palmier dattier

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE D’ORAN ES-SENIA

FACULTE DES SCIENCES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

LABORATOIRE DE PHYTOPATHOLOGIE

MEMOIRE

Présenté par

Mlle. GHOMARI Faïza Nawel

POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE MAGISTER

Spécialité : Microbiologie Appliquée

Option : Phytopathologie

Soutenu le : 15-12-2009 Devant le jury composé de :

Mr. SLIMANI M. Professeur à l'Université d'Es-Sénia Président

Mr. HENNI J.E. Professeur à l'Université d'Es-Sénia Rapporteur

Mr. KIHEL M. Professeur à l'Université d'Es-Sénia Examinateur

Mr. GUESSAS B. Maître de Conférences à l'Université d'Es-Sénia Examinateur

Mr. HEDADJI M. Maître de Conférences à l'Université d'Es-Sénia Examinateur

Année Universitaire : 2008 - 2009

« Moyens de Luttes Chimique et Biologique Contre le

Fusarium oxysporum f.sp. albedinis Agent Causal du Bayoud

Chez le Palmier Dattier Phœnix dactylifera L. »

Table des Matières

Table des Matières

Résumé ...................................................................................................................................... ix

Abstract ...................................................................................................................................... x

xi .................................................................................................................... انهخض

Liste des tableaux .................................................................................................................... xii

Liste des figures ..................................................................................................................... xiii

Liste des abréviations ............................................................................................................... xv

Glossaire ................................................................................................................................ xvi

Introduction........................................................................................................................... 2

Première Partie : Synthèse Bibliographique

Chapitre I : Le palmier dattier ............................................................................................... 6

1/ Distribution systématique .................................................................................................. ....6

2/ Description morphologique ................................................................................................... 7

3/ Cycle végétatif ou cycle de développement ....................................................................... 12

4/ Ecologie du palmier dattier ................................................................................................. 13

5/ Multiplication du palmier dattier ........................................................................................ 14

6/ Répartition géographique du palmier dattier ........................................................................ 15

7/ Importance économique du palmier dattier ......................................................................... 15

Chapitre II : L’agent pathogène ........................................................................................... 18

1/ Historique de la taxonomie ................................................................................................ 18

1.1/ Le genre Fusarium ............................................................................................... 18

1.2/ L’espèce oxysporum ............................................................................................. 18

1.3/ La forme spéciale albedinis .................................................................................. 19

2/ Position systématique .......................................................................................................... 19

3/ L’agent pathogène : Fusarium oxysporum f.sp. albedinis ................................................ 20

4/ Description morphologique .................................................................................................. 20

4.1/ Caractères macroscopiques .................................................................................. 20

4.2/ Caractères microscopiques ................................................................................... 22

ii

Table des Matières

Chapitre III : La maladie du « Bayoud » ............................................................................. 24

1/ Historique et progression de la maladie .............................................................................. 24

2/ Symptômes de la maladie .................................................................................................... 26

2.1/ Symptômes externes .............................................................................................. 26

2.2/ Symptômes internes ............................................................................................. 27

3/ Pénétration et progression du champignon dans la plante .................................................. 27

4/ Epidémiologie ..................................................................................................................... 27

5/ Moyens de luttes .................................................................................................................. 28

5.1/ Les mesures prophylactiques ................................................................................ 28

5.2/ Les techniques culturales ...................................................................................... 28

5.3/ La lutte chimique .................................................................................................. 29

5.4/ La lutte biologique ................................................................................................ 29

5.5/ La lutte génétique ................................................................................................. 30

5.6/ la lutte intégrée ..................................................................................................... 30

Deuxième Partie : Matériels et Méthodes

Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte ............................................................ 34

I/ Le parasite et sa culture ....................................................................................................... 34

1.1/ Espèce étudiée ...................................................................................................... 34

1.2/ Echantillonnage et isolement des souches de F.o.a. ............................................ 34

1.3/ Techniques d’isolement de F.o.a. ........................................................................ 34

1.4/ Purification des souches de F.o.a. ........................................................................ 37

1.5/ Identification des souches de F.o.a. .................................................................... 38

1.5.1/ Etude des caractères culturaux .............................................................. 38

1.5.2/ Etude des caractères microscopiques ................................................... 38

1.6/ Etude physiologique des souches de F.o.a. .......................................................... 39

1.6.1/ Influence de la température ................................................................... 40

1.6.2/ Influence des sources carbonées ............................................................ 40

1.6.3/ Influence des sources azotées ................................................................ 40

1.6.4/ Influence de la lumière .......................................................................... 40

1.6.5/ Influence du pH du milieu ..................................................................... 40

1.6.6/ Influence de l’humidité ........................................................................... 41

iii

Table des Matières

1.7/ Conservation des souches de F.o.a. ..................................................................... 42

II/ L’hôte et sa culture ............................................................................................................. 42

2.1/ Espèce étudiée ...................................................................................................... 42

2.2/ Préparation des plantules de palmier .................................................................... 42

2.2.1/ Germination des noyaux de dattes ......................................................... 42

2.2.2/ Plantation des noyaux de dattes ............................................................. 42

2.2.3/ Préparation de la solution nutritive (Solution KNOP) .......................... 44

2.3/ Etude du pouvoir pathogène ................................................................................. 44

2.3.1/ Préparation de l’inoculum ..................................................................... 44

2.3.2/ Inoculation des plantules au niveau du système racinaire ..................... 44

2.3.3/ Réisolement du parasite ......................................................................... 45

Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique ................................................... 47

I/ Dosage des protéines totales des isolats de F.o.a. ............................................................... 47

1.1/ Préparation des extraits mycéliens ....................................................................... 47

1.1.1/ Culture du champignon ......................................................................... 47

1.1.2/ Obtention des extraits ............................................................................ 47

1.2/ Principe du dosage des protéines .......................................................................... 47

1.2.1/ Composition du Réactif de Bradford ..................................................... 48

1.2.2/ Courbe d’étalonnage ............................................................................. 48

II/ Électrophorèse .................................................................................................................... 48

2.1/ Préparation des gels pour le système PAGE ........................................................ 48

2.2/ Migration et mise sous tension ........................................................................... 49

2.3/ Révélation des systèmes isoenzymatiques ........................................................... 50

2.4/ Isoenzymes étudiés ................................................................................................ 51

2.5/ Préparation des gels pour le système SDS-PAGE ............................................... 52

2.6/ Dénaturation des échantillons .............................................................................. 52

2.7/ Révélation des bandes .......................................................................................... 52

Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte ........................................ 54

I/ Lutte chimique contre L’isolat F13 de F.o.a. ...................................................................... 54

1.1/ Les fongicides testés ................................................................................................. 54

1.2/ Préparation des solutions de fongicides .................................................................... 54

iv

Tables des Matières

1.3/ Test sur milieu solide ............................................................................................... 55

II/ Lutte biologique .................................................................................................................. 57

2.1/ Provenance de l’agent antagoniste testé .................................................................... 57

2.2/ Test de l’activité antagoniste in vitro ........................................................................ 57

2.2.1/ Confrontation par contact direct sur milieu de culture ................................... 58

2.2.2/ Activité des filtrats de culture ......................................................................... 58

Troisième partie : Résultats et Discussions

I/ Isolement du champignon ................................................................................................... 62

II/ Identification des souches de F.o.a. ................................................................................... 62

2.1/ Aspect morphologique .............................................................................................. 62

2.2/ Caractères microscopiques ........................................................................................ 66

2.3/ Effet des différents milieux de culture ..................................................................... 66

III/ Etude physiologique de F.o.a. ........................................................................................... 70

3.1/ Influence de la température ....................................................................................... 70

3.2/ Influence des sources carbonées ............................................................................... 70

3.3/ Influence des sources azotées ................................................................................... 70

3.3/ Influence de la lumière .............................................................................................. 70

3.4/ Influence du pH du milieu ........................................................................................ 70

3.5 Influence du taux d’humidité ..................................................................................... 73

IV/ Estimation du pouvoir pathogène ..................................................................................... 73

V/ Dosage des protéines des isolats de F.o.a. ......................................................................... 75

VI/ Électrophorèse ................................................................................................................... 75

6.1/ Estérases .................................................................................................................... 75

6.2/ Phosphatases ............................................................................................................. 75

6.3/ Peroxydases ............................................................................................................... 75

6.4/ Protéines totales ........................................................................................................ 75

VII/ Lutte chimique contre l’isolat F13 de F.o.a. .................................................................. 79

XI/ Lutte biologique contre l’isolat F13 de F.o.a. .................................................................. 83

8.1/ L’agent antagoniste ................................................................................................... 83

8.2/ Test de l’activité antagoniste de Trichoderma harzianum ........................................ 84

v

Tables des Matières

Discussions .......................................................................................................................... 89

Conclusion ............................................................................................................................ 95

Références Bibliographiques ........................................................................................ 97

Annexes .............................................................................................................................. 110

vi

Remerciements

En mon nom personnel,

Mes premiers remerciements iront à Dieu le tout puissant pour m’avoir aidé

à suivre mes études universitaires et à les corroborer par le présent mémoire.

Mes vifs remerciements s’adressent à mes très chers parents qui ont été

toujours présents quand il le faut.

Que Mr. HENNI J.E., Professeur à la Faculté des Sciences, Département

de Biologie à l’Université d’Oran, veuille bien accepter mes remerciements les plus

sincères pour l’accueil qu’il m’a réservé durant la réalisation de ma thèse au sein de

son Laboratoire de Phytopathologie, à l’Université d’Oran au Département de

Biologie, et la mise à ma disposition des moyens nécessaires pour le déroulement

correct de mon travail.

Je remercie Mr. KARKACHI N., Maître assistant à l’Université d’Oran,

pour son suivi efficace et rigoureux. Je le remercie chaleureusement pour son aide,

sa disponibilité qu’il a constamment montrée à mon égard, son guide précieux et

ses conseils judicieux. Qu’il trouve ici l’expression de ma gratitude et de mon

profond respect.

Je tiens à remercier vivement Mme GHARBI KARKACHI S., Maître

assistante à l’Université Mohamed Boudiaf d’Oran (U.S.T.O.), pour son aide

précieuse, sa rigueur scientifique, ses conseils avisés et ses encouragements

permanents. Qu’elle me soit permise de lui prouver ma profonde reconnaissance.

Je suis très sensible à l’honneur que me fait Mr. SLIMANI M., Professeur

à l’Université d’Oran, qui a bien voulu accepter de présider ce Jury. Qu’il veuille

bien accepter l’expression de mes sincères remerciements.

Je remercie Mr. KIHEL M., Professeur à l’Université d’Oran et Mr.

HADADJI M., Maître de Conférences à l’Université d’Oran, qui ont accepté

d’examiner ce travail. Qu’ils trouvent ici le témoignage de mon profond respect.

Je tiens à remercier tout particulièrement Mr. GUESSAS B., Maître de

Conférences à l’Université d’Oran, qui accepte de juger ce travail. Qu’il trouve ici

l’expression de ma respectueuse gratitude et de mon profond respect.

Mes remerciements s’adressent également à toute l’équipe du Laboratoire de

Phytopathologie et tous mes encouragements à ma promotion de Magister.

Je suis particulièrement reconnaissante à mes collègues Mohamed D. Amina

A., Malika G., et Zakia H., pour leur disponibilité exceptionnelle, leur aide

physique, leurs encouragements et surtout leurs soutien moral.

Je remercie enfin, tout ce qui ont contribué de prés ou de loin et qui ont pris

une part active à la réalisation de ce travail, ainsi que tous ceux qui j’aurais pu

oublier et qui se reconnaitront dans la collaboration apportée à la réalisation de ce

travail.

Faïza Nawel GHOMARI

Résumé

Le Bayoud est une fusariose vasculaire spécifique du palmier dattier (Phœnix

dactylifera L.), due à un champignon tellurique, le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis.

Généralement les orientations de lutte sont identiques à celles adoptées contre toutes les

fusarioses vasculaires.

Notre travail à porter sur l’isolement de 20 souches de champignon appartenant au

genre Fusarium et à identifier 06 souches d’entre elles de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.

La virulence de ces souches est confirmée par le test de pathogénicité.

Après l’isolement et la purification, la caractérisation morphologique indique

l’existence de trois morphotypes mycéliens différents, type cotonneux, type duveteux et type

ras muqueux. En outre, les observations microscopiques, montrent la présence des trois spores

caractéristiques d’un Fusarium.

L’étude physiologique du champignon, révèle une croissance meilleure sur le milieu

PDA à pH 5, avec une température optimale de 28 °C sous une photopériode de 12 heures. La

source de carbone favorable à la croissance est représentée par les monosaccharides et la

source d’azote par les nitrates de potassium et de sodium.

L’étude du polymorphisme isoenzymatique, par la révélation de trois systèmes à savoir :

les estérases, les phosphatases acides et les peroxydases, montre une similarité des profils

électrophorétiques chez les isolats de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.

Les essais d’une lutte chimique d’une part, contre le Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis, par l’utilisation in vitro de 20 substances fongicides incorporées au milieu PDA

solide avec différentes concentrations (50-100-200 et 400 ppm), révèle la présence d’une

activité inhibitrice de quelques substances sur la croissance de la colonie du champignon.

D’autre part, une lutte biologique in vitro avec le Trichoderma harzianum, comme agent

antagoniste, que ce soit d’une façon directe sur milieu de culture ou par activité des filtrats de

culture, montre une inhibition de la croissance mycélienne du pathogène testé.

Mots clés :

Palmier dattier, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, pouvoir pathogène, identification, profils

électrophorétique, lutte chimique, lutte biologique, Trichoderma harzianum.

ix

Abstract

Bayoud is one specific vascular fusariose of the date palm (Phœnix dactylifera L.), due

to a telluric fungi, the Fusarium oxysporum f.sp. albedinis. Generally the orientations of fight

are identical to those adopted against all vascular fusarioses.

Our work to be concerned the isolation of 20 strains of fungi belonging to the genre

Fusarium and to identify 06 stumps of them of Fusarium oxysporum f.sp. albedinis. The

virulence of these stumps is confirmed by the test of pathogenicity.

After the isolation and the purification, the morphological characterization indicates the

existence of three different typical morphotypes typical lifeless, downy and typical short

mucous. Besides, the microscopic observations show the presence of three characteristic spores

of Fusarium.

The physiological study of the fungi strains reveals a better growth on the PDA medium

with pH 5, with an optimal temperature of 28 °C under a photoperiod of 12 hours. The source

of carbon favorable to the growth is represented by monosaccharides and the source of nitrogen

by nitrates of potassium and sodium.

The study of the isoenzymatique polymorphism, by the revelation of three systems

namely: esterase, acid phosphatases and peroxydases, shows a similarity of the electrophoretic

profils for strains of Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.

The essays of a chemical fight, on one hand, against Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis, by the in vitro use of 20 fungicidal substances incorporated in the middle solid PDA

with various concentrations (50-100-200 and 400 ppm), reveals the presence of an inhibition

activity of some substances on the growth of the colony of the fungi.

On the other hand, an in vitro biological fight with Trichoderma harzianum, as

opposing agent, whether it is in a direct way on middle of culture or by activity of the filtrats of

culture, show an inhibition of the growth mycelien of pathogenic tested.

Keywords :

Date palm, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, pathogenic power, identification,

electrophoretic profils, chemical fight, biological fight, Trichoderma harzianum.

x

الملخص

، يصذر فؽز .Phoenix dactylifera L))يزض خاص تأشجار انخيم انذتل انػائي إ

انرجياخ في يكافحر يرشاتح يغ ذهك انرثاخ . Fusarium oxysporum f.sp. albedinsأرظي،

.ػيا ظذ كم أاع انذتل انػائي

حر Fusarium يصذر ي انفؽز انحذر ي جض 20ذزكشخ انرجارب انري قا تا ػه ػشل

ذأ كيذ قذرذ انرزيعيح Fusarium oxysporum f.sp. albedinis يصا در ي 06ظرؽيغ ذحذيذ

.ي خالل اخرثاراخ انكشف ػ انفيزص

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.Fusariumانفؽز

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.تانظكزياخ األحاديح انيرزجي يصذر رزاخ انثذاطيى أ انصديو

دراطح ذؼذد انشاغ اإلشيي، ػ ؼزيق إظار األظح انثالثح، إشيى األطرزج حط إشيى إ

.Fusarium oxysporum f.sp يانفطفر انثيزكظيذاس، أظز ذاطق األشكال نهؼياخ انؼشنح

albedinis.

