourcentage moyen de RC durant les 3 présentations du son de 10 s. C. RC moyenne durant les 5 minutes de test au contexte modifié (CX MOD) et cinétique de la RC lors de la présentation du son, moyennée sur trois essais, par blocs de 10 s. # : Significativement différent du groupe T90 (p<0,05) ; ## : Significativement différent du groupe T90 (p<0,01) ; * : Significativement différent du groupe D (p<0,05) ; ** : Significativement différent du groupe D (p<0,01). PRE-SC : Bloc de 10 s précédant le son ; SC : Présentation du son ; Post 10s à Post 90s : Blocs de 10 s suivant la fin du son.


54

Cette expérience nous a permis de constater que la RC au son décroît avec

l’intervalle de trace alors qu’en parallèle la RC au contexte augmente.

De plus, il est important de remarquer que le groupe d’animaux conditionnés

avec un intervalle de Trace de 30s présente à la fois une bonne RC au son et au

contexte.

CHAPITRE I : DISCUSSION

55

DISCUSSION

I- Intensité du SI et Réponse Conditionnée.

L’intensité du SI est un paramètre essentiel puisque c’est de ce facteur que va

dépendre en grande partie l’intensité de la RC que l’on va pouvoir observer lors des tests. Une

trop faible intensité de SI conduira à une faible RC, alors qu’un SI trop fort aboutira à la mise

en place d’une réponse généralisée ne permettant pas l’étude de processus spécifiquement

impliqués dans l’association entre le SC et le SI (Garcia et Jaffard, 1996; Maes et coll., 1996;

Maren et coll., 1997; Westbrook et coll., 1997; Radulovic et coll., 1998). Nous voulions

obtenir non seulement une RC avec un SC présenté en Délai ou en Trace, mais aussi une RC

au contexte, et pour des raisons éthiques nous voulions nous en tenir à l’intensité de choc la

plus faible permettant d’observer ces phénomènes.

On notera que notre protocole comporte cinq présentations du SC et du SI appariées

ou non, et que dans ces conditions, nous avons montré l’apparition graduelle de la RC lors de

la séance d’acquisition. Dans certaines études comparables, le nombre d’appariements pouvait

être plus faible, voire limité à un seul (Misane et coll., 2005; Rudy et Matus-Amat, 2005). Un

tel protocole ne nous semblerait pas approprié dans la mesure où il nécessite une intensité du

SI importante et se manifeste généralement par un conditionnement au son et au contexte

relativement indifférencié.

Les deux premières expériences portaient sur quatre intensités de SI (0,2 / 0,3 / 0,4 et

0,6 mA) et ont montré que l’intensité de 0.4 mA semblait l’intensité de choc la plus

appropriée à utiliser dans notre protocole de conditionnement de Trace. En effet, une intensité

de choc de 0,2 mA est insuffisante pour permettre la mise en place d’une RC non négligeable

au son. L’intensité de 0,3 mA quant à elle conduit à une RC au son plus forte mais ne permet

pas d’observer de RC au contexte, même lors de l’utilisation d’un protocole non Apparié

censé favoriser la mise en place d’un tel conditionnement. En ce qui concerne le

conditionnement au son, les intensités de 0,4 et 0,6 mA induisent toutes les deux une forte RC


56

à des niveaux identiques. Cependant l’intensité de 0,6 mA contrairement à celle de 0,4 mA

conduit à la mise en place d’une RC au contexte dans une situation où le contexte est supposé

être peu conditionné. L’intensité de 0,4 mA, quant à elle, permet d’obtenir une réponse au

contexte spécifiquement dans la situation non Appariée. Elle semble être l’intensité de choc la

plus appropriée puisque c’est l’intensité la plus faible pour laquelle il est possible d’obtenir

aussi bien une RC au son qu’au contexte et qu’elle ne semble pas induire de réponse de peur

généralisée.

II- Nature du SC et Réponse Conditionnée.

Durant les deux premières expériences de ce chapitre, nous avons systématiquement

utilisé deux types de SC (Tone et Clicker) de façon contrebalancée lors des phases de

conditionnement, afin d’en sélectionner un pour notre protocole. Ces deux sons sont de nature

relativement différente. Le Tone est un son pur qui conserve la même fréquence durant

l’ensemble de sa présentation. Le Clicker quant à lui présente de multiples phases d’allumage

et d’extinction tout au long sa présentation. De plus, le Clicker, contrairement au Tone, est

constitué d’un ensemble de fréquences, notamment de basses fréquences pouvant induire des

vibrations dans la cage lors de sa présentation. Ce dernier point suggère que le Clicker

contrairement au Tone va pouvoir être perçu par l’animal de façon plurimodale (auditive et

tactile).

Les résultats obtenus indiquent que ces deux types de stimuli permettent d’obtenir des

niveaux de RC au son et au contexte comparables quelle que soit l’intensité du SI. Cependant

la deuxième expérience montre que, chez les animaux conditionnés avec le Clicker, la réponse

de peur au son est similaire que ce dernier soit conditionné en PA ou en NAP. Pourtant, seul

le protocole apparié est supposé donner lieu à un véritable conditionnement. Par contre, les

animaux conditionnés avec le Tone ne présentent une forte RC que si ce dernier a été présenté

de façon appariée lors du conditionnement. L’existence d’une forte RC au son indépendante

du protocole chez les animaux conditionnés avec le Clicker pose la question de la nature de la

réponse conditionnée à ce stimulus. De même, la première expérience ne permet pas

d’observer de différence de RC au son en fonction de l’intensité du SI chez des animaux


57

conditionnés avec le Clicker. Effectivement, si l’on considère que l’intensité de 0,2 mA

semble insuffisante pour la mise en place d’une RC au son, la différence de réponse au son

entre cette intensité et les intensités supérieures n’est observable que chez les animaux

conditionnés avec le Tone. L’ensemble de ces constatations suggère donc que l’utilisation du

Tone en tant que SC dans les futures expériences est de nature à faire apparaître plus

nettement des différences entre situations expérimentales.

III- Conditionnement avec intervalle de Trace variable.

Notre troisième expérience portait sur la durée de l’intervalle de Trace à utiliser. Pour

cela, nous avons conditionné quatre groupes d’animaux à l’aide de protocoles de

conditionnement ne différant que par la durée de l’intervalle de Trace séparant le SC et le SI

(0 s, 10 s, 30 s et 90 s). Nous avons ainsi pu observer les variations de RC au son mais aussi

au contexte induites par l’augmentation de l’intervalle de Trace.

Les résultats confirment que les rats sont capable d’associer un SC et un SI et

d’exprimer une réponse de peur conditionnée même lorsque les deux stimuli sont présenté de

façon non contiguë, pour des intervalles de Trace allant au moins jusqu’à 30 s. Ce résultat est

cohérent avec les données de divers autres auteurs (Kamin, 1965; McKinzie et Spear, 1995;

McEchron et coll., 1998; Marchand et Kamper, 2000; Quinn et coll., 2002; Weitemier et

Ryabinin, 2004; Misane et coll., 2005). Au contraire, un intervalle de Trace de 90 s ne semble

plus permettre l’établissement d’une telle association. L’expérience met en outre en évidence

une variation inverse du conditionnement au son et au contexte suggérant l’existence d’un

processus de compétition (Marlin, 1981).

1) RC au son et intervalle de Trace.

Cette expérience met en évidence une diminution graduelle de l’intensité de la RC au

son avec l’utilisation d’intervalles de Trace croissants. La RC au son comme au contexte,

obtenue avec un intervalle de Trace de 90 s est comparable à celle obtenue dans l’expérience

2 avec un protocole où SC et SI étaient non Appariés. Il semble donc qu’il n’y ait pas de


58

conditionnement dans ce cas, l’intervalle de Trace le plus long rapporté dans la littérature du

conditionnement de peur étant de 80 s (McKinzie et Spear, 1995). Néanmoins, dans le groupe

NAP comme dans le groupe Trace 90, une réponse résiduelle au son de l’ordre de 20% est

observée. Cette réponse est analogue celle observée par Quinn et collaborateurs (2002) dans

une situation non appariée, réponse que ces auteurs attribuent à une association entre le son et

le contexte. Si les animaux n’étaient pas capables de se conditionner à un SC présenté en

Trace, alors seule cette réponse devrait être observée, quel que soit l’intervalle de Trace

utilisé. Or nos résultats montrent que les animaux continuent à présenter une RC proche de

50% quand l’intervalle de Trace est de 30 s. Le fait que la RC au son soit significativement

supérieure avec l’intervalle de Trace de 30 s par rapport à l’intervalle de 90 s démontre donc

qu’un conditionnement de Trace existe véritablement et non une réponse au son sensibilisée

par la présentation des chocs (Gormezano et coll., 1983). La diminution graduelle de la RC de

Trace quand l’intervalle augmente peut faire l’objet de plusieurs interprétations. Il est

notamment possible que le rat perde simplement la mémoire à court-terme du son ou que

d’autres stimuli jouent le rôle de distracteurs par rapport au son (Han et coll., 2003).

En parallèle de cette modification de l’intensité de RC, on peut noter que l’insertion

d’un intervalle de Trace modifie peu la cinétique temporelle de cette RC. Il a été largement

démontré que, lors d’un conditionnement de Trace de la membrane nictitante, le pic de RC

après présentation du SC se produit peu avant le moment prévu de l’arrivée du choc

(Gormezano et coll., 1983). Notre expérience suggère que l’insertion de l’intervalle de Trace

semble induire un décalage de 10 s du pic de réponse. Cette apparente différence de cinétique

entre la RC des groupes Délai et T10 demande à être confirmée, mais il faut noter que ce pic

est le même pour l’ensemble des groupes conditionnés en Trace et ne correspond pas à

l’arrivée supposée du SI (hormis bien sûr pour le groupe T10). Ce résultat est cohérent avec

des observations antérieures faites au laboratoire sur les réponses cardiaques conditionnées

(Marchand et Kamper, 2000) ainsi que sur la réponse conditionnée de freezing (Marchand et

coll., 2003). Il semble en désaccord avec les travaux de Burman et Gewirtz (2004) obtenus

avec une mesure de potentialisation du sursaut. Toutefois, ces auteurs n’ont pas examiné

d’intervalles de Trace de plus de 12 s et il est donc possible qu’une sélectivité temporelle soit

observable pour des intervalles de Trace courts (voir aussi Marchand et Kamper, 2000).


59

Plus qu’un décalage temporel, il est fort possible que ce retard de réponse traduise plus

la possibilité des animaux conditionnés en Trace de se conditionner à deux composantes du

SC : son début et son arrêt. Effectivement, lors de l’utilisation d’un protocole de Délai, le

début du son et sa présence prolongée sont les meilleurs prédicteurs du choc. Dans un

conditionnement de Trace, bien que le début et la durée du son prédisent bien l’apparition du

SI, l’arrêt du SC constitue un prédicteur encore plus pertinent puisque c’est cet événement qui

est le plus proche temporellement du SI. Ce phénomène a été montré notamment par

Desmond et Moore (1991) ou Kehoe et Weidemann (1999) au moyen de modifications de la

durée du SC lors du test. La réponse conditionnée de la membrane nictitante présente alors

deux pics produits respectivement par le début et la fin du SC. Par contre, Marchand et coll.

(2003) ont montré un retard dans la réponse de peur conditionnée en Trace (50 s) alors même

que le SC était présenté de manière continue et que cette réponse ne pouvait donc être

attribuée à l’arrêt du SC. Ainsi il semble important lors de la suite de nos travaux de

s’intéresser non seulement à la RC des animaux durant la présentation du son, mais aussi

durant les dizaines de secondes qui suivent l’extinction de ce dernier.

2) RC au contexte et intervalle de Trace.

Cette expérience met en évidence que l’intensité de la RC au contexte augmente

graduellement avec l’utilisation d’intervalles de Trace croissants. En particulier, il est possible

d’observer un niveau non négligeable de RC au contexte avec un intervalle de Trace de 30 s.

Cette réponse semble pouvoir encore augmenter avec l’utilisation d’un intervalle de 90 s ou

encore avec un protocole non Apparié comme celui employé dans l’expérience 2. Nous avons

constaté lors de la deuxième expérience qu’avec une intensité de choc de 0,4 mA les animaux

pouvaient présenter une RC au contexte notable. Cette réponse qui n’était présente que

lorsque le son était présenté de façon non Appariée indique qu’en protocole Apparié il existe

un masquage du conditionnement au contexte par le conditionnement au son. Ce phénomène

est confirmé dans l’expérience 3 par l’existence d’une différence significative de RC au

contexte entre les groupes T90 et Délai.

Dans ces expériences, le conditionnement au contexte est assez aisément éteint lors du

test. Ceci est important car nous voulons pouvoir tester la réponse à un son en Trace


60

indépendamment de toute contribution d’un conditionnement contextuel (Marchand et coll.,

2004). Ainsi, en pratiquant le test au contexte avant le test au Son et en testant le son dans un

contexte modifié (cf. Kim et Fanselow, 1992), la mesure de la RC au son en Trace devrait être

relativement peu influencée par le niveau de conditionnement au contexte. C’est

effectivement ce que l’on constate lors du test au contexte modifié, où la RC mesurée est très

faible, indépendamment du niveau de RC au contexte observée le jour précédent. Même au

cas où l’extinction ne serait pas complète, la réponse au contexte semblerait donc assez

spécifique pour ne pas donner lieu à une généralisation.

3) Compétition entre contexte et son.

Nos résultats montrent une variation inverse des réponses de peur au contexte et au

son en fonction de l’intervalle de Trace. Augmenter ce dernier induit en parallèle une

diminution de la réponse de Trace et une augmentation graduelle du conditionnement au

contexte. Ce phénomène est cohérent avec l’existence d’une compétition entre les deux

stimuli. Ainsi, en protocole de Délai, le contexte est très largement masqué par le son. Ce

phénomène avait été observé avec d’autres mesures de la RC que le freezing, comme la

préférence pour un contexte (Marlin, 1981; Selden et coll., 1991), mais plus difficilement

avec ce type de mesures (LoLordo et coll., 2001). Il est possible que l’emploi d’un petit

nombre d’appariements avec des chocs intenses ou de séances de conditionnement multiples

soit défavorable à l’observation du phénomène de masquage.

Il est important de noter que même le son conditionné en Trace semble capable de

masquer partiellement le contexte, puisque l’apparition de la RC au contexte quand

l’intervalle de Trace augmente est graduelle. De plus, il n’est pas exclu que l’absence de

réponse au son dans le groupe T90 soit due à un masquage de la Trace du son par le contexte

(Westbrook et coll., 1997). La mise en évidence de la compétition entre son et contexte lors

d’un conditionnement de Trace laisse à penser que le conditionnement de Trace ne serait pas

uniquement attribuable à la médiation contextuelle, compte tenu de la relation antagoniste

existant entre ces deux conditionnements.


61

4) Choix de l’intervalle de Trace.

Cette phase de l’étude nous ayant permis d’observer les RC des animaux en fonction

des intervalles de Trace, nous pouvions déterminer l’intervalle de Trace à utiliser dans la suite

des expériences. L’intervalle de 90 s était exclu puisque les animaux ne présentent qu’un

faible niveau de RC lors du test au son. Les intervalles de Trace de 10 s ou 30 s permettent la

mise en place d’une forte RC au son. Cependant le groupe T30 présente les caractéristiques

les plus intéressantes. En effet les animaux conditionnés avec cet intervalle présentent une

réponse moyenne à la fois au son et au contexte. Ces réponses de peur conditionnée indiquent

un certain équilibre dans la compétition entre son et contexte. Ainsi les manipulations

ultérieures devraient permettre de mettre en évidence dans ce groupe aussi bien une

diminution qu’une augmentation du conditionnement au contexte ou au son en Trace. Dans le

cas de l’intervalle de 10 s, il est probable qu’aucune manipulation ne puisse mettre en

évidence une augmentation de la RC puisque la réponse des animaux conditionnés avec cet

intervalle est déjà comparable à celle d’animaux conditionnés en protocole de Délai.

CHAPITRE I : CONCLUSION

62

CONCLUSION

Les expériences présentées de ce chapitre nous ont permis d’aboutir à un protocole

avec lequel se manifestent à la fois un conditionnement de Trace significatif et un

conditionnement contextuel, tous deux sensibles à des manipulations de l’intervalle entre SC

et SI. Dans la suite des expériences, les animaux seront donc exposés à 5 appariements

SC SI dans lequel le SC est un Tone (10 s, 5000 Hz, 70 dB) et le SI un choc électrique (1 s,

0,4 mA), présentés soit en condition de Délai, soit avec un intervalle de Trace de 30 s.

De plus, ces premières expériences nous ont aussi permis d’observer l’existence d’un

phénomène de masquage du conditionnement au contexte par le conditionnement au son. De

manière intéressante ce phénomène de masquage est conservé (bien que diminué) lors de

l’introduction d’un intervalle de Trace. Cette première constatation semble aller à l’encontre

de l’hypothèse de la médiation contextuelle qui suppose que le conditionnement au contexte

et le conditionnement de Trace devraient être établis de façon synergique, puisque le

masquage est la traduction d’un antagonisme entre les deux stimuli.

CHAPITRE II

Composante contextuelle du conditionnement de Trace « Implication de l’hippocampe et de ses sous-régions »

CHAPITRE II : INTRODUCTION

63

INTRODUCTION

Les expériences effectuées dans le chapitre précédent nous ont permis de mettre au

point un protocole de peur conditionnée pour lequel les animaux présentent une RC à un

stimulus auditif même lorsque ce dernier est séparé du SI par un intervalle de Trace de 30 s.

Dans ce chapitre, nous évaluerons la sensibilité de ce conditionnement à diverses

manipulations du fonctionnement de l’hippocampe, ainsi que les liens possibles entre le

conditionnement de Trace et le conditionnement contextuel.

I- L’hippocampe.

1) Généralités.

L’hippocampe est une structure cérébrale du lobe temporal médian appartenant au

système limbique et participant à la fois aux processus émotionnels et mnésiques. Le rôle de

cette structure a largement été étudié depuis les années 50 à la suite des travaux pionniers de

Brenda Milner basés sur l’étude du patient HM. Ce patient avait subi une ablation chirurgicale

des lobes temporaux incluant bilatéralement les 2/3 antérieurs de l’hippocampe, le gyrus

parahippocampique, le cortex temporal antérieur, l’uncus et l’amygdale, afin de tenter

d’endiguer de fortes crise épileptiques résistant aux traitements classiques de l’époque. Le

patient H.M. présentait à la suite de l’intervention de graves troubles mnésiques. Il était

incapable de former des nouveaux souvenirs sur la vie de tous les jours (incapacité à

reconnaître le personnel hospitalier) ou de se rappeler des événements de sa vie survenus

quelques années auparavant, tels que la mort de son oncle. Cependant, certaines de ses

capacités mnésiques semblaient préservées. H.M. était ainsi capable de se souvenir

d’événement survenus dans les jours précédant l’intervention et pouvait acquérir de nouvelles

aptitudes procédurales (Scoville et Milner, 1957).


64

A la suite de ces observations, de nombreuses études chez l’animal et le sujet humain

ont permis de préciser le rôle de cette structure dans la formation initiale des souvenirs à long-

terme. Ces études ultérieures ont mis en évidence l’existence de plusieurs types de mémoire

qui diffèrent non seulement par la nature des informations qu’elles supportent mais aussi par

les aires cérébrales qui les sous-tendent. La fonction hippocampique a également fait l’objet

de diverses théories et de modèles qui exploitent l’organisation anatomique très particulière

de cette région cérébrale.

2) Subdivisions de l’hippocampe.

Si l’hippocampe est une des structures cérébrales les plus étudiées, elle est aussi une

des plus complexes au niveau neuroanatomique. L’hippocampe est une structure

télencéphalique bilatérale faisant partie du système limbique. C’est une structure

phylogénétiquement ancienne (archicortex) qui ne comporte que trois couches cellulaires. Vu

de côté, l’hippocampe a une forme de C se développant sur un axe septo-temporal (figure II-

1A, D). En coupe transversale, on peut remarque que l’hippocampe présente deux structures

en forme de U inversé : le gyrus denté (GD) et la corne d’Ammon (Ramón y Cajal, 1911).

C’est cette deuxième structure qui constitue l’hippocampe à proprement parler.

L’hippocampe est divisé en trois sous régions nommées CA1, CA2 et CA3. A ces trois

sous-régions, on associe généralement le GD ainsi que le subiculum, sous le nom de

formation hippocampique. La connectivité entre ces trois aires est largement

unidirectionnelle. Il existe deux types cellulaires principaux au sein de la formation

hippocampique, les cellules granulaires du GD et les cellules pyramidales des champs

ammoniques. Les corps des cellules granulaires, qui sont essentiellement glutamatergiques,

sont situés dans le stratum granulosum. Les projections axonales de ces neurones vers l’aire

CA3 constituent les fibres moussues. Les corps des cellules pyramidales sont situés dans le

stratum pyramidale des champs ammoniques et sont eux aussi essentiellement

glutamatergiques. L’hippocampe présente en outre un nombre important d’interneurones

inhibiteurs GABAergiques.


65

Figure II-1 : Représentation schématique de l’hippocampe de rats. A : localisation de l’hippocampe dans l’encéphale de rat. B : Section sagittale (1,9 mm de latéralité) et frontale (3,14 mm en arrière du Bregma) présentant l’hippocampe dorsal (en rouge). C : Section sagittale (4,2 mm de latéralité) et frontale (5,20 mm en arrière du Bregma) présentant l’hippocampe dorsal (en rouge) et ventral (en mauve). D : Représentation schématique d’une coupe frontale d’hippocampe dorsal avec ses principales sous-régions et leurs connexions intrinsèques. Abréviations : CEL, cortex entorhinal latéral ; CEM, cortex entorhinal médian ; CS, collatérales de Schaffer ; FM, fibres moussues ; GD, gyrus denté ; Sb, subiculum ; VP, voie perforante.


66

3) Connectivité de l’hippocampe.

a) Efférences.

La principale voie efférente de l’hippocampe est formée par le fornix qui est constitué

du prolongement des axones des cellules pyramidales hippocampique. Le fornix permet ainsi

le transit des informations de l’hippocampe vers des structures telles que le septum et

l’hypothalamus (Chronister et White, 1975).

Une autre voie de sortie importante de l’hippocampe passe par le subiculum. Les

axones des neurones situés en CA1 projettent vers le subiculum qui à son tour projette sur le

cortex entorhinal. Ce dernier va à son tour émettre des projections vers différentes aires

associatives du néocortex telles que le cortex préfrontal ou le cortex orbito-frontal.

En parallèle de ces deux principales voies, on peut noter que l’hippocampe projette

vers diverses structures cérébrales telles que les différents noyaux de l’amygdale, le cortex

entorhinal et les cortex péri- et post-rhinaux, ainsi que vers de nombreuses autres régions

corticales via des projections neuronales essentiellement issues de l’aire CA1 (Figure II-2).

b) Afférences.

Les principales afférences hippocampiques (Figure II-1D) proviennent du cortex

entorhinal qui émet des projections vers le GD mais aussi vers les aires CA3 et CA1. C’est

par ces voies que l’hippocampe va recevoir la majeure partie des informations en provenance

des aires sensorielles. La projection du CE sur le GD est nommée voie perforante. C’est la

seule entrée corticale au niveau du GD. En revanche, le GD reçoit des projections en

provenance de régions sous-corticales telles que le septum ou l’hypothalamus et de régions du

tronc cérébral, en particulier le locus cœruleus et les noyaux du raphé. Il semblerait de plus

qu’une partie de la voie perforante soit constituée de projections axonales en provenance du

cortex périrhinal et se terminant sur les neurones de CA1 (Liu et Bilkey, 1996).

En dehors de la voie perforante, il existe deux voies en provenance du CE et

aboutissant en CA3 et CA1. Les deux champs hippocampiques reçoivent aussi des entrées

sous-corticales en provenance du septum plus importantes en CA1 qu’en CA3 ainsi que


67

quelques entrées thalamiques en provenance directe du nucleus reuniens. Enfin, ces deux

aires reçoivent des connexions en provenance des divers noyaux amygdaliens, plus

importante pour CA1 que pour CA3 qui n’est essentiellement innervé que par le noyau basal

(Pikkarainen et coll., 1999; Pitkanen et coll., 2000).

CA1

GD

SUBICULUM

CA3

CE

Amg

PL

IL

BO

c) Connexions intrinsèques

L’hippocampe présente un profil particulier de connexions intrinsèques reliant

l’ensemble des régions de la formation hippocampique. Ce réseau de connexion est nommé

circuit tri-synaptique. Le point de départ de ce circuit est constitué par la connexion

synaptique entre la voie perforante du CE et les cellules granulaires du GD. Les cellules de la

couche granulaire donnent naissance aux fibres moussues qui innervent à leur tour les cellules

de CA3. Les cellules pyramidales de CA3 émettent des projections nommées collatérales de

Schaffer à destination des cellules de CA1. Il existe de plus au niveau de l’aire CA3 un

Figure II- 2 : Représentation schématique des principales projections en provenance de l’aire CA1 sur le reste de la formation hippocampique et du manteau cortical. Les projections issues de l’aire CA1 dorsale sont représentées en rouge. Les projections issues de l’aire CA1 ventrale sont représentées en bleu. Abréviations : Ag, agranulaire ; Amg, Amygdale ; BO, Bulbe olfactif ; CE, cortex entorhinal ; CgA, Cortex cingulaire antérieur ; CPr, Cortex périrhinal ; ECT, Aire ectorhinale ; FFx, Fimbria-fornix ; GD, Gyrus denté ; IL, Cortex infralimbique ; PL, Cortex prélimbique ; SSs, Aire somatosensorielle supplémentaire. (Adapté de Cenquizca et Swanson, 2007).


68

important ensemble de fibres nommées collatérales récurrentes, constituées par les

prolongements axoniques des cellules de l’aire CA3 projetant sur d’autres cellules de cette

aire. Ces connexions excitatrices récurrentes jouent un rôle central dans les modèles

théoriques proposés pour cette région.

4) Hippocampe dorsal et hippocampe ventral.

Sur la base de différenciations anatomiques (Pitkanen et coll., 2000) et physiologiques

(Donley et coll., 2005; Maggio et Segal, 2007a, 2007b) l’hippocampe est généralement divisé

en deux régions distinctes : l’hippocampe dorsal (HPCd) et l’hippocampe ventral (HPCv). De

façon relativement simpliste on peut définir l’HPCd comme correspondant aux 50% du

volume hippocampique situés dans la région la plus septale alors que l’HPCv correspondrait

aux 50% du volume hippocampique situés dans la région la plus temporale (Bannerman et

coll., 2004). L’HPCd et l’HPCv présentent des profils de connexion différents et semblent

aussi différentiellement impliqués dans plusieurs processus cognitifs.

Une des différences majeures entre ces deux régions hippocampiques repose sur leur

profil de connexions respectives avec les différents noyaux amygdaliens. L’HPCd reçoit peu

d’afférences en provenance de l’amygdale. Au contraire, l’HPCv reçoit de nombreuses

connexions en provenance de l’ensemble des noyaux de l’amygdale. En particulier, le noyau

latéral projette préférentiellement vers l’aire CA1 de l’HPCv alors que le noyau basal projette

à la fois sur les aires CA1 et CA3 de l’HPCv (Pikkarainen et coll., 1999). De plus, seul

l’HPCv émet des projections en direction des noyaux amygdaliens à partir de l’aire CA1

(Pitkanen et coll., 2000). En outre, les afférences sensorielles se répartissent aussi

différemment entre les deux sous-régions hippocampiques. Ainsi, l’HPCd reçoit la majorité

des projections concernant les informations visuo-spatiales en provenance des cortex sensoriel

primaires, via les cortex associatifs et les cortex entorhinal et périrhinal (Amaral et Witter,

1995). Par contre, les projections concernant les autres modalités sensorielles sont réparties de

façon plus diffuse sur l’ensemble de l’hippocampe (Bannerman et coll., 2004).

Les projections de l’HPCd et l’HPCv en direction des cortex se répartissent aussi

différemment. Ainsi, les projections ayant pour origine le CA1 dorsal aboutissent


69

majoritairement sur le cortex rétrosplénial alors que celles en provenance du CA1 ventral se

terminent au niveau des cortex visuel, auditif, somatosensoriel, gustatif, olfactif principal et

accessoire, ainsi que viscéral (Cenquizca et Swanson, 2007).

5) Hippocampe et processus cognitifs.

a) Théories sur la fonction de la formation hippocampique.

Il est de nos jours bien admis que, chez l’homme, l’hippocampe serait capital dans la

formation de la mémoire épisodique, même si la question de son rôle dans le stockage à long-

terme des souvenirs n’est pas résolue (Teyler et Rudy, 2007). La mémoire épisodique est une

forme de mémoire déclarative/explicite qui concerne les événements « biographiques»

survenus dans la vie d’une personne (Tulving, 1972). Cette forme de mémoire réclame

l’intégration de trois composantes : la composante situationnelle ou « quoi » qui concerne la

nature de l’événement, la composante spatiale ou « où » qui concerne le lieu et le contexte

dans lequel l’événement s’est produit et enfin la composante temporelle ou « quand » qui

concerne le moment auquel l’événement a eu lieu. Néanmoins, chez l’animal, l’existence d’un

équivalent de la mémoire épisodique reste encore débattue (Clayton et Dickinson, 1998;

Roberts et coll., 2008, pour revue voir Dere et coll., 2006).

Les connexions anatomiques de la formation hippocampique en font une zone de

réception majeure des signaux en provenance des aires corticales sensorielles. Elles révèlent

aussi une organisation intrinsèque se caractérisant par un haut degré d’interconnexion

favorable à une activité auto-soutenue et récurrente. Tout ceci suggère donc que cette

structure pourrait contribuer à l’utilisation flexible de représentations complexes de stimuli.

Chez l’animal, la capacité de l’hippocampe de permettre la formation et l’utilisation de

représentations complexes et flexibles de stimuli a été invoquée pour expliquer son rôle

majeur dans des tâches spatiales, conditionnelles, ou séquentielles (Eichenbaum, 1996).

L’ensemble des processus hippocampo-dépendants est souvent rassemblé sous le nom de

mémoire déclarative (Squire, 1992; Eichenbaum, 2004). Mais le rôle de la formation

hippocampique apparaît particulièrement critique dans les apprentissages spatiaux. Il a

effectivement été montré par des études lésionnelles que des animaux ne disposant pas d’un


70

hippocampe fonctionnel étaient fortement déficitaires lors d’apprentissages spatiaux et

d’épreuves d’exploration (Morris et coll., 1982; Sutherland et coll., 1982; Jarrard, 1993). Ces

déficits étaient attribués au rôle de l’hippocampe dans la mise en place d’une représentation

spatiale (O'Keefe et Nadel, 1978; Taube et coll., 1990). En outre, cette structure a la capacité

d’associer cette représentation spatiale à des stimuli non spatiaux (Shapiro et Eichenbaum,

1999), ce qui pourrait être important dans le cadre d’un conditionnement de Trace. Cette

interprétation est largement appuyée par l’existence au sein de l’hippocampe de « cellules de

lieu » répondant essentiellement à la position d’un animal dans son environnement, mais

également capables d’intégrer à ce codage une réponse à des stimuli significatifs pour

l’animal (Moita et coll., 2004).

En parallèle de son rôle dans les apprentissages spatiaux, l’hippocampe est impliqué

dans le traitement d’informations contextuelles. Cette structure semble en effet

particulièrement adaptée à la formation d’associations polymodales, complexes (Sutherland et

Rudy, 1989). Ainsi, l’hippocampe ne serait pas requis lors de la mise en place et la restitution

d’associations simples du type SC-SI quand le SC est un stimulus élémentaire, mais serait

nécessaire pour la mise en place de la représentation configurale, unifiée du contexte, qui

semble un préalable au conditionnement contextuel (Phillips et LeDoux, 1992; Holland et

Bouton, 1999; Rudy et coll., 2004).

La fonction hippocampique a fait l’objet de diverses théories et modélisations visant à

préciser comment les diverses informations étaient intégrées et traitées par les différentes

sous-régions. Une idée générale de ces modèles est que l’hippocampe a une fonction de

traitement de l’information qui modifie les représentations de stimuli qui sont ensuite utilisées

par d’autres régions (Rudy et Sutherland, 1995; Gluck et coll., 2003). Ainsi, certains auteurs

ont proposé que l’hippocampe encode les stimuli ou ensembles de stimuli nouveaux

(Schmajuk et DiCarlo, 1992), un processus auquel participerait une modulation cholinergique

de la plasticité synaptique (Hasselmo et coll., 1995). Une autre théorie propose que

l’hippocampe serve à différencier des configurations de stimuli relativement voisines (Gluck

et Myers, 1997). Enfin, une théorie influente considère que l’hippocampe joue le rôle d’un

auto-associateur au niveau de la région CA3. Lors de la présentation d’un élément de la

situation initialement encodée, une représentation de l’ensemble de la situation y serait


71

rappelée et transmise à la région CA1. Cette dernière recoderait l’information issue de CA3 en

y intégrant des événements survenant à différents instants et la transmettrait au néocortex

(Rolls et Kesner, 2006).

Enfin, en dehors de son rôle dans des processus d’encodage et de mémorisation,

l’hippocampe pourrait aussi réguler l’activité d’autres structures comme l’amygdale (Maren et

Hobin, 2007) et ainsi avoir un rôle plus général dans le traitement des informations et la

régulation ultérieure du comportement.

b) Dissociations fonctionnelles de l’hippocampe dorsal et ventral.

Il semble actuellement émerger un consensus quant au fait que l’hippocampe ne serait

pas une structure fonctionnellement uniforme mais que les nombreuses fonctions qu’il sous-

tend serait traitées par des régions spécifiques ségrégées sur son axe septo/temporal

(Bannerman et coll., 2004). L’HPCd et l’HPCv semblent pouvoir être différenciés aussi bien

au niveau anatomique (Pitkanen et coll., 2000) que physiologique (Moser et Moser, 1998;

Donley et coll., 2005; Maggio et Segal, 2007a, 2007b). De même, il semblerait que ces deux

régions soient impliquées de façon différente dans certains processus décrits comme étant

« hippocampo-dépendant». En particulier, des lésions sélectives de ces deux sous-régions

peuvent avoir des effets distincts et dissociables au plan comportemental.

La partie dorsale de l’hippocampe est supposée plus particulièrement impliquée dans

les apprentissages spatiaux. Une lésion de l’hippocampe dorsal peut ainsi avoir des effets

dramatiques et similaires à ceux induit par une lésion totale par aspiration de l’hippocampe

sur les performances d’un animal lors d’un apprentissage spatial en piscine de Morris. Au

contraire, une lésion ne concernant que la partie ventrale de l’hippocampe n’induit que peu de

déficit (Moser et coll., 1993). Ce type de dissociation a été par la suite reproduit à l’aide de

lésions excitotoxiques par injection de NMDA (Bannerman et coll., 1999; Bannerman et coll.,

2002; Bannerman et coll., 2003) ou d’acide iboténique (Moser et coll., 1995). L’implication

sélective de l’hippocampe dorsal dans la mémoire spatiale a pu aussi être mise en évidence

dans des tâches comportementales appétitives telle que l’alternance renforcée dans un

labyrinthe en T (Hock et Bunsey, 1998; Bannerman et coll., 1999) ou en labyrinthe radiaire

(Pothuizen et coll., 2004). L’ensemble de ces travaux met donc en évidence le fait que la


72

composante spatiale supposé hippocampo-dépendante serait essentiellement prise en charge

par la partie dorsale de cette structure aussi bien lors de tâches de mémoire de référence que

de mémoire de travail.

En ce qui concerne l’hippocampe ventral, il semblerait que ce dernier soit

généralement impliqué dans les processus mis en jeu lors d’un conditionnement de peur. Il a

effectivement été montré que des lésions de l’hippocampe ventral étaient suffisantes pour

reproduire les effets d’une lésion totale de l’hippocampe sur les réponses de peur observées

durant le conditionnement et les tests (Richmond et coll., 1999). Par ailleurs, des expériences

de lésion pratiquées avant ou après le conditionnement ont suggéré que l’HPCv et l’HPCd

pourraient être différemment impliqués dans l’expression de la réponse de peur en condition

de Trace (Burman et coll., 2006).

Il reste donc encore nécessaire de déterminer dans quelle mesure l’HPCd et l’HPCv

sont différentiellement impliqués dans la phase d’acquisition du conditionnement de Trace,

ainsi que la spécificité de leur implication dans ce type de conditionnement par rapport à un

conditionnement de Délai.

6) Hippocampe et conditionnement de Trace.

a) L’hippocampe acteur majeur du conditionnement de Trace.

Plusieurs études montrent qu’une lésion de l’hippocampe empêche la mise en place

d’un conditionnement de Trace. Ceci est observable aussi bien lors d’un conditionnement de

la membrane nictitante utilisant un intervalle de trace court chez le lapin (Solomon et coll.,

1986; Moyer et coll., 1990), le rat (Weiss et coll., 1999) ou la souris (Tseng et coll., 2004),

que lors d’un conditionnement de peur utilisant un intervalle de Trace plus long (McEchron et

coll., 2000; Fendt et coll., 2005; Burman et coll., 2006; Trivedi et Coover, 2006). Ces effets

de lésions sont à opposer à l’absence d’effet de lésions similaires sur les réponses

conditionnées manifestées après un conditionnement en protocole de Délai. Cependant, lors

de lésions effectuées avant le conditionnement, il n’est pas possible d’attribuer le déficit

observé spécifiquement à la phase d’acquisition, puisqu’il pourrait aussi bien concerner la

consolidation ou le rappel de cette association. Effectivement, plusieurs études ont montré que


73

les réponses de peur acquises en condition de Trace pouvaient être également perturbées par

des lésions hippocampiques effectuées après la phase d’acquisition du conditionnement

(Quinn et coll., 2002; Chowdhury et coll., 2005), ce qui indique un rôle potentiel dans la

consolidation, le stockage ou le rappel.

Ce résultat illustre une des limites de l’approche lésionnelle mise en œuvre dans de

nombreuses études. Parmi ces difficultés, il faut noter le risque de processus compensatoires,

de dommages induits indirectement sur d’autres structures ou sur les fibres de passage, et les

effets éventuels d’une modification du niveau général d’activité sur la performance

(Anagnostaras et coll., 2001; Burman et coll., 2006). Une grande part de ces difficultés peut

être contournée par l’emploi de manipulations pharmacologiques locales et réversibles.

Un autre aspect de la dépendance hippocampique du conditionnement de Trace est le

fait que les facteurs temporels semblent jouer un rôle prépondérant, indépendamment du rôle

attribué à la contiguïté (Bangasser et coll., 2006). En effet, dans l’étude pharmacologique de

(Misane et coll., 2005), seules les réponses acquises avec un intervalle de trace supérieur à

15 s étaient affectées, mais pas les réponses acquises avec des intervalles de 1 s ou 3 s, cette

durée dépassant largement les possibilités de conditionnement de Trace de la membrane

nictitante. Des résultats analogues ont été obtenus par une approche lésionnelle (Chowdhury

et coll., 2005), alors que certains résultats obtenus par des manipulations génétiques affectant

le fonctionnement hippocampique chez la souris montrent des déficits avec des intervalles de

Trace très courts (Crestani et coll., 2002; Kinney et coll., 2002).

b) Hypothèses fonctionnelles.

Plusieurs processus cognitifs distincts ont été proposés afin de rendre compte du rôle de

l’hippocampe lors de l’acquisition d’un conditionnement de Trace. Il a ainsi été suggéré que

le contexte pourrait avoir un rôle critique en servant de stimulus de médiation durant ce type

de conditionnement (Quinn et coll., 2005). Ainsi le traitement hippocampique pourrait

contribuer au conditionnement de Trace grâce à son rôle dans la mise en place de la

représentation contextuelle (Rudy et coll., 2004). Dans cette hypothèse la médiation

contextuelle pourrait se traduire de diverses façons, le SC pourrait par exemple être associé au

SI par association de second ordre ou alors le SC élémentaire pourrait être intégré de façon


74

configurale à la représentation contextuelle. Dans les deux cas, le conditionnement de Trace

ne pourrait être mis en place en l’absence de conditionnement contextuel. La compréhension

de la relation entre le conditionnement de Trace et le conditionnement au contexte pourrait

ainsi constituer un indice fondamental dans la compréhension du mécanisme permettant de

compenser l’absence de contiguïté lors du conditionnement de Trace (Marchand et coll.,

2004).

II- Approche expérimentale.

La première partie de ce chapitre vise à comparer directement la sensibilité du

conditionnement de Trace et du conditionnement contextuel, obtenus dans les conditions

décrites au chapitre 1, à des lésions totales de l’hippocampe pratiquées avant la phase de

conditionnement.

De plus, il existe relativement peu de travaux concernant des manipulations

pharmacologiques réversibles de l’hippocampe durant le conditionnement de Trace. Ainsi,

dans une seconde expérience, nous avons effectué des inactivations réversibles par injection

de l’agoniste GABAA muscimol dans la partie dorsale ou ventrale de l’hippocampe avant la

phase de conditionnement, dans le but de déterminer s’il était possible de dissocier le rôle

respectif de ces deux sous-régions lors de l’acquisition du conditionnement de Trace.

Ces expériences visaient tout particulièrement à tenter de mieux cerner la relation

existant entre conditionnement au contexte et conditionnement de Trace. Nous avons donc

étudié si les manipulations hippocampiques produisant un déficit de réponse de peur

conditionnée au contexte induisaient aussi un déficit de réponse au son conditionné en Trace,

lorsque ces réponses sont évaluées avec la même mesure comportementale.

CHAPITRE II : EXPERIENCE 1

75

Expérience 1:

Lésion totale de l’hippocampe.

Cette expérience compare la sensibilité respective du conditionnement au son et du

conditionnement au contexte à des lésions excitotoxiques de l’intégralité de l’hippocampe

effectuées avant le conditionnement. Compte tenu des données actuelles de la littérature, on

peut s’attendre à ce que ces lésions perturbent le conditionnement au son en Trace ainsi que le

conditionnement au contexte, sans avoir d’effet sur le conditionnement au son effectué en

Délai.



L’expérience a été réalisée sur 42 rats mâles de la souche Long-Evans, dans les mêmes

conditions que dans la dernière expérience du chapitre précédent.

2) Chirurgie.

Les lésions excitotoxiques bilatérales de l’hippocampe sont effectuées en suivant la

procédure décrite par Coutureau et coll. (1999), adaptée de Jarrard (1989). Préalablement à

l’opération, les rats reçoivent une pré-médication à base du relaxant musculaire à effet

analgésique Xylazine (Rompun® 13 mg/kg i.p.) et de l’anxiolytique à propriété amnésiante

Diazépam (Valium® 3 mg/kg i.p.) puis sont anesthésiés par injection de Kétamine (Virbac®,

100 mg/kg i.m.). Les opérations pouvant durer plus de 2h par animal, une seconde injection

de Kétamine pouvait être administrée au moindre signe de réveil (pouvant avoir lieu au

minimum 1 h après la première injection).

