Diagnostic de laboratoire des parasitoses
sanguicoles et tissulaires-2 (suite)
DR: BOUOUDEN. Foued
2019-2020
4 EMME ANNEE PHARMACIE-
PARASITOLOGIE
I-LEISHMANIOSE VISCÉRALE
Parasitose due à un flagellé sanguicole et tissulaire : Leishmania infantum.
Transmise par insecte vecteur : Phlebotomus perniciosus femelle et admet
comme réservoir le chien.
Diagnostic biologique:
Éléments d’orientation:
Epidémiologique: les foyers sont localises dans le pourtour de la
Méditerranée, au Moyen-Orient, en Afrique de l’Est, en Inde et sur le continent
sud Américain,…
En Algérie existe surtout au niveau de la partie nord du pays (centre, est et
ouest).
Clinique: triade classique : fièvre folle rebelle , splénomégalie et pâleur
cutanéo-muqueuse (surtout chez un enfant en bas âge+ (≤5 ans))
Biologique: pancytopenie progressive.
Diagnostic parasitologique direct : recherche des leishmanies
dans les cellules du systeme reticulo- histio -macrophagique:
Prélèvements:
Ponction de MO +++
Ponction splénique (risque de rupture )
Aspiration ganglionnaire
Sang périphérique
1-Examen Direct :
Frottis de moelle osseuse ,apposition (biopsie) colorés au MGG:
Forme amastigote de Leishmania sp : intracellulaire obligatoire (cellules du
SRE : foie, rate, ganglions, moelle…). forme ronde ou ovalaire de 5 à 10
micron de taille, avec un noyau central et un kinétoplaste juxtaposé
Avantages: sensibilité élevée
Inconvénients de la ponction de MO :
• Geste invasive, douloureuse
• Lecture longue et fastidieuse.
Amastigotes de Leishmania sp
Les prélèvements sanguins ou de moelle peuvent être mis en culture sur
milieux spécifiques: NNN (Novy-Mac Neal-Nicolle): gélose + sang de
lapin), milieu de blanc d’œuf , milieu de Schneider,…
Incubation 25-28°C
1ere lecture: 01semaine, si négative repiquage, il faut 4 semaines avant de
rendre un résultat négatif
2-Culture:
Si culture positive: forme promastigote de Leishmania sp:
Forme allongée mobile de 20 à 25 micron de taille, avec un noyau central,
un kinétoplaste et un flagelle libre.
Promastigotes de Leishmania sp
Avantages:
Plus sensible / examen direct: intérêt surtout pour les parasitémies faibles
Inconvénients:
• Longue
• Contaminations bactériennes et fongiques
3-Leucocytoconcentration (LCC)
Principe: technique qui permet de concentrer les parasites sanguins sur la plus
petite surface possible d’une lame et à éliminer les globules rouges et les
plaquettes.
C’est une technique qui permet d’éviter la ponction de moelle mais sa de
sensibilité est faible
1-Hémolyse : dans un tube conique pour centrifugation, hémolyser 0,5 ml
de sang en le mélangeant avec 2,5 ml de la solution hémolysante.
Homogénéiser soigneusement le mélange par agitation au « vortex ».
Laisser hémolyser jusqu’à l’obtention d’une hémolyse parfaite (l’hémolyse
parfaite est obtenue en 10 à 20 mn lorsque le sang prend un aspect « laqué »)
Technique: a partir d’un prélèvement sanguin fait sur tube citraté
(l’héparine lèse les leishmanies).
Composition de la solution hémolysante: solution de saponine:
Saponine à 0,4%
Formol à 2,5%
Glycérine à 0,5%
Eau salée à 0,9% qsp 100 ml.
Filtrer soigneusement la solution obtenue à l’aide d’un filtre de 0,2 µm,
l’aliquoter en tubes coniques à centrifugation de 5ml et conserver au
congélateur à -20˚C.
2-Leucoconcentration: concentrer les leucocytes et les parasites par une
première centrifugation de 10 minutes à 2500 tours par mn, jeter le
surnageant, reprendre le culot dans 100 µl d’eau salée à 0,9%.
