3eacuteme anneacutee PARASITOLOGIE
Techniques drsquoeacutetude en parasitologie
Dr BENTAHAR Assia
Deacutepartement de Biologie et Physiologie Animale
Universiteacute Ferhat Abbas Seacutetif 1
Faculteacute des Sciences de la Nature et de la Vie
TECHNIQUES DrsquoEacuteTUDE EN PARASITOLOGIE
OBJECTIF
Agrave connaitre les diffeacuterentes meacutethodes de recherches
des parasites selon
leurs groupes et leur localisation
-Protozoires
-Helminthes
-Arthropodes
-P intestinaux
-P sanguins
-P urinaires
Maladie parasitaire
-Historique
-Le parasite biologie
-Reacutepartition geacuteographique
-Description clinique
-Pathogeacutenie
-Deacutefense de lrsquoorganisme
-Diagnostic
biologique -Theacuterapeutique
-Prophylaxie
Modes de parasitisme
Localisation
Classification
Cycle eacutevolutif
-D drsquoorientation clinique
-D direct ou parasitologique
-D indirect ou immunologique
DIAGNOSTIC DIRECTE
PRELEVEMENT
PREPARATION
LrsquoEXAMEN
Selle urine sang
vaginaux ureacutetraux
Cutaneacutes autres
Cleacutes de deacutetermination
des œufs et larves
Chaque parasite nrsquoest
bien mis en eacutevidence
que par la technique qui
lui est adapteacute
Un examen neacutegatif isoleacute nrsquoa aucune valeur drsquoeacutelimination
Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)
-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au
laboratoire
-trousse de secours
-vecirctements protecteurs
-nettoyer les paillasses (deacutetergent et
deacutesinfectent les surfaces)
-se laver les mains
-manipulation des preacutelegravevements exige des
preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des
preacutelegravevement de sang (potentiellement
infectieux)
-eacutelimination des lames porte-objets
Entretien du microscope
Ce que vous devez faire
Etalonnage du microscope
taille est un critegravere important
(kyste et œufs)
cellule heacutematimegravetrique
un micromegravetre oculaire
LA COPROLOGIE
PARASITAIRE
Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites
La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des
selles EPS met en eacutevidence et identifie
Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et
helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)
Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de
leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni
(vit dans le plexus veineux)
LrsquoEPS mettra en eacutevidence
- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en
dehors des selles
- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf
drsquoAncylostoma duodenalis
- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis
les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont
fragiles dans le milieu exteacuterieur
Preacuteparation du malade
Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires
pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches
(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins
Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux
- Les antibiotiques et les sulfamides
- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine
les suppositoires
--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de
contraste comme la baryte
Fiche clinique
acircge sexe adresse animaux de compagnie profession
(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut
immunitaire
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
TECHNIQUES DrsquoEacuteTUDE EN PARASITOLOGIE
OBJECTIF
Agrave connaitre les diffeacuterentes meacutethodes de recherches
des parasites selon
leurs groupes et leur localisation
-Protozoires
-Helminthes
-Arthropodes
-P intestinaux
-P sanguins
-P urinaires
Maladie parasitaire
-Historique
-Le parasite biologie
-Reacutepartition geacuteographique
-Description clinique
-Pathogeacutenie
-Deacutefense de lrsquoorganisme
-Diagnostic
biologique -Theacuterapeutique
-Prophylaxie
Modes de parasitisme
Localisation
Classification
Cycle eacutevolutif
-D drsquoorientation clinique
-D direct ou parasitologique
-D indirect ou immunologique
DIAGNOSTIC DIRECTE
PRELEVEMENT
PREPARATION
LrsquoEXAMEN
Selle urine sang
vaginaux ureacutetraux
Cutaneacutes autres
Cleacutes de deacutetermination
des œufs et larves
Chaque parasite nrsquoest
bien mis en eacutevidence
que par la technique qui
lui est adapteacute
Un examen neacutegatif isoleacute nrsquoa aucune valeur drsquoeacutelimination
Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)
-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au
laboratoire
-trousse de secours
-vecirctements protecteurs
-nettoyer les paillasses (deacutetergent et
deacutesinfectent les surfaces)
-se laver les mains
-manipulation des preacutelegravevements exige des
preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des
preacutelegravevement de sang (potentiellement
infectieux)
-eacutelimination des lames porte-objets
Entretien du microscope
Ce que vous devez faire
Etalonnage du microscope
taille est un critegravere important
(kyste et œufs)
cellule heacutematimegravetrique
un micromegravetre oculaire
LA COPROLOGIE
PARASITAIRE
Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites
La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des
selles EPS met en eacutevidence et identifie
Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et
helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)
Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de
leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni
(vit dans le plexus veineux)
LrsquoEPS mettra en eacutevidence
- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en
dehors des selles
- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf
drsquoAncylostoma duodenalis
- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis
les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont
fragiles dans le milieu exteacuterieur
Preacuteparation du malade
Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires
pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches
(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins
Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux
- Les antibiotiques et les sulfamides
- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine
les suppositoires
--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de
contraste comme la baryte
Fiche clinique
acircge sexe adresse animaux de compagnie profession
(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut
immunitaire
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Maladie parasitaire
-Historique
-Le parasite biologie
-Reacutepartition geacuteographique
-Description clinique
-Pathogeacutenie
-Deacutefense de lrsquoorganisme
-Diagnostic
biologique -Theacuterapeutique
-Prophylaxie
Modes de parasitisme
Localisation
Classification
Cycle eacutevolutif
-D drsquoorientation clinique
-D direct ou parasitologique