20 تإطرؼالFusarium oxysporum f.sp. albedinis ذجارب انكافحح انكييائيح، ظذ ذكشف

in vitro يثيذ نهفؽز 200 -100 -50) ترزاكيش يخرهفح (PDA) ، انذيجح في طػ ان

400ppm )،انفؽزػه . جد يثثػ نثؼط اناد ػه

كؼايم Trichoderma harzianumتإطرؼال (in vitro)ي جح أخز، انكافحح انثينجيح

تؽزيقح يثاشزج في انطػ انشراػي أ ػ ؼزيق يفؼل انطػ انرجزيثي انزشح، أظزخ يعاد، طاء

. انؼياخ انخرثزج ذثثيػ ان ػذ

: مفتاحيةالكلمات ال

، انرصيف، انقذرج انرزيعيح، انجزج Fusarium oxysporum f.sp. albedinisشجزانخيم،

. arzianumh Trichoderma انكافحح انكييائيح، انكافحح انثينجيح،،انكزتائيح

xi

Liste des Tableaux

Tableau n° 01 – Production mondiale des dattes .................................................................... 16

Tableau n° 02 – Sites d’échantillonnages et souches isolées de Fusarium ........................... 35

Tableau n° 03 – Dilutions de la courbe d’étalonnage ............................................................. 48

Tableau n° 04 – Composition des gels de polyacrylamide ..................................................... 49

Tableau n° 05 – Les mélanges réactionnels pour les révélations enzymatiques ..................... 50

Tableau n° 06 – Les substances fongicides testées contre l’isolat F13 de F .o.a. .................. 54

Tableau n° 07 – Provenance des souches T1 et T2 de Trichoderma harzianum ..................... 57

Tableau n° 08 – Différents morphotypes rencontrés chez F.o.a. et Fusarium de la rhizosphère

du palmier dattier ......................................................................................... 63

Tableau n° 10 – Diamètre moyen (cm) des cinq isolats sur les trois milieux de culture ........ 69

Tableau n° 11 – Pourcentage de mortalité des plantules de palmier dattier ........................... 73

Tableau n° 12 – Densité optique (D.O.) de chaque dilution ................................................... 76

Tableau n° 13 – Densité optique (D.O.) et concentration en protéines dans chaque extrait

enzymatique des isolats de F.o.a. ................................................................ 76

Tableau n° 14 – Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la première série des

substances fongicides ................................................................................... 80

Tableau n° 15 – Taux d’inhibition (%) de la première série des substances fongicides contre

l’isolat F13 ................................................................................................... 80

Tableau n° 16 – Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la deuxième série des


Tableau n° 17 – Taux d’inhibition (%) de la deuxième série des substances fongicides contre

l’isolat F13 ................................................................................................... 81

Tableau n° 18 – Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la troisième série des


Tableau n° 19 – Taux d’inhibition (%) de la troisième série des substances fongicides contre

l’isolat F13 ................................................................................................... 82

Tableau n° 20 – Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux d’inhibition (%) des

différentes souches de Trichoderma par contact direct .............................. 84

Tableau n° 21 – Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux d’inhibition (%) des

différentes souches de Trichoderma par action des filtrats de culture ......... 85

xii

Liste des Figures

Figure n° 01 – Construction schématique d’un palmier dattier ................................................ 8

Figure n° 02 – Les quatre types de racines d’un palmier dattier ............................................... 8

Figure n° 03 – Schéma d’une palme ......................................................................................... 9

Figure n° 04 – Une inflorescence du palmier dattier .............................................................. 11

Figure n° 05 – Spathe mâle et spathe femelle ......................................................................... 11

Figure n° 06 (a) – Une fleur femelle ....................................................................................... 11

Figure n° 06 (b) – Une fleur mâle ........................................................................................... 11

Figure n° 07 – Fruit et graine du palmier dattier ..................................................................... 11

Figure n° 08 – Aspect sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis ................................ 21

Figure n° 09 – Macroconidies et microconidies de Fusarium oxysporum .............................. 22

Figure n° 10 – Situation épidémiologique du « Bayoud » du palmier dattier ......................... 25

Figure n° 11 – Symptômes de la maladie du « Bayoud » ....................................................... 26

Figure n° 12 – Symptôme unilatéral du « Bayoud

» sur une palme infectée ........................... 36

Figure n° 13 – Isolement du champignon à partir de rachis infecté sur milieu PDA ............. 36

Figure n° 14 – Germination d’un noyau de datte .................................................................... 43

Figure n° 15 – Schéma de la méthode de mesure du diamètre dans les deux sens

perpendiculaires ............................................................................................. 56

Figure n° 16 – Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par contact direct sur milieu de

culture ............................................................................................................. 59

Figure n° 17 – Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par l’activité des filtrats de

culture ............................................................................................................. 59

Figure n° 18 – Représentations des différents morphotypes rencontrés ................................. 64

Figure n° 19 – Représentation des différents aspects morphologiques des isolats de F.o.a ... 65

Figure n° 20 – Observations au microscope optique des trois types de spores de F.o.a. au

grossissement (X 400) .................................................................................... 67

Figure n° 21 – Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu PDA ................................ 68

Figure n° 22 – Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu Czapeck .......................... 68

Figure n° 23 – Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu Mathur ............................ 68

Figure n° 24 – Représentation graphique de l’influence des différents milieux de culture sur la

croissance des isolats de F.o.a. ..................................................................... 69

Figure n° 25 – Représentation graphique de l’influence des températures sur la croissance de

l’isolat F13 ...................................................................................................... 71

xiii

Figure n° 26 – Représentation graphique de l’influence de la source de carbone sur la

croissance de l’isolat F13 ............................................................................... 71

Figure n° 27 – Représentation graphique de l’influence de la source d’azote sur la croissance

de l’isolat F13 ................................................................................................. 71

Figure n° 28 – Représentation graphique de l’influence d’éclairage sur la croissance de l’isolat

F13 .................................................................................................................. 71

Figure n° 29 – Représentation graphique de l’influence du pH du milieu sur la croissance de

l’isolat F13 ...................................................................................................... 72

Figure n° 30 – Représentation graphique de l’influence du taux d’humidité sur la croissance de

l’isolat F13 ...................................................................................................... 72

Figure n° 31 – Différents symptômes notés chez les plantules de palmier dattier ................. 74

Figure n° 32 – Courbe d’étalonnage ....................................................................................... 76

Figure n° 33 – Profil électrophorétique des estérases chez les isolats de F.o.a ...................... 77

Figure n° 34 – Profil électrophorétique des phosphatases chez les isolats de F.o.a ............... 77

Figure n° 35 – Profil électrophorétique des peroxydases chez les isolats de F.o.a. ............... 78

Figure n° 36 – Profil électrophorétique des protéines totales chez les isolats de F.o.a. ......... 78

Figure n° 37 – Effet de la substance fongicide (P2) à différentes concentrations sur la

croissance mycélienne de l’isolat F13de F.o.a. ............................................. 79

Figure n° 38 – Représentation graphique du diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté

avec la première série des substances fongicides ........................................... 80


avec la deuxième série des substances fongicides ......................................... 81


avec la troisième série des substances fongicides .......................................... 82

Figure n° 41 – Culture de Trichoderma harzianum sur milieu Davet ................................... 83

Figure n° 42 – Observation au microscope optique de Trichoderma harzianum (G x 400) . 83

Figure n° 43 – Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. en contact direct avec les différentes

souches de Trichoderma pendant 4 jours d’incubation .................................. 84

Figure n° 44 – Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. sous l’action des filtrats de culture

des différentes souches de Trichoderma pendant 4 jours d’incubation ......... 85

Figure n° 45 – Taux d’inhibition (%) de Trichoderma harzianum contre les isolats de F.o.a.

pour les deux techniques de confrontations ................................................... 85

Figure n° 46 – Contact direct sur milieu de culture entre Trichoderma harzianum et F.o.a .. 86

Figure n° 47 – Action des filtrats de culture de Trichoderma harzianum sur la croissance de

F.o.a. .............................................................................................................. 86

xiv

Liste des Abréviations

% : pourcent

°C : Degré Celsius

µl : microlitre

µm : micromètre

CLA : Carnation Leaf Agar

Cm : centimètre

CMI50 : Concentration Minimale Inhibitrice

D.O. : Densité Optique

Est : Estérase

F.o.a. : Fusarium oxysporum f.sp. albedinis

f.sp. : forme spéciale

g/L : grammes / Litre

M : Molaire

mA : milliampère

mg : milligramme

ml : millilitre

mm : millimètre

nm : nanomètre

PAC : Phosphatase Acide

PAGE : Poly Acrylamide Gel Electrophoresis

PDA : Potato Dextrose Agar

pH : potentiel d'Hydrogène

Pox : Peroxydase

ppm : partie par million

q.s.p. : quantité suffisante pour

SDS : Sodium Dodécyl Sulfate

Glu : Glucose

Mal : Maltose

Amid : Amidon

Tém : Témoin

Asn : Asparagine

Ec. con : Eclairage continu

Ob. con : Obscurité continue

Photo. 12h : Photopériode de 12 heures

xv

Glossaire

Aisselle : Région située au-dessous de l’insertion d’une feuille sur la tige, au

sommet de l’angle qu’elle forme avec la tige.

Axillaire : Se dit d’un mode de placentation dans lequel les graines paraissent

groupées sur l’axe de l’ovaire.

Bractée : Petite feuille de forme spéciale à la base du pédoncule floral.

Carpelle : Chacune des pièces florales dont l’ensemble soudé forme le pistil des

fleurs.

Corné : Qui a l’apparence de la corne.

Fasciculée : Racine fasciculée, est celle où l’on ne peut distinguer l’axe principal ou

pivot.

Inflorescence : Mode de regroupement des fleurs sur une plante.

Lancéolée : Se dit d’un organe terminé en forme de lance.

Pénée : Se dit des feuilles et des folioles disposés de l’un et de l’autre côté d’un

pétiole commun.

xvi

Introduction

Introduction

Le palmier dattier

«Phœnix dactylifera L.

» est un arbre cultivé principalement dans les zones

arides ou désertiques de l’Afrique du Nord et du Moyen Orient.

En Algérie, précisément au Sahara, le palmier dattier représente l’arbre fruitier par

excellence, puisqu’il a constitué et constitue toujours la base alimentaire des populations de

cette région.

Il assure la production de dattes -fruit au contenu sucré important- et donc il est une source

de revenus (trocs, échanges commerciaux, exportation).

Du point de vue écologique, le palmier dattier permet de :

stabiliser les sols fragiles,

lutter contre les vents,

créer, surtout, sous son couvert, un microclimat favorable à la culture de certains arbres

fruitiers et aussi à toutes autres cultures céréalières, fourragères ou maraîchères.

De plus, toutes les parties du palmier dattier (tronc, palmes, noyau du fruit,...) peuvent être

utilisées pour différents buts et dans différents domaines : industriel, agricole, élevage,

construction, fabrication de meubles, de cordes et de matériel d’emballage (Hodel

et Johnson, 2007).

Si pendant très longtemps le palmier dattier a constitué le pilier sur lequel a reposé tout

l’écosystème oasien, cet arbre symbole se trouve menacé depuis l’apparition d’une fusariose

vasculaire mortelle. Il s’agit d’une maladie cryptogamique, la plus grave et la plus dévastatrice,

appelée localement « Bayoud ». Cette trachéomycose est causée par un champignon du sol : le

Fusarium oxysporum f.sp. albedinis (Djerbi, 1991).

Depuis l’apparition de cette maladie (1898) dans les palmeraies de Figuig au Maroc et Béni

Ouenif (Béchar) en Algérie, plus de 12 Millions de palmiers dattiers ont été détruits dans ces 02

pays (Ouinten, 1996). C’est un véritable fléau des zones phœnicicoles de l’Afrique du Nord et

une menace qui pèse sur cette richesse naturelle et notamment la variété « Deglet Nour

» très

prisée dans les pays Européens.

La stratégie de lutte contre « le Bayoud

» menée par les pouvoirs publics (Ministère de

l’Agriculture, Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique, Instituts

spécialisés...), s’articule principalement sur des approches complémentaires à savoir :

-2-

Introduction

l’arrêt ou plus ou moins le ralentissement de la maladie, la sélection de cultivars ou de

clones résistants au « Bayoud

» mais ayant une bonne rentabilité et qualité dattière et enfin la

multiplication par voie rapide du matériel végétal sélectionné par la culture in vitro et sa

diffusion (Bulit et al., 1967 ; Louvet et Toutain, 1973 ; Saaïdi, 1979 ; Djerbi, 1982 et 1991).

Si depuis plusieurs décennies, de nombreuses études, recherches ou expériences ont été

menées par des spécialistes, des chercheurs,..., en vue d’élucider les causes, les comportements

de l’agent pathogène, sa propagation,..., avec des résultats non négligeables, la solution radicale

n’est pas encore trouvée et donc le domaine de la recherche demeure toujours ouvert.

A la lumière de ces nombreuses études, recherches ou expériences et sur la base des

conclusions auxquelles elles ont débouché, nous avons jugé utile de poursuivre la recherche

dans une suite purement logique, aidés en cela par notre encadreur et certains de nos

Professeurs qui se sont intéressés à ce domaine – que nous remercions vivement – en vue

d’apporter une modeste contribution.

Ainsi nous avons opté pour le thème suivant : « Moyens de luttes chimique et biologique

contre le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis agent causal du Bayoud chez le palmier dattier

(Phœnix dactylifera L.) »

Notre étude est subdivisée en trois (03) parties :

La première partie revêt un caractère théorique en vue de familiariser le lecteur d’une

part, au palmier dattier, son cycle de développement, sa multiplication,..., et d’autre part

à l’agent pathogène, la maladie du « Bayoud

» et les moyens de lutte contre cette

maladie.

La seconde partie repose sur un travail pratique mené au laboratoire et qui s’intègre

dans le cadre des études consacrées à l’agent pathogène Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis, en vue d’évaluer un essai de moyens de lutte in vitro contre ce champignon

par quelques substances fongicides pour la lutte chimique et par l’agent antagoniste

(Trichoderma harzianum), pour la lutte biologique.

Dans la troisième partie, nous nous efforcerons de présenter les observations et les

conclusions obtenues au laboratoire.

-3-

Première Partie : Synthèse Bibliographique

Chapitre I :

Le palmier dattier

Synthèse Bibliographique Chapitre I : Le Palmier Dattier

Le palmier dattier porte le nom latin «Phœnix dactylifera

» est aussi

«date palm

» en anglais et

«nakhil

» en arabe. Cette appellation botanique donnée par Linné depuis 1734, est

vraisemblablement dérivée du mot «Phœnix

», nom donné par les Grecs de l’antiquité à cet

arbre qu’ils considéraient comme l’arbre des phœniciens, ou phoinikes en grec. Quant à

«dactylifera

», cet adjectif dérive de

«daktylus

», qui signifie un doigt et illustre la forme du fruit

du palmier dattier, qu’est la datte (Zaïd, 2002).

1/ Distribution systématique :

Le palmier dattier comme son nom l’indique, appartient à l’une des plus grandes familles

d’angiospermes monocotylédones, celle des Palmaceae ou Arecaceae, représentée par 200

genres et 2700 espèces, répartie en six sous-familles. La sous-famille des Coryphoïdeae est elle

même subdivisée en trois tribus. Le palmier dattier fait partie de la tribu des Phœniceae qui ne

comporte qu’un seul genre : «Phœnix

» (Bounaga, 1991). Douze espèces appartiennent à ce

genre, mais cinq seulement d’entre elles, en dehors du palmier dattier, sont à fruits

consommables : P. atlantica, P. reclinata, P. farinifera, P. humilis et P. acoulis (Munier,

1973).

La classification du palmier dattier donnée par Djerbi (1994), est la suivante :

Groupe : Spadiciflora

Embranchement : Angiospermes

Classe : Monocotyledones

Ordre : Palmales

Famille : Palmaceae

Tribu : Phœniceae

Genre : Phœnix

Espèce : Phœnix dactylifera L.

-6-


2/ Description morphologique :

L’allure la plus commune et la plus connue du palmier dattier est arborescente

monocotylédone, avec un tronc ou stipe monopodique (non ramifié et unique), très élancé,

vertical et cylindrique de couleur brune, pouvant atteindre 30 à 40 mètre de haut et portant au

sommet une couronne de feuilles ou palmes, pennées de 4 à 7 mètres de longueur (Figure

n° 01). L’espèce est dioïque et porte des inflorescences mâles et femelles. Une seule fleur est

fécondée, se développe et forme le fruit : la datte (Hadjari et Kadi Hanifi, 2005).

2.1/ Le système radiculaire :

La partie souterraine du palmier dattier est formée d’un bulbe ou plateau racinaire,

volumineux, qui émerge en partie au dessus du niveau du sol, et à partir duquel, partent des

racines fasciculées, c'est-à-dire, disposées en faisceaux, peu ramifiées et n’ayant relativement

que peu de radicelles (Ouinten, 1996).

Le schéma (Figure n° 02) fait apparaître trois grands types de racines répartis en quatre

zones d’enracinement : les racines de respiration (Zone I), les racines de nutrition (Zone II) et

les racines d’absorption (Zone III et IV) :

- Zone I : se sont les racines respiratoires, de 0 à 20 cm et même jusqu’à 150 cm au-dessus du

sol. Comme leur nom l’indique, ces racines servent aux échanges gazeux pour le palmier

dattier.

- Zone II : se sont les racines de nutrition, allant de 20 à 100 cm et constituent la plus forte

proportion de racines du système. Elles sont obliques ou horizontales.

- Zone III : se sont les racines d’absorption, qui peuvent rejoindre le niveau phréatique à une

profondeur allant de 1 à 2 mètres. Leur fonction est de chercher l’eau.

- Zone IV : se sont les racines d’absorption en profondeur, caractérisées par un géotropisme

positif très accentué. La profondeur de ces racines dépasse les 15 mètres (Munier, 1973 ;

Djerbi, 1994 ; Peyron, 2000).

-7-


Figure n° 01 : Construction schématique d’un palmier dattier

(Munier, 1973; Peyron, 2000).

Figure n° 02 : Les quatre types de racines d’un palmier dattier (Peyron, 2000).

-8-


2.2/ Le système végétatif :

2.2.1/ Le tronc :

Appelé plus justement « stipe », il est cylindrique, c'est-à-dire d’un même diamètre de bas en

haut. Composé à l’intérieur par de nombreux faisceaux libéro-ligneux enchevêtrés entre eux, et

est engainé à l’extérieur -de manière visible-, par les bases pétiolaires qui restent collées après

la mort de la palme et qui assurent une protection au tronc. Leur présence permet de grimper

vers le sommet du palmier dattier.

Le tronc possède un seul bourgeon terminal appelé « phyllophore ou apex », qui assure la

croissance verticale du palmier dattier (Zaïd, 2002).

2.2.2/ La couronne :

On dénombre 50 à 200 palmes chez un palmier dattier adulte, l’ensemble des palmes vertes

forme la couronne ou frondaison, selon la décomposition suivante :

- La couronne basale, formée des palmes les plus âgées,

- La couronne centrale, formée des palmes en pleine activité (adultes),

- Les palmes du cœur, dont celles non encore ouvertes sont dites « en pinceau » (Peyron, 2000).

2.2.3/ Les palmes :

Les palmes sont des feuilles composées pennées qui s’incèrent sur le stipe en hélices très

rapprochées, formant ainsi plusieurs couronnes. Leurs bases forment le pétiole ou rachis, de

consistance ligneuse et de limbe épineux à la base, mais porte des folioles dans les deux tiers

supérieurs disposés régulièrement en position oblique le long du rachis (Figure n° 03) (Ouinten,

1996).

Figure n° 03 : Schéma d’une palme (Peyron, 2000).

-9-


2.2.4/ Les inflorescences :

* Les organes floraux :

Le palmier dattier est une plante dioïque, c'est-à-dire que les organes mâles et les organes

femelles sont portés par des pieds (individus) séparés ; palmiers mâles (dokkars) ou palmiers

femelles (nakhla). Seuls les dattiers femelles donnent les fruits.

Les inflorescences du palmier dattier, se développent parmi les feuilles et naissent de la

germination des bourgeons axillaires, situés à l’aisselle de celles-ci dans la région coronaire du

tronc (Figure n° 04). L’inflorescence est caractéristique, c’est une grappe d’épis, enveloppée et

protégée par une grande bractée membraneuse close de forme allongée, dite : spathe (Figure n°

05) (Peyron, 2000).

** Les fleurs :

Les fleurs monosexuées sur la plante dioïque, sont petites, de couleur blanchâtre, sensibles,

quasi sessiles, sans pédoncules, portées par des pédicelles ou épillets, qui sont à leur tour portés

par un axe charnu dit : hampe ou spadice (Figure n° 04).