Homogénéiser soigneusement par agitation au « vortex ».
Centrifuger une deuxième fois pendant 10 mn à 2500 tours par mn, jeter le
surnageant.
3-Etalement des frottis sur lame porte-objet : confectionner des
frottis à partir du culot de centrifugation sur des lames porte-objet.
4-Coloration: sécher les lames et réaliser une coloration par le Giemsa,
après fixation au méthanol.
5-Lecture : lire au microscope optique au G x100 à la recherche des formes
amastigotes de Leishmania sp.
NB : le reste de prélèvement de tube citrate est destiné pour la culture :
Centrifuger à 2500 trs/mn pendant 10mn. jeter le surnageant et récupérer
l’interphase (la couche leucocytaire) et l’ensemencer sur milieux NNN ou
blanc d’œuf .
4-Biologie moléculaire: recherche d’ADN parasitaire par PCR
Tout type de prélèvement
Sensibilité > ED et culture
Coûteuse, réservée aux laboratoires spécialisés.
Diagnostic indirect : (séro immunologique) : recherche des
anticorps spécifiques dans le sérum du malade.
Plusieurs techniques peuvent être utilisées : ELISA, IFI, HAI, western blot,…
Il faut utiliser deux techniques, une qualitative (western blot,…) et l’autre
quantitative (ELISA, IFI,.. )
Inconvénients: sensibilité ↓ chez immunodéprimé (VIH+)
Réactions croisées: trypanosomoses, toxoplasmose, tuberculose
Intérêt dans le suivi thérapeutique limité: Ac persistent pendant des mois après
guérison.
Anthropozoonose cosmopolite, qui touche les animaux à sang chaud, y
compris l'être humain, due à un protozoaire intracellulaire obligatoire:
le Toxoplasma gondii.
II-TOXOPLASMOSE
Latente: sujets immunocompetants
Risque infectieux : femmes enceintes séro (-), sujets ID:
(sidéens, greffés…).
Diagnostic biologique:
I-Diagnostic direct: mise en évidence du parasite viable , ou de l’ ADN
parasitaire: ( ID+++ )
Prélèvements: placenta, liquide amniotique, LCR, LBA, ponction ganglionnaire, biopsie
cérébrale,…
Frottis ou apposition
lecture souvent difficile.
Inoculation à 'animal (souris)résultats longs à aboutir
Biologie moléculaire: PCRréponse rapide et sensible
PCR en temps réel +++
(MGG) (IFD)
Frottis coloré:(lecture difficile): tachyzoites de T gondii (forme de
croissant asymétrique ou d'un arc, de 5 à 8 μm de long / 2 à 4 μm)
II-Diagnostic indirect: séro-immunologique:
A la suite d'une infection toxoplasmique, l'organisme
synthétise des anticorps spécifiques (IgM, IgA, IgE,
IgG).
Meilleure connaissance de la cinétique
d'évolution de ces anticorps ++++
Interprétation correcte des résultats d’examens
sérologiques.
• IgM spécifiques apparaissent une semaine après la contamination.• atteignent leur maximum en 2 à 3 semaines.• pour disparaitre vers le 4ème ou 6mois.
IgG spécifiques apparaissent vers le 15
maximum vers le 2ème mois
restent en plateau à un taux élevé pendant plusieurs mois (6 mois)
s'abaissent lentement, jusqu'à un taux résiduel IgA ont une évolution parallèle à celle des IgM mais sont détectables au maximum pendant 6 mois
Techniques sérologiques utilisées
Selon la nature de l'antigène utilisé:
1-Techniques utilisant un Ag figuréImmunofluorescence indirecte (IFI) +++
Immuno-Sorbent Agglutination Assay (ISAGA)
2-Techniques utilisant un Ag soluble:Méthodes immuno-enzymatiques : ELISA +++
Techniques complémentaires: dater ou confirmer une
toxoplasmose: Test d’avidité des IgG , Western Blot,…
Valeur du titre des IgG
IgG < 10 UI/ml → (-)10 UI/ml ≤ IgG ≤ 300 UI/ml → f à moyen (+)
IgG > 300 UI/ml → Fortement (+)
Associée 02 techniques:Une technique pour doser les IgM
Une technique pour doser les IgG
Pour les IgG
Les résultats sont rendus en UI/ml
Pour chaque technique: seuil de positivité : 6 UI/ml ou 10 UI/ml.