-D indirect ou immunologique
DIAGNOSTIC DIRECTE
PRELEVEMENT
PREPARATION
LrsquoEXAMEN
Selle urine sang
vaginaux ureacutetraux
Cutaneacutes autres
Cleacutes de deacutetermination
des œufs et larves
Chaque parasite nrsquoest
bien mis en eacutevidence
que par la technique qui
lui est adapteacute
Un examen neacutegatif isoleacute nrsquoa aucune valeur drsquoeacutelimination
Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)
-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au
laboratoire
-trousse de secours
-vecirctements protecteurs
-nettoyer les paillasses (deacutetergent et
deacutesinfectent les surfaces)
-se laver les mains
-manipulation des preacutelegravevements exige des
preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des
preacutelegravevement de sang (potentiellement
infectieux)
-eacutelimination des lames porte-objets
Entretien du microscope
Ce que vous devez faire
Etalonnage du microscope
taille est un critegravere important
(kyste et œufs)
cellule heacutematimegravetrique
un micromegravetre oculaire
LA COPROLOGIE
PARASITAIRE
Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites
La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des
selles EPS met en eacutevidence et identifie
Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et
helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)
Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de
leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni
(vit dans le plexus veineux)
LrsquoEPS mettra en eacutevidence
- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en
dehors des selles
- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf
drsquoAncylostoma duodenalis
- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis
les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont
fragiles dans le milieu exteacuterieur
Preacuteparation du malade
Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires
pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches
(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins
Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux
- Les antibiotiques et les sulfamides
- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine
les suppositoires
--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de
contraste comme la baryte
Fiche clinique
acircge sexe adresse animaux de compagnie profession
(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut
immunitaire
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
DIAGNOSTIC DIRECTE
PRELEVEMENT
PREPARATION
LrsquoEXAMEN
Selle urine sang
vaginaux ureacutetraux
Cutaneacutes autres
Cleacutes de deacutetermination
des œufs et larves
Chaque parasite nrsquoest
bien mis en eacutevidence
que par la technique qui
lui est adapteacute
Un examen neacutegatif isoleacute nrsquoa aucune valeur drsquoeacutelimination
Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)
-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au
laboratoire
-trousse de secours
-vecirctements protecteurs
-nettoyer les paillasses (deacutetergent et
deacutesinfectent les surfaces)
-se laver les mains
-manipulation des preacutelegravevements exige des
preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des
preacutelegravevement de sang (potentiellement
infectieux)
-eacutelimination des lames porte-objets
Entretien du microscope
Ce que vous devez faire
Etalonnage du microscope
taille est un critegravere important
(kyste et œufs)
cellule heacutematimegravetrique
un micromegravetre oculaire
LA COPROLOGIE
PARASITAIRE
Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites
La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des
selles EPS met en eacutevidence et identifie
Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et
helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)
Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de
leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni
(vit dans le plexus veineux)
LrsquoEPS mettra en eacutevidence
- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en
dehors des selles
- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf
drsquoAncylostoma duodenalis
- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis
les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont
fragiles dans le milieu exteacuterieur
Preacuteparation du malade
Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires
pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches
(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins
Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux
- Les antibiotiques et les sulfamides
- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine
les suppositoires
--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de
contraste comme la baryte
Fiche clinique
acircge sexe adresse animaux de compagnie profession
(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut
immunitaire
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Seacutecuriteacute au laboratoire (principes geacuteneacuteraux)
-un manuel des consignes de seacutecuriteacute au
laboratoire
-trousse de secours
-vecirctements protecteurs
-nettoyer les paillasses (deacutetergent et
deacutesinfectent les surfaces)
-se laver les mains
-manipulation des preacutelegravevements exige des
preacutecautions particuliegraveres surtouts en cas des
preacutelegravevement de sang (potentiellement
infectieux)
-eacutelimination des lames porte-objets
Entretien du microscope
Ce que vous devez faire
Etalonnage du microscope
taille est un critegravere important
(kyste et œufs)
cellule heacutematimegravetrique
un micromegravetre oculaire
LA COPROLOGIE
PARASITAIRE
Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites
La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des
selles EPS met en eacutevidence et identifie
Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et
helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)
Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de
leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni
(vit dans le plexus veineux)
LrsquoEPS mettra en eacutevidence
- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en
dehors des selles
- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf
drsquoAncylostoma duodenalis
- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis
les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont
fragiles dans le milieu exteacuterieur
Preacuteparation du malade
Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires
pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches
(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins
Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux
- Les antibiotiques et les sulfamides
- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine
les suppositoires
