REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
LABORATOIRE DE PHYTOPATHOLOGIE
MEMOIRE
Présenté par
Mlle. GHOMARI Faïza Nawel
POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE MAGISTER
Spécialité : Microbiologie Appliquée
Option : Phytopathologie
Soutenu le : 15-12-2009 Devant le jury composé de :
Mr. SLIMANI M. Professeur à l'Université d'Es-Sénia Président
Mr. HENNI J.E. Professeur à l'Université d'Es-Sénia Rapporteur
Mr. KIHEL M. Professeur à l'Université d'Es-Sénia Examinateur
Mr. GUESSAS B. Maître de Conférences à l'Université d'Es-Sénia Examinateur
Mr. HEDADJI M. Maître de Conférences à l'Université d'Es-Sénia Examinateur
Année Universitaire : 2008 - 2009
« Moyens de Luttes Chimique et Biologique Contre le
Fusarium oxysporum f.sp. albedinis Agent Causal du Bayoud
Chez le Palmier Dattier Phœnix dactylifera L. »
Table des Matières
Table des Matières
Résumé ...................................................................................................................................... ix
Abstract ...................................................................................................................................... x
xi .................................................................................................................... انهخض
Liste des tableaux .................................................................................................................... xii
Liste des figures ..................................................................................................................... xiii
Liste des abréviations ............................................................................................................... xv
Glossaire ................................................................................................................................ xvi
Introduction........................................................................................................................... 2
Première Partie : Synthèse Bibliographique
Chapitre I : Le palmier dattier ............................................................................................... 6
1/ Distribution systématique .................................................................................................. ....6
2/ Description morphologique ................................................................................................... 7
3/ Cycle végétatif ou cycle de développement ....................................................................... 12
4/ Ecologie du palmier dattier ................................................................................................. 13
5/ Multiplication du palmier dattier ........................................................................................ 14
6/ Répartition géographique du palmier dattier ........................................................................ 15
7/ Importance économique du palmier dattier ......................................................................... 15
Chapitre II : L’agent pathogène ........................................................................................... 18
1/ Historique de la taxonomie ................................................................................................ 18
1.1/ Le genre Fusarium ............................................................................................... 18
1.2/ L’espèce oxysporum ............................................................................................. 18
1.3/ La forme spéciale albedinis .................................................................................. 19
2/ Position systématique .......................................................................................................... 19
3/ L’agent pathogène : Fusarium oxysporum f.sp. albedinis ................................................ 20
4/ Description morphologique .................................................................................................. 20
4.1/ Caractères macroscopiques .................................................................................. 20
4.2/ Caractères microscopiques ................................................................................... 22
ii
Table des Matières
Chapitre III : La maladie du « Bayoud » ............................................................................. 24
1/ Historique et progression de la maladie .............................................................................. 24
2/ Symptômes de la maladie .................................................................................................... 26
2.1/ Symptômes externes .............................................................................................. 26
2.2/ Symptômes internes ............................................................................................. 27
3/ Pénétration et progression du champignon dans la plante .................................................. 27
4/ Epidémiologie ..................................................................................................................... 27
5/ Moyens de luttes .................................................................................................................. 28
5.1/ Les mesures prophylactiques ................................................................................ 28
5.2/ Les techniques culturales ...................................................................................... 28
5.3/ La lutte chimique .................................................................................................. 29
5.4/ La lutte biologique ................................................................................................ 29
5.5/ La lutte génétique ................................................................................................. 30
5.6/ la lutte intégrée ..................................................................................................... 30
Deuxième Partie : Matériels et Méthodes
Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte ............................................................ 34
I/ Le parasite et sa culture ....................................................................................................... 34
1.1/ Espèce étudiée ...................................................................................................... 34
1.2/ Echantillonnage et isolement des souches de F.o.a. ............................................ 34
1.3/ Techniques d’isolement de F.o.a. ........................................................................ 34
1.4/ Purification des souches de F.o.a. ........................................................................ 37
1.5/ Identification des souches de F.o.a. .................................................................... 38
1.5.1/ Etude des caractères culturaux .............................................................. 38
1.5.2/ Etude des caractères microscopiques ................................................... 38
1.6/ Etude physiologique des souches de F.o.a. .......................................................... 39
1.6.1/ Influence de la température ................................................................... 40
1.6.2/ Influence des sources carbonées ............................................................ 40
1.6.3/ Influence des sources azotées ................................................................ 40
1.6.4/ Influence de la lumière .......................................................................... 40
1.6.5/ Influence du pH du milieu ..................................................................... 40
1.6.6/ Influence de l’humidité ........................................................................... 41
iii
Table des Matières
1.7/ Conservation des souches de F.o.a. ..................................................................... 42
II/ L’hôte et sa culture ............................................................................................................. 42
2.1/ Espèce étudiée ...................................................................................................... 42
2.2/ Préparation des plantules de palmier .................................................................... 42
2.2.1/ Germination des noyaux de dattes ......................................................... 42
2.2.2/ Plantation des noyaux de dattes ............................................................. 42
2.2.3/ Préparation de la solution nutritive (Solution KNOP) .......................... 44
2.3/ Etude du pouvoir pathogène ................................................................................. 44
2.3.1/ Préparation de l’inoculum ..................................................................... 44
2.3.2/ Inoculation des plantules au niveau du système racinaire ..................... 44
2.3.3/ Réisolement du parasite ......................................................................... 45
Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique ................................................... 47
I/ Dosage des protéines totales des isolats de F.o.a. ............................................................... 47
1.1/ Préparation des extraits mycéliens ....................................................................... 47
1.1.1/ Culture du champignon ......................................................................... 47
1.1.2/ Obtention des extraits ............................................................................ 47
1.2/ Principe du dosage des protéines .......................................................................... 47
1.2.1/ Composition du Réactif de Bradford ..................................................... 48
1.2.2/ Courbe d’étalonnage ............................................................................. 48
II/ Électrophorèse .................................................................................................................... 48
2.1/ Préparation des gels pour le système PAGE ........................................................ 48
2.2/ Migration et mise sous tension ........................................................................... 49
2.3/ Révélation des systèmes isoenzymatiques ........................................................... 50
2.4/ Isoenzymes étudiés ................................................................................................ 51
2.5/ Préparation des gels pour le système SDS-PAGE ............................................... 52
2.6/ Dénaturation des échantillons .............................................................................. 52
2.7/ Révélation des bandes .......................................................................................... 52
Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte ........................................ 54
I/ Lutte chimique contre L’isolat F13 de F.o.a. ...................................................................... 54
1.1/ Les fongicides testés ................................................................................................. 54
1.2/ Préparation des solutions de fongicides .................................................................... 54
iv
Tables des Matières
1.3/ Test sur milieu solide ............................................................................................... 55
II/ Lutte biologique .................................................................................................................. 57
2.1/ Provenance de l’agent antagoniste testé .................................................................... 57
2.2/ Test de l’activité antagoniste in vitro ........................................................................ 57
2.2.1/ Confrontation par contact direct sur milieu de culture ................................... 58
2.2.2/ Activité des filtrats de culture ......................................................................... 58
Troisième partie : Résultats et Discussions
I/ Isolement du champignon ................................................................................................... 62
II/ Identification des souches de F.o.a. ................................................................................... 62
2.1/ Aspect morphologique .............................................................................................. 62
2.2/ Caractères microscopiques ........................................................................................ 66
2.3/ Effet des différents milieux de culture ..................................................................... 66
III/ Etude physiologique de F.o.a. ........................................................................................... 70
3.1/ Influence de la température ....................................................................................... 70
3.2/ Influence des sources carbonées ............................................................................... 70
3.3/ Influence des sources azotées ................................................................................... 70
3.3/ Influence de la lumière .............................................................................................. 70
3.4/ Influence du pH du milieu ........................................................................................ 70
3.5 Influence du taux d’humidité ..................................................................................... 73
IV/ Estimation du pouvoir pathogène ..................................................................................... 73
V/ Dosage des protéines des isolats de F.o.a. ......................................................................... 75
VI/ Électrophorèse ................................................................................................................... 75
6.1/ Estérases .................................................................................................................... 75
6.2/ Phosphatases ............................................................................................................. 75
6.3/ Peroxydases ............................................................................................................... 75
6.4/ Protéines totales ........................................................................................................ 75
VII/ Lutte chimique contre l’isolat F13 de F.o.a. .................................................................. 79
XI/ Lutte biologique contre l’isolat F13 de F.o.a. .................................................................. 83
8.1/ L’agent antagoniste ................................................................................................... 83
8.2/ Test de l’activité antagoniste de Trichoderma harzianum ........................................ 84
v
Tables des Matières
Discussions .......................................................................................................................... 89
Conclusion ............................................................................................................................ 95
Références Bibliographiques ........................................................................................ 97
Annexes .............................................................................................................................. 110
vi
Remerciements
En mon nom personnel,
Mes premiers remerciements iront à Dieu le tout puissant pour m’avoir aidé
à suivre mes études universitaires et à les corroborer par le présent mémoire.
Mes vifs remerciements s’adressent à mes très chers parents qui ont été
toujours présents quand il le faut.
Que Mr. HENNI J.E., Professeur à la Faculté des Sciences, Département
de Biologie à l’Université d’Oran, veuille bien accepter mes remerciements les plus
sincères pour l’accueil qu’il m’a réservé durant la réalisation de ma thèse au sein de
son Laboratoire de Phytopathologie, à l’Université d’Oran au Département de
Biologie, et la mise à ma disposition des moyens nécessaires pour le déroulement
correct de mon travail.
Je remercie Mr. KARKACHI N., Maître assistant à l’Université d’Oran,
pour son suivi efficace et rigoureux. Je le remercie chaleureusement pour son aide,
sa disponibilité qu’il a constamment montrée à mon égard, son guide précieux et
ses conseils judicieux. Qu’il trouve ici l’expression de ma gratitude et de mon
profond respect.
Je tiens à remercier vivement Mme GHARBI KARKACHI S., Maître
assistante à l’Université Mohamed Boudiaf d’Oran (U.S.T.O.), pour son aide
précieuse, sa rigueur scientifique, ses conseils avisés et ses encouragements
permanents. Qu’elle me soit permise de lui prouver ma profonde reconnaissance.
Je suis très sensible à l’honneur que me fait Mr. SLIMANI M., Professeur
à l’Université d’Oran, qui a bien voulu accepter de présider ce Jury. Qu’il veuille
bien accepter l’expression de mes sincères remerciements.
Je remercie Mr. KIHEL M., Professeur à l’Université d’Oran et Mr.
HADADJI M., Maître de Conférences à l’Université d’Oran, qui ont accepté
d’examiner ce travail. Qu’ils trouvent ici le témoignage de mon profond respect.
Je tiens à remercier tout particulièrement Mr. GUESSAS B., Maître de
Conférences à l’Université d’Oran, qui accepte de juger ce travail. Qu’il trouve ici
l’expression de ma respectueuse gratitude et de mon profond respect.
Mes remerciements s’adressent également à toute l’équipe du Laboratoire de
Phytopathologie et tous mes encouragements à ma promotion de Magister.
Je suis particulièrement reconnaissante à mes collègues Mohamed D. Amina
A., Malika G., et Zakia H., pour leur disponibilité exceptionnelle, leur aide
physique, leurs encouragements et surtout leurs soutien moral.
Je remercie enfin, tout ce qui ont contribué de prés ou de loin et qui ont pris
une part active à la réalisation de ce travail, ainsi que tous ceux qui j’aurais pu
oublier et qui se reconnaitront dans la collaboration apportée à la réalisation de ce
travail.
Faïza Nawel GHOMARI
Résumé
Le Bayoud est une fusariose vasculaire spécifique du palmier dattier (Phœnix
dactylifera L.), due à un champignon tellurique, le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis.
Généralement les orientations de lutte sont identiques à celles adoptées contre toutes les
fusarioses vasculaires.
Notre travail à porter sur l’isolement de 20 souches de champignon appartenant au
genre Fusarium et à identifier 06 souches d’entre elles de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
La virulence de ces souches est confirmée par le test de pathogénicité.
Après l’isolement et la purification, la caractérisation morphologique indique
l’existence de trois morphotypes mycéliens différents, type cotonneux, type duveteux et type
ras muqueux. En outre, les observations microscopiques, montrent la présence des trois spores
caractéristiques d’un Fusarium.
L’étude physiologique du champignon, révèle une croissance meilleure sur le milieu
PDA à pH 5, avec une température optimale de 28 °C sous une photopériode de 12 heures. La
source de carbone favorable à la croissance est représentée par les monosaccharides et la
source d’azote par les nitrates de potassium et de sodium.
L’étude du polymorphisme isoenzymatique, par la révélation de trois systèmes à savoir :
les estérases, les phosphatases acides et les peroxydases, montre une similarité des profils
électrophorétiques chez les isolats de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
Les essais d’une lutte chimique d’une part, contre le Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis, par l’utilisation in vitro de 20 substances fongicides incorporées au milieu PDA
solide avec différentes concentrations (50-100-200 et 400 ppm), révèle la présence d’une
activité inhibitrice de quelques substances sur la croissance de la colonie du champignon.
D’autre part, une lutte biologique in vitro avec le Trichoderma harzianum, comme agent
antagoniste, que ce soit d’une façon directe sur milieu de culture ou par activité des filtrats de
culture, montre une inhibition de la croissance mycélienne du pathogène testé.
Mots clés :
Palmier dattier, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, pouvoir pathogène, identification, profils
électrophorétique, lutte chimique, lutte biologique, Trichoderma harzianum.
ix
Abstract
Bayoud is one specific vascular fusariose of the date palm (Phœnix dactylifera L.), due
to a telluric fungi, the Fusarium oxysporum f.sp. albedinis. Generally the orientations of fight
are identical to those adopted against all vascular fusarioses.
Our work to be concerned the isolation of 20 strains of fungi belonging to the genre
Fusarium and to identify 06 stumps of them of Fusarium oxysporum f.sp. albedinis. The
virulence of these stumps is confirmed by the test of pathogenicity.
After the isolation and the purification, the morphological characterization indicates the
existence of three different typical morphotypes typical lifeless, downy and typical short
mucous. Besides, the microscopic observations show the presence of three characteristic spores
of Fusarium.
The physiological study of the fungi strains reveals a better growth on the PDA medium
with pH 5, with an optimal temperature of 28 °C under a photoperiod of 12 hours. The source
of carbon favorable to the growth is represented by monosaccharides and the source of nitrogen
by nitrates of potassium and sodium.
The study of the isoenzymatique polymorphism, by the revelation of three systems
namely: esterase, acid phosphatases and peroxydases, shows a similarity of the electrophoretic
profils for strains of Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
The essays of a chemical fight, on one hand, against Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis, by the in vitro use of 20 fungicidal substances incorporated in the middle solid PDA
with various concentrations (50-100-200 and 400 ppm), reveals the presence of an inhibition
activity of some substances on the growth of the colony of the fungi.
On the other hand, an in vitro biological fight with Trichoderma harzianum, as
opposing agent, whether it is in a direct way on middle of culture or by activity of the filtrats of
culture, show an inhibition of the growth mycelien of pathogenic tested.
Keywords :
Date palm, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, pathogenic power, identification,
electrophoretic profils, chemical fight, biological fight, Trichoderma harzianum.
x
الملخص
، يصذر فؽز .Phoenix dactylifera L))يزض خاص تأشجار انخيم انذتل انػائي إ
انرجياخ في يكافحر يرشاتح يغ ذهك انرثاخ . Fusarium oxysporum f.sp. albedinsأرظي،
.ػيا ظذ كم أاع انذتل انػائي
حر Fusarium يصذر ي انفؽز انحذر ي جض 20ذزكشخ انرجارب انري قا تا ػه ػشل
ذأ كيذ قذرذ انرزيعيح Fusarium oxysporum f.sp. albedinis يصا در ي 06ظرؽيغ ذحذيذ
.ي خالل اخرثاراخ انكشف ػ انفيزص
انقؽي، شكم شكم:تؼذ انؼشل انرؽيز، انرييش انرفنجي دل ػه جد ثالز أشكال يخرهفح
ي جح أخز، انالحظاخ انيكزطكتيح، أظزخ جد ثالز أتاؽ ذيش .انشغة شكم انخاغ
.Fusariumانفؽز
جيذ نهفؽز في طػ درجح ،pH 5 في درجح حظح PDA كشفد انذراطح انفيشينجيح ، ػ
انالئى، كا يثال يصذر انكزت. طاػح12 خالل يذج إظاءج قذرا C° 28حزارج ياطثح نه
.تانظكزياخ األحاديح انيرزجي يصذر رزاخ انثذاطيى أ انصديو
دراطح ذؼذد انشاغ اإلشيي، ػ ؼزيق إظار األظح انثالثح، إشيى األطرزج حط إشيى إ
.Fusarium oxysporum f.sp يانفطفر انثيزكظيذاس، أظز ذاطق األشكال نهؼياخ انؼشنح
albedinis.