Interprétation: sur 2 sérums à 1mois d’intervalle:
même technique, même laboratoire
Présence/ absence IgG/IgM
Stabilité/ascension significative des titres des IgG
Examens complémentaires : IgA, avidité des IgG
Dans la toxoplasmose congénitale:
Chez le fœtus et le nouveau-né: à côté du transfert passif
d’AC maternelles, il y a production d'Ac propres au fœtus:
IgM et IgA (5ème mois de la gestation )
Les IgM et IgA ne traversant pas le placenta, leur présence dans le
sérum du nouveau-né à la naissance = atteinte congénitale
Seules les IgG traversent le placenta. (3ème mois de la vie fœtale),
augmentent progressivement au cours de la grossesse
Après la naissance 02situations sont possibles:
Nouveau-né n’est pas infecté
Nouveau-né infecté
Diminution régulière du titre d’IgG
Négativation totale (6 à 9 mois après la
naissance)
du titre des IgG
Atteindre un maximum environ à 01an
Régression lente sans jamais disparaitre
complètement
Diagnostic prénatal : proposé en cas de séroconversion maternelle
Amniocentèse: réalisée à partir de 18 Semaines , au moins 4 semaines après
la date présumée de l’infection maternelle; prélever 15 – 20 ml de liquide
amniotique: PCR, Western blot
Sérologie de contrôle 10j après la naissance
Sérologie tous les mois puis tous les 2 mois durant la première année
Diagnostic néonatal: tout NN de mère contaminée en cours de grossesse
Prélèvement de sang de la mère et de l’enfant : western blot ou ELIFA
Calcul de la charge immunitaire de la mère et de l’enfant
CI =IgG spécifiques (en UI / ml) x 1000
IgG totales (en g / l)
Chez le sujet immunodéprimé
Recherche directe du parasite +++ : dans le sang, LCR,, LBA, moelle
osseuse,. ponction ganglionnaire, biopsie cérébrale,…
Sérologie: souvent difficile à interpréter:
IgM: en général absentes.
IgG: réponses diverses: titres faibles, élevés stables, ( des IgG)
Western Blot: production locale d'anticorps dans le LCR, HA
Toxoplasmose oculaire
Sérologie: mise en évidence d’une synthèse locale des anticorps
spécifiques (IgG , IgM) dans l’Humeur Aqueuse (HA),.
Comparaison de la charge immunitaire de l’ Humeur aqueuse avec
celle du sérum = Coefficient Desmonts.
Comparaison du profil immunologique sérum / HA = analyse
comparée des spécificités des anticorps par Western Blot
PCR: recherche du parasite dans l’ HA
III- TRYPANOSOMOSES
Trypanosomose Humaine Africaine (THA) : maladie de
sommeil)
Maladie parasitaire endémique touchant de nombreux pays de l’Afrique
subsaharienne, les parasites responsables sont des protozoaires flagellés
sanguicoles:
T. brucei gambiense : en Afrique de l’Ouest et Centrale.
T. brucei rhodesiense en Afrique de l’Est.
Ils sont transmis à l’homme par un arthropode vecteur hématophage :
la glossine ou mouche Tsé-Tsé.
Diagnostic biologique:
Le diagnostic de la THA est avant tout biologique: Il faut
• Mettre en évidence le parasite (dg de certitude),
• Établir la phase de la maladie (Phase lymphatico-sanguine ou méningo-
encéphalique), ce qui va orienter le traitement, et apprécier son
efficacité.
Séjour en zone d’endémie (Afrique équatoriale)
Fièvre, adénopathies cervicales et sous claviculaires, splénomégalie
Tout signe neurologique (sensitifs, psychiques, du sommeil ou moteurs),
qui signe alors le passage du parasite du systeme lymphatico-sanguin vers
le LCR
Eléments d’orientation:
Anémie, hyperleucocytose avec monocytose et plasmocytose (cellules de
Mott)
Elévation considérable des IgM sériques (4 à 20x la normale).