Le crâne du rat est alors tondu et sa tête est immobilisée sur le cadre stéréotaxique

(Kopf). La peau du crâne est ensuite désinfectée, anesthésiée par nébulisation de lidocaïne


76

(xylocaïne®) puis incisée longitudinalement. L’os est mis à nu ce qui permet de relever les

coordonnées du Bregma et du Lambda et ainsi de vérifier la bonne horizontalité de la tête de

l’animal. Une fenêtre d’environ 5 mm de côté est ouverte bilatéralement dans le crâne au

moyen d’une fraise dentaire. Les micro-injections de N-Methyl-D-Aspartate (NMDA

20 µg/µl, Sigma-Aldrich) sont pratiquées au moyen d’une micro-pipette en verre

d’environ 100 µm de diamètre fixée à l’extrémité d’une seringue Hamilton. L’ensemble est

monté sur un micro-descendeur fixé sur le bras du cadre stéréotaxique. Les coordonnées des

sites d’injections sont calculées conformément au tableau II-1, la coordonnée 0 dorso-ventrale

étant prise directement sur la dure-mère à -4.8 postérieur au Bregma et + 4.1 latéral au

Bregma. Les coordonnées 0 en antéropostérieur et latéral sont les coordonnées du Bregma

prises sur le crâne de l’animal.

AP ML DV VOLUME (µl) Durée (min)

-6,1= 0,10 (2min)-5,3= 0,10 (2min) -5,4= ±5,0= -4,5= 0,10 (5min)

-5,4= ±4,2= -3,9= 0,10 (5min)-4,7= ±4,5= -6,5= 0,05 (5min)

-7,2= 0,10 (2min)-4,7= ±4,0= -3,5= 0,05 (2min)

-3,9= ±3,5= -2,7= 0,10 (5min)-3,0= 0,10 (2min)-3,9= ±2,2= -1,8= 0,10 (5min)

-3,1= ±3,0= -2,7= 0,10 (5min)-3,0= 0,10 (2min)-3,1= ±1,4= -2,1= 0,10 (5min)

-2,4= ±1,0= -3,0= 0,05 (5min)

La micro-pipette est descendue en chaque point d’injection et la dose de NMDA

correspondante à ce point est injectée en 30 s environ. La pipette est laissée en place entre 2 et

5 minutes en fonction du site afin de permettre au produit de diffuser et d’éviter la remontée

Tableau II-1 : Localisation de l’ensemble des sites d’injections et volumes de NMDA injectés en chaque site. La durée durant laquelle la micro-pipette est laissée en place après injection est notée entre parenthèses. AP : Antéro-Postérieur ; ML : Médio-Latéral ; DV : Dorso-Ventral.


77

de celui-ci lors du retrait de la pipette. La peau du crâne est finalement suturée et traitée à la

chlorhexidine (exoseptoplix®).

Chez les animaux témoins pseudo-lésés (PSEUDO), les fenêtres sont pratiquées dans

le crâne et la dure-mère est percée en plusieurs endroits, mais aucune injection n’est pratiquée

afin d’éviter une lésion mécanique pouvant être induite par la descente de la micropipette et

l’injection du véhicule.

Après l’opération, l’animal est replacé dans sa cage d’élevage dans une salle de réveil

chauffée pour éviter l’hypothermie. Après une nuit passée en salle de réveil, les animaux sont

ramenés dans l’animalerie, puis il leur est laissé au moins une semaine de récupération durant

laquelle leur état de santé est régulièrement contrôlé.

3) Procédure comportementale.

L’ensemble des rats reçoit une période d’acclimatation d’au moins une semaine à

l’animalerie avant l’intervention chirurgicale. Une semaine au moins et pas plus de 2

semaines après avoir effectué la lésion, les animaux sont manipulés et pesés durant 3 jours

consécutifs. La procédure comportementale se déroule ensuite sur 3 jours consécutifs.

Le protocole de conditionnement et les phases de test sont détaillés sur la figure II-3.

Le premier jour, les animaux sont conditionnés conformément aux protocoles de Délai et

Trace 30 s définis à la dernière expérience du chapitre 1. Les animaux conditionnés en Délai

(D) reçoivent le son (Tone, 10 s) durant les 10 s précédant immédiatement la survenue du

choc alors que pour les animaux du groupe Trace 30 s (T30) le son se termine 30 s avant

l’apparition du choc.

Les phases de test sont identiques à celles décrites dans l’expérience 3 du chapitre 1,

excepté que le test au son a une durée totale de 20 minutes et consiste en 3 présentations à

intervalles fixes de 5 minutes du son utilisé lors de la phase de conditionnement.

.


78

4) Histologie.

Une semaine après le dernier test, les animaux sont anesthésiés par injection intra-

péritonéale de Pentobarbital sodique (Ceva, Santé Animale) 1 ml/300 g, puis perfusés avec 60

ml de NaCl (0,9%) suivis de 120 ml d’une solution de Formaldéhyde (10%) à l’aide d’une

pompe à perfusion intra-cardiaque. Une fois prélevés, les cerveaux sont laissés au moins 48

heures dans une solution de formaldéhyde (10%) et saccharose (30%) en agitation lente. Les

cerveaux sont alors coupés en sections de 50 μm d’épaisseur sur un microtome à congélation

et montés sur lames gélatinées. La coloration est effectuée en 3 étapes successives : une

délipidation, suivie d’une étape de coloration par marqueur des corps cellulaires, la thionine,

et enfin une déshydratation. Finalement, les coupes sont incluses dans de la résine (Eukitt ®)

et montées sous lamelle pour examen au microscope

Figure II-3 : Déroulement temporel du protocole expérimental. Ce protocole sera conservé dans l’ensemble des expériences ultérieures.


79

5) Analyse Statistique.

Le traitement des données est le même que celui décrit dans l’expérience 3 du chapitre

1, excepté que la RC post-son n’est mesurée que pendant les 30 s suivant le son, qui

correspondent chez les rats T30 à l’intervalle de Trace. Une analyse de variance (ANOVA) à

deux facteurs est utilisée pour traiter l’ensemble de ces données, avec pour facteurs le

protocole de conditionnement utilisé (D ou T30) ainsi que le traitement effectué (PSEUDO ou

HPC).

II- Résultats.

1) Etendue des lésions.

Après vérification histologique, 18 animaux présentant des lésions s’étendant

largement sur l’hippocampe dorsal et ventral ont été retenus pour l’analyse. Deux rats du

groupe PSEUDO-TRA ont été exclus car ils présentaient une RC non spécifique (plus de 50%

de RC durant le test de réponse au contexte modifié). Finalement, les effectifs respectifs de

chaque groupe étaient donc les suivants : HPC-DEL (n=8), HPC-TRA (n=8), PSEUDO-DEL

(n=11) and PSEUDO-TRA (n=9).

L’étendue maximale et minimale des lésions est schématisée sur la figure II-4. Les

animaux lésés retenus présentaient de larges lésions bilatérales de l’ensemble des champs

ammoniques, du gyrus denté, ainsi que du subiculum dorsal, avec une importante perte

cellulaire aussi bien dans la partie dorsale que dans la partie ventrale de l’hippocampe, bien

que la partie la plus ventrale du gyrus soit souvent épargnée. Chez quelques sujets, une partie

latérale de CA1 ou de l’hippocampe dorsal pouvait être préservée.

2) Acquisition.

La figure II-5A montre la réponse de peur manifestée par les rats durant la minute

faisant suite à chaque choc, en fonction du protocole de conditionnement et de la lésion. Lors


80

de la séance de conditionnement, l’ensemble des rats témoins pseudo-lésés présente des

niveaux de RC importants. Les animaux lésés ne manifestent environ que les deux tiers du

niveau de RC des animaux pseudo-lésés.

L’ANOVA en mesures répétées avec lésion et protocole en tant que facteurs de

comparaison entre sujets ne détecte pas d’effet du protocole (F(1,32)=0,010, p>0,1) mais met en

évidence que la lésion atténue de manière significative la RC des animaux après les chocs

(F(1,32)=12,54, p<0,005), indépendamment du protocole de conditionnement, Trace ou Délai

Figure II-4 : Lésions hippocampiques. A : Photomicrographies de tranches de cerveau d’un rat contrôle (PSEUDO, à gauche) et d’un rat ayant une lésion représentative de l’hippocampe (HPC, à droite). Partie du haut : section coronale au niveau du Bregma -2,8 mm avec en dessous une vue agrandie de l’hippocampe dorsal. Partie du Bas : section coronale au niveau du Bregma -5,8 mm avec en dessous une vue agrandie de l’hippocampe ventral. La coloration à la thionine confirme que les injections multiples de NMDA induisent une perte cellulaire massive dans la presque totalité de l’hippocampe. B : Représentation schématique de l’étendue des lésions hippocampiques chez le rat présentant la lésion la plus étendue (gris foncé) et le rat présentant la lésion la moins étendue (noir). Diagrammes adaptés de Paxinos et Watson (1998), avec les distances au Bregma indiquées en millimètres.

PSEUDO HPC


81

(interaction (F(1,32)=0,25, p>0,1). De plus, la répétition des essais induit une augmentation

significative de la RC (F(4,128)=60,91, p<0,0001), qui ne dépend pas du protocole de

conditionnement (F(4,128)=0,17, p>0,1), mais qui est significativement altérée par la lésion

(interaction : F(4,128)=3,53, p<0,01).

3) RC au contexte.

La RC des animaux lésés et pseudo-lésés durant le test de peur associée au contexte

est présentée sur la figure II-5B. Alors que les rats pseudo-lésés présentent un niveau de RC

moyen aussi bien pour le groupe Délai que pour le groupe Trace, la RC au contexte est

quasiment absente chez les animaux ayant reçu des lésions de l’hippocampe.

L’ANOVA confirme l’effet de la lésion observé (F(1,32)=8,62, p<0,01). Dans cette

expérience il n’y a pas d’effet significatif du protocole de conditionnement sur la RC

(F(1,32)=0,19, p>0,1) ni d’interaction entre le protocole et la lésion (F(1,32)=0,03, p>0,1).

4) RC au son.

La RC des animaux lésés et pseudo-lésés durant le test de peur associée au son est

présentée sur les figures II-6A et C. En présence du contexte modifié, les rats de l’ensemble

des groupes manifestent une très faible RC. Durant la présentation du son, une forte RC

apparaît chez les animaux pseudo-lésés, qui semble plus importante pour les animaux

0

20

40

60

80

100


D/PSEUDOD/HPCT30/PSEUDOT30/HPC

0

20

40

60

80

100

D T30

PSEUDO

HPC

A B

%R

C

0

20

40

60

80

100



0

20

40

60

80

100

D T30

PSEUDO

HPC

A B

0

20

40

60

80

100



0

20

40

60

80

100

D T30

PSEUDO

HPC

0

20

40

60

80

100



0

20

40

60

80

100

D T30

PSEUDO

HPC

A B

%R

C

Figure II-5 : Pourcentage de RC et erreur standard lors de l’expérience 1, en fonction du traitement et du protocole de conditionnement. A : Durant le conditionnement. Evolution au cours des essais de la RC au cours de la minute suivant la fin du choc en fonction du protocole. B : Durant le test au contexte (moyenne des 5 minutes de test).


82

conditionnés avec un protocole de Délai que pour ceux conditionnés avec un protocole de

Trace. Les animaux ayant reçu des lésions de l’hippocampe présentent une réponse amoindrie

par rapport à leurs témoins, qu’ils soient conditionnés avec un protocole de Trace ou de Délai.

Ces constatations sont appuyées par l’ANOVA qui indique un effet significatif du

protocole de conditionnement (F(1,32)=9,18, p<0,005) ainsi que de la lésion (F(1,32)=12,43,

p<0,005), mais ne détecte pas d’interaction entre ces deux facteurs (F(1,32)=0,60, p>0,1).

5) RC durant l’intervalle de Trace.

La RC des animaux lésés et pseudo-lésés après la présentation du son au cours de ce

même test est présentée sur les figures II-6B et C. Les animaux témoins des groupes

D/PSEUDO et T30/PSEUDO présentent une forte RC durant les 30 s suivant la présentation

0

20

40

60

80

100

CX MOD PRE‐SC SC POST 10 POST 20 POST 30 POST 40 POST 50

D/PSEUDOT30/PSEUDOD/MUSCT30/MUSC

0

20

40

60

80

100

D T30

0

20

40

60

80

100

D T30

A B

C

%R

C%

RC

0

20

40

60

80

100



0

20

40

60

80

100

D T30

0

20

40

60

80

100

D T30

0

20

40

60

80

100



0

20

40

60

80

100

D T30

0

20

40

60

80

100

D T30

A B

C

%R

C%

RC

Figure II-6 : Pourcentage de RC et erreur standard lors du test au son de l’expérience 1. A : Moyenne des trois présentations du SC. B : Moyenne des 30 secondes faisant suite aux 3 présentations du SC. C : Durant les 5 minutes de test au contexte modifié (CX MOD) et cinétique de la RC lors de la présentation du son, moyennée sur trois essais. PRE-SC : Bloc de 10 s précédant le son ; SC : Présentation du son ; POST 10 à POST 50 : Blocs de 10 s suivant la fin du son.


83

du son. Cette réponse est d’un niveau comparable pour les deux groupes témoins. Cette

réponse est atténuée chez les animaux ayant reçu une lésion de l’hippocampe par rapport à

leurs témoins et cela pour les deux protocoles de conditionnement.

Ces constatations sont appuyées par l’ANOVA qui ne révèle pas d’effet significatif du

protocole de conditionnement (F(1,32)=0,48, p>0,1) mais confirme l’effet de la lésion

(F(1,32)=10,10, p<0,005) et son absence d’interaction avec le protocole de conditionnement

(F(1,32)=0,07, p>0,1). La lésion affecte donc la RC aussi bien pendant qu’après le son.

Ces expériences montrent que le conditionnement de Trace et le

conditionnement contextuel sont tous deux fortement réduits par des lésions totales

de l’hippocampe pratiquées avant la phase d’acquisition.

Il s’agit d’un déficit global de réponse conditionnée qui concerne également le

conditionnement au son en protocole de Délai.


84

Expérience 2:

Inactivation des sous-régions hippocampiques.

Les résultats de l’expérience précédente suggèrent que le conditionnement de Trace et

le conditionnement au contexte sont tous deux sensibles à un blocage du traitement de

l’information dans la formation hippocampique. Cependant, l’hippocampe ventral et

l’hippocampe dorsal pourraient contribuer de façon différentielle à ces processus (Burman et

al., 2006). L’expérience suivante avait pour but de clarifier et si possible de dissocier la

contribution des régions dorsale et ventrale lors de l’acquisition du conditionnement de Trace

et du conditionnement contextuel. De plus, afin d’exclure que l’effet des lésions observé

précédemment soit au moins en partie dû à une altération de l’expression de la RC lors du test

(Mcnish et al., 1997), nous avons pratiqué une approche par inactivation réversible. Pour cela,

un agoniste des récepteurs GABAA, le muscimol, a été injecté localement dans la région

dorsale ou ventrale de l’hippocampe préalablement au conditionnement.



L’expérience a été réalisée sur 104 rats mâles de la souche Long-Evans. Le dispositif

expérimental ainsi que les procédures de conditionnement, de test et de vérification

histologique sont identiques à ceux décrits dans l’expérience 1 de ce chapitre.

2) Chirurgie et injections de muscimol.

Des implantations bilatérales de guide-canules sont effectuées sous contrôle

stéréotaxique sur les rats préalablement anesthésiés. Pour les implantations dans l’hippocampe

dorsal, des guide-canules de 8 mm de long et de 0,23 mm de diamètre externe sont amenés

aux coordonnées stéréotaxiques suivantes: Antéropostérieur (AP) : -3.6; Latéral (L) : +/- 2.4;

Ventral (V) : -2.5. Pour l’implantation au niveau de l’hippocampe ventral, des guide-canules


85

de 12 mm de long sont utilisés. Les coordonnées d’implantation utilisées pour cette région

sont : AP : -5.2; L : +/- 5; V : -5.1. Une fois implantés, les guide-canules sont fixés par un

bloc de ciment dentaire (Palavit®G) lui-même maintenu par trois petites vis pénétrant le

crâne de l’animal. Un mandrin en fil métallique permet d’obturer le guide-canule et sera retiré

préalablement à l’injection. Durant les trois jours précédant l’injection et le conditionnement,

les animaux sont transportés par deux dans leur cage d’élevage jusqu’à la salle d’injection et

familiarisés avec la procédure de contention (les animaux sont enroulés dans un tissus ne

laissant dépasser que leur tête) ainsi qu’à la manipulation des guide-canules (nettoyage).

Le jour du conditionnement, les rats sont transportés jusqu’à la salle d’injection, les

mandrins sont retirés des guide-canules qui sont nettoyés à l’aide d’un tire-nerf dentaire fin.

L’injection est pratiquée à l’aide d’une canule d’injection de 0,19 mm de diamètre externe,

1 mm plus longue que le guide-canule, reliée via un cathéter à une seringue Hamilton placée

sur une pompe à micro-injection (Harvard Apparatus). Une fois le rat mis en contention, les

canules sont insérées bilatéralement dans les guide-canules et délivrent chacune une dose de

0,25 µg de muscimol (1mg/ml) en solution dans du liquide céphalorachidien artificiel (LCRa).

Cette dose a été préalablement déterminée sur la base d’expériences préliminaires et

correspond aux doses utilisées dans d’autres études (Maren et Holt, 2004). Les animaux

contrôles reçoivent le même volume de véhicule (LCRa). Après la fin de l’injection, les

canules sont laissées en place durant 165 s. Le muscimol, en induisant une activation des

récepteurs ionotropes à l’acide gamma-aminobutyrique (GABA), va induire une

hyperpolarisation se traduisant par une inhibition de l’activité neuronale dans l’intégralité de

la structure cible pendant au moins 2 h (Edeline et coll., 2002). Le conditionnement

commence 25 minutes après le début de l’injection. Les procédures de test et de contrôle

histologique sont identiques à celles décrites dans l’expérience précédente.


Le traitement des données est le même que celui décrit dans l’expérience 1 de ce

chapitre. Les données des six groupes de rats sont soumises à des ANOVA ayant pour facteur

de comparaison entre sujets le traitement (muscimol dans l’HPC ventral, muscimol dans

l’HPC dorsal ou LCRa) et le protocole de conditionnement (D ou T30). Les témoins (LCRa)


86

sont constitués des deux groupes d’animaux ayant reçu le véhicule soit dans l’HPC ventral

soit dans l’HPC dorsal.

II- Résultats.

1) Contrôles histologiques.

A la suite des contrôles histologiques, qui ont conduit à l’exclusion de 9 rats n’ayant

pas été convenablement injectés, un total de 92 animaux a été retenu pour les analyses.

Finalement, les effectifs étaient pour les groupes ayant reçu une injection ventrale D/MUSC

(n=9), D/LCRa (n=10), T/MUSC (n=15) et T/LCRa (n=16), et pour les groupes ayant reçu

une injection dorsale D/MUSC (n=11), D/LCRa (n=9), T/MUSC (n=12) et T/LCRa (n=10).

Les groupes témoins ayant reçu du LCRa au niveau des sites ventraux et dorsaux ne

présentaient pas de différence significative de RC et ont été regroupés dans un souci de

simplification. La localisation des sites d’injections chez les rats pris en compte est indiquée

sur la figure II-7. Pour l’ensemble des animaux inclus, les guide-canules ainsi que les canules

descendent verticalement à travers le cortex et aboutissent au sein de l’hippocampe dorsal ou

de l’hippocampe ventral, en position relativement médiane pour ce dernier. Les dommages

corticaux induits par la pose à demeure des guide-canules restent limités au voisinage de ces

derniers.

2) Acquisition.

La figure II-8A et B présente la réponse de peur manifestée par les rats après chaque

choc durant le conditionnement en fonction du traitement et du protocole de conditionnement.

Lors de la phase de conditionnement, une RC post-choc se développe normalement chez les

rats injectés avec le LCRa mais est atténuée pour les rats injectés avec le muscimol.

L’ANOVA effectuée sur ces données ne révèle pas d’effet significatif du protocole de

conditionnement (F(1,86)=2,39, p>0,05) et indique une tendance à l’effet du traitement

(F(2,86)=3,02, p=0,054), cette tendance étant indépendante du protocole de conditionnement

(F(2,86)=0,71, p>0,1).


87

3) RC au contexte.

La RC au contexte des animaux en fonction du traitement est présentée sur la

figure II-8C. Dans la situation de Délai, les rats manifestent très peu de RC au contexte et cela

même pour les animaux ayant reçu le véhicule. Dans la situation de Trace, un niveau moyen

de RC est observé chez les animaux contrôles. Les rats du groupe Trace ayant reçu les

injections de muscimol dans l’HPC ventral ou dorsal avant la phase de conditionnement ne

manifestent quasiment aucune RC au contexte.

L’ANOVA effectuée sur ces données ne révèle pas d’effet principal du protocole

(F(1,86)=1,60, p>0,05) mais un effet significatif du traitement (F(2,86)=4,85, p<0,05) qui

Figure II-7 : Sites des injections intra-hippocampiques. A,B : Photomicrographie d’une tranche de cerveau marquée à la thionine, à -2,8 mm (A) ou à -5,6 mm (B) du Bregma, montrant la trace du guide-canule ainsi que le site d’injection (flèche) au niveau de l’hippocampe dorsal (A) ou ventral (B) tel que schématisé sur le diagramme de droite. C,D : Localisation de l’ensemble des sites d’injection dans l’hippocampe dorsal (C) ou ventral (D). Cercles noirs : Sites d’injection du muscimol ; Cercles clairs : Sites d’injection du LCRa. Diagrammes adaptés de Paxinos et Watson (1998), avec les distances au Bregma indiquées en millimètres.


88

interagit avec le protocole (F(2,86)=4,95, p<0,01). L’ANOVA partielle effectuée pour chaque

protocole de conditionnement confirme que l’effet du traitement est significatif pour les

animaux conditionnés en Trace (F(2,50)=8,09, p<0,001) mais pas en Délai (F(2,50)=0,51,

p>0,05). La comparaison post-hoc des réponses au contexte des groupes d’animaux

conditionné en Trace (test de Student-Newman-Keuls) indique que les groupes ayant reçu du

muscimol dans l’hippocampe ventral ou dorsal diffèrent significativement du groupe témoin.

Figure II-8 : Pourcentage de RC et erreur standard en fonction du traitement et du protocole de conditionnement dans l’expérience 2. A,B : Durant le conditionnement. Evolution au cours des essais de la RC au cours de la minute suivant la fin du choc en fonction de l’intervalle de Trace A : pour les animaux conditionnés en Délai. B : Pour les animaux conditionnés en Trace 30 s. C : Durant le test au contexte (moyenne des 5 minutes de test). LCRa : Rats ayant reçu une injection de véhicule ; MUSC/DORSAL : Rats ayant reçu une injection de muscimol dans l’HPC dorsal ; MUSC/VENTRAL : Rats ayant reçu du muscimol dans l’HPC ventral.

0

20

40

60

80

100


D/LCRa

D/DORSAL

D/VENTRAL

0

20

40

60

80

100


T30/LCRaT30/DORSALT30/VENTRAL

0

20

40

60

80

100

D T30

LCRa

MUSC/DORSAL

MUSC/VENTRAL

A

B C0

20

40

60

80

100


D/LCRa

D/DORSAL

D/VENTRAL

0

20

40

60

80

100



0

20

40

60

80

100

D T30

LCRa

MUSC/DORSAL

MUSC/VENTRAL

0

20

40

60

80

100


D/LCRa

D/DORSAL

D/VENTRAL

0

20

40

60

80

100



0

20

40

60

80

100

D T30

LCRa

MUSC/DORSAL

MUSC/VENTRAL

A

B C

% RC

% RC


89

4) RC au son.

Les figures II-9A, C et D présentent la RC durant le test de peur associée au son des

animaux qui ont reçu du muscimol ou du véhicule lors du conditionnement. En présence du

contexte modifié, la réponse manifestée par les rats est très faible pour l’ensemble des

groupes. Durant la présentation du son, une forte RC apparaît chez les animaux témoins, plus

importante pour les animaux conditionnés avec un protocole de Délai que pour ceux

conditionnés avec un protocole de Trace. Chez les groupes conditionnés avec un protocole de

Trace, on peut voir que les inactivations des sous-régions hippocampiques induisent une

diminution de la RC lors de la présentation du son, alors que pour les groupes conditionnés en

Délai seule l’inactivation de la région ventrale semble avoir un tel effet.

Une ANOVA effectuée sur ces données confirme l’effet significatif du protocole de

conditionnement (F(1,86)=23,61, p<0,0001) ainsi que du traitement (F(2,86)=7,35, p<0,005) mais

ne détecte qu’une tendance à l’interaction entre ces deux facteurs (F(2,86)=2,51, p=0,086).

L’ANOVA partielle effectuée sur les deux groupes de conditionnement confirme que l’effet

du traitement est significatif pour les animaux conditionnés en Délai (F(2,36)=3,69, p<0,05)

ainsi qu’en Trace (F(2,50)=6,37, p<0,005). Les comparaisons post-hoc confirment un effet des

inactivations dorsales et ventrales pour les groupes conditionnés avec un protocole de Trace

alors que seule l’inactivation de l’hippocampe ventral induit un déficit chez les animaux

conditionnés avec le protocole de Délai.


La RC des animaux ayant reçu du muscimol et des animaux témoins durant les 30 s

suivant le SC est présentée sur les figures II-9B, C et D. Les animaux des groupes D/LCRa et

T30/LCRa présentent une forte RC durant les 30 s suivant la présentation du son. Cette

réponse est approximativement au même niveau pour les deux groupes témoins.

L’inactivation de l’HPC ventral ou dorsal semble induire une diminution de cette réponse

chez les animaux conditionnés en Trace mais ne semble avoir que peu d’effet chez les

animaux conditionnés avec un protocole de Délai. Les effets du muscimol sur la réponse après

le son sont donc comparables aux effets observés pendant la présentation du son lui-même.


90

Une ANOVA effectuée sur ces données ne révèle pas d’effet significatif du protocole

de conditionnement (F(1,86)=1,54, p>0,05) mais confirme l’effet du traitement (F(2,86)=5,90,

p<0,005) ainsi qu’une interaction entre ces deux facteurs (F(2,86)=3,12, p<0,05). L’ANOVA

partielle effectuée sur les deux groupes de conditionnement confirme que l’effet du traitement

est significatif pour les animaux conditionnés en Trace (F(2,50)=10,28, p<0,0005) mais pas en

Délai (F(2,36)=0,68,). Les comparaisons post-hoc confirment un effet des inactivations dorsales

et ventrales pour les groupes conditionnés avec un protocole de Trace.

0

20

40

60

80

100

D T30

LCRa

MUSC/DORSAL

MUSC/VENTRAL

* *

##

0

20

40

60

80

100

D T30

* *

0

20

40

60

80

100

D T30

LCRa

MUSC/DORSAL

MUSC/VENTRAL

* *

##

%R

C%

RC

0

20

40

60

80

100


D/aLCR

D/DORSAL

D/VENTRAL

0

20

40

60

80

100


T30/aLCRT30/DorsalT30/Ventral

%R

C

A B

C

D

0

20

40

60

80

100

D T30

LCRa

MUSC/DORSAL

MUSC/VENTRAL

* *

##

0

20

40

60

80

100

D T30

* *

0

20

40

60

80

100

D T30

LCRa

MUSC/DORSAL

MUSC/VENTRAL

* *

##

%R

C%

RC

0

20

40

60

80

100


D/aLCR

D/DORSAL

D/VENTRAL

0

20

40

60

80

100


T30/aLCRT30/DorsalT30/Ventral

%R

C

A B

C

D

Figure II-9 : Pourcentage de RC et erreur standard lors du test au son de l’expérience 2. A : moyenne des trois présentations de 10 s du SC. B : Moyenne des 30 secondes faisant suite aux 3 présentations du SC. C,D : Durant les 5 minutes de test au contexte modifié (CX MOD) et cinétique de la RC lors de la présentation du son, par blocs de 10 s, moyennée sur trois essais. C : pour les animaux conditionnés en Délai. D : Pour les animaux conditionnés en Trace 30 s. Mêmes conventions que pour la figure II-6.


91

Ces expériences montrent un effet différentiel des inactivations de

l’hippocampe ventral et de l’hippocampe dorsal durant la phase d’acquisition.

L’inactivation de l’hippocampe ventral induit un déficit global de l’ensemble

des RC indépendamment du protocole de conditionnement, déficit observable dès la

phase d’acquisition.

A l’inverse, l’inactivation de l’hippocampe dorsal n’induit de déficit que chez

les animaux conditionnés avec un protocole de Trace et uniquement lors des tests au

son ou au contexte.

CHAPITRE II : DISCUSSION

92

DISCUSSION

Les résultats de ces expériences montrent que des lésions de l’intégralité de

l’hippocampe effectuées avant la phase de conditionnement réduisent non seulement le

conditionnement de Trace mais aussi le conditionnement de Délai ainsi que le

conditionnement au contexte. L’inactivation de l’hippocampe ventral durant la phase de

conditionnement reproduit l’ensemble des effets de la lésion totale. Par contre, l’inactivation

de l’hippocampe dorsal par le muscimol perturbe sélectivement le conditionnement de Trace

et le conditionnement contextuel sans induire de déficit de conditionnement de Délai,

soulignant ainsi la spécificité du rôle de l’hippocampe dorsal au cours du conditionnement de

Trace.

Nous avons également observé que l’ensemble des manipulations hippocampiques

effectuées (lésion totale, inactivation au muscimol de l’hippocampe dorsal ou ventral)

induisaient aussi bien un déficit de réponse au son conditionné en trace qu’un déficit de

réponse au contexte, ce qui suggère l’existence d’une relation étroite entre les processus

neurobiologiques sous-tendant ces deux types d’apprentissages.

I- Aspects méthodologiques.

Nous sommes en droit de nous demander si les effets que nous observons ne

pourraient pas être attribués à une diffusion du muscimol vers d’autres aires cérébrales, telles

que les noyaux genouillés ou l’amygdale. Effectivement, une inactivation de l’amygdale

pourrait produire un effet similaire de diminution globale des conditionnements de peur

(Muller et coll., 1997). Cependant il nous semble improbable que le muscimol ait pu diffuser

jusqu’à cette région en raison de la distance (1-2 mm) ainsi que de l’existence de la barrière

physique constituée par les ventricules. De plus, avec des volumes d’injection similaires

certains auteurs ont pu observer des effets différentiels de l’inactivation de l’hippocampe

ventral et de l’amygdale (Maren et Holt, 2004). D’un autre côté, le site d’injection est proche


93

des noyaux genouillés, et il est difficile d’exclure l’idée que le déficit de conditionnement au

son provienne de la diffusion du muscimol dans cette région, sous réserve que cette diffusion

soit bilatérale (Romanski et LeDoux, 1992). Néanmoins, une telle explication ne serait pas

applicable à l’effet des lésions puisque les lésions hippocampiques que nous avons réalisées

ne semblent pas induire de dommages au niveau thalamique.

Nos injections étaient réalisées avant l’acquisition mais l’inactivation induite par le

muscimol pourrait persister durant plusieurs heures après la fin du conditionnement (Edeline

et coll., 2002). Ainsi, nous ne pouvons exclure qu’une partie des effets observés ici soit due a

une perturbation de la phase de consolidation du conditionnement. De fait, un rôle de

l’hippocampe dorsal dans les processus précoces de consolidation a été démontré par des

expériences où cette structure était inactivée par la tétrodotoxine jusqu’à 1 h 30 après la phase

de conditionnement (Sacchetti et coll., 2002). De plus, un déficit de réponse de peur à un son

conditionné en Trace a été observé quand les lésions de l’hippocampe dorsal et/ou ventral

étaient effectuées après le conditionnement (Quinn et coll., 2002; Chowdhury et coll., 2005;

Burman et coll., 2006; Trivedi et Coover, 2006; Yoon et Otto, 2007). Ainsi, au moins une

partie des effets de nos lésions et inactivations pourrait reposer sur une perturbation des

processus de consolidation. Cependant, nous pensons que les effets que nous observons sont

plus probablement liés à une perturbation des processus mis en jeu durant la phase

d’acquisition. Il a en effet été rapporté qu’une réponse de peur conditionnée associée au

contexte était affectée par une injection de muscimol dans l’hippocampe dorsal préalablement

au conditionnement, mais non quand cette injection était effectuée après ce conditionnement

(Matus-Amat et coll., 2004).

II- L’inactivation de l’hippocampe ventral reproduit les effets de la lésion

totale.

1) Dépendance hippocampique de notre conditionnement de Trace.

Les lésions totales de l’hippocampe que nous avons effectuées avant la phase de

conditionnement induisent un déficit général de l’ensemble des réponses de peur


94

conditionnée. La lésion réduit aussi bien la réponse post-choc observée durant le

conditionnement que la réponse au son mesurée 48 h plus tard ainsi que la réponse au

contexte. Ces données sont cohérentes avec l’idée actuellement admise que l’hippocampe est

impliqué dans le conditionnement contextuel (Hirsh, 1974; Nadel et Willner, 1980; Kim et

Fanselow, 1992; Phillips et LeDoux, 1994; Maren et coll., 1997; Frohardt et coll., 1999;

Fanselow, 2000; Desmedt et coll., 2003) et confirme le fait que des lésions préalables au

conditionnement induisent un déficit dans ce type de conditionnement.

Il est intéressant de remarquer que dans notre situation expérimentale, l’effet des

lésions sur le conditionnement au son ne dépend pas du protocole de conditionnement. Ainsi

les lésions hippocampiques n’affectent pas seulement le conditionnement de Trace mais

produisent aussi un important déficit de réponse chez les animaux conditionnés avec un

protocole de Délai. Cet effet sur le conditionnement de Délai est assez inattendu. En effet, il a

été montré que des lésions comparables affectaient sélectivement le conditionnement de Trace

de la membrane nictitante (Solomon et coll., 1986; Weiss et coll., 1999) et le conditionnement

de peur en condition de Trace (Bangasser et coll., 2006; Burman et coll., 2006; Trivedi et

Coover, 2006). En situation de Délai on considère que le conditionnement de peur à un SC

élémentaire ne nécessite pas un hippocampe fonctionnel (Solomon et coll., 1986; Selden et

coll., 1991; Phillips et LeDoux, 1992; McEchron et coll., 1998). Toutefois, cette idée est

largement basée sur des études reposant sur des lésions de l’hippocampe dorsal uniquement

(Kim et Fanselow, 1992; Phillips et LeDoux, 1992, 1994; Winocur, 1997; Anagnostaras et

coll., 1999; Quinn et coll., 2002; Chowdhury et coll., 2005; Burman et coll., 2006). A

l’inverse, d’autres études employant des lésions totales ou ventrales de l’hippocampe

aboutissent à des résultats plus mitigés. Ainsi certains auteurs observent un effet sur le

conditionnement de délai (Maren, 1999; Richmond et coll., 1999) mais d’autres non (Selden

et coll., 1991; McEchron et coll., 1998; Frohardt et coll., 2000; Desmedt et coll., 2003;

Bangasser et coll., 2006).

Le déficit généralisé des réponses de peur conditionnée induit par nos lésions

hippocampiques peut suggérer l’existence d’un déficit d’expression de la réponse plutôt que

d’une perturbation du processus d’acquisition mnésique (Good et Honey, 1997; McNish et

coll., 1997; Richmond et coll., 1999). En effet, les lésions hippocampiques sont connues pour

induire par exemple une hyperactivité post-lésionnelle. Ce point a été discuté en détail par


95

(Maren et coll., 1998) à propos du conditionnement de peur eu contexte. Ces auteurs

concluent que l’hyperactivité induite par la lésion n’explique pas le niveau du déficit de RC

observé, et suggèrent qu’au contraire l’hyperactivité pourrait résulter d’un déficit d’encodage

et d’habituation au contexte.

Une autre explication possible pourrait tenir au fait que les lésions excitotoxiques que

nous employons induisent une perte cellulaire importante au niveau de l’hippocampe dorsal

mais aussi ventral. Ainsi, le blocage de l’activité de l’hippocampe ventral pourrait avoir un

rôle prépondérant dans le déficit de réponse que nous observons chez les animaux

conditionnés en Délai. Un nombre croissant d’études montrent effectivement que le

conditionnement de peur à un stimulus auditif peut être affecté par des lésions électrolytiques

(Maren et Holt, 2004; Trivedi et Coover, 2004; Burman et coll., 2006) ou neurotoxiques

concernant la partie ventrale de l’hippocampe (Maren, 1999; Richmond et coll., 1999; Rogers

et coll., 2006; Hunsaker et Kesner, 2008; Sutherland et coll., 2008). Dans le cas du

conditionnement de Trace, il semblerait que l’étendue des dommages au niveau de l’HPCv

après lésion puisse affecter le degré de déficit observé (Moyer et coll., 1990; Kim et coll.,

1995; Tseng et coll., 2004; Burman et coll., 2006).

2) Réplication de l’effet de la lésion totale par l’inactivation ventrale.

Dans le but d’exclure un effet indirect, tel qu’un déficit de performance induit par les

lésions, nous avons effectué dans la deuxième expérience de ce chapitre des inactivations

réversibles de l’hippocampe durant la phase de conditionnement. De plus, l’utilisation de

micro-injections locales de muscimol nous a permis d’évaluer l’implication respective de

l’hippocampe ventral et dorsal lors de cette phase. A notre connaissance, l’effet d’une

inactivation de la partie ventrale de l’hippocampe durant la phase d’acquisition d’un

conditionnement de Trace n’a jamais été décrit. Nous avons pu ainsi observer que

l’inactivation de cette aire reproduit l’ensemble des effets de la lésion totale en affectant non

seulement le conditionnement de peur associée au contexte (Rudy et Matus-Amat, 2005),

mais aussi le conditionnement au son (Maren et Holt, 2004). Les effets observés ne peuvent

pas être attribués à un déficit de performance puisque les animaux sont testés 48 h après

l’inactivation. Ces résultats montrent donc que le traitement effectué par l’hippocampe ventral

semble nécessaire lors de l’acquisition de la réponse conditionnée à un stimulus élémentaire


96

tel que le son que nous utilisons. Toutefois, ce traitement ne semble pas spécifique au

conditionnement de Trace puisque le déficit est également présent chez les animaux

conditionnés en condition de Délai. De même, le déficit de conditionnement contextuel ne

signifie pas nécessairement que cette aire soit directement impliquée dans des processus

d’encodage du contexte ou même dans des processus associatifs ou mnésiques.

Il semblerait en effet que l’hippocampe ventral, contrairement à l’hippocampe dorsal,

joue un rôle dans les comportements liés à l’anxiété via une interaction avec des régions

impliquées dans le contrôle des systèmes endocrine, défensif, social et émotionnel (Moser et

Moser, 1998; Bannerman et coll., 2004). De plus, des lésions de l’hippocampe ventral

induisent des déficits dans des tests d’anxiété non conditionnée basés sur des propriétés

éthologiques et ne semblant donc pas dépendre de processus mnésiques. Ainsi, ces lésions

n’altèrent pas seulement la réponse de peur conditionnée mais aussi des réponses de peur non

conditionnée telle que celle induite par le contact avec un prédateur (Pentkowski et coll.,

2006). On observe également une réduction de l’hyponéophagie se manifestant par une prise

alimentaire plus rapide dans un contexte potentiellement anxiogène, une augmentation des

interactions sociales, ainsi qu’une diminution de la latence pour passer du compartiment noir

au compartiment blanc dans le test de la boîte à compartiments clair/obscur (Bannerman et

coll., 2003; McHugh et coll., 2004). Ces données suggèrent que l’hippocampe ventral pourrait

jouer un rôle important dans l’expression des comportements reliés à l’anxiété (Richmond et

coll., 1999; Bannerman et coll., 2004; Degroot et Treit, 2004; McHugh et coll., 2004). Il est à

noter qu’une partie de ces effets ne concordent pas avec une lésion de l’amygdale mais sont

cohérents avec les effets observés après lésion totale de l’hippocampe (Deacon et coll., 2002;

Deacon et Rawlins, 2005). De ce fait, des lésions totales ou ventrales de l’hippocampe

semblent pouvoir avoir un effet anxiolytique. Cette réduction globale des réponses de peur

induite par les lésions de l’HPCv pourrait être mise sur le compte de la forte interconnectivité

existant entre cette région et les différents noyaux amygdalien ainsi que l’hypothalamus

rostral comparativement à celle relativement faible existant entre ces régions et l’HPCd. On

peut donc raisonnablement penser que, de même, l’inactivation de l’hippocampe ventral

pourrait avoir des effets anxiolytiques durant le conditionnement (Bannerman et coll., 2003).

Le fait que l’inactivation ventrale aussi bien que la lésion totale réduise de façon significative

la réponse post-choc des animaux semble compatible avec cette interprétation. Si les animaux


97

expriment moins de peur durant la séance de conditionnement, ceci peut directement influer

sur la manifestation ultérieure de la réponse de peur conditionnée (Harris et Westbrook,

1999). Ainsi une partie au moins des effets induits par l’inactivation de l’hippocampe ventral

pourrait être liée à une anxiolyse durant la phase de conditionnement.

III- Contribution de l’hippocampe dorsal au conditionnement de peur

associée au contexte et de Trace.

Nous avons montré au cours de ces travaux que l’inactivation de l’hippocampe dorsal

par le muscimol durant la phase d’acquisition induit un déficit sélectif du conditionnement de

Trace avec un intervalle de 30 s sans affecter le conditionnement de Délai. Ce résultat vient

appuyer de précédentes études montrant que des lésions limitées à l’hippocampe dorsal

effectuées préalablement à la phase de conditionnement affectent sélectivement la réponse de

peur conditionnée en Trace, qu’elle soit mesurée par la réponse cardiaque (McEchron et coll.,

2000) ou par la potentialisation du sursaut (Fendt et coll., 2005; Burman et coll., 2006;

Trivedi et Coover, 2006). De plus le conditionnement de peur effectué en Trace apparaît

sensible au blocage des récepteurs NMDA de l’hippocampe dorsal préalablement au

conditionnement (Misane et coll., 2005; Quinn et coll., 2005), un effet qui n’apparaît que lors

de l’utilisation d’intervalles de Trace longs (Misane et coll., 2005). Un tel effet sélectif

suggère que le traitement affecte les aspects temporels du conditionnement plutôt que ses

aspects émotionnels.