20 تإطرؼالFusarium oxysporum f.sp. albedinis ذجارب انكافحح انكييائيح، ظذ ذكشف
in vitro يثيذ نهفؽز 200 -100 -50) ترزاكيش يخرهفح (PDA) ، انذيجح في طػ ان
400ppm )،انفؽزػه . جد يثثػ نثؼط اناد ػه
كؼايم Trichoderma harzianumتإطرؼال (in vitro)ي جح أخز، انكافحح انثينجيح
تؽزيقح يثاشزج في انطػ انشراػي أ ػ ؼزيق يفؼل انطػ انرجزيثي انزشح، أظزخ يعاد، طاء
. انؼياخ انخرثزج ذثثيػ ان ػذ
: مفتاحيةالكلمات ال
، انرصيف، انقذرج انرزيعيح، انجزج Fusarium oxysporum f.sp. albedinisشجزانخيم،
. arzianumh Trichoderma انكافحح انكييائيح، انكافحح انثينجيح،،انكزتائيح
xi
Liste des Tableaux
Tableau n° 01 – Production mondiale des dattes .................................................................... 16
Tableau n° 02 – Sites d’échantillonnages et souches isolées de Fusarium ........................... 35
Tableau n° 03 – Dilutions de la courbe d’étalonnage ............................................................. 48
Tableau n° 04 – Composition des gels de polyacrylamide ..................................................... 49
Tableau n° 05 – Les mélanges réactionnels pour les révélations enzymatiques ..................... 50
Tableau n° 06 – Les substances fongicides testées contre l’isolat F13 de F .o.a. .................. 54
Tableau n° 07 – Provenance des souches T1 et T2 de Trichoderma harzianum ..................... 57
Tableau n° 08 – Différents morphotypes rencontrés chez F.o.a. et Fusarium de la rhizosphère
du palmier dattier ......................................................................................... 63
Tableau n° 10 – Diamètre moyen (cm) des cinq isolats sur les trois milieux de culture ........ 69
Tableau n° 11 – Pourcentage de mortalité des plantules de palmier dattier ........................... 73
Tableau n° 12 – Densité optique (D.O.) de chaque dilution ................................................... 76
Tableau n° 13 – Densité optique (D.O.) et concentration en protéines dans chaque extrait
enzymatique des isolats de F.o.a. ................................................................ 76
Tableau n° 14 – Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la première série des
substances fongicides ................................................................................... 80
Tableau n° 15 – Taux d’inhibition (%) de la première série des substances fongicides contre
l’isolat F13 ................................................................................................... 80
Tableau n° 16 – Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la deuxième série des
substances fongicides ................................................................................... 81
Tableau n° 17 – Taux d’inhibition (%) de la deuxième série des substances fongicides contre
l’isolat F13 ................................................................................................... 81
Tableau n° 18 – Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la troisième série des
substances fongicides ................................................................................... 82
Tableau n° 19 – Taux d’inhibition (%) de la troisième série des substances fongicides contre
l’isolat F13 ................................................................................................... 82
Tableau n° 20 – Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux d’inhibition (%) des
différentes souches de Trichoderma par contact direct .............................. 84
Tableau n° 21 – Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux d’inhibition (%) des
différentes souches de Trichoderma par action des filtrats de culture ......... 85
xii
Liste des Figures
Figure n° 01 – Construction schématique d’un palmier dattier ................................................ 8
Figure n° 02 – Les quatre types de racines d’un palmier dattier ............................................... 8
Figure n° 03 – Schéma d’une palme ......................................................................................... 9
Figure n° 04 – Une inflorescence du palmier dattier .............................................................. 11
Figure n° 05 – Spathe mâle et spathe femelle ......................................................................... 11
Figure n° 06 (a) – Une fleur femelle ....................................................................................... 11
Figure n° 06 (b) – Une fleur mâle ........................................................................................... 11
Figure n° 07 – Fruit et graine du palmier dattier ..................................................................... 11
Figure n° 08 – Aspect sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis ................................ 21
Figure n° 09 – Macroconidies et microconidies de Fusarium oxysporum .............................. 22
Figure n° 10 – Situation épidémiologique du « Bayoud » du palmier dattier ......................... 25
Figure n° 11 – Symptômes de la maladie du « Bayoud » ....................................................... 26
Figure n° 12 – Symptôme unilatéral du « Bayoud
» sur une palme infectée ........................... 36
Figure n° 13 – Isolement du champignon à partir de rachis infecté sur milieu PDA ............. 36
Figure n° 14 – Germination d’un noyau de datte .................................................................... 43
Figure n° 15 – Schéma de la méthode de mesure du diamètre dans les deux sens
perpendiculaires ............................................................................................. 56
Figure n° 16 – Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par contact direct sur milieu de
culture ............................................................................................................. 59
Figure n° 17 – Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par l’activité des filtrats de
culture ............................................................................................................. 59
Figure n° 18 – Représentations des différents morphotypes rencontrés ................................. 64
Figure n° 19 – Représentation des différents aspects morphologiques des isolats de F.o.a ... 65
Figure n° 20 – Observations au microscope optique des trois types de spores de F.o.a. au
grossissement (X 400) .................................................................................... 67
Figure n° 21 – Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu PDA ................................ 68
Figure n° 22 – Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu Czapeck .......................... 68
Figure n° 23 – Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu Mathur ............................ 68
Figure n° 24 – Représentation graphique de l’influence des différents milieux de culture sur la
croissance des isolats de F.o.a. ..................................................................... 69
Figure n° 25 – Représentation graphique de l’influence des températures sur la croissance de
l’isolat F13 ...................................................................................................... 71
xiii
Figure n° 26 – Représentation graphique de l’influence de la source de carbone sur la
croissance de l’isolat F13 ............................................................................... 71
Figure n° 27 – Représentation graphique de l’influence de la source d’azote sur la croissance
de l’isolat F13 ................................................................................................. 71
Figure n° 28 – Représentation graphique de l’influence d’éclairage sur la croissance de l’isolat
F13 .................................................................................................................. 71
Figure n° 29 – Représentation graphique de l’influence du pH du milieu sur la croissance de
l’isolat F13 ...................................................................................................... 72
Figure n° 30 – Représentation graphique de l’influence du taux d’humidité sur la croissance de
l’isolat F13 ...................................................................................................... 72
Figure n° 31 – Différents symptômes notés chez les plantules de palmier dattier ................. 74
Figure n° 32 – Courbe d’étalonnage ....................................................................................... 76
Figure n° 33 – Profil électrophorétique des estérases chez les isolats de F.o.a ...................... 77
Figure n° 34 – Profil électrophorétique des phosphatases chez les isolats de F.o.a ............... 77
Figure n° 35 – Profil électrophorétique des peroxydases chez les isolats de F.o.a. ............... 78
Figure n° 36 – Profil électrophorétique des protéines totales chez les isolats de F.o.a. ......... 78
Figure n° 37 – Effet de la substance fongicide (P2) à différentes concentrations sur la
croissance mycélienne de l’isolat F13de F.o.a. ............................................. 79
Figure n° 38 – Représentation graphique du diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté
avec la première série des substances fongicides ........................................... 80
Figure n° 39 – Représentation graphique du diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté
avec la deuxième série des substances fongicides ......................................... 81
Figure n° 40 – Représentation graphique du diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté
avec la troisième série des substances fongicides .......................................... 82
Figure n° 41 – Culture de Trichoderma harzianum sur milieu Davet ................................... 83
Figure n° 42 – Observation au microscope optique de Trichoderma harzianum (G x 400) . 83
Figure n° 43 – Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. en contact direct avec les différentes
souches de Trichoderma pendant 4 jours d’incubation .................................. 84
Figure n° 44 – Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. sous l’action des filtrats de culture
des différentes souches de Trichoderma pendant 4 jours d’incubation ......... 85
Figure n° 45 – Taux d’inhibition (%) de Trichoderma harzianum contre les isolats de F.o.a.
pour les deux techniques de confrontations ................................................... 85
Figure n° 46 – Contact direct sur milieu de culture entre Trichoderma harzianum et F.o.a .. 86
Figure n° 47 – Action des filtrats de culture de Trichoderma harzianum sur la croissance de
F.o.a. .............................................................................................................. 86
xiv
Liste des Abréviations
% : pourcent
°C : Degré Celsius
µl : microlitre
µm : micromètre
CLA : Carnation Leaf Agar
Cm : centimètre
CMI50 : Concentration Minimale Inhibitrice
D.O. : Densité Optique
Est : Estérase
F.o.a. : Fusarium oxysporum f.sp. albedinis
f.sp. : forme spéciale
g/L : grammes / Litre
M : Molaire
mA : milliampère
mg : milligramme
ml : millilitre
mm : millimètre
nm : nanomètre
PAC : Phosphatase Acide
PAGE : Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
PDA : Potato Dextrose Agar
pH : potentiel d'Hydrogène
Pox : Peroxydase
ppm : partie par million
q.s.p. : quantité suffisante pour
SDS : Sodium Dodécyl Sulfate
Glu : Glucose
Mal : Maltose
Amid : Amidon
Tém : Témoin
Asn : Asparagine
Ec. con : Eclairage continu
Ob. con : Obscurité continue
Photo. 12h : Photopériode de 12 heures
xv
Glossaire
Aisselle : Région située au-dessous de l’insertion d’une feuille sur la tige, au
sommet de l’angle qu’elle forme avec la tige.
Axillaire : Se dit d’un mode de placentation dans lequel les graines paraissent
groupées sur l’axe de l’ovaire.
Bractée : Petite feuille de forme spéciale à la base du pédoncule floral.
Carpelle : Chacune des pièces florales dont l’ensemble soudé forme le pistil des
fleurs.
Corné : Qui a l’apparence de la corne.
Fasciculée : Racine fasciculée, est celle où l’on ne peut distinguer l’axe principal ou
pivot.
Inflorescence : Mode de regroupement des fleurs sur une plante.
Lancéolée : Se dit d’un organe terminé en forme de lance.
Pénée : Se dit des feuilles et des folioles disposés de l’un et de l’autre côté d’un
pétiole commun.
xvi
Introduction
Introduction
Le palmier dattier
«Phœnix dactylifera L.
» est un arbre cultivé principalement dans les zones
arides ou désertiques de l’Afrique du Nord et du Moyen Orient.
En Algérie, précisément au Sahara, le palmier dattier représente l’arbre fruitier par
excellence, puisqu’il a constitué et constitue toujours la base alimentaire des populations de
cette région.
Il assure la production de dattes -fruit au contenu sucré important- et donc il est une source
de revenus (trocs, échanges commerciaux, exportation).
Du point de vue écologique, le palmier dattier permet de :
stabiliser les sols fragiles,
lutter contre les vents,
créer, surtout, sous son couvert, un microclimat favorable à la culture de certains arbres
fruitiers et aussi à toutes autres cultures céréalières, fourragères ou maraîchères.
De plus, toutes les parties du palmier dattier (tronc, palmes, noyau du fruit,...) peuvent être
utilisées pour différents buts et dans différents domaines : industriel, agricole, élevage,
construction, fabrication de meubles, de cordes et de matériel d’emballage (Hodel
et Johnson, 2007).
Si pendant très longtemps le palmier dattier a constitué le pilier sur lequel a reposé tout
l’écosystème oasien, cet arbre symbole se trouve menacé depuis l’apparition d’une fusariose
vasculaire mortelle. Il s’agit d’une maladie cryptogamique, la plus grave et la plus dévastatrice,
appelée localement « Bayoud ». Cette trachéomycose est causée par un champignon du sol : le
Fusarium oxysporum f.sp. albedinis (Djerbi, 1991).
Depuis l’apparition de cette maladie (1898) dans les palmeraies de Figuig au Maroc et Béni
Ouenif (Béchar) en Algérie, plus de 12 Millions de palmiers dattiers ont été détruits dans ces 02
pays (Ouinten, 1996). C’est un véritable fléau des zones phœnicicoles de l’Afrique du Nord et
une menace qui pèse sur cette richesse naturelle et notamment la variété « Deglet Nour
» très
prisée dans les pays Européens.
La stratégie de lutte contre « le Bayoud
» menée par les pouvoirs publics (Ministère de
l’Agriculture, Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique, Instituts
spécialisés...), s’articule principalement sur des approches complémentaires à savoir :
-2-
Introduction
l’arrêt ou plus ou moins le ralentissement de la maladie, la sélection de cultivars ou de
clones résistants au « Bayoud
» mais ayant une bonne rentabilité et qualité dattière et enfin la
multiplication par voie rapide du matériel végétal sélectionné par la culture in vitro et sa
diffusion (Bulit et al., 1967 ; Louvet et Toutain, 1973 ; Saaïdi, 1979 ; Djerbi, 1982 et 1991).
Si depuis plusieurs décennies, de nombreuses études, recherches ou expériences ont été
menées par des spécialistes, des chercheurs,..., en vue d’élucider les causes, les comportements
de l’agent pathogène, sa propagation,..., avec des résultats non négligeables, la solution radicale
n’est pas encore trouvée et donc le domaine de la recherche demeure toujours ouvert.
A la lumière de ces nombreuses études, recherches ou expériences et sur la base des
conclusions auxquelles elles ont débouché, nous avons jugé utile de poursuivre la recherche
dans une suite purement logique, aidés en cela par notre encadreur et certains de nos
Professeurs qui se sont intéressés à ce domaine – que nous remercions vivement – en vue
d’apporter une modeste contribution.
Ainsi nous avons opté pour le thème suivant : « Moyens de luttes chimique et biologique
contre le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis agent causal du Bayoud chez le palmier dattier
(Phœnix dactylifera L.) »
Notre étude est subdivisée en trois (03) parties :
La première partie revêt un caractère théorique en vue de familiariser le lecteur d’une
part, au palmier dattier, son cycle de développement, sa multiplication,..., et d’autre part
à l’agent pathogène, la maladie du « Bayoud
» et les moyens de lutte contre cette
maladie.
La seconde partie repose sur un travail pratique mené au laboratoire et qui s’intègre
dans le cadre des études consacrées à l’agent pathogène Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis, en vue d’évaluer un essai de moyens de lutte in vitro contre ce champignon
par quelques substances fongicides pour la lutte chimique et par l’agent antagoniste
(Trichoderma harzianum), pour la lutte biologique.
Dans la troisième partie, nous nous efforcerons de présenter les observations et les
conclusions obtenues au laboratoire.
-3-
Première Partie : Synthèse Bibliographique
Chapitre I :
Le palmier dattier
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
Le palmier dattier porte le nom latin «Phœnix dactylifera
» est aussi
«date palm
» en anglais et
«nakhil
» en arabe. Cette appellation botanique donnée par Linné depuis 1734, est
vraisemblablement dérivée du mot «Phœnix
», nom donné par les Grecs de l’antiquité à cet
arbre qu’ils considéraient comme l’arbre des phœniciens, ou phoinikes en grec. Quant à
«dactylifera
», cet adjectif dérive de
«daktylus
», qui signifie un doigt et illustre la forme du fruit
du palmier dattier, qu’est la datte (Zaïd, 2002).
1/ Distribution systématique :
Le palmier dattier comme son nom l’indique, appartient à l’une des plus grandes familles
d’angiospermes monocotylédones, celle des Palmaceae ou Arecaceae, représentée par 200
genres et 2700 espèces, répartie en six sous-familles. La sous-famille des Coryphoïdeae est elle
même subdivisée en trois tribus. Le palmier dattier fait partie de la tribu des Phœniceae qui ne
comporte qu’un seul genre : «Phœnix
» (Bounaga, 1991). Douze espèces appartiennent à ce
genre, mais cinq seulement d’entre elles, en dehors du palmier dattier, sont à fruits
consommables : P. atlantica, P. reclinata, P. farinifera, P. humilis et P. acoulis (Munier,
1973).
La classification du palmier dattier donnée par Djerbi (1994), est la suivante :
Groupe : Spadiciflora
Embranchement : Angiospermes
Classe : Monocotyledones
Ordre : Palmales
Famille : Palmaceae
Tribu : Phœniceae
Genre : Phœnix
Espèce : Phœnix dactylifera L.
-6-
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
2/ Description morphologique :
L’allure la plus commune et la plus connue du palmier dattier est arborescente
monocotylédone, avec un tronc ou stipe monopodique (non ramifié et unique), très élancé,
vertical et cylindrique de couleur brune, pouvant atteindre 30 à 40 mètre de haut et portant au
sommet une couronne de feuilles ou palmes, pennées de 4 à 7 mètres de longueur (Figure
n° 01). L’espèce est dioïque et porte des inflorescences mâles et femelles. Une seule fleur est
fécondée, se développe et forme le fruit : la datte (Hadjari et Kadi Hanifi, 2005).
2.1/ Le système radiculaire :
La partie souterraine du palmier dattier est formée d’un bulbe ou plateau racinaire,
volumineux, qui émerge en partie au dessus du niveau du sol, et à partir duquel, partent des
racines fasciculées, c'est-à-dire, disposées en faisceaux, peu ramifiées et n’ayant relativement
que peu de radicelles (Ouinten, 1996).
Le schéma (Figure n° 02) fait apparaître trois grands types de racines répartis en quatre
zones d’enracinement : les racines de respiration (Zone I), les racines de nutrition (Zone II) et
les racines d’absorption (Zone III et IV) :
- Zone I : se sont les racines respiratoires, de 0 à 20 cm et même jusqu’à 150 cm au-dessus du
sol. Comme leur nom l’indique, ces racines servent aux échanges gazeux pour le palmier
dattier.
- Zone II : se sont les racines de nutrition, allant de 20 à 100 cm et constituent la plus forte
proportion de racines du système. Elles sont obliques ou horizontales.
- Zone III : se sont les racines d’absorption, qui peuvent rejoindre le niveau phréatique à une
profondeur allant de 1 à 2 mètres. Leur fonction est de chercher l’eau.
- Zone IV : se sont les racines d’absorption en profondeur, caractérisées par un géotropisme
positif très accentué. La profondeur de ces racines dépasse les 15 mètres (Munier, 1973 ;
Djerbi, 1994 ; Peyron, 2000).
-7-
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
Figure n° 01 : Construction schématique d’un palmier dattier
(Munier, 1973; Peyron, 2000).
Figure n° 02 : Les quatre types de racines d’un palmier dattier (Peyron, 2000).
-8-
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
2.2/ Le système végétatif :
2.2.1/ Le tronc :
Appelé plus justement « stipe », il est cylindrique, c'est-à-dire d’un même diamètre de bas en
haut. Composé à l’intérieur par de nombreux faisceaux libéro-ligneux enchevêtrés entre eux, et
est engainé à l’extérieur -de manière visible-, par les bases pétiolaires qui restent collées après
la mort de la palme et qui assurent une protection au tronc. Leur présence permet de grimper
vers le sommet du palmier dattier.
Le tronc possède un seul bourgeon terminal appelé « phyllophore ou apex », qui assure la
croissance verticale du palmier dattier (Zaïd, 2002).
2.2.2/ La couronne :
On dénombre 50 à 200 palmes chez un palmier dattier adulte, l’ensemble des palmes vertes
forme la couronne ou frondaison, selon la décomposition suivante :
- La couronne basale, formée des palmes les plus âgées,
- La couronne centrale, formée des palmes en pleine activité (adultes),
- Les palmes du cœur, dont celles non encore ouvertes sont dites « en pinceau » (Peyron, 2000).
2.2.3/ Les palmes :
Les palmes sont des feuilles composées pennées qui s’incèrent sur le stipe en hélices très
rapprochées, formant ainsi plusieurs couronnes. Leurs bases forment le pétiole ou rachis, de
consistance ligneuse et de limbe épineux à la base, mais porte des folioles dans les deux tiers
supérieurs disposés régulièrement en position oblique le long du rachis (Figure n° 03) (Ouinten,
1996).
Figure n° 03 : Schéma d’une palme (Peyron, 2000).
-9-
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
2.2.4/ Les inflorescences :
* Les organes floraux :
Le palmier dattier est une plante dioïque, c'est-à-dire que les organes mâles et les organes
femelles sont portés par des pieds (individus) séparés ; palmiers mâles (dokkars) ou palmiers
femelles (nakhla). Seuls les dattiers femelles donnent les fruits.
Les inflorescences du palmier dattier, se développent parmi les feuilles et naissent de la
germination des bourgeons axillaires, situés à l’aisselle de celles-ci dans la région coronaire du
tronc (Figure n° 04). L’inflorescence est caractéristique, c’est une grappe d’épis, enveloppée et
protégée par une grande bractée membraneuse close de forme allongée, dite : spathe (Figure n°
05) (Peyron, 2000).
** Les fleurs :
Les fleurs monosexuées sur la plante dioïque, sont petites, de couleur blanchâtre, sensibles,
quasi sessiles, sans pédoncules, portées par des pédicelles ou épillets, qui sont à leur tour portés
par un axe charnu dit : hampe ou spadice (Figure n° 04).