Examen direct de sang à l’état frais: entre lame et lamelle : les
trypanosomes ondulent entre les hématies
Prélèvements: sang, ponction ganglionnaire, LCR.
1-Phase sanguine:
Examen direct après différentes techniques d’enrichissement :
Centrifugation en tube capillaire hépariné (très utilisée sur le terrain)
Centrifugation après lyse des hématies (leuco-concentration)
Les trypanosomes, très mobiles, sont observés à l’interface
globules rouges – plasma.
Frottis sanguin, goutte épaisse, ponction ganglionnaire
colores au MGG : forme trypomastigote, forme allongée, 15 à 25 µm,
noyau central, kinétoplaste punctiforme postérieur, membrane ondulante
longeant le corps sur toute sa longueur et flagelle libre à partir de
l'extrémité antérieure
Trypomastigotes de Trypanosoma brucei
Trypomastigotes de Trypanosoma brucei
Culture su milieu NNN: peu pratiquée.
Résultat: forme épimastigote, forme allongée, de 15 à 20 µm, noyau
central, kinétoplaste proche du noyau, flagelle libre à partir de
l'extrémité antérieure
Épimastigote de Trypanosama sp
Autres techniques:
Filtration sur colonne échangeuse d’ions (DEAE cellulose):
Les trypanosomes seuls éléments du sang à passer à travers la colonne,
sont recueillis dans un tube et observés. sur le terrain, des mini-colonnes
sont utilisées. Inoculation a l’animal : peu pratiquée
Sérologie: recherche des Ac spécifiques
En cas de négativité des examens précédents, le recours aux
techniques sérologiques est nécessaire :
Immunofluorescence indirecte (IFI)
Techniques immuno-enzymatiques :ELISA
2-Phase méningo-encéphalique (tardive):
Dans le LCR: recherche des trypanosomes (après éventuel enrichissement par
centrifugation): souvent difficile de voir des trypanosomes.
Toute suspicion de THA impose la réalisation d’une ponction lombaire.
La numération des cellules constitue un bon critère de passage en phase
neurologique:
les IgM sont 4-20 fois supérieures a la normale. hyperleucocytose,
monocytose, et surtout plasmocytose (cellule de Mott) et protidémie forte
quasi pathognomonique de la trypanosomose
Trypanosomose Humaine Américaine (Maladie de
Chagas):
La Trypanosomose Américaine, ou maladie de Chagas, est provoquée par
Trypanosoma cruzi, transmis par les déjections des arthropodes
hématophages, réduves du genre Triatoma, Rhodnius ou Panstrongylus. Elle
sévit à l'état endémique en Amérique tropicale
Le diagnostic est évoqué sur des arguments:
Épidémiologiques: séjour en zone d’endémie (continent sud américain,
Mexique, sud de l’Argentine).
Cliniques : œdème bipalpebral, unilateral (signe de Romana), fièvre
irrégulière), lésions musculaires, atteinte myocardique et digestive,…
Diagnostic biologique
Eléments d’orientation:
Diagnostic de la phase aiguë: diagnostic parasitologique direct
La recherche du parasite se fait au niveau du sang
On utilise les mêmes techniques que pour les trypanosomoses Africaines
Examen direct (goutte de sang a l’état frais)
Examens après concentration: (méthodes de concentrations)
Frottis, goutte épaisse,..
Après coloration au MGG: forme trypomastigote de Trypanosoma cruzi
allongée de 15 a 25 μm, kinetoplaste volumineux postérieur, près duquel se
trouve le kinétosome sur lequel s’insère le flagelle
Trypanosoma cruzi se différencie du T. brucei par un kinétoplaste subterminal
très volumineux et une forme trapue en C
Trypanosoma cruzi (trypomastigote)
Trypanosoma cruzi (trypomastigote)
Trypanosoma cruzi (trypomastigote)
Rechercher les anticorps spécifiques de T. cruzi : IFI, ELISA, HAI
Diagnostic de la phase chronique: essentiellement sérologique
Autres techniques exceptionnellement pratiquées:
Le xénodiagnostic: les malades sont
piqués par des réduves non infectées élevées
au laboratoire. Les trypomastigotes seront
recherchés 30, 60 et 90 jours plus tard dans
leurs déjections,.