Outre ses effets sur le conditionnement de Trace, l’inactivation de l’hippocampe dorsal

abolit le conditionnement contextuel. Le niveau de réponse contextuelle des animaux

conditionnés en Délai est très faible en raison du masquage, mais un effet significatif des

lésions peut être observé chez les animaux conditionnés en Trace. Les théories actuelles

suggèrent que c’est en grande partie au sein de l’hippocampe que s’établirait la représentation

unifiée du contexte et que c’est cette représentation unifiée qui pourrait être associée par la

suite avec le SI (Rudy et O'Reilly, 1999; Fanselow, 2000). L’acquisition et la consolidation

d’une représentation conjonctive du contexte semble bien nécessiter l’intégrité de

l’hippocampe dorsal (Selden et coll., 1991; Phillips et LeDoux, 1994; Good et Honey, 1997;


98

Anagnostaras et coll., 2001; Rudy et coll., 2004). De plus de nombreuses amnésies

antérogrades de conditionnement de peur associée au contexte ont été rapporté après injection

dans cette région de divers agents pharmacologiques tel que la scopolamine (Rogers et

Kesner, 2004) ou des antagonistes des récepteurs NMDA (Young et coll., 1994; Stiedl et coll.,

2000; Bast et coll., 2003), même si les études antérieures n’avaient pas montré d’effet d’une

injection de muscimol dans l’hippocampe dorsal sur le conditionnement de peur associée au

contexte (Maren et Holt, 2004; Matus-Amat et coll., 2004).

IV- Relation entre conditionnement de trace et conditionnement contextuel.

Le protocole de conditionnement que nous avons mis au point met en évidence la

sensibilité du conditionnement au contexte à de nombreuses manipulations. L’étude du rôle

du contexte lors du conditionnement de Trace est d’une importance capitale pour la

compréhension des mécanismes sous-tendant ce dernier puisque de nombreuses analogies ont

été relevées entre les deux types d’apprentissage (Quinn et coll., 2002; Marchand et coll.,

2004). Il n’était donc pas surprenant que la perturbation d’une structure fortement impliquée

dans le conditionnement contextuel induise un important déficit lors d’un conditionnement de

Trace. Plusieurs hypothèses fonctionnelles ont été proposées afin de rendre compte de ces

analogies. Il a ainsi été suggéré que le conditionnement de Trace pourrait reposer sur un

conditionnement de second ordre avec le contexte qui est présent durant l’intervalle de Trace

(Quinn et coll., 2005). Une alternative serait que l’hippocampe participe au processus

permettant de combler l’espace entre le SC et le SI en permettant un maintien de la

représentation du SC jusqu’à la survenue du SI (Kehoe et coll., 1993; Buhusi et Schmajuk,

1999; Levy et coll., 2005). Dans ce cas, le conditionnement de trace ne nécessiterait pas le

conditionnement à un autre stimulus que le SC et il devrait donc être possible de dissocier le

conditionnement de Trace du conditionnement contextuel.

Nos résultats ne permettent cependant pas de mettre en évidence une telle dissociation,

si l’on excepte l’existence d’une réponse de peur résiduelle dans des situations où la réponse

de peur associée au contexte a été totalement abolie par nos manipulations. Ainsi

l’impossibilité de l’animal à se conditionner au contexte ne semble pas totalement empêcher

ce dernier de se conditionner à un stimulus présenté en Trace. Il est généralement observé lors


99

de manipulations touchant l’hippocampe qu’un déficit de réponse au contexte accompagne les

déficits de conditionnement de Trace (p. ex. Misane et coll., 2005). Néanmoins, quelques

travaux semblent montrer la possibilité d’observer un déficit de réponse en conditionnement

de Trace sans déficit de peur contextuelle (Quinn et coll., 2005). On peut donc envisager que

l’hippocampe dorsal puisse jouer un rôle dans le conditionnement de trace indépendamment

du conditionnement contextuel en permettant un maintien de la Trace du SC.

V- L’hippocampe comme support de la « Trace ».

Nos observations sont ainsi compatibles avec l’idée que, lors de la phase d’acquisition

du conditionnement de Trace, l’hippocampe dorsal pourrait permettre l’association

d’événements temporellement discontigus par le maintien d’une "Trace" sous la forme d’une

activité neuronale persistante induite par la présentation du SC, indépendamment du contexte.

Cette Trace serait toujours active au moment ou surviendrait le SI et pourrait ainsi constituer

le véritable support de l’association SC/SI (Kehoe et coll., 1993; Buhusi et Schmajuk, 1999).

De telles activités présentes après la présentation du stimulus ont été rapportées lors de tâches

de mémoire de travail (Sakurai, 1990; Deadwyler et Hampson, 2004). Dans le cas d’un

conditionnement de trace proprement dit, certaines données électrophysiologiques permettent

de préciser ce point. McEchron et collaborateurs (2003) ont étudié les réponses neuronales en

CA1 lors d’un protocole de trace en peur conditionnée chez le lapin. Ces auteurs montrent que

lors de la présentation du SC seul en test, une certaine proportion des neurones (12 à 18 %)

ont une décharge maximale qui coïncide avec l’instant où devrait apparaître le SI (choc

électrique), soit 10 s ou 20 s après le SC selon les groupes (McEchron et coll., 2003). Par

ailleurs, cette équipe a comparé chez le rat conditionné avec un intervalle de trace de 20 s les

patrons de décharge de neurones de CA1 et du Gyrus Denté (GD) (Gilmartin et McEchron,

2005a). Ils observent une décharge associée au SC dans le GD qui est stabilisée par le

protocole de conditionnement. A l’inverse, dans CA1, la réponse excitatrice au SC se

transforme graduellement en inhibition. Toutefois, les auteurs n’observent pas d’activité

spécifique dans ces sous-régions au cours de l’intervalle de trace. Ainsi, contrairement à des

neurones enregistrés dans le cortex préfrontal (Gilmartin et McEchron, 2005b), les neurones

hippocampiques ne semblent pas en mesure de décharger de manière continue tout au long de


100

l’intervalle de trace. De plus, le pic de réponse des neurones de CA1 observé chez le lapin au

moment attendu du choc n’était pas retrouvé lors de cette étude chez le rat.

De même, une étude en imagerie fonctionnelle chez le sujet humain (Knight et coll.,

2004), montre une absence d’activation spécifique de l’hippocampe durant l’intervalle de

trace. Ces résultats ne vont pas dans le sens d’un maintien d’une activité par l’hippocampe

après la présentation du SC. Toutefois, ces données n’excluent pas la possibilité que l’activité

pendant l’intervalle de trace ne représente pas directement le SC. En outre, les

enregistrements électrophysiologiques réalisés jusqu’ici ne concernaient pas la région CA3 de

l’hippocampe qui pourrait être plus particulièrement concernée. Cette sous-région a été

notamment impliquée dans des tâches de mémoire spatiale dans des environnements

nouveaux avec des délais de quelques secondes à quelques minutes (Lee et Kesner, 2003).

Selon l’hypothèse proposée par Rodriguez et Levy (2001), la région CA3 de

l’hippocampe pourrait permettre de combler l’intervalle de trace du fait de son importante

connectivité récurrente. Rodriguez et Levy (2001) proposent que le temps qui s’écoule après

la présentation du SC soit codé sous la forme de patrons d’activité évolutifs. Les patrons

d’activité évoqués par le SC au début de l’intervalle de Trace et par le SI à la fin de

l’intervalle de Trace seraient reliés par un « pont » constitué d’activités intermédiaires,

évoquées notamment par le contexte, et qui s’associeraient pour former une chaîne

d’activation (Levy et coll., 2005). Ce modèle serait compatible avec les observations

précédentes dans la mesure où il ne nécessite ni l’activité prolongée d’un neurone donné, ni

une augmentation de l’activité d’ensemble des neurones au cours de l’intervalle de trace. En

outre, dans ce modèle, la spécificité temporelle de la réponse conditionnée serait une

caractéristique intégrante de l’association réalisée puisque ce n’est qu’au terme de la séquence

d’activation que les unités associées au SI seraient activées. Il convient toutefois de noter que

ce modèle a jusqu’ici été développé pour simuler le conditionnement de la paupière, mais

semble perdre son efficacité pour des intervalles de temps longs comme ceux typiquement

employés en conditionnement de peur (Levy et coll., 2005). L’absence de spécificité

temporelle observée dans nos expériences, ainsi que lors de travaux antérieurs (Marchand et

Kamper, 2000; Marchand et coll., 2003) nous semble en outre plutôt compatible avec un

modèle dans lequel un même patron d’activité serait soutenu tout au long de l’intervalle entre

SC et SI. Ceci nous amène à rechercher si des patrons d’activité prolongée ne seraient pas


101

présents dans d’autres structures, et si l’implication de l’hippocampe dans ce conditionnement

ne serait pas liée à son fonctionnement au sein d’un réseau plus large.

CHAPITRE II : CONCLUSION

102

CONCLUSION

L’ensemble des résultats présentés dans ce chapitre indique que les deux sous-régions

hippocampiques (dorsale et ventrale) semblent nécessaire à la mise en place d’un

conditionnement de peur à un stimulus présenté en Trace. Cependant le déficit général des

réponses de peur produit par l’inactivation de l’hippocampe ventral suggère que cette région

jouerait plus un rôle dans le traitement des aspects émotionnels du conditionnement de peur

plutôt qu’un rôle spécifique dans le maintien de l’information nécessaire au conditionnement

de Trace. A l’inverse, l’hippocampe dorsal semble quant à lui impliqué dans des traitements

plus spécifiques des informations permettant ce type de conditionnement. Le rôle de cette

structure pourrait être de combler l’intervalle de trace séparant le SC et le SI en permettant

l’intégration du SC présenté en Trace et du contexte ou bien de permettre un maintien de la

représentation du SC indépendamment du contexte.

CHAPITRE III

Conditionnement de Trace et Trace persistante «Rôle du cortex entorhinal et du cortex préfrontal

médian»

CHAPITRE III : INTRODUCTION

103

INTRODUCTION

Le chapitre précédent nous a permis de montrer que le conditionnement de trace était

spécifiquement atténué par une inactivation de l’hippocampe dorsal, structure

particulièrement impliquée dans le traitement des informations spatiales et contextuelles.

Cette même manipulation abolissait le conditionnement contextuel et ne permettait pas de

dissocier clairement ces deux types de conditionnement. Cependant, il n’est pas nécessaire de

supposer que la présence du contexte durant le conditionnement soit nécessaire pour établir

l’association entre le SC et le SI lorsqu’un intervalle de temps les sépare. En effet, le

conditionnement de trace pourrait reposer largement sur l’existence d’une représentation

persistante du SC pendant l’intervalle de trace, cette représentation ne nécessitant pas la prise

en compte d’indices contextuels. Ainsi, il y aurait une analogie entre le conditionnement de

trace et une forme de mémoire immédiate. Nous sommes donc amenés à nous intéresser à

deux structures particulièrement mises en jeu dans des tâches reposant sur la mémoire de

travail : le cortex préfrontal et le cortex entorhinal. Les expériences présentées dans ce

chapitre visent, au moyen de lésions de ces deux structures, à mettre en évidence une

composante du conditionnement de trace qui ne soit pas nécessairement liée au

conditionnement contextuel.

I- Le Cortex Préfrontal.

1) Généralités.

Chez l’homme, le cortex préfrontal (CPF), qui constitue chez l’homme la partie

antérieure du lobe frontal, a longtemps été considérée comme étant le siège de « la

personnalité ». Cette idée reposait en grande partie sur l’étude d’un cas clinique qui marqua

un tournant dans la compréhension du rôle de cette structure : le patient Phineas Gage qui, en

1848, avait subi la destruction d’une grande partie de son lobe frontal après qu’une barre à

mine lui ait traversé la tête de part en part. Ses proches constatèrent alors un changement

radical de personnalité : « il n’était plus Gage » (Damasio, 1995). Gage était effectivement


104

devenu irritable, impatient et n’était plus capable de mener à terme la plupart des tâches qu’il

entreprenait. De nos jours, la nature de ces troubles cognitifs a été spécifiée et le CPF apparaît

surtout essentiel pour ce que l’on nomme « fonctions exécutives », c’est-à-dire un ensemble

de processus de contrôle cognitif nécessaires à l’exécution optimale de séquences

comportementales complexes. Les fonctions exécutives incluent notamment la sélection

attentionnelle, la résistance à l’interférence, la mise à jour des informations, l’inhibition et la

flexibilité comportementale, les processus de décision, ainsi que la mémoire de travail (Kane

et Engle, 2002; Dalley et coll., 2004; Koechlin et Summerfield, 2007).

2) Subdivisions du cortex préfrontal.

Chez le rat, la partie la plus antérieure du cortex peut être considérée comme un

homologue fonctionnel du CPF humain, bien que ce point ait longtemps fait l’objet de

controverses. Le cortex préfrontal (CPF) présente en effet d’importantes variations selon les

espèces en termes de critères cytoarchitectoniques et de connectivité, notamment par la

présence ou non d’une zone granulaire. L’existence d’une homologie a été initialement

proposée sur la base des projections thalamocorticales en provenance du noyau dorsomédian

du thalamus (Rose et Woolsey, 1948). De nos jours, des similitudes ont été décrites chez

plusieurs espèces concernant non seulement les patrons de connectivité du cortex préfrontal

(Uylings et coll., 2003), mais également ses propriétés fonctionnelles (comportementales et

électrophysiologiques), ainsi que le type de neurotransmission présent dans ces régions

corticales.

Plusieurs zones distinctes du cortex préfrontal peuvent être identifiées chez le rat : le

CPF latéral, le CPF ventral et le CPF médian. Ces trois régions sont elles-mêmes subdivisées

en plusieurs aires (Dalley et coll., 2004).

Le CPF latéral inclut les aires agranulaires Insulaires dorsale et ventrale ainsi que le

cortex Orbital latéral. Les fonctions de cette région restent relativement peu étudiées, et

concerneraient notamment le traitement des stimuli gustatifs ou olfactifs chargés

affectivement (Kesner et Gilbert, 2007) ainsi que le contrôle de la douleur (Coffeen et coll.,

2008).


105

Le CPF ventral comprend les cortex Orbitofrontaux ventral et ventrolatéral. Cette

région semble plus particulièrement impliquée dans les tâches avec inversion de consigne

(reversal learning), l’encodage des relations entre stimulus et récompense (Ostlund et

Balleine, 2007) et la génération de prédiction des conséquences de l’action (Schoenbaum et

Roesch, 2005).

Le CPF médian (CPFm) comprend dorsalement le cortex Précentral et le cortex

Cingulaire antérieur (ACg), et ventralement le cortex Prélimbique (PL), Infralimbique (IL) et

le cortex Orbital médian (MO) (figure III-1). Dans cette étude, nous nous intéresserons plus

particulièrement à cette région en raison d’une part de l’existence de travaux suggérant son

implications dans le conditionnement de trace chez le rongeur, et d’autre part de son

homologie supposée avec le cortex préfrontal dorsolatéral des primates (Hoover et Vertes,

2007). Chez les primates et chez l’homme, le cortex préfrontal dorsolatéral est généralement

associé à des fonctions cognitives supérieures telles que la mémoire de travail (Fuster, 2001).

3) Le cortex préfrontal médian.

Cette région s’organise en deux ensembles de circuits distincts : la partie dorsale

(Précentral, Cingulaire antérieur et Prélimbique dorsal) présente des relations importantes

avec des aires corticales sensorimotrices et associatives. Elle projette vers des régions sous-

Figure III- 1 : Schémas illustrant les différentes aires du cortex préfrontal chez le rat. A : Section sagittale, 0,9 mm de latéralité (en vert le cortex préfrontal médian ventral). B : Section frontale, 3,5 mm en avant du Bregma. Les différentes intensités de gris représentent les trois sous-divisions du cortex préfrontal. Abréviations : BO, bulbe olfactif ; CgA, Cortex cingulaire antérieur ; IAD, cortex insulaire agranulaire dorsal ; IAV, cortex insulaire agranulaire ventral ; IL, cortex infralimbique ; M1, cortex moteur primaire ; PL, cortex prélimbique ; OL, cortex orbital latéral ; OM, cortex orbital médian ; OV, cortex orbital ventral ; OVL, cortex orbital ventrolatéral. (Adapté de Dalley et coll., 2004).


106

corticales comme le cœur (core) du noyau Accumbens, le striatum dorsal et l’hypothalamus

(Ding et coll., 2001; Gabbott et coll., 2005). Ces circuits semblent principalement impliqués

dans les processus attentionnels, la capacité à s’écarter de lieux préalablement associés à une

récompense, et la planification des actions et des séquences comportementales (Heidbreder et

Groenewegen, 2003).

Les cortex Prélimbique et Infralimbique, ainsi que le cortex Orbital Médian forment ce

que l’on nomme le cortex préfrontal médian ventral (CPFm ventral). Les circuits du CPFm

ventral sont particulièrement importants pour la flexibilité comportementale impliquant des

changements de règle ou de stratégie dans des tâches de discrimination, les processus

préparatoires à l’action et le contrôle de l’action dirigée, ainsi que pour l’intégration des états

internes et des stimuli externes dans des situations aversives (Heidbreder et Groenewegen,

2003). Nous concentrerons notre étude sur cette région du CPFm ventral qui est fortement

connectée avec des structures impliquées aussi bien dans le conditionnement de Trace que

dans le conditionnement de Peur.

4) Connectivité du CPFm ventral.

En dépit des distinctions établies ci-dessus, toutes les aires du cortex préfrontal sont

fortement interconnectées entre elles, et notamment avec les régions adjacentes. Toutefois, la

principale particularité du CPFm ventral est d’être en relation étroite avec diverses aires

corticales et sous-corticales dites « limbiques ». Ainsi, cette région est largement

interconnectée avec diverses aires corticales temporales et associatives, notamment le cortex

périrhinal et entorhinal.

a) Efférences.

Contrairement au CPFm dorsal, le CPFm ventral projette vers l’Amygdale, la coque

(shell) du noyau Accumbens, le Septum et l’Hypothalamus médian (Heidbreder et

Groenewegen, 2003). L’IL projette plus particulièrement sur le Septum latéral, le noyau du

Lit de la Strie Terminale, les parties médianes de l’Hypothalamus et certaines régions du tronc

cérébral qui sont impliquées dans le contrôle viscéromoteur (Vertes, 2004). Par contre, le PL


107

envoie des projections sur le thalamus médian et plus précisément le nucleus reuniens qui

constitue une des principales entrées thalamiques de l’hippocampe (Vertes et coll., 2007).

Par ailleurs, le CPFm ventral présente d’importantes projections vers les noyaux

monoaminergiques du tronc cérébral tels que le Raphé dorsal (pour le PL) et l’aire

Tegmentale ventrale (Vertes, 2004).

b) Afférences.

Le CPFm est largement innervé par des projections afférentes du cortex Insulaire, du

Claustrum, de l’Amygdale, du Thalamus médian, des noyaux Supramammillaires et de la

substance grise périaqueducale. Il reçoit également des projections monoaminergiques de

l’aire Tegmentale ventrale, du Raphé, et du locus Coeruleus (Heidbreder et Groenewegen,

2003).

Il est important de souligner que le CPFm ventral est la seule région du CPF à recevoir

des projections en provenance de la formation hippocampique (plus précisément de l’aire

CA1 et du Subiculum, Jay et Witter, 1991; Laroche et coll., 2000).

5) CPF et processus cognitifs.

a) Théories sur la fonction du CPF.

Il est maintenant bien admis que le CPF est mis en jeu lors d’un vaste ensemble de

processus cognitifs. L’étude du cas de Phineas Gage (Damasio, 1995) mais aussi de patients

souffrant de psychopathologies telles que la schizophrénie (Friedman et coll., 1999), des

études par imagerie cérébrale fonctionnelle (D'Esposito et coll., 2000) ou encore des études

menées sur modèle animal (Dalley et coll., 2004) ont permis de souligner l’importance de ce

cortex dans de nombreux processus cognitifs de haut niveau.

Le cortex préfrontal médian du rat apparaît comme « indifférencié » et pourrait avoir

des fonctions analogues à celles du CPF dorsolatéral du primate, y compris humain (Brown et

Bowman, 2002). Pour appuyer cette idée, il est important d’identifier des fonctions de base

communes entre les espèces. On considère de façon générale que le cortex préfrontal joue un

rôle dans les processus cognitifs sous-tendant le contrôle de l’action, appelés fonctions

exécutives. Ce sont des processus nécessaires à la mise en jeu flexible de comportements

adaptés. Ils incluent notamment la mémoire de travail, les processus attentionnels, le


108

traitement et l’organisation des événements dans le temps, l’identification des conséquences

des événements ou actions, la capacité de planification, de prise de décision, l’inhibition de

réponses prépotentes, la capacité de réorienter l’attention et de modifier sa stratégie, etc. (pour

revue voir : (Kane et Engle, 2002; Dalley et coll., 2004).

Il a été proposé que le PFC fonctionne comme une structure modulatrice qui biaise le

traitement des informations en faveur d’associations faibles, mais appropriées entre stimuli et

réponses (Miller et Cohen, 2001). La connectivité étendue de cette région lui permettrait

d’associer des stimuli arbitraires. D’autre part, sa capacité de mettre à jour et de maintenir une

information dans le temps malgré la présence de distracteurs permettrait la mise en jeu d’une

stratégie ou règle en fonction du contexte de la tâche.

Chez le rat, des lésions du CPFm produisent des déficits sévères dans des tâches de

réponse retardée ou d’alternance différée et dans différents types de tâches de non

appariement retardé (pour revue voir Uylings et coll., 2003; Dalley et coll., 2004). De plus,

ces lésions induisent des déficits attentionnels dans diverses tâches, ainsi que dans la capacité

à réorienter l’attention vers un nouveau type d’indices. On peut également identifier des effets

sur diverses formes d’inhibition (Dalley et coll., 2004). Enfin, ces lésions tendent à

désorganiser les séquences motrices dans des comportements particuliers à l’espèce

(construction du nid, cache de nourriture…).

Chez le rat comme chez le primate, l’existence de distinctions fonctionnelles au sein

du cortex préfrontal a fait l’objet d’un grand intérêt. Cette spécialisation pourrait être basée

soit sur la nature de l’information traitée par les différentes régions (spécificité

informationnelle ou de domaine), soit sur des différences concernant la manière de traiter

cette information (spécificité de traitement, Brown et Bowman, 2002).

b) Spécificités régionales au sein du CPFm du rat.

Il apparaît actuellement que les parties ventrales et dorsales du CPFm peuvent être

dissociées fonctionnellement. Alors que les parties dorsales, et notamment l’ACg sont plutôt

impliquées dans l’organisation de séquences motrices, les régions plus ventrales (PL et IL)

jouent plus particulièrement un rôle dans des fonctions de supervision attentionnelles, la

gestion des processus émotionnels, ainsi que dans divers traitements cognitifs de haut niveau

incluant la mémoire de Travail (Heidbreder et Groenewegen, 2003; Uylings et coll., 2003;

Dalley et coll., 2004).


109

Au sein du CPFm ventral, on peut également différencier les fonctions de l’aire

prélimbique (PL) et infralimbique (IL) : La région PL semble participer aux fonctions

attentionnelles (Chudasama et Muir, 2001) et à l’encodage des conséquences de l’action

(Killcross et Coutureau, 2003). Avec un groupe limité de structures, elle forme un « circuit

prélimbique » incluant l’Hippocampe, le cortex Insulaire, le noyau Accumbens, le noyau

basolatéral de l’Amygdale, les noyaux médiodorsal et reuniens du Thalamus et l’aire

Tegmentale ventrale. Des lésions de chacune de ces structures sont susceptibles de produire

des déficits dans les tâches de réponse différée (Vertes, 2006; Hoover et Vertes, 2007). Dans

ce circuit le reuniens du thalamus pourrait jouer le rôle d’intermédiaire entre le PL et

l’hippocampe, car s’il existe des projections de l’hippocampe sur la région PL, il ne semble

pas exister de projection directe en retour (Goldman-Rakic et coll., 1984; Buchanan et coll.,

1994). Cette connexion en retour pourrait se faire directement via les projections du reuniens

sur CA1 ou par l’intermédiaire du cortex entorhinal.

La région IL, par contre, semble jouer un rôle particulier dans le contrôle des fonctions

autonomes et la modulation des comportements de peur (Heidbreder et Groenewegen, 2003;

Uylings et coll., 2003; Hoover et Vertes, 2007). Elle présente des liens particuliers avec le

noyau central de l’Amygdale (Vertes, 2004; Gabbott et coll., 2005), impliqué dans la réponse

conditionnée peur à des stimuli auditifs et contextuel. Des mécanismes dépendants de l’IL

semble nécessaires à l’extinction à long-terme de cette peur (Quirk et coll., 2006).

6) CPF et conditionnement de Trace.

La contribution du CPF au conditionnement de trace a été surtout étudiée lors du

conditionnement de la membrane nictitante chez le lapin. Ainsi, il a été montré que des

lésions du CPF avant un conditionnement de trace où l’intervalle de trace était de quelques

centaines de millisecondes induisaient des déficits de conditionnement (Kronforst-Collins et

Disterhoft, 1998; Weible et coll., 2000; McLaughlin et coll., 2002; Powell et coll., 2005;

Oswald et coll., 2006). Les processus d’acquisition du conditionnement de trace sont

notamment concernés puisque des infusions dans le CPFm de l’agoniste GABAA muscimol

effectuées avant chaque séance de conditionnement, retardent sélectivement le

conditionnement de trace (Takehara-Nishiuchi et coll., 2005). Des injections de l’antagoniste

des récepteurs NMDA APV, avant ou après la phase de conditionnement, induisent des effets


110

comparables ce qui confirme l’implication de cette région dans l’acquisition mais aussi durant

la phase précoce de consolidation de cet apprentissage (Takehara-Nishiuchi et coll., 2005,

2006).

Des résultats analogues ont été obtenus lors de conditionnement de peur au moyen de

lésions (Han et coll., 2003) ou d’une approche pharmacologique (Runyan et Dash, 2004;

Runyan et coll., 2004).

Les régions du CPF impliquées ne sont pas nécessairement les mêmes selon le

protocole de conditionnement considéré. Dans un protocole de conditionnement de la

membrane nictitante il semble que la région caudale du CPF (en grande partie le cortex

cingulaire) soit particulièrement impliquée (Kronforst-Collins et Disterhoft, 1998; Weible et

coll., 2000), alors qu’en conditionnement de peur c’est la partie plus rostrale et plus

précisément le CPFm ventral (PL et IL) qui serait mise en jeu (Baeg et coll., 2001; Runyan et

coll., 2004; Quinn et coll., 2008).

Cependant il a également été mis en évidence que des lésions excitotoxiques du

CPFm, sont susceptibles d’atténuer les réponses conditionnées au son tout en exacerbant les

réponses conditionnées au contexte dans un conditionnement de peur en protocole de Délai,

(Lacroix et coll., 2000). Ainsi, l’existence d’un rôle spécifique du CPFm durant le

conditionnement de Trace reste à confirmer, son implication pouvant aussi être due à son rôle

dans le contrôle des réactions de peur (Morgan et LeDoux, 1995).

7) Processus de maintien de la Trace dans le CPF.

A l’heure actuelle, un grand nombre de processus neurobiologiques ayant lieu dans le

CPF ont été décrits. Une grande part du travail des chercheurs vise à associer ces processus à

des fonctions cognitives spécifiques. Parmi ces processus nous allons principalement nous

intéresser à l’implication des "cellules délai" du CPFm dans la mémoire de travail, puisque

c’est ce processus qui semble le plus à même de rendre compte du conditionnement de Trace.

Le terme de "cellules délai" fait référence à un groupe de cellule du CPFm ayant un

patron de décharge particulier. Ces neurones sont capables d’émettre une réponse différée par

rapport au moment de présentation d’un stimulus. La présence de tels neurones dans le CPF a

tout d’abord été mise en évidence chez le primate en 1971 par Joaquin Fuster et Garret


111

Alexander (1971) dans un test de réponse différée dans lequel les animaux devaient effectuer

une réponse précise en fonction du stimulus olfactif qui leur était présenté. Cette réponse ne

pouvait être donnée qu’après un délai imposé de 32, 65 ou 67 s. Les enregistrements

électrophysiologiques effectués durant les tests ont permis de mettre en évidence l’existence

de neurones dans le CPF pour lesquels la présentation du stimulus olfactif induisait une

décharge maintenue durant le délai de rétention (figure III-2A).

Ces cellules délai ont immédiatement été considérées comme centrales dans les

processus de mémoire de travail, Fuster et Alexander supposant quelle pourraient avoir un

rôle dans « la focalisation attentionnelle de l’animal sur des informations qui sont mémorisées

temporairement pour une utilisation prospective ».

Il est à noter que lors d’un conditionnement de peur associée à un son effectué avec un

intervalle de trace de 2 s, un parallèle entre la cinétique de l’activité de ces cellules et le

moment prédit de survenue d’un choc électrique a récemment été mis en évidence par Baeg et

coll. (2001)(figure III-2B).

Il est important de souligner que ces cellules Délai reposeraient sur un système de

récurrence synaptique nécessitant une plasticité synaptique afin de mettre en place un

maintien d’activité. Hasselmo suggère que ce système semblerait approprié pour le maintien

d’informations préalablement familiarisées et donc ayant pu induire cette plasticité

synaptique, mais serait insuffisant dès lors que l’information à maintenir serait nouvelle

(Hasselmo et Stern, 2006).

sc

10 s

SC SI

Survenue attendu du

Temps en secondes

A B

Figure III- 2 : Patron de décharge de cellules délai. A : enregistrées dans le cortex préfrontal de primate après la présentation d’un stimulus olfactif devant induire une réponse motrice après un délai de 32 s (trois premières représente lignes) ou 67 et 65 s (lignes suivantes). Les flèches indiquent le moment où la réponse motrice est effectuée. La zone grisée représente le moment de présentation du stimulus olfactif. (D’après Fuster et Alexander, 1971) B : dans le cortex préfrontal médian de rats lors de la phase de test d’un conditionnement de peur associée à un son effectué avec un intervalle de Trace de 2 s. (D’après Baeg et coll., 2001). SC, stimulus conditionnel ; SI, stimulus inconditionnel.


112

II- Le cortex entorhinal.

1) Généralités.

Le cortex entorhinal (CE) est une structure cérébrale du lobe temporal appartenant à la

formation hippocampique. Le CE constitue le principal relais d’entrée des informations

sensorielles dans l’hippocampe. Pour cette raison, son rôle dans le traitement des informations

et les apprentissages a longtemps été mis sur le compte du traitement hippocampique.

Pourtant, il est maintenant admis que le CE, plus qu’un simple relais de l’information, est une

structure capable d’effectuer des traitements intégrés de l’information sensorielle. On sait par

exemple qu’une partie du traitement des informations spatiales nécessaires aux apprentissages

est effectuée en amont de l’hippocampe par des cellules spécialisée du CE nommées « grid

cells » (Fyhn et coll., 2004; Sargolini et coll., 2006). Il est aussi suggéré que cette structure

aurait un rôle primordial dans les processus nécessitant le maintien à court-terme d’une

nouvelle information, comme par exemple ceux engagés lors de tâches nécessitant la mise en

jeu de la mémoire de travail (pour revue voir Hasselmo et Stern, 2006).

2) Subdivisions du cortex entorhinal.

Le CE est généralement subdivisé en deux-sous régions (figure III-3) sur la base de

critères cytoarchitectoniques : le cortex entorhinal latéral (CEL) et le cortex entorhinal médian

(CEM). Le CEL est localisé de façon rostrolatérale par rapport au CEM et les afférences de

ces deux sous-structures se distribuent différemment sur chacune d’entre elles.

3) Connectivité du Cortex entorhinal.

a) Connexions afférentes.

Le cortex entorhinal reçoit des projections afférentes d’un grand nombre de structures

corticales et sous-corticales. La majeure partie des entrées corticales du CE sont originaires de

structures olfactives telles que le cortex piriforme, le bulbe olfactif ou le noyau olfactif

antérieur (Amaral et Witter, 1995). Une autre composante majeure des entrées corticales du

CE provient des régions temporales regroupant le cortex périrhinal, le cortex postrhinal, le

cortex associatif temporal ventral et le cortex associatif auditif. Les projections en provenance


113

du cortex périrhinal se terminent préférentiellement sur le CEL alors que celles en provenance

du cortex postrhinal sont plus importantes sur le CEM (Burwell, 2000). Enfin, le cortex

entorhinal est aussi fortement innervé par des régions frontales telles que le cortex PL et IL ou

encore le cortex cingulaire antérieur.

Le cortex entorhinal reçoit aussi des projections en provenance de nombreuses régions

sous-corticales. On peut entre autres citer l’importance des projections du complexe

amygdalien et plus particulièrement des noyaux basal et latéral (Pitkanen et coll., 2000). Le

cortex entorhinal reçoit une grande quantité d’informations sensorielles via d’importantes

projections en provenance du thalamus sensoriel et plus particulièrement du nucleus reuniens.

Il est à noter que le CE est étroitement connecté avec une des structures principales du

système cholinergique cérébral : le complexe septum médian / Bande diagonale de Broca

(Amaral et Witter, 1995).

b) Connexions efférentes.

Les efférences du CE les plus étudiées sont celles projetant vers l’hippocampe. Il

existe trois voies de projections directe du CE vers les 3 sous-régions hippocampiques que

sont le GD ainsi que les aires CA3 et CA1. La projection la mieux connue est la projection

directe en provenance des couches superficielles (II et III) du CE sur le GD appelée voie

perforante. Cette voie présente la particularité d’être la seule projection du cortex entorhinal

Figure III- 3 : Schémas illustrant les différentes aires du cortex entorhinal chez le rat. A : Section latérale, 3,9 mm de latéralité. B : Section frontale, 7,3 mm en arrière du Bregma. La zone bleue correspond au cortex entorhinal. Abréviations : CEL, cortex entorhinal latéral ; CEM, cortex entorhinal médian ; Dsc, Lamina Dissecans du cortex entorhinal ; CPr, Cortex périrhinal. (Adapté de Paxinos et Watson, 1998).


114

sur l’hippocampe pour laquelle les projections du CEL et du CEM ne sont pas ségrégées. Il

est important de noter qu’il existe aussi une projection en retour de l’hippocampe sur les

couches profondes (essentiellement la couche V) du CE. Ce profil de connexion serait donc le

siège d’une boucle de CE-HPC-CE où la voie CE-HPC serait impliquée dans l’acquisition

alors que la voie HPC-CE permettrait un rétrocontrôle vers les circuits néo-corticaux. Ce

circuit pourrait être entre autres considéré comme un détecteur de nouveauté dans lequel le

CE servirait alors à comparer les informations en provenance du néo-cortex et les

informations sortant de l’hippocampe (Chrobak et coll., 2000).

Outre ces efférences vers l’hippocampe, le CE établit des connexions vers de

nombreuses autres structures telles que le cortex périrhinal et postrhinal mais aussi de façon

massive vers le complexe amygdalien (noyau basal et noyau latéral).

4) Cortex entorhinal et fonctions cognitives.

Ces dernières années le CE a fait l’objets de nombreux travaux mettant en évidence

l’importance de cette structure dans plusieurs fonctions cognitives de haut niveau.

Une avancée théorique majeure est l’attribution d’un rôle actif au CE dans les

processus sous-tendant la mémoire de travail. Les travaux de Michael E. Hasselmo entre

autres ont permis de caractériser l’implication de cette structure ainsi que les processus

neurobiologiques sous-jacents dans cette fonction (Hasselmo et Stern, 2006). Dans ses

interprétations, Hasselmo suggère que le CE jouerait le rôle de tampon mnésique pour les

nouvelles informations. Ce tampon mnésique permettrait entre autres la réalisation de tâche de

mémoire de travail, mais aussi le stockage à long terme en mémoire épisodique de la

représentation du stimulus (Hasselmo et Stern, 2006). Ces hypothèses reposent aussi bien sur

des approches comportementales (McGaughy et coll., 2005) qu’électrophysiologiques

(Suzuki et coll., 1997; Young et coll., 1997; Egorov et coll., 2002) ou encore de modélisation

informatique (Fransen, 2005). Le terme « nouveau stimuli » employé par Hasselmo est capital

puisqu’il explique la nécessité d’un CE fonctionnel lors de tests en mémoire de travail dans

lesquels les stimuli sont présentés pour la première fois (Gaffan et Murray, 1992; Stern et

coll., 2001; Squire et coll., 2004; Ranganath et Blumenfeld, 2005), mais pas lorsque les

stimuli ont été préalablement familiarisés (Corkin, 1984; Otto et Eichenbaum, 1992; Eacott et

coll., 1994). Le CE, en permettant le maintien de nouvelles informations, viendrait ainsi


115

complémenter le rôle du CPF qui serait par contre indispensable et suffisant lorsque

l’information à maintenir est familière (McGaughy et coll., 2005).

5) Cortex entorhinal et conditionnement de Trace.

A ce jour, une seule étude effectuée en conditionnement de la membrane nictitante a

mis en évidence la nécessité d’un CE fonctionnel pour la mise en place d’un conditionnement

de Trace (Ryou et coll., 2001). De plus, cette étude montre que les modifications de l’activité

hippocampique induites par la mise en place du conditionnement de Trace n’étaient plus

visibles chez des lapins ayant subi une lésion du CE. Nous savons de plus que le CE établit de

nombreuses connections nerveuses aussi bien avec les aires sensorielles telles que le thalamus

sensoriel mais aussi avec des structures limbiques telles que l’hippocampe ou le complexe

amygdalien dont on sait qu’elles sont indispensables à la mise en place d’un conditionnement

de peur effectué avec un protocole de Trace. D’autre part, le parallèle existant entre les

processus de mémoire de travail et le maintien de la Trace du SC nécessaire à la mise en place

du conditionnement de Trace prend ici tout son sens. En effet, lorsqu’un conditionnement de

peur à un stimulus présenté en Trace est effectué en une seule séance, il semble nécessaire

qu’un processus neurobiologique permette le maintien de la Trace du SC alors que celui-ci est

nouveau pour l’animal. Le rôle de tampon mnésique du CE vis-à-vis des nouveaux stimuli

proposé par Hasselmo permet de penser que c’est au sein de cette structure que s’effectue le

maintien de la Trace du SC.

6) Possible nature de la Trace dans le cortex entorhinal.

S’il est possible que le CE joue un rôle crucial dans le conditionnement de trace il est

nécessaire de formuler une hypothèse quant à ce rôle et au mécanisme neurobiologique qui le

sous-tend. Il existerait effectivement deux explications possibles à cette fonction. La première

serait que le CE situé en amont du traitement hippocampique ne serait impliqué dans le

conditionnement de Trace que par le fait qu’il constitue le principal relais de l’information

sensorielle vers l’hippocampe (Ryou et coll., 2001). Une autre explication viserait à conférer

un rôle actif au CE dans le maintien de la Trace du SC.


116

Récemment, des auteurs ont mis en évidence par une approche électrophysiologique

sur tranche de cerveau de rat, l’existence dans le CE de neurones qui, une fois qu’ils sont

activés, continuent à décharger durant plusieurs minutes sans stimulation supplémentaire

(Klink et Alonso, 1997; Egorov et coll., 2002) (figure III-4). Cette découverte fait écho à

l’enregistrement dans le CE de primate, de neurones capables de maintenir une activité

induite par la présentation d’un stimulus visuel spécifique durant le délai imposé dans une

tâche de reconnaissance différée (Suzuki et coll., 1997) (figure III-4). Ainsi, il serait possible

que le cortex entorhinal participe activement au maintien de la Trace du SC nécessaire à la

mise en place d’un conditionnement de trace par le biais de ces activités persistantes.

A

0,3 nAsimulation

0 2000

10

20

30

40

50 E NCB

Spikes/sec


Les expériences effectuées dans ce chapitre ont pour but d’évaluer la spécificité du

rôle du CPFm et du CE durant l’acquisition d’un conditionnement de Trace. Ces deux

structures semblant capitales pour le maintien d’information à très court terme nécessaire à la

réalisation d’épreuve en mémoire de travail, nous avons pensé, qu’elles pouvaient aussi être

impliquées lors d’un conditionnement de Trace afin de maintenir une Trace du SC et de

Figure III- 4 : Activités neuronales persistantes. A : Enregistrement sur tranche d’un neurone du CE de rats présentant une activité persistante après une unique stimulation électrique (d’après Egorov et coll., 2002). B : Enregistrement dans le CE d’un singe rhésus, d’un neurone présentant une activité persistante après la présentation du stimulus visuel de référence (E) durant le délai d’une procédure d’appariement différé. NC : stimulus non concordant. En gris la durée de présentation des stimuli. En abscisse le temps en ms. (d’après Suzuki et coll., 1997).


117

combler le vide temporel existant entre la présentation du SC et du SI. Il a de plus été montré

que chacune de ces deux structures était nécessaire à la mise en place de l’association SC/SI

lors d’un conditionnement de Trace de la membrane nictitante. Cependant l’implication

spécifique de ces deux structures dans un conditionnement de peur avec un intervalle de trace

de plusieurs dizaines de secondes reste encore à confirmer.

Notre hypothèse est donc que le CPF ou le CE pourrait sous-tendre le maintien de la

Trace du SC, grâce à l’existence des cellules délai pour le CPF et par le biais de neurones à

activité persistante pour le CE. Cette Trace du SC devrait être spécifiquement requise pour la

mise en place d’un conditionnement de Trace alors qu’elle ne devrait pas être indispensable à

la mise en place d’un conditionnement de Délai. De même, le fonctionnement d’une structure

permettant le maintien de cette Trace devrait être requis spécifiquement pour la mise en place

du conditionnement de Trace mais pas de Délai.

Pour tester cette hypothèse, nous avons donc effectué chez deux groupes d’animaux

des lésions excitotoxiques du CPFm ou du CE préalablement à la phase d’acquisition d’un

conditionnement avec un intervalle de Trace de 30 s ou en protocole de Délai. Nous avons

ainsi pu évaluer la nécessité de l’intégrité de ces deux structures pour ces deux types de

conditionnement.

CHAPITRE III : EXPERIENCE 1

118

Expérience 1:

Lésion du Cortex Préfrontal médian

Cette expérience a pour but de comparer la sensibilité du conditionnement au son

effectué en protocole de délai ou en protocole de Trace à une lésion du CPFm pratiquée avant

la phase d’acquisition.


1) Sujets.


expérimental, les procédures de conditionnement, de test et de vérification histologique sont

identiques à ceux décrits dans l’expérience 1 du chapitre II.

2) Chirurgie.

Les lésions excitotoxiques bilatérales du Cortex Préfrontal médian (CPFm) sont

effectuées en adaptant la procédure décrite par Killcross et Coutureau (Killcross et Coutureau,

2003).

L’ensemble de la procédure chirurgicale est comparable à celle décrite dans la

première expérience du chapitre II mise à part une modification des sites d’injection.

Les coordonnées des sites d’injection sont calculées conformément au tableau III-1, la

coordonnée 0 dorso-ventrale étant prise directement sur le crâne au niveau du Bregma.


Les moments pour lesquels la RC est prise en compte sont identiques à ceux décrits

dans l’expérience 1 du chapitre II. Une analyse de variance (ANOVA) à deux facteurs est

utilisée pour traiter l’ensemble de ces données avec pour facteurs le protocole de

conditionnement utilisé (D ou T30) ainsi que le traitement effectué (PSEUDO ou CPFm). Des


119

ANOVA partielles et le test post-hoc de Student-Newman-Keuls viennent compléter les

analyses si nécessaire.