Les fleurs mâles sont un peu plus allongées que les fleurs femelles (Figure n° 06 a et b).
Elles possèdent six étamines, qui à leur maturité, s’ouvrent et libèrent des grains de pollen.
Quant aux fleurs femelles, sont globulaires et ont un ovaire de trois carpelles indépendants
comportant chacun un ovule. Un seul ovule par fleur est fertilisé et peut mener au
développement des fruits, les deux autres disparaissent (Peyron, 2000).
2.2.5/ La fructification :
Les fruits, communément appelés « dattes », sont des baies oblongues ou ovoïdes parfois
même sphériques, de couleur jaune clair à brun plus ou moins foncé, longues jusqu’à 8 cm, leur
poids varie de quelques grammes à plus de 50 g, contenant une pulpe sucrée et une seule
graine, lisse, de consistance ligneuse, avec un sillon ventral et un embryon dorsal
(Figure n° 07) (Peyron, 2000).
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Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
Figure n° 07 : Fruit et graine du palmier dattier (Peyron, 2000).
Figure n° 06 (a) : Une fleur femelle
(Peyron, 2000).
Figure n° 06 (b) : Une fleur mâle
(Peyron, 2000).
hampe ou spadice
Figure n° 04 : Une inflorescence du
Palmier dattier (Peyron, 2000).
Figure n° 05 : Spathe mâle et spathe femelle
(Peyron, 2000).
Hampe ou spadice
-11-
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
3/ Cycle végétatif ou cycle de développement :
Le palmier dattier ou le genre Phœnix, est unique dans sa morphologie et dans son
développement, puisque cinq phases sont possibles à distinguer durant la croissance d’un
palmier dattier. Ces dernières sont séparées sur la base de critères morphologiques, alors
qu’elles ne sont en réalité que des périodes physiologiques :
- Stade I : La graine
Elle possède un albumen (endosperme) dur et corné, dont l’embryon est toujours très petit par
rapport à l’albumen (2 à 3 mm).
- Stade II : Phase germinative
A ce stade, la plantule ou la germination vit sur les réserves de l’albumen. La première feuille
est linéaire et lancéolée, cette forme est l’une des caractéristiques du genre Phœnix.
- Stade III : Construction de la plantule
Cette phase « post germinative » est la plus importante dans le cycle d’un palmier dattier, car
elle aboutit à la formation de l’axe primaire. La plante devient autotrophe et son système
vasculaire commence à se construire. On peut l’appeler aussi « phase d’établissement »,
puisqu’une série de feuilles à limbe para-penné puis penné s’incèrent d’une manière spiralée.
- Stade IV : Phase adulte végétative
Durant cette phase qui peut durer 3 à 8 ans, le palmier dattier construit son tronc, produit des
feuilles et accumule des réserves. Le tronc couvert par les bases pétiolaires des feuilles
anciennes mortes et/ou coupées, peut atteindre 20 à 30 m de haut et environ 1 m de diamètre.
- Stade V : Phase adulte reproductive
Entre la 5éme
et la 8éme
année voir même la 10éme
, le palmier dattier commence à produire des
inflorescences. Ce n’est qu’à ce stade qu’on peut reconnaître le sexe, qu’il soit un palmier mâle
ou femelle (Riedacker, 1990 ; Bounaga 1991).
-12-
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
4/ Ecologie du palmier dattier :
Le palmier dattier est cultivé comme arbre fruitier dans les régions arides et semi arides du
globe, caractérisées par des étés longs et chauds et un très bas niveau d’humidité relative
(Peyron, 2000). Cet arbre peut s’adapter à de nombreuses conditions, grâce à sa grande
variabilité. Différents facteurs climatiques (température, humidité, lumière, pluies et vent..) et
même édaphiques, sont très importants pour pouvoir déterminer la convenance d’un
emplacement spécifique pour la culture d’un palmier dattier (Zaïd, 2002). Pour cela, et pour
donner une production normale, un palmier dattier doit bénéficier des paramètres suivants :
1. d’un climat chaud, sec et ensoleillé :
Le point 0 de la végétation est estimé à + 10° C, entre 10° et 40° C, le palmier dattier est en
activité végétative, mais le maximum de cette dernière s’observe pour des températures
comprises entre 32° et 38° C. La haute limite de végétation est de + 45° C. Toutefois, à 65° C
le palmier dattier ne semble pas souffrir, s’il est correctement irrigué (CIRAD et GRET, 2002).
Les pluies ont une action néfaste, surtout lorsqu’elles sont violentes. Elles peuvent entrainer
le pollen, abaisser les températures et favoriser les maladies cryptogamiques. Quant aux vents,
ils ont une action mécanique et desséchante. Ils peuvent provoquer la chute des fruits, la
cassure des hampes des inflorescences et la propagation de quelques prédateurs du palmier
dattier.
Le palmier dattier est une espèce héliophile, c'est-à-dire, qui aime le soleil et la disposition
des folioles sur les palmes favorise la photosynthèse (Peyron, 2000).
2. d’une alimentation en eau suffisante :
Le choix des zones de plantation dépend strictement des ressources hydriques (nappes
phréatiques) et des possibilités de les utiliser (Peyron, 2000).
3. d’un sol neutre, profond, bien drainé, assez riche ou susceptible d’être fertilisé :
Le palmier dattier préfère les sols légers, il y croit plus rapidement qu’en sols lourds et
atteint un développement maximal, en diamètre du tronc et en nombre de palmes (Peyron,
2000 ; CIRAD et GRET, 2002). Pour cela, le palmier dattier est la végétation caractéristique
des oasis (Zaïd, 2002).
-13-
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
5/ Multiplication du palmier dattier :
Trois méthodes de multiplication peuvent être utilisées, pour mettre en place de nouvelles
surfaces de phœniciculture ou pour l’extension des palmeraies.
5.1/ Multiplication par semis (par graine) :
La reproduction par graine est longue, généralement utilisée lorsqu’il y a absence des rejets.
Elle ne permet pas de contrôler le sexe du palmier dattier et ne permet d’obtenir des pieds
productifs qu’au bout d’une dizaine d’années. Elle est donc une technique consommatrice de
temps pour des résultats incertains (Ben Abdallah, 1990).
5.2/ Multiplication par rejets :
Cette méthode de multiplication permet de conserver les caractéristiques du pied mère et de
ses fruits. Les rejets sont prélevés de la base du tronc (lorsqu’ils atteignent un poids de 12
à 25 kg), à l’aide d’un outil tranchant, en effectuant une coupe au niveau de la zone de liaison.
Cette séparation du rejet de son pied mère est une opération qui conditionne sa reprise.
Cette technique de multiplication est donc considérée comme la plus stable et la plus
efficace par les phœniciculteurs (CIRAD et GRET, 2002).
5.3/ Multiplication in-vitro :
Deux méthodes de micropropagation du palmier dattier sont connues :
- Voie de l’organogénèse, repose sur la capacité de bourgeonnement des bourgeons axillaires,
avec un cycle de 4 phases : l’initiation de tissus organogènes, la multiplication ou le
bourgeonnement, l’élongation, l’enracinement et l’acclimatation (Poulin et al., 1979 ; Drira,
1981 ; Anonymous, 1989 ; Djerbi, 1991).
- Voie de l’embryogénèse somatique, qui présente deux phases : la formation de la cal
embryogène, la régénération et la germination des embryons (Daikh et Demarly, 1987 ;
Letouze et Daguin, 1988 ; Djerbi, 1991).
-14-
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
6/ Répartition géographique du palmier dattier :
6.1/ Dans le monde :
L’aire de répartition du palmier dattier dans le monde, couvre les cinq continents. La culture
du palmier dattier s’étend depuis le sud de l’Iran à l’Est, jusqu’à la côte Atlantique de l’Afrique
du Nord à l’Ouest. Cette culture est concentrée dans les régions arides et semi arides du
continent Africain, où le palmier dattier forme la végétation caractéristique des oasis.
Les limites extrêmes de la distribution géographique sont entre les altitudes 10° Nord
(Somalie) et 39° Nord (Elche en Espagne ou Tukmenistan). Les secteurs les plus favorables
pour cette culture sont situés entre 24° et 34° Nord (Maroc, Algérie, Tunisie, Libye, Egypte,
Irak, Iran, Arabie Saoudite, Soudan, ...). Le palmier dattier se trouve aussi aux Etats-Unis entre
33° et 35° Nord, d’autres surfaces négligeables pour la culture du palmier dattier sont à
l’hémisphère sud (Australie, Mexique, Argentine, ...) (Ben Abdellah, 1990 ; Zaïd, 2002).
6.2/ En Algérie :
Quant à la répartition en Algérie, la culture du palmier dattier occupe toutes les régions
situées sous l’Atlas saharien, soit 6000 ha depuis la frontière Marocaine à l’Ouest, jusqu’à la
frontière Tuniso-libyenne à l’Est.
Du nord au sud du pays, la culture du palmier dattier, s’étend depuis la limite sud de l’Atlas
saharien jusqu’à Regghane à l’Ouest, Tamanrasset au centre et Djanet à l’Est (Matallah, 2003).
7/ Importance économique du palmier dattier :
7.1/ Production dans le monde :
Le palmier dattier fait l’objet d’une exploitation intense en Afrique du Nord, au Moyen
Orient et aux U.S.A. Deux groupes de pays sont à distinguer :
- Les pays grands exportateurs ;
- Les pays principalement consommateurs.
La production mondiale des dattes est estimée à 5.087.000 tonnes pour l’année 2005, dont
41 % soit 2.074.000 tonnes, proviennent du bassin méditerranéen dont : L’Egypte, 1er
pays
producteur avec 23% et l’Algérie classée au 4ème
rang mondial avec 10 %.
-15-
Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier
L’Algérie est devancée par l’Iran 20% et l’Arabie Saoudite 19%.
Le tableau n° 01 nous renseigne sur le détail de cette production mondiale, selon les
statistiques de la F.A.O. publiés en 2007.
Tableau n° 01 : Production mondiale des dattes (statistiques de la F.A.O., 2007).
Pays Quantité de production
(1000 tonnes) (%)
Monde 5 087 100%
Méditerranée 2 075 41%
Egypte 1 170 23%
Iran 997 20%
Arabie Saoudite 970 19%
Algérie 516 10%
Pakistan 497 10%
Soudan 328 6%
Libye 181 4%
Chine 130 3%
Tunisie 125 2%
Maroc 48 1%
7.2/ Production en Algérie :
Le patrimoine phœnicicole Algérien estimé en 1996 à plus de 10 Millions de palmiers
dattiers, se caractérise par une diversité exceptionnelle aussi bien dans les variétés que les
techniques utilisées. Malheureusement, ces palmiers se trouvent aujourd’hui menacés de
disparition.
Les principales régions productrices sont celles de l’Est, avec principalement les palmeraies
de Oued Righ et des Ziban, de Oued Souf, de la cuvette de Ouargla et du M’zab. A l’Ouest, ce
sont les palmeraies de l’Oued Saoura, du Touat, du Gourara et du Tidikelt (Matallah, 2003).
C’est dans ces régions, que les meilleures variétés de dattes sont produites telle que, Deglet
Nour, souvent exportée et qui constitue ainsi, une source non négligeable de devises pour le
pays, ainsi que d’autres variétés commerciales telles que : Ghars, Mech Degla et Degla Baïda,
..., etc (Ouinten, 1996).
-16-
Chapitre II :
L’agent pathogène
Synthèse Bibliographique Chapitre II : L’agent Pathogène
1/ Historique de la taxonomie :
1.1/ Le genre Fusarium :
Le genre Fusarium a été décrit pour la première fois par Link en 1809 (in Booth, 1985). La
détermination des Fusarium, comme celle des autres champignons imparfaits été basée
essentiellement, et jusqu’à ce jour, sur les critères morphologiques (pigmentation, aspect du
mycélium, présence ou absence des spores, taille, forme, nombre de cloisons, ...).
La diversité et l’extrême variabilité de ces caractères au cours des repiquages successifs et
en fonction des conditions de culture des champignons appartenant à ce genre, expliquent les
difficultés rencontrées pour la classification, d’où les nombreux systèmes taxonomiques et les
controverses proposés. Les travaux de Wollenweber et Rincking (1935), qui ont servi de
références, ont pu décrire 65 espèces, 55 variétés et 22 formes, rassemblées en 16 sections et 06
sous-sections (Synder et Hansen, 1940).
Le genre Fusarium a été profondément revu par Synder et Hansen (1940, 1941, 1945),
Tousson et Nelson (1968, 1975) et Messiaen et Cassini (1968, 1981).
Ils ont simplifié la classification pour ne retenir que 09 espèces, dans le but de permettre une
détermination rapide des parasites rencontrés (Bounaga, 1991).
D’autres systèmes taxonomiques proposés, s’appuyant sur les travaux de Wollenweber, ont
été suggérés, notamment par Raillo (1935), Bilai (1955, 1970), Gordon (1952, 1960, 1965),
Booth (1971, 1975, 1981), Joffe (1974) et Gerlach (1970, 1977, 1981), et ils ont conservé un
certain nombre de section et d’espèces avec quelques modifications (Bounaga, 1991).
1.2/ L’espèce oxysporum :
Wollenweber et Rincking (1935) ont placé l’espèce oxysporum dans la section « Elegans
»,
qu’ils ont subdivisé en 03 sous-sections, en se basant sur la forme et la taille des spores et sur
les caractères culturaux.
Dès 1940, toutes les espèces de la section « Elegans
» sont rassemblées dans une seule
espèce Fusarium oxysporum, par Synder et Hansen, à laquelle, Synder et al., adjoignent le
cultivar « Redolens
» en 1957.
-18-
Synthèse Bibliographique Chapitre II : L’agent Pathogène
Dans le genre Fusarium, l’espèce oxysporum, constitue 50% à 70% des populations
« fusariennes
» des sols (Guillemat et Montegut, 1958; Gorden1965 ; M.C. Mullen et Stack,
1983). Elle est considérée comme colonisatrice primaire du rhizoplan et du cortex racinaire.
Elle représente plus de 50 % des isolats de Fusarium à partir des racines de plantes diverses
(Bruel, 1976 ; MC Mullen et Stack, 1983 ; in Bounaga, 1991).
L’espèce oxysporum, peut vivre en saprophyte ou en parasites de vertébrés ou de plantes
(Nelson et al., 1981 ; Rebell, 1981, in Bounaga, 1991). Sa forme parfaite n’est pas encore
connue.
1.3/ La forme spéciale albedinis :
L’espèce est actuellement subdivisée en plus de 80 formes spéciales (Armestrong G. et
Armestrong J., 1981), suivant la plante hôte à laquelle elle s’attaque et dont elle est isolée. La
reconnaissance de ces formes spéciales, ne fait appel à aucun critère morphologique mais
seulement à la pathogénicité du champignon, dont la détermination doit se faire par la
réinoculation du pathogène dans la plante hôte (Bounaga, 1991).
Ces formes spéciales peuvent être subdivisées en races, basées sur la pathogénicité
différentielle des isolats sur des variétés distinctes. Mais par contre, certaines formes spéciales
ont été rassemblées, car elles étaient susceptibles de provoquer la même maladie dans plusieurs
hôtes (Armestrong G. et Armestrong J., 1981). Le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis est la
forme spéciale du palmier dattier (Bounaga, 1991).
2/ Position systématique :
Le système Saccardo de la classification des champignons imparfaits
« Fungi imperfecti
»
(Henni, 1998), classe le Fusarium comme suit :
Embrancement des Thallophytes,
Classe des Deutéromycètes,
Ordre des Moniliales,
Famille des Tuberculariacées,
Genre Fusarium
espèce oxysporum
-19-
Synthèse Bibliographique Chapitre II : L’agent Pathogène
3/ L’agent pathogène : Fusarium oxysporum f.sp. albedinis
Le champignon imparfait Fusarium oxysporum f.sp. albedinis est un parasite vasculaire,
isolé pour la première fois d’un palmier dattier infecté en 1921 et identifié en 1934 par
Malençon comme étant un Fusarium oxysporum. Les souches isolées du palmier dattier, n’ont
infecté que cette plante, elles constituent ce que l’on appelle la forme spéciale albedinis.
Il existe d’autres plantes telles que la luzerne (Medicago sativa L.) et le henné (Lawsonia
inermis L.), qui sont cultivées en association avec le palmier dattier et qui peuvent héberger le
Fusarium oxysporum f.sp. albedinis dans leurs racines, mais sans manifester aucun symptôme
externe de la fusariose vasculaire, se sont donc des « porteurs sains » du Fusarium oxysporum
f.sp. albedinis (Djerbi et al., 1985).
L’agent pathogène (Fusarium oxysporum f.sp. albedinis), peut être isolé d’un palmier dattier
infecté, à partir des rachis de palmes présentant les symptômes typiques du «Bayoud», en
déposant, dans des conditions aseptiques, des petits fragments sur un milieu de culture à base
de Pomme de terre ou sur un milieu sélectif (milieu Komada). Le Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis peut aussi être isolé à partir de stipe ou de racine mais jamais de fruits (Malençon,
1950 ; Bulit et al., 1967 ; Ouinten, 1996).
4/ Description morphologique :
4.1/ Caractères macroscopiques :
L’aspect sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis est caractérisé par un tapis
mycélien fin frisé, de couleur rose saumon à la lumière et blanc ou violet à l’obscurité, au sein
du quel se forme de petites sporodochies (Figure n° 08).
L’aspect ou la forme sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis permet d’identifier
l’agent causal du «Bayoud» sans recours aux tests de virulence (Djerbi et al., 1984 ; Sedra et
Djerbi, 1984). Des sclérotes de couleur bleue à noire naissent parfois groupées et mesurent de 1
à 3 mm de diamètre (Djerbi, 1988).
-20-
Figure n° 08 : Aspect sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
-21-
Synthèse Bibliographique Chapitre II : L’agent Pathogène
4.2/ Caractères microscopiques :
Le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis possède un mycélium hyalin cloisonné, il est fin et
régulier en culture jeune. Ce mycélium présente des cellules hypertrophiées en chaine, d’aspect
globuleux en cultures âgées ayant une grande ressemblance avec les chlamydospores, mais sans
épaississement de la paroi.
La multiplication asexuée se réalise par des microphialides et des marophialides qui
produisent respectivement des microconidies et des macroconidies.
- Les microconidies : sont très nombreuses, hyalines de forme et de dimension variables dans
une même culture (3-15 x 3-5 µm). En culture jeune elles sont globuleuses, par contre en
culture âgées, elles sont plus allongées. Les microconidies sont souvent unicellulaires, parfois
bicellulaires et possèdent deux cloisons.
- Les macroconidies : sont peu nombreuses, à base pédiforme, et une extrémité pointue et
courte. Elles possèdent trois cloisons, rarement 4 ou 5 et mesurent (20-35 x 3-5 µm).
