Régulation
Nécessité et mécanismes
L’organisme se procure quelques composés, en synthétise la majorité… La vitesse d’approvisionnement (FLUX à travers la voie métabolique) doit répondre à ses besoins.Pour y arriver, il va CONTROLER L’ACTIVITE des enzymes, et REGULER LA CONCENTRATION des métabolites intermédiaires.
FLUX:
Contrôle de l’activité enzymatique:
• Quantité: synthèse et dégradation
• Activité:
– Régulation covalente
– Régulation non covalente
Synthèse/dégradation
ctkEkk
tdEkk
Ed
dds
ds
'])[''ln(
)(][''
][
cEkk
EE t En
ds
])[''ln(
][][,0
0
0
tk
ds
ds
dsdds
deEkk
Ekk
EkktkEkk
'
0
0
][''
][''
])[''ln('])[''ln(
]['')(
][Ekk
td
Edds
Synthèse-dégradation: cinétique
Aug
men
tatio
n de
l’ac
tivité
enz
ymat
ique
2.5 5 7.5 10
Pyruvate kinase (t1/2 24h)
Tryptophane 2-3, dioxygénase (t1/2 2.5h)
Ornithine décarboxylase (t1/2 0.3h)
Temps (heures)
tk
d
s
d
s deEk
k
Ek
k
E
E '
000
1]['
'
]['
'
][
][
Demi vies dans le foie de rat:(extrait de: Fundamentals of Enzymology (3rded) N.C. Price et L. StevensOxford University Press)Enzyme t1/2
Ornithine décarboxylase 20 min
5-aminolevulinate synthase (mitochindriale)
1.2h
RNA polymérase I 1.3 h
Tyrosine aminotransférase 1.5 h
Tryptophane 2,3 dioxygénase
2.0 h
Thymidine kinase 2.6 h
HMG Co-A réductase 4.0 h
Sérine déshydratase 5.2 h
PEP carboxykinase 8.0 h
Déhydro-orotase 12.0 h
RNA polymérase II 13.0 h
Glucose-6-P déshydrogénase 24.0 h= 1.0 j
glucokinase 1.3 j
catalase 1.4 j
Acétyl co-A carboxylase 2.1 j
GAP déshydrogénase 3.1 j
Pyruvate kinase 3.5 j
Arginase 4.5 j
Fructose bisphosphate aldolase 4.9 j
Lactate déshydrogénase 6.0 j
6-PFK 7.0 j
Membranes microsomales
t1/2 (heures)
Cytochrome b5 (out) 0.4
Cytochrome b5 reductase (out)
5.8
NADPH-cytochrome reductase (out)
2.9
NDPase (in) 1.3
Carboxylestérase (in) 4.0
HMG CoA réductase 0.2
NAD+ nucléotidase 18.0
Mitochondrie t1/2 (jours)
Carbamoyl Phosphate synthétase
7.7
Malate déshydrogénase 2.6
Glutamate déshydrogénase
1;0
Carnitine acétyl transférase
1.8
Ornithine amino transférase
1.9
Amine oxidase 2.8
Cytochrome c oxidase >8.0
Pyruvate déshydrogénase
4.5 à 5.6
Recyclage individuel des protéines!
Contrôle de la synthèse et de la dégradation:
• Transcription• Stabilité de l’ARNm (séquences « UA riche », etc)• Traduction• Dégradation de la protéine (séquences « PEST »,
ubiquitinylation, SUMOylation, mais aussi protéolyse régulée de la HMG CoA réductase, « down-regulation » des récepteurs, etc.)