--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de
contraste comme la baryte
Fiche clinique
acircge sexe adresse animaux de compagnie profession
(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut
immunitaire
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Entretien du microscope
Ce que vous devez faire
Etalonnage du microscope
taille est un critegravere important
(kyste et œufs)
cellule heacutematimegravetrique
un micromegravetre oculaire
LA COPROLOGIE
PARASITAIRE
Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites
La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des
selles EPS met en eacutevidence et identifie
Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et
helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)
Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de
leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni
(vit dans le plexus veineux)
LrsquoEPS mettra en eacutevidence
- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en
dehors des selles
- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf
drsquoAncylostoma duodenalis
- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis
les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont
fragiles dans le milieu exteacuterieur
Preacuteparation du malade
Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires
pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches
(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins
Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux
- Les antibiotiques et les sulfamides
- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine
les suppositoires
--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de
contraste comme la baryte
Fiche clinique
acircge sexe adresse animaux de compagnie profession
(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut
immunitaire
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
LA COPROLOGIE
PARASITAIRE
Chapitre 1 Premiegraveres observations des parasites
La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des
selles EPS met en eacutevidence et identifie
Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et
helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)
Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de
leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni
(vit dans le plexus veineux)
LrsquoEPS mettra en eacutevidence
- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en
dehors des selles
- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf
drsquoAncylostoma duodenalis
- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis
les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont
fragiles dans le milieu exteacuterieur
Preacuteparation du malade
Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires
pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches
(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins
Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux
- Les antibiotiques et les sulfamides
- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine
les suppositoires
--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de
contraste comme la baryte
Fiche clinique
acircge sexe adresse animaux de compagnie profession
(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut
immunitaire
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
La coprologie parasitaire ou lrsquoexamen parasitologique des
selles EPS met en eacutevidence et identifie
Les parasites vivants dans le tube digestif Ex Protozoaires et
helminthes (Ascaris lumbricoides tronguiloides stercoralis)
Les parasites pour les quelles les selles sont un moyen drsquoeacutelimination de
leur forme de disseacutemination dans le milieu exteacuterieur Ex Schistosoma mansoni
(vit dans le plexus veineux)
LrsquoEPS mettra en eacutevidence
- une partie du parasite Ex Anneaux deTaenia saginata qui se deacutetachent en
dehors des selles
- une forme eacutevolutive du parasite (larve et oeuf drsquohelminthe) Ex oeuf
drsquoAncylostoma duodenalis
- la forme deacutefinitive du parasite Ex adulte drsquohelminthe Strongyloides stercoralis
les formes veacutegeacutetatives des amibes et des flagelleacutes sont
fragiles dans le milieu exteacuterieur
Preacuteparation du malade
Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires
pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches
(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins
Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux
- Les antibiotiques et les sulfamides
- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine
les suppositoires
--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de
contraste comme la baryte
Fiche clinique
acircge sexe adresse animaux de compagnie profession
(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut
immunitaire
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Preacuteparation du malade
Reacutegime alimentaire limiteacute avant de faire lrsquoexamen Eacuteviter de consommer Les fruits agrave cuticule dure (poires
pommes) Feacuteculents et graines agrave enveloppes segraveches
(lentillefegraveves) Foie drsquoovins ou de bovins
Arrecircter des meacutedicaments - Les antiseptiques intestinaux
- Les antibiotiques et les sulfamides
- Les laxatifs tels que le bismuth le charbon lhuile de paraffine
les suppositoires
--Ne pas faire de radiologie digestive utilisant des produits de
contraste comme la baryte
Fiche clinique
acircge sexe adresse animaux de compagnie profession
(veacuteteacuterinaire agriculteur) habitudes alimentaires statut
immunitaire
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
PRELEVEMENT
Nombre de preacutelegravevements
Une seul analyse ne permet de deacuteceler la preacutesense
drsquoeacuteleacutements parasitaires que dans 30 des cas
- Rareteacute des eacuteleacutements parasitaires
- Efficaciteacute des techniques utiliseacutees
-Une peacuteriode muette de rejet des eacutelements
caracteacuteristiques (giardiase amibiase)
Il faut dans lrsquoideal pratiquer trois
examens coprologiques agrave quelques
jours drsquointervalle pour affirmer la
neacutegativiteacute
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Recueil des selles
-Reacutecipient propre et sec agrave bouchage hermeacutetique
-faire recueillir lrsquoensemble de lrsquoeacutemission
-etiquetage prescripteur nom du patient date
du preacutelegravevement et traitement observeacute si il existe
- les selles ne doit surtout pas ecirctre meacutelanger aux
urines (destruction des formes veacutegeacutetatives)
Deacutelai drsquoexamen
Il faut que la selle parvienne dans les plus brefs deacutelais au
laboratoire afin drsquoeacuteviter la deacutegeacuteneacuterescence des formes
veacutegeacutetatives des protozoaires qui sont sensible agrave la variation
