Interaction de Interaction de Neisseria meningitidisNeisseria meningitidis avec avec l’endothelium :l’endothelium :
Un rôle du récepteur béta-2-adrénergique ?Un rôle du récepteur béta-2-adrénergique ?
Interaction Neisseria meningitidis et cellules endothélialesInteraction Neisseria meningitidis et cellules endothéliales
??
Ezrine recrutéeet phosphorylée
RhoCdc 42
Polymerisation d’actine
Microvillosités
????
Résistance au fluxRésistance au fluxInternalisationInternalisation??
Formation des microvillositésFormation des microvillosités
Eugene, J Cell Sci 2002
PIP2PIP2PIP2PIP2
PP
Rho kinasePKCα
Nck interacting kinase
PIP2PIP2
Recrutement et activation de l’ezrineRecrutement et activation de l’ezrine
Bretscher, Nat Rev Cell Biol 2002
Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005
Induction de Induction de rufflesruffles par l’Ach. Ces par l’Ach. Ces rufflesruffles sont riches en ERM phosphorylée sont riches en ERM phosphorylée
L’induction des L’induction des rufflesruffles par Ach nécessite l’ezrine par Ach nécessite l’ezrine
Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005
Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine
GRK2 est capable de phosphoryler l’ezrine sur son site « habituel » GRK2 est capable de phosphoryler l’ezrine sur son site « habituel » d’activation in vitro. d’activation in vitro. Cette phosphorylation est dépendante de la présence de PIP2 et de Cette phosphorylation est dépendante de la présence de PIP2 et de GG : : nécessité activation récepteur ? nécessité activation récepteur ?
Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005
Le Le rufflingruffling induit par ACh dépendant de GRK2 et de la phosphorylation de induit par ACh dépendant de GRK2 et de la phosphorylation de l’ezrinel’ezrine
Dominant négatif
GRK2
GRK2 sans a
ctivit
é kinase
GRK2 non recru
table
Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005
Induction de l’endocytose du récepteur 2 adrénergique par l’isprotérénol (agoniste).Cette endocytose est connue
pour être dépendante de l’actine.
Il existe une Il existe une colocalisation avec les colocalisation avec les pERMpERM
Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005
L’endocytose du β2-AR induit par un agoniste, phénomène dépendant de l’actine, nécessite nécessite l’ezrine.l’ezrine.
Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine
Cant, Mol Biol Cell 2005
rôle possible des GPCR dans les modifications du cytosquelette d’actine rôle possible des GPCR dans la phosphorylation de l’ezrine via GRK2 certains GPCR sont endocytés après fixation de l’agoniste, dans un processus nécessitant l’ezrine et la polymerisation d’actine.
Existe-t-il un lien entre la formation de la plaque corticale Existe-t-il un lien entre la formation de la plaque corticale induite par induite par NmNm et un GPCR ? et un GPCR ?
Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de Rôle possible des GPCR dans le recrutement et l’activation de l’ezrinel’ezrine
CCR5Β2-adrenergic R
CXCR4ATI-R
Il existe un recrutement de GPCR au niveau de la plaque Il existe un recrutement de GPCR au niveau de la plaque corticalecorticale
L’induction de l’endocytose (agoniste) du L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe 2AR inhibe le recrutement d’ezrinele recrutement d’ezrine
Ezrin recruitment
0%
20%
40%
60%
80%
100%
cont
rol
Iso SDF1
MIP
1β IL8
AT2
5 à10 x Kd
% o
f re
cru
itin
g c
olo
ny
ββ-agonist-agonist
Ct 0,0001 0,01 1 10
Ezrin recruitment
Isoproterenol (μM)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
% o
f re
cru
itin
g c
olo
ny
- 10µM 10µM 1µM 1µM - - + - +
Ezrin recruitment
0%
20%
40%
60%
80%
100%
IsoproterenolPropranolol
% o
f re
cru
itin
g c
olo
ny
Cet effet est bien du à l’action spécifique de l’isoprotérénol sur son récepteur 2AR
L’induction de l’endocytose (agoniste) du L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe 2AR inhibe le recrutement d’ezrinele recrutement d’ezrine
0
20
40
60
80
100%
of
recr
uiti
ng
co
lon
yEzrin recruitment
Control Propranolol10 uM
ββ-antagonist-antagonist
Nm n’interagit pas avec le site actif du 2AR
L’induction de l’endocytose (agoniste) du L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe 2AR inhibe le recrutement d’ezrinele recrutement d’ezrine
0
20
40
60
80
100
Control PKA-PS
20uM 10uM
Forkolin10-5 M
PKA-PS Forkolin10-6 M
Ezrin recruitment
% o
f re
cru
itin
g c
olo
ny
Le recrutement d’ezrine induit par l’interaction Nm/2AR n’est pas dépendant de la voie des protéines G
L’induction de l’endocytose (agoniste) du L’induction de l’endocytose (agoniste) du 2AR inhibe 2AR inhibe le recrutement d’ezrinele recrutement d’ezrine
Il existe une deuxième voie de transduction du signal Il existe une deuxième voie de transduction du signal 2adrénergique2adrénergique
Lefkowitz, Science 2005
Il existe une deuxième voie de transduction du signal Il existe une deuxième voie de transduction du signal 2adrénergique2adrénergique
Beta-arrestin2-GFP ezrin GRK2-GFP ezrin
Ezrin recruitment
0%
20%
40%
60%
80%
100%
ControlsiRNA
Arrestin 1+2sirRNA
FLNA sirRNA GRK2 sirRNA
Ezrin
Il existe une deuxième voie de transduction du signal Il existe une deuxième voie de transduction du signal 2adrénergique2adrénergique
30 min
2C43-GFP + isoproterenol
2C43-GFP
90 min 150 min 210 min 270 min
Nm, Nm, 2AR et microvillosités2AR et microvillosités
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
ct 0h ct 1h ct 2h ct 3h Ct 4h
0 à 12µm
12 à 48µm
48 à 192µm
+ de 192
Nm, Nm, 2AR et microvillosités2AR et microvillosités
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
ct 0h ct 1h ct 2h ct 3h Ct 4h
0 à 12µm
12 à 48µm
48 à 192µm
+ de 192
+ iso :+ iso :
* séquence de recrutement des GPCR
* si RNA 2AR
* vérifier l’activation de 2AR (voie des protéines G)
* screening des GRK impliqués
A court terme …A court terme …