- Les chlamydospores : dans les cultures âgées ou dans le sol, le Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis forme des chlamydospores, régulières, soit globuleuses, à paroi lisse et épaisse, et
leur taille varie de 6 à 20 µm. Elles sont intercalaires ou terminales et sont isolées ou groupées
par 2. Elles se forment soit sur le mycélium, soit à partir des macroconidies (Bulletin OEPP/
EPPO, 2003).
Figure n° 09 : Macroconidies et microconidies de Fusarium oxysporum
(Leslie et Summerell, 2006).
-22-
a b c
a : macroconidies b : microconidies c : monophialide portant les microconidies en
fausses têtes échelle = 50 µm
Chapitre III :
La maladie du « Bayoud »
Synthèse Bibliographique Chapitre III : La Maladie du Bayoud
Le palmier dattier, comme toute autre espèce végétale, se trouve sous la menace de diverses
pathologies dues à des ravageurs (insectes ou acariens) ou à des parasites (champignons,
bactéries, ou mycoplasmes). A titre d’exemple, on peut citer :
La maladie du « Boufaroua
», due à un acarien, Oligonychus afrasiticus ;
La maladie du « Djereb
», due à la cochenille blanche, Parlatoria blanchardi ;
La pourriture de l’inflorescence ou « Khamedj
», causée par le champignon imparfait,
Mauginiella scaetae.
La fusariose vasculaire appelée « Bayoud » due au champignon imparfait appartenant à
l’espèce Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
D’autres maladies telles que la pourriture du bourgeon, la maladie du « cœur qui
penche », ..., sont causées par d’autres espèces de champignons (Bounaga et Djerbi,
1990).
Si certaines de ces maladies, peuvent se manifester pour une période ou une saison donnée
et, par la suite, constituer l’infection dont les dégâts sont réversibles, en revanche, et
malheureusement, la fusariose vasculaire appelée «Bayoud» représente la maladie la plus grave
et la plus dévastatrice qui provoque un dépérissement irréversible du palmier dattier et, par
conséquent, des dégâts considérables et définitifs (Ouinten, 1996). Ainsi le patrimoine du
palmier dattier des régions phœnicicoles de l’Afrique du Nord, est attaqué depuis plusieurs
décennies, et continue à l’être toujours, particulièrement au Maroc et en Algérie (El Hadrami et
al., 2005).
1/ Historique et progression de la maladie :
C’est vraiment difficile d’établir exactement la date, le lieu et les conditions dans lesquelles
est apparue la maladie du «Bayoud». Cependant, plusieurs auteurs, s’accordent sur l’origine
Marocaine de la maladie (pays endémique), où elle a été observée pour la première fois dans la
Vallée du Drâa, au nord du Zagora avant 1870. A cette époque, toutes les palmeraies qui
bordaient l’Oued du Drâa ont été ravagées (Malençon, 1934 ; Perreau Leroy, 1958 ; Toutain,
1965 ; Bulit et al., 1967 ; Djerbi, 1982).
Depuis lors, Le «Bayoud» progresse vers l’Ouest et atteint Foum El Hasan en 1960. Dès
1898, la maladie atteint les palmeraies de Figuig au Maroc et de Béni Ouenif en Algérie, puis
-24-
Synthèse Bibliographique Chapitre III : La Maladie du Bayoud
Béchar en 1940, par la localisation de quelques foyers. Les palmeraies proches de ces
centres sont atteintes à leur tour tel que Béni Abbès en 1908 et Taghit en 1923 (Figure n° 10).
Entre 1940 et 1950, deux contaminations sont particulièrement importantes, la région d’In
Salah et celle d’Adrar, respectivement vers 1943 et 1950 (Brac De La Perriere et Benkhalifa,
1991).
Bien que le «Bayoud» a enregistré une progression de proche en proche vers l’Ouest, de la
Vallée du Drâa au Maroc jusqu’à Béni Ouenif en Algérie ; il effectue au Sahara central de
l’Algérie, des bonds désordonnés, de régions en régions, malgré qu’elles soient très éloignées
géographiquement à savoir :
- 700 km en 04 ans entre Béni Ouenif et Fouggarat El Arab,
- 300 km en 12 ans entre Béchar et Fatis,
- 700 km en 08 ans entre In salah et Metlili (Toutain, 1965).
Enfin, et plus récemment, les palmeraies de Ghardaïa et d’El Goléa, sont contaminées à leur
tour en 1965 et 1978 (Djerbi, 1982 ; Brac De La Perriere et Benkhalifa, 1991). Parallèlement,
certaines palmeraies algériennes sont indemnes, notamment les palmeraies de Kerzaz, de
Timimoun et de la Station de Recherche de l’I.N.R.A. d’Adrar (Brac De La Perriere et
Benkhalifa, 1991).
Figure n° 10 : Situation épidémiologique du « Bayoud » du palmier dattier
(Fernandez et al., 1995).
-25-
Synthèse Bibliographique Chapitre III : La Maladie du Bayoud
2/ Symptômes de la maladie :
2.1/ Symptômes externes :
En général, les premiers signes de la maladie se manifestent par un dépérissement
progressif, de la base vers l’extrémité, d’une ou de plusieurs palmes au niveau de la couronne
moyenne. Les folioles ou les épines situés sur le même côté de la palme se dessèchent et se
replient contre la nervure principale (rachis), c’est l’attaque hémiplégique typique de la
fusariose. Lorsque tout ce côté est atteint, le dépérissement commence sur l’autre côté, de
l’extrémité jusqu’à la base (Bulletin OEPP/ EPPO, 2003).
En se desséchant, la palme fini par mourir et prend l’aspect d’une plume mouillée (Figure
n° 11), avec une couleur blanchâtre, d’où le nom du «Bayoud», qui dérive du mot arabe
« abyed » et qui veut dire blanc (Djerbi, 1990 ; Ouinten, 1996).
L’évolution du desséchement sur les folioles s’accompagne par l’apparition d’une rayure
brune longitudinale sur le rachis. Depuis, l’attaque se généralise sur la totalité des palmes du
bourgeon terminal, entraînant ainsi la mort de l’arbre.
Le palmier dattier atteint, meurt 06 mois à 12 ans, après l’attaque par le Fusarium
oxysporum f.sp. albedinis et l’apparition des premiers symptômes de la maladie (Bulletin
OEPP/ EPPO, 2003).
Figure n° 11 : Symptômes de la maladie du « Bayoud ».
-26-
Synthèse Bibliographique Chapitre III : La Maladie du Bayoud
2.2/ Symptômes internes :
Le déracinement d’un palmier dattier malade permet d’observer un nombre réduit de racines
malades rougeâtres, elles représentent la porte pour la pénétration du champignon. De plus, des
coupes transversales au niveau du tronc, mettent en évidence une coloration brune rougeâtre
des vaisseaux conducteurs, témoignant le passage du champignon le long du stipe (OEPP,
1994).
3/ Pénétration dans le palmier dattier et progression du champignon :
La pénétration du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis se fait au niveau du système
racinaire, à travers les tissus très jeunes des radicelles proches de la coiffe ou bien à travers des
ouvertures provoquées par diverses causes biologiques ou mécaniques (Malençon, 1950).
Le champignon traverse les parenchymes par voie inter puis intra cellulaire jusqu’à
atteindre le cylindre central. Une fois arrivé dans les vaisseaux conducteurs du palmier dattier,
le champignon s’installe et la progression est ascendante.
Par la suite, le champignon fructifie et libère des conidies qui sont entraînées par la sève
montante. Arrivées et bloquées par les cloisons transversales des vaisseaux, les conidies sont
arrêtées, elles germent et donnent naissance à des filaments mycéliens qui traversent la cloison.
Le mycélium poursuit son développement et forme de nouvelles microconidies ; ce phénomène
se poursuit jusqu’au sommet du palmier dattier entrainant ainsi sa mort (OEPP, 1994).
4/ Epidémiologie :
Le champignon est distribué inégalement dans le sol, présent entre 0 et 30 cm parfois
jusqu’à plus de 1m de profondeur (Tantaoui, 1989). Il peut être alternativement saprophyte ou
parasite (Bounaga, 1985). Il peut aussi se conserver pendant plusieurs années sous forme de
chlamydospores, dans le sol, en absence de la plante hôte ou dans les tissus d’un palmier dattier
infecté (Louvet, 1977).
La contamination s’effectue d’une manière régulière par le contact entre les racines malades
et les racines saines entre les palmiers dattiers, ainsi, l’irrigation importante favorise
l’expansion de la maladie.
-27-
Synthèse Bibliographique Chapitre III : La Maladie du Bayoud
Les plantes des autres cultures, associées à la phoeniciculture, dont on a déjà parlé, et qui
sont des « porteurs sains », peuvent contribuer au maintien du Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis dans le sol.
La propagation de la maladie du « Bayoud » entre les palmeraies contaminées et celles
indemnes, peut être assurée par la dispersion des conidies (Laville, 1973), principalement par
l’échange du matériel végétal (rejets), du sol, d’outils ou de machines agricoles, ..., etc
(Bulletin OEPP/ EPPO, 2003). L’étendue de cette dispersion dépend aussi des pratiques
culturales (fertilisation, irrigation,...) et des conditions climatiques (température, vent,...)
(OEPP, 1994).
5/ Moyens de luttes contre la maladie du « Bayoud » :
5.1/ Les mesures prophylactiques :
Afin d’éviter ou de retarder la dissémination du « Bayoud » dans les régions indemnes, les
mesures prophylactiques constituent un des moyens de luttes préventifs contre cette
trachéomycose, grâce à la sensibilisation et l’aide des phoeniciculteurs, d’une part, pour mieux
connaître la maladie, l’aire de sa répartition, sa progression et sa surveillance et d’autres parts,
pour veiller à n’utiliser que des rejets sains pour la plantation et d’interdire les échanges de
matériel végétal entre les palmeraies.
5.2/ Les techniques culturales :
Les techniques culturales contre les fusarioses vasculaires, consistent à éviter les conditions
favorisant la croissance de l’agent pathogène. La maladie est moins présente en conditions
d’irrigation réduites, ainsi que dans les sols à pH alcalin, riches en calcium et potassium,
pauvres en phosphore et magnésium et dont l’azote est sous forme nitrique plutôt
qu’ammoniacal (Woltz et Johnes, 1981 ; Ollaguier et Renard, 1976).
Dans les parcelles contaminées, il faut éviter les cultures du henné et de la luzerne qui
nécessitent une irrigation abondante favorable à la maladie, et qui sont des porteurs sains de
l’agent pathogène, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis (Bulit et al., 1967).
En outre, le contact souterrain entre les arbres voisins doit être évité, par l’application des
méthodes modernes d’irrigation et de plantation des palmiers dattiers (Louvet, 1991).
-28-
Synthèse Bibliographique Chapitre III : La Maladie du Bayoud
5.3/ La lutte chimique :
La lutte chimique repose sur l’utilisation de nombreux produits phytosanitaires qui sont soit
thérapeutiques, appelés systémiques, soit protecteurs, appelés préventifs (Roger, 1990).
La désinfection du sol est très couteuse et difficile, ainsi, la lutte chimique n’est
envisageable qu’à la découverte du foyer primaire (point de départ d’une nouvelle infection
dans une région saine). Dans ce cas, le traitement du sol peut être effectué par l’utilisation du
bromure de méthyle (Frederix et Den Brader, 1989).
Différents autres fongicides couramment utilisés en agriculture ont été testés (Saaidi et
Rodet, 1974 ; Vanachter, 1991 ; Frederiks et Dembreber, 1991), tels que :
Le bénomyl et le méthylthophanate, qui inhibent la croissance mycélienne in vitro à des
doses de 10 et 100 ppm respectivement (Saaidi et Rodet, 1974).
La chloropicrine, qui est une substance chimique hautement volatile avec une activité
antifongique très élevée, mais qui présente l’inconvénient de ne pénétrer que faiblement
dans les débris végétaux. Contrairement au bromure de méthyle, qui présente une
grande capacité de pénétrer dans le sol grâce à sa tension de vapeur élevée, mais avec
une fongitoxicité relativement moins élevée (Cheikh-Aïssa, 1990 ; Vanachter, 1991).
Cependant, si l’application de ces fongicides a donné des résultats encourageants pour la
lutte contre ce pathogène (Fusarium oxysporum f.sp. albedinis), l’utilisation répétée de ces
produits de synthèse entraine souvent la pollution de l’environnement et l’apparition chez le
parasite de nouvelles souches résistantes et plus virulentes (Ozbaz et Newman, 2004). De plus,
leurs effets toxiques sont souvent signalés pour l’homme et l’animal (Messiaen et Lafon, 1970)
et pour le déséquilibre biologique du sol.
5.4/ La lutte biologique :
Une autre alternative pour protéger les plantes contre les agents pathogènes est l’application
des méthodes de biocontrôle (Azco’ n-Aguilar et Bare, 1997), par l’utilisation de différents
micro-organismes doués d’activité antagoniste, conduisant à des phénomènes d’antibiose et
d’hyperparasitisme.
-29-
Synthèse Bibliographique Chapitre III : La Maladie du Bayoud
Plusieurs chercheurs se sont intéressés aux micro-organismes antagonistes tels que les
bactéries, les champignons et les actinomycètes, dans l’espoir de mettre au point un procédé de
lutte efficace capable de limiter la gravité des fusarioses (Alabouvette et al., 1986).
Parmi les bactéries utilisées en lutte biologique, on peut citer les Pseudomonas fluorescens
et Serratia marcescens, et parmi mes champignons, il existe les Fusarium non pathogènes et le
Trichoderma harzianum.
Amir (1991 a) et Amir et Mahdi (1993), ont sélectionné des souches de Fusarium solani et
Fusarium oxysporum non pathogène, pour leur pouvoir compétitif élevé et inhibiteur de deux
formes spéciales : Fusarium oxysporum f.sp. lini et Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
Hibar et ses collaborateurs (2005), ont montré qu’il est d’intérêt primordial d’utiliser le
Trichoderma harzianum en tant qu’agent de lutte biologique contre la fusariose vasculaire.
5.5/ La lutte génétique :
Le palmier dattier a l’avantage de présenter une grande diversité génétique de résistance au
Bayoud (Bounaga et al., 1992).
Cette diversité génétique de chaque palmeraie qui est le fruit de sélections autonomes et
d’échanges entre les agriculteurs, a servi dans la plupart des cas à luter directement contre la
fusariose par la multiplication empirique des clones les plus tolérants (Brac de la Perriere et
Bounaga, 1990). Ceci est mis en évidence, pendant 25 ans, après les essais de comparaison de
résistance de 32 variétés au Bayoud, dans les palmeraies infestées naturellement au Maroc.
Selon Saaïdi (1992), ces cultivars résistants sont devenus susceptibles après 15 ans.
L’expression de ce type de résistance est influencée par les conditions de développement des
arbres et probablement par l’abondance et l’activité de l’inoculum de Fusarium pathogène dans
le sol (Louvet, 1991).
5.6/ La lutte intégrée :
Amir (1991 b), propose également une lutte intégrée contre Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis comprenant l’éradication par fumigation et inoculation avec des antagonistes des
foyers primaires dangereux, création de variétés résistantes nouvelles par croisement, recherche
de mutants résistants à partir des cultures in vitro, création des pépinières et repeuplement des
palmeraies dévastées grâce à la multiplication in vitro de plants
-30-
Synthèse Bibliographique Chapitre III : La Maladie du Bayoud
éventuellement inoculés en antagonistes ; éradication par dessèchement et ressalement naturel
du sol et l’introduction de la lutte prophylactique et culturale.
Ces méthodes sont complémentaires et prennent en compte la prévention, l’éradication des
foyers et le repeuplement des zones dévastées.
-31-
Deuxième Partie : Matériels et Méthodes
Chapitre I :
Etude du parasite et de la plante hôte
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
I/ Le parasite et sa culture :
1.1/ Espèce étudiée :
Notre étude est basée essentiellement sur le champignon phytopathogène Fusarium
oxysporum f.sp. albedinis (F.o.a), l’agent causal de la fusariose vasculaire. Cette maladie
connue sous le nom du « Bayoud
», chez le palmier dattier, menace la majorité des palmeraies
algériennes.
1.2/ Echantillonnage et isolement des souches de F.o.a. :
Nous avons isolé une vingtaine de souches de Fusarium. La liste complète est fournie dans
le Tableau n° 02 avec la date et le lieu d’échantillonnage ainsi que la partie d’isolement dont
elles proviennent.
Toutes les souches isolées ont fait l’objet de la culture monospore. Les cinq souches de
F.o.a. isolées du rachis (F1-F4-F7-F8- et F13) et l’une isolée du sol (F12’), ont été utilisées
pour le test du pouvoir pathogène, pour le dosage des protéines totales et pour l’étude du
polymorphisme isoenzymatique. Pour les essais d’antagonisme (lutte biologique), seules les
cinq souches isolées du rachis ont été utilisées.
1.3/ Techniques d’isolement de F.o.a. :
1.3.1/ Isolement à partir des rachis infectés :
Le rachis des palmes infectées, présentant les symptômes typiques du « Bayoud
»
(Figure n° 12), est débarrassé des tissus externes, coupé d’une façon transversale puis découpé
en petits fragments. Ces derniers sont trompés dans une solution d’Hypochlorite de Sodium
diluée à 2% pendant 03 minutes, pour une désinfection superficielle ensuite rincés avec trois
bains successifs d’eau distillée stérile.
Les petits fragments sont déposés (la face sectionnée), dans des boites de Pétri
(Figure n° 13) contenant le milieu PDA (Annexe n° 01). Les boites sont mises à incuber dans
une chambre de culture, à une température de 22 °C, sous une photopériode de 12 heures.
-34-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
Tableau n° 02 : Sites d’échantillonnages et souches isolées de F.o.a..
Date
d’échantillonnage
Référence
de la souche Site de prélèvement Wilaya
Partie
d’isolement
11-03-2008 F 1
F 1’ El Mahdia Adrar
Rachis
Rhizosphère
18-03-2008 F 2’ Aoughrout (Timimoun) Adrar Rhizosphère
02-04-2008 F 3’ Laksour (Timimoun) Adrar Rhizosphère
26, 27 -03-2008
F 4
F 4’ Igli A2 Béchar
Rachis
Rhizosphère
F 5’ Igli A3 Béchar Rhizosphère
F 6 Igli A4 Béchar Rachis
F 7 Igli A5 Béchar Rachis
F 8
F 8’
F 8’’
Igli B Béchar Rachis
Rhizosphère
F 9’ Béni Abbes -1- Béchar Rhizosphère
F 10’ Béni Abbes -2- Béchar Rhizosphère
F 11’ Béni Abbes -3- Béchar Rhizosphère
10-04-2008 F 12’
Taghit Béchar Rhizosphère F 12’’
21-05-2008 F 13 Ksar Ouled Aissa
(Timimoun) Adrar Rachis
03-07-2008 F 14’ Maït (Taghit) Béchar Rhizosphère
03-06-2008 F 15 Ghardaïa Rachis
-35-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
Figure n° 12 : Symptôme unilatéral du « Bayoud
» sur une palme infectée.