de tempeacuteratures et agrave la deacuteshydratation
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Techniques de conservation
Conservation provisoire par le froid (+4degC)
-Bonne conservation des kystes de protozoaires etou
œufs drsquohelminthes
-Mort rapide des trophozoites de protozoaire
-Mort les larves drsquoanguilules
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethode agrave lrsquoeau formoleacutee ( fixation conservation)
-Aldehyde formique( formol) de 5 agrave 20
-Glyceacuterine( facultatif)
-Eau distilleacutee ou lrsquoeau physiologique 100ml La selle +
3 vol 1 vol
tamiser Sedimenter stoker
Bonne conservation œufs drsquohelminthe et kystes de
protozoaires tant que le preacutelegravevement reste liquide
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Fixation au MIF (Merthiolate-Iode-Formol)
SOLUTION 1 de mercurothiolate iode
ndashformol
-teinture de mercurethiolate 200 ml
-glycerine 5 ml
-formol agrave 40 25 ml
-eau distilleacutee 250 ml
SOLUTION 2 de Lugol
-iode 05 g
-iode de potassium 1g
-eau distilleacutee 10 ml
1175 ml 075ml +
3 agrave 5 g selles
Triturer stoker
Conservation beaucoups plus longue des
formes veacutegeacutetatives et les kystes de protozoaires
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutelange fixateur agrave lrsquoalcool polyvinylique APV
APV
-alcool polyvinylique en poudre
5g
-glyceacuterol 15ml
-eau distilleacutee 625 ml
un bain marie ( 70 -75degC)10mn
Fixateur de Schaudinn modifieacute
-cristaux de clorure de mercure HgCl2
15g
-ethanol agrave 95 31 ml
Acide aceacutetique glacial 5ml +
2 agrave 3 mn
-Bonne conservation
-Une fixtion permettant de pratiquer des
frottis pouvant etre coloreacutes
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Concervation des vers
Neacutematotes
Treacutematodes
cestodes
+ eau physiologique Entre 2 lames
Plongeacutes dan un fixteur
Ex - alcool 70 bouillant
- meacutelange alcool et formol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Aspect normal de la selle - poids de 110 agrave 150 g
- couleur brune
- Une consistance ferme et un aspect mouleacute
-- Un pH drsquoenviron 7
Microscopiquement en doit observeacute
-- Des fibres musculaires
-- De la cellulose non digestible poils vaisseaux
ligneux eacuteleacutements scleacutereux
-- de lrsquoamidon si le reacutegime est riche en feacuteculents et chez
lrsquoenfant
-- Quelques masses amorphes ou disques radieacutes ( les
savons)
-- il ne doit pas avoir de globules gras ( graisses
neutres)
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
COPROLOGIE PARASITAIRE Conduite de lrsquoexamen
1048766 Examen macroscopique
1048766 Examen microscopique
- Examen direct sans concentration
- Examen direct apreacutes concentration
- Les meacutethodes physiques
- Techniques de flottation
- Techniques de seacutedimentation
- Les meacutethodes physico-chimiques
- Les meacutethodes combineacutees
-Colorations speacutecifiques
- cultures
- Examens particuliers
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Lrsquoobservation macroscopique Il permet de noter
- Couleur ( brune jaune ou ocre verte
deacutecoloreacutee noire rouge)
- consistance (molle dure liquide)
- aspect (preacutesence de bulles ou de gras
steacuteatorrheacutee)
- Preacutesence drsquoeacuteleacutements surajouteacutes
-Parasites adulte drsquoAscaris femelle drsquooxuyre
anneau ou chaine de taenia
-glaire (mucus)
-sang de pus
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Lrsquoexamen direct sans concentration -Lexamen direct est le seule examen qui permet drsquoappreacutecier la vitaliteacute des
parasites
-Il met en eacutevidence les kystes et les formes veacutegeacutetatives de protozoaires ainsi
quelques oeufs et les larves dhelminthes
- On peut rajouter du Lugol double sur la lame qui fixe et colore les
structure nucleacuteaires
- Quelque soit le reacutesultat de lrsquoexamen direct on doit obligatoirement le
compleacuteter par deux techniques de concentration lrsquoune pour les kystes et
lrsquoautre pour les oeufs
- Il est impeacuteratif de connaitre la deacutescription des eacuteleacutements parasitaire et
de retenir les possibles faux parasites
Lrsquoobservation microscopique
une noisette de selle
(agrave diffeacuterents endroits)
lrsquoeau physiologique
agrave 09
suspension homogegravene
2 gouttes sur une
lame recouvrir par
une lamelle
lecture en
zig-zag x10
x 40
+
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Les meacutethodes de concentrations
Les techniques par lesquelles on
essaie agrave partir de la grande quantiteacute
de la matieres feacutecales recueillies
drsquoobtenir dans un faible volume les
œufs larves kystes voire formes
veacutegeacutetatifs fixeacutees de parasites par
eacutelimination des reacutesidus de la
digestion
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Les meacutethodes physiques
Les selles dilueacutees dans un reacuteactif de densiteacute
diffeacuterente de celle de parasite
DR superieur DP = flottation
DR inferieur DP = seacutedimentation
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
A-Techniques de flottation
Crsquoest une technique part du principe que la densiteacute du liquide et supeacuterieur
agrave celle des parasites ces derniers plus leacutegers flottent agrave la surface
Les principales techniques de flottation
- Meacutethode de Fullborn (1920) elle utilise une solution satureacutee de NaCl
(NaCl 250g ED 750ml d=12)
- Meacutethode de Willis (1921) simple et utilisable en routine
bullDiluer une noisette de selle dans la solution satureacutee de NaCl agrave 25
bullRemplissez un tube en verre conique jusquagrave sonbord en formant un
meacutenisque concave (verre de montre) sur lequel on deacutepose une lamelle
pendant 15 minutes (pas plus pour eacuteviter la cristalisation des oeufs) On la
deacutepose ensuite sur une lame porte objet et on observe agrave lrsquoobjectif X10 agrave la
recherche des OEufs drsquohelminthes tels que ceux drsquoHymenolepis ou
drsquoAnkylstomes
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
-Meacutethode de Janeckso et Urbanyi(1931) utilise comme reacuteactif une
solution de domercurate de potassium ( d=114) qui doit etre manipuleacutee
avec prudence
Iodo-mercurate de potassium
Bi iodure de mercure 100g
Iodure de potassium 74g
Eau distilleacutee 50 ml
-Meacutethode de Faust (1938) on centrifuge agrave 1500 tm une dilution des
selles dans lrsquoeau ordinaire tieacutede et on rejette le surnageant et on remet le
culot en suspension dans drsquoeau On reacutepegravete lrsquoopeacuteration jusqursquoagrave ce que le
surnageant soit limpide on remet alors le culot en suspension dans le
sulfate de Zink agrave 33 Apreacutes centrifugation on preacutelegraveve agrave lrsquoanse de