+3,8 ±0,6 -3,8 0,10 (2min)

+3,2 ±0,6 -3,6 0,1µl (2min)

+3,0 ±0,7 -5,4 0,1µl (2min)

+2,5 ±0,6 -3,4 0,1µl (2min)

II- Résultats


Après la vérification histologique, les performances comportementales de 37 animaux

présentant des lésions s’étendant sur le cortex prélimbique et le cortex infralimbique ont été

analysées. Un rat du groupe D/PSEUDO a été exclu pour cause de RC non spécifique. Les

effectifs respectifs de chaque groupe étaient donc les suivants : D/CPFm (n=10), T30/CPFm

(n=10), D/PSEUDO (n=8) et T30/PSEUDO (n=8).

Les animaux ayant reçu des lésions du cortex préfrontal médian présentent

généralement des lésions bilatérales recouvrant une grand partie des cortex PL et IL avec

Tableau III-1 : Localisation de l’ensemble des sites d’injection et volumes de NMDA injectés en chaque site afin de produire une lésion du cortex préfrontal médian. La durée durant laquelle la micro-pipette est laissée en place après injection est notée entre parenthèses. AP : Antéro-Postérieur ; ML : Médio-Latéral ; DV : Dorso-Ventral.


120

parfois de légères atteintes du cortex orbital médian et du cortex cingulaire antérieur.

(Figure III-5).

2) Acquisition.

La figure III- 6A représente la RC des animaux lésés et pseudo-lésés immédiatement

après l’administration de chaque choc en fonction du protocole de conditionnement. Au cours

de la session de conditionnement, l’ensemble des rats témoins acquiert une RC. Les animaux

des groupes lésés présentent eux-aussi une augmentation de la RC au fur et à mesure des

essais mais cette RC est plus faible que celle des rats témoins, indépendamment du protocole

de conditionnement.

L’ANOVA sur les taux de RC post-choc met en évidence que cette dernière est

atténuée de manière significative par la lésion (F(1,32)=13,6, p<0,001) et ce de façon

indépendante du protocole de conditionnement (interaction: F(1, 32)=0,04, p>0,01).

Pseudo CPFm

A B

Figure III-5 : Lésions du cortex préfrontal médian. A : Représentation schématique de l’étendue des lésions du cortex préfrontal médian chez le rat présentant la lésion la plus étendue (gris foncé) et le rat présentant la lésion la moins étendue (noir). Diagrammes adaptés de Paxinos & Watson 1998, avec les distances au Bregma indiquées en millimètres. B : Photomicrographie de tranches d’un hémisphère de cerveau à 3,2 mm en avant du Bregma d’un rat contrôle (PSEUDO, à gauche) et d’un rat ayant une lésion représentative cortex préfrontal médian (CPFm, à droite). Les limites de la lésion sont indiquées par des flèches.


121

3) RC au contexte.

La figure III- 6B représente la RC des animaux lésés et pseudo-lésés durant le test de

peur associée au contexte. Les animaux du groupe T30/PSEUDO présentent une forte RC au

contexte alors que ceux du groupe D/PSEUDO ont une RC plus faible. La lésion du CPFm

induit une diminution de cette RC quel que soit le protocole de conditionnement.

L’ANOVA confirme ces constatations en détectant un effet significatif du protocole de

conditionnement (F(1,32)=12,06, p<0,005) ainsi qu’un effet de la lésion (F(1,32)=4,81, p<0,05)

mais pas d’interaction entre ces deux facteurs (F(1,32)=0,0002, p>0,01). Cependant l’ANOVA

partielle effectuée sur ces données ne met en évidence un effet significatif de la lésion que

pour les groupes conditionnés avec un protocole de Délai (F(1,16)=6.81, p<.05) et non pour les

animaux conditionnés avec un protocole de Trace (F(1,16)=1,45, p>.05).

% RC

A B

0

20

40

60

80

100


D/PSEUDOD/CPFmT30/PSEUDOT30/CPFm

0

20

40

60

80

100

D T30

PSEUDO

CPFm

*

4) RC au son.

La RC des animaux lésés et pseudo-lésés durant la présentation du son en fonction du

protocole de conditionnement est présentée sur les figure III-7A et C. En présence du contexte

modifié, la RC manifestée par les rats est négligeable pour l’ensemble des groupes.

Durant la présentation du son, une forte RC apparaît chez les animaux pseudo-lésés.

Cette réponse est plus forte pour les animaux conditionnés avec un protocole de Délai que

pour ceux conditionnés avec un protocole de Trace. Les animaux du groupe D/CPFm

Figure III-6 : Pourcentage de RC et erreur standard en fonction du traitement et du protocole de conditionnement de l’expérience 1. A : Durant le conditionnement. Evolution au cours des essais de la RC au cours de la minute suivant la fin du choc en fonction du protocole. B : Durant le test au contexte (moyenne des 5 minutes de test).


122

présentent une réponse affaiblie par rapport à leurs témoins, alors qu’à l’inverse la lésion

semble sans effet pour le groupe conditionné avec un protocole de Trace.

L’ANOVA indique un effet significatif du protocole de conditionnement (F(1,32)=8,28,

p<0,01) ainsi que de la lésion (F(1,32)=4,15, p<0,05), mais ne parvient cependant pas à détecter

une interaction entre ces deux facteurs (F(1,32)=2,03, p>0,05). L’ANOVA partielle effectuée

sur ces données met en évidence un effet significatif des lésions seulement pour les groupes

conditionnés avec un protocole de Délai (F(1,16)=6,83, p<0,05), mais pas pour les animaux

conditionnés avec un protocole de Trace (F(1,16)=0,17, p>0,05).


La RC des animaux lésés et pseudo-lésés durant l’intervalle de trace en fonction du

protocole de conditionnement est présentée sur les figure III-7B et C. Les animaux des

groupes témoins D/PSEUDO et T30/PSEUDO présentent une forte RC durant les 30 s suivant

la présentation du son. Cette réponse est au même niveau pour les deux groupes témoins. Les

animaux ayant reçu une lésion du CPFm présentent une diminution de cette réponse par

rapport à leur témoins et ce pour les deux protocoles de conditionnement.


protocole de conditionnement (F(1,32)=0,86, p>0,05) mais confirme l’effet de la lésion

(F(1,32)=6,77, p<0,05) et son absence d’interaction avec le protocole de conditionnement

(F(1,32)=0,22, p>0,05). L’ANOVA partielle effectuée sur ces données ne met en évidence un

effet significatif de la lésion que pour les groupes conditionnés avec un protocole de Délai

(F(1,16)=7.06, p<0,05), mais pas pour les animaux conditionnés avec un protocole de Trace

(F(1,16)=1,71, p>0,05).


123

0

20

40

60

80

100

D T30

PSEUDO

CPFm

*

0

20

40

60

80

100

D T30

*

0

20

40

60

80

100


D/PSEUDOD/CPFmT30/PSEUDOT30/CPFm

A B

C

Figure III-7 : Pourcentage de RC et erreur standard lors du test au son de l’expérience 1. A : Moyenne des trois présentations du SC. B : Moyenne des 30 secondes faisant suite aux 3 présentations du SC. C : Durant les 5 minutes de test au contexte modifié (CX MOD) et cinétique de la RC lors de la présentation du son, moyennée sur trois essais. PRE-SC : Bloc de 10 s précédant le son ; SC : Présentation du son ; POST 10 à POST 50 : Blocs de 10 s suivant la fin du son.

Cette expérience nous a permis de constater que les lésions du CPFm

induisaient un déficit des RC au contexte et au son mais seulement quand ce dernier

est conditionné en Délai.

On ne note pas d’effet significatif de la lésion sur la réponse au SC quand il est

conditionné en Trace.

% RC

% RC


124

Expérience 2:

Lésion du cortex entorhinal.


Cette expérience a pour but de comparer la sensibilité du conditionnement au son

effectué en protocole de Délai ou en protocole de Trace à une lésion du CE pratiquée avant la

phase d’acquisition. Nous supposons que le CE devrait permettre l’acquisition du

conditionnement de Trace en étant le siège du maintien de la trace mnésique du SC, par

l’intermédiaire des neurones à activité persistante décrits par (Egorov et coll., 2002). La lésion

du CE devrait donc produire un déficit spécifique de RC au son chez les animaux

conditionnés en Trace, conformément aux résultats obtenus en protocole de conditionnement

de la membrane nictitante (Ryou et coll., 2001).

1) Sujets et procédures.


expérimental ainsi que les procédures de conditionnement, de test et de vérification

histologique sont identiques à celles décrites dans l’expérience 1 du chapitre II.

2) Chirurgie.

Les lésions excitotoxiques bilatérales du Cortex Entorhinal (CE) sont effectuées en

adaptant la procédure décrite dans Coutureau et coll. (1999) adaptée de Jarrard (1989).

L’ensemble de la procédure chirurgicale est comparable à celle décrite dans la

première expérience du chapitre II, mise à part une modification des sites d’injection.

Les coordonnées des sites d’injections sont calculées conformément au tableau III-2,

la coordonnée 0 dorso-ventrale étant prise directement sur la dure-mère à la verticale du site

d’injection.


125


Les moments pour lesquels la RC est quantifiée sont identiques à ceux décrits dans

l’expérience 1 de ce chapitre. Les données des six groupes de rats sont soumises à une

ANOVA ayant pour facteurs de comparaison entre sujets le traitement (PSEUDO ou ENT) et

le protocole de conditionnement (D ou T30).


-6,1 ±5,8 -6,9 0,05µl (2min)

-6,5 ±4,7 -7,4 0,025µl (1min)

±4,5 -6,6 0,05µl (1min) -7,0

±5,8 -5,8 0,075 µl (2min)

-7,5 ±4,6 -5,8 0,1 µl (5min)

-8,0 ±4,7 -5,3 0,1 µl (5min)

-8,5 ±4,8 -3,6 0,1 µl (5min)

Tableau III-2 : Localisation de l’ensemble des sites d’injections et volumes de NMDA injectés en chaque site afin de produire une lésion du cortex entorhinal. La durée durant laquelle la micro-pipette est laissée en place après injection est notée entre parenthèses. AP : Antéro-Postérieur ; ML : Médio-Latéral ; DV : Dorso-Ventral.


126

II- Résultats.


Après la vérification histologique, les performances comportementales de 45 animaux

présentant des lésions touchant le cortex entorhinal médian et latéral sans atteinte du

subiculum ont été analysées. Deux rats du groupe T30/PSEUDO et 1 rat du groupe D/ENT

ont été exclus pour cause de RC non spécifique. Les effectifs respectifs de chaque groupe

étaient donc les suivants : D/ENT (n=11), T30/ENT (n=13), D/PSEUDO (n=9) et

T30/PSEUDO (n=9).

Les animaux ayant reçu des lésions du cortex entorhinal présentent généralement une

atteinte bilatérale du cortex entorhinal médian et latéral. La localisation de la zone à atteindre

favorisant le bouchage de la micropipette, l’étendue des lésions présente une légère variabilité

(figure III-8).

2) Acquisition.

La RC des animaux lésés et pseudo-lésés après administration des chocs en fonction

du protocole de conditionnement est présentée sur la figure III-9A. Lors de la session de

conditionnement, l’ensemble des rats témoins acquiert une RC. Les animaux des groupes

lésés présentent eux aussi une augmentation de la RC au fur et à mesure des essais, mais cette

RC semble légèrement plus faible que celle des rats témoins, indépendamment du protocole

de conditionnement.

L’ANOVA sur les taux de RC post-choc ne détecte pas d’effet du protocole de

conditionnement (F(1,38)=0,32, p>0,01), ni de la lésion (F(1,38)=2,98 p>0 ,05), ni d’interaction

entre ces deux facteurs ((1, 38)=0,02, p>0,01).


127

A

‐6,40

‐7,40

‐8,00

‐8,72

B Pseudo

ENT

3) RC au contexte.

La RC des animaux lésés et pseudo-lésés durant le test de peur associée au contexte

est présentée sur la figure III-9B. Les animaux du groupe T30/PSEUDO présentent une forte

RC au contexte alors que ceux du groupe D/PSEUDO ont une RC plus faible. La lésion du

CE induit une forte diminution de cette RC pour les groupes d’animaux conditionnés avec un

protocole de Trace.

L’ANOVA confirme en partie ces constatations puisqu’elle met en évidence l’effet de la

lésion (F(1,38)=8,53, p<0,01), mais ne détecte pas d’effet significatif du protocole de

Figure III-8 : Lésions du cortex entorhinal. A : Représentation schématique de l’étendue des lésions du cortex entorhinal chez le rat présentant la lésion la plus étendue (gris foncé) et le rat présentant la lésion la moins étendue (noir). Diagrammes adaptés de Paxinos & Watson 1998, avec les distances au Bregma indiquées en millimètres. B : Photomicrographie de tranches d’un hémisphère de cerveau à 7,4 mm en arriere du Bregma d’un rat contrôle (Pseudo, en haut) et d’un rat ayant une lésion représentative du cortex entorhinal (ENT, en bas). Les limites de la lésion sont indiquées par des flèches.


128

conditionnement (F(1,38)=2,07, p>0,05) et seulement une tendance à l’interaction entre ces

deux facteurs (F(1,38)=3,38, p=0,074). L’ANOVA partielle effectuée sur ces données indique

que l’effet de la lésion est significatif uniquement pour les groupes conditionnés avec un

protocole de Trace (F(1,20)=10,60, p<0,005) et non pour les animaux conditionnés avec un

protocole de Délai (F(1,18)=0,64, p>0,05).

0

20

40

60

80

100


D/PSEUDOD/ENTT30/PSEUDOT30/ENT

0

20

40

60

80

100

D T30

SHAM

ENT

**

%RC

A B

4) RC au son.

La RC des animaux lésés et pseudo-lésés durant la présentation du son en fonction du

protocole de conditionnement est présentée sur les figures III-10A et C. La RC manifestée par

les rats en présence du contexte modifié est négligeable pour l’ensemble des groupes.

Durant la présentation du son une forte RC apparaît chez les animaux pseudo-lésés

qui semble légèrement plus forte pour les animaux conditionnés avec un protocole de Délai

que pour ceux conditionnés avec un protocole de Trace. Les animaux du groupe T30/CE

présentent une réponse fortement diminuée par rapport à leurs témoins, alors qu’à l’inverse la

lésion semble sans effet pour le groupe conditionné avec un protocole de Délai.


protocole de conditionnement (F(1,38)=15,19, p<0,0005), ainsi que de la lésion (F(1,38)=4,84,

p<0,05), ainsi qu’une interaction entre ces deux facteurs (F(1,38)=6,87, p<0,05). L’ANOVA

partielle effectuée sur ces données confirme que l’effet de la lésion est significatif uniquement

Figure III-9 : Pourcentage de RC et erreur standard en fonction du traitement et du protocole de conditionnement de l’expérience 2. A : Durant le conditionnement. Evolution au cours des essais de la RC au cours de la minute suivant la fin du choc en fonction du protocole. B : Durant le test au contexte (moyenne des 5 minutes de test).


129

pour les groupes conditionnés avec un protocole de Trace (F(1,20)=11,98, p<0,005), mais pas

pour les animaux conditionnés avec un protocole de Délai (F(1,18)=0,09, p>0,05).


La RC des animaux lésés et pseudo-lésés durant l’intervalle de trace en fonction du

protocole de conditionnement est présentée sur les figures 5B et C. Les animaux des groupes

D/PSEUDO et T30/PSEUDO présentent une forte RC durant les 30 s suivant la présentation

du son. Cette réponse est globalement au même niveau pour les deux groupes témoins, bien

que la réponse du groupe conditionné en Trace apparaisse légèrement plus tardivement.

Comme pour la réponse durant le son, la lésion du CE semble induire une diminution de la

RC des animaux conditionnés en Trace, mais être sans effet sur les animaux conditionnés en

Délai.


protocole de conditionnement (F(1,38)=2,32, p>0,05), mais confirme l’effet de la lésion

(F(1,38)=4,15, p<0,05) ainsi que la présence d’une interaction entre ce facteur et le protocole de

conditionnement (F(1,38)=6,52, p<0,05). L’ANOVA partielle effectuée sur ces données

confirme que l’effet de la lésion est significatif uniquement pour les groupes conditionnés

avec un protocole de Trace (F(1,20)=13,59, p<0,005), mais pas pour les animaux conditionnés

avec un protocole de Délai (F(1,18)=0,11, p>0,05).

Ces données indiquent donc que les lésions neurotoxiques du CE effectuées

préalablement au conditionnement perturbent spécifiquement le conditionnement de Trace,

sans induire de déficit chez les animaux conditionnés avec un protocole de Délai. La forte

diminution de RC au son conditionné en Trace est accompagnée par un déficit important de la

RC au contexte.


130

0

20

40

60

80

100

D T30

SHAM

ENT

0

20

40

60

80

100

D T30

**

0

20

40

60

80

100

AC PRE‐CS CS POST 10 POST 20 POST 30 POST 40 POST 50

D/PSEUDOD/ENTT30/PSEUDOT30/ENT

% RC

% RC

A B

C

Figure III-10 : Pourcentage de RC et erreur standard lors du test au son de l’expérience 2. A : Moyenne des trois présentations du SC. B : Moyenne des 30 secondes faisant suite aux 3 présentations du SC. C : Durant les 5 minutes de test au contexte modifié (CX MOD) et cinétique de la RC lors de la présentation du son, moyennée sur trois essais. PRE-SC : Bloc de 10 s précédant le son ; SC : Présentation du son ; POST 10 à POST 50 : Blocs de 10 s suivant la fin du son.

L’expérience qui vient d’être présentée met en évidence un effet sélectif de la

lésion du cortex entorhinal. Cette lésion induit un déficit de RC au contexte et de la

RC au son uniquement chez les animaux ayant été conditionnés avec un protocole de

Trace.

CHAPITRE III : DISCUSSION

131

DISCUSSION

I- Effets de la lésion du CPFm.

Les lésions du CPFm ont induit une diminution globale de la réponse post-choc des

animaux lors de la séance de conditionnement, indépendamment du protocole. Par la suite, la

RC des animaux conditionnés avec un protocole de Délai s’est montrée fortement réduite lors

du test au son, mais aussi du test au contexte. Toutefois, chez les animaux conditionnés en

Trace, il n’a pas été possible de mettre en évidence d’effet de cette lésion sur le niveau de RC

lors du test au son.

1) Effet de la lésion sur le conditionnement de Délai.

Les lésions du CPFm que nous avons effectuées induisent un fort déficit de réponse

chez les animaux conditionnés en Délai, dès la phase d’acquisition et par la suite lors de la

phase de test au son. Il semble émerger depuis quelques années un accord général sur

l’implication du mPFC dans la mise en place et le rappel de l’extinction d’un conditionnement

de peur (pour revue voir Quirk et coll., 2006). D’un autre côté, l’implication de ce dernier

dans la mise en place de ce type de conditionnement est sujette à controverse. Pour certains

auteurs, des lésions limitées du CPFm touchant les cortex prélimbique et cingulaire

augmentent la réponse de peur induite par la présentation du SC (Morgan et LeDoux, 1995).

Des lésions plus ventrales (infralimbiques) semblent sans effet sur l’acquisition du

conditionnement de peur (Morgan et coll., 1993). D’autres auteurs obtiennent une atténuation

du conditionnement de peur avec des lésions touchant plus largement le CPFm (Lacroix et

coll., 2000). Il semble donc que ces effets soient fortement dépendants de différences de

procédures entre les diverses études. Cependant les auteurs de l’ensemble de ces études

semblent tout de même s’accorder sur le fait que l’implication du CPFm dans la mise en place

d’une RC ou l’extinction de cette RC lors d’un conditionnement de peur reposerait sur la forte

connectivité directe et indirecte (en particulier via des projections hypothalamique et sur le

tronc cérébral) que ce cortex entretient avec le complexe amygdalien (Likhtik et coll., 2005;

Vidal-Gonzalez et coll., 2006). Les projections du PL et de l’IL aboutissent (via le noyau


132

basolatéral de l’amygdale pour le PL et via les cellules intercalées de la partie latérale du

noyau central de l’amygdale pour l’IL) sur la partie médiane du noyau central de l’amygdale

dont on sait qu’il joue un rôle majeur dans l’expression de la réponse de peur (Pitkanen et

coll., 1997; Quirk et coll., 2006). Ainsi, le déficit quasi global observé dans notre expérience

pourrait être lié à un effet sur l’expression de la réponse de peur plus qu’à un déficit purement

mnésique ou associatif.

2) Effet de la lésion sur le conditionnement de Trace.

Notre hypothèse de départ était que le maintien d’une Trace du SC ne devrait être

requis que dans le cas d’un conditionnement de Trace puisqu’elle permettrait dans ce cas de

rétablir la contiguïté entre SC et SI. De ce fait, perturber cette Trace ne devrait induire un

déficit de RC au son que chez des animaux conditionnés en Trace. A l’opposé, une telle

perturbation devrait être sans effet sur la RC au son d’animaux conditionnés avec un

protocole de Délai pour lesquels la contiguïté est respectée. De façon surprenante, nos

résultats montrent plutôt un déficit chez les animaux conditionnés en Délai. Au contraire, la

lésion du CPFm, bien qu’induisant un léger déficit de réponse des animaux conditionnés en

Trace lors de la phase de conditionnement, semble n’avoir que peu d’effet sur la RC au son

lors du test.

Le seul effet observé dans ce cas concerne la RC après l’arrêt du son. En effet,

contrairement aux animaux témoins conditionnés en Trace, les animaux lésés ne présentent

qu’une faible augmentation de leur RC après le son. Une interprétation possible de ce résultat

serait que cette phase de la réponse soit plus liée à un conditionnement contextuel (Quinn et

coll., 2002) que nos lésions affectent aussi, mais ce point reste très spéculatif. Ce phénomène

pourrait aussi concerner les cellules délai qui devraient décharger préférentiellement dans

l’intervalle séparant le SC et le SI (Gilmartin et McEchron, 2005b).

Il était attendu, au vu de la littérature actuelle, que la lésion du CPFm induise un

déficit de conditionnement chez des animaux conditionnés en Trace. En effet, l’implication de

cette structure dans le conditionnement de Trace a déjà été mise en évidence par approche

lésionnelle (Kronforst-Collins et Disterhoft, 1998; Weible et coll., 2000; Han et coll., 2003;

Quinn et coll., 2008) pharmacologique (Runyan et coll., 2004; Takehara-Nishiuchi et coll.,

2005; Takehara-Nishiuchi et coll., 2006) ou par enregistrement électrophysiologique (Baeg et


133

coll., 2001; Gilmartin et McEchron, 2005b). Il est ainsi surprenant que nos résultats n’aillent

pas totalement dans ce sens. Il y a plusieurs différences de procédure entre ces études et la

nôtre, mais nous pouvons suggérer au moins deux explications à ces résultats discordants,

l’une basée sur des considérations anatomiques et l’autre sur les protocoles de

conditionnement.

Une explication possible serait que les lésions que nous avons effectuées et qui

touchaient principalement les régions Prélimbique (PL) et Infralimbique (IL) n’atteignaient

pas les sous-régions du CPFm impliquée dans le conditionnement de Trace. Effectivement,

plusieurs études faites sur le lapin en conditionnement de la membrane nictitante suggèrent

l’implication de la partie caudale du CPFm dans ce type de conditionnement alors que sa

partie rostrale ne semblerait pas requise (Weible et coll., 2000; McLaughlin et coll., 2002). La

partie rostrale du CPFm chez le lapin correspondrait en grande partie aux cortex PL et IL du

rongeur alors que la partie caudale correspondrait plus au cortex cingulaire antérieur (CCA).

Ce serait donc préférentiellement le CCA qui participerait au conditionnement de Trace (Han

et coll., 2003). Cependant d’autres études en conditionnement de peur chez le rongeur, pour la

quasi-totalité centrées sur les parties PL et IL du CPFm, mettent en évidence une implication

de ce cortex lors du conditionnement de Trace (Runyan et Dash, 2004; Runyan et coll., 2004;

Quinn et coll., 2008). De plus, les enregistrements des cellules délais, qui sont supposées être

le substrat neurobiologique permettant la mise en place de ce type de conditionnement, ont été

effectués dans les cortex PL et IL (Baeg et coll., 2001; Gilmartin et McEchron, 2005b). Il

semblait donc peu probable que ces régions du CPFm ne soient pas impliquées dans le


Une autre explication possible quant au peu d’effet de nos lésions repose sur le

nombre restreint d’essais que nous effectuons lors de notre conditionnement. De fait, la quasi-

totalité des études mettant en évidence une implication du CPFm dans le conditionnement de

Trace repose sur des protocoles qui utilisent un grand nombre d’appariements entre SC et SI.

Ainsi, les auteurs effectuent environ une centaine d’essais par session pour les protocoles de

conditionnement de la membrane nictitante. Par ailleurs, les enregistrements

électrophysiologiques effectués après conditionnement de peur caractérisent les réponses

cellulaires observables dans le CPFm alors que l’association entre SC et SI a déjà été

effectuée (après un minimum de 22 appariements pour 100 présentations du SC dans le cas de

Baeg et coll. (2001) et entre 18 et 24 appariements dans le cas de Gilmartin (Gilmartin et


134

McEchron, 2005b). Cette différence quant au niveau d’exposition au SC est d’une importance

capitale si le mécanisme cellulaire sous-tendant le conditionnement de Trace au sein du CPFm

repose sur les cellules délai. En effet, les modèles d’apprentissage basés sur ces cellules

supposent qu’elles pourraient maintenir des informations uniquement si ces dernières

concernent un SC dont la représentation a été formée préalablement (Durstewitz et coll.,

2000; Hasselmo et Stern, 2006). Dans notre protocole, le nombre restreint d’appariements

effectués sur une seule séance de conditionnement ne permet probablement pas une telle

familiarisation au SC. La RC que nous observons pourrait donc dépendre d’un autre

mécanisme ne nécessitant pas une connaissance préalable du SC pour que ce dernier induise

une activité maintenue après sa présentation.

II- Effets d’une lésion du CE.

Les lésions du CE effectuées avant la phase de conditionnement ne semblent pas avoir

d’effet sur la réponse post-choc des animaux. Cependant, elles réduisent fortement la RC au

son des rats conditionnés en Trace par rapport aux rats témoins. Ce déficit s’accompagne

d’une diminution de la RC en présence du contexte de conditionnement. Par contre, la lésion

du CE semble sans effet sur la réponse des animaux conditionnés avec un protocole de Délai

et ce quelle que soit la phase de test.

1) Effet de la lésion sur le conditionnement de Délai et contextuel.

Les lésions du CE pratiquées ici n’induisent pas de modification de la RC des animaux

conditionnés en Délai, que ce soit durant la phase d’acquisition ou durant la phase de test. A

l’heure actuelle, peu d’études ont abordé la question de l’implication du CE lors d’un

conditionnement de peur à un stimulus élémentaire tel que le son que nous utilisons.

Cependant, nos résultats sont en accord avec les rares travaux effectués à ce sujet qui

semblent montrer que cette structure cérébrale ne serait pas requise dans le conditionnement

au son en Délai (Phillips et LeDoux, 1995; Schenberg et coll., 2005; Majchrzak et coll.,

2006).


135

Cependant, ces mêmes lésions réduisent de manière drastique de la réponse de peur

associée au contexte des animaux conditionnés en Trace. Compte tenu du rôle prépondérant

que joue l’hippocampe dans le conditionnement contextuel (Hirsh, 1974; Nadel et Willner,

1980; Kim et Fanselow, 1992; Phillips et LeDoux, 1994; Maren et coll., 1997; Frohardt et

coll., 1999; Fanselow, 2000; Desmedt et coll., 2003; Hasselmo, 2006), on pourrait s’attendre à

ce que le CE, qui constitue une des principales voies d’entrée des informations sensorielles

vers l’hippocampe, soit lui aussi indispensable à ce type de conditionnement. Cette question

reste pourtant encore débattue, puisque certains auteurs montrent une absence d’effet de

lésions du CE (Phillips et LeDoux, 1995; Good et Honey, 1997; Bannerman et coll., 2001) sur

l’acquisition du conditionnement de peur contextuelle. Au contraire, d’autres mettent en

évidence un effet de lésions comparables sur ce même type de conditionnement (Maren et

Fanselow, 1997; Burwell et coll., 2004; Majchrzak et coll., 2006). De même, une section des

voies perforantes (Ferbinteanu et coll., 1999) ou encore un blocage des récepteur NMDA

durant le conditionnement par injection d’APV (Schenberg et coll., 2005) peuvent atténuer le

conditionnement au contexte. La similarité des protocoles de conditionnement utilisé ainsi

que les niveaux comparable de RC manifestée par les groupes contrôles de l’ensemble de ces

auteurs ne permet pas de trouver une explication satisfaisante quant aux différences d’effets

observés. Nos résultats vont néanmoins dans le sens de la majorité des études et sont en

adéquation théorique avec le rôle de la formation hippocampique dans le conditionnement

contextuel.

2) Effet de la lésion sur le conditionnement de Trace.

Les résultats que nous avons obtenus mettent en évidence un effet considérable de la

lésion du CE sur la RC durant et après le son chez les animaux conditionnés avec un protocole

de Trace. Ces résultats font écho à ceux obtenus par J.W. Ryou qui montrait que des lésions

comparables atténuaient le conditionnement de Trace de la membrane nictitante chez le lapin

(Ryou et coll., 2001). A notre connaissance, nous sommes donc les premiers à mettre en

évidence une telle implication du CE dans le conditionnement de peur à un son présenté en

protocole de Trace. Cependant, un effet inverse de lésion du cortex entorhinal latéral a déjà

été obtenu dans une tâche d’aversion olfactive conditionnée avec un intervalle de Trace de

plusieurs heures (Ferry et coll., 2006; Mouly et Di Scala, 2006). Il ne semble pas que ces


136

résultats puissent être directement comparés aux nôtres en raison des importantes différences

de procédure touchant en particulier la localisation des lésions, plus médianes dans notre cas,

mais surtout la très longue durée de l’intervalle de Trace incompatible avec le

conditionnement de peur.

Plusieurs hypothèses fonctionnelles peuvent être émises pour expliquer nos résultats.

La première explication serait de relier l’effet de la lésion du CE et celui que nous avons pu

observer lors du chapitre précédent après lésion ou inactivation de l’hippocampe. La lésion du

CE semble effectivement reproduire le déficit de conditionnement de trace que nous avions

observé après inactivation de l’hippocampe dorsal. Il semble possible de supposer que l’effet

de la lésion entorhinale est la résultante de la forte connectivité que ce cortex entretien avec

l’hippocampe. Ainsi, cet effet ne mettrait pas en évidence une perturbation du traitement de

l’information effectué par le CE, mais le simple blocage du transit de l’information en

provenance du thalamus sensoriel et des cortex périrhinaux. Dans cette hypothèse, le

rétablissement de la contiguïté entre SC et SI aurait lieu en grande partie au niveau de

l’hippocampe dorsal.

Cependant une autre explication envisageable serait que, conformément à notre

hypothèse le cortex entorhinal pourrait maintenir la Trace du SC durant l’ensemble de

l’intervalle de Trace. Cette Trace pourrait en particulier être transmise à l’hippocampe dorsal

et permettrait ainsi l’association du SC et du SI. Ainsi, l’implication du cortex entorhinal dans

le maintien d’une Trace du SC serait en accord avec les conceptions récentes du rôle de cette

structure en tant que tampon à court-terme pour les informations nouvelles (Hasselmo et

Stern, 2006).

De fait, en dehors de son rôle essentiel en tant que le relais de l’information vers

l’hippocampe, le cortex entorhinal semble capable d’effectuer des traitements complexes de

l’information, que celle-ci soit spatiale (Sargolini et coll., 2006), ou non spatiale (Talnov et

coll., 2003). De plus, les lésions du CE sont susceptibles d’induire des déficits dans des tâches

spécifiques qui sont insensibles à des lésions hippocampiques, telles que l’inhibition latente

(Coutureau et coll., 1999) ou l’équivalence acquise (Coutureau et coll., 2002).


137

3) Le CE joue-t-il un rôle spécifique dans le conditionnement de Trace ?

Nos résultats indiquent clairement l’existence d’une dissociation entre

conditionnement de Trace et conditionnement de Délai lors de lésions du cortex entorhinal.

Ainsi nous avons pu voir que la lésion de cette structure induisait un déficit de RC à la suite

d’un conditionnement de peur dans lequel l’intervalle de Trace est de 30 s.

Dans le cadre d’un conditionnement de la paupière Ryou et collaborateurs (2001)

montraient un déficit associé aux lésions entorhinales pour un intervalle de Trace beaucoup

plus court (750 ms). Toutefois, ces auteurs ne décrivaient pas l’effet de ces mêmes lésions sur

des animaux conditionnés en Délai. Nous confirmons donc que cette structure n’est

indispensable que lors du conditionnement de Trace, puisque les lésions du CE se révèlent

sans effet la RC des animaux conditionnés sans intervalle de Trace.

La spécificité de l’implication du cortex entorhinal lors du conditionnement de Trace

pourrait constituer un indice quant à l’implication de cette aire cérébrale dans le processus

neurobiologique permettant le rétablissement de la contiguïté entre SC et SI. Le CE pourrait

en particulier être le siège d’activités persistantes constituant le support de la Trace. Nous

suggérons de plus que la mise en relation à travers le temps entre SC et SI s’effectue de

manière consciente (Clark et Squire, 1998 ; Carter et coll. 2003) lorsque cette région corticale

participe au traitement des stimuli pour le conditionnement de Trace.

CHAPITRE III : CONCLUSION

138

CONCLUSION

L’ensemble des expériences effectuées au cours de ce chapitre avait pour but de

déterminer si des structures cérébrales connues pour leur rôle dans la mémoire de travail

avaient également un rôle dans les processus sous-tendant le conditionnement de Trace. Nous

avions pour cela sélectionné deux structures, le CPFm et le cortex entorhinal.

Les résultats obtenus semblent indiquer que les deux structures pourraient

effectivement avoir un rôle dans la mise en place de ce type de conditionnement. Il existe

cependant une différence de poids entre les effets produits par les lésions respectives de ces

deux structures. Cette différence concerne la spécificité du déficit. En effet les lésions du

CPFm induisent une diminution de la RC indépendamment de la présence ou de l’absence de

l’intervalle de Trace, alors qu’à l’inverse la lésion du CE n’est délétère sur la RC au son que

pour des rats conditionnés en Trace.

De plus, l’effet sur la RC de Trace de lésions du CE apparaît quantitativement bien

plus important que celui induit par la lésion du CPFm, ce qui indique que le CPFm pourrait

jouer un rôle assez général dans le contrôle de l’expression de la RC, alors que le cortex

entorhinal serait plus à même d’être impliqué dans la mémoire de travail codant le SC durant

le conditionnement.

L’effet des lésions du CE sur la RC des animaux conditionnés en Trace est observable

aussi bien au moment de la présentation du SC que durant la période qui suit son arrêt, ce qui

est concordant avec le mode d’action des cellules à activités persistantes qui commencent à

décharger dès la présentation du stimulus et qui continuent à émettre des décharges après

l’arrêt de ce dernier.

Néanmoins, notre approche lésionnelle pose un problème majeur étant donné qu’elle

ne permet pas de déterminer quelle phase du conditionnement est perturbée. De fait, selon

notre hypothèse, le mécanisme permettant le rétablissement de la contiguïté ne devrait être

indispensable que durant la phase d’acquisition puisqu’il permettrait la mise en place de

l’association entre SC et SI. La suite de nos travaux visera donc à déterminer si le CE est

effectivement impliqué durant l’acquisition, ainsi qu’à obtenir des indices suggérant

l’implication des neurones à activité persistante du CE dans le mécanisme de maintien de la

Trace et du rétablissement de la contiguïté.

CHAPITRE IV

Conditionnement de Trace et Trace persistante « Implication du système cholinergique du cortex

entorhinal lors du conditionnement de Trace »

CHAPITRE IV : INTRODUCTION

139

INTRODUCTION

Nous avons mis en évidence dans le précédent chapitre que le cortex entorhinal (CE)

semblait être un des acteurs majeurs permettant la mise en place du conditionnement de

Trace. L’hypothèse fonctionnelle que nous défendons pour rendre compte de cette implication

serait que le CE maintienne une représentation du SC en mémoire de travail. Dans ce chapitre,

nous allons tenter d’évaluer le rôle des activités cholinergiques au sein du CE lors de

l’acquisition du conditionnement de Trace, en nous basant sur le rôle essentiel de ce

neuromédiateur dans des processus tels que mémoire de travail, attention et traitement de la

nouveauté.

Dans le cadre du conditionnement de Trace, nous attachons une importance

particulière à l’existence, au sein du cortex entorhinal, de neurones capables de répondre de

façon persistante à la présentation d’un stimulus. Ces neurones pourraient constituer le

support de la Trace du SC et permettraient l’établissement d’une association entre SC et SI en

rétablissant la contiguïté mise en défaut dans le conditionnement de Trace. De plus,

l’activation cholinergique du CE serait l’un des facteurs critiques permettant le maintien de

ces activités persistantes. Ainsi, par des manipulations ciblées de l’activité cholinergique dans

cette région, nous évaluerons la possible implication d’un tel mécanisme dans le maintien de

la Trace.

I- Les neurones à activité persistante.

Les expériences visant à caractériser les propriétés électrophysiologiques sous-tendant

ces activités ont été effectuées in vitro sur le cerveau de rat (Egorov et coll., 2002). La couche

V du CE occupe une position particulièrement intéressante puisqu’elle est la cible de

nombreuses afférences corticales et émet de nombreuses projections vers l’hippocampe, dont

elle reçoit en retour des projections en provenance du Présubiculum (Wouterlood et coll.,

2004). Cette couche cellulaire comporte en outre d’importantes connexions bidirectionnelles

avec les noyaux de l’amygdale (Brothers et Finch, 1985; Pitkanen et coll., 1997). On observe

dans cette couche des neurones capables de répondre de manière prolongée dans le temps

après une stimulation ponctuelle (Egorov et coll., 2002). Des neurones à activité persistante


140

ont également été décrits dans les couches II et III du CE (Klink et Alonso, 1997; Tahvildari

et coll., 2007). Plusieurs propriétés des neurones à activité persistante présentent un grand

intérêt dans la perspective d’un rôle dans la mémoire de travail, notamment leur capacité à

répondre à des stimuli nouveaux, à soutenir une décharge pendant plusieurs minutes et à

intégrer des stimuli successifs (Hasselmo et Stern, 2006).

1) Caractérisation électrophysiologique.

Les neurones à activité persistante du CE présentent in vitro trois caractéristiques de

base. Premièrement, une impulsion dépolarisante va induire une brève décharge de potentiels

d’action à haute fréquence, qui va conduire à l’installation d’une décharge secondaire stable et

de plus basse fréquence constituant le niveau "persistant" à proprement parler.

Deuxièmement, chaque présentation successive du même stimulus va induire une

augmentation graduelle de la fréquence de la décharge persistante jusqu’à atteindre un niveau

plateau d’environ 12 Hz. Enfin, troisièmement, un stimulus hyperpolarisant peut induire une

diminution transitoire de la fréquence de décharge, chaque hyperpolarisation conduisant à une

fréquence plus basse que la précédente jusqu’à conduire à un arrêt de la décharge (Figure IV-

1). Ces décharges persistantes sont dépendantes de l’activation d’un courant cationique non

spécifique sensible au calcium (Fransen et coll., 2006).

2) Caractérisation pharmacologique.

Quelques études ont démontré une importante caractéristique pharmacologique des

neurones des couches II, III et V du CE, manifestant une activité persistante après une seule

stimulation (Klink et Alonso, 1997; Egorov et coll., 2002; Tahvildari et coll., 2007; Yoshida

et coll., 2008). En effet, toutes ces activités dépendent d’une activation cholinergique. Ce

n’est qu’en présence d’un agoniste cholinergique (le carbachol) en perfusion continue dans la

solution physiologique qu’une stimulation induit des activités prolongées. L’acétylcholine

joue en fait un simple rôle permissif sur ces activités puisque la stimulation par le carbachol

n’est pas capable à elle seule de les déclencher.


141

De plus, l’action de l’acétylcholine sur ces activités passe par des récepteurs

muscariniques. En effet, un antagoniste muscarinique non spécifique, l’atropine, supprime la

phase persistante du signal. En outre, un antagoniste spécifique des récepteurs muscariniques

de type M1, la pirenzépine, induit les même effets que l’atropine ce qui indique que ce sous-

type de récepteurs est prépondérant dans ce processus (Egorov et coll., 2002).

Par ailleurs, une autre classe de neurones dans la couche III du CE semble également

capable de présenter des activités persistantes, mais celle-ci ne sont pas sensibles à l’atropine.

Ces neurones ne seraient pas sous dépendance cholinergique mais glutamatergique et

nécessiteraient une stimulation tonique des récepteur métabotropiques au glutamate de type I

(mGluR I) pour permettre le maintien de l’activité induite par une stimulation (Yoshida et

coll., 2008).

A

B

Figure IV- 1: Activités persistantes enregistrées in vitro dans le cortex entorhinal de rats en présence de carbachol. A : une stimulation répétée sous la forme d’une dépolarisation de 4 s déclenche une décharge maintenue et une augmentation de la fréquence de cette décharge au fur et à mesure des stimulations. B : une hyperpolarisation de répétée de 6 s induit une diminution graduelle de la fréquence de décharge au fur et à mesure des répétitions jusqu’à induire l’arrêt total de la persistance. (Adapté de Egorov et coll., 2002).


142

II- Système cholinergique du cortex entorhinal.

1) Neuroanatomie du système cholinergique entorhinal.

Une part importante des afférences cholinergiques du cortex entorhinal proviennent du

complexe septum médian (SM) / Bande diagonale de Broca (BDB) (Alonso et Kohler, 1984;

Milner et Amaral, 1984), ce qui le différencie d’autres régions corticales principalement

innervées par le Noyau Basal de Meynert (Mesulam et coll., 1983). Le complexe MS/BDB est

un des principaux points d’origine du réseau cholinergique cérébral, et projette

essentiellement sur les régions hippocampiques, mais aussi sur le cortex cingulaire. Ces

projections sont organisées de telle sorte que les cellules de la partie horizontale de la BDB

projettent préférentiellement sur le CEL alors que le SM et la partie la plus verticale de la

BDB projettent préférentiellement sur le CEM (Alonso et Kohler, 1984; Milner et Amaral,

1984) figures (IV-2).

CPF

SM

BDB

BHB

BM

Amg

CE

Thalamus

HPC

PP

Figure IV-2 : Représentation schématique des neurones cholinergiques et de leurs projections dans le cerveau de rats. En rouge : neurones issus du complexe Septum médian/bande de Broca. En bleu : neurones issus du noyau basal de Meynert. En vert : neurones issus du noyau Pédonculo-pontin Latéro-dorsal. Abréviations : Amg, amygdale ; BDB, bande diagonale de Broca ; BHB, bande horizontale de Broca ; BM, noyau basal de Meynert ; CE, cortex entorhinal ; CPF, cortex préfrontal ; HPC, hippocampe ; PP, noyau Pédonculo-pontin Latéro-dorsal. Adapté d’Everitt et Robbins (1997).