Les fleurs mâles sont un peu plus allongées que les fleurs femelles (Figure n° 06 a et b).

Elles possèdent six étamines, qui à leur maturité, s’ouvrent et libèrent des grains de pollen.

Quant aux fleurs femelles, sont globulaires et ont un ovaire de trois carpelles indépendants

comportant chacun un ovule. Un seul ovule par fleur est fertilisé et peut mener au

développement des fruits, les deux autres disparaissent (Peyron, 2000).

2.2.5/ La fructification :

Les fruits, communément appelés « dattes », sont des baies oblongues ou ovoïdes parfois

même sphériques, de couleur jaune clair à brun plus ou moins foncé, longues jusqu’à 8 cm, leur

poids varie de quelques grammes à plus de 50 g, contenant une pulpe sucrée et une seule

graine, lisse, de consistance ligneuse, avec un sillon ventral et un embryon dorsal

(Figure n° 07) (Peyron, 2000).

-10-


Figure n° 07 : Fruit et graine du palmier dattier (Peyron, 2000).

Figure n° 06 (a) : Une fleur femelle

(Peyron, 2000).

Figure n° 06 (b) : Une fleur mâle

(Peyron, 2000).

hampe ou spadice

Figure n° 04 : Une inflorescence du

Palmier dattier (Peyron, 2000).

Figure n° 05 : Spathe mâle et spathe femelle

(Peyron, 2000).

Hampe ou spadice

-11-


3/ Cycle végétatif ou cycle de développement :

Le palmier dattier ou le genre Phœnix, est unique dans sa morphologie et dans son

développement, puisque cinq phases sont possibles à distinguer durant la croissance d’un

palmier dattier. Ces dernières sont séparées sur la base de critères morphologiques, alors

qu’elles ne sont en réalité que des périodes physiologiques :

- Stade I : La graine

Elle possède un albumen (endosperme) dur et corné, dont l’embryon est toujours très petit par

rapport à l’albumen (2 à 3 mm).

- Stade II : Phase germinative

A ce stade, la plantule ou la germination vit sur les réserves de l’albumen. La première feuille

est linéaire et lancéolée, cette forme est l’une des caractéristiques du genre Phœnix.

- Stade III : Construction de la plantule

Cette phase « post germinative » est la plus importante dans le cycle d’un palmier dattier, car

elle aboutit à la formation de l’axe primaire. La plante devient autotrophe et son système

vasculaire commence à se construire. On peut l’appeler aussi « phase d’établissement »,

puisqu’une série de feuilles à limbe para-penné puis penné s’incèrent d’une manière spiralée.

- Stade IV : Phase adulte végétative

Durant cette phase qui peut durer 3 à 8 ans, le palmier dattier construit son tronc, produit des

feuilles et accumule des réserves. Le tronc couvert par les bases pétiolaires des feuilles

anciennes mortes et/ou coupées, peut atteindre 20 à 30 m de haut et environ 1 m de diamètre.

- Stade V : Phase adulte reproductive

Entre la 5éme

et la 8éme

année voir même la 10éme

, le palmier dattier commence à produire des

inflorescences. Ce n’est qu’à ce stade qu’on peut reconnaître le sexe, qu’il soit un palmier mâle

ou femelle (Riedacker, 1990 ; Bounaga 1991).

-12-


4/ Ecologie du palmier dattier :

Le palmier dattier est cultivé comme arbre fruitier dans les régions arides et semi arides du

globe, caractérisées par des étés longs et chauds et un très bas niveau d’humidité relative

(Peyron, 2000). Cet arbre peut s’adapter à de nombreuses conditions, grâce à sa grande

variabilité. Différents facteurs climatiques (température, humidité, lumière, pluies et vent..) et

même édaphiques, sont très importants pour pouvoir déterminer la convenance d’un

emplacement spécifique pour la culture d’un palmier dattier (Zaïd, 2002). Pour cela, et pour

donner une production normale, un palmier dattier doit bénéficier des paramètres suivants :

1. d’un climat chaud, sec et ensoleillé :

Le point 0 de la végétation est estimé à + 10° C, entre 10° et 40° C, le palmier dattier est en

activité végétative, mais le maximum de cette dernière s’observe pour des températures

comprises entre 32° et 38° C. La haute limite de végétation est de + 45° C. Toutefois, à 65° C

le palmier dattier ne semble pas souffrir, s’il est correctement irrigué (CIRAD et GRET, 2002).

Les pluies ont une action néfaste, surtout lorsqu’elles sont violentes. Elles peuvent entrainer

le pollen, abaisser les températures et favoriser les maladies cryptogamiques. Quant aux vents,

ils ont une action mécanique et desséchante. Ils peuvent provoquer la chute des fruits, la

cassure des hampes des inflorescences et la propagation de quelques prédateurs du palmier

dattier.

Le palmier dattier est une espèce héliophile, c'est-à-dire, qui aime le soleil et la disposition

des folioles sur les palmes favorise la photosynthèse (Peyron, 2000).

2. d’une alimentation en eau suffisante :

Le choix des zones de plantation dépend strictement des ressources hydriques (nappes

phréatiques) et des possibilités de les utiliser (Peyron, 2000).

3. d’un sol neutre, profond, bien drainé, assez riche ou susceptible d’être fertilisé :

Le palmier dattier préfère les sols légers, il y croit plus rapidement qu’en sols lourds et

atteint un développement maximal, en diamètre du tronc et en nombre de palmes (Peyron,

2000 ; CIRAD et GRET, 2002). Pour cela, le palmier dattier est la végétation caractéristique

des oasis (Zaïd, 2002).

-13-


5/ Multiplication du palmier dattier :

Trois méthodes de multiplication peuvent être utilisées, pour mettre en place de nouvelles

surfaces de phœniciculture ou pour l’extension des palmeraies.

5.1/ Multiplication par semis (par graine) :

La reproduction par graine est longue, généralement utilisée lorsqu’il y a absence des rejets.

Elle ne permet pas de contrôler le sexe du palmier dattier et ne permet d’obtenir des pieds

productifs qu’au bout d’une dizaine d’années. Elle est donc une technique consommatrice de

temps pour des résultats incertains (Ben Abdallah, 1990).

5.2/ Multiplication par rejets :

Cette méthode de multiplication permet de conserver les caractéristiques du pied mère et de

ses fruits. Les rejets sont prélevés de la base du tronc (lorsqu’ils atteignent un poids de 12

à 25 kg), à l’aide d’un outil tranchant, en effectuant une coupe au niveau de la zone de liaison.

Cette séparation du rejet de son pied mère est une opération qui conditionne sa reprise.

Cette technique de multiplication est donc considérée comme la plus stable et la plus

efficace par les phœniciculteurs (CIRAD et GRET, 2002).

5.3/ Multiplication in-vitro :

Deux méthodes de micropropagation du palmier dattier sont connues :

- Voie de l’organogénèse, repose sur la capacité de bourgeonnement des bourgeons axillaires,

avec un cycle de 4 phases : l’initiation de tissus organogènes, la multiplication ou le

bourgeonnement, l’élongation, l’enracinement et l’acclimatation (Poulin et al., 1979 ; Drira,

1981 ; Anonymous, 1989 ; Djerbi, 1991).

- Voie de l’embryogénèse somatique, qui présente deux phases : la formation de la cal

embryogène, la régénération et la germination des embryons (Daikh et Demarly, 1987 ;

Letouze et Daguin, 1988 ; Djerbi, 1991).

-14-


6/ Répartition géographique du palmier dattier :

6.1/ Dans le monde :

L’aire de répartition du palmier dattier dans le monde, couvre les cinq continents. La culture

du palmier dattier s’étend depuis le sud de l’Iran à l’Est, jusqu’à la côte Atlantique de l’Afrique

du Nord à l’Ouest. Cette culture est concentrée dans les régions arides et semi arides du

continent Africain, où le palmier dattier forme la végétation caractéristique des oasis.

Les limites extrêmes de la distribution géographique sont entre les altitudes 10° Nord

(Somalie) et 39° Nord (Elche en Espagne ou Tukmenistan). Les secteurs les plus favorables

pour cette culture sont situés entre 24° et 34° Nord (Maroc, Algérie, Tunisie, Libye, Egypte,

Irak, Iran, Arabie Saoudite, Soudan, ...). Le palmier dattier se trouve aussi aux Etats-Unis entre

33° et 35° Nord, d’autres surfaces négligeables pour la culture du palmier dattier sont à

l’hémisphère sud (Australie, Mexique, Argentine, ...) (Ben Abdellah, 1990 ; Zaïd, 2002).

6.2/ En Algérie :

Quant à la répartition en Algérie, la culture du palmier dattier occupe toutes les régions

situées sous l’Atlas saharien, soit 6000 ha depuis la frontière Marocaine à l’Ouest, jusqu’à la

frontière Tuniso-libyenne à l’Est.

Du nord au sud du pays, la culture du palmier dattier, s’étend depuis la limite sud de l’Atlas

saharien jusqu’à Regghane à l’Ouest, Tamanrasset au centre et Djanet à l’Est (Matallah, 2003).

7/ Importance économique du palmier dattier :

7.1/ Production dans le monde :

Le palmier dattier fait l’objet d’une exploitation intense en Afrique du Nord, au Moyen

Orient et aux U.S.A. Deux groupes de pays sont à distinguer :

- Les pays grands exportateurs ;

- Les pays principalement consommateurs.

La production mondiale des dattes est estimée à 5.087.000 tonnes pour l’année 2005, dont

41 % soit 2.074.000 tonnes, proviennent du bassin méditerranéen dont : L’Egypte, 1er

pays

producteur avec 23% et l’Algérie classée au 4ème

rang mondial avec 10 %.

-15-


L’Algérie est devancée par l’Iran 20% et l’Arabie Saoudite 19%.

Le tableau n° 01 nous renseigne sur le détail de cette production mondiale, selon les

statistiques de la F.A.O. publiés en 2007.

Tableau n° 01 : Production mondiale des dattes (statistiques de la F.A.O., 2007).

Pays Quantité de production

(1000 tonnes) (%)

Monde 5 087 100%

Méditerranée 2 075 41%

Egypte 1 170 23%

Iran 997 20%

Arabie Saoudite 970 19%

Algérie 516 10%

Pakistan 497 10%

Soudan 328 6%

Libye 181 4%

Chine 130 3%

Tunisie 125 2%

Maroc 48 1%

7.2/ Production en Algérie :

Le patrimoine phœnicicole Algérien estimé en 1996 à plus de 10 Millions de palmiers

dattiers, se caractérise par une diversité exceptionnelle aussi bien dans les variétés que les

techniques utilisées. Malheureusement, ces palmiers se trouvent aujourd’hui menacés de

disparition.

Les principales régions productrices sont celles de l’Est, avec principalement les palmeraies

de Oued Righ et des Ziban, de Oued Souf, de la cuvette de Ouargla et du M’zab. A l’Ouest, ce

sont les palmeraies de l’Oued Saoura, du Touat, du Gourara et du Tidikelt (Matallah, 2003).

C’est dans ces régions, que les meilleures variétés de dattes sont produites telle que, Deglet

Nour, souvent exportée et qui constitue ainsi, une source non négligeable de devises pour le

pays, ainsi que d’autres variétés commerciales telles que : Ghars, Mech Degla et Degla Baïda,

..., etc (Ouinten, 1996).

-16-

Chapitre II :

L’agent pathogène

Synthèse Bibliographique Chapitre II : L’agent Pathogène

1/ Historique de la taxonomie :

1.1/ Le genre Fusarium :

Le genre Fusarium a été décrit pour la première fois par Link en 1809 (in Booth, 1985). La

détermination des Fusarium, comme celle des autres champignons imparfaits été basée

essentiellement, et jusqu’à ce jour, sur les critères morphologiques (pigmentation, aspect du

mycélium, présence ou absence des spores, taille, forme, nombre de cloisons, ...).

La diversité et l’extrême variabilité de ces caractères au cours des repiquages successifs et

en fonction des conditions de culture des champignons appartenant à ce genre, expliquent les

difficultés rencontrées pour la classification, d’où les nombreux systèmes taxonomiques et les

controverses proposés. Les travaux de Wollenweber et Rincking (1935), qui ont servi de

références, ont pu décrire 65 espèces, 55 variétés et 22 formes, rassemblées en 16 sections et 06

sous-sections (Synder et Hansen, 1940).

Le genre Fusarium a été profondément revu par Synder et Hansen (1940, 1941, 1945),

Tousson et Nelson (1968, 1975) et Messiaen et Cassini (1968, 1981).

Ils ont simplifié la classification pour ne retenir que 09 espèces, dans le but de permettre une

détermination rapide des parasites rencontrés (Bounaga, 1991).

D’autres systèmes taxonomiques proposés, s’appuyant sur les travaux de Wollenweber, ont

été suggérés, notamment par Raillo (1935), Bilai (1955, 1970), Gordon (1952, 1960, 1965),

Booth (1971, 1975, 1981), Joffe (1974) et Gerlach (1970, 1977, 1981), et ils ont conservé un

certain nombre de section et d’espèces avec quelques modifications (Bounaga, 1991).

1.2/ L’espèce oxysporum :

Wollenweber et Rincking (1935) ont placé l’espèce oxysporum dans la section « Elegans

»,

qu’ils ont subdivisé en 03 sous-sections, en se basant sur la forme et la taille des spores et sur

les caractères culturaux.

Dès 1940, toutes les espèces de la section « Elegans

» sont rassemblées dans une seule

espèce Fusarium oxysporum, par Synder et Hansen, à laquelle, Synder et al., adjoignent le

cultivar « Redolens

» en 1957.

-18-


Dans le genre Fusarium, l’espèce oxysporum, constitue 50% à 70% des populations

« fusariennes

» des sols (Guillemat et Montegut, 1958; Gorden1965 ; M.C. Mullen et Stack,

1983). Elle est considérée comme colonisatrice primaire du rhizoplan et du cortex racinaire.

Elle représente plus de 50 % des isolats de Fusarium à partir des racines de plantes diverses

(Bruel, 1976 ; MC Mullen et Stack, 1983 ; in Bounaga, 1991).

L’espèce oxysporum, peut vivre en saprophyte ou en parasites de vertébrés ou de plantes

(Nelson et al., 1981 ; Rebell, 1981, in Bounaga, 1991). Sa forme parfaite n’est pas encore

connue.

1.3/ La forme spéciale albedinis :

L’espèce est actuellement subdivisée en plus de 80 formes spéciales (Armestrong G. et

Armestrong J., 1981), suivant la plante hôte à laquelle elle s’attaque et dont elle est isolée. La

reconnaissance de ces formes spéciales, ne fait appel à aucun critère morphologique mais

seulement à la pathogénicité du champignon, dont la détermination doit se faire par la

réinoculation du pathogène dans la plante hôte (Bounaga, 1991).

Ces formes spéciales peuvent être subdivisées en races, basées sur la pathogénicité

différentielle des isolats sur des variétés distinctes. Mais par contre, certaines formes spéciales

ont été rassemblées, car elles étaient susceptibles de provoquer la même maladie dans plusieurs

hôtes (Armestrong G. et Armestrong J., 1981). Le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis est la

forme spéciale du palmier dattier (Bounaga, 1991).

2/ Position systématique :

Le système Saccardo de la classification des champignons imparfaits

« Fungi imperfecti

»

(Henni, 1998), classe le Fusarium comme suit :

Embrancement des Thallophytes,

Classe des Deutéromycètes,

Ordre des Moniliales,

Famille des Tuberculariacées,

Genre Fusarium

espèce oxysporum

-19-


3/ L’agent pathogène : Fusarium oxysporum f.sp. albedinis

Le champignon imparfait Fusarium oxysporum f.sp. albedinis est un parasite vasculaire,

isolé pour la première fois d’un palmier dattier infecté en 1921 et identifié en 1934 par

Malençon comme étant un Fusarium oxysporum. Les souches isolées du palmier dattier, n’ont

infecté que cette plante, elles constituent ce que l’on appelle la forme spéciale albedinis.

Il existe d’autres plantes telles que la luzerne (Medicago sativa L.) et le henné (Lawsonia

inermis L.), qui sont cultivées en association avec le palmier dattier et qui peuvent héberger le

Fusarium oxysporum f.sp. albedinis dans leurs racines, mais sans manifester aucun symptôme

externe de la fusariose vasculaire, se sont donc des « porteurs sains » du Fusarium oxysporum

f.sp. albedinis (Djerbi et al., 1985).

L’agent pathogène (Fusarium oxysporum f.sp. albedinis), peut être isolé d’un palmier dattier

infecté, à partir des rachis de palmes présentant les symptômes typiques du «Bayoud», en

déposant, dans des conditions aseptiques, des petits fragments sur un milieu de culture à base

de Pomme de terre ou sur un milieu sélectif (milieu Komada). Le Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis peut aussi être isolé à partir de stipe ou de racine mais jamais de fruits (Malençon,

1950 ; Bulit et al., 1967 ; Ouinten, 1996).

4/ Description morphologique :

4.1/ Caractères macroscopiques :

L’aspect sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis est caractérisé par un tapis

mycélien fin frisé, de couleur rose saumon à la lumière et blanc ou violet à l’obscurité, au sein

du quel se forme de petites sporodochies (Figure n° 08).

L’aspect ou la forme sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis permet d’identifier

l’agent causal du «Bayoud» sans recours aux tests de virulence (Djerbi et al., 1984 ; Sedra et

Djerbi, 1984). Des sclérotes de couleur bleue à noire naissent parfois groupées et mesurent de 1

à 3 mm de diamètre (Djerbi, 1988).

-20-

Figure n° 08 : Aspect sauvage du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.

-21-


4.2/ Caractères microscopiques :

Le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis possède un mycélium hyalin cloisonné, il est fin et

régulier en culture jeune. Ce mycélium présente des cellules hypertrophiées en chaine, d’aspect

globuleux en cultures âgées ayant une grande ressemblance avec les chlamydospores, mais sans

épaississement de la paroi.

La multiplication asexuée se réalise par des microphialides et des marophialides qui

produisent respectivement des microconidies et des macroconidies.

- Les microconidies : sont très nombreuses, hyalines de forme et de dimension variables dans

une même culture (3-15 x 3-5 µm). En culture jeune elles sont globuleuses, par contre en

culture âgées, elles sont plus allongées. Les microconidies sont souvent unicellulaires, parfois

bicellulaires et possèdent deux cloisons.

- Les macroconidies : sont peu nombreuses, à base pédiforme, et une extrémité pointue et

courte. Elles possèdent trois cloisons, rarement 4 ou 5 et mesurent (20-35 x 3-5 µm).