Figure n° 13 : Isolement du champignon à partir de rachis infecté sur milieu PDA.
-36-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
1.3.2/ Isolement à partir de la rhizosphère :
L’échantillon du sol rhizosphérique est bien tamisé et sécher dans une étuve réglée à 70 °C
pendant 03 jours, et pour l’isolement d’un Fusarium, on procède de deux manières:
saupoudrer directement quelques graines de sol à la surface d’une boite de Pétri contenant le
milieu PDA additionné d’antibiotique,
réaliser une série de dilutions décimales.
En arriver à la dilution 10-6
, 05 à 06 gouttes de cette dernière, sont étalées à la surface
d’une boite de Pétri contenant le milieu Gélose 2% (Annexe n° 01). L’incubation se fait à
22 °C, sous une photopériode de 12 heures.
1.4/ Purification des souches de F.o.a. :
Après 05 à 07 jours d’incubation, des hyphes mycéliennes apparaissent au tour de chaque
petit fragment de rachis infecté, ou bien des petites tâches blanches à la surface de la boite pour
la technique d’isolement à partir de la rhizosphère (technique des dilutions).
Des explants de la zone périphérique du mycélium ne présentant aucune contamination,
ainsi que ces petites taches blanches, sont prélevés et transférés (d’une manière aseptique) sur
d’autres boites de Pétri contenant le milieu PDA.
Ces repiquages sont renouvelés plusieurs fois jusqu’à l’obtention d’une culture pure.
A fin d’obtenir une culture issue d’une même ascendance, la culture monospore reste le
procédé le plus simple et le plus sûr.
Cette technique consiste à introduire dans un tube de 09 ml d’eau distillée stérile, un petit
fragment qui a poussé sur milieu PDA et âgé de 07 jours. Le tout est agité pendant 02 minutes.
Un (01) ml de cette suspension de spores, est étalé à la surface d’une boite de Pétri contenant le
milieu Gélose 2%. Après 24 à 48 heures, et à l’aide d’une loupe binoculaire, les spores germées
sont repérées puis ensemencées aseptiquement sur milieu PDA (05 spores en moyenne), puis
mises à incuber à 22 °C pendant une semaine. Les cultures issues de la croissance d’une seule
spore sont appelées clones.
-37-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
1.5/ Identification des souches de F.o.a. :
1.5.1/ Etude des caractères culturaux :
Cette étude est réalisée par un repiquage d’un implant mycélien de 6 mm de diamètre (de
chaque isolat), dans des boites de Pétri contenant chacune un milieu différent de l’autre :
un milieu organique (PDA),
un milieu minéral (Czapeck),
un milieu riche (Mathur) (Annexe n° 01).
L’aspect morphologique de la colonie, et sa pigmentation, s’effectue par un examen direct
à l’œil nu, le diamètre de la colonie est mesuré quotidiennement pendant 10 jours d’incubation
à 22 °C sous photopériode de 12 heures.
1.5.2/ Etude des caractères microscopiques :
L’examen d’un implant entre lame et lamelle, dans une goutte de Bleu de Méthylène, ne
permet pas l’obtention de la structure intacte du champignon à cause de sa fragilité particulière.
Pour cela, deux techniques appropriées pour l’examen direct au microscope, sont utilisées :
1.5.2.1/ Culture en chambre humide :
Une boite de Pétri en verre doit contenir un support, sur lequel sont déposées une lame
avec sa lamelle. Le tout est stérilisé au four Pasteur à 170 °C pendant 30 minutes.
Une goutte du milieu PDA est déposée sur la lame, puis recouverte de sa lamelle (à l’aide
d’une pince stérile). L’excès du milieu qui déborde sous la lamelle est ensemencé par la souche
de Fusarium. On fait couler quelques millilitres d’eau distillée stérile dans la boite de Pétri et la
culture est mise à incuber à 22 °C pendant 5 à 7 jours.
1.5.2.2/ Repiquage sur milieu CLA :
Le milieu CLA (Carnation Leaf Agar) est un milieu à substrat naturel, ce petit morceau de
feuille d’œillet, que contient le milieu, favorise la sporulation des macroconidies (Synder et al.,
1947, Fisher et al., 1982).
-38-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
Les petits morceaux de feuilles d’œillet sont préparés à partir d’une collecte de cette plante
d’œillet fraîche non traitée par des fongicides d’insecticides. Les feuilles collectées sont
découpées en petits morceaux de 5-8 mm2
(ils se rétrécissent après séchage), puis séchés dans
un four (~70 °C) pendant 3 à 4 heures, ils peuvent être séchés aussi dans une micro-onde. Le
stockage de ces petits morceaux se fait dans un endroit sec de température ambiante jusqu’à 12
mois avant usage (Leslie et Summerell, 2006).
Une bouture mycélienne est placée à côté de cette feuille d’œillet stérile, le tout, dans une
boite de Pétri contenant le milieu Gélose 2%. La boite est mise à incuber dans la chambre de
culture à 22 ° C, sous une photopériode de 12 heures.
1.5.2.3/ Observations microscopiques :
Après incubation de la culture en chambre humide, la lame est observée au microscope
optique au grossissement x 400.
Plusieurs espèces de Fusarium sporulent sur le milieu CLA après 06 à 10 jours de
repiquage. Les cultures fongiques sur milieu CLA produisent des macroconidies de formes et
de dimensions plus constantes que celles produites sur des milieux riches tels que le milieu
PDA ou le milieu Czapek.
Le mode de formation des macroconidies sur des monophialides ou des polyphialides, la
présence de chaines ou de fausses têtes des microconidies ainsi que la présence des
chlamydospores, peuvent être déterminés par un examen direct de la boite de Pétri (culture
fongique sur milieu CLA), sous microscope optique au grossissement (x 400) en suivant une
clé d’identification des espèces de Fusarium.
1.6/ Etude physiologique des souches de F.o.a. :
Cette étude s’est appliquée sur un seul isolat de F.o.a. (L’isolat F13), qui a montré une
meilleure vitesse de croissance durant la période d’incubation sur les trois différents milieux de
culture cités précédemment. Les expériences ont été répétées trois fois (trois boites pour chaque
facteur étudié).
-39-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
1.6.1/ Influence de la température :
Pour déterminer la température optimale, des boites de Pétri contenant un seul milieu de
culture choisi : le milieu PDA, sont ensemencées au centre par une bouture mycélienne de 6
mm de diamètre, prélevée d’une préculture âgée de 07 jours. Les boites sont incubées à
différentes températures : 15 °C, 22 °C, 28 °C et 35 °C pendant 7 jours. La lecture des
diamètres est effectuée quotidiennement.
1.6.2/ Influence des sources carbonées :
Pour chercher la source de carbone la plus assimilable par notre souche, le milieu utilisé
était le milieu Czapek, dans lequel, le saccharose utilisé pour les boites témoin, était remplacé
par d’autres sources de carbone : le Glucose comme monosaccharide, le Maltose comme
disaccharide et l’Amidon comme polysaccharide.
1.6.3/ Influence des sources azotées :
Le milieu utilisé est le milieu Czapek, dont la source d’azote NaNo3 (Nitrate de Sodium)
est remplacée par le KNO3 (Nitrate de Potassium) et le NH4SO4 (Sulfate d’Ammonium),
comme deux sources d’azote minéral, et par l’Asparagine comme source d’azote organique.
1.6.4/ Influence de la lumière :
Le milieu utilisé est le milieu PDA. Les boites de Pétri sont ensemencées au centre puis
mises à incubées sous : un éclairage continu, une photopériode de 12heures une obscurité
continue.
1.6.5/ Influence du pH du milieu :
Pour préciser le pH optimal à la croissance mycélienne de F.o.a., notre souche est cultivée
sur milieu PDA solide tamponné à différents pH : 4 et 5 par le Tampon Acétate de Sodium, 7 et
8 par le Tampon Phosphate.
- Tampon acétate : composé de deux solutions :
-40-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
Solution A = Solution d’acide acétique à 0,2 M.
Solution B = Solution d’acétate de sodium à 0,2 M.
X ml de la solution A + Y ml de la solution B
- Tampon phosphate : composé de deux solutions :
Solution A = Solution de Na2HPO4 à 0,2 M.
Solution B = Solution de NaH2PO4 à 0,2 M.
X ml de la solution A + Y ml de la solution B
1.6.6/ Influence de l’humidité :
La technique consiste à placer des implants de 6 mm de diamètre de la souche de F.o.a. sur
le milieu PDA en boite de Pétri. Les boites sont tournées et les couvercles sont remplis de 9 ml
d’une solution saline saturée. Le tableau suivant montre la quantité de sel ajoutée à 100 ml
d’eau distillée pour l’obtention des différents taux d’humidité.
Solutions Taux d’humidité relative
Eau distillée 100 %
0,8 g Na Cl 95 %
10 g Na Cl 80 %
30 g Na Cl 74 %
32 g Na Cl 50 %
50 g Na Cl 14 %
pH X Y
4 41,0 9,0
5 14,8 35,2
pH X Y
7 39,0 61,0
8 94,7 5,3
-41-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
1.7/ Conservation des souches de F.o.a. :
La conservation des souches de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis se fait par des cultures
inclinées sur différents milieux : PDA, Gélose 2%, SNA (Annexe n° 01), à une température de
- 4 °C et ceci pour des utilisations ultérieures.
II/ L’hôte et sa culture :
2.1/ Espèce étudiée :
Etant donné que notre étude porte essentiellement sur le champignon Fusarium oxysporum
f.sp. albedinis qui attaque le palmier dattier appelé aussi Phoenix dactylifera L., nous avons
donc besoin dans nos essais de petites plantules de palmier dattier issues de la germination des
noyaux de dattes.
2.2/ Préparation des plantules de palmier dattier :
2.2.1/ Germination des noyaux de dattes :
La germination s’est effectuée au niveau de notre laboratoire, en récoltant un nombre élevé
de noyaux de dattes. Après la désinfection, par trempage dans une solution d’Hypochlorite de
Sodium diluée à 2% pendant 03 minutes, suivie de 03 bains successifs d’eau distillée stérile, les
noyaux sont déposés dans des boites de Pétri en verre tapissées d’un coton imbibé d’eau
distillée, stérilisés auparavant à l’autoclave à 120 °C pendant 20 minutes avec une pression de
1 bar.
Les boites sont incubées à une température de 4 °C pendant 02 à 03 jours pour accélérer la
germination, puis sont transférées dans une étuve réglée à une température de 28 °C pour
provoquer un choc thermique aux noyaux. Après 07 à 09 jours d’incubation, l’embryon de
chaque noyau peut apparaître à la surface (Figure n° 14).
2.2.2/ Plantation des noyaux de dattes :
Les noyaux avec leurs embryons sont transférés dans des sacs en plastique, contenant un
mélange de tourbe et de sol (V/V), puis arrosés avec une solution nutritive, une à deux fois par
semaine. Après 30 à 40 jours, la première feuille apparaît à la surface.
-42-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
Figure n° 14 : Germination d’un noyau de datte.
-43-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
2.2.3/ Préparation de la solution nutritive (Solution KNOP) :
Il suffit de mélanger les ingrédients suivants, un à un, dans un litre d’eau distillée :
Nitrate de Calcium (CaNO3) ……………… 1 g
Nitrate de Potassium (KNO3) ……………… 0,25 g
Sulfate de Magnésium (MgSO4) ……………… 0,25 g
Phosphate monopotassique (KH2PO4) ……………… 0,25 g
Sulfate ferreux (FeSO4) ……………… 0,001 g
2.3/ Etude du pouvoir pathogène :
2.3.1/ Préparation de l’inoculum :
Sept boites de Pétri sont ensemencées avec 01 ml d’une suspension de spores, préparée à
partir d’une culture âgée de 05 jours, (à raison d’une boite pour chaque souche), puis sont mises
à incuber à 22 °C pendant 08 jours. Après ce temps d’incubation, la surface de la boite de
chaque isolat est raclée avec 05 ml d’eau distillée stérile. Cette opération est répétée pour une
deuxième fois. Les 10 ml récupérés représentent la suspension de spores ou l’inoculum qui sera
ajusté par la suite à 106 spores/ ml (à l’aide d’une cellule de Malassez).
2.3.2/ Inoculation des plantules au niveau du système racinaire :
Dans cette étude, nous nous sommes arrivés à cultiver 56 plantule de palmier dattier, dont
40 plantules, âgées de 03 mois ± 01 semaine (au stade végétatif de 02 à 03 feuilles), sont
réparties en 08 lots (à raison d’un lot pour chaque souche, les deux derniers étant des lots
témoins). Chaque lot est composé de 05 plantules, c’est-à-dire que 05 répétitions ont été
effectuées.
Après avoir préparé et ajusté la suspension de spores à 106 spores / ml, l’infection est
réalisée par l’inoculation (à l’aide d’une seringue) de 10 ml de cette suspension dans les
racines de chaque plantule, rassemblées à la base du sachet.
Parallèlement et pour les deux lots témoins mis en place, le premier est traité par 10 ml
d’eau distillée stérile, le second représente les plantules n’ayant subies aucun traitement.
L’ensemble des plantules a été disposé sous serre.
-44-
Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte
2.3.3/ Réisolement du parasite :
Après l’inoculation, la recherche du parasite dans la plante infectée a pour objectif de
montrer la capacité du champignon de pénétrer dans la plante et de s’assurer que les
symptômes notés sont l’effet du pathogène. Ce contrôle est effectué sur toutes les plantes
inoculées, le champignon est recherché dans le sol, au niveau des racines et dans la tige.
L’organe végétal est désinfecté superficiellement (passage à l’éthanol et flambage) et
découpé d’une manière longitudinale et en conditions aseptiques en petits fragments que l’on
dépose, la face sectionnée, sur milieu PDA en boites de Pétri. L’incubation de ces fragments est
réalisée à 22 °C.
-45-
Chapitre II :
Etude du polymorphisme
isoenzymatique
Matériels et Méthodes Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique
I/ Dosage des protéines totales des isolats de F.o.a. :
1.1/ Préparation des extraits mycéliens :
1.1.1/ Culture du champignon :
Des fioles de roux, contenant 100 ml de liquide de Czapeck-Dox, sont ensemencées par 5
boutures mycéliennes (de 6 mm de diamètre), prélevées de la zone périphérique d’une
préculture (5 à 7 jours) du champignon sur milieu PDA. Les cultures à raison de 2 fioles pour
chaque isolat sont conduites à 22 °C pendant 10 jours sous agitation et photopériode de 12
heures.
1.1.2/ Obtention des extraits :
Le mycélium est récupéré après filtration du milieu de culture à l’aide d’une passoire
stérile. Il est ensuite broyé dans un mortier maintenu au froid dans de la glace, additionné du
sable de Fontaine bleau et du Tampon Phosphate (0,1 M - pH 7,1) (P/P/V), jusqu’à l’obtention
d’une pâte fine et homogène. Le broyât est récupéré dans des tubes puis centrifugés à 10 000 g
pendant 20 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée (4 °C) (type Biofuge).
Le surnageant est réparti rapidement dans des tubes eppendorf par fraction de 100 µl. Il
peut être utilisé directement pour l’électrophorèse, comme il peut être conservé au congélateur
mais, une fois décongelé, il n’est jamais recongelé.
1.2/ Principe du dosage des protéines :
La méthode utilisée dans notre expérience est celle de Bradford (1976), qui consiste à une
coloration des protéines par le Bleu de Coomassie G250. L’intensité de la coloration est
proportionnelle à la concentration des protéines et le maximum d’absorption est situé à une
longueur d’ondes λ= 595 nm.
-47-
Matériels et Méthodes Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique
1.2.1/ Composition du Réactif de Bradford :
Bleu de Coomassie 10 mg
Acide Orthophosphorique 85 % 10 ml
Ethanol 95 % 5 ml
Eau distillée q.s.p. 100 ml
1.2.2/ Courbe d’étalonnage :
Une solution mère de Sérum Bovine Albumine (SBA) est préparée à une concentration de
1 mg/ ml. De cette dernière une série de dilutions est effectuée. A chaque dilution, 2 ml de
réactif de Bradford sont ajoutés pour faire la lecture au spectrophotomètre, à une longueur
d’ondes λ= 595 nm, on peut aller même jusqu’à 20 dilutions (Tableau n° 03 ci-après) :
Tableau n° 03 : Dilutions de la courbe d’étalonnage.
Pour déterminer la concentration des protéines dans l’extrait enzymatique de chaque
échantillon, 100 µl de chaque extrait est mélangé avec 2 ml de réactif de Bradford, bien agité
au vortex et après 2 à 3 minutes de repos, la lecture de la densité optique (D.O.) est faite à la
longueur d’ondes λ= 595 nm.
II/ Électrophorèse :
2.1/ Préparation des gels pour le système PAGE :
L’électrophorèse se fait sur gel de polyacrylamide. Les deux gels (de séparation à 10% et
de concentration à 5%) sont préparés selon la méthode de Laenlmli (1970), modifiée de la
manière suivante (Tableau n° 04 ci-contre) :
Dilution 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 blanc
SBA (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 /
Eau distillée (µl) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 200
Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
-48-
Matériels et Méthodes Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique
Tableau n° 04 : Composition des gels de polyacrylamide.
La composition des tampons utilisés pour la préparation des gels et pour la migration est
donnée en Annexe n° 02.
Le gel se présente sous forme de matériel gélifié, formé par la polymérisation d’un
mélange d’acrylamide et de bis-acrylamide. Le gel de concentration est coulé en haut du gel de
séparation, pour permettre une entrée homogène de l’échantillon dans le gel de séparation. Des
pistes individuelles (puits) sont réalisées à l’aide d’un peigne, qui sépare le gel de concentration
en portions égales, destinées à la migration de chaque échantillon.
2.2/ Migration et mise sous tension :
Les extraits enzymatiques de chaque échantillon, sont dilués dans du tampon de charge
avec des proportions 5 : 1 (V/V) dans chaque puits.
Chaque extrémité du gel sera mise en contact avec le tampon de migration qui, soumis
dans un potentiel électrique, permettra la propagation d’un courant dans le gel. Ce courant
entraînera les molécules constituant l’échantillon.
La migration se déroule en chambre froide à 4 °C sous tension constante de 150 V, avec
une intensité de 50 mA durant environ 2 heures.