Souvent: régulation coordonnée de toute la voie
Prokaryotes: opérons ( lac)
Eucaryotes: activité multi enzymatique, homologie promoteurs
Fatty acid synthase
Régulation covalente: autres• Phosphorylation: Ser/Thr
– (glycogène phosphorylase, glycogène synthase, Ac CoA carboxylase, F2,6 bis phosphatase/PFK2, GPCRs, etc, etc)
• Phosphorylation: Tyr– (voie de signalisation de l’insuline, de facteurs de
croissance)
• ADP-ribosylation – (protéines G, glutamine synthétase, RNA polymérase, etc)
• Adenylylation, uridylylation, etc– (glutamine synthétase E Coli, etc)
Régulation non covalente:
– Concentration adéquate de substrat, de cofacteur
– Accumulation du produit
– Inhibiteurs/activateurs allostériques
– Protéines inhibitrices (BPTI / trypsine,
protéine nucléaire / glycogène synthase,
glycogène phosphorylase a / glycogène synthase
phosphatase, etc)
Enzymes allostériques et enzymes coopératives
• Enzymes allostériques: – Enzymes régulées par des composés ne ressemblant ni au
substrat, ni au produit de la réactionExemples: inhibition de la phosphofructokinase par l’ATP, …
• Enzymes coopératives:– Enzymes multimériques, cinétique de forme « sigmoïde »
{ v = fct( [S]n) }
Remarque: PAS SYNONYMES!Même si la majorité des enzymes coopératives sont également allostériques, et si beaucoup d’enzymes allostériques sont également coopératives vis-à-vis d’au moins un substrat.
Enzyme coopérative, ou “de type K”:l’aspartate transcarbamoylase
Aspartate transcarbamoylase bactérienne:enzyme coopérative et allostérique
0 20 400
0.5
1
[SUBSTRAT] (mM)
VIT
ES
SE
0 5 100
0.5
1
[SUBSTRAT] (mM)
VIT
ES
SE
ZOOM:
+ATP
+CTP
Controle +ATP
+CTP
Controle
Début de la synthèse des bases puriques: (d)CTP, UTP, dTTP; Inhibé lorsque les purines sont disponibles;activé lorsque les pyrimidines ( (d)ATP, (d)GTP ) sont disponibles
Courbe sigmoïde: pourquoi?
0 2 4 6 8 100
0.5
1
Conformation RConformation TEnzyme allostérique (2sites)
L’enzyme coopérative existe en 2 conformations: R et T. A faibles [S], T prédomine; les courbes v et T sont confondues à très petit [S]. Lorsque [S] augmente, le % R augmente: la vitesse se rapproche de la courbe R
0 0.2 0.4 0.6 0.8 10
0.5
1
[S]
[S]
vitesse
vitesse
T
R
T
R
Monod, Jacob et Changeux:TR
SS
S S
SS
S S
nn
nn
n
n
T
R
cL
cLY
R
TL
K
Sc
K
S Si
)1()1(
)1()1( 11
Deux conformations préexistantes, changement coordonné.
Chaque ligand (substrat, activateur, inhibiteur) favorise une des deux conf.
Koshland, Néméthy et Filmer:
S
S
SS
S S
Deux conformations possibles pour chaque sous unité, chaque ligand peut induire une des deux conformations.
Les ligands n’affectent que la sous unité qu’ils occupent
La réalité: un mélange de ces deux modèles?
SS S
SS S
SS S
SS S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R4 T4RT3R2T2R2T2R3T
Monod-Wyman-ChangeuxKoshland-Néméthy-Filmer
Régulation d’une enzyme coopérative par des régulateurs allostériques:
0 2 4 6 8 100
0.5
1
Enzyme allostérique, 2 sites (T/R = 100)Enzyme allostérique activé (T/R = 10)Enzyme allostérique inhibé (T/R = 1000)
Inhibiteur stabilisant T
Activateur, stabilisant R
Enzyme Michaelienne versus coopérative: apparemment pas grande différence au niveau des vitesses?