- Les chlamydospores : dans les cultures âgées ou dans le sol, le Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis forme des chlamydospores, régulières, soit globuleuses, à paroi lisse et épaisse, et

leur taille varie de 6 à 20 µm. Elles sont intercalaires ou terminales et sont isolées ou groupées

par 2. Elles se forment soit sur le mycélium, soit à partir des macroconidies (Bulletin OEPP/

EPPO, 2003).

Figure n° 09 : Macroconidies et microconidies de Fusarium oxysporum

(Leslie et Summerell, 2006).

-22-

a b c

a : macroconidies b : microconidies c : monophialide portant les microconidies en

fausses têtes échelle = 50 µm

Chapitre III :

La maladie du « Bayoud »

Synthèse Bibliographique Chapitre III : La Maladie du Bayoud

Le palmier dattier, comme toute autre espèce végétale, se trouve sous la menace de diverses

pathologies dues à des ravageurs (insectes ou acariens) ou à des parasites (champignons,

bactéries, ou mycoplasmes). A titre d’exemple, on peut citer :

La maladie du « Boufaroua

», due à un acarien, Oligonychus afrasiticus ;

La maladie du « Djereb

», due à la cochenille blanche, Parlatoria blanchardi ;

La pourriture de l’inflorescence ou « Khamedj

», causée par le champignon imparfait,

Mauginiella scaetae.

La fusariose vasculaire appelée « Bayoud » due au champignon imparfait appartenant à

l’espèce Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.

D’autres maladies telles que la pourriture du bourgeon, la maladie du « cœur qui

penche », ..., sont causées par d’autres espèces de champignons (Bounaga et Djerbi,

1990).

Si certaines de ces maladies, peuvent se manifester pour une période ou une saison donnée

et, par la suite, constituer l’infection dont les dégâts sont réversibles, en revanche, et

malheureusement, la fusariose vasculaire appelée «Bayoud» représente la maladie la plus grave

et la plus dévastatrice qui provoque un dépérissement irréversible du palmier dattier et, par

conséquent, des dégâts considérables et définitifs (Ouinten, 1996). Ainsi le patrimoine du

palmier dattier des régions phœnicicoles de l’Afrique du Nord, est attaqué depuis plusieurs

décennies, et continue à l’être toujours, particulièrement au Maroc et en Algérie (El Hadrami et

al., 2005).

1/ Historique et progression de la maladie :

C’est vraiment difficile d’établir exactement la date, le lieu et les conditions dans lesquelles

est apparue la maladie du «Bayoud». Cependant, plusieurs auteurs, s’accordent sur l’origine

Marocaine de la maladie (pays endémique), où elle a été observée pour la première fois dans la

Vallée du Drâa, au nord du Zagora avant 1870. A cette époque, toutes les palmeraies qui

bordaient l’Oued du Drâa ont été ravagées (Malençon, 1934 ; Perreau Leroy, 1958 ; Toutain,

1965 ; Bulit et al., 1967 ; Djerbi, 1982).

Depuis lors, Le «Bayoud» progresse vers l’Ouest et atteint Foum El Hasan en 1960. Dès

1898, la maladie atteint les palmeraies de Figuig au Maroc et de Béni Ouenif en Algérie, puis

-24-


Béchar en 1940, par la localisation de quelques foyers. Les palmeraies proches de ces

centres sont atteintes à leur tour tel que Béni Abbès en 1908 et Taghit en 1923 (Figure n° 10).

Entre 1940 et 1950, deux contaminations sont particulièrement importantes, la région d’In

Salah et celle d’Adrar, respectivement vers 1943 et 1950 (Brac De La Perriere et Benkhalifa,

1991).

Bien que le «Bayoud» a enregistré une progression de proche en proche vers l’Ouest, de la

Vallée du Drâa au Maroc jusqu’à Béni Ouenif en Algérie ; il effectue au Sahara central de

l’Algérie, des bonds désordonnés, de régions en régions, malgré qu’elles soient très éloignées

géographiquement à savoir :

- 700 km en 04 ans entre Béni Ouenif et Fouggarat El Arab,

- 300 km en 12 ans entre Béchar et Fatis,

- 700 km en 08 ans entre In salah et Metlili (Toutain, 1965).

Enfin, et plus récemment, les palmeraies de Ghardaïa et d’El Goléa, sont contaminées à leur

tour en 1965 et 1978 (Djerbi, 1982 ; Brac De La Perriere et Benkhalifa, 1991). Parallèlement,

certaines palmeraies algériennes sont indemnes, notamment les palmeraies de Kerzaz, de

Timimoun et de la Station de Recherche de l’I.N.R.A. d’Adrar (Brac De La Perriere et

Benkhalifa, 1991).

Figure n° 10 : Situation épidémiologique du « Bayoud » du palmier dattier

(Fernandez et al., 1995).

-25-


2/ Symptômes de la maladie :

2.1/ Symptômes externes :

En général, les premiers signes de la maladie se manifestent par un dépérissement

progressif, de la base vers l’extrémité, d’une ou de plusieurs palmes au niveau de la couronne

moyenne. Les folioles ou les épines situés sur le même côté de la palme se dessèchent et se

replient contre la nervure principale (rachis), c’est l’attaque hémiplégique typique de la

fusariose. Lorsque tout ce côté est atteint, le dépérissement commence sur l’autre côté, de

l’extrémité jusqu’à la base (Bulletin OEPP/ EPPO, 2003).

En se desséchant, la palme fini par mourir et prend l’aspect d’une plume mouillée (Figure

n° 11), avec une couleur blanchâtre, d’où le nom du «Bayoud», qui dérive du mot arabe

« abyed » et qui veut dire blanc (Djerbi, 1990 ; Ouinten, 1996).

L’évolution du desséchement sur les folioles s’accompagne par l’apparition d’une rayure

brune longitudinale sur le rachis. Depuis, l’attaque se généralise sur la totalité des palmes du

bourgeon terminal, entraînant ainsi la mort de l’arbre.

Le palmier dattier atteint, meurt 06 mois à 12 ans, après l’attaque par le Fusarium

oxysporum f.sp. albedinis et l’apparition des premiers symptômes de la maladie (Bulletin

OEPP/ EPPO, 2003).

Figure n° 11 : Symptômes de la maladie du « Bayoud ».

-26-


2.2/ Symptômes internes :

Le déracinement d’un palmier dattier malade permet d’observer un nombre réduit de racines

malades rougeâtres, elles représentent la porte pour la pénétration du champignon. De plus, des

coupes transversales au niveau du tronc, mettent en évidence une coloration brune rougeâtre

des vaisseaux conducteurs, témoignant le passage du champignon le long du stipe (OEPP,

1994).

3/ Pénétration dans le palmier dattier et progression du champignon :

La pénétration du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis se fait au niveau du système

racinaire, à travers les tissus très jeunes des radicelles proches de la coiffe ou bien à travers des

ouvertures provoquées par diverses causes biologiques ou mécaniques (Malençon, 1950).

Le champignon traverse les parenchymes par voie inter puis intra cellulaire jusqu’à

atteindre le cylindre central. Une fois arrivé dans les vaisseaux conducteurs du palmier dattier,

le champignon s’installe et la progression est ascendante.

Par la suite, le champignon fructifie et libère des conidies qui sont entraînées par la sève

montante. Arrivées et bloquées par les cloisons transversales des vaisseaux, les conidies sont

arrêtées, elles germent et donnent naissance à des filaments mycéliens qui traversent la cloison.

Le mycélium poursuit son développement et forme de nouvelles microconidies ; ce phénomène

se poursuit jusqu’au sommet du palmier dattier entrainant ainsi sa mort (OEPP, 1994).

4/ Epidémiologie :

Le champignon est distribué inégalement dans le sol, présent entre 0 et 30 cm parfois

jusqu’à plus de 1m de profondeur (Tantaoui, 1989). Il peut être alternativement saprophyte ou

parasite (Bounaga, 1985). Il peut aussi se conserver pendant plusieurs années sous forme de

chlamydospores, dans le sol, en absence de la plante hôte ou dans les tissus d’un palmier dattier

infecté (Louvet, 1977).

La contamination s’effectue d’une manière régulière par le contact entre les racines malades

et les racines saines entre les palmiers dattiers, ainsi, l’irrigation importante favorise

l’expansion de la maladie.

-27-


Les plantes des autres cultures, associées à la phoeniciculture, dont on a déjà parlé, et qui

sont des « porteurs sains », peuvent contribuer au maintien du Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis dans le sol.

La propagation de la maladie du « Bayoud » entre les palmeraies contaminées et celles

indemnes, peut être assurée par la dispersion des conidies (Laville, 1973), principalement par

l’échange du matériel végétal (rejets), du sol, d’outils ou de machines agricoles, ..., etc

(Bulletin OEPP/ EPPO, 2003). L’étendue de cette dispersion dépend aussi des pratiques

culturales (fertilisation, irrigation,...) et des conditions climatiques (température, vent,...)

(OEPP, 1994).

5/ Moyens de luttes contre la maladie du « Bayoud » :

5.1/ Les mesures prophylactiques :

Afin d’éviter ou de retarder la dissémination du « Bayoud » dans les régions indemnes, les

mesures prophylactiques constituent un des moyens de luttes préventifs contre cette

trachéomycose, grâce à la sensibilisation et l’aide des phoeniciculteurs, d’une part, pour mieux

connaître la maladie, l’aire de sa répartition, sa progression et sa surveillance et d’autres parts,

pour veiller à n’utiliser que des rejets sains pour la plantation et d’interdire les échanges de

matériel végétal entre les palmeraies.

5.2/ Les techniques culturales :

Les techniques culturales contre les fusarioses vasculaires, consistent à éviter les conditions

favorisant la croissance de l’agent pathogène. La maladie est moins présente en conditions

d’irrigation réduites, ainsi que dans les sols à pH alcalin, riches en calcium et potassium,

pauvres en phosphore et magnésium et dont l’azote est sous forme nitrique plutôt

qu’ammoniacal (Woltz et Johnes, 1981 ; Ollaguier et Renard, 1976).

Dans les parcelles contaminées, il faut éviter les cultures du henné et de la luzerne qui

nécessitent une irrigation abondante favorable à la maladie, et qui sont des porteurs sains de

l’agent pathogène, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis (Bulit et al., 1967).

En outre, le contact souterrain entre les arbres voisins doit être évité, par l’application des

méthodes modernes d’irrigation et de plantation des palmiers dattiers (Louvet, 1991).

-28-


5.3/ La lutte chimique :

La lutte chimique repose sur l’utilisation de nombreux produits phytosanitaires qui sont soit

thérapeutiques, appelés systémiques, soit protecteurs, appelés préventifs (Roger, 1990).

La désinfection du sol est très couteuse et difficile, ainsi, la lutte chimique n’est

envisageable qu’à la découverte du foyer primaire (point de départ d’une nouvelle infection

dans une région saine). Dans ce cas, le traitement du sol peut être effectué par l’utilisation du

bromure de méthyle (Frederix et Den Brader, 1989).

Différents autres fongicides couramment utilisés en agriculture ont été testés (Saaidi et

Rodet, 1974 ; Vanachter, 1991 ; Frederiks et Dembreber, 1991), tels que :

Le bénomyl et le méthylthophanate, qui inhibent la croissance mycélienne in vitro à des

doses de 10 et 100 ppm respectivement (Saaidi et Rodet, 1974).

La chloropicrine, qui est une substance chimique hautement volatile avec une activité

antifongique très élevée, mais qui présente l’inconvénient de ne pénétrer que faiblement

dans les débris végétaux. Contrairement au bromure de méthyle, qui présente une

grande capacité de pénétrer dans le sol grâce à sa tension de vapeur élevée, mais avec

une fongitoxicité relativement moins élevée (Cheikh-Aïssa, 1990 ; Vanachter, 1991).

Cependant, si l’application de ces fongicides a donné des résultats encourageants pour la

lutte contre ce pathogène (Fusarium oxysporum f.sp. albedinis), l’utilisation répétée de ces

produits de synthèse entraine souvent la pollution de l’environnement et l’apparition chez le

parasite de nouvelles souches résistantes et plus virulentes (Ozbaz et Newman, 2004). De plus,

leurs effets toxiques sont souvent signalés pour l’homme et l’animal (Messiaen et Lafon, 1970)

et pour le déséquilibre biologique du sol.

5.4/ La lutte biologique :

Une autre alternative pour protéger les plantes contre les agents pathogènes est l’application

des méthodes de biocontrôle (Azco’ n-Aguilar et Bare, 1997), par l’utilisation de différents

micro-organismes doués d’activité antagoniste, conduisant à des phénomènes d’antibiose et

d’hyperparasitisme.

-29-


Plusieurs chercheurs se sont intéressés aux micro-organismes antagonistes tels que les

bactéries, les champignons et les actinomycètes, dans l’espoir de mettre au point un procédé de

lutte efficace capable de limiter la gravité des fusarioses (Alabouvette et al., 1986).

Parmi les bactéries utilisées en lutte biologique, on peut citer les Pseudomonas fluorescens

et Serratia marcescens, et parmi mes champignons, il existe les Fusarium non pathogènes et le

Trichoderma harzianum.

Amir (1991 a) et Amir et Mahdi (1993), ont sélectionné des souches de Fusarium solani et

Fusarium oxysporum non pathogène, pour leur pouvoir compétitif élevé et inhibiteur de deux

formes spéciales : Fusarium oxysporum f.sp. lini et Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.

Hibar et ses collaborateurs (2005), ont montré qu’il est d’intérêt primordial d’utiliser le

Trichoderma harzianum en tant qu’agent de lutte biologique contre la fusariose vasculaire.

5.5/ La lutte génétique :

Le palmier dattier a l’avantage de présenter une grande diversité génétique de résistance au

Bayoud (Bounaga et al., 1992).

Cette diversité génétique de chaque palmeraie qui est le fruit de sélections autonomes et

d’échanges entre les agriculteurs, a servi dans la plupart des cas à luter directement contre la

fusariose par la multiplication empirique des clones les plus tolérants (Brac de la Perriere et

Bounaga, 1990). Ceci est mis en évidence, pendant 25 ans, après les essais de comparaison de

résistance de 32 variétés au Bayoud, dans les palmeraies infestées naturellement au Maroc.

Selon Saaïdi (1992), ces cultivars résistants sont devenus susceptibles après 15 ans.

L’expression de ce type de résistance est influencée par les conditions de développement des

arbres et probablement par l’abondance et l’activité de l’inoculum de Fusarium pathogène dans

le sol (Louvet, 1991).

5.6/ La lutte intégrée :

Amir (1991 b), propose également une lutte intégrée contre Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis comprenant l’éradication par fumigation et inoculation avec des antagonistes des

foyers primaires dangereux, création de variétés résistantes nouvelles par croisement, recherche

de mutants résistants à partir des cultures in vitro, création des pépinières et repeuplement des

palmeraies dévastées grâce à la multiplication in vitro de plants

-30-


éventuellement inoculés en antagonistes ; éradication par dessèchement et ressalement naturel

du sol et l’introduction de la lutte prophylactique et culturale.

Ces méthodes sont complémentaires et prennent en compte la prévention, l’éradication des

foyers et le repeuplement des zones dévastées.

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Deuxième Partie : Matériels et Méthodes

Chapitre I :

Etude du parasite et de la plante hôte

Matériels et Méthodes Chapitre I : Etude du parasite et de la plante hôte

I/ Le parasite et sa culture :

1.1/ Espèce étudiée :

Notre étude est basée essentiellement sur le champignon phytopathogène Fusarium

oxysporum f.sp. albedinis (F.o.a), l’agent causal de la fusariose vasculaire. Cette maladie

connue sous le nom du « Bayoud

», chez le palmier dattier, menace la majorité des palmeraies

algériennes.

1.2/ Echantillonnage et isolement des souches de F.o.a. :

Nous avons isolé une vingtaine de souches de Fusarium. La liste complète est fournie dans

le Tableau n° 02 avec la date et le lieu d’échantillonnage ainsi que la partie d’isolement dont

elles proviennent.

Toutes les souches isolées ont fait l’objet de la culture monospore. Les cinq souches de

F.o.a. isolées du rachis (F1-F4-F7-F8- et F13) et l’une isolée du sol (F12’), ont été utilisées

pour le test du pouvoir pathogène, pour le dosage des protéines totales et pour l’étude du

polymorphisme isoenzymatique. Pour les essais d’antagonisme (lutte biologique), seules les

cinq souches isolées du rachis ont été utilisées.

1.3/ Techniques d’isolement de F.o.a. :

1.3.1/ Isolement à partir des rachis infectés :

Le rachis des palmes infectées, présentant les symptômes typiques du « Bayoud

»

(Figure n° 12), est débarrassé des tissus externes, coupé d’une façon transversale puis découpé

en petits fragments. Ces derniers sont trompés dans une solution d’Hypochlorite de Sodium

diluée à 2% pendant 03 minutes, pour une désinfection superficielle ensuite rincés avec trois

bains successifs d’eau distillée stérile.

Les petits fragments sont déposés (la face sectionnée), dans des boites de Pétri

(Figure n° 13) contenant le milieu PDA (Annexe n° 01). Les boites sont mises à incuber dans

une chambre de culture, à une température de 22 °C, sous une photopériode de 12 heures.

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Tableau n° 02 : Sites d’échantillonnages et souches isolées de F.o.a..

Date

d’échantillonnage

Référence

de la souche Site de prélèvement Wilaya

Partie

d’isolement

11-03-2008 F 1

F 1’ El Mahdia Adrar

Rachis

Rhizosphère

18-03-2008 F 2’ Aoughrout (Timimoun) Adrar Rhizosphère

02-04-2008 F 3’ Laksour (Timimoun) Adrar Rhizosphère

26, 27 -03-2008

F 4

F 4’ Igli A2 Béchar

Rachis

Rhizosphère

F 5’ Igli A3 Béchar Rhizosphère

F 6 Igli A4 Béchar Rachis

F 7 Igli A5 Béchar Rachis

F 8

F 8’

F 8’’

Igli B Béchar Rachis

Rhizosphère

F 9’ Béni Abbes -1- Béchar Rhizosphère



10-04-2008 F 12’

Taghit Béchar Rhizosphère F 12’’

21-05-2008 F 13 Ksar Ouled Aissa

(Timimoun) Adrar Rachis

03-07-2008 F 14’ Maït (Taghit) Béchar Rhizosphère

03-06-2008 F 15 Ghardaïa Rachis

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Figure n° 12 : Symptôme unilatéral du « Bayoud

» sur une palme infectée.

Figure n° 13 : Isolement du champignon à partir de rachis infecté sur milieu PDA.