Solutions
Gel de
séparation 10%
Gel de
concentration 5%
Solution d’acrylamide 30%
Solution de bis-acrylamide 1%
Tampon de séparation pH = 8,8
Tampon de concentration pH = 6,8
Solution SDS 10% (pour le
système SDS-PAGE)
Eau distillée
Temed
Persulfate d’Ammonium 10%
5 ml
5 ml
1,95 ml
/
0,15 ml
4,1 ml
50 µl
100 µl
2,5 ml
3,9 ml
/
3,75 ml
0,15 ml
4,65 ml
50 µl
100 µl
-49-
Matériels et Méthodes Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique
2.3/ Révélation des systèmes isoenzymatiques :
La révélation des isoenzymes est effectuée par incubation du gel (après démoulage) dans
un mélange réactionnel, contenant le substrat de l’enzyme étudiée. Trois systèmes
enzymatiques sont étudiés : Estérases (Est), Phosphatases acide (PAC) et Peroxydases (Pox).
Le tableau n° 05 ci-après, nous indique les mélanges réactionnels pour la révélation de ces
dernières.
Tableau n° 05 : Les mélanges réactionnels pour les révélations enzymatiques.
NB : Les chiffres écrits en gras entre parenthèses (1 à 3) renvoient à la liste des solutions de
révélation en Annexe n° 02.
Enzyme
Mélange réactionnel
Estérases Scandalios (1969)
Un ester carboxylique + H2O
Est un alcool + un anion
acide carboxylique
Fast Blue RR 40 mg
Tampon Phosphate (0,1 M; pH = 7,1) (1) 50 ml
Bien dissoudre, Ajouter:
β-Naphtyl Acétate 2% (0,02g dans 1 ml Acétone) 2 ml
α-Naphtyl Acétate 2% (0,02g dans 1 ml Acétone) 2 ml
Rincer et Fixer.
Phosphatase Acide (PAC)
Pai, Endo et Oka (1975)
α-Naphtyl Phosphate
PAC α-Naphtol Acétate
α-Naphtyl Acide Phosphate 50 mg
Fast Garnet GBC 50 mg
Tampon Acétate (0,05 M; pH = 5) (2) 50 ml
Incuber 3 heures à 40° C, Rincer et Fixer.
Peroxydase
Shaw et Prasad
Pox
2 H2O2 2 H2O2 + O2
3 Amino, 9 Ethyl Carbazole 40 mg
Diméthyl formamide 5 ml
Tampon Acétate (0,05 M ; pH = 5) 92,5 ml
Solution de Ca Cl2 (0,1 M) (3) 2 ml
Solution de H2O2 à 30% 30 µl
Incuber 30 à 60 minutes, Rincer et Fixer.
-50-
Matériels et Méthodes Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique
2.4/ Isoenzymes étudiés :
Le terme Isoenzyme a été introduit en premier par Markert et Moller (1959), pour faire
référence à de multiples formes moléculaires d'une enzyme, avec une semblable ou identique
spécificité du substrat, qui se produit dans le même organisme (Baaziz, 2000).
- Les Estérases :
Une estérase est une enzyme de l'hydrolase qui fend les esters en un acide et un alcool,
sous une réaction chimique avec l'eau appelée l'hydrolyse.
Il existe une grande gamme d’estérases, mais qui diffèrent entre elles par la spécificité du
substrat, la structure de la protéine et la fonction biologique (Baaziz, 2002).
- Les Phosphatases Acides (PAC) :
Sous le terme de Phosphatase Acide, sont regroupées des hydrolases. Ces hydrolases
catalysent la déphosphorylation d'esters orthophosphoriques organiques et dont le pH d'activité
optimale est inférieur à 7. Elles possèdent également une activité transférasique, assurant le
transfert d'un phosphate sur le groupement hydroxyle d'un alcool (Moss, 1984).
- Les Peroxydases :
Une Peroxydase est une enzyme, qui contient parfois un hème, qui catalyse une réaction de
la forme :
ROOR' + donneur d'électrons (2 e-) + 2H
+ → ROH + R'OH
Ce type d'enzyme a notamment pour fonction de décomposer les peroxydes, dérivés
toxiques de l'oxygène (comme par exemple l'eau oxygénée ou peroxyde d'hydrogène), ce qui
lui vaut son nom. Se sont des enzymes très répondues chez les êtres vivants. Chez les plantes,
elles catalysent l’oxydation de différents substrats (des amines aromatiques, des phénols,...),
elles interviennent ainsi dans différents phénomènes physiologiques tels que l’enracinement, la
lignification, et la résistance aux stress biotiques et abiotiques (Qacif et al., 2006).
Certaines interviennent dans le métabolisme de l'iode et sont nécessaires à l'élaboration des
hormones thyroïdiennes. D'autres participent au transfert du chlore dans certaines cellules
-51-
Matériels et Méthodes Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique
du système immunitaire, permettant ainsi la production d'hypochlorite (la vulgaire eau de
Javel), servant à la destruction des microorganismes ingérés. D'autres microorganismes utilisent
des Peroxydases pour fabriquer des antibiotiques. Ces enzymes sont donc parmi les plus
universelles du monde vivant.
2.5/ Préparation des gels pour le système SDS-PAGE :
La différence qui existe entre le système PAGE et le système SDS-PAGE, est la présence
de l’agent dissociant le plus utilisé et le détergent anionique qui défait la structure spatiale et se
fixe sur les protéines à chaud : Sodium Dodécyl Sulfate (SDS). Toutes les molécules seraient
donc chargées négativement et la séparation est uniquement fonction de la masse moléculaire
(taille) (Lafont, 2005).
La préparation des gels de séparation et de concentration est la même que celle du système
PAGE additionnée du SDS (Tableau n° 04).
2.6/ Dénaturation des échantillons :
L’extrait enzymatique de chaque échantillon est dilué dans un même volume du tampon de
charge (V/V). Le tout est porté à ébullition dans un bain-marie pendant 5 minutes.
2.7/ Révélation des bandes :
Après une migration complète, le gel est fixé puis coloré afin de pouvoir visualiser les
bandes protéiques. Les solutions de fixation, de coloration, de décoloration et de conservation
sont portées dans une liste en Annexe n° 03.
-52-
Chapitre III :
Essais in vitro de recherches
de moyens de lutte
Matériels et Méthodes Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte
I/ Lutte chimique contre L’isolat F13 de F.o.a. :
Les méthodes du laboratoire qui permettent d’estimer les propriétés d’un produit in vitro
sont nombreuses mais reposent toutes sur le même principe, celui de confronter le fongicide et
le champignon sur un support artificiel (Henni, 1987).
1.1/ Les fongicides testés :
Une vingtaine de substances antifongiques ont été testées vis-à-vis l’isolat F13 de F.o.a.,
synthétisées par différents Laboratoires de Chimie Organique. Le tableau n° 06, montre la
provenance de chaque substance.
Tableau n° 06 : Les substances fongicides testées contre l’isolat F13 de F.o.a.
1.2/ Préparation des solutions de fongicides :
Chaque produit à tester est soluble dans un solvant organique qui lui convient, il peut être
l’acétone, le méthanol, le chloroforme, …etc. Dans nos essais seul l’acétone est utilisé, d’autres
produits sont hydrosolubles (Tableau ci-dessus).
Substance
Fongicide Laboratoire Solubilité
Substance
Fongicide Laboratoire Solubilité
O1
Laboratoire
de Chimie
Université
ES-Sénia
Oran
Acétone
Am6
Hydrosoluble
P2 Acétone Am7 Hydrosoluble
P3 Acétone ZS 49
Laboratoire
de Chimie
Université
ES-Sénia
Oran
Acétone
M4 Acétone ZS 50 Acétone
M5 Acétone ZS 54 Acétone
Am1
Laboratoire
de Chimie
Université de
Saïda
Hydrosoluble ZS 55 Acétone
Am2 Hydrosoluble ZS 60 Acétone
Am3 Hydrosoluble ZS 61 Acétone
Am4 Hydrosoluble ZS 65 Acétone
Am5 Hydrosoluble ZS 66 Acétone
-54-
Matériels et Méthodes Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte
Dans un premier temps, une solution mère de chaque produit est préparée à une
concentration de 105 ppm (partie par million), puis des dilutions seront effectuées avec un
milieu liquide à base de pomme de terre, pour arriver à chaque fois à la concentration voulue
(50, 100, 200 et 400 ppm). Le 0 ppm comme étant le témoin, ne contient que le solvant
incorporé dans le milieu PDA.
Les différentes dilutions sont obtenues en respectant la loi suivante :
1.3/ Test sur milieu solide :
Des implants mycéliens de 6 mm de diamètre sont prélevés de la périphérie d’une
préculture de 7 jours de l’isolat F13 de F.o.a., et sont déposés au centre de la boite de Pétri
contenant le milieu PDA avec les 04 concentrations pour chaque substance active à étudier
(Braffio et al., 2004).
Pour chaque concentration et chaque produit, deux répétitions sont réalisées. L’incubation
a été faite à 22 °C sous photopériode de 12 heures pendant 7 jours et la lecture se fait
quotidiennement. La mesure de la croissance radiale de la colonie est faite selon la méthode des
deux diamètres perpendiculaires (Figure n° 15) (Blaise et al., 2001).
Pour chaque dose, on détermine le pourcentage d’inhibition qui se calcule selon la formule
suivante :
C1 V1 = C2 V2
C1 : Concentration de la solution mère V1 : Volume pris de la solution mère
C2 : Concentration à préparer V2 : Volume final voulu du milieu PDA
Taux d’inhibition (%) = (D témoin – D test) / D témoin x 100
D : Diamètre
-55-
Matériels et Méthodes Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte
Figure n° 15 : Schéma de la méthode de mesure du diamètre dans les deux sens
perpendiculaires (Blaise et al., 2001).
Boite de Pétri
contenant le
milieu de culture
Implants du
mycélium
-56-
Matériels et Méthodes Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte
II/ Lutte biologique :
Parallèlement aux travaux effectués sur l’effet in vitro de 20 fongicides sur la croissance de
F.o.a., et dans le but d’essayer de mettre au point une lutte biologique, un agent antagoniste
actif sur divers agents pathogènes est utilisé : le Trichoderma harzianum (Elad et al., 1982 ;
Daami-Remadi et El Mahjoub, 2001).
2.1/ Provenance de l’agent antagoniste testé :
Pour lutter contre F.o.a., trois souches de Trichoderma harzianum sont testées T1, T2 et
TM. Les deux premières souches proviennent d’un isolement à partir de la rhizosphère
saharienne (Tableau n° 07). La troisième souche (TM) nous a été fournie par Mme BENFRIHA,
Maître assistante, au Laboratoire de Phytopathologie, à l’Université de Mascara.
Les cultures utilisées pour ces essais, sont âgées de 10 jours.
Tableau n° 07 : Provenance des souches T1 et T2 de Trichoderma harzianum.
Après l’isolement des souches de Trichoderma (T1 et T2) à partir du sol par la technique des
dilutions (similaire à celle citée pour l’isolement de F.o.a.), les caractères macroscopiques et
microscopiques sont étudiés par la culture de cet agent antagoniste sur le milieu Davet (Annexe
01).
2.2/ Test de l’activité antagoniste in vitro :
L’activité antagoniste in vitro de Trichoderma harzianum contre les isolats de F.o.a., a été
étudiée selon deux méthodes :
Date
d’échantillonnage
Code de la
souche Wilaya
Site de
prélèvement
Partie
d’isolement
03.07.2008
T1
Béchar
Haya
Sol
03.07.2008 T2 Béchar Maït Sol
-57-
Matériels et Méthodes Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte
2.2.1/ Confrontation par contact direct sur milieu de culture :
Cette technique consiste à placer, dans la même boite de Pétri contenant le milieu PDA et
d’une façon diamétralement opposée, deux pastilles gélosées de 6 mm de diamètre, l’une
portant le Trichoderma et l’autre le F.o.a., à une distance de 3 cm l’une de l’autre
(Figure n° 16). Les repiquages sont effectués en même temps (Benhamou et Chet, 1996).
Le témoin est constitué par un repiquage du pathogène seul.
L’incubation se fait à 25 °C pendant 5 jours à l’obscurité. Des notations concernant
l’inhibition de la croissance mycélienne des colonies de F.o.a. et leur envahissement par le
mycélium de Trichoderma, sont effectuées quotidiennement.
2.2.2/ Activité des filtrats de culture :
Une bouture mycélienne prélevée dans la zone de croissance d’une culture de l’antagoniste
est déposée dans une fiole contenant 100 ml de milieu pomme de terre liquide. Ces fioles sont
mises à incuber pendant 3 semaines à l’obscurité à 25 °C (Catain et Peterson, 1966 ; Wilson et
Porter 1957 ; Henni, 1998).
Après ce délai, le mycélium est séparé du milieu de culture par centrifugation à
4000 t / min pendant 30 minutes, puis le surnageant est filtré sur filtre millipore de 0.22 µ. Ces
filtrats sont ensuite conservés au congélateur.
Un (01) ml du filtrat de culture est ensuite incorporé avec 10 ml du milieu PDA maintenu
en surfusion (40 à 45 °C) dans chaque boite de Pétri. Des pastilles gélosées, de chaque isolat,
de l’agent pathogène âgé de 5 jours, sont placées dans le centre de la boite (Figure n° 17).
Le témoin est constitué par un filtrat de culture de l’agent antagoniste dénaturé au bain-
marie pendant 5 minutes.
Ainsi, le pourcentage d’inhibition (%) est calculé (dans les deux cas de
confrontation) comme suit :
(%) d’inhibition = (D Témoin – D Test) / D Témoin x 100
D témoin : distance radiale maximale de la croissance du champignon.
D Test : distance radiale sur une ligne en direction de l’antagoniste.
-58-
Matériels et Méthodes Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte
F.o.a. T. harzianum
Milieu PDA
Figure n° 16 : Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par contact direct sur milieu de
culture.
Implant de F.o.a.
Figure n° 17 : Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par l’activité des filtrats de culture.
Milieu PDA contenant le
filtrat de culture de T.
harzianuum
-59-
3 cm
Troisième Partie : Résultats et Discussions
Résultats
Résultats
I/ Isolement du champignon :
Les isolements à partir des rachis d’un palmier infecté ou de la rhizosphère, révèlent un
développement des souches fongiques qui présentent des colonies duveteuses à cotonneuses ou
ras muqueuses, de couleur rose saumon, rose orangé ou violet pale. L’observation
microscopique de tous les isolats, révèle la présence de trois types de spores (microconidies,
macroconidies et chlamydospores), ce qui confirme que les isolats appartiennent au genre
Fusarium.
II/ Identification des souches de F.o.a. :
2.1/ Aspect morphologique :
Après quelques jours d’incubation, seuls des morphotypes mycéliens ont été rencontrés.
Les colonies sont généralement caractérisées par les morphotypes suivants : duveteux,
cotonneux ou ras muqueux (Tableau n° 08 et Figure n° 18).
Le morphotype cotonneux, présente un mycélium aérien très abondant, épais et dense avec
une couleur blanche rosé. Dans ce type, les microconidies sont produites tardivement
(Figure n° 18 -a-).
Le morphotype duveteux, présente un mycélium aérien assez court mais dense, portant de
nombreuses microconidies. Les macroconidies et les chlamydospores sont formées tardivement
(Figure n° 18 -b-).
Le morphotype ras et muqueux, est caractérisé par l’absence du mycélium aérien, ce qui
donne à la culture un aspect muqueux comme si elle était envahie par des bactéries. Les
microconidies sont très abondantes, les macroconidies sont rares et les chlamydospores sont
tardives mais abondantes (Figure n° 18 -c-).
-62-
Résultats
Tableau n° 08 : Différents morphotypes rencontrés chez F.o.a. et Fusarium de la
rhizosphère du palmier dattier.
Souches
isolées
Partie
d’isolement
Site de
prélèvement Morphotype Pigmentation Identification
F 1 Rachis Adrar ras muqueux
(type sauvage)
Rose violet F.o.a.
F 1’ Rhizosphère Adrar
cotonneux Blanc rosé Fusarium sp.
F 2’ Rhizosphère Adrar duveteux Rose pâle Fusarium sp.
F 3’ Rhizosphère Adrar
cotonneux Blanc rosé Fusarium sp.
F 4 Rachis Béchar ras muqueux Rose orangé F.o.a.
F 4’ Rhizosphère Adrar
cotonneux Blanc Fusarium sp.
F 5’ Rhizosphère Béchar duveteux Blanc rosé Fusarium sp.
F 6 Rachis Béchar duveteux Rouge carmin Fusarium sp.
F 7 Rachis Béchar ras muqueux
(type sauvage)
Rose orangé F.o.a.
F 8 Rachis Béchar ras muqueux
(type sauvage)
Rose orangé F.o.a.
F 8’ Rhizosphère Béchar
duveteux Rouge carmin Fusarium sp.
F 8’’ Rhizosphère Béchar
duveteux Rouge carmin Fusarium sp.
F 9’ Rhizosphère Béchar ras Rose clair Fusarium sp.
F 10’ Rhizosphère Béchar cotonneux Blanc Fusarium sp.
F 11’ Rhizosphère Béchar ras Orange Fusarium sp.
F 12’ Rhizosphère Béchar ras muqueux
(type sauvage)
Violet pâle F.o.a.
(saprophyte)
F 12’’ Rhizosphère Béchar
ras Orange Fusarium sp.
F 13 Rachis Adrar ras muqueux
(type sauvage)
Rose orangé F.o.a.
F 14’ Rhizosphère Béchar ras muqueux Blanc Fusarium sp.
F 15 Rachis Ghardaïa ras blanc Fusarium sp.
-63-
Résultats
Figure n° 18 : Représentations des différents morphotypes rencontrés.
Figure n° 18 -a- :
Morphotype cotonneux
Figure n° 18 -b- :
Morphotype duveteux
Figure n° 18 -c- :
Morphotype ras muqueux
-64-
Résultats
Figure n° 19 : Représentation des différents aspects morphologiques des isolats de F.o.a.
L’isolat F1 L’isolat F4
L’isolat F7 L’isolat F8
L’isolat F12’ L’isolat F13
-65-
Résultats
2.2/ Caractères microscopiques :
Le champignon qui sort des tissus de palmier présente un mycélium fin blanc, cloisonné. Il
produit trois types de spores caractéristiques du genre Fusarium (Figure n° 20) :
* Les microconidies, sont nombreuses, le plus souvent unicellulaires et quelques fois
bicellulaires, regroupées en fausses têtes. Elles sont produites par des phialides courtes en
forme de bouteille implantées perpendiculairement sur le mycélium (Figure n° 20 -a-).
* Les macroconidies, sont courbes, cloisonnées de 2 à 3 cloisons, rarement plus, (Figure
n° 20 -b-). Elles ne sont produites en quantité par le F.o.a. que lors du premier isolement en
présence de palmier. Dés que le champignon est repiqué, il perd sa capacité à produire des
macroconidies.
* Les chlamydospores, produites soit à partir du mycélium, soit à partir des macroconidies.
Elles sont lisses et produites en grande quantité dans les cultures âgées
(Figure n° 20 -c-).