platine la pellicule de surfase qursquoon examine au microscope
- Meacutethode drsquoOtto Hwitt et Straham (1941) on procegravede de la meme
maniere que pour le Willis mais avec une solution aqueuse de sulfate
de Zink agrave 33 D=118
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
-Sensibiliteacute treacutes bonne++++
Inconveacutenient
-Elle a ce pendant lrsquoinconveacutenient drsquoalteacuterer des Larves et les
Kystes pour les quels elle est contre-indiqueacutee ( reactifs
hypertoniques) de mecircme que pour les selles liquides ou
riches en lipides
-Elle donne de bons reacutesultats pour les oeufs drsquohelminthes
leacutegers (oeufs drsquoHymenolepis drsquoAnkylostome et deTaelignia)
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
B-Techniques de seacutedimentation bullLe diluant a une densiteacute inferieure agrave celle du
parasite alors se dernier se seacutedimente
Les principales techniques
- Meacutethode par seacutedimentation simple
- Meacutethode de Faust et IngallsReacutealiseacutee en utilisant
lrsquoeau glyceacuterineacutee (Eau + Glyceacuterine agrave 05) elle
permet drsquoaugmenter la mouillabiliteacute qui facilite la
seacutedimentation des parasites larves Anguillules
Œufs drsquoAscaris non feacutecondeacutes et œufs de
Schistosoma mansoni
-Meacutethode de Baroody et MostSeacutedimentation
centrifugation Eau de robinet chauffeacutee agrave 42degC
- Meacutethode de Jahnes et Hodges
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Avantage -Technique simple
-Mateacuteriel rudimentaire
- reacutealisation en seacuterie
- Traitent une grande masse feacutecale ( parasites rares ou irreacuteguliegraverere ment
repartis dans la selle)
Inconveacutenient -une technique longue agrave reacutealiser
-Les cellules veacutegeacutetales seacutedimentent aussi vite que les parasites (Preacutesence
de certains reacutesidus)
-Non indiqueacutes en routine (sensibiliteacute
moyenne++)
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethodes physico-chimiques ou
Diphasiques Caracteacuteriseacutees par la mise en preacutesence de deux
phases non miscibles lrsquoune aqueuse et lrsquoautre
constitueacutee par lrsquoeacutether qui est un solvant des lipidesil
se creacutee un coefficient de partage entre ces deux
phases et la reacutepartition de chaque eacuteleacutement feacutecal dans
chacune drsquoelles sera isoleacutes en fonction de son pouvoir
hydrophile ou lipophile
Bailenger a montreacute que le pH de la solution eacutetait
leacuteleacutement deacuteterminant pour la plus ou moins grande
efficaciteacute dune technique selon le parasite rechercheacute
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Principes theacuteoriques
-Les selles tritureacutees (meacutelange au dixiegraveme environ) dans la solution choisie - elle peut ecirctre preacutealablement passeacutee sur un tamis pour eacuteliminer les gros deacutebris
le filtrat est verseacute dans un tube agrave centrifuger agrave fond conique en le remplissant 13
deacutether de maniegravere agrave ce quil y ai 23 du meacutelange selle en laissant 1 cm pour
fermer le tube
- Lrsquoagiter pendant une minute
- La suspension eacutetheacutero-liquide obtenue est centrifugeacutee agrave une vitesse lente de
lordre de 1500 agrave 2000 toursminute pendant une agrave trois minutes
- Apregraves centrifugation les constituants de la suspension sont reacutepartis en quatre
Couches
- Deacutecoller la couche des reacutesidus lipophiles agrave laide dune baguette de verre
- Retourner le tube au dessus de leacutevier (en faisant couler de leau) ou dun bac agrave
deacutechets liquides
- Essuyer les parois du tube avec un coton tenu agrave la pince en laissant toujours le
tube avec louverture dirigeacutee vers le bas pour eacuteviter de souiller le culot avec les
reacutesidus
- Retourner alors le tube et ajouter une goutte de solution isotonique pour
remettre en suspension le culot qui sera examineacute
- le culot qui nous inteacuteresse qui contient les eacuteleacutement parasitaires (kystes des
protozoaires)
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Ether Debris
Phase aqueuse
Le culot
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Les meacutethodes diphasiques sont
-Meacutethode de Telmann 1908
-Meacutethode De Rivas 1928
-Meacutethode De Carles et Bartheacuteleacutemy 1917
-Meacutethode De Faust et Ingalls 1946
-Meacutethode De Ritchie 1948
-Meacutethode De Ritchie simplifieacutee par Ridley et Hawgood
-Meacutethode De Blagg schloegell Mansour et Khalaf
-Meacutethode De Roman 1957
-Meacutethode de Bailenger 1962-1963
-Meacutethode De Theacutebault simplifieacutee par Valentin et Solle
-Meacutethode de Junod 1927
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethode de Telemann modifieacutee par Rivas - Avantage
Facile rapide bien les parasites les plus courants (Giardia
Entamoeba et oeufs de trichoceacutephale)
La coque des kystes dEntamoeba histohtica se deacutedouble
lors de la centrifugation ce qui est un argument
diagnostique inteacuteressant
- Inconveacutenients
Les oeufs de bilharzies dascaris ou de grande douve
restent dans la couche lipophile cest donc une meacutethode agrave
deacuteconseiller dans les pays ougrave seacutevissent ces parasitoses
- Deacuteroulement de la technique
acide aceacutetique cristallisable 5 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethode de Bailenger - Avantages
Elle est beaucoup plus fiable dans la recherche des kystes et
des oeufs se concentrant bien dans un pH aux environs de 5
(giardia amibes trichoceacutephale ankylostome)
- Inconveacutenients
Pour rechercher les oeufs de schistosome une autre
technique est neacutecessaire
- Deacuteroulement de la technique
aceacutetate de sodium 15 g
acide aceacutetique 36 ml
eau distilleacutee qsp 1000 ml
Ajuster agrave pH5 avec acide aceacutetique ou soude dilueacutee agrave laide
dun pH-megravetre
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethode de Ritchie simplifieacutee
- Avantages Cette meacutethode peut ecirctre utiliseacutee sur les selles
formuleacutees donc sur des selles collecteacutees pour
enquecirctes eacutepideacutemiologiques Elle concentre bien les
oeufs dascaris et de schistosome
- Inconveacutenients
Le culot souvent volumineux est de lecture difficile
- Deacuteroulement de la technique
- Solutions de Ritchie
eau chlorureacutee sodique agrave 9 lt
eau formuleacutee agrave 10 (formol officinal)
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethode de Blagg et al
-Avantages
-concentration les oeufs de schistosome et dascaris Les kystes de protozoaires v oire
les formes veacutegeacutetatives sont coloreacutes et ainsi facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le culot obtenu est souvent important La manipulation de grandes quantiteacutes de