-36-


1.3.2/ Isolement à partir de la rhizosphère :

L’échantillon du sol rhizosphérique est bien tamisé et sécher dans une étuve réglée à 70 °C

pendant 03 jours, et pour l’isolement d’un Fusarium, on procède de deux manières:

saupoudrer directement quelques graines de sol à la surface d’une boite de Pétri contenant le

milieu PDA additionné d’antibiotique,

réaliser une série de dilutions décimales.

En arriver à la dilution 10-6

, 05 à 06 gouttes de cette dernière, sont étalées à la surface

d’une boite de Pétri contenant le milieu Gélose 2% (Annexe n° 01). L’incubation se fait à

22 °C, sous une photopériode de 12 heures.

1.4/ Purification des souches de F.o.a. :

Après 05 à 07 jours d’incubation, des hyphes mycéliennes apparaissent au tour de chaque

petit fragment de rachis infecté, ou bien des petites tâches blanches à la surface de la boite pour

la technique d’isolement à partir de la rhizosphère (technique des dilutions).

Des explants de la zone périphérique du mycélium ne présentant aucune contamination,

ainsi que ces petites taches blanches, sont prélevés et transférés (d’une manière aseptique) sur

d’autres boites de Pétri contenant le milieu PDA.

Ces repiquages sont renouvelés plusieurs fois jusqu’à l’obtention d’une culture pure.

A fin d’obtenir une culture issue d’une même ascendance, la culture monospore reste le

procédé le plus simple et le plus sûr.

Cette technique consiste à introduire dans un tube de 09 ml d’eau distillée stérile, un petit

fragment qui a poussé sur milieu PDA et âgé de 07 jours. Le tout est agité pendant 02 minutes.

Un (01) ml de cette suspension de spores, est étalé à la surface d’une boite de Pétri contenant le

milieu Gélose 2%. Après 24 à 48 heures, et à l’aide d’une loupe binoculaire, les spores germées

sont repérées puis ensemencées aseptiquement sur milieu PDA (05 spores en moyenne), puis

mises à incuber à 22 °C pendant une semaine. Les cultures issues de la croissance d’une seule

spore sont appelées clones.

-37-


1.5/ Identification des souches de F.o.a. :

1.5.1/ Etude des caractères culturaux :

Cette étude est réalisée par un repiquage d’un implant mycélien de 6 mm de diamètre (de

chaque isolat), dans des boites de Pétri contenant chacune un milieu différent de l’autre :

un milieu organique (PDA),

un milieu minéral (Czapeck),

un milieu riche (Mathur) (Annexe n° 01).

L’aspect morphologique de la colonie, et sa pigmentation, s’effectue par un examen direct

à l’œil nu, le diamètre de la colonie est mesuré quotidiennement pendant 10 jours d’incubation

à 22 °C sous photopériode de 12 heures.

1.5.2/ Etude des caractères microscopiques :

L’examen d’un implant entre lame et lamelle, dans une goutte de Bleu de Méthylène, ne

permet pas l’obtention de la structure intacte du champignon à cause de sa fragilité particulière.

Pour cela, deux techniques appropriées pour l’examen direct au microscope, sont utilisées :

1.5.2.1/ Culture en chambre humide :

Une boite de Pétri en verre doit contenir un support, sur lequel sont déposées une lame

avec sa lamelle. Le tout est stérilisé au four Pasteur à 170 °C pendant 30 minutes.

Une goutte du milieu PDA est déposée sur la lame, puis recouverte de sa lamelle (à l’aide

d’une pince stérile). L’excès du milieu qui déborde sous la lamelle est ensemencé par la souche

de Fusarium. On fait couler quelques millilitres d’eau distillée stérile dans la boite de Pétri et la

culture est mise à incuber à 22 °C pendant 5 à 7 jours.

1.5.2.2/ Repiquage sur milieu CLA :

Le milieu CLA (Carnation Leaf Agar) est un milieu à substrat naturel, ce petit morceau de

feuille d’œillet, que contient le milieu, favorise la sporulation des macroconidies (Synder et al.,

1947, Fisher et al., 1982).

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Les petits morceaux de feuilles d’œillet sont préparés à partir d’une collecte de cette plante

d’œillet fraîche non traitée par des fongicides d’insecticides. Les feuilles collectées sont

découpées en petits morceaux de 5-8 mm2

(ils se rétrécissent après séchage), puis séchés dans

un four (~70 °C) pendant 3 à 4 heures, ils peuvent être séchés aussi dans une micro-onde. Le

stockage de ces petits morceaux se fait dans un endroit sec de température ambiante jusqu’à 12

mois avant usage (Leslie et Summerell, 2006).

Une bouture mycélienne est placée à côté de cette feuille d’œillet stérile, le tout, dans une

boite de Pétri contenant le milieu Gélose 2%. La boite est mise à incuber dans la chambre de

culture à 22 ° C, sous une photopériode de 12 heures.

1.5.2.3/ Observations microscopiques :

Après incubation de la culture en chambre humide, la lame est observée au microscope

optique au grossissement x 400.

Plusieurs espèces de Fusarium sporulent sur le milieu CLA après 06 à 10 jours de

repiquage. Les cultures fongiques sur milieu CLA produisent des macroconidies de formes et

de dimensions plus constantes que celles produites sur des milieux riches tels que le milieu

PDA ou le milieu Czapek.

Le mode de formation des macroconidies sur des monophialides ou des polyphialides, la

présence de chaines ou de fausses têtes des microconidies ainsi que la présence des

chlamydospores, peuvent être déterminés par un examen direct de la boite de Pétri (culture

fongique sur milieu CLA), sous microscope optique au grossissement (x 400) en suivant une

clé d’identification des espèces de Fusarium.

1.6/ Etude physiologique des souches de F.o.a. :

Cette étude s’est appliquée sur un seul isolat de F.o.a. (L’isolat F13), qui a montré une

meilleure vitesse de croissance durant la période d’incubation sur les trois différents milieux de

culture cités précédemment. Les expériences ont été répétées trois fois (trois boites pour chaque

facteur étudié).

-39-


1.6.1/ Influence de la température :

Pour déterminer la température optimale, des boites de Pétri contenant un seul milieu de

culture choisi : le milieu PDA, sont ensemencées au centre par une bouture mycélienne de 6

mm de diamètre, prélevée d’une préculture âgée de 07 jours. Les boites sont incubées à

différentes températures : 15 °C, 22 °C, 28 °C et 35 °C pendant 7 jours. La lecture des

diamètres est effectuée quotidiennement.

1.6.2/ Influence des sources carbonées :

Pour chercher la source de carbone la plus assimilable par notre souche, le milieu utilisé

était le milieu Czapek, dans lequel, le saccharose utilisé pour les boites témoin, était remplacé

par d’autres sources de carbone : le Glucose comme monosaccharide, le Maltose comme

disaccharide et l’Amidon comme polysaccharide.

1.6.3/ Influence des sources azotées :

Le milieu utilisé est le milieu Czapek, dont la source d’azote NaNo3 (Nitrate de Sodium)

est remplacée par le KNO3 (Nitrate de Potassium) et le NH4SO4 (Sulfate d’Ammonium),

comme deux sources d’azote minéral, et par l’Asparagine comme source d’azote organique.

1.6.4/ Influence de la lumière :

Le milieu utilisé est le milieu PDA. Les boites de Pétri sont ensemencées au centre puis

mises à incubées sous : un éclairage continu, une photopériode de 12heures une obscurité

continue.

1.6.5/ Influence du pH du milieu :

Pour préciser le pH optimal à la croissance mycélienne de F.o.a., notre souche est cultivée

sur milieu PDA solide tamponné à différents pH : 4 et 5 par le Tampon Acétate de Sodium, 7 et

8 par le Tampon Phosphate.

- Tampon acétate : composé de deux solutions :

-40-


Solution A = Solution d’acide acétique à 0,2 M.

Solution B = Solution d’acétate de sodium à 0,2 M.

X ml de la solution A + Y ml de la solution B

- Tampon phosphate : composé de deux solutions :

Solution A = Solution de Na2HPO4 à 0,2 M.

Solution B = Solution de NaH2PO4 à 0,2 M.

X ml de la solution A + Y ml de la solution B

1.6.6/ Influence de l’humidité :

La technique consiste à placer des implants de 6 mm de diamètre de la souche de F.o.a. sur

le milieu PDA en boite de Pétri. Les boites sont tournées et les couvercles sont remplis de 9 ml

d’une solution saline saturée. Le tableau suivant montre la quantité de sel ajoutée à 100 ml

d’eau distillée pour l’obtention des différents taux d’humidité.

Solutions Taux d’humidité relative

Eau distillée 100 %

0,8 g Na Cl 95 %

10 g Na Cl 80 %

30 g Na Cl 74 %

32 g Na Cl 50 %

50 g Na Cl 14 %

pH X Y

4 41,0 9,0

5 14,8 35,2

pH X Y

7 39,0 61,0

8 94,7 5,3

-41-


1.7/ Conservation des souches de F.o.a. :

La conservation des souches de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis se fait par des cultures

inclinées sur différents milieux : PDA, Gélose 2%, SNA (Annexe n° 01), à une température de

- 4 °C et ceci pour des utilisations ultérieures.

II/ L’hôte et sa culture :

2.1/ Espèce étudiée :

Etant donné que notre étude porte essentiellement sur le champignon Fusarium oxysporum

f.sp. albedinis qui attaque le palmier dattier appelé aussi Phoenix dactylifera L., nous avons

donc besoin dans nos essais de petites plantules de palmier dattier issues de la germination des

noyaux de dattes.

2.2/ Préparation des plantules de palmier dattier :

2.2.1/ Germination des noyaux de dattes :

La germination s’est effectuée au niveau de notre laboratoire, en récoltant un nombre élevé

de noyaux de dattes. Après la désinfection, par trempage dans une solution d’Hypochlorite de

Sodium diluée à 2% pendant 03 minutes, suivie de 03 bains successifs d’eau distillée stérile, les

noyaux sont déposés dans des boites de Pétri en verre tapissées d’un coton imbibé d’eau

distillée, stérilisés auparavant à l’autoclave à 120 °C pendant 20 minutes avec une pression de

1 bar.

Les boites sont incubées à une température de 4 °C pendant 02 à 03 jours pour accélérer la

germination, puis sont transférées dans une étuve réglée à une température de 28 °C pour

provoquer un choc thermique aux noyaux. Après 07 à 09 jours d’incubation, l’embryon de

chaque noyau peut apparaître à la surface (Figure n° 14).

2.2.2/ Plantation des noyaux de dattes :

Les noyaux avec leurs embryons sont transférés dans des sacs en plastique, contenant un

mélange de tourbe et de sol (V/V), puis arrosés avec une solution nutritive, une à deux fois par

semaine. Après 30 à 40 jours, la première feuille apparaît à la surface.

-42-


Figure n° 14 : Germination d’un noyau de datte.

-43-


2.2.3/ Préparation de la solution nutritive (Solution KNOP) :

Il suffit de mélanger les ingrédients suivants, un à un, dans un litre d’eau distillée :

Nitrate de Calcium (CaNO3) ……………… 1 g

Nitrate de Potassium (KNO3) ……………… 0,25 g

Sulfate de Magnésium (MgSO4) ……………… 0,25 g

Phosphate monopotassique (KH2PO4) ……………… 0,25 g

Sulfate ferreux (FeSO4) ……………… 0,001 g

2.3/ Etude du pouvoir pathogène :

2.3.1/ Préparation de l’inoculum :

Sept boites de Pétri sont ensemencées avec 01 ml d’une suspension de spores, préparée à

partir d’une culture âgée de 05 jours, (à raison d’une boite pour chaque souche), puis sont mises

à incuber à 22 °C pendant 08 jours. Après ce temps d’incubation, la surface de la boite de

chaque isolat est raclée avec 05 ml d’eau distillée stérile. Cette opération est répétée pour une

deuxième fois. Les 10 ml récupérés représentent la suspension de spores ou l’inoculum qui sera

ajusté par la suite à 106 spores/ ml (à l’aide d’une cellule de Malassez).

2.3.2/ Inoculation des plantules au niveau du système racinaire :

Dans cette étude, nous nous sommes arrivés à cultiver 56 plantule de palmier dattier, dont

40 plantules, âgées de 03 mois ± 01 semaine (au stade végétatif de 02 à 03 feuilles), sont

réparties en 08 lots (à raison d’un lot pour chaque souche, les deux derniers étant des lots

témoins). Chaque lot est composé de 05 plantules, c’est-à-dire que 05 répétitions ont été

effectuées.

Après avoir préparé et ajusté la suspension de spores à 106 spores / ml, l’infection est

réalisée par l’inoculation (à l’aide d’une seringue) de 10 ml de cette suspension dans les

racines de chaque plantule, rassemblées à la base du sachet.

Parallèlement et pour les deux lots témoins mis en place, le premier est traité par 10 ml

d’eau distillée stérile, le second représente les plantules n’ayant subies aucun traitement.

L’ensemble des plantules a été disposé sous serre.

-44-


2.3.3/ Réisolement du parasite :

Après l’inoculation, la recherche du parasite dans la plante infectée a pour objectif de

montrer la capacité du champignon de pénétrer dans la plante et de s’assurer que les

symptômes notés sont l’effet du pathogène. Ce contrôle est effectué sur toutes les plantes

inoculées, le champignon est recherché dans le sol, au niveau des racines et dans la tige.

L’organe végétal est désinfecté superficiellement (passage à l’éthanol et flambage) et

découpé d’une manière longitudinale et en conditions aseptiques en petits fragments que l’on

dépose, la face sectionnée, sur milieu PDA en boites de Pétri. L’incubation de ces fragments est

réalisée à 22 °C.

-45-

Chapitre II :

Etude du polymorphisme

isoenzymatique

Matériels et Méthodes Chapitre II : Etude du polymorphisme isoenzymatique

I/ Dosage des protéines totales des isolats de F.o.a. :

1.1/ Préparation des extraits mycéliens :

1.1.1/ Culture du champignon :

Des fioles de roux, contenant 100 ml de liquide de Czapeck-Dox, sont ensemencées par 5

boutures mycéliennes (de 6 mm de diamètre), prélevées de la zone périphérique d’une

préculture (5 à 7 jours) du champignon sur milieu PDA. Les cultures à raison de 2 fioles pour

chaque isolat sont conduites à 22 °C pendant 10 jours sous agitation et photopériode de 12

heures.

1.1.2/ Obtention des extraits :

Le mycélium est récupéré après filtration du milieu de culture à l’aide d’une passoire

stérile. Il est ensuite broyé dans un mortier maintenu au froid dans de la glace, additionné du

sable de Fontaine bleau et du Tampon Phosphate (0,1 M - pH 7,1) (P/P/V), jusqu’à l’obtention

d’une pâte fine et homogène. Le broyât est récupéré dans des tubes puis centrifugés à 10 000 g

pendant 20 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée (4 °C) (type Biofuge).

Le surnageant est réparti rapidement dans des tubes eppendorf par fraction de 100 µl. Il

peut être utilisé directement pour l’électrophorèse, comme il peut être conservé au congélateur

mais, une fois décongelé, il n’est jamais recongelé.

1.2/ Principe du dosage des protéines :

La méthode utilisée dans notre expérience est celle de Bradford (1976), qui consiste à une

coloration des protéines par le Bleu de Coomassie G250. L’intensité de la coloration est

proportionnelle à la concentration des protéines et le maximum d’absorption est situé à une

longueur d’ondes λ= 595 nm.

-47-


1.2.1/ Composition du Réactif de Bradford :

Bleu de Coomassie 10 mg

Acide Orthophosphorique 85 % 10 ml

Ethanol 95 % 5 ml

Eau distillée q.s.p. 100 ml

1.2.2/ Courbe d’étalonnage :

Une solution mère de Sérum Bovine Albumine (SBA) est préparée à une concentration de

1 mg/ ml. De cette dernière une série de dilutions est effectuée. A chaque dilution, 2 ml de

réactif de Bradford sont ajoutés pour faire la lecture au spectrophotomètre, à une longueur

d’ondes λ= 595 nm, on peut aller même jusqu’à 20 dilutions (Tableau n° 03 ci-après) :

Tableau n° 03 : Dilutions de la courbe d’étalonnage.

Pour déterminer la concentration des protéines dans l’extrait enzymatique de chaque

échantillon, 100 µl de chaque extrait est mélangé avec 2 ml de réactif de Bradford, bien agité

au vortex et après 2 à 3 minutes de repos, la lecture de la densité optique (D.O.) est faite à la

longueur d’ondes λ= 595 nm.

II/ Électrophorèse :

2.1/ Préparation des gels pour le système PAGE :

L’électrophorèse se fait sur gel de polyacrylamide. Les deux gels (de séparation à 10% et

de concentration à 5%) sont préparés selon la méthode de Laenlmli (1970), modifiée de la

manière suivante (Tableau n° 04 ci-contre) :

Dilution 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 blanc

SBA (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 /

Eau distillée (µl) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 200

Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

-48-


Tableau n° 04 : Composition des gels de polyacrylamide.

La composition des tampons utilisés pour la préparation des gels et pour la migration est

donnée en Annexe n° 02.

Le gel se présente sous forme de matériel gélifié, formé par la polymérisation d’un

mélange d’acrylamide et de bis-acrylamide. Le gel de concentration est coulé en haut du gel de

séparation, pour permettre une entrée homogène de l’échantillon dans le gel de séparation. Des

pistes individuelles (puits) sont réalisées à l’aide d’un peigne, qui sépare le gel de concentration

en portions égales, destinées à la migration de chaque échantillon.

2.2/ Migration et mise sous tension :

Les extraits enzymatiques de chaque échantillon, sont dilués dans du tampon de charge

avec des proportions 5 : 1 (V/V) dans chaque puits.

Chaque extrémité du gel sera mise en contact avec le tampon de migration qui, soumis

dans un potentiel électrique, permettra la propagation d’un courant dans le gel. Ce courant

entraînera les molécules constituant l’échantillon.

La migration se déroule en chambre froide à 4 °C sous tension constante de 150 V, avec

une intensité de 50 mA durant environ 2 heures.

Solutions

Gel de

séparation 10%

Gel de

concentration 5%

Solution d’acrylamide 30%

Solution de bis-acrylamide 1%

Tampon de séparation pH = 8,8

Tampon de concentration pH = 6,8

Solution SDS 10% (pour le

système SDS-PAGE)

Eau distillée

Temed

Persulfate d’Ammonium 10%

5 ml

5 ml

1,95 ml

/

0,15 ml

4,1 ml

50 µl

100 µl

2,5 ml

3,9 ml

/

3,75 ml

0,15 ml

4,65 ml

50 µl

100 µl

-49-


2.3/ Révélation des systèmes isoenzymatiques :

La révélation des isoenzymes est effectuée par incubation du gel (après démoulage) dans

un mélange réactionnel, contenant le substrat de l’enzyme étudiée. Trois systèmes

enzymatiques sont étudiés : Estérases (Est), Phosphatases acide (PAC) et Peroxydases (Pox).