Suivant ces caractéristiques, seules les souches sauvages isolées du rachis (F1-F4-F7-F8-
F13) et une souche saprophyte du sol (F12’) sont des Fusarium oxysporum (Figure n° 19), les
autres isolats appartenaient à d’autres espèces du genre Fusarium.
2.3/ Effet des différents milieux de culture :
Sous les conditions de culture utilisées, trois critères morphologiques sont pris en
considération (l’aspect du mycélium, sa pigmentation et la vitesse de croissance de la colonie).
Le mycélium de tous les isolats (F1-F4-F7-F8 et F13), s’est très bien développé sur le
milieu PDA, avec un aspect ras muqueux et une pigmentation naturelle (Figure n° 21),
contrairement aux deux autres milieux (Czapeck et Mathur), qui permettent une bonne
croissance mais la colonie a une faible pigmentation : blanchâtre sur le milieu Czapeck (Figure
n° 22) et presque transparente sur le milieu Mathur (Figure n° 23).
La vitesse de croissance de tous les isolats est presque similaire sur les trois milieux de
culture. Le Tableau n° 10 et la Figure n° 24, illustrent les résultats du diamètre moyen, calculé
après 10 jours d’incubation et d’une manière quotidienne, selon la méthode des deux sens
perpendiculaires.
-66-
Résultats
Figure n° 20 : Observations au microscope optique des trois types de spores de F.o.a .
au grossissement (X 400).
-a-
-b-
-c-
1
2
3
4
5
6
1 : microconidies en fausse tête 2 : monophialide courte 3 : mycélium
4 : macroconidie 5 : chlamydospore 6 : microconidie
6,8 µm
5 µm
6,8 µm
-67-
Résultats
Figure n° 21 : Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu PDA.
Figure n° 22 : Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu Czapeck.
Figure n° 23 : Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu Mathur.
F1 F4
F7 F8
F13
F1 F4
F7
F13
F8
F1 F4
F7 F8
F13
F8
F8
F7
F7
-68-
Résultats
Tableau n° 10 : Diamètre moyen (cm) des cinq isolas sur les trois milieux de culture.
Figure n° 24 : Représentation graphique de l’influence des différents milieux de culture sur la
croissance des isolats de F.o.a.
0
1
2
3
4
5
6
PDA Czapeck Mathur
Dia
mèt
re d
e la
co
lon
ie (
cm)
Milieux de culture
F 1
F 4
F 7
F 8
F 13
Milieux
Souches
PDA Czapeck Mathur
F 1 4,995 3,958 4,79
F 4 4,878 5,063 4,882
F 7 4,998 4,699 4,965
F 8 4,877 4,783 5,015
F 13 5,413 5,211 4,911
-69-
Résultats
III/ Etude physiologique de F.o.a. :
3.1/ Influence de la température :
Après 07 jours d’incubation, on remarque que la température optimale pour la croissance
de notre souche F13 est de 28 °C avec une colonie de 5,12 cm de diamètre, au-dessous et au-
dessus de celle-ci, la croissance mycélienne se voit ralentir, c’est ce qui est rapporté sur la
Figure n° 25.
3.2/ Influence des sources carbonées :
Les résultats représentés par la Figure n° 26, montrent que le maltose et le glucose
permettent une meilleure croissance pour notre souche F13.
L’amidon constitue une source de carbone non négligeable, par contre une croissance
moyenne de notre souche F13 est remarquée chez le témoin avec le saccharose comme source
de carbone.
3.3/ Influence des sources azotées :
Les résultats représentés par la Figure n° 27, montrent que l’utilisation des nitrates de
potassium donne une très bonne croissance. L’asparagine est la deuxième source permettant
une bonne croissance. En revanche, le sulfate d’ammonium, inhibe fortement la croissance de
notre souche F13.
3.3/ Influence de la lumière :
La croissance de notre souche F13 en obscurité continue est maximale. Elle est bonne sous
photopériode de 12 heures, et moyenne sous éclairage continu. Ceci est confirmé par la Figure
n° 28.
3.4/ Influence du pH du milieu :
On remarque qu’au pH extrême (pH = 4), notre souche F13 s’est développée mais très
faiblement. L’optimum se situe à pH 5 et une gamme allant de 5,5 jusqu’à 8 permet aussi une
bonne croissance (Figure n° 29).
-70-
Résultats
Figure n° 25 : Représentation graphique de
l’influence des températures sur la
croissance de l’isolat F13.
Figure n° 26 : Représentation graphique de
l’influence de la source de carbone sur la
croissance de l’isolat F13.
Figure n° 28 : Représentation graphique de
l’influence d’éclairage sur la croissance de
l’isolat F13.
Figure n° 27 : Représentation graphique de
l’influence de la source d’azote sur la
croissance de l’isolat F13.
-71-
0
1
2
3
4
5
Ec. Con. Ob. Con. Photo. 12H
0
1
2
3
4
5
6
15° C 22° C 28° C 35° C
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
Glucose Maltose Amidon
0
1
2
3
4
5
Asparagine NH4SO4 KNO3
Diamètre (cm) Diamètre (cm)
Diamètre (cm) Diamètre (cm)
Résultats
Figure n° 29 : Représentation graphique de l’influence du pH du milieu sur la croissance de
l’isolat F13.
Figure n° 30 : Représentation graphique de l’influence du taux d’humidité sur la croissance
de l’isolat F13.
-72-
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
pH = 4 pH = 5 pH = 7 pH = 8
Diamètre (cm)
Diamètre (cm)
Résultats
3.5 Influence du taux d’humidité :
La croissance mycélienne est meilleure avec un taux d’humidité de 80 %, les taux de 75 %
et 50 % permettent eux aussi une bonne croissance du champignon.
La croissance de notre souche F13 semble moyenne aux taux très élevés : 95 % et 100 %
et est sensible aux taux très bas : 14 %. C’est ce qui confirme la Figure n° 30.
IV/ Estimation du pouvoir pathogène :
Nous avons débuté les notations des symptômes, 01 mois après l’inoculation Ces notations
consistent à relever le nombre de plantule mortes, provoqué par chaque souche et est exprimé
en pourcentage de mortalité (Tableau n° 11).
Les plantules infectées, présentent différents symptômes d’altérations, tel qu’un
jaunissement suivi d’un dessèchement puis un dépérissement des feuilles jusqu’à la mort totale
de la plante. Ceci est rapporté sur la Figure n° 31.
Pour pouvoir confirmer les symptômes constatés du pouvoir pathogène de chaque souche,
le réisolement du champignon, a révélé sa dans le sol, les racines et la tige de chaque plantule
Tableau n° 11 : Pourcentage de mortalité des plantules de palmier dattier.
Souches de F.o.a. Nombre de
plantules atteintes
Pourcentage de
mortalité (%)
F1 4 80%
F4 2 40%
F7 2 40%
F8 4 80%
F12’ 1 20%
F13 3 60%
-73-
Résultats
Figure n° 31 : Différents symptômes notés chez les plantules de palmier dattier.
A
C
C
E
F
D
A : Plantule de palmier dattier saine (témoin) B : Jaunissement C et D : Dessèchement
E : Dépérissement F : Mort totale de la plantule
B
-74-
Résultats
V/ Dosage des protéines des isolats de F.o.a. :
Après la lecture au spectrophotomètre à la longueur d’ondes λ = 595 nm, les résultats de la
densité optique de chaque dilution sont représentés sur le Tableau n° 12. Ils seront par la suite
reportés sur la Figure n° 32 qui constitue la courbe d’étalonnage D.O. = f (concentrations).
La concentration en protéine dans chaque échantillon d’extrait enzymatique, est calculée
par l’équation de la droite de la courbe d’étalonnage (Tableau n° 13).
VI/ Électrophorèse :
Le gel de polyacrylamide a servi pour l’étude isozymique des isolats de F.o.a. (F1-F4-F7-
F8-F12’ et F13), récoltés des différentes régions du Sahara Algérien. Trois systèmes
enzymatiques ont été étudiés.
6.1/ Estérases :
Ce système révèle un profil électrophorétique de 04 bandes chez tous les isolats de F.o.a.
Les bandes sont parfaitement visibles, d’une intensité variable et, d’une couleur rouge brique
ou marron (Figure n° 33).
6.2/ Phosphatases :
Le profil électrophorétique des phosphatases des isolats de F.o.a. révèle la présence d’une
seule bande lisible et visible d’une intensité variable et d’une couleur marron (Figure n° 34).
6.3/ Peroxydases :
La révélation de ce système est négative. Le profil électrophorétique n’a présenté aucune
bande visible pour les isolats de F.o.a. (Figure n° 35).
6.4/ Protéines totales :
La révélation des bandes protéiques sur le gel de polyacrylamide en présence du SDS,
montre la présence de plusieurs bandes sur un profil électrophorétique presque similaires pour
tous les isolats de F.o.a. (Figure n° 36).
-75-
Résultats
Tableau n° 12 : Densité optique (D.O.) de chaque dilution.
Figure n° 32 : Courbe d’étalonnage.
Tableau n° 13 : Densité optique (D.O.) et concentration en protéines dans chaque extrait
enzymatique des isolats de F.o.a.
Dilutions 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10
D.O. 0,869 0,840 0,824 0,782 0,776 0,734 0,719 0,701 0,689
Dilutions 1/11 1/12 1/13 1/14 1/15 1/16 1/17 1/18 1/19
D.O. 0,666 0,660 0,631 0,578 0,573 0,560 0,552 0,532 0519
Souches F1 F4 F7 F8 F12’ F13
D.O. 0,312 0,277 0,332 0,204 0,351 0,281
Concentration en
protéines (µg/ml) 14,65 12,93 15,63 9,35 16,56 13,13
-76-
Concentration de SBA (µg / ml)
D.O
.
Résultats
Figure n° 33 : Profil électrophorétique des estérases chez les isolats de F.o.a.
Figure n° 34 : Profil électrophorétique des phosphatases chez les isolats de F.o.a.
F13 F12’ F8 F7 F4 F1
( - )
( + )
F13 F12’ F8 F7 F4 F1
F1 F4 F7 F8 F12’ F13 F1 F4 F7 F8 F12’ F13
( - )
( + )
-77-
Résultats
Figure n° 35 : Profil électrophorétique des peroxydases chez les isolats de F.o.a.
Figure n° 36 : Profil électrophorétique des protéines totales chez les isolats de F.o.a.
F1 F4 F7 F8 F12’ F13
F1 F4 F7 F8 F12’ F13 F1 F4 F7 F8 F12’ F13
( + )
( - )
-78-
Résultats
VII/ Lutte chimique contre l’isolat F13 de F.o.a. :
Les 20 fongicides testés in vitro contre F.o.a., sont répartis en trois séries selon leurs
natures chimiques. Ce test révèle l’efficacité de certaines de ces substances fongicides,
déterminée par le calcul du diamètre moyen de la colonie, pendant les 10 jours d’incubation
(Tableaux n° 14-16-18) ainsi que par le calcul du taux d’inhibition de chaque produit et à
chaque concentration testée (Tableaux n° 15-17-19).
Les résultats obtenus sont illustrés par les Figures n° 38, 39 et 40. La Figure n° 37 est un
exemple de l’effet d’une substance fongicide (P2) sur la croissance mycélienne de l’isolat F13
de F.o.a.
Figure n° 37 : Effet de la substance fongicide (P2) à différentes concentrations sur la
croissance mycélienne de l’isolat F13de F.o.a.
0 ppm 50 ppm 100 ppm
200 ppm 400 ppm
-79-
Résultats
Tableau n° 14 : Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la première série des
substances fongicides.
Tableau n° 15 : Taux d’inhibition (%) de la première série des substances fongicides contre
l’isolat F13.
Figure n° 38 : Représentation graphique du diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté
avec la première série des substances fongicides.
O1 P2 P3 M4 M5
0 ppm 3,95 4,65 5,91 4,35 3,51
50 ppm 3,96 4,63 5,43 3,26 3,38
100 ppm 4,48 3,66 4,65 5,51 3,6
200 ppm 3,43 2,68 4,01 5,31 3,28
400 ppm 3,48 2,53 3,81 4,7 2,75
O1 P2 P3 M4 M5
50 ppm - 0,43 8,12 25,1 3,7
100 ppm - 21,29 21,3 - -
200 ppm 13,16 42,36 32,1 - 6,55
400 ppm 11,89 45,59 35,5 - 21,7
-80-
0
1
2
3
4
5
6
O1 P2 P3 M4 M5
Dia
mèt
re
mo
yen
de
la c
olo
nie
(cm
)
0 ppm
50 ppm
100 ppm
200 ppm
400 ppm
Résultats
Tableau n° 16 : Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la deuxième série des
substances fongicides.
Tableau n° 17 : Taux d’inhibition (%) de la deuxième série des substances fongicides contre
l’isolat F13.
Figure n° 39 : Représentation graphique du diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté
avec la deuxième série des substances fongicides.
Am1 Am2 Am3 Am4 Am5 Am6 Am7
0 ppm 4,93 4,28 2,11 4,08 3,13 3,43 3,26
50 ppm 4,38 3,61 2,3 6,03 2,08 1,23 3,18
100 ppm 4,83 2,33 2,3 5,11 2,16 1,01 3,36
200 ppm 4,88 2,63 2,26 5,81 2,3 0,76 3,41
400 ppm 4,86 2,28 2,26 4,01 2,78 1,48 4,36
Am1 Am2 Am3 Am4 Am5 Am6 Am7
50 ppm 11,15 15,65 - - 33,5 64,13 3,04
100 ppm 2,02 45,65 - - 31 70,55 -
200 ppm 1,01 38,55 - - 26,5 77,84 -
400 ppm 1,41 46,72 - 1,71 11,2 56,84 -
-81-
0
1
2
3
4
5
6
7
Am1 Am2 Am3 Am4 Am5 Am6 Am7
Dia
mèt
re m
oy
en d
e la
co
lon
ie (
cm)
0 ppm
50 ppm
100 ppm
200 ppm
400 ppm
Résultats
Tableau n° 18 : Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la troisième série des
substances fongicides.
Tableau n° 19 : Taux d’inhibition (%) de la troisième série des substances fongicides contre
l’isolat F13.
Figure n° 40 : Représentation graphique du diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté
avec la troisième série des substances fongicides.
ZS49 ZS50 ZS54 ZS55 ZS 60 ZS 61 ZS65 ZS 66
0 ppm 3,46 3,8 3,5 2,98 4,16 4,18 3,9 4,13
50 ppm 2,81 3,03 2,95 3,68 3,05 2,8 2,78 3,25
100 ppm 2,73 2,56 2,3 2,7 2,88 2,65 2,61 3,38
20 ppm 2,95 2,46 1,55 3,11 2,48 2,48 1,9 3,68
400 ppm 2,8 2,7 1,11 4,06 2,16 3,15 1,95 4,46
ZS 49 ZS 50 ZS 54 ZS 55 ZS 60 ZS 61 ZS 65 ZS 66
50 ppm 18,78 20,26 15,7 - 27 31,87 28,71 21,3
100 ppm 21,09 32,63 34,3 9,39 31,1 35,52 33,07 18,15
200 ppm 14,73 35,26 55,7 - 40,7 39,65 51,28 10,89
400 ppm 19,07 28,94 68,3 - 48,3 23,35 50 -
-82-
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
ZS49 ZS50 ZS54 ZS55 ZS 60 ZS 61 ZS65 ZS 66
Dia
mèt
re m
oy
en d
e la
co
lon
ie (
cm)
0 ppm
50 ppm
100 ppm
20 ppm
400 ppm
Résultats
XI/ Lutte biologique contre les isolats de F.o.a. :
8.1/ L’agent antagoniste :
La culture des souches de Trichoderma harzianum sur le milieu Davet révèle la présence
d’un mycélium très clair étalé sur le milieu gélosé, avec des arborescences terminées par des
formations sphériques de couleur verte irrégulières : « têtes » (Figure n° 41).
L’observation microscopique de Trichoderma harzianum montre que l’organisation des
structures conidiogènes est telle que des ramifications qui se répartissent perpendiculairement
et de façon opposée de part et d’autre d’un axe principal qui est le conidiophore (Figure n° 42),
les spores à paroi lisse, sont de forme ovalaire et de couleur verte.
Figure n° 41 : Culture de Trichoderma harzianum sur milieu Davet.
Figure n° 42 : Observation au microscope optique de Trichoderma harzianum
(G x 400).
4 µm 1
2
3
1 : spore
2 : phialide
3 : conidiophore
-83-
Résultats
8.2/ Test de l’activité antagoniste de Trichoderma harzianum :
Le repiquage simultané de Trichoderma harzianum et des isolats de F.o.a. (F1-F4-F7-F8
et F13) a montré une croissance plus rapide de l’agent antagoniste que celle des isolats de
F.o.a. Au bout de quatre jours d’incubation, la boite de Pétri est totalement envahie par
l’antagoniste, alors que les isolats de F.o.a. n’occupent qu’une petite surface, ce qui correspond
à une inhibition de la croissance mycélienne. Le diamètre moyen de la colonie mycélienne de
chaque isolat de F.o .a. ainsi que le taux d’inhibition pour les deux techniques du test de
l’activité antagoniste (contact direct et action des filtrats de culture), sont mentionnés dans les
Tableaux n° 20 et 21 et illustrés par les Figures n° 43,44, et 45.
Tableau n° 20 : Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux d’inhibition (%) des
différentes souches de Trichoderma par contact direct.
Figure n° 43 : Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. en contact direct avec les
différentes souches de Trichoderma pendant 4 jours d’incubation.
F1 T.H.% F4 T.H.% F7 T.H.% F8 T.H.% F13 T.H.%
T1 2,7 22,8 1,26 54,2 2,6 16,6 2,38 28,3 2,8 30,9
T2 2,7 22,8 1,52 47,1 2,44 21,8 1,96 40,9 2,62 36,0
Tm 2,62 25,1 2,2 22,5 2,16 30,7 2,4 27,7 2,82 31,2
Témoin 3,5 2,84 3,12 3,32 4,12
-84-
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
F1 F4 F7 F8 F13
T1
T2
Tm
Témoin
Diamètre moyen de la
colonie (cm)
Résultats
Tableau n° 21 : Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux d’inhibition (%) des
différentes souches de Trichoderma par action des filtrats de culture.
Figure n° 44 : Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. sous l’action des filtrats de
culture des différentes souches de Trichoderma pendant 4 jours d’incubation.