liquide coloreacute agrave leacuteosine augmente les risques de taches et surtout la preacutesence de
mercure souille les effluents du laboratoire
- Deacuteroulement de la technique
Les selles sont dilueacutees au dixiegraveme dans la solution de merthiolate-formol pure ou
additionneacutee de Lugol agrave 5 (cf coloration des selles) Apregraves tamisage le filtrat est
verseacute dans un tube agrave centrifuger ougrave lon ajoute moitieacute moins deacutether Une agitation
eacutenergique permet dobtenir une suspension quon laisse reposer deux minutes
Si la suspension reste stable la centrifugation (1700 toursminute pendant 1 minute)
permet dobtenir un culot qui sera preacuteleveacute avec les soins habituels et examineacute
Si leacutether forme une couche superficielle libre il faut ajouter un millilitre deau et
recommencer lagitation
On remet de leau jusquagrave lobtention dune suspension stable apregraves deux minutes et
cest alors seulement que la centrifugation peut ecirctre effectueacutee
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethode de Caries et Bartheacuteleacutemy - Avantages
-le culot obtenu est tregraves faible et deacutebarrasseacutes de la majoriteacute des bacteacuteries des selles
Les oeufs de trichoceacutephale ou dankylostome et les kystes amibiens sont retrouveacutes
aiseacutement et facilement identifiables
- Inconveacutenients
Le pH particuliegraverement bas (18) est deacutefavorable pour retrouver les oeufs de
schistosomes ou les larves danguillule exigeant deux centrifugations est plus longue
que les techniques en un temps
- Deacuteroulement de la technique
A) NaCl 9 g
formol officinal 10 ml
eau qsp 1000 ml
B) acide citrique 100 g
formol officinal 20 ml
eau qsp 1000 ml
Meacutethodes combineacutees
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethode de Theacutebault simplifieacutee (Valentin et Solle) - Avantages Leacutemulsion avec leacutether est pratiqueacutee dans une ampoule agrave deacutecanter et
par conseacutequent il est possible de techniquer sur une plus grande
quantiteacute de selles
Cette meacutethode est particuliegraverement inteacuteressante pour concentrer les
rares kystes des petites amibes On retrouve eacutegalement fixeacutees des
formes veacutegeacutetatives damibes et les oeufs de trichoceacutephale
- Inconveacutenients
Les kystes dEntamoeba coli et surtout de Giardia descendent assez
mal - Deacuteroulement de la technique
A acide trichloraceacutetique agrave 20 10 ml
formol officinal 100 ml
eau qsp 1 000 ml
B bromure de sodium cristalliseacute 622 g
eau distilleacutee 1000 ml
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Premiegravere meacutethode de Junod - Avantages Cest certainement lune des meacutethodes les plus inteacuteressantes tant
pour les recherches doeufs que pour celles de formes veacutegeacutetatives ou
kystes de protozoaires Elle remplace lexigence de plusieurs techniques diffeacuterentes pour
trouver des parasites de densiteacute diffeacuterente
- Inconveacutenients
Cette technique neacutecessitant cinq centrifugations demande un temps
assez long Dautre part lutilisation dune solution diodo-mercurate
preacutesente les inconveacutenients (solution toxique et corrosive)
- Deacuteroulement de la technique
- Premiegravere technique de Junod (densiteacute 15)
liqueur de Thoulet de densiteacute 317 100 ml
eau distilleacutee 334 ml
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Concentration diphasique
(MIF ou Bailenger)
une solution de
sulfate de zinc
30 secondes agrave f v
dilueacute au quart avec ED
Examiner
Le culot
Examiner
Le culot
iodomercurate
de potassium
de densiteacute 15
dilueacute au quart avec ED
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Deuxiegraveme meacutethode de Junod (Junod
simplifieacutee) - Avantages
donne autant de bons reacutesultats que la technique complegravete
- Inconveacutenients
Quoique simplifieacutee la technique impose encore quatre centrifugations et lemploi
dune solution de iodomercurate
- Deacuteroulement de la technique
Solution A (aceacuteto-aceacutetique formuleacutee)
- aceacutetate de sodium 15 g
- acide aceacutetique cristallisable 20 ml
- formol 40 ml
-eau qsp 1000 ml
Solution B (densiteacute 140)
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 442 volumes
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
8 g de selles
50 ml de solution de NaCl agrave
85 o formuleacutee agrave 8 1200 toursmin1 min
Suspension homo
+Tamisage Examiner
Le culot
eacuteliminer
le surnageant
20 ml dune solution A
+ 5 agrave 7 ml deacutether eacutethylique
1200 toursmin 2min 1200 toursmin1 min
4 agrave 6 ml de solution B eacuteliminer
le surnageant
Examiner
Le culot
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethode de seacutedimentation-flottation
pour oeufs et larves - Avantages Pour une recherche speacutecifique doeufs ou de larves
- Inconveacutenients
Quand la teneur des selles en lipides est anormalement
eacuteleveacutee les concentrations sans eacutether sont encombreacutees de
graisses neutres savons et acides gras -Deacuteroulement de la technique
Solution de densiteacute 135
- liqueur de Thoulet 1 volume
- eau 520 volumes
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
la suspension feacutecale en
eau agrave 85 de NaCl
1200 toursmin2 min 1200 toursmin1 min
1200 toursmin1 min 1200 toursmin1 min
20 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacute
eacuteliminer
le surnageant
5 agrave 7 ml de solution diodomercurate
de potassium de densiteacute 135 20 ml deau
Examen du culot
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Seacutedimentation-flottation au saccharose
pour protozoaires - Avantages
permet de trouver de rares formes veacutegeacutetatives de protozoaires alors que les
kystes sont inexistants Elle est dexeacutecution rapide et surtout recommandeacutee quand
lexamen direct a prouveacute la preacutesence de rares formes veacutegeacutetatives et quaucun kyste
na eacuteteacute retrouveacute pour pouvoir affirmer le diagnostic Elle est utilisable sur des
selles fixeacutees au MIF
- Inconveacutenients
Une certaine techniciteacute est indispensable pour ne pas confondre les amibes et
flagelleacutes avec les blastocystis et champignons qui sont un peu deacuteformeacutes De
plus une selle trop riche en lipides ne peut ecirctre ainsi concentreacutee Noter en outre
que des sels de mercure sont encore utiliseacutes
-Deacuteroulement de la technique - Seacutedimentation-Flottation en saccharose
saccharose 120 g
eau 200 ml
Si le surnageant est trop chargeacute reprendre la suspension initiale en AAF et
utiliser alors
saccharose 90 agrave 100 g eau 200 ml
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Suspension homo
+Tamisage +
2 agrave 3 heures
50 ml de solution