Le tableau n° 05 ci-après, nous indique les mélanges réactionnels pour la révélation de ces

dernières.

Tableau n° 05 : Les mélanges réactionnels pour les révélations enzymatiques.

NB : Les chiffres écrits en gras entre parenthèses (1 à 3) renvoient à la liste des solutions de

révélation en Annexe n° 02.

Enzyme

Mélange réactionnel

Estérases Scandalios (1969)

Un ester carboxylique + H2O

Est un alcool + un anion

acide carboxylique

Fast Blue RR 40 mg

Tampon Phosphate (0,1 M; pH = 7,1) (1) 50 ml

Bien dissoudre, Ajouter:

β-Naphtyl Acétate 2% (0,02g dans 1 ml Acétone) 2 ml

α-Naphtyl Acétate 2% (0,02g dans 1 ml Acétone) 2 ml

Rincer et Fixer.

Phosphatase Acide (PAC)

Pai, Endo et Oka (1975)

α-Naphtyl Phosphate

PAC α-Naphtol Acétate

α-Naphtyl Acide Phosphate 50 mg

Fast Garnet GBC 50 mg

Tampon Acétate (0,05 M; pH = 5) (2) 50 ml

Incuber 3 heures à 40° C, Rincer et Fixer.

Peroxydase

Shaw et Prasad

Pox

2 H2O2 2 H2O2 + O2

3 Amino, 9 Ethyl Carbazole 40 mg

Diméthyl formamide 5 ml

Tampon Acétate (0,05 M ; pH = 5) 92,5 ml

Solution de Ca Cl2 (0,1 M) (3) 2 ml

Solution de H2O2 à 30% 30 µl

Incuber 30 à 60 minutes, Rincer et Fixer.

-50-


2.4/ Isoenzymes étudiés :

Le terme Isoenzyme a été introduit en premier par Markert et Moller (1959), pour faire

référence à de multiples formes moléculaires d'une enzyme, avec une semblable ou identique

spécificité du substrat, qui se produit dans le même organisme (Baaziz, 2000).

- Les Estérases :

Une estérase est une enzyme de l'hydrolase qui fend les esters en un acide et un alcool,

sous une réaction chimique avec l'eau appelée l'hydrolyse.

Il existe une grande gamme d’estérases, mais qui diffèrent entre elles par la spécificité du

substrat, la structure de la protéine et la fonction biologique (Baaziz, 2002).

- Les Phosphatases Acides (PAC) :

Sous le terme de Phosphatase Acide, sont regroupées des hydrolases. Ces hydrolases

catalysent la déphosphorylation d'esters orthophosphoriques organiques et dont le pH d'activité

optimale est inférieur à 7. Elles possèdent également une activité transférasique, assurant le

transfert d'un phosphate sur le groupement hydroxyle d'un alcool (Moss, 1984).

- Les Peroxydases :

Une Peroxydase est une enzyme, qui contient parfois un hème, qui catalyse une réaction de

la forme :

ROOR' + donneur d'électrons (2 e-) + 2H

+ → ROH + R'OH

Ce type d'enzyme a notamment pour fonction de décomposer les peroxydes, dérivés

toxiques de l'oxygène (comme par exemple l'eau oxygénée ou peroxyde d'hydrogène), ce qui

lui vaut son nom. Se sont des enzymes très répondues chez les êtres vivants. Chez les plantes,

elles catalysent l’oxydation de différents substrats (des amines aromatiques, des phénols,...),

elles interviennent ainsi dans différents phénomènes physiologiques tels que l’enracinement, la

lignification, et la résistance aux stress biotiques et abiotiques (Qacif et al., 2006).

Certaines interviennent dans le métabolisme de l'iode et sont nécessaires à l'élaboration des

hormones thyroïdiennes. D'autres participent au transfert du chlore dans certaines cellules

-51-

http://fr.wikipedia.org/wiki/Enzyme

http://fr.wikipedia.org/wiki/H%C3%83%C2%A8me

http://www.didier-pol.net/1CATALA.html




du système immunitaire, permettant ainsi la production d'hypochlorite (la vulgaire eau de

Javel), servant à la destruction des microorganismes ingérés. D'autres microorganismes utilisent

des Peroxydases pour fabriquer des antibiotiques. Ces enzymes sont donc parmi les plus

universelles du monde vivant.

2.5/ Préparation des gels pour le système SDS-PAGE :

La différence qui existe entre le système PAGE et le système SDS-PAGE, est la présence

de l’agent dissociant le plus utilisé et le détergent anionique qui défait la structure spatiale et se

fixe sur les protéines à chaud : Sodium Dodécyl Sulfate (SDS). Toutes les molécules seraient

donc chargées négativement et la séparation est uniquement fonction de la masse moléculaire

(taille) (Lafont, 2005).

La préparation des gels de séparation et de concentration est la même que celle du système

PAGE additionnée du SDS (Tableau n° 04).

2.6/ Dénaturation des échantillons :

L’extrait enzymatique de chaque échantillon est dilué dans un même volume du tampon de

charge (V/V). Le tout est porté à ébullition dans un bain-marie pendant 5 minutes.

2.7/ Révélation des bandes :

Après une migration complète, le gel est fixé puis coloré afin de pouvoir visualiser les

bandes protéiques. Les solutions de fixation, de coloration, de décoloration et de conservation

sont portées dans une liste en Annexe n° 03.

-52-

Chapitre III :

Essais in vitro de recherches

de moyens de lutte

Matériels et Méthodes Chapitre III : Essais in vitro de recherches de moyens de lutte

I/ Lutte chimique contre L’isolat F13 de F.o.a. :

Les méthodes du laboratoire qui permettent d’estimer les propriétés d’un produit in vitro

sont nombreuses mais reposent toutes sur le même principe, celui de confronter le fongicide et

le champignon sur un support artificiel (Henni, 1987).

1.1/ Les fongicides testés :

Une vingtaine de substances antifongiques ont été testées vis-à-vis l’isolat F13 de F.o.a.,

synthétisées par différents Laboratoires de Chimie Organique. Le tableau n° 06, montre la

provenance de chaque substance.

Tableau n° 06 : Les substances fongicides testées contre l’isolat F13 de F.o.a.

1.2/ Préparation des solutions de fongicides :

Chaque produit à tester est soluble dans un solvant organique qui lui convient, il peut être

l’acétone, le méthanol, le chloroforme, …etc. Dans nos essais seul l’acétone est utilisé, d’autres

produits sont hydrosolubles (Tableau ci-dessus).

Substance

Fongicide Laboratoire Solubilité

Substance

Fongicide Laboratoire Solubilité

O1

Laboratoire

de Chimie

Université

ES-Sénia

Oran

Acétone

Am6

Hydrosoluble

P2 Acétone Am7 Hydrosoluble

P3 Acétone ZS 49

Laboratoire

de Chimie

Université

ES-Sénia

Oran

Acétone

M4 Acétone ZS 50 Acétone

M5 Acétone ZS 54 Acétone

Am1

Laboratoire

de Chimie

Université de

Saïda

Hydrosoluble ZS 55 Acétone

Am2 Hydrosoluble ZS 60 Acétone




-54-


Dans un premier temps, une solution mère de chaque produit est préparée à une

concentration de 105 ppm (partie par million), puis des dilutions seront effectuées avec un

milieu liquide à base de pomme de terre, pour arriver à chaque fois à la concentration voulue

(50, 100, 200 et 400 ppm). Le 0 ppm comme étant le témoin, ne contient que le solvant

incorporé dans le milieu PDA.

Les différentes dilutions sont obtenues en respectant la loi suivante :

1.3/ Test sur milieu solide :

Des implants mycéliens de 6 mm de diamètre sont prélevés de la périphérie d’une

préculture de 7 jours de l’isolat F13 de F.o.a., et sont déposés au centre de la boite de Pétri

contenant le milieu PDA avec les 04 concentrations pour chaque substance active à étudier

(Braffio et al., 2004).

Pour chaque concentration et chaque produit, deux répétitions sont réalisées. L’incubation

a été faite à 22 °C sous photopériode de 12 heures pendant 7 jours et la lecture se fait

quotidiennement. La mesure de la croissance radiale de la colonie est faite selon la méthode des

deux diamètres perpendiculaires (Figure n° 15) (Blaise et al., 2001).

Pour chaque dose, on détermine le pourcentage d’inhibition qui se calcule selon la formule

suivante :

C1 V1 = C2 V2

C1 : Concentration de la solution mère V1 : Volume pris de la solution mère

C2 : Concentration à préparer V2 : Volume final voulu du milieu PDA

Taux d’inhibition (%) = (D témoin – D test) / D témoin x 100

D : Diamètre

-55-


Figure n° 15 : Schéma de la méthode de mesure du diamètre dans les deux sens

perpendiculaires (Blaise et al., 2001).

Boite de Pétri

contenant le

milieu de culture

Implants du

mycélium

-56-


II/ Lutte biologique :

Parallèlement aux travaux effectués sur l’effet in vitro de 20 fongicides sur la croissance de

F.o.a., et dans le but d’essayer de mettre au point une lutte biologique, un agent antagoniste

actif sur divers agents pathogènes est utilisé : le Trichoderma harzianum (Elad et al., 1982 ;

Daami-Remadi et El Mahjoub, 2001).

2.1/ Provenance de l’agent antagoniste testé :

Pour lutter contre F.o.a., trois souches de Trichoderma harzianum sont testées T1, T2 et

TM. Les deux premières souches proviennent d’un isolement à partir de la rhizosphère

saharienne (Tableau n° 07). La troisième souche (TM) nous a été fournie par Mme BENFRIHA,

Maître assistante, au Laboratoire de Phytopathologie, à l’Université de Mascara.

Les cultures utilisées pour ces essais, sont âgées de 10 jours.

Tableau n° 07 : Provenance des souches T1 et T2 de Trichoderma harzianum.

Après l’isolement des souches de Trichoderma (T1 et T2) à partir du sol par la technique des

dilutions (similaire à celle citée pour l’isolement de F.o.a.), les caractères macroscopiques et

microscopiques sont étudiés par la culture de cet agent antagoniste sur le milieu Davet (Annexe

01).

2.2/ Test de l’activité antagoniste in vitro :

L’activité antagoniste in vitro de Trichoderma harzianum contre les isolats de F.o.a., a été

étudiée selon deux méthodes :

Date

d’échantillonnage

Code de la

souche Wilaya

Site de

prélèvement

Partie

d’isolement

03.07.2008

T1

Béchar

Haya

Sol

03.07.2008 T2 Béchar Maït Sol

-57-


2.2.1/ Confrontation par contact direct sur milieu de culture :

Cette technique consiste à placer, dans la même boite de Pétri contenant le milieu PDA et

d’une façon diamétralement opposée, deux pastilles gélosées de 6 mm de diamètre, l’une

portant le Trichoderma et l’autre le F.o.a., à une distance de 3 cm l’une de l’autre

(Figure n° 16). Les repiquages sont effectués en même temps (Benhamou et Chet, 1996).

Le témoin est constitué par un repiquage du pathogène seul.

L’incubation se fait à 25 °C pendant 5 jours à l’obscurité. Des notations concernant

l’inhibition de la croissance mycélienne des colonies de F.o.a. et leur envahissement par le

mycélium de Trichoderma, sont effectuées quotidiennement.

2.2.2/ Activité des filtrats de culture :

Une bouture mycélienne prélevée dans la zone de croissance d’une culture de l’antagoniste

est déposée dans une fiole contenant 100 ml de milieu pomme de terre liquide. Ces fioles sont

mises à incuber pendant 3 semaines à l’obscurité à 25 °C (Catain et Peterson, 1966 ; Wilson et

Porter 1957 ; Henni, 1998).

Après ce délai, le mycélium est séparé du milieu de culture par centrifugation à

4000 t / min pendant 30 minutes, puis le surnageant est filtré sur filtre millipore de 0.22 µ. Ces

filtrats sont ensuite conservés au congélateur.

Un (01) ml du filtrat de culture est ensuite incorporé avec 10 ml du milieu PDA maintenu

en surfusion (40 à 45 °C) dans chaque boite de Pétri. Des pastilles gélosées, de chaque isolat,

de l’agent pathogène âgé de 5 jours, sont placées dans le centre de la boite (Figure n° 17).

Le témoin est constitué par un filtrat de culture de l’agent antagoniste dénaturé au bain-

marie pendant 5 minutes.

Ainsi, le pourcentage d’inhibition (%) est calculé (dans les deux cas de

confrontation) comme suit :

(%) d’inhibition = (D Témoin – D Test) / D Témoin x 100

D témoin : distance radiale maximale de la croissance du champignon.

D Test : distance radiale sur une ligne en direction de l’antagoniste.

-58-


F.o.a. T. harzianum

Milieu PDA

Figure n° 16 : Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par contact direct sur milieu de

culture.

Implant de F.o.a.

Figure n° 17 : Confrontation de F.o.a. avec T. harzianum par l’activité des filtrats de culture.

Milieu PDA contenant le

filtrat de culture de T.

harzianuum

-59-

3 cm

Troisième Partie : Résultats et Discussions

Résultats

Résultats

I/ Isolement du champignon :

Les isolements à partir des rachis d’un palmier infecté ou de la rhizosphère, révèlent un

développement des souches fongiques qui présentent des colonies duveteuses à cotonneuses ou

ras muqueuses, de couleur rose saumon, rose orangé ou violet pale. L’observation

microscopique de tous les isolats, révèle la présence de trois types de spores (microconidies,

macroconidies et chlamydospores), ce qui confirme que les isolats appartiennent au genre

Fusarium.

II/ Identification des souches de F.o.a. :

2.1/ Aspect morphologique :

Après quelques jours d’incubation, seuls des morphotypes mycéliens ont été rencontrés.

Les colonies sont généralement caractérisées par les morphotypes suivants : duveteux,

cotonneux ou ras muqueux (Tableau n° 08 et Figure n° 18).

Le morphotype cotonneux, présente un mycélium aérien très abondant, épais et dense avec

une couleur blanche rosé. Dans ce type, les microconidies sont produites tardivement

(Figure n° 18 -a-).

Le morphotype duveteux, présente un mycélium aérien assez court mais dense, portant de

nombreuses microconidies. Les macroconidies et les chlamydospores sont formées tardivement

(Figure n° 18 -b-).

Le morphotype ras et muqueux, est caractérisé par l’absence du mycélium aérien, ce qui

donne à la culture un aspect muqueux comme si elle était envahie par des bactéries. Les

microconidies sont très abondantes, les macroconidies sont rares et les chlamydospores sont

tardives mais abondantes (Figure n° 18 -c-).

-62-

Résultats

Tableau n° 08 : Différents morphotypes rencontrés chez F.o.a. et Fusarium de la

rhizosphère du palmier dattier.

Souches

isolées

Partie

d’isolement

Site de

prélèvement Morphotype Pigmentation Identification

F 1 Rachis Adrar ras muqueux

(type sauvage)

Rose violet F.o.a.

F 1’ Rhizosphère Adrar

cotonneux Blanc rosé Fusarium sp.

F 2’ Rhizosphère Adrar duveteux Rose pâle Fusarium sp.


cotonneux Blanc rosé Fusarium sp.

F 4 Rachis Béchar ras muqueux Rose orangé F.o.a.


cotonneux Blanc Fusarium sp.

F 5’ Rhizosphère Béchar duveteux Blanc rosé Fusarium sp.

F 6 Rachis Béchar duveteux Rouge carmin Fusarium sp.

F 7 Rachis Béchar ras muqueux

(type sauvage)

Rose orangé F.o.a.

F 8 Rachis Béchar ras muqueux

(type sauvage)

Rose orangé F.o.a.

F 8’ Rhizosphère Béchar

duveteux Rouge carmin Fusarium sp.

F 8’’ Rhizosphère Béchar

duveteux Rouge carmin Fusarium sp.

F 9’ Rhizosphère Béchar ras Rose clair Fusarium sp.

F 10’ Rhizosphère Béchar cotonneux Blanc Fusarium sp.

F 11’ Rhizosphère Béchar ras Orange Fusarium sp.

F 12’ Rhizosphère Béchar ras muqueux

(type sauvage)

Violet pâle F.o.a.

(saprophyte)

F 12’’ Rhizosphère Béchar

ras Orange Fusarium sp.

F 13 Rachis Adrar ras muqueux

(type sauvage)

Rose orangé F.o.a.

F 14’ Rhizosphère Béchar ras muqueux Blanc Fusarium sp.

F 15 Rachis Ghardaïa ras blanc Fusarium sp.

-63-

Résultats

Figure n° 18 : Représentations des différents morphotypes rencontrés.

Figure n° 18 -a- :

Morphotype cotonneux

Figure n° 18 -b- :

Morphotype duveteux

Figure n° 18 -c- :

Morphotype ras muqueux

-64-

Résultats

Figure n° 19 : Représentation des différents aspects morphologiques des isolats de F.o.a.

L’isolat F1 L’isolat F4

L’isolat F7 L’isolat F8

L’isolat F12’ L’isolat F13

-65-

Résultats

2.2/ Caractères microscopiques :

Le champignon qui sort des tissus de palmier présente un mycélium fin blanc, cloisonné. Il

produit trois types de spores caractéristiques du genre Fusarium (Figure n° 20) :

* Les microconidies, sont nombreuses, le plus souvent unicellulaires et quelques fois

bicellulaires, regroupées en fausses têtes. Elles sont produites par des phialides courtes en

forme de bouteille implantées perpendiculairement sur le mycélium (Figure n° 20 -a-).

* Les macroconidies, sont courbes, cloisonnées de 2 à 3 cloisons, rarement plus, (Figure

n° 20 -b-). Elles ne sont produites en quantité par le F.o.a. que lors du premier isolement en

présence de palmier. Dés que le champignon est repiqué, il perd sa capacité à produire des

macroconidies.

* Les chlamydospores, produites soit à partir du mycélium, soit à partir des macroconidies.

Elles sont lisses et produites en grande quantité dans les cultures âgées

(Figure n° 20 -c-).

Suivant ces caractéristiques, seules les souches sauvages isolées du rachis (F1-F4-F7-F8-

F13) et une souche saprophyte du sol (F12’) sont des Fusarium oxysporum (Figure n° 19), les

autres isolats appartenaient à d’autres espèces du genre Fusarium.