0 2 4 6 8 100
0.5
1
Enzyme "Michaelienne"Enzyme allostérique (2 sites)
Mais…pas du tout le même effet sur le « Flux » à travers la voie métabolique:
{ orifice large à la base,
devient de plus en plus étroit }
{ Orifice étroit à la base, s’élargit,
puis redevient très étroit }
0 0.1 0.2 0.30
0.1
0.2
0.3
Enzyme "Michaelienne"Enzyme allostérique (2 sites)
[Substrat]
vite
sse
Pourquoi? Zoom sur les petites concentrations de Substrat:
Enzyme Michaelienne:v varie moins que S
Flux augmente, mais moins que [S]
0 0.1 0.2 0.30
0.1
0.2
0.3
Enzyme "Michaelienne"Enzyme allostérique (2 sites)
[Substrat]
vite
sse Enzyme coopérative:
v varie plus que S
Flux augmente, plus que [S]
Enzyme coopérative
Régulation d’une enzyme coopérative et allostérique:
Inhibiteur, stabilisant la conformation « T »,Activateur, stabilisant la conformation « R »
Régulation de voies métaboliques:
Coordonnée, à plusieurs niveaux.
Pourquoi?
Glucose
Régulation de la glycolyse et du cycle de Krebs:
Synthèse et de la dégradation du glycogène:
AMPc
GlycogèneGlucose P
(Glycogène +Pi) Glucose-P
UDP-glucose glycogène
Synthèse et de la dégradation du glycogène :
glucose
Questions:
On observe en règle générale plusieurs
mécanismes de contrôle dans une voie
métabolique.
• Comment identifier l’enzyme qui contrôle
effectivement la voie?
• A quoi servent les autres contrôles?
• Pourquoi une telle multiplication des contrôles?
• Lorsqu’une même voie conduit à plusieurs
produits, comment l’organisme s’arrange-t-il pour
avoir en permanence une synthèse adéquate de
tous les produits?
• Une vitesse de réaction « Michaelienne » passe
de 10% à 90% du maximum lorsque la [S] passe
de 0.1 à 10 KM («la réponse se développe sur 2
logarithmes »).
– Comment obtenir une réponse « oui/non » (division
cellulaire, apoptose, …)
– au contraire, une réponse graduelle sur 7 à 8
logarithmes (vision)?
Flux, contrôle et régulation?
Le problème: comprendre comment l’organisme s’arrange pour obtenir ce dont il a besoin sans gaspillage:
Il doit pouvoir contrôler le Flux à travers chaque voie de synthèse ou de dégradation, tout en régulant la concentration des métabolites intermédiaires…
Flux, contrôle et régulation:• « Flux » : vitesse de production (et d’utilisation) des différents
métabolites dont l’organisme a besoin. (Par analogie: ventes et réapprovisionnement d’un supermarché)
• « Contrôle » : capacité du système à obtenir un flux adéquat
pour répondre à la demande. (Par analogie: bouton de réglage de la température d’un frigo.)
• « Régulation » : capacité de l’organisme à maintenir la
concentration des métabolites intermédiaires à un niveau plus ou
moins constant. (Par analogie: capacité du frigo à maintenir une température constante,
proche de la température demandée, quelque soit le nombre d’ouvertures
de la porte et la température demandée.)
Quelle est l’enzyme qui contrôle
la vitesse de la cascade de
réaction:
•La plus lente?
•La moins concentrée?
•Le lièvre, ou les tortues???
Enzyme « rate limiting »???
Quelle étape devrait on contrôler?
• A l’état stationnaire, toutes les réactions se
produisent à la même vitesse: c’est ce qu’on
appelle le « Flux » à travers la voie métabolique.
• Traditionnellement, on suppose que l’étape qui
contrôle le flux devrait être une réaction
irréversible, particulièrement lente.
• Mais: crédible?
Le « rate limiting step »: légende ou réalité?