Figure n° 45 : Taux d’inhibition (%) de Trichoderma harzianum contre les isolats de
F.o.a. pour les deux techniques de confrontations.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
F1 F4 F7 F8 F13
T1
T2
Tm
Témoin
Diamètre moyen de la
colonie (cm)
F1 T.H.% F4 T.H.% F7 T.H.% F8 T.H.% F13 T.H.%
T1 2,43 42,9 2,98 40,0 2,65 45,3 2,66 32,1 2,92 39,9
T2 2,43 42,9 2,31 53,4 2,15 35,6 2,08 47,0 2,45 49,6
Tm 1,26 70,2 1,63 67,1 1,5 55,0 1,4 64,3 1,8 63,0
Témoin 4,26 4,97 3,33 3,93 4,86
0
10
20
30
40
50
60
F1 F4 F7 F8 F13
0
10
20
30
40
50
60
70
80
F1 F4 F7 F8 F13
Action des Filtrats de Culture Contact Direct
T1 T2 Tm T.H. (%) T.H. (%)
-85-
Résultats
Le test de l’activité antagoniste de Trichoderma harzianum contre les isolats de F.o.a., que
se soit par contact direct sur milieu de culture ou par l’action des filtrats de culture, révèle un
recouvrement des isolats de F.o.a. par le mycélium de l’agent antagoniste sur toute la surface
de la boite de Pétri, avec l’existence de fructification de ce dernier sur les isolats de F.o.a. et la
sécrétion de substance jaune dans la zone de contact (Figure n° 46 et 47).
Figure n° 46 : Contact direct sur milieu de culture entre Trichoderma harzianum et F.o.a.
1° Jour d’incubation 4° Jour d’incubation Témoin
Croissance rapide de l’agent
antagoniste (pastille à droite) dés le
premier jour d’incubation par
rapport à l’agent pathogène
(pastille à gauche).
Envahissement total de la boite de
Pétri par l’agent antagoniste avec
la sécrétion de la substance jaune.
Croissance de l’agent pathogène
seul (témoin) en absence de l’agent
antagoniste.
Témoin
-86-
Résultats
Figure n° 47 : Action des filtrats de culture de Trichoderma harzianum sur la croissance de
F.o.a.
Croissance de l’agent antagoniste à
partir du filtrat de culture et
envahissement de la boite de Pétri
par rapport à l’agent pathogène
(pastille du centre).
Envahissement total par l’agent
antagoniste et production de
fructifications sur l’agent
pathogène (pastille du centre).
Croissance de l’agent pathogène
seul (témoin) en absence du filtrat
de culture de l’agent antagoniste.
1° Jour d’incubation 4° Jour d’incubation Témoin
-87-
Discussions
Discussions
Notre travail de recherche s’inscrit dans le cadre de l’étude de la caractérisation
morphologique et physiologique de l’espèce Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, l’agent
causal de la maladie du « Bayoud » (fusariose vasculaire) du palmier dattier, avec comme
objectif : essayer un moyen de lutte in vitro, par des substances fongicides, d’un côté et par
l’utilisation de l’agent antagoniste le Trichoderma harzianum, d’un autre côté.
1/ L’étude morphologique de nos isolats, a fait apparaître trois morphotypes différents : l’aspect
cotonneux, l’aspect duveteux et l’aspect ras muqueux.
Cette diversité morphologique du genre Fusarium obtenue est identique à celle observée dans
les travaux de (Ouinten, 1996) sur la même espèce Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, ainsi
que ceux menés par (Guessas, 1993 ; Henni, 1998 et Hamini, 2002) sur Fusarium oxysporum
f.sp. lycopersici.
2/ L’étude microscopique des souches nous a démontré que le mycélium est cloisonné avec
l’apparition des trois sortes de spores ; les microconidies, les macroconidies et les
chlamydospores.
Ces résultats sont concordants avec ceux auxquels ont abouti (Armstrong et Armstrong, 1981 ;
Henni, 1998; Toshiaki et Takashi, 2004).
3/ S’agissant de l’étude physiologique,
3.1/ Le test d’influence de la source carbonée sur la croissance du Fusarium oxysporum
f.sp. albedinis fait apparaître une préférence pour le glucose et le maltose. Une bonne
croissance est enregistrée sur le milieu contenant l’amidon comme source de carbone, et ce, à
l’instar des résultats obtenus dans les différents travaux menés auparavant par (Lopez et Fergus,
1965; Bounaga, 1970; Henni, 1998 et Hamini, 2002).
3.2/ L’influence de la source azotée sur la croissance du Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis nous a montré une meilleure croissance sur des milieux contenant les nitrates de
sodium et les nitrates de potassium, confirmant ainsi les conclusions des différents auteurs qui
estiment que la plupart des Fusarium pathogènes préfèrent l’azote organique que l’azote
minéral (Wolf, 1966 ; Lopez et Fergus, 1965 ; Hamini, 2002).
-89-
Discussions
Par ailleurs, Une croissance inhibée de notre souche a été remarquée sur le milieu
contenant le sulfate d’ammonium comme seule source azotée. Les mêmes constatations ont été
faites par (Guessas, 1993 ; Ameziane, 1997).
4/ L’étude du pouvoir pathogène, nous a permis de constater que tous les isolats du Fusarium
oxysporum f.sp. albedinis, issus du rachis, étaient pathogènes (après une période de 3 mois et
plus ou moins quelques semaines), sur les plantules du palmier dattier obtenues après la
germination des noyaux de dattes, avec un degré de pathogénicité variable. Nos observations
concordent avec celles obtenues par (Ouinten, 1996).
Parmi les 05 plantules inoculées, nous avons enregistré 04 plantules détruites pour chacun des
isolats F1 et F8, avec un pourcentage de mortalité de 80 % et 03 plantules pour l’isolat F13 où
le taux de mortalité a atteint 60 %.
Chez les isolats F4 et F7, le taux de mortalité enregistré a atteint 40 %, soit 02 plantules sur la
totalité.
Par ailleurs, nous avons constaté que, seul l’isolat F12’, issu de la rhizosphère dégage le
nombre le plus faible des plantules atteintes (01 seule), soit un taux de mortalité de 20 %.
5/ L’étude du polymorphisme isoenzymatique, par la révélation des estérases et des
phosphatases acides, ainsi que les protéines totales de nos isolats du Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis, nous a montré une similarité des profils électrophorétiques entre les isolats pour
chaque système révélé. Le même constat a été fait par (Bounaga, 1985).
Nous avons, en ce qui nous concerne enregistré une absence totale de bandes pour la révélation
des peroxydases, chez tous les isolats de F.o.a., peut être que le réactif de révélation était
périmé.
A la lumière des résultats obtenus dans les études morphologiques, microscopiques et
physiologiques (citées précédemment), nous avons lancé nos essais des luttes chimique et
biologique contre le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, pendant plusieurs mois pour enfin,
aboutir aux constats suivants :
-90-
Discussions
Dans la première série des substances fongicides, nous n’avons pas pu calculer le taux
d’inhibition pour le produit O1 (à 50 et 100 ppm), le produit M4 (à 100, 200 et 400 ppm) et le
produit M5 (à 100 ppm) ; puisque le diamètre de l’isolat F13 dans ces concentrations (le test),
dépasse celui du témoin (0 ppm).
Le taux d’inhibition de la croissance mycélienne de l’isolat F13, calculé pour cette série de
substances fongicides, varie considérablement de 0,43% (le taux le plus faible) à 45,59 % (le
taux le plus élevé).
Les meilleurs pourcentages d’inhibition sont obtenus avec le produit P2 (42,36 % à 200 ppm et
45,59 % à 400 ppm) et le produit P3 (32,1 % à 200 ppm et 35,5 % à 400 ppm). Cela implique
que la CMI50 de ces deux produits (P2 et P3), dépasse la concentration 400 ppm.
Dans la deuxième série des substances fongicides, nous avons constaté qu’il existe une
différence dans l’efficacité entre chaque produit testé.
En premier lieu,
les produits Am3 - Am4 et Am7, ne montrent aucune inhibition de l’isolat F13 ;
autrement dit, ces 03 produits n’ont aucun effet sur la croissance mycélienne du champignon.
Le produit Am1, quant à lui, présente un taux très faible de 11,15 % (à 50 ppm), qui
devient négligeable dans les concentrations qui suivent (2,02 % à 100 ppm, 1,01 à 200 ppm et
1,41 à 400 ppm).
En second lieu, le produit Am5 présente une dégradation du pourcentage d’inhibition, où
l’efficacité commence avec un pourcentage de 33,5 % à 50 ppm, puis décroit à 31% à 100 ppm
et chute enfin à 11,2 % à 400 ppm.
En dernier lieu, et concernant les 02 produits restants (Am2 et Am6), nous avons pu enregistrer
pour le premier, un taux d’inhibition relativement élevé 46,72 % à 400 ppm par contre, le
second a dégagé le taux le plus élevé soit 77,84 % à 200 ppm. Dans ce cas, nous pouvons
estimer la CMI50 supérieure à 400 ppm, pour le produit Am2 et inférieure à 400 ppm pour le
produit Am6.
-91-
Discussions
Dans la troisième série des substances fongicides, les molécules de triazoles ZS54,
ZS60 et ZS6 testées sur la souche fongique F.o.a. F13, ont exercé un effet inhibiteur sur sa
croissance mycélienne à une concentration de 400 ppm avec un taux de 68.3 %, 48.3 % et 50 %
respectivement.
Avec les autres substances testées on remarque une inhibition au niveau des
concentrations 50 ppm, 100 ppm et 200 ppm; mais avec la concentration de 400 ppm on note
un rehaussement de la croissance de la souche F13 qui fait penser à l’hypothèse de résistance
ou de mutation.
Parmi ces substances on citera la ZS50 et ZS61 où la croissance à 400 ppm est plus
importante que celle notée avec les concentrations 50 ppm et 100 ppm. Elles enregistrent un
taux d’inhibition maximal avec les concentrations 100 et 200 ppm, soit 35 % à 200 ppm et 39,
6 % à 200 ppm respectivement.
Les substances ZS55 et ZS66 n’ont aucune activité inhibitrice envers la croissance
mycélienne de la souche F13 du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
Les résultats obtenus dans la lutte biologique contre le Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis par l’agent antagoniste Trichoderma harzianum, nous a montré une nette réduction du
diamètre moyen de la croissance mycélienne, une zone d’inhibition dès le 1er
jour et un
envahissement total de la boite de Pétri par l’agent antagoniste au bout de 4 jours d’incubation.
S’agissant de la confrontation directe sur milieu de culture entre le Fusarium oxysporum
f.sp. albedinis et les 03 souches de Trichoderma harzianum, elle nous a démontré que la
croissance radiale maximale des isolats ne dépasse les 30 mm, ce qui nous a permis
d’enregistrer l’inhibition la plus élevée avec les taux de :
54 % obtenu par la souche (T1) contre l’isolat (F4),
47 % obtenu par la souche (T2) contre le même isolat,
31 % obtenu par la souche (Tm) contre l’isolat (F13).
Quant à l’action des filtrats de culture de l’agent antagoniste Trichoderma harzianum,
contre le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, elle a démontré un ralentissement de la
croissance mycélienne, à travers les taux d’inhibition suivants :
-92-
Discussions
45 % avec la souche (T1) contre l’isolat (F7),
53 % avec la souche (T2) contre l’isolat (F4),
70 % avec la souche (Tm) contre l’isolat (F1).
Dans ce même sens, l’observation est faite par (Benhamou et Chet, 1996) en réalisant
une confrontation directe sur milieu de culture entre cet antagoniste et un autre champignon
tellurique, le Pythium ultimum et ce au bout de quatre à cinq jour après l’inoculation. Daami-
Remadi et El Mahjoub (2001), ont signalé, en testant l’activité antagoniste de Trichoderma
harzianum, vis-à-vis de deux espèces de Pythium, que pendant les trois premiers jours, la boite
de Pétri est totalement envahie par Pythium spp. et que Trichoderma harzianum ne commence
à exercer son activité antagoniste qu’à partir du quatrième jour d’incubation. Quant à Hibar et
al., 2005, qui ont travaillé sur le Trichoderma harzianum contre le Fusarium oxysporum f.sp.
radicis-lycopersici, ont trouvé que les isolats de l’agent pathogène n’occupent qu’une surface
de 20 mm de diamètre, ce qui correspond à une inhibition de 65 %. Le témoin cultivé seul
occupe une surface d’environ 50 mm de diamètre.
-93-
Conclusion
Conclusion
Notre travail au Laboratoire de Phytopathologie, Département de Biologie, à l’Université
d’Oran Es-Sénia, a porté principalement sur trois axes de recherche :
1- L’identification et la caractérisation des isolats de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis
par une étude morphologique des caractères macroscopiques et microscopiques ainsi
que l’influence de quelques facteurs physico-chimiques sur la croissance mycélienne.
2- L’étude du polymorphisme isoenzymatique des isolats de Fusarium oxysporum f.sp.
albedinis par la révélation des protéines totales et de trois systèmes enzymatiques à
savoir : les estérases, les phosphatases acides et les peroxydases.
3- Les effets ou résultats de la lutte contre Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, que ce soit
une lutte chimique par des substances fongicides ou une lutte biologique par l’agent
antagoniste Trichoderma harzianum.
L’expérience menée au Laboratoire, pendant plusieurs mois, sous l’œil vigilant de notre
encadreur, qui fut aussi riche en évènements et leçons que frustrante (notamment l’analyse
électrophorétique), n’est pas sans insuffler une certaine fierté, dans la mesure où, elle nous
a permis de constater de visu, essentiellement, les opérations suivantes :
Le processus infectieux (le pouvoir pathogène),
L’inhibition de la maladie sous l’effet des substances fongicides,
L’effet nettement antagoniste de Trichoderma harzianum contre le Fusarium
oxysporum f.sp. albedinis.
Il faut croire et reconnaitre que des actions substantielles, difficiles et voire
douloureuses ont été menées, avec un dévouement constant, en vue de parvenir aux résultats
souhaités et présenter un travail qui puisse être utile aux lecteurs d’une manière générale et aux
professionnels d’une manière particulière.
Les résultats auraient été meilleurs, n’eussent été :
- La vétusté du matériel et des équipements,
- L’exiguïté du Laboratoire,
- Le travail discontinu (afin de permettre à d’autres étudiantes et étudiants d’effectuer leurs
travaux),
- La rareté de certains produits chimiques.
-95-
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Annexes
Annexes
Annexe n° 01 : Composition des milieux de culture
- Tous les milieux de culture sont stérilisés à l’autoclave à 120 °C pendant 20 minutes sous une
pression de 1 bar.
* Milieu PDA (g/ l) :
Pomme de terre …………………….. 200 g
Glucose …………………….. 20 g
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
- La pomme de terre est épluchée, coupée en petits dés puis cuite dans un litre d’eau distillée.
Après cuisson, le filtrat est récupéré, ajusté à 1000 ml puis ajuster le pH à 5,5.
* Milieu Czapek (g/ l):
Saccharose …………………….. 30 g
KH2PO4 …………………….. 1 g
KCl …………………….. 0,5 g
Na2No3 …………………….. 2 g
MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g
FeSO4 …………………….. 0,1 g
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
pH = 5,6
* Milieu Mathur (g/ l):
Extrait de levure …………………….. 0,5 g
KH2PO4 …………………….. 2,72 g
Peptone …………………….. 1,5 g
MgSO4 7H2O …………………….. 1,23 g
Glucose …………………….. 2,8 g
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
pH = 5,6
-110-
Annexes
* Gélose 2 % :
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
* Milieu SNA (g/ l) :
KH2PO4 …………………….. 1 g
KNO3 …………………….. 1 g
KCl …………………….. 0,5 g
MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g
Glucose …………………….. 0,2 g
Sucrose …………………….. 0,2 g
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
- Placer une à deux pièces de papier filtre stérile par autoclavage (1 cm2), sur la surface du
milieu après qu’il soit gélifié (pour la sporulation et comme autre source de carbone).
* Milieu Davet (g/ l) :
Ca (NO3)2 …………………….. 1 g
CaCl2 …………………….. 1 g
KNO3 …………………….. 250 mg
MgSO4 7H2O …………………….. 250 mg
KH2PO4 …………………….. 125 mg
Saccharose …………………….. 2 g
Acide citrique …………………….. 50 mg
Agar agar …………………….. 25 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
pH = 4,5
-111-
Annexes
Annexe n° 02 : Composition des solutions d’électrophorèse
* Tampon de charge (PAGE) :
Glycérol …………………….. 5 ml
Bleu de bromophénol 1% …………………….. 1 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 10 ml
Le tampon est réparti à raison de 0,5 ml par tube à hémolyse avant d’être conservé au
congélateur jusqu’au moment de l’emploi.
* Tampon de charge (SDS-PAGE) :
(Tris-HCl: 0,125 M; SDS: 4%; Glycérol: 20%; 2- Mercaptoethanol 0,04 %; pH= 6 ,8)
Tris-HCl (0,5 M) …………………….. 1,25 ml
SDS 10 % …………………….. 2 ml
Glycérol …………………….. 5 ml
2- Mercaptoethanol …………………….. 0,5 ml
Bleu de Bromophénol 1 % …………………….. 1 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 10 ml
Le tampon est réparti à raison de 0,5 ml par tube à hémolyse avant d’être conservé au
congélateur jusqu’au moment de l’emploi.
* Tampon de migration :
(Tris : 0,25 M ; Glycine : 1,92 M ; SDS : 0,1 % ; pH=8,3)
Tris …………………….. 3,03 g
Glycine …………………….. 14,4 g
SDS (pour le système SDS-PAGE) …………………….. 1 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
Le tampon est conservé au réfrigérateur.
-112-
Annexes
* Tampon de séparation (Tris-HCl : 1,5 M ; pH = 8,8) :
Tris …………………….. 36,3 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 100 ml
Le pH est ajusté avec environ 24 ml d’HCl 1N, puis complété à 200 ml avec de l’eau
distillée. Après filtration la solution est conservée à 4°C.
* Tampon de concentration (Tris-HCl : 0,5 M ; pH = 6,8) :
Tris …………………….. 3 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 20 ml
Le pH est ajusté avec environ 24 ml d’HCl 1N, puis complété à 200 ml avec de l’eau
distillée. Après filtration la solution est conservée à 4°C.
* Tampon Na-phosphate 0,1 M – pH = 7,1 (1) :
Solution A : KH2PO4, H2O …………… 2,76 g dans 100 ml H2O
Solution B : Na2HPO4, 2 H2O …………… 7,12 g dans 100 ml H2O
Ajuster le pH de la solution A à 7,1 avec la solution B.
* Tampon Acétate 0,05 M – pH = 5 (2) :
Acétate de Sodium, 3H2O …………………….. 3,4 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 475 ml
Ajuster à pH = 5 avec HCl 1N, Compléter à 500 ml avec H2O.
* Solution CaCl2 0,1 M (3) :
CaCl2 …………………….. 1,1 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 100 ml
-113-
Annexes
Annexe n° 03 : Composition des solutions pour la révélation des bandes
protéiques
* Solution de fixation :
Acide acétique …………………….. 200 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
* Solution de coloration :
Bleu de coomassie G250 …………………….. 1,5 g
Ethanol …………………….. 250 ml
Acide acétique …………………….. 40 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
* Solution de décoloration :
Ethanol …………………….. 250 ml
Acide acétique …………………….. 20 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
* Solution de conservation :
Acide acétique …………………….. 70 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
-114-