Caractérisation biochimique et
propriétés interfaciales de deux
phospholipases A2 de venins de vipères
tunisiennes
Baïram, Douja
Laboratoire des venins et biomolécules thérapeutiques, IPT
Directrice de thèse: Pr Marrakchi Naziha
Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016
Venin de serpents
Métalloprotéases
Désintégrines
Phospholipases A2
Sérines protéases Inhibiteurs
de protéases
Toxines three finger Léctines de type C
L-amino oxydases
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Phospholipase A2 des venins de serpents
S.V PLA2
GIIA
Ca2+ ++
120-125 résidus
13-14 kDa Structure conservée
40-99 % homologies
7 ponts S-S
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Propriétés pharmacologiques des svPLA2 • PLA2 du venin des Elapidae (Terra et al., 2015)
• PLA2 basique du venin de Daboia russelii (Tan et al., 2015) Neurotoxicité
• Myotoxines Asp49 et Lys49, Bothrops asper (Mora-Obando et al., 2014)
• ColTx-I, Crotalus oreganus lutosus (Almeida et al., 2016a) Myotoxicité
• La PA11, PLA2 du venin de Pseudechis australis (Du et al., 2016) Anticoagulante
• PLA2 du venin du serpent corail Micrurus fulvius (Arce-Bejarano et al., 2014) Hémolytique
• OHV A-PLA2 du venin de Ophiophagus hannah (Huang and Gopalakrishnakone, 1996) Cardiotoxique
• NN-XIb-PLA2, PLA2 acide du venin de Naja naja (Sudarshan and Dhananjaya, 2016) Antimicrobienne
• Lmr-PLA2 du venin de Lachesis muta rhombeata (Cordeiro et al., 2015)
• NnPLA2 du venin du cobra indien Naja naja (Dutta et al., 2015)
Inhibition de l’agrégation plaquettaire
• BthA-I-PLA2 du venin de Bothrops jararacussu (Roberto et al., 2004)
• BnSP-6, Lys49 PLA2, du venin de Bothrops pauloensis (Azevedo et al., 2016) Anti-tumorale
• BE-I-PLA2, PLA2 acide du venin de Bothrops erythromelas (de Albuquerque Modesto et al., 2006) Anti-angiogénique
• BthTX-I du venin de Bothrops jararacussu (Prinholato da Silva et al., 2015)
• BnSP-6 du venin de Bothrops pauloensis (Azevedo et al., 2016) Apoptotique
• Bleu TX-III du venin de Bothrops leucurus (Marangoni et al., 2013)
• ColTx-I du venin de Crotalus oreganus lutosus (Almeida et al., 2016) Pro-inflammatoire
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MVL-PLA2 vs CC-PLA2
Macrovipera lebetina transmediterranea (Bazaa et al., 2009)
Cerastes cerastes (Kessentini-Zouari et al., 2009)
MVL-PLA2 CC-PLA2 Acides
~ 14 kDa
His48-Asp49
7 ponts S-S
~ 120 résidus
Anti-tumorales
Inflammation
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Objectif
Corrélation entre les activités pharmacologiques des PLA2 avec leur capacité à hydrolyser les phospholipides
?
Caractérisation de la MVL-PLA2 et de la CC-PLA2 sur le plan catalytique
Étude des propriétés interfaciales
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Propriétés cinétique et biochimique de la MVL-PLA2 et de la CC-PLA2
Activité catalytique optimale
[NaTDC]
[CaCl2]
T °C
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Effet de la température
CC-PLA2 active à 60 °C
MVL-PLA2 active à 37 °C
CC-PLA2
MVL-PLA2
13 333 U/mg
1473 U/mg
Max Activité 20 °C – 60 °C
Max Activité 20 °C – 45 °C
CC-PLA2 > > > MVL-PLA2
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Effet de la concentration en Ca2+
CC-PLA2 3 mM CaCl2
MVL-PLA2 1 mM CaCl2
Ca 2+ essentiel à l’activité catalytique de la CC-PLA2 et de la MVL-PLA2
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Effet de la concentration en NATDC
Sels biliaires non essentiels à l’activité des PLA2
CC-PLA2 0 – 3 mM NaTDC
MVL-PLA2 0 – 1 mM NaTDC
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Principe de la méthode du film monomoléculaire
Les produits de la réaction d’hydrolyse > solubles que le phospholipide
Dissolution des produits de la réaction Diminution de la pression de surface
Activité d’hydrolyse
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Propriétés interfaciales des PLA2
Forte affinité DLPC et DLPE
Forte affinité DLPG et DLPS
1,02 mol cm-2 min-1 M-1
25 mN m-1 avec le DLPC
1,66 mol cm-2 min-1 M-1
20 mN m-1 avec le DLPG
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Modélisation moléculaire de la MVL-PLA2 et de la CC-PLA2
PLA2 du venin d’Agkistrodonhalys Pallas Modèle de référence
Structure conservée Trois hélices α, deux feuillets β et un site de fixation de Ca2+
Superposition des structures Valeur RMSD = 2,7 Å
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Docking des PLA2 aux membranes lipidiques
H2/H3 Support structural du site catalytique
H1 Interface d’interaction avec les phospholipides
L18/Y19 CC-PLA et la L18/T19 MVL-PA2 Encrage de la protéine
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Distribution des charges de surface
Répartition des charges de surface différente
Les charges + (bleues) sont fortement groupées à proximité de l’hélice H1, essentiellement pour la CC-PLA2
Charge globale identique
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Le moment dipolaire des PLA2
μ MVL-PLA2 = 97 D μ CC-PLA2 = 470 D
Les calculs des moments dipolaires + des potentiels électrostatiques sont en corrélation avec les profils activités/pression de surface obtenus avec la technique de monocouche lipidique
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Conclusions
La MVL-PLA2 et la CC-PLA2 partagent de nombreuses caractéristiques
Multiples différences significatives ont été mises en évidence
CC-PLA2 est thermoactive Activité CC-PLA2 >>>>>>> Activité MVL-PLA2
Forte affinité de la CC-PLA2 aux phospholipides anioniques
Forte affinité de la MVL-PLA2 aux phospholipides neutres
Moment dipolaire Implication de l’anisotropie des charges électrostatiques dans la sélectivité et l’activité enzymatique de la MVL-PLA2 et de la CC-PLA2
Expériences supplémentaires Corréler ces caractéristiques avec les propriétés pharmacologiques des enzymes