aceacuteto-aceacutetique formuleacutee
fraicircche
10 agrave 15 ml de la suspension
1800-2000 toursmin 90sec
rejeter le surnageant
L 1 en12humide
3 agrave 4 g de selles
Seacute
dim
en
tatio
n
8 agrave 10 ml de solution de saccharose
+ 05 ml de solution de chlorure
mercurique agrave 15 en ED
1000 toursmin 45 sec
deacutecanter le
surnageant
dans T2
L 2 en12humide
Flottation
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
T2 20 agrave 30 ml deau
2000 toursmin90 sec
L 3 en12humide
Preacutecipitation
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Les colorations
utile en cas de doute lrsquoidentification des
kystes surtout pour un diagnostic drsquoespegraveces
des formes veacutegeacutetatives (structures nucleacuteaires
coloreacutees
recommandeacutee pour la conservation de
mateacuteriel de reacutefeacuterence ou lrsquoenvoi vers un autre
laboratoire pour avis
indispensable pour le diagnostic de certains
parasites (Cryptosporides microsporides)
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethodes de coloration rapides
(Colorations en tubes)
- Meacutethode de Bailenger et Faraggi
- Meacutethode de Sapro Lawless et
Strome
-- Meacutethode au bleu de meacutethylegravene
tamporeacute
-Meacutethode de Horkin
- Meacutethode de Sargeaut
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
-Au Merthiolate Iode Formol (technique de Sapero
Lawless et Strome) -Dans un tube agrave heacutemolyse on met 015 ml dune solution de
Lugol agrave 5 + 235 ml dune solution de merthiolate-eacuteosine-
formol Apregraves meacutelange
- en ajoutant dans le tube un gros pois de matiegraveres feacutecales agrave
laide dune tigelle qui permet dhomogeacuteneacuteiser le tout
-Apregraves 20 agrave 30 minutes les selles se sont deacuteposeacutees dans le
fond du tube
-La couche superficielle du seacutediment est la plus riche en
protozoaires Les formes veacutegeacutetatives sont fixeacutees
immeacutediatement pseudopodes encore visibles La chromatine
des noyaux est coloreacutee en brun par liode
Les kystes mucircrs apparaissent en clair sur fond rose et semblent
donc avoir des reflets verdacirctres Leurs noyaux fixeacutes par le formol
sont nets et parfois deacutejagrave coloreacutes par liode Ulteacuterieurement
leacuteosine peacutenegravetre agrave linteacuterieur des kystes
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
- Coloration au cristal violet de Bailenger La coloration de Bailenger peut ecirctre reacutealiseacutee en tube ou
directement sur la lame en diluant une goutte de la suspension
de selles avec le colorant
Les parasites sont coloreacutes tregraves rapidement Le cytoplasme des
protozoaires devient rose tandis que la chromatine des noyaux
apparaicirct en noir Cette coloration est stable pendant plusieurs
jours
la coloration de Bailenger
Laisser pendant une nuit en contact
cristal violet 2 g
fuchsine basique 005 g
alcool agrave 95deg 20 ml
pheacutenol cristalliseacute fondu 10 ml
eau distilleacutee 100 ml
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Coloration des frottis
Pour bien observer les structures nucleacuteaires et
garder des lames de reacutefeacuterence on
confectionne un frottis de selles humide et
eacutepais agrave sa fixation et agrave sa coloration se fait en
- 3 temps fixation puis coloration puis
diffeacuterentiation (Mdegde Heidenhain)
- 2 Temps fixation puis coloration(Mdeg
Wheatley) - 1TempsFixation colration (MdegKohn)
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Coloration agrave lheacutematoxyline ferrique -Effectuer un eacutetalement humide en zigzag
- Fixer immeacutediatement sans laisser seacutecher
soit par la solution ordinaire de Bouin (15 min) puis dans deux bains
dalcool agrave 90degpuis un bain dalcool agrave 70deg (quelques jours)
soit par le fixateur de Duboscq-Brasil recommandeacute pour les kystes (15 min)
soit par la solution de Schaudinn aceacutetique qui semblerait la meilleure (1
heure)
-plonger la lame 10 agrave 20 min dans un bain dalcool agrave 70degadditionneacute diode
-rincer dans des bains dalcool agrave 70deg avant de laver agrave leau
- Mordancer plonger la lame dans une solution aqueuse dalun de fer agrave 3
30 min agrave leacutetuve agrave 37deg
- plonger la lame dans les bains dheacutematoxyline (A tempeacuterature de la piegravece
24 h Dans leacutetuve agrave 37deg 30 agrave 60 min) Les parasites sont alors bien noirs
-Diffeacuterencier avec la solution aqueuse dalun de fer agrave 1 en surveillant au
microscope cette diffeacuterenciation jusquagrave ce que les noyaux apparaissent
nettement
-Arrecircter la diffeacuterenciation par dabondants lavages agrave leau
-Deacuteshydrater
-une goutte de baume de Canada ou de baume syntheacutetique et la lamelle est
poseacutee deacutefinitivement
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
- Coloration au noir chlorazol de Kohn Cette coloration permet de colorer les
trophozoiumltes en gris et de bien voir la structure
des noyaux Les kystes apparaissent en bleu
pacircle avec des noyaux bien nets Cest une
technique facile agrave reacutealiser
- Effectuer un eacutetalement humide mince si possible
- Plonger la lame dans le fixateur colorant de
Kohn et la laisser 8 agrave 10 heures
- Laver agrave leau courante deacuteshydrater et monter au
baume de Canada ou au baume syntheacutetique
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Technique de Zeihl Neelsen modifieacutee par
Henriksen et PohlenzColore le cryptosporidium Confectionneacute agrave partirdrsquoun culot de Ritchie
- Seacutechage
- Fixation pendant 5mn au Meacutethanol
- coloration dans la Fuchsine pheacuteniqueacutee pendant 1 heur agrave froid
- Rinccedilage agrave lrsquoeau de robinet
- diffeacuterenciation dans un bain drsquoAcide Sulfurique agrave 2 pendant 20
secondes en agitant
- Rinccedilage
-Contre coloration pendant 5mn dans du Vert Malachite agrave 5
- Rincer seacutecher et lire agrave lrsquoimmersion X100
- Les Oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert
Coloration des microscporidies
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Coloration pour recherche de microsporidies -Formuler la selle dans une solution de formol agrave 10
- Effectuer un frottis de la selle
- Fixer le frottis pendant 5 minutes dans un bain de
meacutethanol
- Plonger dans la solution de chromotrope 2R 90 minutes
- Rincer deux fois agrave leau du robinet dabord
en solution acide-alcool ensuite - acide aceacutetique 45 ml
- alcool agrave 90 9955 ml Les spores rechercheacutees agrave lobjectif xlOO apparaissent en rouge
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Coloration par le Trichrome de Gomori modifieacutee
microsporidies - Diluer les selles au 13 dans du formol-
Confectionner un frottis de selles agrave partir de la dilution