2.3/ Effet des différents milieux de culture :

Sous les conditions de culture utilisées, trois critères morphologiques sont pris en

considération (l’aspect du mycélium, sa pigmentation et la vitesse de croissance de la colonie).

Le mycélium de tous les isolats (F1-F4-F7-F8 et F13), s’est très bien développé sur le

milieu PDA, avec un aspect ras muqueux et une pigmentation naturelle (Figure n° 21),

contrairement aux deux autres milieux (Czapeck et Mathur), qui permettent une bonne

croissance mais la colonie a une faible pigmentation : blanchâtre sur le milieu Czapeck (Figure

n° 22) et presque transparente sur le milieu Mathur (Figure n° 23).

La vitesse de croissance de tous les isolats est presque similaire sur les trois milieux de

culture. Le Tableau n° 10 et la Figure n° 24, illustrent les résultats du diamètre moyen, calculé

après 10 jours d’incubation et d’une manière quotidienne, selon la méthode des deux sens

perpendiculaires.

-66-

Résultats

Figure n° 20 : Observations au microscope optique des trois types de spores de F.o.a .

au grossissement (X 400).

-a-

-b-

-c-

1

2

3

4

5

6

1 : microconidies en fausse tête 2 : monophialide courte 3 : mycélium

4 : macroconidie 5 : chlamydospore 6 : microconidie

6,8 µm

5 µm

6,8 µm

-67-

Résultats

Figure n° 21 : Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu PDA.

Figure n° 22 : Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu Czapeck.

Figure n° 23 : Aspect du mycélium des cinq isolats sur le milieu Mathur.

F1 F4

F7 F8

F13

F1 F4

F7

F13

F8

F1 F4

F7 F8

F13

F8

F8

F7

F7

-68-

Résultats

Tableau n° 10 : Diamètre moyen (cm) des cinq isolas sur les trois milieux de culture.

Figure n° 24 : Représentation graphique de l’influence des différents milieux de culture sur la

croissance des isolats de F.o.a.

0

1

2

3

4

5

6

PDA Czapeck Mathur

Dia

mèt

re d

e la

co

lon

ie (

cm)

Milieux de culture

F 1

F 4

F 7

F 8

F 13

Milieux

Souches

PDA Czapeck Mathur

F 1 4,995 3,958 4,79

F 4 4,878 5,063 4,882

F 7 4,998 4,699 4,965

F 8 4,877 4,783 5,015

F 13 5,413 5,211 4,911

-69-

Résultats

III/ Etude physiologique de F.o.a. :

3.1/ Influence de la température :

Après 07 jours d’incubation, on remarque que la température optimale pour la croissance

de notre souche F13 est de 28 °C avec une colonie de 5,12 cm de diamètre, au-dessous et au-

dessus de celle-ci, la croissance mycélienne se voit ralentir, c’est ce qui est rapporté sur la

Figure n° 25.

3.2/ Influence des sources carbonées :

Les résultats représentés par la Figure n° 26, montrent que le maltose et le glucose

permettent une meilleure croissance pour notre souche F13.

L’amidon constitue une source de carbone non négligeable, par contre une croissance

moyenne de notre souche F13 est remarquée chez le témoin avec le saccharose comme source

de carbone.

3.3/ Influence des sources azotées :

Les résultats représentés par la Figure n° 27, montrent que l’utilisation des nitrates de

potassium donne une très bonne croissance. L’asparagine est la deuxième source permettant

une bonne croissance. En revanche, le sulfate d’ammonium, inhibe fortement la croissance de

notre souche F13.

3.3/ Influence de la lumière :

La croissance de notre souche F13 en obscurité continue est maximale. Elle est bonne sous

photopériode de 12 heures, et moyenne sous éclairage continu. Ceci est confirmé par la Figure

n° 28.

3.4/ Influence du pH du milieu :

On remarque qu’au pH extrême (pH = 4), notre souche F13 s’est développée mais très

faiblement. L’optimum se situe à pH 5 et une gamme allant de 5,5 jusqu’à 8 permet aussi une

bonne croissance (Figure n° 29).

-70-

Résultats

Figure n° 25 : Représentation graphique de

l’influence des températures sur la

croissance de l’isolat F13.


l’influence de la source de carbone sur la



l’influence d’éclairage sur la croissance de

l’isolat F13.


l’influence de la source d’azote sur la


-71-

0

1

2

3

4

5

Ec. Con. Ob. Con. Photo. 12H

0

1

2

3

4

5

6

15° C 22° C 28° C 35° C

4.2

4.3

4.4

4.5

4.6

4.7

Glucose Maltose Amidon

0

1

2

3

4

5

Asparagine NH4SO4 KNO3

Diamètre (cm) Diamètre (cm)

Diamètre (cm) Diamètre (cm)

Résultats

Figure n° 29 : Représentation graphique de l’influence du pH du milieu sur la croissance de

l’isolat F13.

Figure n° 30 : Représentation graphique de l’influence du taux d’humidité sur la croissance

de l’isolat F13.

-72-

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

pH = 4 pH = 5 pH = 7 pH = 8

Diamètre (cm)

Diamètre (cm)

Résultats

3.5 Influence du taux d’humidité :

La croissance mycélienne est meilleure avec un taux d’humidité de 80 %, les taux de 75 %

et 50 % permettent eux aussi une bonne croissance du champignon.

La croissance de notre souche F13 semble moyenne aux taux très élevés : 95 % et 100 %

et est sensible aux taux très bas : 14 %. C’est ce qui confirme la Figure n° 30.

IV/ Estimation du pouvoir pathogène :

Nous avons débuté les notations des symptômes, 01 mois après l’inoculation Ces notations

consistent à relever le nombre de plantule mortes, provoqué par chaque souche et est exprimé

en pourcentage de mortalité (Tableau n° 11).

Les plantules infectées, présentent différents symptômes d’altérations, tel qu’un

jaunissement suivi d’un dessèchement puis un dépérissement des feuilles jusqu’à la mort totale

de la plante. Ceci est rapporté sur la Figure n° 31.

Pour pouvoir confirmer les symptômes constatés du pouvoir pathogène de chaque souche,

le réisolement du champignon, a révélé sa dans le sol, les racines et la tige de chaque plantule

Tableau n° 11 : Pourcentage de mortalité des plantules de palmier dattier.

Souches de F.o.a. Nombre de

plantules atteintes

Pourcentage de

mortalité (%)

F1 4 80%

F4 2 40%

F7 2 40%

F8 4 80%

F12’ 1 20%

F13 3 60%

-73-

Résultats

Figure n° 31 : Différents symptômes notés chez les plantules de palmier dattier.

A

C

C

E

F

D

A : Plantule de palmier dattier saine (témoin) B : Jaunissement C et D : Dessèchement

E : Dépérissement F : Mort totale de la plantule

B

-74-

Résultats

V/ Dosage des protéines des isolats de F.o.a. :

Après la lecture au spectrophotomètre à la longueur d’ondes λ = 595 nm, les résultats de la

densité optique de chaque dilution sont représentés sur le Tableau n° 12. Ils seront par la suite

reportés sur la Figure n° 32 qui constitue la courbe d’étalonnage D.O. = f (concentrations).

La concentration en protéine dans chaque échantillon d’extrait enzymatique, est calculée

par l’équation de la droite de la courbe d’étalonnage (Tableau n° 13).

VI/ Électrophorèse :

Le gel de polyacrylamide a servi pour l’étude isozymique des isolats de F.o.a. (F1-F4-F7-

F8-F12’ et F13), récoltés des différentes régions du Sahara Algérien. Trois systèmes

enzymatiques ont été étudiés.

6.1/ Estérases :

Ce système révèle un profil électrophorétique de 04 bandes chez tous les isolats de F.o.a.

Les bandes sont parfaitement visibles, d’une intensité variable et, d’une couleur rouge brique

ou marron (Figure n° 33).

6.2/ Phosphatases :

Le profil électrophorétique des phosphatases des isolats de F.o.a. révèle la présence d’une

seule bande lisible et visible d’une intensité variable et d’une couleur marron (Figure n° 34).

6.3/ Peroxydases :

La révélation de ce système est négative. Le profil électrophorétique n’a présenté aucune

bande visible pour les isolats de F.o.a. (Figure n° 35).

6.4/ Protéines totales :

La révélation des bandes protéiques sur le gel de polyacrylamide en présence du SDS,

montre la présence de plusieurs bandes sur un profil électrophorétique presque similaires pour

tous les isolats de F.o.a. (Figure n° 36).

-75-

Résultats

Tableau n° 12 : Densité optique (D.O.) de chaque dilution.

Figure n° 32 : Courbe d’étalonnage.

Tableau n° 13 : Densité optique (D.O.) et concentration en protéines dans chaque extrait

enzymatique des isolats de F.o.a.

Dilutions 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10

D.O. 0,869 0,840 0,824 0,782 0,776 0,734 0,719 0,701 0,689

Dilutions 1/11 1/12 1/13 1/14 1/15 1/16 1/17 1/18 1/19

D.O. 0,666 0,660 0,631 0,578 0,573 0,560 0,552 0,532 0519

Souches F1 F4 F7 F8 F12’ F13

D.O. 0,312 0,277 0,332 0,204 0,351 0,281

Concentration en

protéines (µg/ml) 14,65 12,93 15,63 9,35 16,56 13,13

-76-

Concentration de SBA (µg / ml)

D.O

.

Résultats

Figure n° 33 : Profil électrophorétique des estérases chez les isolats de F.o.a.

Figure n° 34 : Profil électrophorétique des phosphatases chez les isolats de F.o.a.

F13 F12’ F8 F7 F4 F1

( - )

( + )

F13 F12’ F8 F7 F4 F1

F1 F4 F7 F8 F12’ F13 F1 F4 F7 F8 F12’ F13

( - )

( + )

-77-

Résultats

Figure n° 35 : Profil électrophorétique des peroxydases chez les isolats de F.o.a.

Figure n° 36 : Profil électrophorétique des protéines totales chez les isolats de F.o.a.

F1 F4 F7 F8 F12’ F13

F1 F4 F7 F8 F12’ F13 F1 F4 F7 F8 F12’ F13

( + )

( - )

-78-

Résultats

VII/ Lutte chimique contre l’isolat F13 de F.o.a. :

Les 20 fongicides testés in vitro contre F.o.a., sont répartis en trois séries selon leurs

natures chimiques. Ce test révèle l’efficacité de certaines de ces substances fongicides,

déterminée par le calcul du diamètre moyen de la colonie, pendant les 10 jours d’incubation

(Tableaux n° 14-16-18) ainsi que par le calcul du taux d’inhibition de chaque produit et à

chaque concentration testée (Tableaux n° 15-17-19).

Les résultats obtenus sont illustrés par les Figures n° 38, 39 et 40. La Figure n° 37 est un

exemple de l’effet d’une substance fongicide (P2) sur la croissance mycélienne de l’isolat F13

de F.o.a.

Figure n° 37 : Effet de la substance fongicide (P2) à différentes concentrations sur la

croissance mycélienne de l’isolat F13de F.o.a.

0 ppm 50 ppm 100 ppm

200 ppm 400 ppm

-79-

Résultats

Tableau n° 14 : Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la première série des

substances fongicides.

Tableau n° 15 : Taux d’inhibition (%) de la première série des substances fongicides contre

l’isolat F13.

Figure n° 38 : Représentation graphique du diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté

avec la première série des substances fongicides.

O1 P2 P3 M4 M5

0 ppm 3,95 4,65 5,91 4,35 3,51

50 ppm 3,96 4,63 5,43 3,26 3,38

100 ppm 4,48 3,66 4,65 5,51 3,6

200 ppm 3,43 2,68 4,01 5,31 3,28

400 ppm 3,48 2,53 3,81 4,7 2,75

O1 P2 P3 M4 M5

50 ppm - 0,43 8,12 25,1 3,7

100 ppm - 21,29 21,3 - -

200 ppm 13,16 42,36 32,1 - 6,55

400 ppm 11,89 45,59 35,5 - 21,7

-80-

0

1

2

3

4

5

6

O1 P2 P3 M4 M5

Dia

mèt

re

mo

yen

de

la c

olo

nie

(cm

)

0 ppm

50 ppm

100 ppm

200 ppm

400 ppm

Résultats

Tableau n° 16 : Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la deuxième série des


Tableau n° 17 : Taux d’inhibition (%) de la deuxième série des substances fongicides contre

l’isolat F13.


avec la deuxième série des substances fongicides.

Am1 Am2 Am3 Am4 Am5 Am6 Am7

0 ppm 4,93 4,28 2,11 4,08 3,13 3,43 3,26

50 ppm 4,38 3,61 2,3 6,03 2,08 1,23 3,18

100 ppm 4,83 2,33 2,3 5,11 2,16 1,01 3,36

200 ppm 4,88 2,63 2,26 5,81 2,3 0,76 3,41

400 ppm 4,86 2,28 2,26 4,01 2,78 1,48 4,36


50 ppm 11,15 15,65 - - 33,5 64,13 3,04

100 ppm 2,02 45,65 - - 31 70,55 -

200 ppm 1,01 38,55 - - 26,5 77,84 -

400 ppm 1,41 46,72 - 1,71 11,2 56,84 -

-81-

0

1

2

3

4

5

6

7


Dia

mèt

re m

oy

en d

e la

co

lon

ie (

cm)

0 ppm

50 ppm

100 ppm

200 ppm

400 ppm

Résultats

Tableau n° 18 : Diamètre moyen (cm) de l’isolat F13 confronté avec la troisième série des


Tableau n° 19 : Taux d’inhibition (%) de la troisième série des substances fongicides contre

l’isolat F13.


avec la troisième série des substances fongicides.

ZS49 ZS50 ZS54 ZS55 ZS 60 ZS 61 ZS65 ZS 66

0 ppm 3,46 3,8 3,5 2,98 4,16 4,18 3,9 4,13

50 ppm 2,81 3,03 2,95 3,68 3,05 2,8 2,78 3,25

100 ppm 2,73 2,56 2,3 2,7 2,88 2,65 2,61 3,38

20 ppm 2,95 2,46 1,55 3,11 2,48 2,48 1,9 3,68

400 ppm 2,8 2,7 1,11 4,06 2,16 3,15 1,95 4,46

ZS 49 ZS 50 ZS 54 ZS 55 ZS 60 ZS 61 ZS 65 ZS 66

50 ppm 18,78 20,26 15,7 - 27 31,87 28,71 21,3

100 ppm 21,09 32,63 34,3 9,39 31,1 35,52 33,07 18,15

200 ppm 14,73 35,26 55,7 - 40,7 39,65 51,28 10,89

400 ppm 19,07 28,94 68,3 - 48,3 23,35 50 -

-82-

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

ZS49 ZS50 ZS54 ZS55 ZS 60 ZS 61 ZS65 ZS 66

Dia

mèt

re m

oy

en d

e la

co

lon

ie (

cm)

0 ppm

50 ppm

100 ppm

20 ppm

400 ppm

Résultats

XI/ Lutte biologique contre les isolats de F.o.a. :

8.1/ L’agent antagoniste :

La culture des souches de Trichoderma harzianum sur le milieu Davet révèle la présence

d’un mycélium très clair étalé sur le milieu gélosé, avec des arborescences terminées par des

formations sphériques de couleur verte irrégulières : « têtes » (Figure n° 41).

L’observation microscopique de Trichoderma harzianum montre que l’organisation des

structures conidiogènes est telle que des ramifications qui se répartissent perpendiculairement

et de façon opposée de part et d’autre d’un axe principal qui est le conidiophore (Figure n° 42),

les spores à paroi lisse, sont de forme ovalaire et de couleur verte.

Figure n° 41 : Culture de Trichoderma harzianum sur milieu Davet.

Figure n° 42 : Observation au microscope optique de Trichoderma harzianum

(G x 400).

4 µm 1

2

3

1 : spore

2 : phialide

3 : conidiophore

-83-

Résultats

8.2/ Test de l’activité antagoniste de Trichoderma harzianum :

Le repiquage simultané de Trichoderma harzianum et des isolats de F.o.a. (F1-F4-F7-F8

et F13) a montré une croissance plus rapide de l’agent antagoniste que celle des isolats de

F.o.a. Au bout de quatre jours d’incubation, la boite de Pétri est totalement envahie par

l’antagoniste, alors que les isolats de F.o.a. n’occupent qu’une petite surface, ce qui correspond

à une inhibition de la croissance mycélienne. Le diamètre moyen de la colonie mycélienne de

chaque isolat de F.o .a. ainsi que le taux d’inhibition pour les deux techniques du test de

l’activité antagoniste (contact direct et action des filtrats de culture), sont mentionnés dans les

Tableaux n° 20 et 21 et illustrés par les Figures n° 43,44, et 45.

Tableau n° 20 : Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux d’inhibition (%) des

différentes souches de Trichoderma par contact direct.

Figure n° 43 : Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. en contact direct avec les

différentes souches de Trichoderma pendant 4 jours d’incubation.

F1 T.H.% F4 T.H.% F7 T.H.% F8 T.H.% F13 T.H.%

T1 2,7 22,8 1,26 54,2 2,6 16,6 2,38 28,3 2,8 30,9

T2 2,7 22,8 1,52 47,1 2,44 21,8 1,96 40,9 2,62 36,0

Tm 2,62 25,1 2,2 22,5 2,16 30,7 2,4 27,7 2,82 31,2

Témoin 3,5 2,84 3,12 3,32 4,12

-84-

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

F1 F4 F7 F8 F13

T1

T2

Tm

Témoin

Diamètre moyen de la

colonie (cm)

Résultats

Tableau n° 21 : Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. et le taux d’inhibition (%) des

différentes souches de Trichoderma par action des filtrats de culture.

Figure n° 44 : Diamètre moyen (cm) des isolats de F.o.a. sous l’action des filtrats de

culture des différentes souches de Trichoderma pendant 4 jours d’incubation.

Figure n° 45 : Taux d’inhibition (%) de Trichoderma harzianum contre les isolats de

F.o.a. pour les deux techniques de confrontations.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

F1 F4 F7 F8 F13

T1

T2

Tm

Témoin

Diamètre moyen de la

colonie (cm)

F1 T.H.% F4 T.H.% F7 T.H.% F8 T.H.% F13 T.H.%

T1 2,43 42,9 2,98 40,0 2,65 45,3 2,66 32,1 2,92 39,9

T2 2,43 42,9 2,31 53,4 2,15 35,6 2,08 47,0 2,45 49,6

Tm 1,26 70,2 1,63 67,1 1,5 55,0 1,4 64,3 1,8 63,0

Témoin 4,26 4,97 3,33 3,93 4,86

0

10

20

30

40

50

60

F1 F4 F7 F8 F13

0

10

20

30

40

50

60

70

80

F1 F4 F7 F8 F13

Action des Filtrats de Culture Contact Direct

T1 T2 Tm T.H. (%) T.H. (%)

-85-

Résultats

Le test de l’activité antagoniste de Trichoderma harzianum contre les isolats de F.o.a., que

se soit par contact direct sur milieu de culture ou par l’action des filtrats de culture, révèle un

recouvrement des isolats de F.o.a. par le mycélium de l’agent antagoniste sur toute la surface

de la boite de Pétri, avec l’existence de fructification de ce dernier sur les isolats de F.o.a. et la

sécrétion de substance jaune dans la zone de contact (Figure n° 46 et 47).