143

2) Rappel des modes d’action et de la pharmacologie de l’acétylcholine.

L’acétylcholine est synthétisée au niveau des terminaisons axonales à partir de la

choline et l’acétylcoenzyme A (Acétyl-CoA). Cette réaction de synthèse est catalysée par

l’enzyme cytoplasmique, choline acétyl-transférase (ChAT) qui est synthétisée au niveau du

corps cellulaire et apportée au niveau des terminaisons axonales par transport axonal

antérograde. La localisation de la ChAT dans le corps cellulaire et tout le long de l’axone

jusqu’aux terminaisons en fait donc un marqueur de choix des fibres cholinergiques. Une fois

libérée sous l’effet d’une dépolarisation membranaire, l’acétylcholine va se fixer sur ses

récepteurs puis être dégradée. L’enzyme de dégradation de l’acétylcholine est

l’Acétylcholinestérase (AchE). Les inhibiteurs de l’AchE, tel que le donépézil, sont à l’heure

actuelle un des traitements majeurs des démences séniles (Birks et Harvey, 2003). Il a de plus

été montré qu’une inhibition de l’AchE était en mesure d’induire chez le rongeur des

augmentations des performances dans des tâches faisant appel à la mémoire spatiale (Wise et

coll., 2007) ou à la mémoire de travail (Zhi et coll., 1995).

L’action de l’acétylcholine sur les performances cognitive pourrait passer par plusieurs

types de récepteurs différents. Il existe effectivement deux classes de récepteurs à

l’acétylcholine, les récepteurs nicotiniques qui sont des récepteurs ionotropiques et les

récepteurs muscariniques qui sont des récepteurs métabotropiques couplés à la protéine G. Il

existe plusieurs sous-types de récepteurs pour chacune de ces classes. Les récepteurs M1 sont

les récepteurs métabotropiques prédominants au niveau hippocampique, cortical et dans

l’amygdale (Wei et coll., 1994; Moreira et coll., 2003) et leur localisation sur le corps

cellulaire et les dendrites serait cohérente avec l’idée qu’ils constitueraient le récepteur

muscarinique postsynaptique excitateur majeur au niveau du système nerveux central (Levey

et coll., 1991). Il a de plus été montré que l’injection d’antagonistes sélectifs des récepteurs

M1 tel que la pirenzépine induisait des déficits dans des tâches d’évitement passif (Ohnuki et

Nomura, 1996) ou de mémoire de travail (Wall et Messier, 2002), soulignant l’implication de

ce récepteur dans la fonction mnésique et le maintien d’informations.

Par ailleurs, la plupart des neurones cholinergiques expriment à leur surface le

récepteur aux neurotrophines p75NTR. L’expression de ce récepteur est hautement co-localisée


144

avec la présence de la ChAT (Pioro et Cuello, 1990). Cette propriété a conduit au

développement d’une toxine très spécifique, la 192-IgG-Saporine (SAP). La SAP est une

toxine (saporine) couplée à un anticorps monoclonal de souris dirigé contre les récepteurs

p75NTR du rat. Une fois administré, le complexe 192-IgG-Saporine va se fixer sur les

récepteurs aux neurotrophines p75NTR et être internalisé dans la cellule. La saporine est alors

dissociée de l’anticorps et inactive les ribosomes, et l’inhibition de la synthèse protéique ainsi

induite aboutit à la mort de la cellule. Seules les cellules exprimant le récepteur p75NTR vont

être affectées. La 192-IgG-Saporine est extrêmement efficace quand elle est injectée dans les

structures d’origine des projections cholinergiques, mais elle peut également être utilisée pour

effectuer une déafférentation locale au niveau d’une structure cible de ces afférences (de

Lacalle et coll., 1998; McGaughy et coll., 2005).

3) Voie cholinergique septo-hippocampique et fonctions cognitives.

a) Effets généraux des manipulations cholinergiques

L’acétylcholine est connue depuis de nombreuses années pour être un des

neurotransmetteurs fortement impliqué dans de multiples fonctions cognitives, incluant en

particulier les fonctions attentionnelles et la mémoire à court-terme (Everitt et Robbins,

1997). Il est maintenant bien admis qu’un des facteurs majeurs de l’apparition des démences

séniles, qu’elles soient d’ordre pathologique (maladie d’Alzheimer) ou non, reposerait en

grande partie sur des troubles de la neurotransmission cholinergique (Bartus et coll., 1982;

Robbins et coll., 1997). De plus, un grand nombre de données expérimentales montrent l’effet

délétère d’injections systémiques ou intracérébrales de drogues perturbant spécifiquement la

neurotransmission cholinergique, telles que la scopolamine, sur les apprentissages et la

mémoire, par exemple dans des tâches d’apprentissage associatif (Anagnostaras et coll., 1999)

(Calandreau et coll., 2006), de discrimination (Turchi et coll., 2008) ou des tâches à

composante spatiale (Bymaster et coll., 1993).

Une des difficultés pour interpréter ces résultats reste que des injections systémiques

sont susceptibles d’agir sur la plupart des composantes du système cholinergique, comme les

projections cholinergiques sur l’amygdale ou le thalamus, qui peuvent affecter le niveau

d’éveil ou de réactivité émotionnelle du sujet (Everitt et Robbins, 1997), ou la voie basalo-


145

corticale qui prend son origine dans le noyau basal de Meynert et serait largement impliquée

dans les aspects attentionnels du fonctionnement cognitif. Ainsi il a par exemple été montré

qu’une déafférentation cholinergique du cortex préfrontal augmentait la sensibilité des

animaux à des distracteurs durant une tâche d’attention soutenue (Newman et McGaughy,

2008).

Dans des tâches de mémoire de travail telles que des tâches de réponse différée, un

critère important est l’obtention d’un déficit dépendant du délai. Ainsi, une injection

systémique d’un antagoniste cholinergique muscarinique induit une réduction des

performances dans une tâche de reconnaissance après délai de rétention, sans perturber les

performances dans cette même tâche avec un délai de rétention de 0 s (Bartus et Johnson,

1976; Penetar et McDonough, 1983). Cette spécificité est importante puisque la présence d’un

déficit en l’absence de délai de rétention indiquerait un problème attentionnel, perceptif ou

d’exécution de la réponse.

Dans le cadre de la peur conditionnée, il a été montré que des injections systémiques

de scopolamine avant l’apprentissage réduisaient l’acquisition de la peur contextuelle à des

doses qui n’affectaient pas le conditionnement de Délai à un son, les mêmes injections

réalisées après l’acquisition se révélant sans effet (Anagnostaras et coll., 1995; Anagnostaras

et coll., 1999). Le rôle de la projection cholinergique septo-hippocampique dans ces effets

contextuels semble essentiel, puisqu’il a été montré que des infusions locales de scopolamine

dans l’hippocampe dorsal bloquent l’acquisition de la peur contextuelle (Gale et coll., 2001;

Wallenstein et Vago, 2001).

Le conditionnement de Trace de la membrane nictitante (Kaneko et Thompson, 1997)

ou d’une réponse appétitive (Seager et coll., 1999) est également affecté par des injections

systémiques de scopolamine. Chez des rats juvéniles, la scopolamine affecte spécifiquement

l’acquisition d’un conditionnement de peur de Trace, tout en étant sans effet sur un

conditionnement de Délai « long» respectant le même intervalle entre le début du SC et le SI

(Hunt et coll., 2006; Hunt et Richardson, 2007).


146

A l’inverse, l’injection de drogues pro-cholinergiques comme les inhibiteurs de

l’acétylcholinestérase (métrifonate, physostigmine) peuvent atténuer des déficits mnésiques

en augmentant la durée d’action et la quantité d’acétylcholine présente au niveau synaptique

(Fibiger, 1991; Mohammed, 1993). Chez les lapins âgés, le métrifonate facilite l’acquisition

du conditionnement de Trace de la membrane nictitante (Disterhoft et coll., 1999), un effet

qui semble médié par des récepteurs muscariniques car bloqué par l’atropine. De manière

analogue, chez des rats trop jeunes (25 jours) pour présenter un conditionnement de Trace en

peur conditionnée, la physostigmine facilite l’acquisition de ce conditionnement (Hunt et

Richardson, 2007).

b) Effets spécifiques au système septo-hippocampique

Des injections pharmacologiques peuvent être également effectuées de façon locale.

On dispose toutefois de peu d’information sur le rôle de la modulation cholinergique dans le

cortex entorhinal dans des tâches nécessitant le maintien à court-terme d’informations, telles

que par exemple les tâches reconnaissance différée chez le singe. Il a néanmoins été montré

qu’une injection de scopolamine dans le cortex périrhinal avec une large diffusion dans le

cortex entorhinal induit un déficit de réponse dans la tâche de reconnaissance similaire à celui

observé après les injections systémiques, alors que des injections comparables dans des

structures adjacentes n’induisent pas de déficit (Tang et coll., 1997).

L’étude du système cholinergique a été grandement facilitée par des techniques de

déafférentation sélectives qui consistent à léser les corps cellulaires des structures d’origine de

projections cholinergiques, soit par l’AMPA qui induit des lésions excitotoxiques, soit par

l’immunotoxine 192-IgG-saporine. Ces lésions peuvent être relativement sélectives, puisque

par exemple les lésions du septum médian et de la BDB peuvent produire des effets

comportementaux dissociables dans une tâche de mémoire de travail spatiale (McAlonan et

coll., 1995a). Les mêmes auteurs ont montré que ces lésions des projections septo-

hippocampiques avaient des effets opposés sur la peur conditionnée au contexte et en

conditionnement de Trace, facilitant la première et atténuant fortement la seconde pour des

intervalles de Trace longs (30 s) (McAlonan et coll., 1995b). Les auteurs spéculaient que,

dans l’hippocampe, l’acétylcholine pourrait comme dans le néocortex prolonger les réponses


147

à des stimuli sensoriels variés, mais cette idée n’a pas reçu à l’heure actuelle de confirmation

expérimentale.

Enfin, une technique spécifique de déafférentation cholinergique du cortex entorhinal

a été proposée, par injection locale de 192-IgG-saporine directement au niveau de cette

structure cible (de Lacalle et coll., 1998; McGaughy et coll., 2005). Chez les rats lors d’une

tâche de reconnaissance différée, cette déafférentation induit un déficit de réponse mais

uniquement dans le cas où le stimulus à reconnaître est nouveau pour l’animal, alors qu’aucun

déficit n’est observé avec un stimulus familier (McGaughy et coll., 2005). Il est important de

remarquer que les auteurs de cette étude mettent en relation le déficit induit par la

déafférentation et une implication probable des activités persistantes dans le maintien de la

représentation du stimulus, nécessaire pour résoudre la tâche.


Les expériences effectuées au cours de ce chapitre visent, en évaluant le rôle des

activités cholinergiques au sein du CE lors de l’acquisition du conditionnement de Trace, à

établir un lien entre les neurones à activités persistantes du CE et ce conditionnement. Pour

cela, nous avons tenté de répliquer in vivo des manipulations de l’activité cholinergique qui

bloquent in vitro les activités persistantes. Ainsi, si le conditionnement de Trace repose sur la

présence de ces activités persistantes, alors perturber ces activités devrait rendre les animaux

incapables de se conditionner en Trace.

Nous avons ainsi dans un premier temps réalisé une déafférentation cholinergique du

CE par injection de 192 IgG-Saporine directement au niveau de cette structure. Dans un

second temps nous avons tenté d’intervenir plus précisément sur les récepteurs à

l’acétylcholine de type M1 qui semblent être essentiels aux activités persistantes. Pour cela,

nous avons effectué des injections d’un antagoniste sélectif de ce sous-type de récepteur, la

pirenzépine, préalablement à la phase de conditionnement, et recherché si le conditionnement

de Trace présentait un déficit sélectif qui n’affecterait pas le conditionnement de Délai. Enfin,

une de nos hypothèses étant que la présence des activités persistantes permet de restaurer la

contiguïté durant la phase de conditionnement, nous avons voulu confirmer que les activités

persistantes n’étaient nécessaires que durant l’acquisition. Pour cela, nous avons donc effectué


148

des injections de pirenzépine dans le cortex entorhinal immédiatement après le


CHAPITRE IV : EXPERIENCE 1

149

Expérience 1 :

Déafférentation cholinergique du cortex entorhinal.

Cette expérience vise à mettre en évidence l’implication spécifique de la transmission

cholinergique au niveau du cortex entorhinal lors du conditionnement de Trace. Pour cela

nous allons effectuer une déafférentation cholinergique de cette structure par injection de 192-

IgG-Saporine et comparer l’effet de cette déafférentation sur la RC d’animaux conditionnés

en Trace ou en Délai.



L’expérience a été réalisée sur 41 rats mâles de la souche Long-Evans. Les conditions

d’élevage et le dispositif expérimental sont identiques à ceux décrits dans les chapitres

précédents.

2) Chirurgie.

Les déafférentations cholinergiques du cortex entorhinal sont effectuées par des

injections effectuées en 7 sites par côté de 192-IgG-Saporine (Advanced Targeting Systems,

San Diego, USA). Dans le cas présent, les injections sont effectuées directement dans le

cortex entorhinal. Nous avons choisi d’injecter dans cette région où se trouvent les

terminaisons afférentes plutôt qu’au niveau des corps cellulaires afin d’obtenir une

déafférentation spécifique du CE en préservant largement le reste des projections

cholinergiques en particulier vers l’hippocampe et le néocortex. Quelques travaux montrent

que la 192-IgG-Saporine est effectivement capable d’agir au niveau des terminaisons

cholinergiques du CE en produisant une dégénérescence massive des fibres correspondantes,

mais en laissant intacts une grande proportion des neurones de la région du Septum

médian/Bande diagonale de Broca (de Lacalle et coll., 1998; McGaughy et coll., 2005).


150

Préalablement à l’opération, les rats sont soumis à une anesthésie gazeuse à

l’isoflurane (4%) dans une chambre d’induction. Quatre minutes après le début de l’induction

les animaux sont sortis de la chambre d’induction et fixés sur le cadre stéréotaxique où

l’anesthésie est maintenue via un masque (Kopf modèle 929-B) permettant de faire circuler le

mélange air/isoflurane tout en aspirant le gaz en excès ainsi que le CO2 rejeté par l’animal

(concentration en isoflurane pour le maintien de l’anesthésie : 2%). La tête des rats est tondue

puis la peau du crâne est désinfectée, anesthésiée par nébulisation de lidocaïne (xylocaïne®)

et enfin incisée longitudinalement. L’os est mis à nu ce qui permet de relever les coordonnées

du Bregma et du Lambda et ainsi vérifier la bonne horizontalité de la tête de l’animal. Deux

fenêtres d’environ 5 mm de côté sont ouvertes bilatéralement dans le crâne au moyen d’une

fraise dentaire.

Les micro-injections de 192-IgG-saporine ( en solution dans du tampon phosphate)

sont pratiquées au moyen d’une micro-pipette en verre d’environ 100 µm de diamètre fixée

sur le bras du cadre stéréotaxique et reliée via un cathéter à un micro-injecteur d’air

(Picospritzer) permettant un contrôle précis du volume injecté. Les coordonnées des sites

d’injections sont calculées conformément au tableau IV-1. La coordonnée 0 dorso-ventrale est

prise directement sur la dure-mère pour chaque point d’injection, alors que les coordonnées 0

latérales et antéro-postérieures sont prises au niveau du Bregma. La micro-pipette est

descendue en chaque point d’injection et le volume de 192-IgG-saporine correspondant à ce

point est injecté en 30 s environ. La pipette est laissée en place entre 2 et 5 minutes en

fonction du site afin de permettre au produit de diffuser et d’éviter la remontée de celui-ci lors

du retrait de la pipette. La peau du crâne est finalement suturée et traitée à la chlorhexidine

(exoseptoplix®).

Chez les animaux témoins, le protocole est exactement le même excepté que seul le

véhicule constitué d’un tampon phosphate (TP) est injecté.

Après l’opération, l’animal est replacé dans sa cage d’élevage dans une salle de réveil

chauffée pour éviter une hypothermie pouvant faire suite à l’anesthésie. Après une nuit passée

en salle de réveil, les animaux sont ramenés dans l’animalerie puis il leur est laissé au moins

deux semaines de récupération durant laquelle ils sont régulièrement contrôlés.


151


-6,1 ±5,8 -6,9 0,1µl (2min)

-6,5 ±4,7 -7,4 0,05µl (1min)

±4,5 -6,6 0,1µl (1min) -7,0

±5,8 -5,8 0,15 µl (2min)

-7,5 ±4,6 -5,8 0,2 µl (5min)

-8,0 ±4,7 -5,3 0,2 µl (5min)

-8,5 ±4,8 -3,6 0,2 µl (5min)

3) Histologie et immunohistochimie.

Les animaux sont sacrifiés après le test au son en vue de la vérification de la

déafférentation cholinergique par marquage immunohistochimique de la choline acétyl-

transférase (ChaT). Ce marquage immunohistochimique va ainsi mettre en évidence la

présence ou l’absence de fibres cholinergiques dans la région d’intérêt. Les rats sont

anesthésiés par injection intra-péritonéale de Pentobarbital sodique (Ceva, Santé Animale)

1 ml/300 g, puis perfusés avec 160 ml de solution saline (0,9%) suivi de 300 ml de

paraformaldéhyde (4% dans tampon phosphate 0,1 M (TP), pH 7,4) à l’aide d’une pompe à

perfusion intra-cardiaque. Les cerveaux sont ensuite prélevés et mis à agiter durant une

journée à 4 -C dans des piluliers individuels contenant du liquide de fixation identique à celui

utilisé lors de la perfusion. Les cerveaux sont ensuite placés dans une solution de saccharose

(30% dans du TP) durant une nuit afin de les protéger lors de la congélation. On effectue alors

des coupes sériées de 50 µm d’épaisseur au microtome à congélation. Les coupes sont

récupérées dans des boîtes à 6 puits dans du TP. Pour le marquage immunohistochimique, les

coupes sont rincées dans du tampon phosphate 0,1 M et incubées durant 30 minutes dans une

solution de H2O2 (0,3 % dans du TP) afin de neutraliser les péroxydases endogènes. Les

coupes sont ensuite rincées avec du TP et mises à incuber dans une solution de saturation

Tableau IV-1 : Localisation des sites d’injections et volumes de 192-IgG-Saporine injectés en chaque site afin de produire une déafférentation cholinergique du cortex entorhinal. La durée durant laquelle la micro-pipette est laissée en place après injection est notée entre parenthèses. AP : Antéro-Postérieur ; ML : Médio-Latéral ; DV : Dorso-Ventral.


152

durant 60 minutes à température ambiante. La solution de saturation (TP ; BSA 0,1% ; Triton

X-100 0,2% ; Sérum d’âne 2%) va saturer l’ensemble des sites de liaison non spécifiques des

anticorps utilisés et ainsi réduire le bruit de fond du marquage. Après rinçage au TP, les

coupes sont mises à incuber durant une nuit à température ambiante et sous agitation dans une

solution contenant l’anticorps polyclonal primaire : anticorps anti-ChaT fabriqué chez la

chèvre (Chemicon International) et dilué à 1 :1000 dans la solution de saturation. Les coupes

sont ensuite rincées avec du TP et mise à incuber sous agitation à température ambiante

durant 120 minutes dans une solution contenant l’anticorps secondaire biotinylé dirigé contre

les anticorps de chèvre (1 :2000 dans solution de saturation). Après rinçage les coupes sont

incubées en présence d’un Complexe Avidine-Biotine-Peroxydase (Vectastain Elite Kit ;

Vector Laboratories) dans la solution de saturation. Après rinçage, l’activité Peroxydase est

révélée par un chromogène (3,3’-diamino-benzidine) dissous dans du tampon TRIS en

présence d’H2O2 (4 µl/200 ml) pendant environ 15 minutes. La réaction colorimétrique est

stoppée par rinçage au TP à 4 -C. Les coupes sont ensuite montées sur lames gélatinées,

déshydratées, incluses dans de la résine (Eukitt ®) et montées sous lamelles pour examen sous

microscope.

4) Procédure comportementale et statistiques.

La procédure comportementale et l’analyse statistique sont identiques à celles mises en

œuvre dans les chapitres précédents. Une analyse de variance (ANOVA) à deux facteurs est

utilisée pour traiter l’ensemble des données avec pour facteurs le protocole de

conditionnement utilisé (D ou T30) ainsi que le traitement effectué (TP ou SAP).

II- Résultats.

1) Déafférentation du CE.

La toxine 192-IgG-Saporine (SAP) a été injectée directement dans le CE afin d’induire

une perte des terminaisons cholinergique dans cette région. Après vérification

immunohistochimique, les 20 animaux ayant reçu l’injection de SAP ont été conservés pour


153

l’analyse. Deux rats des groupes T30/SAP et T30/TP ont été exclus pour cause de RC non

spécifique (plus de 50 % de RC au contexte modifié). Les effectifs respectifs de chaque

groupe étaient donc les suivants : D/SAP (n=10), T30/SAP (n=10), D/TP (n=10) et T30/TP

(n=9).

Les rats ayant reçu la déafférentation cholinergique du CE présentent une forte

diminution de la quantité de fibres cholinergiques dans le CE (Figure IV- 3) alors que les

fibres des autres cortex semblent préservées. Dans l’hippocampe, il est difficile d’évaluer

l’existence d’une réduction des fibres cholinergiques étant donné le peu de marquage ChaT

observé dans cette région chez les animaux témoins dans nos conditions expérimentales. A

l’inverse, la densité de marquage dans la région du Septum médian/BDB reste très importante

y compris chez les animaux lésés. Dans le CE, on doit enfin noter la présence d’un marquage

ChaT dans le soma de certaines cellules (probablement des interneurones cholinergiques) qui

ne semblent pas affectées par l’injection de SAP, ce que d’autres auteurs avaient déjà observé

(de Lacalle et coll., 1998).

2) Acquisition.

La RC des rats déafférentés et témoins après administration des chocs est présentée sur

la figure IV-4A. Lors de la session de conditionnement, l’ensemble des rats témoins acquiert

une RC. Les animaux des groupes déafférentés présentent eux aussi une augmentation de la

RC au fur et à mesure des essais qui semble légèrement atténuée. Les groupes de rats

conditionnés avec un protocole de Trace montrent une RC légèrement plus faible que les

groupes Délai. Toutefois l’ANOVA sur les taux de RC post-choc ne met en évidence aucun

effet significatif, que cela soit du protocole de conditionnement (F(1,36)=0,92, p>0,1), de la

déafférentation cholinergique (F(1,36)=2,93, p>0,05), ou l’interaction entre ces deux facteurs

(F(1, 36)=0,002, p>0,1).


154

TEMOIN TP 192‐IgG‐Saporine

‐7,04

3) RC au contexte.

La RC des animaux déafférentés et témoins durant le test de peur associée au contexte

est présentée sur la figure IV-4B. Les animaux du groupe T30/TP présentent une forte RC au

contexte alors que ceux du groupe D/TP ont une RC plus faible. La déafférentation du CE

semble induire une augmentation de cette RC chez les animaux conditionnés avec un

protocole de Délai et être sans effet chez les animaux conditionnés en Trace. Cependant

l’ANOVA ne met en évidence aucun effet significatif que cela soit du protocole (F(1,36)=0,04,

p>0,1) de la déafférentation (F(1,36)=0,56, p>0,1), ou l’interaction entre ces deux facteurs

(F(1,36)=2,02, p>0,05).

Figure IV-3 : Déafférentation cholinergique du CE par injection de 192-IgG-saporine. Microphotographies prises dans la région du CE schématisée par un rectangle sur le diagramme, sur une coupe effectuée 7.4 mm en arrière du Bregma. La coupe témoin (à gauche) d’un rat ayant reçu le véhicule (TP) présente de nombreuses fibres et terminaisons immunoréactives à la ChAT. Le cortex d’un rat traité (à droite) montre une importante réduction de ce marquage. Les interneurones (flêches) semblent préservés.


155

% RC

0

20

40

60

80

100


D/TPD/SAPT30/TPT30/SAP

0

20

40

60

80

100

D T30

TP

SAP

A B

4) RC au son.

La RC des animaux déafférentés et témoins durant la présentation du son en fonction

du protocole de conditionnement est présentée sur les figures IV-5A et C. La RC manifestée

par les rats en présence du contexte modifié est négligeable pour l’ensemble des groupes.

Durant la présentation du son, une forte RC apparaît chez les animaux témoins, plus forte

pour les animaux conditionnés avec un protocole de délai que pour ceux conditionnés avec un

protocole de trace. La déafférentation cholinergique du cortex entorhinal semble sans effet sur

cette réponse quel que soit le protocole de conditionnement utilisé. Ces constatations sont

appuyées par l’ANOVA qui indique un effet significatif du protocole de conditionnement

(F(1,36)=10,68, p<0,005) mais pas de la déafférentation (F(1,36)=0,015, p>0,1) ni d’interaction

entre ces deux facteurs (F(1,36)=0,63, p>0,1).


La RC des animaux déafférentés et témoins durant l’intervalle de trace en fonction du

protocole de conditionnement est présentée sur les figures IV-5B et C. Les animaux des

groupes témoins présentent une forte RC durant les 30 s suivant la présentation du son, qui

semble plus faible chez les animaux conditionnés en Trace qu’en Délai. La déafférentation

cholinergique du cortex entorhinal apparaît sans effet sur cette réponse comme sur la réponse

pendant le son, quel que soit le protocole de conditionnement utilisé. Ces constatations sont

Figure IV- 4 : Pourcentage de RC et erreur standard en fonction du protocole de conditionnement dans l’expérience 1. A : Durant le conditionnement. Evolution au cours des essais de la RC au cours de la minute suivant la fin du choc. B : Durant le test au contexte (moyenne des 5 minutes de test). D : protocole de Délai ; T30 : protocole de Trace 30 s ; SAP : animaux déafférentés ; TP : animaux témoins.


156

appuyées par l’ANOVA qui indique un effet significatif du protocole de conditionnement

(F(1,36)=5,91, p<0,05) mais pas de la déafférentation (F(1,36)=2,72, p>0,05) ni d’interaction

entre ces deux facteurs (F(1,36)=0,003, p>0,1).

0

20

40

60

80

100


D/TPD/SAPT30/TPT30/SAP

0

20

40

60

80

100

D T30

TP

SAP

0

20

40

60

80

100

D T30

A B

C

%RC

%RC

Figure IV-5 : Pourcentage de RC et erreur standard lors du test au son dans l’expérience 1. A : Moyenne des trois présentations de 10 s du SC. B : Moyenne des 30 secondes faisant suite aux 3 présentations du SC. C : Durant les 5 minutes de test au contexte modifié (CX MOD) et cinétique de la RC lors de la présentation du son, moyennée sur trois essais. PRE-SC : Bloc de 10 s précédant le son ; SC : Présentation du son ; POST 10 à POST 50 : Blocs de 10 s suivant la fin du son.

Cette expérience montre que, contrairement à nos attentes, la déafférentation

cholinergique du cortex entorhinal effectuée préalablement au conditionnement est

sans effet sur le conditionnement de Trace.

Il faut cependant noter que l’injection de 192-IgG-Saporine semble laisser

intacts certains interneurones cholinergique du CE.


157

Expérience 2:

Blocage des récepteurs muscariniques M1 du CE par la

pirenzépine durant le conditionnement.

La déaférentation cholinergique du CE peut-être seulement partielle n’ayant pas

permis de perturber le conditionnement de Trace, nous nous sommes fixés pour but dans cette

expérience de bloquer de manière plus complète le type particulier de récepteurs

cholinergiques muscariniques impliqué dans le maintien des activités persistantes in vitro

(Egorov et coll., 2002). Pour cela, un antagoniste sélectif des récepteurs muscariniques de

type M1, la pirenzépine, va être injecté dans le CE préalablement à la séance de

conditionnement. Notre hypothèse est que le blocage des activités persistantes ainsi obtenu

devrait perturber sélectivement le conditionnement de Trace mais être sans effet en condition

de Délai.

I- Matériel et méthodes

1) Sujets.

L’expérience à été réalisées sur 54 rats mâles de la souche Long-Evans. Le dispositif

expérimental ainsi que les procédures de conditionnement et de test sont identiques à celles

décrites dans l’expérience 1 de ce chapitre.

2) Chirurgie et injection des drogues.

Les implantations bilatérales de guide-canules sont comparables à celles effectuées

pour les implantations dans l’hippocampe ventral lors de l’expérience 2 du chapitre 2, à

l’exception des coordonnées. Les coordonnées d’implantation utilisées pour cette région sont :

AP : -7,5; L : +/- 5,5; V : -6,5.


158

Le jour du conditionnement, une fois le rat mis en contention, les canules sont insérées

bilatéralement dans les guide-canules et délivrent chacune le même volume (0,3 µl) de

Pirenzépine. Pour cette étude deux concentrations de pirenzépine de 10 mg/ml (PIR 10) et 15

mg/ml (PIR 15) ont été utilisées. La pirenzépine est solubilisée dans du liquide céphalo-

rachidien artificiel (LCRa) qui est injecté seul et à volume identique chez les groupes témoins.

Après la fin de l’injection, les canules sont laissées en place durant 165 s. Le conditionnement

commence 20 minutes après le début de l’injection.

2) Histologie.

Les marquages et contrôles histologiques des implantations sont effectués de façon

identique à celle décrite pour l’expérience 1 du chapitre II.


Le traitement des données est identique à celui décrit dans l’expérience 1 de ce

chapitre. Les données des six groupes de rats sont soumises à des ANOVA ayant pour facteur

de comparaison entre sujets, le traitement (PIR 10, PIR 15 ou LCRa) et le protocole de

conditionnement (Délai ou Trace).

II- Résultats.

1) Contrôles histologiques.

Après vérification histologique des sites d’injection (figure IV-6), les effectifs retenus

dans chaque groupe étaient les suivants : D/PIR 15 (n=8), T30/PIR 15 (n=9), D/PIR 10 (n=9),

T30/PIR 10 (n=7), D/LCRa (n=8), T30/LCRa (n=8).


159

2) Acquisition.

Les figures IV-7A et B présentent la RC des rats après administration des chocs en

fonction du protocole de conditionnement et de la dose de pirenzépine injectée. Lors de la

session de conditionnement, l’ensemble des rats témoins acquiert une RC. Les animaux des

groupes ayant reçu de la pirenzépine présentent une augmentation de la RC au fur et à mesure

des essais comparable à celle observée chez témoins, indépendamment du protocole de

conditionnement et de la dose de pirenzépine injectée. L’ANOVA effectuée sur ces taux de

RC post-choc ne détecte pas d’effet du protocole de conditionnement (F(1,43)=0,29, p>0,1) ni

du traitement (F(2,43)=0,058 p>0,1) ou d’interaction entre ces deux facteurs (F(2, 43)=0,76,

p>0,1).

‐7,04

‐7,60

‐8,00

‐8,30

P15 P10 LCRa

3) RC au contexte.

La RC des animaux durant le test de peur associée au contexte est présentée sur la

figure 7C en fonction du protocole de conditionnement et de la dose de pirenzépine. Les

animaux témoins présentent une très faible RC en présence du contexte de conditionnement,

Figure IV-6 : Localisation de l’ensemble des sites d’injection dans le cortex entorhinal. A gauche : Sites d’injection de la pirenzépine à 15 mg/ml ; Au centre : sites d’injection de la pirenzépine à 10 mg/ml ; A droite : Sites d’injection du LCRa. Diagrammes adaptés de Paxinos & Watson 1998, avec les distances au Bregma indiquées en millimètres.


160

et cela même quand ils ont été conditionnés avec un protocole de Trace. Cette RC ne semble

affectée ni par le protocole, ni par le traitement. L’ANOVA effectuée sur cette RC ne détecte

pas d’effet du protocole de conditionnement (F(1,43)=0,45, p>0,1), ni du traitement (F(2,43)=0,31

p>0,1), ni d’interaction entre ces deux facteurs (F(2, 43)=0,70, p>0,1). Ces observations ne

peuvent toutefois pas être considérées comme concluantes étant donné le très faible niveau de

réponse des animaux témoins.

0

20

40

60

80

100


D/LCRaD/P10D/P15

0

20

40

60

80

100


T30/LCRaT30/P10T30/P15

0

20

40

60

80

100

D T30

LCRa

P10

P15

% RC

% RC

B

A

C

4) RC au son.

La RC des animaux durant la présentation du son en fonction du protocole de

conditionnement et de la dose de pirenzépine est présentée sur les figures 8A et C. En

présence du contexte modifié, la RC est négligeable pour l’ensemble des groupes. Durant la

présentation du son, une forte RC apparaît chez les animaux témoins injectés au LCRa. Cette

Figure IV-7: Pourcentage de RC et erreur standard en fonction du traitement et du protocole de conditionnement dans l’expérience 2. A,B : Durant le conditionnement. Evolution au cours des essais du pourcentage de réponse conditionnée (RC) au cours de la minute suivant la fin du choc en fonction de l’intervalle de Trace A : pour les animaux conditionnés en Délai. B : Pour les animaux conditionnés en Trace 30 s. C : Durant le test au contexte (moyenne des 5 minutes de test).


161

RC est plus forte pour les animaux conditionnés avec un protocole de délai que pour ceux

conditionnés avec un protocole de trace. L’injection de pirenzépine est sans effet pour les

groupes conditionnés avec un protocole de Délai, quelle que soit la dose injectée. A l’inverse,

pour les groupes conditionnés avec le protocole de Trace, la pirenzépine induit une

diminution de la RC lors de la présentation du son. Cette diminution est nette pour le groupe

ayant reçu la forte dose de pirenzépine (15mg/ml).


protocole de conditionnement (F(1,43)=24,50, p<0,0001) ainsi que du traitement (F(2,43)=3,50,

p<0,05), bien qu’il n’y ait pas d’interaction entre ces deux facteurs (F(2,43)=0.97, p>0,1).

L’ANOVA partielle effectuée sur ces données confirme que l’effet de l’injection de

pirenzépine est significatif uniquement pour les groupes conditionnés avec un protocole de

Trace (F(2,21)=4,51, p<0,05) et non pour les animaux conditionnés avec un protocole de Délai

(F(2,22)=0,75, p>0,1). De plus, le test post hoc SNK indique que seule la forte dose de

pirenzépine induit une diminution significative de la RC par rapport aux animaux ayant reçu

du LCRa.


La RC des animaux durant l’intervalle de trace en fonction du protocole de

conditionnement et de la dose de pirenzépine est présentée sur les figures 8B et C. Les

animaux des groupes témoins présentent une forte RC durant les 30 s suivant la présentation

du son quel que soit le protocole. L’injection de pirenzépine préalablement au

conditionnement semble sans effet pour les groupes conditionnés en Délai, quelle que soit la

dose injectée. A l’inverse, l’injection de la plus forte dose de pirenzépine semble induire un

déficit de RC durant les 30 s suivant l’arrêt du son chez les animaux conditionnés en trace,

comme il avait été observé pour la réponse durant le son. Toutefois, l’ANOVA ne permet pas

de mettre en évidence un effet significatif du protocole (F(1,43)=2,24, p>0,05), du traitement

(F(2,43)=1,91, p>0,05), ni d’interaction entre ces deux facteurs (F(2,43)=0,72, p>0,1).


162

A% RC

0

20

40

60

80

100

D T30

LCRa

P10

P15

*

0

20

40

60

80

100

D T30

0

20

40

60

80

100


D/LCRaD/P10D/P15

0

20

40

60

80

100


T30/LCRaT30/P10T30/P15

% RC

% RC

B

C

D

Figure IV-8 : Pourcentage de RC et erreur standard en fonction du traitement et du protocole de conditionnement lors du test au son. A : moyenne des trois présentations du SC. B : Moyenne des 30 secondes faisant suite aux 3 présentations du SC. C,D : Durant les 5 minutes de test au contexte modifié (CX MOD) et cinétique de la RC lors de la présentation du son, par blocs de 10 s, moyennée sur trois essais. C : pour les animaux conditionnés en Délai. D : Pour les animaux conditionnés en Trace 30 s.


163

Cette expérience montre que l’injection ciblée de pirenzépine dans le cortex

entorhinal immédiatement avant la phase de conditionnement atténue fortement la

RC d’un stimulus conditionné avec un protocole de Trace, sans avoir d’effet sur lors

du conditionnement de Délai.

En parallèle, le faible taux de RC au contexte exprimé par les animaux

témoins ne permet pas d’observer d’effet du traitement pharmacologique.


164

Expérience 3:

Blocage des récepteurs muscariniques M1 du CE par la

pirenzépine après le conditionnement.

Cette expérience a pour but de déterminer si les récepteurs M1 à l’acétylcholine sont

mobilisés durant la phase précoce de consolidation ou bien si, comme nous le pensons, la

mise en jeu de ces récepteurs n’est nécessaire que durant l’acquisition afin de permettre un

rétablissement de la contiguïté entre SC et SI par le biais des activités persistantes. Pour cela

nous avons effectué des injections dans le CE de pirenzépine immédiatement après la phase

de conditionnement à une dose dont nous avons pu voir précédemment qu’elle était efficace.

I- Matériel et méthodes

1) Sujets.

L’expérience a été réalisée sur 14 rats mâles de la souche Long-Evans.

2) Protocole expérimental.

Le dispositif expérimental ainsi que les procédures de conditionnement, de test,

d’implantation de guide-canules et de vérification histologique sont identiques à celles

décrites dans l’expérience 2 de ce chapitre.

Les injections de pirenzépine ou de LCRa sont effectuées immédiatement après la

phase de conditionnement contrairement à l’expérience 2 de ce chapitre.

Suite aux résultats de l’expérience 2 de ce chapitre, seule la dose de 15 mg/ml de

pirenzépine est utilisée et cela uniquement sur des animaux conditionnés en Trace. Nous

disposons donc de deux groupe d’animaux : un groupe conditionné en Trace et injecté avec du

liquide céphalo-rachidien artificiel (T30/LCRa) et un groupe conditionné en Trace et injecté

avec de la pirenzépine (T30/PIR 15).


165


Les données des deux groupes de rats sont soumises à des ANOVA à un seul facteur,

le traitement (PIR 15 ou LCRa).

II- Résultats.

Après vérification histologique, les performances comportementales de 14 animaux

correctement implantés et injectés ont été analysées. Les effectifs respectifs de chaque groupe

étaient donc les suivants : T30/PIR 15 (n=7), T30/LCRa (n=7).

1) RC au contexte.

L’injection de pirenzépine ayant lieu après le conditionnement, la RC durant cette

phase n’est pas présentée. La figure IV-9 présente la RC durant le test de peur associée au

contexte des animaux témoins ou traités à la pirenzépine après le conditionnement. Les

animaux témoins présentent une RC inférieure à 40% en présence du contexte de

conditionnement. Cette RC semble diminuée chez les animaux injectés avec de la pirenzépine

après la phase de conditionnement. Cependant l’ANOVA ne détecte qu’une tendance à l’effet

du traitement (F(1,12)=3,54, p=0,085).

0

20

40

60

80

100 LCRa

PIR 15

% RC

Figure IV-9 : Pourcentage de RC et erreur standard en fonction du traitement chez des rats conditionnés avec un protocole de Trace dans l’expérience 3 durant le test au contexte (moyenne des 5 minutes de test).


166

2) RC au son.

Les figures IV-10A et C présentent la RC durant la présentation du son des animaux

témoins ou traités à la pirenzépine après le conditionnement. La RC manifestée par les rats en

présence du contexte modifié est négligeable pour les deux groupes d’animaux. Les deux

groupes de rats présentent une réponse moyenne lors de la présentation du son et cette réponse

n’est pas altérée par le traitement à la pirenzépine. Cette constatation est appuyée par

l’ANOVA qui ne détecte aucun effet significatif du traitement (F(1,12)=0,04, p>0,1).

0

20

40

60

80

100


T30/LCRa

T30/P15

0

20

40

60

80

100LCRa

PIR 15

0

20

40

60

80

100A B

C

%RC

%RC


La RC des animaux durant l’intervalle de trace est présentée sur les figure IV-10B et

C. Les deux groupes de rats présentent une forte réponse après l’arrêt de la présentation du

son et cette réponse ne semble pas altérée par le traitement à la pirenzépine. Cette constatation

Figure IV-10 : Pourcentage de RC et erreur standard en fonction du traitement lors du test au son pour des animaux conditionnés en Trace 30 s dans l’expérience 3 A : moyenne des trois présentations du SC. B : Moyenne des 30 secondes faisant suite aux 3 présentations du SC. C : Durant les 5 minutes de test au contexte modifié (CX MOD) et cinétique de la RC lors de la présentation du son, par blocs de 10 s, moyennée sur trois essais.


167

est appuyée par l’ANOVA qui ne détecte aucun effet significatif du traitement (F(1,12)=0,36,

p>0,1).

Cette expérience montre qu’une injection ciblée de pirenzépine dans le cortex

entorhinal immédiatement après la phase de conditionnement est sans effet sur la RC

à un son conditionné en Trace.

Cette même injection semble montrer une tendance à induire un déficit de RC

au contexte.

CHAPITRE IV : DISCUSSION

168

DISCUSSION

Le but des travaux présentés dans ce chapitre était d’évaluer l’impact d’une

manipulation des activités cholinergique au niveau du CE lors du conditionnement de Trace et

de tenter ainsi de manière indirecte de mettre en évidence un rôle de la mémoire de travail

sous-tendue par des activités persistantes. Notre hypothèse suggérait en effet que, durant le

conditionnement de Trace, une activation cholinergique pourrait permettre au SC d’évoquer

des activités persistantes nécessaires à la restauration de la contiguïté avec le SI.

Afin d’éliminer les afférences cholinergiques du CE préalablement au

conditionnement, nous avons dans une première expérience induit une déafférentation

cholinergique spécifique de cette région par de multiples injections locales de 192-IgG-

Saporine. Cette manipulation s’est révélée sans effet sur l’acquisition et l’expression du


Dans une seconde expérience nous avons voulu affecter plus précisément le niveau

post-synaptique de cette transmission cholinergique. Puisqu’il avait été montré in vitro qu’un

blocage sélectif des récepteurs M1 à l’acétylcholine empêchait la mise en place des activités

persistantes, nous avons voulu déterminer si un blocage comparable in vivo pouvait perturber

la mise en place du conditionnement de Trace. Cette expérience a montré qu’un antagoniste

sélectif de ce sous-type de récepteurs, la pirenzépine, injecté localement avant la phase de

conditionnement, avait un effet sélectif sur le conditionnement de Trace sans affecter le


Enfin, nous avons voulu confirmer que la persistance de l’excitation provoquée par la

présentation du SC n’était critique que pour l’établissement de l’association entre SC et SI

durant l’acquisition. Ainsi, nous avons montré que des injections de pirenzépine

immédiatement après la phase d’acquisition n’affectaient pas le conditionnement.