- Colorer pendant 3 heures
- Rincer agrave lrsquoeau aceacutetique agrave 02
-Contre colorer 30 secondes par le vert de malachite agrave 1-
Rincer seacutecher et lire au grossissement x100
Coloration par Uvitex 2B
Utilise un fluorochrome agrave affiniteacute
pour la chitine Met en eacutevidence les
microsporidie par une fluorescence
directe On obtient une
fluorescence bleue pale sur fond
noir
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Scotch test anal ( test de Graham agrave
la cellophane adheacutesive) Met en eacutevidence les oeufs drsquoEnterobius
vermicularis ainsi que les anneaux ou les
oeufs de taenia saginata eacutelimineacutes en dehors
de la deacutefeacutecation Le scotch transparent est
appliqueacute au niveau de lrsquoanus le matin avant
toute toilette en position foetale ou genou
pectoral on deacuteplisse les plis radieacutes de lrsquoanus
et on applique le scotch qui sera en suite fixeacute
sur une lame porte objetLrsquoobservation se fera
agrave lrsquoobjectif X10
NBCe test est geacuteneacuteralement effectueacute par les
parents drsquoenfants il faudra leur expliquer que
la technique devra ecirctre faite avec des gants
ou agrave deacutefaut bien se laver les mains ensuite
pour eacuteviter la contamination par les oeufs
auto-infestant de lrsquooxyure
Meacutethodes speacuteciales
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Meacutethode de Kato et Kato-Katz confection dun frottis eacutepais que lon
eacuteclaircit Crsquoest la recherche les oeufs
drsquohelminthes dans une quantiteacute de selle
de la taille drsquoun petit pois
Laiser srsquoimpreacutegner la veille de lrsquoexamen
des carreacutes de cellophanes de 2 sur 5 cm
dans une quantiteacute de vert malachite agrave
3 (contre colorant) et de glyceacuterine
appliquer la bande sur la selle et sur la
lame renverser et appuyer sur la
paillasse
Methode de Kato-Katz quantitative
utilise un gabarie pour la selle
Meacutethode efficace pour la recherche
doeufs drsquoascaris et de trichoceacutephale
mais inutilisable pour les kytes et les
larves ainsi que les oeufs dankylostome
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Technique de Baerman et Lee Technique drsquoextraction des larves drsquoAnguillule
(Strongyoidess tercoralis) baseacutee sur lrsquohygrotropisme et
le thermotropisme des larves
Consiste agrave mettre lrsquoeacutechantillon de selles sur un tamis
meacutetallique tapisseacute de quelques couches de gaze sur un
entonnoire
Le dispositif implique une tubulure avec robinet faisant
suite agrave lrsquoentonnoire ou tout simplement un caoutchouc
fermeacute par une pince
on remplit lrsquoentonnoir drsquoeau steacuterile agrave 45degC la
tempeacuterature doit ecirctre constante (utiliser une eacutetuve) le
niveau drsquoeau doit frocircler la selle sans y ecirctre immergeacute
NBlrsquoeau du robinet ou de source peut contenir des
neacutematodes libres qui peuventf ausser le diagnosticdrsquoougrave
lrsquoimpeacuterative drsquoutiliser une eau fiable
Au bout de 2 agrave 3 heureson ouvre la pince pour
recueillir 10ml de liquide dans un tube agrave centrifuger On
centrifuge agrave1500trmn pendant 3agrave 5mn puis on examine
le culot
NBil ne faut jamais oublier queles anguillules peacutenegravetrent
parvoie cutaneacutee drsquoougrave les mesures de preacutecautions
manuelles lors de la manipulation
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
La coproculture
La culture est plus sensible que lrsquoexamen agrave
deacutetats frais et diminue le besoin drsquoexamens
reacutepeacuteteacutes
- Coproculture en protozoologie( sans
les sporozoaires)
- En protozoologie (coccidies )
- En helminthologie
Consiste agrave faire eacutevoluer des œufs preacutesents dans les
fegraveces en larves Cette technique permet drsquoobtenir
des formes plus facilement identifiables Elle
srsquoapplique essentiellement agrave la diagnose des
strongles digestifs
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
En protozoologie (sans les
sporozoaires) La culture des selles en milieux speacutecifiques pour
protozoaires permet la multiplication de rares amibes
ou flagelleacutes observeacutes agrave lexamen direct et dont le
diagnostic na pu ecirctre eacutetabli dune faccedilon certaine
Milieu de Dobell et Laidlam milieu diphasique
avec 2 parties
-support seacuterum de cheval coaguleacute en plan inclineacute
-ampoule 5ml de phase liquide composeacutee de 6 parties
de liquide de Ringer 1partie de seacuterum de cheval plus
amidon de riz
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
En protozoologie (coccidies) Lorsquon observe des oocystes de coccidie
dans les selles pour affirmer le diagnostic de
genre et despegravece il est neacutecessaire de
provoquer leur maturation par une coproculture
agrave tempeacuterature du laboratoire Les selles
leacutegegraverement reacutehydrateacutees par addition deau
distilleacutee pourront ecirctre meacutelangeacutees avec un peu
de poudre de charbon ou de solution dacide
chromique agrave 05 pour eacuteviter les
fermentations La lecture sera effectueacutee tous
les jours Cest apregraves 48 agrave 72 heures que les
sporozoiumltes seront formeacutes
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
En helminthologie la multiplication in vitro des anguillules
(cycle sexueacute) ne soit pas toujours
observeacutee une coproculture positive peut
permettre daffirmer un diagnostic quune
concentration ou une extraction de
Baermann nauraient pu prouver
Culture sur buvard en boicircte de Peacutetri
Culture sur buvard en tube agrave essai
Culture sur charbon
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Limites de la coproparasitologie -Faux neacutegatif
Doivent etre eacutecarteacutes par le choix technique et par
la reacutepeacutetition des preacutelegravevements
-Confusions et faux positif
reacutesidus alimentaires graisses savons
amidon
pollens
spores de champignons
eacuteleacutements endogegravenes( leucocytes et cellules
eacutepitheacuteliales)
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Eacuteleacutements non parasitaires (faux parasites)
Cristaux de Charcot Leyden
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Reacutesidus digestifs veacutegeacutetaux
Cellules de feacuteculents Grain drsquoamidon Poil veacutegeacutetal
Vaisseau spiraleacute
Bois veacutegeacutetal
Placard eacutepidermique
(de nature cellulosique) Amas de cellules de poire
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Reacutesidus digestifs animaux
Fibre musculaire mal digeacutereacutee Gouttelette lipidique
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
Cristaux
Cristaux drsquoacide gras Phosphate ammoniaci-magnesien
Cristal drsquooxalate Cristaux de cholesterol
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