Figure n° 46 : Contact direct sur milieu de culture entre Trichoderma harzianum et F.o.a.

1° Jour d’incubation 4° Jour d’incubation Témoin

Croissance rapide de l’agent

antagoniste (pastille à droite) dés le

premier jour d’incubation par

rapport à l’agent pathogène

(pastille à gauche).

Envahissement total de la boite de

Pétri par l’agent antagoniste avec

la sécrétion de la substance jaune.

Croissance de l’agent pathogène

seul (témoin) en absence de l’agent

antagoniste.

Témoin

-86-

Résultats

Figure n° 47 : Action des filtrats de culture de Trichoderma harzianum sur la croissance de

F.o.a.

Croissance de l’agent antagoniste à

partir du filtrat de culture et

envahissement de la boite de Pétri

par rapport à l’agent pathogène

(pastille du centre).

Envahissement total par l’agent

antagoniste et production de

fructifications sur l’agent

pathogène (pastille du centre).

Croissance de l’agent pathogène

seul (témoin) en absence du filtrat

de culture de l’agent antagoniste.

1° Jour d’incubation 4° Jour d’incubation Témoin

-87-

Discussions

Discussions

Notre travail de recherche s’inscrit dans le cadre de l’étude de la caractérisation

morphologique et physiologique de l’espèce Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, l’agent

causal de la maladie du « Bayoud » (fusariose vasculaire) du palmier dattier, avec comme

objectif : essayer un moyen de lutte in vitro, par des substances fongicides, d’un côté et par

l’utilisation de l’agent antagoniste le Trichoderma harzianum, d’un autre côté.

1/ L’étude morphologique de nos isolats, a fait apparaître trois morphotypes différents : l’aspect

cotonneux, l’aspect duveteux et l’aspect ras muqueux.

Cette diversité morphologique du genre Fusarium obtenue est identique à celle observée dans

les travaux de (Ouinten, 1996) sur la même espèce Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, ainsi

que ceux menés par (Guessas, 1993 ; Henni, 1998 et Hamini, 2002) sur Fusarium oxysporum

f.sp. lycopersici.

2/ L’étude microscopique des souches nous a démontré que le mycélium est cloisonné avec

l’apparition des trois sortes de spores ; les microconidies, les macroconidies et les

chlamydospores.

Ces résultats sont concordants avec ceux auxquels ont abouti (Armstrong et Armstrong, 1981 ;

Henni, 1998; Toshiaki et Takashi, 2004).

3/ S’agissant de l’étude physiologique,

3.1/ Le test d’influence de la source carbonée sur la croissance du Fusarium oxysporum

f.sp. albedinis fait apparaître une préférence pour le glucose et le maltose. Une bonne

croissance est enregistrée sur le milieu contenant l’amidon comme source de carbone, et ce, à

l’instar des résultats obtenus dans les différents travaux menés auparavant par (Lopez et Fergus,

1965; Bounaga, 1970; Henni, 1998 et Hamini, 2002).

3.2/ L’influence de la source azotée sur la croissance du Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis nous a montré une meilleure croissance sur des milieux contenant les nitrates de

sodium et les nitrates de potassium, confirmant ainsi les conclusions des différents auteurs qui

estiment que la plupart des Fusarium pathogènes préfèrent l’azote organique que l’azote

minéral (Wolf, 1966 ; Lopez et Fergus, 1965 ; Hamini, 2002).

-89-

Discussions

Par ailleurs, Une croissance inhibée de notre souche a été remarquée sur le milieu

contenant le sulfate d’ammonium comme seule source azotée. Les mêmes constatations ont été

faites par (Guessas, 1993 ; Ameziane, 1997).

4/ L’étude du pouvoir pathogène, nous a permis de constater que tous les isolats du Fusarium

oxysporum f.sp. albedinis, issus du rachis, étaient pathogènes (après une période de 3 mois et

plus ou moins quelques semaines), sur les plantules du palmier dattier obtenues après la

germination des noyaux de dattes, avec un degré de pathogénicité variable. Nos observations

concordent avec celles obtenues par (Ouinten, 1996).

Parmi les 05 plantules inoculées, nous avons enregistré 04 plantules détruites pour chacun des

isolats F1 et F8, avec un pourcentage de mortalité de 80 % et 03 plantules pour l’isolat F13 où

le taux de mortalité a atteint 60 %.

Chez les isolats F4 et F7, le taux de mortalité enregistré a atteint 40 %, soit 02 plantules sur la

totalité.

Par ailleurs, nous avons constaté que, seul l’isolat F12’, issu de la rhizosphère dégage le

nombre le plus faible des plantules atteintes (01 seule), soit un taux de mortalité de 20 %.

5/ L’étude du polymorphisme isoenzymatique, par la révélation des estérases et des

phosphatases acides, ainsi que les protéines totales de nos isolats du Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis, nous a montré une similarité des profils électrophorétiques entre les isolats pour

chaque système révélé. Le même constat a été fait par (Bounaga, 1985).

Nous avons, en ce qui nous concerne enregistré une absence totale de bandes pour la révélation

des peroxydases, chez tous les isolats de F.o.a., peut être que le réactif de révélation était

périmé.

A la lumière des résultats obtenus dans les études morphologiques, microscopiques et

physiologiques (citées précédemment), nous avons lancé nos essais des luttes chimique et

biologique contre le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, pendant plusieurs mois pour enfin,

aboutir aux constats suivants :

-90-

Discussions

Dans la première série des substances fongicides, nous n’avons pas pu calculer le taux

d’inhibition pour le produit O1 (à 50 et 100 ppm), le produit M4 (à 100, 200 et 400 ppm) et le

produit M5 (à 100 ppm) ; puisque le diamètre de l’isolat F13 dans ces concentrations (le test),

dépasse celui du témoin (0 ppm).

Le taux d’inhibition de la croissance mycélienne de l’isolat F13, calculé pour cette série de

substances fongicides, varie considérablement de 0,43% (le taux le plus faible) à 45,59 % (le

taux le plus élevé).

Les meilleurs pourcentages d’inhibition sont obtenus avec le produit P2 (42,36 % à 200 ppm et

45,59 % à 400 ppm) et le produit P3 (32,1 % à 200 ppm et 35,5 % à 400 ppm). Cela implique

que la CMI50 de ces deux produits (P2 et P3), dépasse la concentration 400 ppm.

Dans la deuxième série des substances fongicides, nous avons constaté qu’il existe une

différence dans l’efficacité entre chaque produit testé.

En premier lieu,

les produits Am3 - Am4 et Am7, ne montrent aucune inhibition de l’isolat F13 ;

autrement dit, ces 03 produits n’ont aucun effet sur la croissance mycélienne du champignon.

Le produit Am1, quant à lui, présente un taux très faible de 11,15 % (à 50 ppm), qui

devient négligeable dans les concentrations qui suivent (2,02 % à 100 ppm, 1,01 à 200 ppm et

1,41 à 400 ppm).

En second lieu, le produit Am5 présente une dégradation du pourcentage d’inhibition, où

l’efficacité commence avec un pourcentage de 33,5 % à 50 ppm, puis décroit à 31% à 100 ppm

et chute enfin à 11,2 % à 400 ppm.

En dernier lieu, et concernant les 02 produits restants (Am2 et Am6), nous avons pu enregistrer

pour le premier, un taux d’inhibition relativement élevé 46,72 % à 400 ppm par contre, le

second a dégagé le taux le plus élevé soit 77,84 % à 200 ppm. Dans ce cas, nous pouvons

estimer la CMI50 supérieure à 400 ppm, pour le produit Am2 et inférieure à 400 ppm pour le

produit Am6.

-91-

Discussions

Dans la troisième série des substances fongicides, les molécules de triazoles ZS54,

ZS60 et ZS6 testées sur la souche fongique F.o.a. F13, ont exercé un effet inhibiteur sur sa

croissance mycélienne à une concentration de 400 ppm avec un taux de 68.3 %, 48.3 % et 50 %

respectivement.

Avec les autres substances testées on remarque une inhibition au niveau des

concentrations 50 ppm, 100 ppm et 200 ppm; mais avec la concentration de 400 ppm on note

un rehaussement de la croissance de la souche F13 qui fait penser à l’hypothèse de résistance

ou de mutation.

Parmi ces substances on citera la ZS50 et ZS61 où la croissance à 400 ppm est plus

importante que celle notée avec les concentrations 50 ppm et 100 ppm. Elles enregistrent un

taux d’inhibition maximal avec les concentrations 100 et 200 ppm, soit 35 % à 200 ppm et 39,

6 % à 200 ppm respectivement.

Les substances ZS55 et ZS66 n’ont aucune activité inhibitrice envers la croissance

mycélienne de la souche F13 du Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.

Les résultats obtenus dans la lutte biologique contre le Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis par l’agent antagoniste Trichoderma harzianum, nous a montré une nette réduction du

diamètre moyen de la croissance mycélienne, une zone d’inhibition dès le 1er

jour et un

envahissement total de la boite de Pétri par l’agent antagoniste au bout de 4 jours d’incubation.

S’agissant de la confrontation directe sur milieu de culture entre le Fusarium oxysporum

f.sp. albedinis et les 03 souches de Trichoderma harzianum, elle nous a démontré que la

croissance radiale maximale des isolats ne dépasse les 30 mm, ce qui nous a permis

d’enregistrer l’inhibition la plus élevée avec les taux de :

54 % obtenu par la souche (T1) contre l’isolat (F4),

47 % obtenu par la souche (T2) contre le même isolat,

31 % obtenu par la souche (Tm) contre l’isolat (F13).

Quant à l’action des filtrats de culture de l’agent antagoniste Trichoderma harzianum,

contre le Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, elle a démontré un ralentissement de la

croissance mycélienne, à travers les taux d’inhibition suivants :

-92-

Discussions

45 % avec la souche (T1) contre l’isolat (F7),

53 % avec la souche (T2) contre l’isolat (F4),

70 % avec la souche (Tm) contre l’isolat (F1).

Dans ce même sens, l’observation est faite par (Benhamou et Chet, 1996) en réalisant

une confrontation directe sur milieu de culture entre cet antagoniste et un autre champignon

tellurique, le Pythium ultimum et ce au bout de quatre à cinq jour après l’inoculation. Daami-

Remadi et El Mahjoub (2001), ont signalé, en testant l’activité antagoniste de Trichoderma

harzianum, vis-à-vis de deux espèces de Pythium, que pendant les trois premiers jours, la boite

de Pétri est totalement envahie par Pythium spp. et que Trichoderma harzianum ne commence

à exercer son activité antagoniste qu’à partir du quatrième jour d’incubation. Quant à Hibar et

al., 2005, qui ont travaillé sur le Trichoderma harzianum contre le Fusarium oxysporum f.sp.

radicis-lycopersici, ont trouvé que les isolats de l’agent pathogène n’occupent qu’une surface

de 20 mm de diamètre, ce qui correspond à une inhibition de 65 %. Le témoin cultivé seul

occupe une surface d’environ 50 mm de diamètre.

-93-

Conclusion

Conclusion

Notre travail au Laboratoire de Phytopathologie, Département de Biologie, à l’Université

d’Oran Es-Sénia, a porté principalement sur trois axes de recherche :

1- L’identification et la caractérisation des isolats de Fusarium oxysporum f.sp. albedinis

par une étude morphologique des caractères macroscopiques et microscopiques ainsi

que l’influence de quelques facteurs physico-chimiques sur la croissance mycélienne.

2- L’étude du polymorphisme isoenzymatique des isolats de Fusarium oxysporum f.sp.

albedinis par la révélation des protéines totales et de trois systèmes enzymatiques à

savoir : les estérases, les phosphatases acides et les peroxydases.

3- Les effets ou résultats de la lutte contre Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, que ce soit

une lutte chimique par des substances fongicides ou une lutte biologique par l’agent

antagoniste Trichoderma harzianum.

L’expérience menée au Laboratoire, pendant plusieurs mois, sous l’œil vigilant de notre

encadreur, qui fut aussi riche en évènements et leçons que frustrante (notamment l’analyse

électrophorétique), n’est pas sans insuffler une certaine fierté, dans la mesure où, elle nous

a permis de constater de visu, essentiellement, les opérations suivantes :

Le processus infectieux (le pouvoir pathogène),

L’inhibition de la maladie sous l’effet des substances fongicides,

L’effet nettement antagoniste de Trichoderma harzianum contre le Fusarium

oxysporum f.sp. albedinis.

Il faut croire et reconnaitre que des actions substantielles, difficiles et voire

douloureuses ont été menées, avec un dévouement constant, en vue de parvenir aux résultats

souhaités et présenter un travail qui puisse être utile aux lecteurs d’une manière générale et aux

professionnels d’une manière particulière.

Les résultats auraient été meilleurs, n’eussent été :

- La vétusté du matériel et des équipements,

- L’exiguïté du Laboratoire,

- Le travail discontinu (afin de permettre à d’autres étudiantes et étudiants d’effectuer leurs

travaux),

- La rareté de certains produits chimiques.

-95-

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-108-

Annexes

Annexes

Annexe n° 01 : Composition des milieux de culture

- Tous les milieux de culture sont stérilisés à l’autoclave à 120 °C pendant 20 minutes sous une

pression de 1 bar.

* Milieu PDA (g/ l) :

Pomme de terre …………………….. 200 g

Glucose …………………….. 20 g

Agar agar …………………….. 20 g

Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml

- La pomme de terre est épluchée, coupée en petits dés puis cuite dans un litre d’eau distillée.

Après cuisson, le filtrat est récupéré, ajusté à 1000 ml puis ajuster le pH à 5,5.

* Milieu Czapek (g/ l):

Saccharose …………………….. 30 g

KH2PO4 …………………….. 1 g

KCl …………………….. 0,5 g

Na2No3 …………………….. 2 g

MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g

FeSO4 …………………….. 0,1 g

Agar agar …………………….. 20 g


pH = 5,6

* Milieu Mathur (g/ l):

Extrait de levure …………………….. 0,5 g

KH2PO4 …………………….. 2,72 g

Peptone …………………….. 1,5 g

MgSO4 7H2O …………………….. 1,23 g

Glucose …………………….. 2,8 g

Agar agar …………………….. 20 g


pH = 5,6

-110-

Annexes

* Gélose 2 % :

Agar agar …………………….. 20 g


* Milieu SNA (g/ l) :

KH2PO4 …………………….. 1 g

KNO3 …………………….. 1 g

KCl …………………….. 0,5 g

MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g

Glucose …………………….. 0,2 g

Sucrose …………………….. 0,2 g

Agar agar …………………….. 20 g


- Placer une à deux pièces de papier filtre stérile par autoclavage (1 cm2), sur la surface du

milieu après qu’il soit gélifié (pour la sporulation et comme autre source de carbone).

* Milieu Davet (g/ l) :

Ca (NO3)2 …………………….. 1 g

CaCl2 …………………….. 1 g

KNO3 …………………….. 250 mg

MgSO4 7H2O …………………….. 250 mg

KH2PO4 …………………….. 125 mg

Saccharose …………………….. 2 g

Acide citrique …………………….. 50 mg

Agar agar …………………….. 25 g


pH = 4,5

-111-

Annexes

Annexe n° 02 : Composition des solutions d’électrophorèse

* Tampon de charge (PAGE) :

Glycérol …………………….. 5 ml

Bleu de bromophénol 1% …………………….. 1 ml


Le tampon est réparti à raison de 0,5 ml par tube à hémolyse avant d’être conservé au

congélateur jusqu’au moment de l’emploi.

* Tampon de charge (SDS-PAGE) :

(Tris-HCl: 0,125 M; SDS: 4%; Glycérol: 20%; 2- Mercaptoethanol 0,04 %; pH= 6 ,8)

Tris-HCl (0,5 M) …………………….. 1,25 ml

SDS 10 % …………………….. 2 ml

Glycérol …………………….. 5 ml

2- Mercaptoethanol …………………….. 0,5 ml

Bleu de Bromophénol 1 % …………………….. 1 ml


Le tampon est réparti à raison de 0,5 ml par tube à hémolyse avant d’être conservé au

congélateur jusqu’au moment de l’emploi.

* Tampon de migration :

(Tris : 0,25 M ; Glycine : 1,92 M ; SDS : 0,1 % ; pH=8,3)

Tris …………………….. 3,03 g

Glycine …………………….. 14,4 g

SDS (pour le système SDS-PAGE) …………………….. 1 g


Le tampon est conservé au réfrigérateur.

-112-

Annexes

* Tampon de séparation (Tris-HCl : 1,5 M ; pH = 8,8) :

Tris …………………….. 36,3 g


Le pH est ajusté avec environ 24 ml d’HCl 1N, puis complété à 200 ml avec de l’eau

distillée. Après filtration la solution est conservée à 4°C.

* Tampon de concentration (Tris-HCl : 0,5 M ; pH = 6,8) :

Tris …………………….. 3 g


Le pH est ajusté avec environ 24 ml d’HCl 1N, puis complété à 200 ml avec de l’eau

distillée. Après filtration la solution est conservée à 4°C.

* Tampon Na-phosphate 0,1 M – pH = 7,1 (1) :

Solution A : KH2PO4, H2O …………… 2,76 g dans 100 ml H2O

Solution B : Na2HPO4, 2 H2O …………… 7,12 g dans 100 ml H2O

Ajuster le pH de la solution A à 7,1 avec la solution B.

* Tampon Acétate 0,05 M – pH = 5 (2) :

Acétate de Sodium, 3H2O …………………….. 3,4 g


Ajuster à pH = 5 avec HCl 1N, Compléter à 500 ml avec H2O.

* Solution CaCl2 0,1 M (3) :

CaCl2 …………………….. 1,1 g


-113-

Annexes

Annexe n° 03 : Composition des solutions pour la révélation des bandes

protéiques

* Solution de fixation :

Acide acétique …………………….. 200 ml


* Solution de coloration :

Bleu de coomassie G250 …………………….. 1,5 g

Ethanol …………………….. 250 ml



* Solution de décoloration :

Ethanol …………………….. 250 ml



* Solution de conservation :



-114-

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