L’hémoculture: milieu (LIT: Liver Infusion Tryptose) ;
Les cultures sont maintenues à 28 °C et sont observées mensuellement pendant 4
à 6 mois (recherche des epimastigotes identiques a celles de T. brucie )
Biologie moléculaire: recherche de l’ADN parasitaire par PCR
IV-MICROFILAIRES SANGUICOLES
Loa loa: filariose cutanéo-dermique par la localisation des adultes et
sanguicoles par la localisation des microfilaires.
Wuchereria bancrofti, Brugia malayi: filarioses lymphatiques par
la localisation des adultes et des microfilaires dans les voies lymphatiques, et
sanguicoles par la localisation des microfilaires.
Séjour en zone d’endémie
Hyper éosinophilie+++
Signes cliniques: très différents selon les espèces:
Loase: œdème allergique, migrateur et fugace ( œdème de Calabar),
localisé préférentiellement aux membres supérieurs , reptation de la filaire
adulte sous la conjonctive de l’œil.
Éléments d’orientation:
Filarioses lymphatiques: Wuchereria bancrofti, Brugia malayi
Lymphangites aigues et chroniques, sclérose et éléphantiasis des membres.
Recherche et identification des microfilaires:
Prélèvement sanguin:
Les microfilaires apparaissent dans le sang selon une périodicité qu’il faut
respecter pour optimiser le rendement diagnostique :
Loa loa : le jour, entre 10 h et 16 h
W. bancrofti: la nuit, entre 22 h et 4 h
B. malayi : la nuit, entre 22 h et 4 h
Techniques de mise en évidence
Examen direct: goutte de 10 μl de sang frais, entre lame et lamelle
permettant de voir facilement la microfilaire entre les globules rouges (Gx 10 )
Microfilaire de Loa loa.
Frottis sanguin ou goutte épaisse (MGG): facilitent le diagnostic
d’espèce.
Les critères morphologiques d’identification sont en particulier:
La taille des microfilaires
La présence ou non d’une gaine plus ou moins colorée au Giemsa,
La forme de l’extrémité postérieure plus ou moins effilée
L’extrémité céphalique grande ou petite
La présence plus ou moins terminale des noyaux somatiques
Microfilaires Loa loa Wuchereria
bancrofti
Brugia malayi
Critères
Taille 300 um 300 um 250 um
Présence d’une
gaine plus ou
moins colorée
Gaine courte mal colorée Gaine courte bien
colorée
Gaine longue bien colorée
L’espace
céphalique
Court Court Long
l’extrémité
postérieure
(caudale)
Effilée contenant des noyaux
terminaux
Effilée contenant des
noyaux subterminaux
2renflements
,1subterminal et
1terminal contenant
chacun un noyau
Principaux caractères des microfilaires sanguinoles
La gaine
Microfilaire de Loa loa
Frottis de sang coloré: Extrémité post effilée, avec noyaux terminaux allongés
Microilaire de Loa loa : frottis sanguin
Frottis de sang: microfilaire de Loa loa
Microfilaire de W. bancrofti GE colorée noyaux subterminaux
Microfilaires Wuchereria bancrofti
Brugia malayi. Espace céphalique long. Deux noyaux terminaux bien séparés
Frottis. Microfilaires Brugia malayi. Gaine longue bien colorée
Brugia malayi. Goutte épaisse. Attitude régulière. Coloration M.G.G. Obj. 10.
Technique de leuco-concentration: très utile en cas de pauci
parasitisme. Elle conserve la mobilité des microfilaires
Microfilaire de Loa loa (LCC)
Sérologie: les résultats obtenus doivent être interprètes avec beaucoup
de prudence du fait des réactions croisées nombreuses existant entre les
nématodes: ELISA, IFI, Electrosynerese …
Détection des antigènes circulants : kits spécifiques de Wuchereria
bancrofti par immuno-chromatographie, donne de bons résultats.