A B C D E…
Supposons:
• Réaction B C (par exemple) particulièrement lente
• A et B ↑, et C ↓
• Si C ↓ vitesse réaction C D ralentie (loi d’action des
masses),
• Si A et B ↑ vitesse de transformation BC accélérée,
jusqu’à atteindre une vitesse équivalente à C D
Rappel: comment visualiser le flux?
Diminution d’une activité
enzymatique accumulation
des métabolites en amont,
déplétion des métabolites en
aval de.
Dangereux, voire même
toxique?
Risque d’emballement
d’autres voies?
Rappel: forme de « l’écluse » qui relie les canaux ?
Vmax/KM ou KS
Cascade de réactions irréversibles:
UDP-Glucose
Apport dans le premier bassin ↑,
niveau ( [S1] ) ↑ vitesse ↑, le niveau ([S2]) ↑, etc.
Difficulté : ↑ du flux suffisante, sans (trop) ↑ [métabolites intermédiaires]!
glycogène synthase
Glycémie (veine porte)
Glucose 1P
GLUT 4 / Glucokinase/
phosphoglucomutase
Repas
Glycogène
UDP-glucosepyrophosphorylase
Rôle de la régulation:• Régulation nécessaire pour maintenir
[métabolites] ≈ , quelle que soit la demande (par
exemple: régulation de la glycémie lors de
l’effort et du repos)
• Nécessité de contrôler le flux (vitesse de
production).
• Pour contrôler la vitesse de chaque réaction :
modifier KM, Vmax , [enzymes], proportion
d’enzyme en conformation active, etc…
Outils: Effet d’une augmentation / diminution de la quantité d ’enzyme ou de son activité (Vmax)?
vitesse
[S]
Effet d’une diminution de KM?
vitesse
[S]
Enzyme coopérative:
Ressemble à un tuyau: le « bas » de l’écluse s’évase.
Idéal pour conserver une concentration stable de substrat !
Inhibition d’une enzyme coopérative et
allostérique (composé favorisant la conformation T)
Inhibiteur favorise TActivateur favorise R
inhibition / activation surtout aux faibles [S]
« Metabolic Control Analysis »:
Formalisme mathématique, permet la description quantitative du contrôle du flux à travers une voie métabolique, et de sa régulation par les différents mécanismes qui ont étés identifiés par les biochimistes.
Intérêt:
• Permet de valider les « impressions » qualitatives sur
l’importance des différents mécanismes de contrôle
observés
• Permet (en théorie) de contrôler qu’on a bien identifié
tous les mécanismes de régulation, et d’en évaluer
l’importance relative
• Explique pourquoi on observe en général des
changements « coordonnés » de la concentration de
tous les enzymes impliqués dans une voie métabolique
Dans le but de quantifier l’effet de chaque mode de
régulation, Kacser et Burns puis Heinrich et
Rapoport ont défini trois fonctions:
• Elasticité, εsv : mesure la variation de la vitesse de
chaque réaction prise séparément.
• Coefficients de contrôle du flux, CEJ : mesure la variation
du flux (càd. à travers l’ensemble de la voie) lorsque E
change.
• Coefficients de contrôle de métabolite, CEM : mesure la
variation de chaque [métabolite] (à l’état stationnaire)
lorsque Ej change.
Élasticité:De quel pourcentage varie la vitesse lorsque la concentration
de substrat augmente? se traduit en termes mathématiques par:
( )( ) [ ]
?([ ] ([ ])
[ ]
vv Sv
S S vS
D
SD
N
SNS
D
SDN
D
SN
N
DS
S
D
N
N
DS
D
Navec F ?
S
F
F
S
FS
FS
2
1[ ]
1[ ]
[ ] [ ]v
[ ] [ ] [ ]1
alors
1
[ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ] [ ]1
1
1 11
S PS S
S P IM M i
S Sv S
PS M
S S PS S
S P IM M i
eq
P
vS
eqeq
S
K S K PS P I
K K K
K KS S
K S K P S P IK K K
K
K
K S
K S
K
PEEPESES
équilibrel à Réaction
/
:'
Mesure le déséquilibre substrats / produits
Fraction de E occupé par S
Habituellement: ε >0 si métabolite = substrat, ε <0 si le métabolite = produit de la réaction.