Par ailleurs, les effets de la pirenzépine sur le conditionnement au contexte restent à

confirmer en raison du faible niveau de réponse obtenu dans ces expériences. On peut

toutefois noter que l’absence de conditionnement au contexte n’empêche pas les animaux

témoins de présenter une RC au son conditionné en Trace, ce qui indique que nos

manipulations affectent une composante du conditionnement de Trace qui ne dépend pas d’un

conditionnement contextuel.


169

I- Absence d’effet de la déafférentation cholinergique.

Les deux manipulations du système cholinergique que nous avons effectuées ont mené

à des résultats largement opposés. En effet, alors que la déafférentation cholinergique n’a

induit aucun effet significatif sur la RC des animaux conditionnés en Trace, l’injection de

pirenzépine préalablement au conditionnement a induit une diminution massive de la RC des

rats dans les mêmes conditions. Il faut noter que des effets différents de la déafférentation

cholinergique ou de l’injection d’un antagoniste des récepteurs à l’acétylcholine ont déjà été

rapportés par diverses équipes (Gutierrez et coll., 1999; Chudasama et coll., 2004; Marques

Pereira et coll., 2005).

Divers travaux qui impliquent la voie cholinergique septo-hippocampique dans des

processus tels que la mémoire de travail ou le conditionnement de peur sont basés sur une

approche pharmacologique par voie générale. L’injection d’un antagoniste cholinergique, la

scopolamine, est par exemple capable d’induire des déficits dans des tâches de mémoire de

travail (Fadda et coll., 2006; Masuoka et coll., 2006) mais aussi de conditionnement de peur

associée au contexte (Rudy, 1996) ou à un stimulus présenté en Trace (Hunt et coll., 2006).

Une part de ces effets a put être répliqué par une injection directe de scopolamine dans

l’hippocampe (Dunnett et coll., 1990; Ohno et coll., 1997; Gale et coll., 2001). Par contre

l’effet de la scopolamine sur le conditionnement de Trace (Kaneko et Thompson, 1997; Hunt

et coll., 2006) n’avait pour le moment été relié à aucun site d’action particulier.

En parallèle, la plupart des études reposant sur une déafférentation cholinergique

septo-hippocampique par injection d’AMPA (McAlonan et coll., 1995a) ou de 192-IgG-

Saporine (Steckler et coll., 1995; Marques Pereira et coll., 2005) injectaient la toxine

directement au niveau de la structure d’origine de cette voie, la région SM/BDB. Les effets

décrits par McAlonan sont particulièrement intéressants pour notre étude. La lésion

cholinergique qu’il effectue produit un déficit de la réponse après un conditionnement de peur

en Trace (McAlonan et coll., 1995a). Toutefois, il faut noter que les lésions cholinergiques

produites par injection directe dans la région SM/BDB sont susceptibles d’induire une

déafférentation importante à la fois du CE et de l’hippocampe, mais probablement aussi du

cortex cingulaire antérieur, trois régions pouvant être impliquées dans ce type de

conditionnement. .


170

Pour pallier ce manque de spécificité de la voie atteinte, il est possible avec la 192-

IgG-Saporine d’induire une déafférentation cholinergique spécifique de l’aire cérébrale

d’intérêt. Jill McGaughy et collaborateurs ont ainsi effectué une déafférentation du CE en

injectant directement la toxine dans cette structure. Ces auteurs mettent en évidence le rôle

des afférences cholinergique du CE dans le maintien de la représentation d’un stimulus

olfactif nouveau durant une tâche de reconnaissance avec délai (McGaughy et coll. 2005).

En nous inspirant de cette approche, nous n’avons pas pu observer d’effet de la

déafférentation cholinergique du CE. Une explication possible à cette absence d’effet pourrait

tenir au fait que la dose totale de 192-IgG-Saporine que nous avons injectée dans le CE est

relativement faible. En effet, Jill McGaughy et collaborateurs, dans leur étude de 2005,

avaient injecté un volume 4 fois supérieur au nôtre d’une solution à concentration identique

de 192-IgG-Saporine. Considérant ce volume trop important (il approchait les 8 µl au total),

nous avions donc effectué des tests préalables visant à déterminer si des volumes inférieurs

pouvaient induire une déafférentation comparable. A la suite de ces tests, nous avons

volontairement réduit ce volume, et obtenu néanmoins une diminution très importante des

fibres immunoréactives à la ChAT dans l’ensemble des couches du CE, qui ne s’accompagne

pas d’une diminution perceptible de la réactivité dans la VDB. Nous ne pouvons cependant

pas totalement exclure l’hypothèse que cette déafférentation, que nous voulions sélective,

reste partielle et que ce soit la cause de l’absence de déficit observé. En outre, lorsqu’une

lésion cholinergique n’est pas totale, des phénomènes de compensation peuvent apparaître,

notamment un bourgeonnement des terminaisons résiduelles. Toutefois, ces effets atteignent

généralement un maximum huit semaines environ après la lésion, et n’ont actuellement pas

été décrits pour des durées inférieures à 1 mois (Hartonian et de Lacalle, 2005). Il est donc

peu probable que ce phénomène ait contribué à une récupération chez nos animaux, puisque

ces derniers étaient conditionnés deux semaines après la lésion, de même que dans l’étude de

McGaughy et collaborateurs (2005).

Il faut noter cependant que la déafférentation affecte fortement les fibres

immunoréactives à la ChAT mais préserve un certain nombre de corps cellulaires

correspondant vraisemblablement à des interneurones cholinergiques. Nous avons observé ce

phénomène quelle que soit la dose de 192-IgG-Saporine injectée dans le CE. Comme un


171

certain nombre d’interneurones cholinergiques corticaux, ces interneurones du CE ne

semblent pas exprimer le récepteur de type p75 à la neurotrophine (de Lacalle et coll., 1998;

Varga et coll., 2003) et sont de ce fait insensibles à la toxine 192-IgG-Saporine. La présence

de ces interneurones permet de penser qu’une activité cholinergique résiduelle pourrait suffire

pour permettre le conditionnement de Trace. Il faut cependant noter que le rôle des

interneurones cholinergique dans le cortex entorhinal reste à ce jour peu documenté, bien que

l’existence d’interneurones coexprimant un polypeptide intestinal vasoactif et la ChAT ait été

mise en évidence dans le cortex de rats (Bayraktar et coll., 1997).

II- Effets sélectifs du blocage des récepteurs M1.

La deuxième expérience présentée dans ce chapitre montre que le blocage des

récepteurs M1 à l’acétylcholine induit un déficit spécifique de la RC au son quand ce dernier

est conditionné en Trace. Cet effet se manifestait pour la dose de pirenzépine la plus forte par

une diminution de RC lors de l’acquisition ainsi que lors du test au son, que ce soit pendant ou

après la présentation de celui-ci. De plus, cette même dose se révélait sans effet chez des

animaux conditionnés avec un protocole de Délai, ce qui indiquait la spécificité des effets

observés. Ainsi, un blocage des récepteurs M1 dans le CE lors du conditionnement réplique

les effets observés après lésion excitotoxique de cette même structure.

On pourrait envisager que l’effet induit par la pirenzépine soit en fait dû à une

diffusion de la drogue dans le cortex périrhinal. En effet il a été récemment montré par

approche lésionnelle que le conditionnement de Trace nécessite la mise en jeu du cortex

périrhinal (Kholodar-Smith et coll., 2008) Cependant, le faible volume d’injection que nous

utilisons ainsi que le fait que nos injections répliquent l’effet de lésions qui ne touchaient pas

le cortex périrhinal nous laissent supposer que le déficit observé est bien le résultat de l’action

de la pirenzépine sur le cortex entorhinal.

L’effet de l’injection de pirenzépine indique que le conditionnement de Trace et les

activités persistantes dépendent de manière analogue de l’activation des récepteurs


172

muscariniques de type M1 dans le CE (Egorov et coll., 2002). Ce résultat va donc dans le sens

d’une implication possible de ces activités dans le maintien de la Trace du SC.

Contrairement à la 192-IgG-Saporine, qui provoque une dégénérescence du neurone

pré-synaptique, ce qui devrait réduire la quantité d’acétylcholine émise après une stimulation,

la pirenzépine agit directement au niveau post-synaptique en bloquant les récepteurs M1.

Ainsi, une dose suffisante de pirenzépine serait susceptible d’empêcher tout développement

d’activités persistantes, de manière relativement indépendante de la quantité d’acétylcholine

libérée en amont.

L’implication des récepteurs M1 du cortex entorhinal dans le conditionnement de

Trace n’est pas simplement due à un rôle général de ces récepteurs dans le conditionnement

de peur qui peut apparaître lors d’injections systémiques d’un antagoniste M1 (Soares et coll.,

2006). En effet, dans nos expériences, le conditionnement de Délai, qui ne nécessite pas de

rétablir la contiguïté entre SC et SI, s’avère insensible aux injections locales de pirenzépine,

contrairement au conditionnement de Trace. Ce résultat est en accord avec nos hypothèses.

Il est probable que la pirenzépine agisse pendant plusieurs heures après l’injection. En

effet chez le chat une injection de pirenzépine dans l’hypothalamus induit des modifications

de l’activité nerveuse enregistrée dans l’hippocampe jusqu’à 5 h après l’injection (Bocian et

Konopacki, 2004). Ainsi le déficit de performance que nous observons pourrait être imputable

à une perturbation des processus post-acquisition tels que les mécanismes précoces de

consolidation. Toutefois, il ne semble pas que le cortex entorhinal soit impliqué dans ces

processus à la suite d’un conditionnement de peur (Schenberg, 2005; Baldi et coll., 1998).

De plus, la troisième expérience de ce chapitre nous permet de préciser que

l’activation des récepteurs M1 est critique uniquement lors de la phase d’acquisition. En effet,

si l’on injecte immédiatement après cette phase une dose de pirenzépine qui s’était révélée

efficace sur le conditionnement, cette injection s’avère sans effet. Ceci nous permet d’exclure

que l’effet de la pirenzépine concerne la phase de consolidation du conditionnement de Trace,

en accord avec l’idée que cet effet est directement lié à la nécessité de rétablir la contiguïté

lors des appariements entre SC et SI. Cet effet lors de la phase d’acquisition peut être mise en

regard de plusieurs travaux sur le cortex préfrontal montrant au contraire un effet de

manipulations pharmacologiques effectuées après le conditionnement (Runyan et coll., 2004).


173

L’effet différent de l’injection de pirenzépine avant ou après le conditionnement

pourrait être considéré comme une indication que le conditionnement de Trace est sensible à

l’état particulier induit par cette drogue. En effet, dans le premier cas, le test au son est

effectué alors que l’effet de la substance injectée au moment du conditionnement s’est dissipé,

alors que dans le second cas les deux phases sont effectuées en l’absence de drogue. Bien que

nous n’ayons pas directement testé cette hypothèse par des injections au moment du test au

son, divers résultats suggèrent que cette interprétation est peu vraisemblable. D’une part

l’effet d’un antagoniste M1 injecté par voie générale ne semble pas lié à une dépendance

d’état (Soares et coll., 2006), et d’autre part ce type d’effet ne semble pas avoir été rapporté

dans le cas de micro-injections de diverses substances pharmacologiques effectuées

directement dans les structures cibles (Bast et coll., 2003).

Au delà de notre hypothèse fonctionnelle concernant le rôle des neurones à activité

persistantes du CE dans la mise en place du conditionnement de Trace, l’implication de

l’acétylcholine dans ce type de conditionnement pourrait résulter de son implication dans

divers autres processus cognitifs. Ce neurotransmetteur est effectivement connu pour son

implication dans des fonctions telles que l’attention ou la mémoire de travail (Bartus et

Johnson, 1976; Penetar et McDonough, 1983; Newman et McGaughy, 2008). Dans la mesure

où le conditionnement de Trace met en jeu ces mêmes fonctions cognitives (Clark et Squire,

1998; Manns et coll., 2000b, 2000a, 2002; Carter et coll., 2003), et notamment lors de la

phase d’acquisition, une implication du système cholinergique peut être attendue.

Toutefois, du fait que les manipulations décrites dans ce chapitre étaient sélectivement

dirigées vers le CE, elles laissaient très certainement intact une grande partie du système

cholinergique cérébral. C’est ainsi qu’il n’y a aucune raison de penser que les injections de

Pirenzépine dans le CE aient pu directement affecter les processus attentionnels mis en jeu

dans le cortex cingulaire antérieur, qui apparaissent nécessaires au conditionnement de trace

(Han et coll., 2003), et cela même s’ils dépendent vraisemblablement d’activités

cholinergiques (Sarter et coll., 2005).


174

III- Rôle de l’acétylcholine dans le conditionnement de Trace.

L’effet de l’acétylcholine sur les activités persistantes qui a été décrit in vitro dépend

des récepteurs de type M1 présents au niveau post-synaptique sur les neurones à activité

persistante, puisque l’effet de la pirenzépine est observé sur une préparation où la

transmission synaptique a été préalablement bloquée (Egorov et coll., 2002). Ce point est

important car il montre que ces activités sont une propriété membranaire intrinsèque des

neurones du CE qui ne nécessite pas de plasticité synaptique. Ainsi, ces activités sont

adaptées au traitement de stimuli nouveaux ne nécessitant pas d’encodage préalable.

La libération d’acétycholine au sein de la formation hippocampique lors de la

présentation d’un stimulus nouveau a été décrite aussi bien pour des stimuli contextuels (Nail-

Boucherie et coll., 2000; Giovannini et coll., 2001) que pour des stimuli élémentaires

(McGaughy et coll., 2005). Lorsque le stimulus devient familier, il reste capable d’induire une

décharge cholinergique comparable à celle évoquée par la présentation d’un stimulus nouveau

s’il évoque de l’anxiété chez l’animal (Acquas et coll., 1996; Nail-Boucherie et coll., 2000).

Nous n’avons pas connaissance de mesures comparables effectuées in vivo dans le CE, mais

dans la mesure où la libération d’acétylcholine dans le cortex entorhinal par la voie septo-

hippocampique pourrait être comparable à celle observée dans l’hippocampe, ces données

permettent d’envisager un effet direct de cette libération sur les activités persistantes du CE

lors du conditionnement de Trace.

Ces résultats pourraient expliquer l’effet facilitateur d’un inhibiteur de

l’acétylcholinestérase administré par voie générale dans l’acquisition d’un conditionnement

de Trace chez le lapin âgé (Disterhoft et coll., 1999), ou le raton (Hunt et Richardson, 2007).

Effectivement, si la libération d’acétylcholine est atténuée chez ces sujets (Robbins et coll.,

1997), le fait de prolonger l’action synaptique de l’acétylcholine pourrait avoir un rôle

permissif sur les activités persistantes. Toutefois, en raison du mode d’administration de la

drogue, d’autres effets cholinergiques sur l’attention et la mémoire de travail pourraient

également être impliqués.


175

Ces expériences ne constituent pas une preuve formelle de l’implication des activités

persistantes du CE dans le conditionnement de trace, même si elles en constituent un

mécanisme probable. Il est à noter, en particulier, qu’il n’est pas exclu que l’injection de

pirenzépine perturbe également le conditionnement contextuel, bien que les données sur ce

point ne soient pas claires.

CHAPITRE IV : CONCLUSION

176

CONCLUSION

Les résultats que nous avons obtenus semblent confirmer notre hypothèses concernant

l’implication spécifique du CE dans le conditionnement de Trace puisque l’injection ciblée de

pirenzépine reproduit parfaitement les effets induit par la lésion de cette structure (expérience

2 du chapitre III).

De plus, le fait que le blocage spécifique des récepteurs M1 durant l’acquisition suffise

à induire un déficit de conditionnement de Trace confirme l’importance de ce

neurotransmetteur dans ce type d’apprentissage et appuie l’hypothèse d’une implication des

neurones à activité persistante du CE, dont on sait qu’ils sont dépendants de ce sous-type de

récepteurs.

Enfin il semblerait que le CE ne soit nécessaire que pour la mise en place du

conditionnement et pas pour les processus post-apprentissage, ce qui va bien dans le sens d’un

implication spécifique du CE dans le processus compensatoires de la perte de contiguïté

durant le conditionnement.

DISCUSSION GENERALE

DISCUSSION GENERALE

177

DISCUSSION GENERALE

Le conditionnement de Trace diffère du conditionnement classique dit

conditionnement de Délai par la présence d’un intervalle de temps « vide » entre la fin de la

présentation du SC et la présentation du SI (Pavlov, 1927). Ce processus va à l’encontre de la

règle de contiguïté formulée par les modèles formels classiques d’apprentissage associatif

(Gormezano et Kehoe, 1981). La simple présence de cet intervalle de Trace demande que le

cerveau mobilise des processus cognitifs tel que l’attention ou la mémoire de Travail pour

permettre l’association entre SC et SI à travers le temps (Kesner, 2005). Le travail présenté ici

permet de préciser comment des structures cérébrales et processus neurobiologiques

impliqués dans ces fonctions cognitives peuvent contribuer à l’acquisition d’un


Ce travail visait tout particulièrement à évaluer deux hypothèses actuelles concernant

la façon dont la contiguïté est rétablie entre SC et SI durant un conditionnement de Trace :

(1) la médiation contextuelle (Quinn et coll., 2005) et (2) le maintien de la Trace du SC

(Buhusi et Schmajuk, 1999).

I- Rappel des principaux résultats.

Les études que nous avons effectuées nous ont permis de mettre en évidence plusieurs

caractéristiques du conditionnement de peur effectué en protocole de Trace. Ces

caractéristiques distinguent partiellement le conditionnement de Trace du conditionnement de

Délai d’une part et du conditionnement Contextuel d’autre part, mais soulignent aussi une

certaine proximité au niveau des mécanismes et des structures cérébrales qui les sous-tendent.

Les expériences comportementales présentées dans le premier chapitre nous ont ainsi

permis de constater qu’il existait un processus de compétition entre conditionnement de Trace

et conditionnement au contexte (Expérience 3). Cette compétition se traduisait par un

masquage du conditionnement de Trace sur le conditionnement au contexte, ce qui impliquait

DISCUSSION GENERALE

178

que ces deux stimuli fassent l’objet d’un traitement distinct. Par ailleurs, la seule distinction

nette entre conditionnement de Délai et conditionnement de Trace était un léger retard de la

réponse de l’ordre d’une dizaine de secondes, indépendamment de la durée de l’intervalle de

Trace. Ainsi, les animaux conditionnés en Trace manifestaient dès la présentation du SC une

réponse conditionnée assez similaire à celle d’animaux conditionnés en protocole de Délai.

En ce qui concerne les structures cérébrales impliquées, nous avons pu montrer au

chapitre 2 que l’hippocampe, et plus particulièrement sa partie ventrale, semblait

indispensable à un processus général d’acquisition de la peur conditionnée (Expérience 2). En

accord avec des données récentes de la littérature, nous avons posé l’hypothèse que cette

région pourrait participer à la perception et au marquage émotionnel de la situation. Par

contre, l’hippocampe dorsal semble mis en jeu de façon plus spécifique pour l’acquisition du

conditionnement de Trace et du conditionnement contextuel. Les effets similaires des

manipulations affectant cette région cérébrale sur les deux types d’apprentissage suggère qu’il

existerait bien une composante contextuelle au conditionnement de Trace.

En dehors de cette composante contextuelle, nous avons recherché une contribution

d’autres processus cognitifs permettant le maintien à court-terme d’une représentation du SC,

conformément à ce que postule l’hypothèse de la Trace persistante. Pour cela, nous avons

évalué dans le troisième chapitre l’effet de lésions de deux autres structures cérébrales

supposées indispensables dans la mémoire de travail, le cortex préfrontal médian et le cortex

entorhinal. Le cortex préfrontal médian, à l’image de l’hippocampe ventral, semble nécessaire

à la mise en place de l’ensemble des RC observées, indépendamment du protocole de

conditionnement (Expérience 1). Nous avons attribué ce déficit global de réponse à un rôle du

CPFm dans le contrôle des réponses comportementales.

A l’inverse le cortex entorhinal semble jouer un rôle bien plus spécifique (Expérience

2). En effet, aussi bien les lésions que les manipulations pharmacologiques effectuées au

chapitre 4 indiquent que cette aire cérébrale joue un rôle particulier au moment de

l’acquisition du conditionnement de Trace, sans être nécessaire au conditionnement de Délai.

De plus, ce traitement spécifique de l’information effectué par le CE est sous la dépendance

de mécanismes cholinergiques muscariniques, de même que les activités persistantes mises en

DISCUSSION GENERALE

179

évidence dans cette région par plusieurs auteurs lors d’expériences in vitro. La déafferentation

cholinergique du CE s’est avérée sans effet (expérience 1), alors qu’un blocage des récepteurs

cholinergiques de type M1 par la pirenzépine a fortement diminué les réponses à un stimulus

conditionnel en Trace, sans affecter le conditionnement de Délai (Expérience 2). Enfin, une

dernière expérience a confirmé que le rôle de ces récepteurs était limité à la phase

d’acquisition du conditionnement de Trace. Les données sembleraient en outre indiquer qu’un

blocage des récepteurs cholinergiques après la phase de conditionnement peut affecter le

conditionnement contextuel, sans perturber le conditionnement de Trace. Si ce résultat devait

être confirmé, il démontrerait que l’implication du CE dans ces deux processus est sous-

tendue par des mécanismes différents.

II- Nature et spécificité du conditionnement de Trace.

Notre étude visait avant tout à mettre en évidence des processus susceptibles de

rétablir la contiguïté dans le conditionnement de Trace. C’est lors de la phase d’acquisition de

ce conditionnement que de tels processus devraient intervenir pour permettre une association

à travers le temps entre SC et SI. Il importe de comparer sur ce point conditionnement de

Délai et conditionnement de Trace.

1) Conditionnement de Trace et conditionnement de Délai.

a) Réponse au son lui-même.

Dans toute notre étude, les animaux témoins conditionnés avec un protocole de Trace

émettent une RC lors du test au son dont l’amplitude et la cinétique reste voisine de celle des

animaux conditionnés en Délai. Lors du son lui-même, la réponse conditionnée apparaît un

peu plus faible dans les groupes Trace, alors qu’après le son cette différence tend à s’inverser,

ce qui correspond à un retard d’une dizaine de secondes dans l’émission de la réponse. Ce

retard est également observé lorsque la réponse conditionnée est mesurée par la fréquence

cardiaque (Marchand et Kamper, 2000) mais ne correspond aucunement à l’intervalle de

Trace de 30 s à la fin duquel le choc serait attendu (Marchand et coll., 2003). Dans un

conditionnement de Trace de la membrane nictitante, il a été au contraire mis en évidence une

DISCUSSION GENERALE

180

spécificité temporelle de la réponse puisque dans ce cas la réponse apparaît non pas au

moment de la présentation du SC, mais au moment ou le SI devrait arriver (Gormezano et

Kehoe, 1981; Gormezano et coll., 1983). Le fait que dans nos expériences, les animaux

commencent à émettre une réponse durant la présentation du son suggère une analogie de

traitement du SC dans le cadre d’un conditionnement de Trace et de Délai, puisque le son est

bien reconnu comme indiquant l’arrivée du choc. Cette observation est en accord avec celles

de Quinn et collaborateurs qui observaient de même une réponse lors du son chez des

animaux conditionnés avec un intervalle de Trace de 30 s (Quinn et coll., 2002). De plus, tout

comme nous, ces auteurs constataient qu’il n’y a pas de différence fondamentale liée à la

durée de l’intervalle de Trace dans le maintien de la RC durant la minute qui suit la fin du son

(Quinn et coll., 2002), ce qui semble encore une fois suggérer que les processus

neurobiologique et cognitifs sous-tendant ces deux formes de conditionnement de peur

seraient au moins partiellement communs.

b) Codage du temps dans le conditionnement de Trace.

Cette différence de spécificité temporelle entre le conditionnement de peur et celui de

la membrane nictitante repose selon nous sur plusieurs facteurs. Premièrement, les intervalles

de Trace utilisés dans ces deux types de paradigmes expérimentaux sont de durée très

différente (inférieure à la seconde en conditionnement de la membrane nictitante contre

plusieurs dizaines de secondes dans le conditionnement de peur). Or il a été montré que la

durée de cet intervalle était un facteur décisif, déterminant notamment la dépendance

hippocampique du conditionnement de trace (Chowdhury et coll., 2005; Misane et coll.,

2005). Les deux types de conditionnement semblent reposer sur des processus d’autant plus

différents que le conditionnement de peur n’est plus dépendant de l’hippocampe lorsque

l’intervalle de Trace est court (3 s), alors que cette durée est déjà trop longue pour pouvoir

obtenir un conditionnement de la membrane nictitante. Marchand et Kamper (2000) ont

proposé que le conditionnement de Trace avec des intervalles courts repose sur une

composante précoce spécifique. Selon eux, le retard de réponse observé avec des intervalles

de Trace plus longs reflèterait simplement l’absence de conditionnement de cette composante.

Deuxièmement le nombre d’appariements SC-SI nécessaires au conditionnement

(plusieurs centaines pour le conditionnement de la membrane nictitante, moins d’une dizaine

DISCUSSION GENERALE

181

pour le conditionnement de peur) pourrait jouer un rôle pour permettre la mise en place

graduelle d’une réponse temporellement adaptée. Enfin le type de RC mesuré est différent.

Dans le cadre d’un conditionnement de peur, la RC de freezing est une réponse de préparation

au choc mais ne permet pas de l’éviter. Au contraire dans le cas du conditionnement de la

membrane nictitante, la RC (clignement de la paupière) permet d’éviter ou d’atténuer l’effet

du SI, la condition pour obtenir cet effet protecteur étant que la RC survienne au bon moment.

Ainsi, il apparaît que dans le conditionnement de peur, l’adaptation temporelle n’est

pas un aspect essentiel de l’association de Trace entre SC et SI. Au contraire, elle pourrait ne

survenir qu’à partir du moment où l’association entre le SC et le SI serait bien établie

(Marchand et Kamper, 2000). Ce processus pourrait s’apparenter à l’inhibition de délai

observée dans des conditionnements où le SC est relativement long et où sa partie initiale

devient un signal de sécurité (Rescorla, 1967). Ainsi les processus sous-tendant le codage du

temps lors du conditionnement de Trace ne seraient qu’indirectement liés aux processus

permettant le maintien de la représentation du SC.

c) Dissociations entre conditionnements de Trace et de Délai.

En parallèle de ces données comportementales, il a été montré dans le cadre d’un

conditionnement de la membrane nictitante que les substrats neurobiologiques impliqués dans

les conditionnements de Trace et de Délai pouvaient faire l’objet d’une double dissociation,

l’hippocampe contribuant spécifiquement au conditionnement de Trace, mais le cortex

cérébelleux n’étant indispensable que pour un conditionnement de Délai (Woodruff-Pak et

Disterhoft, 2008). Ces auteurs émettent l’hypothèse que, dans le cadre d’un conditionnement

de Trace mais non de Délai, le traitement effectué par l’hippocampe pourrait se substituer au

cervelet pour fournir l’information concernant le SC aux noyaux du pont.

Nous avons pu voir que dans le cas du conditionnement de peur, il est possible

d’induire des perturbations du conditionnement de Trace sans atteinte du conditionnement de

Délai, en perturbant ou bloquant l’activité de certaines structures cibles telles que

l’hippocampe dorsal ou encore le cortex entorhinal. Cependant, il n’existe pas à notre

connaissance d’étude ayant mis en évidence une perturbation sélective du conditionnement de

Délai sans atteinte du conditionnement de Trace. Ainsi, dans cette tâche, nous ne mettons en

DISCUSSION GENERALE

182

évidence qu’une simple dissociation, ce qui pourrait s’interpréter comme une simple fragilité

du conditionnement de Trace relativement au conditionnement de Délai. La sensibilité

particulière du conditionnement de Trace à des distracteurs (Han et coll., 2003), ou à un

renforcement partiel (Powell et coll., 2005) pourrait s’interpréter de même. Ceci pourrait

suggérer que le conditionnement de Trace partagerait en grande partie les substrats du

traitement nécessaire au conditionnement de Délai, mais nécessite des étapes de traitement

supplémentaires effectuées dans certaines structures clefs non impliquées dans le


2) Conditionnement de Trace et conditionnement contextuel.

a) Processus de compétition entre Trace et contexte.

Nous avons pu voir que notre procédure comportementale indiquait l’existence d’une

compétition entre conditionnement de Trace et conditionnement contextuel (Selden et coll.,

1991; McKinzie et Spear, 1995; Williams et LoLordo, 1995; Wilkinson et coll., 1996;

Parkinson et coll., 1999; Hall et coll., 2001; Quinn et coll., 2002).

Certains aspects de nos résultats semblent suggérer un certain niveau d’indépendance

entre le conditionnement au contexte et le conditionnement de Trace. Tout d’abord, la

dernière expérience du premier chapitre a permis de montrer que le conditionnement au son

en Trace était capable de masquer le conditionnement contextuel, ce qui irait notamment à

l’encontre de l’hypothèse d’un conditionnement de second ordre du SC via le contexte.

D’autres auteurs avant nous avaient pu observer cet effet de balance entre le conditionnement

au contexte et le conditionnement au CS en fonction de l’intervalle de Trace (Selden et coll.,

1991; McKinzie et Spear, 1995; Parkinson et coll., 1999; Hall et coll., 2001 ). Le masquage

d’un stimulus par un autre reposant sur un processus de compétition entre stimuli, ceci

suppose un traitement différentiel et un antagonisme entre le contexte et le son présenté en

Trace, alors que l’hypothèse de la médiation contextuelle suggère au contraire une synergie

entre les deux conditionnements.

DISCUSSION GENERALE

183

b) Fragilité relative du conditionnement contextuel.

D’autre part, en comparant le niveau de RC au contexte dans les différents groupes

témoins sur l’ensemble des expériences, on peut remarquer qu’un certain nombre de groupes

témoins conditionnés en Trace ne semblent présenter aucun conditionnement au contexte,

alors que ce conditionnement était notable dans les expériences du chapitre 1. Ce problème

semble spécifiquement concerner les rats ayant reçu une implantation de guide-canules au

niveau de l’hippocampe ventral ou du cortex entorhinal. De fait, ces rats ne semblent plus

capables de manifester de RC au contexte, suggérant ainsi une certaine fragilité du

conditionnement contextuel obtenu à l’aide de notre protocole. Les mêmes groupes

d’animaux présentent néanmoins des niveaux de RC au son en Trace importants et similaires

quel que soit le site d’implantation des guide-canules. La relative fragilité du conditionnement

contextuel comparé à la plus grande stabilité du conditionnement de Trace dans nos

conditions suggère donc que ce dernier ne peut pas entièrement reposer sur une médiation

contextuelle.

c) Déficits de conditionnement contextuel et déficits de réponse de Trace.

Cependant, si nous prenons en compte l’ensemble des observations effectuées au cours

de nos travaux ainsi que les résultats obtenus par certains auteurs, nous devons admettre que

les lésions comme les manipulations pharmacologiques qui provoquent un déficit de

conditionnement contextuel induisent de façon systématique un déficit de conditionnement de

Trace. Effectivement, bien qu’il soit possible de perturber sélectivement le conditionnement

de Trace sans atteinte du conditionnement contextuel (Quinn et coll., 2005), il n’a jamais été

clairement montré que le conditionnement de Trace pouvait être effectué indépendamment

d’un conditionnement contextuel. Ceci suggère donc l’existence d’une relation entre ces deux

types de conditionnement, comme le postule l’hypothèse de la médiation contextuelle. De

plus, la forte dépendance du conditionnement de Trace à l’intégrité de l’hippocampe dorsal va

également dans ce sens puisqu’on sait que cette structure contribue largement à la mise en

place de la représentation contextuelle (Rudy et coll., 2004) et à fortiori du conditionnement

au contexte (Phillips et LeDoux, 1992; Holland et Bouton, 1999). Ainsi il semble difficile

d’exclure que l’hypothèse de la médiation contextuelle soit à même de rendre compte, au

moins en partie, du conditionnement de Trace.

DISCUSSION GENERALE

184

Ainsi, en ce qui concerne la nature du conditionnement de Trace, notre hypothèse de

départ postulait que ce dernier devait être soit dépendant du contexte soit dépendant du

maintien d’une Trace du SC. Nos résultats ainsi que la littérature actuelle nous suggèrent

pourtant que le conditionnement de Trace ne dépendrait pas uniquement de l’un ou de l’autre

de ces processus mais en serait la résultante conjointe.

III- Structures et circuits impliqués.

La réflexion que nous avons mené sur la nature du conditionnement de Trace nous a

amené à formuler l’hypothèse que le conditionnement de Trace serait à la fois en partie

comparable au conditionnement de peur associée au contexte et au conditionnement de Délai.

Nous avons décrit dans l’introduction de ce travail de thèse les circuits généraux impliqués

dans ces deux dernières formes de conditionnement (LeDoux, 2000) et nous allons nous

appuyer sur ces circuits pour préciser de quelle manière pourrait selon nous se mettre en place

le conditionnement de Trace (figures O-5 et O-6).

1) Hippocampe dorsal et composante contextuelle du conditionnement de Trace.

La structure majoritairement impliquée dans le conditionnement de peur associée au

contexte est l’hippocampe et plus particulièrement sa région dorsale. Cette implication

reposerait sur la capacité de l’hippocampe dorsal à établir une représentation unifiée du

contexte. C’est cette représentation unifiée qui serait par la suite associée au SI (Rudy et

O'Reilly, 1999; Fanselow, 2000).

L’hypothèse de la médiation contextuelle du conditionnement de Trace peut se

décliner de plusieurs manières différentes : Premièrement, le SC présenté en Trace pourrait

être associé au SI par association de second ordre avec le contexte (Quinn et coll., 2002). La

force associative acquise du fait de la contiguïté entre le contexte et le SI se transfèrerait alors

au SC. Deuxièmement, le SC pourrait être intégré à la représentation unifiée du contexte de

manière à ce que la présentation du SC ou du contexte évoque la RC. Enfin, le SC pourrait

faire partie intégrante d’une représentation épisodique incluant des aspects contextuels et

DISCUSSION GENERALE

185

temporels (Quinn et coll., 2005). Dans les deux premiers cas, le conditionnement de Trace ne

pourrait avoir lieu sans établissement de la représentation unifiée du contexte. Ainsi, c’est

cette capacité de l’hippocampe à associer les éléments spatialement et temporellement

discontigus qui rendrait compte de l’implication de cette structure dans le conditionnement de

Trace (Wallenstein et coll., 1998). Toutefois, dans le cadre de l’hypothèse épisodique, la

relation qu’entretiendrait le SC avec le contexte est mal spécifiée et ne permet pas de faire de

prédiction précise sur l’interdépendance entre les deux conditionnements. Cette hypothèse

pose également quelques problèmes théoriques, outre le fait qu’il n’a pas encore été prouvé

qu’un tel type de mémoire existait chez le rat (Roberts et coll., 2008). En effet, si le son

rappelle l’intégralité de l’épisode de conditionnement, on ne voit pas comment prendre en

compte les facteurs d’agencement temporel des stimuli.

Dans le cadre de l’hypothèse selon laquelle le SC serait intégré à la représentation

contextuelle, il a été montré que les cellules de lieu de l’hippocampe pouvaient acquérir une

réponse reliée au SC quand celui est présenté de façon appariée mais pas lorsqu’il est présenté

de façon non appariée lors d’un conditionnement de peur (Moita et coll., 2003). Ceci pourrait

constituer une partie du processus permettant une telle association. Cependant, toutes les

hypothèses reposant sur la médiation contextuelle posent un problème théorique identique

puisque l’agencement temporel des stimuli ne semble pas y jouer de rôle. Comment dans ce

cas rendre compte de l’absence de conditionnement au son à la suite d’un protocole non

Apparié (Calandreau et coll., 2005) ou encore lors de notre conditionnement avec un

intervalle de Trace de 90 s (expérience III chapitre 1). Pour rendre compte de la capacité de

l’animal à établir cette discrimination il faudrait pour cela supposer qu’une représentation

contextuelle différente s’associe au SI dans le cas du conditionnement de Trace et dans le cas

d’un protocole non Apparié. Ceci implique une représentation plastique du contexte

susceptible d’évoluer au cours du temps. Ainsi, il faudrait que l’intervalle de Trace soit

suffisamment court pour que le SC soit présent dans la représentation unifiée au moment de

l’arrivée du choc.

Ceci rejoint une hypothèse relativement ancienne selon laquelle le conditionnement de

Trace reposerait sur la capacité de l’animal à discriminer la représentation contextuelle avant

la présentation du SC (qui ne prédit pas le SI), et la représentation contextuelle après la

DISCUSSION GENERALE

186

présentation du SC (qui elle est prédictive) (Bolles et coll., 1978; Chowdhury et coll., 2005).

Selon un modèle proposé par Howard & Hasselmo, la formation d’une représentation

contextuelle qui évolue avec le temps serait liée à la fois aux variations lentes d’activités

neuronales dans le cortex entorhinal et aux capacités auto-associatives de la région CA3 de

l’hippocampe (Howard et coll., 2005). Ainsi, il est vraisemblable que le circuit de traitement

des informations contextuelles dans le cadre du conditionnement de Trace inclut également le

cortex entorhinal. Nous avons vu que les lésions entorhinales affectaient aussi bien la réponse

de peur associée au contexte que celle associée au son présenté en Trace, ce qui est en accord

avec les résultats d’autres auteurs (Maren et Fanselow, 1997; Burwell et coll., 2004;

Majchrzak et coll., 2006). On pourrait donc attribuer l’effet des lésions entorhinales à un

simple blocage du transit de l’information sensorielle vers l’hippocampe dorsal,

indépendamment d’un traitement en mémoire de travail spécifique du CE (Ryou et coll.,

2001). Toutefois, cette interprétation ne suffit pas à expliquer l’effet analogue produit par la

pirenzépine injectée dans le CE. En effet, le simple blocage des récepteurs M1 induit par la

pirenzépine ne devrait avoir qu’un effet modulateur sur la transmission nerveuse (Richter et

coll., 1999). Il préserve la réponse neuronale durant une stimulation (Egorov et coll., 2002) et

ne devrait donc pas induire un blocage de la communication du cortex entorhinal vers

l’hippocampe dorsal. De plus le blocage des récepteurs cholinergiques après la phase de

conditionnement semble être en mesure d’affecter le conditionnement contextuel, sans

perturber le conditionnement de Trace ce qui suggérerait que l’implication du CE dans ces

deux processus se ferait indépendamment l’un de l’autre.

2) Cortex entorhinal et composante persistante de la Trace.

A ce jour, le rôle du cortex entorhinal lors du conditionnement de peur effectué en

Trace n’avait pas encore été démontré et constitue un résultat original. Sur la base des

arguments indirects obtenus dans le chapitre 4, nous pensons que cette structure pourrait

permettre le maintien de la représentation du SC et rétablir ainsi la contiguïté entre ce dernier

et le SI.

Nous avons décrit dans l’introduction les deux voies principale du conditionnement à

de peur à un stimulus élémentaire auditif. La voie courte (voie sous-corticale) ne permettrait

pas d’établir la mise en relation du SC et du SI puisque ces derniers ne sont pas présentés

DISCUSSION GENERALE

187

simultanément. On peut donc envisager que la mise en place de cette association repose sur

une voie longue thalamus sensoriel-CE-amygdale. Le cortex entorhinal permettrait dans ce

circuit de conserver durant une brève période de temps une représentation du SC, et c’est cette

représentation qui serait par la suite associée au SI. Il serait alors possible que le signal

persistant représentant le SC intègre le circuit classique de conditionnement de Délai via les

projections que le CE émet vers les divers noyaux du complexe amygdalien (Brothers et

Finch, 1985; Pitkanen et coll., 2000) sans nécessairement passer par l’hippocampe (conf.

Figure D-1). Ainsi, le cortex entorhinal pourrait jouer dans le conditionnement de Trace un

rôle similaire à celui du cortex auditif dans le conditionnement de Délai. La nécessité de ce

traitement cortical pourrait selon nous expliquer la nécessité d’un accès à la conscience du

sujet pour mettre en relation les deux stimuli dans le cadre du conditionnement de Trace

(Clark et Squire, 1998; Carter et coll., 2003).

CORTEX ENTORHINAL

CORTEX PREFRONTAL MEDIAN

HIPPOCAMPE

DORSAL

VENTRAL

SEPTUM MEDIAN & SIGNAL CHOLINERGIQUE

AMYGDALE

THALAMUS SENSORIEL

Focalisation attentionnelle

Maintientde la Trace

Evaluation de la composante émotionnelle

Prise en charge de la composante contextuelle

Contrôle de la réponse

Perception des stimuli présents

Association et sortie comportementale

SC/SI

Figure D-1 : Schéma illustrant les principales structures impliquées dans le conditionnement de peur à un son présenté avec un intervalle de Trace. Les flèches indiquent les connexions nerveuses existantes entre ces structures et les termes en italique précisent la fonction que pourraient avoir ces structures dans ce type de conditionnement.

DISCUSSION GENERALE

188

3) Cortex préfrontal médian, hippocampe ventral et mécanismes généraux du

conditionnement de peur.

Les données expérimentales que nous avons obtenues nous ont aussi permis de mettre

en évidence un rôle plus général de deux autres structures cérébrales dans les processus

nécessaires à la mise en place d’une RC en conditionnement de peur. En effet, dans le cas

d’une lésion totale de l’hippocampe ou du cortex préfrontal médian, ainsi qu’après une

inactivation au muscimol de l’hippocampe ventral durant l’acquisition, nous avons constaté

une réduction générale de l’ensemble des RC de peur indépendamment du protocole de

conditionnement. De plus, dans ces cas là, nous observons aussi une diminution de la RC

manifestée par les animaux après administration des chocs électriques, de même que Yoon &

Otto (2007) après lésions de l’hippocampe ventral (Yoon et Otto, 2007). A l’inverse, les

manipulations plus sélectives de l’hippocampe dorsal ou du cortex entorhinal qui provoquent

un déficit spécifique de la RC durant le test au son chez les animaux conditionnés en Trace

n’induisent aucune perturbation de la RC observée durant le conditionnement (voir aussi

Rogers et coll., 2006). Ainsi, la RC observée lors de l’acquisition ne semble pas liée à

l’efficacité du conditionnement de Trace, ni même du conditionnement au contexte

(Fanselow, 1980), mais semble plutôt prédire le futur déficit global de RC.

Ces résultats nous ont donc conduit à attribuer des rôles généraux et néanmoins

distincts à ces deux structures dans le cadre du conditionnement de peur. En ce qui concerne

le rôle de l’hippocampe ventral, les données bibliographiques actuellement disponibles

conduisent à penser que le déficit global de réponse observé pourrait être imputable à un effet

anxiolytique de la lésion ou de l’inactivation de cette région durant l’acquisition (Moser et

Moser, 1998; Richmond et coll., 1999; Bannerman et coll., 2004; Degroot et Treit, 2004;

McHugh et coll., 2004). Dans cette hypothèse les connexions massive existant entre

l’amygdale et l’hippocampe (Pikkarainen et coll., 1999; Pitkanen et coll., 2000) auraient une

implication majeure. La perturbation de ce circuit conduirait à une mauvaise évaluation par le

système de la valence émotionnelle de la situation. Cette diminution de l’anxiété durant le

conditionnement se traduirait par une diminution générale de la RC observé durant les tests,

analogue à l’effet d’une réduction de l’intensité du SI. Ceci rendrait bien compte du fait que la

DISCUSSION GENERALE

189

RC au contexte, dont nous avons montré la sensibilité à ce paramètre dans le chapitre 1,

apparaît complètement abolie par ces manipulations.

En ce qui concerne le rôle du cortex préfrontal médian, cette région cérébrale semble

jouer un rôle dans l’ensemble des trois conditionnements de peur observés (contexte, Délai et

Trace). Contrairement à ce qui pouvait être attendu sur la base des données concernant la

mémoire de travail (Kesner, 2005), ou les enregistrements électrophysiologiques pendant le

conditionnement de Trace (Gilmartin et McEchron, 2005b), la réponse au son conditionné en

Trace n’est que partiellement affectée par des lésions de cette structure. Ces lésions induisent

néanmoins un déficit général de RC lors d’un protocole de Délai, ainsi qu’une atténuation du

conditionnement contextuel en protocole de Trace. Les données de la littérature suggèrent que

le cortex préfrontal pourrait avoir un rôle dans le contrôle de la réponse de peur (Morgan et

LeDoux, 1995; Quirk et coll., 2006), en particulier par le jeu de projections de l’aire

infralimbique vers les cellules intercalées de l’amygdale. Ainsi, nos observations suggèrent

que les rats porteurs de lésions du cortex préfrontal médian répondraient de manière

inappropriée à la situation expérimentale.

L’observation d’un déficit de réponse de Trace limité à la période qui suit l’arrêt du

son, combiné au fait que les réponses conditionnées observées dans nos expériences montrent

peu de spécificité temporelle, peut suggérer un rôle spécifique pour le cortex préfrontal dans

le cas où le conditionnement de Trace serait poursuivi sur un plus grand nombre d’essais

(Marchand et Kamper, 2000). L’affinement temporel de la réponse lors du conditionnement

de Trace pourrait dans ce cas consister en une extinction des réponses précoces analogue au

processus d’inhibition de délai (Rescorla, 1967). Il est ainsi possible de supposer que le cortex

préfrontal permettrait de retarder le moment de manifestation de la RC au fur et à mesure des

appariements et en parallèle de la formation de l’association SC/SI.

IV- Nouveaux mécanismes proposés

Notre travail met non seulement en évidence une implication sélective du CE lors du

conditionnement de Trace, mais de plus il suggère au moyen des expériences du chapitre 4 un

DISCUSSION GENERALE

190

mécanisme nouveau jusqu’ici invoqué pour la mémoire de travail. Nous supposons en effet un

rôle majeur des activités neuronales persistantes induites par le SC dans cette structure, et

démontrons la dépendance du conditionnement de Trace vis-à-vis de l’activité cholinergique

qui permet ces activités. Dans ce cadre nous supposons donc que l’acétycholine joue un rôle

central pour permettre l’association à travers le temps entre SC et SI.

Nous pouvons tout d’abord supposer que c’est la libération de ce neurotransmetteur

dans le CE induite par la présentation d’un nouveau stimulus saillant qui permettrait le

déclenchement et le maintien des activités persistantes. Par la suite, nous émettons

l’hypothèse que la perte du statut de nouveauté du SC pourrait être compensé par le gain

d’une valence aversive grâce à la mise en place de l’association SC/SI (Acquas et coll., 1996;

Giovannini et coll., 2001 ; McGaughy et coll., 2005).

Les activités décrites in vitro sont susceptibles de se prolonger au delà de plusieurs

minutes (Egorov et coll., 2002). Il est donc raisonnable de penser qu’elles constituent le

stimulus effectif capable de se conditionner par contiguïté avec le SI. Il faut cependant

expliquer la diminution de la RC observée après une augmentation de l’intervalle de Trace

ainsi que l’incapacité des animaux à établir une association entre SC et SI lorsque cet

intervalle devient trop long. Ainsi, il est nécessaire de supposer que ces activités ne peuvent

persister que durant un temps limité, ce qui pourrait résulter de plusieurs processus.

Tout d’abord il est possible que le niveau d’acétylcholine dans le milieu extra-

cellulaire soit un facteur décisif et qu’un retour au niveau basal de ce dernier conduise à un

arrêt de ces activités. Une étude récente par une méthode électrochimique rapide dans le

cortex préfrontal montre que l’hydrolyse de l’acétylcholine relarguée par une stimulation

brève s’effectue en moins de 30 s (Bruno et coll., 2006). En outre, Hunt et Richardson (2007)

ont montré chez le raton que l’inhibition systémique de l’acétylcholinesterase permettait de

faciliter le conditionnement de trace. Cependant, au cours d’expériences préliminaires, il ne

nous a pas été possible de répliquer ce résultat chez le rat adulte ayant reçu une injection de

physostigmine lors d’une tentative de conditionnement avec un intervalle de Trace de 60 s.

ceci soulève la possibilité que le niveau cholinergique de base du CE chez le rat adulte soit

suffisamment élevé tout au long de la séance de conditionnement pour avoir un effet permissif

sur les activités persistantes.

DISCUSSION GENERALE

191

Un autre facteur susceptible d’expliquer l’arrêt de ces activités est la présence de

distracteurs. Il a été montré que le conditionnement de Trace est particulièrement sensible aux

distracteurs (Han et coll., 2003). De même, ces activités persistantes pourraient être modifiées

lors de la présentation du distracteur. Ainsi il est possible d’imaginer que l’excitation

neuronale induite par la présence d’un autre stimulus pourrait conduire (par exemple via

l’intermédiaire d’inter-neurones GABAergiques) à une hyperpolarisation, dont on sait qu’elle

peut conduire à terme à l’arrêt de la persistance du signal (Egorov et coll., 2002). Le fait que

l’animal explore l’environnement durant le conditionnement va le soumettre à la présence

d’autres stimuli qui pourraient jouer le rôle de distracteurs. Ainsi, plus l’animal sera exposé

longtemps au contexte après la présentation du son, plus la probabilité que les activités

persistantes soient stoppées sera élevée. Ce principe pourrait expliquer l’incapacité de

l’animal à établir une association SC/SI avec un intervalle de Trace trop long, ainsi que le fait

que l’augmentation de l’intervalle de Trace conduise à une réduction de la RC comparable à

celle prédite par le modèle de Rescorla-Wagner par une diminution de la saillance du SC.

Enfin, les activités persistantes devraient être évoquées aussi bien lors du

conditionnement que lors du test où le son est présenté seul. Or, tant que la décharge persiste,

elle ne comporte aucune information sur le temps écoulé. Par conséquent, ce mécanisme

implique que l’apparition de ces activités évoque immédiatement l’association avec le SI,

autrement dit que la RC débute lors de la présentation du SC ou dès son arrêt.


192


L’ensemble des données présentées dans ce manuscrit semble indiquer que le

conditionnement de Trace serait la résultante de deux formes d’associations distinctes. La

première forme reposerait sur une médiation contextuelle alors que l’autre forme repose sur

l’existence d’activités persistantes généralement associées aux processus de mémoire de

travail dans le cortex entorhinal.

Bien que nous n’ayons pas réussi totalement à dissocier les substrats impliqués dans

ces deux processus, il semblerait pourtant que les mécanismes sous-tendant le

conditionnement de Trace puissent avoir un certain niveau d’indépendance vis-à-vis du

conditionnement contextuel. Cette indépendance s’appuyant sur un certain nombre de

constatations indirectes, mais également sur le fait qu’il semble possible de dissocier les

processus post-apprentissage nécessaires à la mise en place du conditionnement contextuel et

du conditionnement de Trace, même si ceci reste encore à confirmer.

Nos résultats indiquent que le cortex entorhinal semble être une structure majeure dans

le processus permettant de compenser l’absence de contiguïté lors du conditionnement de

Trace. Il reste cependant à montrer si, comme nous le pensons, cette compensation peut se

faire indépendamment de l’hippocampe, en particulier grâce aux fortes connexions que le

cortex entorhinal entretient avec l’amygdale. Pour cela il serait intéressant dans un premier

temps de déterminer quel serait l’effet d’une inactivation sélective du noyau latéral ou

basolatéral de l’amygdale durant l’acquisition d’un conditionnement de Trace. Ceci pourrait

donner une idée plus précise sur la nature de l’association effectuée lors du conditionnement

de Trace, puisqu’il semblerait que ces noyaux amygdaliens soient sélectivement responsables

du conditionnement à un stimulus élémentaire pour le LA ou au contexte pour le BLA.

De plus il reste nécessaire de mettre en évidence in vivo, à l’aide d’enregistrements

électrophysiologiques, l’existence d’activités persistantes dans le cortex entorhinal. Ces

activités devraient pouvoir être induites par la présentation d’un son nouveau et devraient être

sensibles à la pirenzépine. De tels résultats, couplés à nos données actuelles, viendraient

étayer notre hypothèse concernant les activités persistantes du CE et leur rôle probable dans la

mise en place du conditionnement de Trace.



193

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ANNEXES

Differential Contribution of Dorsal and Ventral Hippocampusto Trace and Delay Fear Conditioning

Frederic Esclassan,1,2 Etienne Coutureau,1 Georges Di Scala,1 and Alain R. Marchand1*

ABSTRACT: Trace conditioning relies on the maintained representa-tion of a stimulus across a trace interval, and may involve a persistenttrace of the conditioned stimulus (CS) and/or a contribution of contex-tual conditioning. The role of hippocampal structures in these two typesof conditioning was studied by means of pretraining lesions and reversi-ble inactivation of the hippocampus in rats. Similar levels of condition-ing to a tone CS and to the context were obtained with a trace intervalof 30 s. Neurotoxic lesions of the whole hippocampus or reversible mus-cimol inactivation of the ventral hippocampus impaired both contextualand tone freezing in both trace- and delay-conditioned rats. Dorsal hip-pocampal injections impaired contextual freezing and trace condition-ing, but not delay conditioning. No dissociation between trace and con-textual conditioning was observed under any of these conditions. Alto-gether, these data indicate that the ventral and dorsal parts of thehippocampus compute different aspects of trace conditioning, with theventral hippocampus being involved in fear and anxiety processes, andthe dorsal hippocampus in the temporal and contextual aspects of eventrepresentation. VVC 2008 Wiley-Liss, Inc.

KEY WORDS: NMDA lesions; muscimol; contextual fear; rat; freezing

INTRODUCTION

In ‘‘trace’’ conditioning, the temporal separation of conditioned (CS)and unconditioned (US) stimuli violates the contiguity conditionassumed by most models of associative learning (Gormezano and Kehoe,1981), since it requires from the subject the ability to associate an arbi-trary CS with an US that does not occur immediately. This ‘‘trace’’interval renders trace conditioning sensitive to specific neurobiologicalmanipulations, in particular affecting the hippocampal formation(Kesner, 2005), which do not affect standard ‘‘delay’’ conditioning (i.e.,with the CS and US contiguous in time). The conditioning phase is ofspecial interest for understanding the process through which the nervoussystem ‘‘bridges the gap’’ (the trace interval between the CS and US).However, the specific contribution of the hippocampus to this acquisi-

tion phase is not fully understood. In particular, anumber of studies have concentrated on the dorsalsubdivision of the hippocampus, whereas its ventralsubdivision has only recently been the subject ofrenewed interest.

Several studies reported that lesions of the hippo-campus (HPC) prevented trace conditioning. This wasobserved with an eyeblink response and short traceintervals in rabbits (Solomon et al., 1986; Moyeret al., 1990), rats (Weiss et al., 1999) and mice(Tseng et al., 2004), but also with longer trace inter-vals in fear conditioning protocols (McEchron et al.,2000; Fendt et al., 2005; Burman et al., 2006; Trivediand Coover, 2006). The dorsal and ventral part of thehippocampus appear to have distinct anatomical(Pitkanen et al., 2000) as well as physiological proper-ties (Donley et al., 2005; Maggio and Segal, 2007).However, there is still no agreement as to whetherthese regions perform qualitatively different functionsduring fear conditioning (Rudy and Matus-Amat,2005). There is increasing evidence that conditioningwith trace interval of long duration is particularly sen-sitive to dorsal hippocampal manipulations (Chowd-hury et al., 2005; Misane et al., 2005). The ventralpart of the hippocampus could also play a role intrace conditioning, since the amount of damage tothis region appears to affect the degree of deficitobserved (Moyer et al., 1990; Kim et al., 1995; Tsenget al., 2004; Burman et al., 2006). However, it hasbeen reported that electrolytic (Burman et al., 2006)or neurotoxic lesions (Maren, 1999; Richmond et al.,1999) affecting the ventral part of the hippocampusmay also impair delay auditory fear conditioning.Thus, it remains to be determined whether the ventraland dorsal subdivision of the hippocampus are differ-entially and specifically involved in trace fear condi-tioning as opposed to delay conditioning.

A few studies have used pharmacological manipula-tion of hippocampal structures during conditioning,so that the animals were tested in the absence of thedrug, in order to circumvent issues of hyperactivity orfear expression. Most of these studies have focused onthe role of the dorsal hippocampus. Thus, in bothmice and rats, blockade of N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptors in the dorsal hippocampus priorto conditioning affects trace fear conditioning mea-sured by freezing (Misane et al., 2005; Quinn et al.,

1Universite de Bordeaux, Centre de Neurosciences Integratives et Cog-nitives, C.N.R.S. UMR 5228, Talence, France; 2Universite Paul Sabatier,Centre de Recherche sur la Cognition Animale, C.N.R.S. UMR 5169,Toulouse, FranceGrant sponsors: C.N.R.S., Universite de Bordeaux, Conseil Regionald’Aquitaine, Ministere de l’Enseignement superieur et de la Recherche.*Correspondence to: Alain Marchand, Centre de Neurosciences Integra-tives et Cognitives, UMR 5228, Universite de Bordeaux, C.N.R.S., Ave-nue des Facultes, F-33405 Talence Cedex, France.E-mail: [email protected] for publication 16 June 2008DOI 10.1002/hipo.20473Published online 6 August 2008 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com).

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VVC 2008 WILEY-LISS, INC.

2005). The latter study, in particular, demonstrated that miceinfused with the NMDA receptor antagonist APV did notexhibit a deficit with short trace intervals.

Two processes have been proposed to require an hippocam-pal contribution during the acquisition of trace conditioning:the context might play a critical role as a mediating stimulusduring trace conditioning (Quinn et al., 2005), so that hippo-campal processing could contribute to conditioning by support-ing a contextual representation (Rudy et al., 2004). Alterna-tively, the hippocampus may be involved in maintaining a per-sisting ‘‘CS trace,’’ still active at the time of occurrence of theUS, which would constitute the effective CS supporting condi-tioning (Kehoe et al., 1993; Buhusi and Schmajuk, 1999).Thus, the relationship between trace conditioning and condi-tioning to contextual cues should constitute an important clueon how the organism bridges the temporal gap (Marchandet al., 2004).

The aim of the present study was to compare the effects ontrace and delay fear conditioning of total hippocampal lesionsand selective reversible inactivation targeted at the ventral ordorsal hippocampus during the acquisition phase. Reversibleinactivation avoids some difficulties of lesion studies such aspossible effects on retrieval or performance, as well as lesion-induced plasticity. We developed a trace conditioning protocolthat simultaneously induced moderate levels of contextual con-ditioning and was therefore appropriate to investigate the possi-ble relationship between trace and context conditioning. More-over, we evaluated trace and delay conditioning in separate ex-perimental groups.

MATERIALS AND METHODS

Experiment 1

Forty two naive Long-Evans male rats were obtained from acommercial supplier (Centre d’Elevage et de Recherche Janvier,le Genest-St-Isle, France) at about 8 weeks of age. They werehoused in pairs in standard rat cages (polycarbonate 49 3 263 20 cm) throughout the experiment with ad libitum foodand water and a 12/12 h light cycle (light on at 7.00 AM).Conditioning and testing took place during the light phase ofthe cycle. All experiments were conducted in agreement withthe French (council directive 87848, October 19, 1987; per-mission 3306793 to A.M.) and international (directive 86–609,November 24, 1986, European Community) legislation regard-ing animal experiments, and care was taken at all stages tominimize stress and discomfort to the animals.

Apparatus

Conditioning took place in eight identical conditioningchamber (40 3 35 3 30 cm, Imetronic, Pessac, France) madeof gray PVC on three sides and transparent Perspex on theopening face. Each chamber was located inside a sound-attenu-

ating cubicle with a loudspeaker above. A grid floor (27 parallel0.5-cm diameter stainless-steel bars, 1.5-cm apart) above a saw-dust tray could deliver mild foot shocks (US, 1 s, 0.4 mAscrambled pulses). A ventilation fan provided a backgroundnoise of �55 dB. The CS was a tone (5,000 Hz, 70 dB, 10 sin duration). Stimuli were delivered by a computerized inter-face (Imetronic). The floor of the conditioning chambers wascleaned with water between subjects. For the CS test, the con-ditioning chambers were modified to define an altered contextand minimize residual contextual fear, and each animal wastested in another chamber than the one used for conditioning.The test room was brightly lit instead of dimly. Black andwhite visual patterns were fitted on the front and transparentwall to alter the visual features of the environment. The geome-try of the chambers was altered by inserting a vertical whitewall on the diagonal. Tactile cues were altered by placing agranulated plastic plate with a checkerboard visual pattern onthe grid floor. Olfactory cues were changed by removing thesawdust tray. Transportation cues were also modified. For con-ditioning and the contextual fear test, the home cages wereplaced on a trolley. For the CS test, the home cages were trans-ported by hand, covered with a white overall.

Each conditioning chamber was equipped with a miniatureblack and white video camera (SK-2005, OptoVision, Toulouse,France) that allowed automatic freezing measurements(Marchand et al., 2003). The camera monitored the entirechamber from the top through a 2.45-mm wide angle lens.Lighting (10 lux) was provided by four LEDs on the box ceil-ing. Each set of four cameras was connected via a Quad-typemultiplexer (Ganz QD-04C) to a PC type microcomputer(AMD Athlon XP 26001, 512 Mo RAM) equipped with avideo acquisition card (Matrox ‘‘Orion’’) and sampled at 1 Hz.The video signals were also recorded on two DVD recordersfor backup and play-back. Data acquisition was carried out bya program written under the TestPoint1 software. Freezinganalysis was conducted with a set of procedures written underExcel1 Visual Basic1, as described in Marchand et al. (2003).Briefly, an image of the empty cages was subtracted from eachsampled frame before computing the standard deviation (SD)of pixel values (8-bit). Variation of this SD over three consecu-tive frames corresponded to a movement of the animal. Freez-ing was defined as movement remaining below a fixed thresh-old (0.075) for at least two consecutive seconds (Anagnostaraset al., 2000). With this set-up, all eight conditioning chamberscould be monitored.

Surgical procedure

Bilateral excitotoxic lesions of the hippocampus were per-formed according to the procedure described by Coutureauet al. (1999, adapted from Jarrard, 1989). The rats were anes-thetized with Ketamine (Virbac, 100 mg/kg i.m.), after premed-ication with Xylazine (Rompun1 13 mg/kg i.p.) and Diazepam(Valium1 3 mg/kg i.p.). When needed, a second injection ofKetamine was performed 1 h later. After immobilizing the ratflat-skull in the stereotaxic frame, a bone window was opened to

34 ESCLASSAN ET AL.

Hippocampus

expose the cortical surface. Multiple injections of NMDA(20 mg/ml) were then performed from a glass pipette fitted to aHamilton syringe, according to the coordinates shown in Table 1.The specified volume was injected within 30 s, and then thepipette was left in place for 2–5 min to avoid diffusion alongthe track. Control rats were submitted to sham lesions, with thecortex being exposed and the dura mater breached in severalpoints. The rats were left to recover for several hours in a warmroom before being returned to the animal house. After the endof the experiments, the rats were killed with an overdose ofpentobarbital and perfused with saline and formaldehyde(10%). Postmortem histological control of the lesions was per-formed on 50-lm thick slices stained with thionin.

Behavioral procedure

All rats were acclimated for at least 1 week prior to surgery,then left to recover in pairs for 1 week in their home cage.They were weighed and handled for 2 min on each of threeconsecutive days before conditioning. Conditioning consistedof a 30-min conditioning session with five pairings of tone andshock at irregular intervals with the trace interval depending ongroup assignment. Half the rats in each lesion group wereassigned to ‘‘Delay’’ protocol and half to a ‘‘Trace’’ protocol.Rats in the ‘‘Trace group’’ were conditioned with a trace inter-val of 30 s between tone termination and shock onset. For the‘‘Delay group,’’ the onset of the shock coincided with the offsetof the tone. This condition where the trace interval is set tozero can be considered as equivalent to standard delay condi-tioning where the two stimuli coterminate (Han et al., 2003;Misane et al., 2005). Twenty four hours later, the rats wereplaced again for 10 min in their own conditioning chamber toassess contextual fear and attenuate its subsequent manifesta-tion. Context was tested first with a short session, because audi-

tory trace conditioning was found to be more robust than con-textual conditioning in our experimental conditions. On theday after re-exposure to the context, tone fear conditioning wasassessed in the altered context. The tone test was a 20-min ses-sion with three presentations of the tone (10 s) at 5-min inter-vals after a 5-min stimulus-free period to assess response to thealtered context.

Statistical analysis

Freezing scores were averaged over specific periods of inter-est. The fraction of time spent freezing x was normalized bythe arcsine transformation t 5 arcsin (square_root(x)) toimprove homogeneity of variance (Zar, 1999). For the condi-tioning session, the minute following each of the five shocks(postshock freezing) was analyzed in a repeated-measuresdesign. For the contextual fear test, only the first 5-min block(out of 10 min) was analyzed in order to avoid extinction. Forthe tone fear test, the response to the altered context duringthe 5 min preceding the first tone presentation was first eval-uated, and rats displaying indiscriminate fear (more than 50%freezing to the altered context, which corresponds approxi-mately to three SDs away from the mean) were excluded fromthe analysis. The tone response was computed on the averageof the three trials. The 10-s tone presentation (CS), and the30 s following the CS (trace interval) were separately analyzed.A two-way analysis of variance (ANOVA) was used with thefactors hippocampal intervention (HPC vs. Sham) and trainingprotocol (Delay vs. Trace). Partial ANOVAs and Student–New-man–Keuls post hoc tests complemented the analysis whenappropriate. The threshold for rejecting the null hypothesis was0.05 throughout.

Experiment 2

One hundred four rats were included in this experiment.Procedures were similar to those described in Experiment 1.Bilateral implantation of cannulae were performed under ste-reotaxic control in anesthetized rats. For dorsal hippocampalimplantation, 8-mm long, 36 gauge (American Standard WireGage) guide cannulae were aimed at the following stereotaxiccoordinates based on the atlas of the rat brain (Paxinos andWatson, 1998): Anteroposterior (AP): 23.6; Lateral (L): 62.4;Ventral (V): 22.5. For ventral hippocampal implantation, 12-mm long guide cannulae were used. The coordinates were: AP:25.2; L: 65; V: 25.1. The guide cannulae were then immobi-lized in a block of dental cement (Palavit1G) that enclosedthree small screws fitting into the bone. A piece of wire wasinserted into the cannula to protect it from dust until the timeof injection. For 3 days preceding the injection and condition-ing day, the animals were brought in pairs to the injectionroom in their home cage and familiarized with the lightrestraint procedure (being wrapped into a cloth) and withmanipulations of the cannulae (cleaning).

On the conditioning day, the rats were brought to the injec-tion room, the wire was removed and the inside of the cannulawas cleaned with a dental nerve broach. Injections were per-

TABLE 1.

Stereotaxic Coordinates and Volume for NMDA Lesions

AP ML DV Volume (ll)

25.4 65.0 26.1 0.10

25.3 0.10

24.5 0.10

25.4 64.2 23.9 0.10

24.7 64.5 26.5 0.05

24.7 64.0 27.2 0.10

23.5 0.05

23.9 63.5 22.7 0.10

23.9 62.2 23.0 0.10

21.8 0.10

23.1 63.0 22.7 0.10

23.1 61.4 23.0 0.10

22.1 0.10

22.4 61.0 23.0 0.05

Coordinates are based on the atlas of the rat brain (Paxinos and Watson,1998). A total of 28 sites were injected bilaterally for NMDA lesions of thewhole hippocampus.

HIPPOCAMPUS AND TRACE CONDITIONING 35

Hippocampus

formed with a 39-gauge injection cannula, 1 mm longer thanthe guide cannula, connected through a catheter to a Hamiltonsyringe on an infusion pump. Injection cannulae were inserted

bilaterally into the guide cannulae, each delivering a dose of0.25 lg muscimol (1 mg/ml) in artificial cerebrospinal fluid(aCSF). This dose was selected on the basis of a pilot experi-ment and was consistent with that used in other studies (Marenand Holt, 2004). Control rats received the same volume ofvehicle (aCSF). Injections lasted 75 s and the cannulae werethen left in place for 165 s. Conditioning took place 20 minafter the end of the injection. The remaining testing and histo-logical control procedures were identical to those of the previ-ous experiments. The data from the six groups of rats weresubmitted to ANOVAs with treatment (Muscimol in ventralHPC, dorsal HPC, or aCSF) and conditioning protocol (Delayor Trace) as between subject factors. Controls injected withaCSF in the ventral or dorsal hippocampus were pooled to-gether since no statistical difference could be found betweenthem (Largest F 5 2.25, P > 0.1). For the tone test, the 10 sof tone presentation and the subsequent 30 s were analyzed asdescribed in Experiment 1.

RESULTS

Experiment 1: Hippocampal Lesions

Experiment 1 aimed at comparing the sensitivity of traceand contextual conditioning to pretraining excitotoxic lesionsof the whole hippocampus. It was expected that hippocampallesions would impair both trace and context conditioning,whereas conditioning in absence of a trace interval would belargely preserved. A preliminary experiment determined thattrace and contextual conditioning of comparable magnitudecould be obtained in fear conditioning with a trace interval of30 s, whereas more conditioning occurred to the CS and lessto the context in the delay condition.

Following histological examination, 18 animals presentedextensive lesions to both the dorsal and ventral parts of thehippocampus. Two rats from the Sham-H-TRA group had tobe excluded because they exhibited indiscriminate freezing, thatis, more than 50% freezing during the altered context test. Thisleft the following cells sizes HPC-DEL (n 5 8), HPC-TRA(n 5 8), Sham-H-DEL (n 5 11), and Sham-H-TRA (n 5 9).Hippocampal lesions typically included large bilateral damageto all CA fields, the dentate gyrus and the dorsal subiculum,with important cell loss in both the dorsal and ventral hippo-

FIGURE 1. Hippocampal lesions. (A) Extent of lesions of thewhole hippocampus in the rat sustaining the most extensive (gray)or least extensive (black) hippocampal lesions. Diagrams adaptedfrom Paxinos and Watson (1998), with distance from Bregma inmillimeters. (B) Photomicrographs of brain sections in a control rat(SHAM, left panels) and a representative lesioned rat (HPC, rightpanels). Upper part: coronal section at Bregma 22.8, with enlargedview of the dorsal hippocampus. Lower part: coronal section atBregma25.8, with enlarged view of the ventral hippocampus. Thio-nin staining shows that multiple NMDA microinjections produced amassive cell loss in nearly the whole extent of hippocampus.

36 ESCLASSAN ET AL.

Hippocampus

campal regions, although a part of the ventral dentate gyrus wasoften preserved (Fig. 1). Damage to the lateral parts of CA1 orthe dorsal hippocampus was also incomplete in a few cases.

Acquisition

During the conditioning session, freezing behavior appearedin all control rats. Lesioned rats globally displayed less freezingthan sham-lesioned animals (average postshock freezing 0.41vs. 0.64, data not shown), presumably reflecting impairedshort-term memory processes (Stiedl et al., 2000). TheANOVA with lesion and protocol as between-subject factorsshowed that postshock freezing was significantly attenuatedby the lesion (F(1,32) 5 11.6, P < 0.005), irrespective ofthe conditioning protocol (interaction: F(1, 32) 5 0.67,P > 0.1).

Contextual fear

Freezing during the contextual fear memory test is displayedin Figure 2A. Sham lesioned rats displayed moderate levels offreezing in both the Delay and Trace conditions, whereas freez-ing was essentially absent in hippocampal-lesioned rats. TheANOVA indicated a significant effect of lesion (F(1, 32) 58.48, P < 0.1). In this experiment, there was neither anyeffect of the conditioning protocol (F(1, 32) 5 0.27, P > 0.1),nor any interaction of lesion and protocol (F(1, 32) 5 0.04,P > 0.1).

Tone fear

Responses during the tone test are represented in Figures2B,C. Freezing to the altered context, before the first trial, wasvery low in all groups. During the tone, strong freezingresponses appeared in sham-lesioned rats. The peak freezingresponse occurred toward the end of the tone in the Delaygroup but distinctly after tone offset in Trace group, with aslightly smaller amplitude in the Trace group (Fig. 2C). Freez-ing then decayed partly in both groups to a plateau around45%. Freezing did not increase toward the end of the traceinterval in Trace group, contrary to what would be expected ifthe conditioned response was centered around the expectedinstant of shock occurrence (arrow). Rats with lesions of thehippocampus displayed impaired responses both during andafter the tone, especially in the trace condition. The peakresponses occurred during the tone in the delay condition andafter the tone in the trace condition. However, freezing inlesioned rats decayed quickly to baseline under both the delayand trace conditions. Figure 2B compares the responses duringthe tone in the various groups. The ANOVA on these datawith lesion and protocol as between-subject factors indicates aneffect of lesion (F(1, 32) 5 12.3, P < 0.005) together with aneffect of the conditioning protocol (F(1, 32) 5 10.2, P <0.005), but no significant interaction of lesion with protocol(F(1, 32) 5 0.52, P > 0.1). An analysis of the freezingresponse after the tone (trace interval) confirmed the effect of

lesion (F(1, 32) 5 10.1, P < 0.005), but showed no effectrelated to protocol (largest F 5 0.75).

Our data thus indicate that neurotoxic lesions of the hippo-campus did not specifically disrupt trace fear conditioning,but also affected the Delay groups, even during the immediatepostshock period. The reduced freezing responses to thetone were accompanied by a profound deficit in contextualconditioning.

Experiment 2: Subregional HippocampalInactivations With Muscimol

The results of Experiment 1 suggest that trace and contextconditioning are similarly sensitive to disruption of processingwithin the hippocampal formation. However, the ventral anddorsal parts of the hippocampus may differentially contributeto these processes (Burman et al., 2006). The following experi-ment thus aimed at clarifying and possibly dissociating the con-tribution of the dorsal and ventral hippocampal regions to theacquisition of trace and contextual conditioning. Moreover, the

FIGURE 2. Conditioned responses in Experiment 1. (A) Aver-age freezing and standard error (s.e.) bars during re-exposure tothe context (5 min). HPC: rats with total hippocampal lesions;Sham: control rats with sham lesions; D: Delay Group; T30: TraceGroup. (B) Mean freezing and s.e. in the lesioned and sham ratsduring the 10 s presentation of the tone, average of three presenta-tions. (C) Pretone, tone, and post-tone response pattern, in blocksof 10 s, average of three presentations of the tone. Alt CX: Meanfreezing during the first 5 min of altered context. PRE-CS: Meanfreezing in the 10 s preceding the three tone presentations, includ-ing carry over of freezing from previous presentations. CS: Meanfreezing during the tone. POST 10 to POST 50: Freezing after thetone, in blocks of 10 s. Arrow: expected time of shock in the Tracegroup.


Hippocampus

effect of lesions in the previous experiment may have been duein part to an alteration of the expression of the freezingresponse at the time of testing (Mcnish et al., 1997). Toexclude such performance effects, a reversible inactivationapproach was undertaken. The GABAA agonist muscimol was

locally injected in either the dorsal or ventral hippocampusprior to conditioning.

A total of 92 rats were retained for analysis, after excludingnine rats that could not be properly injected, and three ratsthat had incorrectly placed injection sites. The final countswere in the ventral groups MUSC-DEL (n 5 9), aCSF-DEL(n 5 10), MUSC-TRA (n 5 15), aCSF-TRA (n 5 16), andin the dorsal groups MUSC-DEL (n 5 11), aCSF-DEL (n 5 9),MUSC-TRA (n 5 12), aCSF-TRA (n 5 10).

The location of injection sites in the remaining rats is indicatedon Figure 3. For all the animals included, the guide and infusioncannulae descended vertically through the cortex and endedwithin the dorsal hippocampus (Fig. 3A,B) or the ventral hippo-campus (Fig. 3C,D). Cortical damage due to the guide cannulaewas limited to the area immediately surrounding the cannulae.

Acquisition

During the conditioning session, postshock freezing devel-oped normally in rats injected with aCSF, but was attenuatedin rats injected with muscimol (average postshock freezing 0.48and 0.41, data not shown). The ANOVA with treatment andprotocol as between-subject factors revealed a trend toward amain effect of the conditioning protocol (F(2,86) 5 2.83, P 50.096) and a trend toward a main effect of treatment (F(2,86)5 2.81, P 5 0.066). Actually, from the second shock onward,levels of freezing were significantly lower in muscimol-treatedrats with respect to control rats (mean 0.57 and 0.47, F(2,86)5 4.47, P < 0.05).

Contextual fear

Freezing during the contextual fear test is represented in Figure4A. In the Delay condition, rats exhibited very little freezing tothe context, even when injected with vehicle. In the Trace con-dition, moderate freezing was observed in the control group. Inrats that had received pretraining injections of muscimol intothe ventral or the dorsal hippocampal region, freezing in theTrace condition was essentially abolished. Strikingly, none ofthe rats injected with muscimol in the ventral hippocampusdisplayed any indication of freezing to the context. An ANOVAwith factors treatment and protocol showed no main effect ofprotocol (F(1,86) 5 0.81, P > 0.1), but a significant effect oftreatment (F(2,86) 5 5.79, P < 0.005) that interacted with

FIGURE 3. Intrahippocampal injection sites. (A) Photomicro-graphs of a brain section at Bregma 22.8 stained with thioninshowing the track of the guide cannula and the site of injection(arrow) in the dorsal hippocampus as indicated by the schematicrepresentation on the right. (B) Location of the injection sites inthe dorsal hippocampus. Gray dots: aCSF injection sites; Blackdots: muscimol injection sites. (C) Photomicrographs of a brainsection at Bregma 25.6 showing the track of the guide cannulaand the site of injection (arrow) in the ventral hippocampus. (D)Location of the injection sites in the ventral hippocampus. Dia-grams adapted from Paxinos and Watson (1998), with distancefrom Bregma in millimeters.

38 ESCLASSAN ET AL.

Hippocampus

protocol (F(2,86) 5 5.62, P < 0.01). Splitting the analysisaccording to the conditioning protocol confirmed that theeffects of injection were significant in the Trace groups. Specifi-cally, both Trace groups injected with muscimol froze signifi-cantly less to context than the control group (Student–New-man–Keuls post hoc test). In the Delay groups, responses wereclose to floor and no effect of injections could be detected.

Tone fear

Figures 4B–D shows the tone responses in rats with pretrain-ing injections of muscimol into the ventral or the dorsal hippo-

campal region. Before the first tone (altered context), freezinglevels were very low.

In the Delay group, strong freezing responses appeared incontrol rats during the tone (Fig. 4C). Their response patternwas similar to that described in Experiment 1, with a peakresponse around the end of the tone presentation, and a partialdecay afterward. No effect of the dorsal hippocampal injectioncan be observed under these conditions. The response in theventral injection group appears attenuated.

In the Trace groups (Fig. 4D), control rats injected with ve-hicle displayed a large freezing response that appeared strongerbut similar in pattern to that in Experiment 1. In particular,the peak response occurred after tone offset and decayed onlyslightly during or after the trace interval. Rats injected withmuscimol into the dorsal or ventral hippocampus displayedgreatly impaired responses both during and after the tone, sothat the conditioned response pattern was preserved. Both sitesof injection apparently yielded similar effects on trace condi-tioning. Figure 4B compares the response during the tone inall groups. An ANOVA on these data, with treatment and pro-tocol as between-subject factors, indicated a significant effect ofinjection (F(2,86) 5 7.98, P < 0.001) as well as of the condi-tioning protocol (F(1,86) 5 22.1, P < 0.0001), with a signifi-cant interaction between these factors (F(2,86) 5 3.42, P <0.05). The Student–Newman–Keuls test indicated that in theDelay condition, rats with ventral injections were impairedwith respect to the other groups, whereas in the Trace condi-tion both the dorsal and ventral groups showed similarlyreduced freezing. Similar results were obtained by analyzingfreezing during the trace interval.

Thus, both ventral and dorsal hippocampal inactivations sig-nificantly reduced conditioning to the context and to the toneunder Trace conditions, but only ventral inactivations signifi-cantly attenuated the acquisition of CS responses in the Delaycondition.

DISCUSSION

The present work showed that pretraining lesions of thewhole hippocampus affected not only trace fear conditioning,but also delay conditioning as well as contextual fear. Ventralhippocampal inactivation prior to conditioning replicated theeffects of whole hippocampal lesions, affecting both contextualand tone fear. However, dorsal hippocampal inactivation withmuscimol selectively impaired trace and context conditioningbut not delay conditioning, thus dissociating trace from delayconditioning.

Trace and delay tone conditioning were investigated in sepa-rate groups of rats. They lead to distinct patterns of condi-tioned responses, suggesting differences in learning processes.In control rats, trace responses can be characterized by condi-tioned responses during the tone that are somewhat weakercompared with delay conditioning, as well as by post-toneresponses that appear stronger and more prolonged. Impor-

FIGURE 4. Conditioned responses in Experiment 2. (A) Aver-age freezing and s.e. during re-exposure to the context (5 min). D:Delay Group; T30: Trace Group; aCSF: control rats injected withartificial cerebrospinal fluid; MUSC/DORSAL: rats with injectionsof muscimol in dorsal hippocampus. MUSC/VENTRAL: rats withinjections of muscimol in ventral hippocampus. (B) Mean freezingand s.e. in the different groups during presentation of the tone.*Significantly different from aCSF injections; #Significantly differ-ent from ventral muscimol injections. (C) Response pattern in theDelay group (D), in blocks of 10 s, average of three presentationsof the tone, for each type of injection (aCSF, Dorsal, Ventral). SeeFigure 2 for abbreviations (D) Response pattern in the Trace group(T30). Arrow: expected time of shock in the Trace group.


Hippocampus

tantly, the peak of the freezing response occurred in the secondsfollowing tone offset rather that at the expected time of USoccurrence. This response pattern indicates the absence of astrict temporal specificity of trace fear responses, and mayreflect the time course of a conditioned trace. It is in agreementwith our previous results showing that in trace fear condition-ing, the cardiac conditioned response patterns could resultfrom two components with distinct but fixed time courses(Marchand and Kamper, 2000).

The present work is original in that it assesses under thesame conditions the contribution of the dorsal and ventral hip-pocampus to the acquisition phase of trace conditioning, usingreversible inactivations. It is based on a protocol that allowedthe expression and measurement of both trace and context con-ditioning. Rodents can acquire trace conditioning as well asconditioning to the context when the CS and US are widelyseparated in time. With this protocol, inducing intermediatelevel of freezing to both context and trace, contextual condi-tioning was abolished by either hippocampal lesion or localinactivation. All manipulations of the hippocampal formationinducing a deficit in contextual fear also induced a deficit intrace conditioning, suggesting that these two processes may berelated.

Ventral Hippocampal Inactivation Mimics theEffects of Whole Hippocampal Lesions

Lesions of the whole hippocampus prior to conditioningwere found to induce marked deficits in freezing responsesunder all conditions. The lesions attenuated both immediatepostshock freezing and tone responses 48 h later, and they fur-thermore abolished contextual fear. These data are consistentwith the general idea that the hippocampus is involved in con-text conditioning (Hirsh, 1974; Nadel and Willner, 1980; Kimand Fanselow, 1992; Phillips and LeDoux, 1994; Maren et al.,1997; Frohardt et al., 1999; Fanselow, 2000; Desmedt et al.,2003) and confirm that lesions of this structure induce antero-grade deficits in contextual fear.

In the present experiments, the effect of the lesions on toneconditioning did not depend on the conditioning protocol.Thus, lesions of the whole hippocampus affected not only tracefear conditioning, but also delay conditioning. This was ratherunexpected, since lesions of the whole hippocampus are thoughtto selectively impair trace eyeblink conditioning (Solomonet al., 1986; Weiss et al., 1999) and trace fear conditioning(Bangasser et al., 2006; Burman et al., 2006; Trivedi andCoover, 2006). Under delay conditions, fear conditioning toexplicit CSs classically involves a circuit including the thalamusand amygdala (Pare et al., 2004) and does not require a func-tional hippocampus (Solomon et al., 1986; Selden et al., 1991;Phillips and LeDoux, 1992; McEchron et al., 1998). It shouldbe noted, however, that this notion is largely based on studiesthat lesioned only the dorsal part of the hippocampus (Kim andFanselow, 1992; Phillips and LeDoux, 1992, 1994; Winocur,1997; Anagnostaras et al., 1999; Quinn et al., 2002; Chowd-

hury et al., 2005; Burman et al., 2006). Other studies usingtotal or ventral lesions yielded more varied results (Selden et al.,1991; McEchron et al., 1998; Richmond et al., 1999; Frohardtet al., 2000; Desmedt et al., 2003; Bangasser et al., 2006).

The global effect of whole hippocampus lesions on all condi-tioned responses may indicate that the impairment concernsthe expression of the freezing response, rather than fear mem-ory or acquisition (Good and Honey, 1997; McNish et al.,1997; Richmond et al., 1999; for discussion of these issues, seeAnagnostaras et al., 2001). Another possible factor is that theneurotoxic lesions used in this study induced a massive cell lossin a large portion of the ventral hippocampus in addition tothe dorsal hippocampus. Thus disruption of ventral hippocam-pal function might have contributed to the deficits that weobserved in delay conditioning. A growing body of evidenceindicates that auditory fear conditioning can be affected byelectrolytic (Maren and Holt, 2004; Trivedi and Coover, 2004;Burman et al., 2006) or neurotoxic lesions involving the ventralpart of the hippocampus (Maren, 1999; Richmond et al.,1999; Rogers et al., 2006; Hunsaker and Kesner, 2008; Suther-land et al., 2008). Furthermore, lesions of ventral part of thehippocampus have been reported to alter not only conditionedfreezing following exposure to footshocks, but also uncondi-tioned freezing responses such as those evoked by exposure to apredator (Pentkowski et al., 2006). It has thus been suggestedthat this region plays a general role in the expression of anxiety-related behaviors (Richmond et al., 1999; Bannerman et al.,2004; Degroot and Treit, 2004; McHugh et al., 2004).

To exclude indirect or performance effects of the lesion, weperformed in Experiment 2 reversible hippocampal inactiva-tions during the conditioning phase. By using local microinjec-tions, we furthermore assessed the relative contribution of theventral and dorsal regions of the hippocampus to this phase.To our knowledge, the effects of ventral hippocampal inactiva-tion on trace conditioning had not previously been investi-gated. Ventral hippocampal inactivation prior to conditioningfully replicated the effects of whole hippocampal lesions, affect-ing both contextual fear (Bast et al., 2001; Rudy and Matus-Amat, 2005) and tone fear (Maren and Holt, 2004). The ven-tral hippocampus thus appears necessary for the acquisition ofconditioned fear responses to elementary stimuli such as tones(Maren and Holt, 2004). This contribution is in no way spe-cific to trace conditioning. Similarly, the deficit in context con-ditioning does not necessarily imply that this region is specifi-cally involved in contextual encoding or even in associative ormemory processes. It is more likely that the ventral hippocam-pus is involved in emotion-related processes in general. Indeed,the ventral inactivation has potential anxiolytic effects duringconditioning (Bannerman et al., 2003). The observation thatboth the lesion and ventral inactivation significantly reducedimmediate postshock freezing is consistent with this interpreta-tion. Moreover, the level of fear responses expressed duringconditioning may influence the subsequent memory of fear(Harris and Westbrook, 1999). Thus, at least part of the deficitobserved with ventral inactivation could be due to anxiolyticeffects during the conditioning phase.

40 ESCLASSAN ET AL.

Hippocampus

It may be argued that muscimol-inactivation could haveextended beyond the intended range and affected areas like themedial geniculate nucleus or the amygdala. Inactivation of theamygdala would produce a general reduction of freezingresponses (Muller et al., 1997). However we do not think it islikely that muscimol diffused to this region both because ofdistance (1–2 mm) and the presence of the ventricle. Moreover,with similar injection volumes, other authors have observedquite distinct effects of muscimol in the ventral hippocampusand amygdala (Maren and Holt, 2004). On the other hand,the ventral injection sites are close to the medial geniculate nu-cleus, and we cannot exclude that diffusion in this regionimpaired fear conditioning to tones. Nevertheless, lesion studiessuggest that only bilateral inactivation of the medial geniculatenucleus would affect conditioning (Romanski and LeDoux,1992). Moreover, we did not observe any damage to the thala-mus in hippocampal-lesioned animals so that a separate expla-nation would be required for the effect of lesions.

Dorsal Hippocampal Contribution to Trace andContext Conditioning

We show here that dorsal hippocampal inactivation withmuscimol during acquisition selectively impairs trace condition-ing with a trace interval of 30 s, whereas delay conditioningwas left intact. This result extends earlier lesional or pharmaco-logical studies. There is evidence that pretraining lesions lim-ited to the dorsal hippocampus selectively affect trace-condi-tioned fear measured through conditioned cardiac responses(McEchron et al., 2000) or fear-potentiated startle (Fendtet al., 2005; Burman et al., 2006; Trivedi and Coover, 2006).The contribution of the dorsal hippocampus during the acqui-sition phase is more appropriately assessed using reversible inac-tivation that has a narrower time window and allows less timefor lesion-induced plasticity. Trace fear responses have beenshown to be sensitive to blockade of NMDA receptors prior toconditioning (Misane et al., 2005; Quinn et al., 2005). Sincethese effects were dependent on the use of a long trace interval(Misane et al., 2005), they suggest that the dorsal hippocampalcontribution is related to the information content ofconditioning.

In addition to trace conditioning, dorsal hippocampal inacti-vations abolished contextual conditioning. The levels of condi-tioning to the context in the Delay group were quite low, butsignificant effects of the injection were observed in the Tracegroup. Theoretical accounts of the hippocampal function sug-gest that it establishes an unified representation of all contextualelements that allows it to be subsequently associated with theshock US (Rudy and O’Reilly, 1999; Fanselow, 2000). The ac-quisition and consolidation of a conjunctive contextual repre-sentation appears dependent upon the integrity of the hippo-campus, and particularly, its dorsal subdivision (Selden et al.,1991; Phillips and LeDoux, 1994; Good and Honey, 1997;Anagnostaras et al., 2001; Rudy and Matus-Amat, 2005). More-over, anterograde amnesia for contextual fear has been consis-tently produced by dorsal hippocampal injections of various

pharmacological agents such as scopolamine (Rogers and Kesner,2004) or NMDA receptor antagonists (Young et al., 1994;Stiedl et al., 2000; Bast et al., 2003). However, muscimol injec-tions into the dorsal hippocampus had not previously beenreported to affect contextual fear (Maren and Holt, 2004;Matus-Amat et al., 2004, Experiment 4). The neuronal inactiva-tion due to muscimol likely persists for some time after the con-ditioning phase (Edeline et al., 2002), and we cannot excludethat some of these effects could be due to an action on the con-solidation of contextual fear. Indeed, the dorsal hippocampus isknown to participate in this early consolidation as demonstratedby postconditioning injections of tetrodotoxin (Sacchetti et al.,1999). Moreover, reliable and specific effects on tone fear mem-ory established after trace fear conditioning are observed withpost-training lesions of the dorsal and/or ventral hippocampus(Quinn et al., 2002; Chowdhury et al., 2005; Burman et al.,2006; Trivedi and Coover, 2006; Yoon and Otto, 2007), sug-gesting that at least part of the effects of the lesions could bedue to alteration of consolidation processes. Nevertheless, wethink it is likely that the effects observed here mainly concernthe acquisition phase, since dorsal hippocampal injections ofmuscimol have been shown to affect the acquisition of a contextrepresentation when performed before but not after contextexposure (Matus-Amat et al., 2004, Experiment 4).

The protocol used in the present study revealed the sensitiv-ity of contextual conditioning to various manipulations. Therole of context in trace conditioning is an important issue,since a number of interpretations focus on the analogiesbetween these two types of conditioning and lead us to expectthat damage to a structure involved in the acquisition of a con-textual representation would cause a deficit in trace condition-ing. Several functional hypotheses have been proposed toaccount for this analogy. It has been suggested for instance thattrace conditioning involves second-order conditioning with thecontext that is present during the trace interval (Quinn et al.,2005). Alternatively, the hippocampus might contribute to‘‘bridging the gap’’ (the trace interval between CS and US) bymaintaining a representation of the CS until the time of USoccurrence. In this perspective, trace conditioning would notrequire any other stimulus than the CS and it might be possi-ble to dissociate trace conditioning from context conditioning(Kehoe et al., 1993; Buhusi and Schmajuk, 1999; Levy et al.,2005). Our results do not clearly dissociate these two types ofconditioning. Some residual trace-conditioned responses couldbe observed when contextual conditioning was abolished byhippocampal manipulations. In addition, the pattern of theseresponses was not qualitatively changed by the hippocampallesion or inactivation. Thus, the absence of context condition-ing may not fully prevent the occurrence of trace-conditionedresponses. We have suggested earlier that models emphasizing apersistent trace of the CS that bridges the temporal gapbetween the CS and US (Marchand and Kamper, 2000;Marchand, 2002) provide a good account of conditionedresponse patterns and are more likely than models relying onthe continued presence of contextual cues to bridge the gap.The effects of dorsal hippocampal inactivation on both trace


Hippocampus

and context conditioning suggest that the dorsal hippocampusmight contribute to integrate contextual information with apersistent trace of the tone CS.

Taken together, our data indicate that both the dorsal hippo-campus and the ventral hippocampus are important during theacquisition phase of trace conditioning. However, the general-ized deficit observed when the ventral hippocampus is notfunctional is consistent with a role of this region in the emo-tional aspects of fear conditioning in general. In contrast, thedorsal hippocampus appears involved in processing the infor-mational aspects of trace conditioning, for instance by enhanc-ing the salience of a persistent trace through its integrationwith contextual elements. Trace conditioning is also likely toinvolve interactions of the hippocampus with cortical structuressuch as the medial prefrontal cortex (Runyan and Dash, 2004;Gilmartin and McEchron, 2005; Powell et al., 2005) and ante-rior cingulate cortex (Han et al., 2003), as well as the entorhi-nal cortex (Ryou et al., 2001).

Acknowledgments

The authors are grateful to D. Panzeri and N. Argenta foranimal care, to L. Decorte and A. Faugere for their help in thehistological work, and to M. Giurfa for valuable discussions.

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Behavioral/Systems/Cognitive

A Cholinergic-Dependent Role for the Entorhinal Cortex inTrace Fear Conditioning

Frederic Esclassan,1,2,3 Etienne Coutureau,1,2 Georges Di Scala,1,2 and Alain R. Marchand1,2

1Centre National de la Recherche Scientifique, Centre de Neurosciences Integratives et Cognitives, Unite Mixte de Recherche (UMR) 5228, and 2Universitede Bordeaux, UMR 5228, F-33405 Talence, France, and 3Universite Paul Sabatier, UMR 5169, F-31062 Toulouse, France

Trace conditioning is considered a model of higher cognitive involvement in simple associative tasks. Studies of trace conditioning haveshown that cortical areas and the hippocampal formation are required to associate events that occur at different times. However, themechanisms that bridge the trace interval during the acquisition of trace conditioning remain unknown. In four experiments with fearconditioning in rats, we explored the involvement of the entorhinal cortex (EC) in the acquisition of fear under a trace-30 s protocol. Wefirst determined that pretraining neurotoxic lesions of the EC selectively impaired trace-, but not delay-conditioned fear as evaluated byfreezing behavior. A local cholinergic deafferentation of the EC using 192-IgG-saporin did not replicate this deficit, presumably becausecholinergic interneurons were spared by the toxin. However, pretraining local blockade of EC muscarinic receptors with the M1 antago-nist pirenzepine yielded a specific and dose-dependent deficit in trace-conditioned responses. The same microinjections performed afterconditioning were without effect on trace fear responses. These effects of blocking M1 receptors are consistent with the notion thatconditioned stimulus (CS)-elicited, acetylcholine-dependent persistent activities in the EC are needed to maintain a representation of atone CS across the trace interval during the acquisition of trace conditioning. This function of the EC is consistent with recent views of thisregion as a short-term stimulus buffer.

IntroductionA number of recent studies have shown that higher-level cognitiveprocesses can be addressed through simple associative learning par-adigms (Holland, 2008). Particularly challenging is the ability to as-sociate events that are causally related but discontiguous in time(Bangasser et al., 2006). In pavlovian trace conditioning, a condi-tioned stimulus (CS) is followed with an unconditioned stimulus(US) after a stimulus-free trace interval that can last hundreds ofmilliseconds in the case of eyeblink conditioning (Gormezano et al.,1983), but tens of seconds in fear conditioning (Marchand and Ka-mper, 2000). As a result, trace conditioning taps more cognitiveresources than standard delay conditioning in which the CS and USare contiguous. It mobilizes attention and awareness (Clark et al.,2002), and requires the participation of specific brain regions such asthe prefrontal cortex (Han et al., 2003) and the hippocampal forma-tion (Solomon et al., 1986; McEchron et al., 1998; Yoon and Otto,2007; Esclassan et al., 2009) in both rodents and humans (Clark andSquire, 1998; Carter et al., 2006).

It has been proposed that the hippocampal formation is re-quired to overcome the temporal discontiguity in trace condi-

tioning (Wallenstein et al., 1998; Bangasser et al., 2006). Its func-tion could be to maintain a representation of the CS over time,since fear responses conditioned with trace intervals of long du-ration (15–30 s) are particularly sensitive to dorsal hippocampallesions (Chowdhury et al., 2005) or pharmacological manipula-tions (Misane et al., 2005), whereas conditioning in the absenceof trace interval (delay conditioning) or with trace intervals ofonly a few seconds is generally unaffected (Selden et al., 1991;Phillips and LeDoux, 1992; McEchron et al., 1998; Chowdhury etal., 2005).

The relative participation of the various components of thehippocampal formation to trace conditioning is as yet poorlyunderstood. Processing of trace stimuli could occur upstream ofthe hippocampus, in the entorhinal cortex (EC) (Ryou et al.,2001). Recent computational theories indeed emphasize the roleof the EC as a short-term temporal buffer for novel information(Hasselmo and Stern, 2006). In vitro recordings moreover indi-cate that neurons from layer V in the medial EC (Egorov et al.,2002) or layer III in the lateral EC (Tahvildari et al., 2007) showvery long persistent responses that are dependent on cholinergictone, and might encode and maintain information about the CSafter its offset. In addition, as a novel stimulus, the CS is expectedto elicit cholinergic activity (Acquas et al., 1996). Consequently,acetylcholine-dependent persistent activity in the EC might sup-port the working memory function required to associate eventsseparated in time (McGaughy et al., 2005).

To explore this hypothesis in rats, we first determined thatpretraining neurotoxic lesions of the EC selectively impairedtrace conditioning. We then evaluated the role of cholinergicafferents using deafferentation by 192-IgG-saporin and local

Received Feb. 2, 2009; revised May 18, 2009; accepted May 19, 2009.This work was supported by grants from the Centre National de la Recherche Scientifique and Conseil Regional

d’Aquitaine. F.E. is a fellow of the Ministere de l’Enseignement Superieur. We are grateful to D. Panzeri, N. Argenta,and J. Huard for animal care, to L. Decorte and A. Faugere for their help in the histological work, and to M. Giurfa forvaluable discussions.

Correspondence should be addressed to Dr. Alain R. Marchand, Centre National de la Recherche Scientifique,Centre de Neurosciences Integratives et Cognitives, UMR 5228, Avenue des Facultes, F-33405 Talence Cedex, France.E-mail: [email protected].

DOI:10.1523/JNEUROSCI.0543-09.2009Copyright © 2009 Society for Neuroscience 0270-6474/09/298087-07$15.00/0

The Journal of Neuroscience, June 24, 2009 • 29(25):8087– 8093 • 8087

pharmacological blockade of M1 muscarinic receptors that arerequired for persistent activities in the EC. We systematicallyevaluated the specificity of these effects in trace versus delayprocedures.

Materials and MethodsSubjects and apparatus. Male naive Long–Evans male rats, received at �8weeks of age from the Centre d’Elevage et de Recherche Janvier (leGenest-St-Isle, France), were pair-housed in standard rat cages (polycar-bonate, 49 � 26 � 20 cm) in a temperature-controlled vivarium under a12 h light cycle (light on at 7:00 A.M.). All rats were given ad libitumaccess to food and water. Animal protocols were conducted in agreementwith the French (council directive 87848, October 19, 1987; permission3306793 to A.R.M.) and international (directive 86-609, November 24,1986, European Community) legislation regarding animal experiments,and care was taken at all stages to minimize stress and discomfort to theanimals. Conditioning took place in eight identical conditioning cham-bers (40 � 35 � 30 cm, Imetronic) made of gray polyvinyl chloride onthree sides and transparent Perspex on the opening face. Each chamberwas located inside a sound-attenuating cubicle with a loudspeaker above.A grid floor (27 parallel 0.5-cm-diameter stainless-steel bars, 1.5 cmapart) above a sawdust tray could deliver mild foot shocks (US, 1 s, 0.4mA scrambled pulses). A ventilation fan provided a background noise of�55 dB. The CS was a tone (5000 Hz, 70 dB, 10 s in duration). Stimuliwere delivered by a computerized interface (Imetronic).

Behavioral procedure. The animals, randomly assigned to either a “de-lay” or a “trace” condition, were submitted to 3 d of conditioning andtesting. During a 30-min-long conditioning session (first day), rats re-ceived five tone-shock pairings at pseudo-random intervals. In the delaycondition, the onset of the shock coincided with the offset of the tone,whereas the shock was presented after a 30 s trace interval following theend of the CS in the trace condition. Twenty-four hours later, the ratswere again placed in their conditioning chamber for 10 min to extinguishcontextual fear. On the following day, conditioned fear to the tone wasevaluated in a 20 min test in an altered context which differed from theoriginal context by visual (black and white visual patterns) and olfactory(removal of the dust tray) features, as well as shape (vertical white sepa-ration on the diagonal of the chamber). During this test, after a 5 minstimulus-free period, the animals received three tone presentations witha fixed interval of 5 min. Conditioned fear was assessed using freezingbehavior, defined as the absence of all movement. Freezing behavior wasquantified using an automatic procedure fully described previously(Marchand et al., 2003; Esclassan et al., 2009). Briefly, images captured byminiature black and white video cameras (SK-2005; OptoVision) moni-tored rats’ movements. An image of the empty cages was subtracted fromeach sampled frame before computing the SD of pixel values (8-bit).Variation of this SD over three consecutive frames corresponded to amovement of the animal. When movement remained below a fixedthreshold (0.075) for at least two consecutive seconds, each second wasnoted as freezing. Freezing scores were the number of seconds noted asfreezing during each period of interest divided by the duration of thesame period.

Surgery. Rats submitted to pretraining excitotoxic lesions of the ento-rhinal cortex were initially anesthetized with a mixture of ketamine (Vir-bac, 100 mg/kg, i.m.), xylazine (Rompun, 13 mg/kg, i.p.) and diazepam(Valium, 3 mg/kg, i.p.). Using a stereotaxic device (Kopf), excitotoxiclesions of the entorhinal cortex were achieved by injecting NMDA (20mg/ml) through a glass pipette fitted to a Hamilton syringe, in seven siteson each side, according to the following coordinates (in mm): anteropos-terior (AP) �6.1, mediolateral (ML) �5.8, dorsoventral (DV) �6.9 (0.05�l); AP �6.5, ML �4.7, DV �7.4 (0.025 �l); AP �7, ML �4.5, DV �6.6(0.05 �l); AP �7, ML �5.8, DV �5.8 (0.075 �l); AP �7.5, ML �4.6, DV�5.8 (0.1 �l); AP �8, ML �4.7, DV �5.3 (0.1 �l); AP �8.5, ML �4.8,DV �3.6 (0.1 �l). Control rats were submitted to sham lesions, with thecortex being exposed and the dura mater breached in several points.

Pretraining lesions of cholinergic terminals within the entorhinal cor-tex were performed in rats maintained under anesthesia with isoflurane(1%). The toxin IgG saporin (Advanced Targeting Systems, 0.4 �g/�l),

dissolved in a phosphate buffer vehicle solution, was injected through anelongated glass pipette (tip diameter 30 �m) using a pressure ejectionsystem (Picospritzer II, General Valve Corporation) at the same coordi-nates as for the excitotoxic lesions (with volumes 0.1, 0.05, 0.05, 0.15, 0.2,0.2, and 0.2 �l, respectively). Rats in the sham group received a similarsurgical procedure with injections of vehicle. Injections were made at therate of 0.1 �l/min, and the pipette was left in place for 5 min after theinjection to allow diffusion of the solution into the tissue. IgG saporininfused directly into the cortex binds to the p75 NTR receptor located oncholinergic terminals and is retrogradely transported to the basal fore-brain, where it induces a selective loss of cholinergic neurons projectingto the target structure (Ohtake et al., 1997).

Cannulation was performed in ketamine/xylazine-anesthetized rats.Stainless-steel guide cannulae (12 mm long, 36 gauge; American Stan-dard Wire Gauge) were implanted into the entorhinal cortex (AP, �7.5;ML, �5.5; DV, �6.5). The guide cannulae were then immobilized in ablock of dental cement (PalavitG) that enclosed three small screws fittinginto the bone. A stylet inserted into the cannula to prevent clogging wasremoved before injection. Injection cannulae that extended 1.5 mm be-yond the guide cannulae were used for drug infusions.

After surgery, animals were returned to the vivarium and left to re-cover for 2 weeks with ad libitum access to food and water.

Pharmacological injections. The M1 receptor antagonist pirenzepinewas dissolved in artificial CSF (aCSF) to provide a concentration of 10mg/ml or 15 mg/ml. Then a volume of 0.3 �l per side was injected by amotorized infusion pump at a rate of 0.2 �l/min, 20 min before theconditioning session in the pretraining experiment or immediately(within 3 min) after the conditioning session in the post-training exper-iment. The test sessions were performed in the absence of drug. Controlrats received the same volume of aCSF.

Histology and immunohistochemistry. At the completion of behavioraltesting, all animals received a lethal dose of sodium pentobarbital (CevaSante Animale). For the histological control of excitotoxic lesions andcannulae placement, rats were perfused transcardially with 60 ml of a0.9% sodium chloride solution, followed by 120 ml of a 10% formalde-hyde solution. Brains were stored in a 30% sucrose–formalin solution for72 h before being cut in 50 �m sections with a freezing microtome (LeicaSM2400). After being collected onto gelatin-coated slides, brain sectionswere left to dry for 48 h, and finally they were stained with thionin.Section reconstructions were drawn in reference to the atlas of Paxinosand Watson (1998).

To assess the extent of cholinergic denervation, rats were perfusedtranscardially with 300 ml of NaCl 0.9% solution, followed by 300 ml ofparaformaldehyde (PFA) 4% solution in 0.1 M phosphate buffer (PB).The brains were removed, postfixed overnight in PFA 4%, and trans-ferred to a PB 0.1 M/sucrose 30% solution for 48 h at 4°C. Serial coronalsections (50 �m thick) collected and stored in a buffer solution (PB 0.1M/azide 0.03%) were processed for choline acetyltransferase (ChAT) im-munostaining. Free-floating sections were incubated with ChAT primaryantibody (1/1000) for 24 h at 4°C on a shaker. They were then incubatedwith biotinylated donkey anti-goat secondary antibody (1/2000 in PB0.3%, Jackson ImmunoResearch) for 90 min at room temperature. Theywere then incubated with avidin– biotin–peroxidase complex (VectorLaboratories) for 90 min at room temperature. The final staining wasmade with a diaminobenzidine (Sigma-Aldrich) and hydrogen peroxidesolution. Sections were rinsed with Tris buffer, collected on gelatin-coated slides, dehydrated with toluene, and mounted in Eukitt mountingmedium.

To provide an evaluation of fiber loss, labeled sections were photo-graphed under an Olympus BX50 microscope with a 20� lens, con-nected to a Sony DXC-950 camera. Microphotographs of 89 sections ofentorhinal cortex (ranging from bregma �6.4 to �7.5) were examined.For each section, five circular regions of 200 �m diameter per hemi-sphere were considered. Quantification of ChAT immunoreactivity wasperformed using an automated method developed in the laboratory us-ing NIH ImageJ software. To determine the number of labeled particles,a black and white digitized version of the microphotograph wassmoothed with a Gaussian filter (diameter 12 pixels) and subtracted fromthe original picture to isolate high spatial frequencies. The picture was

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then subjected to a fixed threshold to identify labeled elements and to asingle dilation step to minimize bias by large objects. The number ofdetected pixels in the circle of interest was then divided by an estimate ofthe area of each particle (14 pixels) and by the area of the region ofinterest to yield an estimate of the number and density of particles.

Data analysis. Freezing scores (fraction of time spent freezing) wereaveraged over specific periods of interest. For the conditioning session,the minute following each of the 5 shocks (postshock freezing) was ana-lyzed in a repeated-measures design. Responses during and after eachtone presentation were also examined. For the tone test, freezing re-sponses during the three tone presentations were averaged. These datawere analyzed using a two-way ANOVA with condition (delay vs trace)and treatment (lesion or drug) as factors. Partial ANOVAs and Student–Newman–Keuls (SNK) post hoc tests complemented the analysis whenappropriate. The � risk was 0.05 throughout.

ResultsEntorhinal involvement in trace conditioningTo examine the involvement of EC integrity in trace fear condition-ing, two groups of rats were conditioned with a trace protocol afterEC or sham lesions, T30/entorhinal-lesioned (ENT) (n � 13) andT30/sham (n � 9), and two other groups were conditioned with adelay protocol, D/ENT (n � 11) and D/sham (n � 9). Figure 1, Aand B, illustrates the extent of damage to the EC in the lesionedgroups. The cell loss was centered on the medial part of the EC butextended to the lateral EC in most subjects. Freezing during theconditioning session developed normally in all groups [lesion ef-fects; largest F(1,38) � 2.98, not significant (n.s.)], with an importantcarryover of fear from previous shocks. The tone and post-tone re-sponses were thus not informative at this stage of the experiment(supplemental Fig. 1, available at www.jneurosci.org as supplemen-

tal material). Figure 1C shows the tone-induced freezing during the final test in allgroups. The lesion induced a strong reduc-tion of tone-conditioned freezing in the tracegroup (F(1,20) � 11.98, p � 0.01), but not inthe delay group (F(1,18) � 0.09, n.s.), the in-teraction between lesion and protocol beingsignificant (F(1,38) � 6.87, p � 0.05). The cellbody lesion of the EC therefore induced aselective deficit in trace-conditioned fear.

Effects of a cholinergic deafferentationof the entorhinal cortexTo examine the role of cholinergic affer-ents to the EC during trace conditioning,two groups of rats were submitted to acholinergic deafferentation of the EC with192-IgG-saporin (SAP). Two weeks later,they were conditioned with a trace proto-col (T30/SAP, n � 10) or a delay protocol(D/SAP, n � 10), and compared with con-trol groups having received an injection ofvehicle (T30/PB, n � 9 and D/PB, n � 10).Figure 2A illustrates the loss of ChAT im-munoreactivity produced by the local in-jection of SAP. As evidenced in Figure 2B,the number of detected fibers was reducedon average by 76% in the EC of SAP-treated animals (F(1,33) � 36.6, p �0.0001). In contrast, similar numbers ofimmunostained cell bodies could be ob-served in lesioned and control rats (F(1,33)

� 0.32, n.s.), indicating the presence ofcholinergic interneurons that were not af-

fected by the toxin. During the conditioning session, freezingdeveloped normally in all groups (largest F(1,33) � 3.04, n.s.). Asshown in Figure 2C, there was no significant effect of the deaffer-entation on tone-induced freezing (largest F(1,33) � 0.71, n.s.).Thus, the loss of cholinergic afferents induced by SAP did notaffect trace-conditioned fear.

Role of entorhinal M1 receptors in trace conditioningThe possible contribution of cholinergic mechanisms to the ac-quisition of trace conditioning was further assessed by blockingpostsynaptic muscarinic receptors in the EC. Rats implanted withguide-cannulae in the EC were microinjected with one of twodoses of pirenzepine (10 mg/ml or 15 mg/ml) or vehicle (aCSF)and conditioned with either a trace or a delay protocol, thusyielding six groups: T30/P10 (n � 7), D/P10 (n � 9), T30/P15(n � 9), D/P15 (n � 8), T30/aCSF (n � 8), and D/aCSF (n � 8).Injection sites are depicted in Figure 3A. They were located in theEC in all animals. During the acquisition session, there was nosignificant effect of injection group on postshock freezing (largestF(2,43) � 0.76, n.s.), and responses to the tone were not affected bythe treatment (supplemental Fig. 2, available at www.jneuro-sci.org as supplemental material). Figure 3B presents the toneresponse at test in each of the groups. Rats injected with pirenz-epine displayed attenuated trace-conditioned responses. The ef-fects of injection were indeed significant in the trace condition(F(2,21) � 4.51, p � 0,05), but not in the delay condition (F(2,22) �0.75, n.s.), although the interaction between lesion and protocolwas not significant (F(2,43) � 0.97, n.s.). The SNK post hoc testindicated that only rats injected with the largest dose showed

Figure 1. Cell body lesions of the entorhinal cortex impair trace-conditioned fear responses. A, Extent of lesions of the ento-rhinal cortex in the rat sustaining the most extensive (gray) or least extensive (black) lesions. Diagrams adapted from Paxinos andWatson (1998), with distance from bregma in millimeters. B, Photomicrographs at bregma �7.40 mm of brain sections stainedwith thionin in a representative lesioned rat (ENT, right) and a control rat (sham, left) show a massive cell loss in both medial andlateral entorhinal cortex. C, Conditioned freezing to the tone in the ENT, trace-conditioned group (right) is markedly reduced withrespect to control rats (sham), whereas freezing in the delay-conditioned group (left) is unaffected. **p � 0.01.

Esclassan et al. • Entorhinal Cortex and Trace Conditioning J. Neurosci., June 24, 2009 • 29(25):8087– 8093 • 8089

reduced trace-conditioned responses. Theblockade of M1 receptors before condi-tioning thus selectively and dose-dependently attenuated trace-conditionedfear, confirming the effects of neurotoxiclesions observed in our first experiment. Inaddition, two groups of rats conditionedwith a trace protocol were microinjectedwith the higher dose (15 mg/ml) of piren-zepine or vehicle in the EC immediatelyafter conditioning. No significant effect ofthese injections on trace-conditioned re-sponses could be detected (aCSF, 52 �10%; PIR15, 39 � 10% freezing and SEM,F(1,16) � 0.96, n.s). These results are con-sistent with the hypothesis that pirenz-epine microinjections suppressed persis-tent activities required to bridge the traceinterval during, but not after, the acquisi-tion phase of trace conditioning.

DiscussionThe present work provides novel indica-tions about the role of the entorhinal cor-tex in the acquisition of trace condition-ing. We show that conditioned fearresponses to a tone are disrupted by pre-training cell body lesions of the entorhinalcortex under a trace protocol, but not un-der a delay protocol. Local injections of the toxin 192-IgG-saporin strongly reduced the number of cholinergic terminals inthe EC but failed to affect conditioned responses. Nevertheless,microinjections of the M1 muscarinic receptor antagonist piren-zepine within the EC replicated the effects of lesions when per-formed before but not after conditioning.

Our study was focused on the acquisition phase of trace con-ditioning. During the conditioning session itself, the freezing re-sponse during and after the CS largely reflected residual fear fromthe previous shock, so that no group differences emerged in anyof the experiments. Differences in learning were thus only evidentduring subsequent tests. The effects of pretraining neurotoxiclesions of the EC on trace fear conditioning extend the findings ofRyou et al. (2001), obtained in the conditioned eyeblink prepa-ration, and furthermore show that this deficit is selective to traceconditioning, sparing delay conditioning. We recently showedthat the dorsal part of the hippocampus is specifically required toestablish trace fear conditioning, whereas the ventral part alsocontributed, but in a less specific manner (Esclassan et al., 2009).It is, however, unlikely that the EC serves as a simple relay for thetransmission of information from the sensory thalamus andparahippocampal cortices to the hippocampus (Kerr et al., 2007).Indeed, an increasing number of studies indicate distinct roles ofthe EC and of the hippocampus proper in information processing(Coutureau et al., 1999, 2002; Shohamy et al., 2000; Talnov et al.,2003; Sargolini et al., 2006). Moreover, no persistent activitybridging the long time gap between the CS and US has so far beenrecorded in the hippocampus proper during trace fear condition-ing (Gilmartin and McEchron, 2005). Processing could take placein the EC and the information could be relayed not only to thehippocampus, but also directly to subcortical structures involvedin fear conditioning, such as the amygdalar complex (Pitkanen etal., 2000) or the nucleus accumbens (Totterdell and Meredith,

1997). This might allow the EC to substitute for the auditorycortex in the classical circuit (LeDoux, 2000) of fear conditioning.

Our data highlight the contribution of cholinergic innerva-tion within the EC to trace conditioning. The local injections ofthe toxin 192-IgG-saporin directly into the EC used here pro-duced an anatomically selective and drastic decrease in the num-ber of immunoreactive fibers within the EC. This denervationwas without effect, in contrast with a previous report of an im-pairment of trace conditioning after neurotoxic lesions of themedial septum/diagonal band (McAlonan et al., 1995). However,the latter lesions were less selective, eliminating not only cholin-ergic projections to the hippocampus and entorhinal cortex, butalso to the anterior cingulate cortex (Gaykema et al., 1990), whichappears involved in trace conditioning (Han et al., 2003). How-ever, deficits in a working memory task requiring the mainte-nance of novel olfactory information can be induced by the in-jection of a large volume of SAP into the EC (McGaughy et al.,2005). We observed residual cholinergic fibers in the EC of deaf-ferented rats, as well as similar numbers of immunoreactive cellbodies as in control rats, corresponding to bipolar cholinergicinterneurons that are known to provide an important source(�30%) of cholinergic innervation in the cortex (Bayraktar et al.,1997). These neurons appear insensitive to the toxin, presumablybecause they do not express the p75 NTR receptor (de Lacalle etal., 1998), and they should thus prevent a complete denervationby 192-IgG-saporin. Residual levels of acetylcholine may be suf-ficient for the present task, as observed in other preparations(Gutierrez et al., 1999; Chudasama et al., 2004; Marques Pereiraet al., 2005). A fraction of cortical cholinergic interneurons thatexpress vasoactive intestinal polypeptide has been suggested toparticipate in local cerebrovascular regulation (Chedotal et al.,1994), but their functional role, in general, and in the EC, inparticular, is largely unknown (Bayraktar et al., 1997) and mayhave been underestimated. Alternatively, we cannot exclude that

Figure 2. Cholinergic deafferentation of the entorhinal cortex does not affect trace conditioning. A, Schema and microphoto-graphs illustrating the loss of ChAT-immunoreactive terminals in the lateral entorhinal cortex (rectangular area) after localinjections of the toxin SAP compared with vehicle injections (PB). Scale bar, 100 �m. B, Quantification of deafferentation (seeMaterials and Methods). Rats treated with SAP show �76% decrease in the density of ChAT immunoreactivity (fibers; left), inboth the delay- and trace-conditioned groups. The number of labeled interneurons (cell bodies; right) is similar in control andSAP-treated rats. C, Conditioned freezing to the tone in both delay- and trace-conditioned groups is unaffected by the SAPtreatment. **p � 0.0001.


the cholinergic deafferentation may have induced compensatorychanges in the expression of metabotropic glutamate receptors,resulting in facilitation or restoration of persistent firing in ento-rhinal cortex neurons (Yoshida et al., 2008).

Our results clearly indicate that cholinergic activity within theEC is required for trace conditioning, since pirenzepine injecteddirectly into the EC was sufficient to greatly impair trace fearresponses. Most of the effects of the antagonist appear to be re-stricted to the acquisition phase, since pirenzepine had no signif-icant effect when injected just after the conditioning session. Thisindicates that putative effects of pirenzepine on consolidationprocesses are less important than effects in acquisition, in agree-ment with our hypothesis. Moreover, these effects are selectivefor trace conditioning, since rats conditioned under a delay pro-tocol were not impaired. Pirenzepine may affect neuronal re-sponses up to 5 h after injection, but not after 24 h (Bocian andKonopacki, 2004), so that the drug was absent during the tonetest conducted 48 h after injection in both the pretraining andpost-training injection experiments. Our data nevertheless donot exclude the possibility that the EC may also contribute to theexpression of trace-, but not of delay-conditioned responses. Thisissue would require further studies, since inactivating the EC attest in aversive tasks does not appear to produce consistent effects(Izquierdo et al., 1997; Baldi et al., 1998; Lewis and Gould, 2007).

Data about the role of cholinergic modulation of the EC intasks requiring the short-term maintenance of information arestill scarce (Tang et al., 1997; McGaughy et al., 2005). Neverthe-less, systemic injections of muscarinic antagonists have beenshown to impair trace conditioning (Kaneko and Thompson,1997; Seager et al., 1999; Hunt et al., 2006), and the EC could be asite of action for these drugs.

The effects of pirenzepine in vivo indicate that trace condi-tioning and the persisting activities that have been described invitro (Egorov et al., 2002) both depend on the activation of M1receptors within the EC. The M1 receptor is largely representedon cortical and striatal cell bodies and neurites, consistent with itsrole as a major postsynaptic muscarinic receptor (Levey et al.,1991). Blocking M1 receptors in the EC with pirenzepine may

thus prevent both septohippocampal cholinergic activation andthe effects of residual acetylcholine released by interneurons.

Persistent activities in the EC could contribute to trace condi-tioning in the following way. A natural stimulus, such as the toneused as a CS, may depolarize entorhinal neurons (Vinogradova,2001), as well as activate septohippocampal cholinergic projec-tions (Acquas et al., 1996), thereby triggering persistent activities.Intrinsic membrane properties in the EC are sufficient to main-tain a trace of novel stimuli without the need for synaptic plastic-ity (Hasselmo and Stern, 2006). The activities constituting thetrace could thus become associated with the US at the end of thetrace interval by simple contiguity. Further experiments would beneeded to confirm the role and duration of persistent activities invivo.

We did not present here the freezing response after CS offsetsince, as previously reported (Esclassan et al., 2009), it essentiallyfollows the pattern observed during the CS itself. Interestingly,this absence of temporal specificity with long trace intervals(Marchand and Kamper, 2000; Quinn et al., 2002; Marchand etal., 2003) may be attributable to the fact that temporally stablepersistent discharges do not bear information about elapsed time.This contrasts with trace eyeblink conditioning, for whichhippocampal-dependent, temporally selective mechanisms havebeen proposed (Grossberg and Merrill, 1992; Levy et al., 2005;Hasselmo et al., 2007). Nevertheless, acetylcholine is rapidly de-graded by hydrolysis in the cortex (Bruno et al., 2006), which maylimit the range of acceptable trace intervals. This would be con-sistent with the facilitation of trace conditioning by cholinester-ase inhibitors that has been observed in young rats (Hunt andRichardson, 2007). In addition, long trace intervals should in-crease the likelihood of distractors resetting neuronal activity,thereby preventing conditioning (Han et al., 2003).

To date, the involvement of the entorhinal cortex in trace fearconditioning had not been previously reported. The requirementfor the EC in the absence of temporal contiguity (Chowdhury etal., 2005; Bangasser et al., 2006) is consistent with a role of thisstructure as a short-term temporal buffer (Hasselmo and Stern,2006). According to this notion, successive stimuli occurring in

Figure 3. Effects of pirenzepine microinjections in the entorhinal cortex. A, Location of the injection sites in the entorhinal cortex of rats injected bilaterally with 0.3 �l of aCSF or two doses ofpirenzepine (P10, 10 mg/ml; P15, 15 mg/ml). Diagrams adapted from Paxinos and Watson (1998), with distance from bregma in millimeters. B, Conditioned freezing to the tone in thetrace-conditioned group injected with pirenzepine before conditioning is markedly reduced with respect to rats injected with vehicle (right), whereas freezing in the delay-conditioned group (left)is unaffected. *p � 0.05.


the environment would be gradually incorporated into the pat-tern of EC neuronal activity, the trace of the older stimuli decay-ing as new events appear. Finally, cortical processing of the CSwithin the entorhinal cortex might explain why trace condition-ing requires conscious awareness of the relationship between theCS and US events (Clark and Squire, 1998; Carter et al., 2003).

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AUTHOR: Frédéric ESCLASSAN. TITLE: NATURE AND NEUROBIOLOGICAL SUBSTRATE OF TRACE CONDITIONING: a study using conditioned fear in rats. PhD SUPERVISOR: Dr Alain MARCHAND and Pr Martin GIURFA. PLACE AND DATE OF THE DEFENSE: 19/12/2008, Université Paul Sabatier, Toulouse, France. ABSTRACT Trace conditioning is a special case of Pavlovian conditioning where the conditional stimulus (CS) and the unconditional stimulus (US) are separated by a stimulus-free time interval. Establishing an association between these two stimuli appears to contradict the law of Contiguity. To explain how stimuli can be associated across time, two hypotheses have been developed. The Contextual Mediation hypothesis relies upon the hippocampal function, whereas the Persistent Trace hypothesis could be based on structures involved in working memory such as the medial prefrontal cortex or the entorhinal cortex (EC). In this thesis, we assess, in a fear conditioning task, the sensitivity of trace and contextual conditioning to lesions or reversible manipulations of these structures, in rats conditioned with a 30 s trace interval or with a delay protocol. The results suggest that both hypotheses may account for at least part of the trace conditioning phenomenon. However, a special role may be attributed to the EC in maintaining a CS representation across the Trace interval. In particular, we show that this process requires cholinergic activity in the EC during the acquisition of Trace conditioning and that this form of conditioning could rely upon neurons in the EC displaying persistent activities, as has been shown in working memory tasks. KEYWORDS Hippocampus – Classical conditioning – Learning – Entorhinal Cortex – Rat – Context – Trace conditioning – Prefrontal cortex. DISCIPLINE Neuroscience NAME AND ADDRESS OF THE LABORATORY Centre de Neurosciences Intégratives et Cognitives, UMR 5228 CNRS – Université de Bordeaux1, Avenue des Facultés, Bâtiment B2 33405 Talence Cedex.

& Centre de Recherches sur la Cognition Animale, UMR 5169, CNRS – Université Paul Sabatier, Bât IVR3, 118 route de Narbonne 31062 Toulouse cedex 09, France.

AUTEUR : Frédéric ESCLASSAN. TITRE : NATURE ET SUBSTRAT NEUROBIOLOGIQUE DU CONDITIONNEMENT DE TRACE : Etude en conditionnement de peur chez le rat. DIRECTEUR DE THESE : Dr Alain MARCHAND et Pr Martin GIURFA. LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : 19/12/2008, Université Paul Sabatier, Toulouse, France. RESUME Le conditionnement de Trace est une forme particulière de conditionnement pavlovien dans laquelle le stimulus conditionnel (SC) et le stimulus inconditionnel (SI) sont séparés par un intervalle de temps. La possibilité d’établir une association entre ces deux stimuli va à l’encontre de la loi de contiguïté. Pour expliquer comment l’absence de contiguïté est compensée, deux hypothèses ont été formulées. L’hypothèse de la Médiation Contextuelle repose sur la fonction hippocampique, alors que l’hypothèse de la Trace persistante pourrait reposer sur des structures impliquées dans la mémoire de travail telles que le cortex préfrontal médian ou le cortex entorhinal (CE). Ce travail de thèse examine lors d’un conditionnement de peur, la sensibilité respective du conditionnement de Trace et du conditionnement contextuel vis-à-vis de lésions ou d’inactivations réversibles de ces structures, dans des groupes de rats conditionnés avec un intervalle de Trace de 30 s ou en protocole de Délai. Les résultats obtenus laissent supposer que chacun des deux mécanismes proposés pourrait être impliqués. Cependant, un rôle particulier pourrait être attribué au CE dans le maintien d’une représentation du SC durant l’intervalle de Trace. Nous montrons en particulier que ce maintien nécessiterait une activité cholinergique dans cette structure durant l’acquisition et qu’il pourrait reposer sur la présence dans le CE de neurones à activités persistantes supposées impliquées dans les processus de mémoire de Travail. MOTS-CLEFS Hippocampe – Conditionnement classique – Apprentissage – Cortex Entorhinal – Rat – Contexte – Conditionnement de Trace – Cortex préfrontal. DISCIPLINE ADMINISTRATIVE Neurosciences INTITULE ET ADRESSE DU LABORATOIRE Centre de Neurosciences Intégratives et Cognitives, UMR 5228 CNRS – Université de Bordeaux1, Avenue des Facultés, Bâtiment B2 33405 Talence Cedex.

& Centre de Recherches sur la Cognition Animale, UMR 5169, CNRS – Université Paul Sabatier, Bât IVR3, 118 route de Narbonne 31062 Toulouse cedex 09, France.

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Version FINALE coquilles revues 26 10