│ ε │ ↑ lorsque l’équilibre produit/substrat est presque atteint (Γ/K
≈1): le flux à travers l’enzyme est très faible (la réaction est en
fait aussi rapide dans les deux directions).
ε ↓ lorsque occupation par le métabolite élevée: lorsque l’enzyme
est déjà saturé, augmenter la concentration du métabolite n’a pas
d’effet…
Elasticité: % de variation de la vitesse par % d’augmentation de [M]:
KS
Sv
v
eq
vS
11
1propriété « locale » de l’enzyme
- mesure in vitro - peu d’infos sur le flux (voie métabolique)
équilibre)l' de près absoluevaleur en augmente ; produitpar
activation si saufnégative, nt(normaleme K
K
définir peut on même, De
eq
eqvP
11
réactionla pas catalyse ne E si 0 réactionla catalyse E si v
E1
réactifs) non
sinhibiteur lespour négative (toujours vI
1
Elasticités des enzymes « Michaeliennes » catalysant des réactions irréversibles:
• Si réaction irréversible, si [S]/KM
est très petit: vitesse de la
réaction ↑ avec [S]:
ε ≈ 1.
• [S] saturant: v ≈ Vmax, donc (en
valeur relative), d(v)/v tend vers
0.
Elasticité maximale ( ≈ 1) en
[S]/KM petit, 0 en [S]/KM
grand…
•
Elasticité d'une réaction Michaelienne irréversible:
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101
[S]
Ela
stic
ité
• Réaction réversible: vitesse
résiduelle (v(SP) - v(PS)) ≈0.
Près de l’équilibre :
faible modification de [S] ou [P]
forte modification de la
vitesse résiduelle :
en valeur absolue,
│ε │ ∞ en v 0.
Elasticités des enzymes « Michaeliennes » catalysant des réactions réversibles:
Elasticité d'une réaction Michaelienne réversible:
-30
-20
-10
0
10
20
30
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101
[S]El
astic
ité Equ
ilibr
e
Cœfficients de contrôle:
; S substratdu ionconcentratla contrôler à i"" réactionla
catalysant enzymel' de capacitéla mesure
EE
SS
C
;J"" flux le controler à i"" réactionla
catalysant enzymel' de capacitéla mesure
EE
JJ
C
j
i
i
j
j
SE
i
i
JE
j
i
i
][][
Beaucoup plus difficiles à évaluer mathématiquement que les élasticités:
chaque cœfficient de contrôle dépend des autres enzymes!
Signification:• Les cœfficients de contrôle de flux : effet de ↑ [enzyme]
sur le « flux », à l’état stationnaire, à travers la voie métabolique dans son ensemble;
• Les cœfficients de contrôle de concentration effet de ↑ [enzyme] sur la [métabolites], à l’état stationnaire, lorsque la voie enzymatique complète est considérée;
• Les élasticités mesurent l’effet de chaque métabolite sur la vitesse de chaque réaction enzymatique (régulations
allostériques, rapport [S]/KM, etc)
Évaluation des cœfficients de contrôle?
• Mathématique:– Relations entre élasticités et cœfficients de contrôle…
• Expérimentale:– Ajoute d’une enzyme? (système acellulaire)
– Augmentation / diminution d’expression d’une enzyme (mutation
du promoteur, transfection stable ou transitoire, siRNA, cellules
polynuclées, etc.)?
– Augmentation / diminution d’activité d’une enzyme: effet
d’inhibiteurs? D’activateurs? De mutations?
– « Top down » analysis: analyse de groupes de réaction
Glycolyze: ajoute d’enzyme
Hexokinase
PFKase
Respiration mitochondriale: inhibiteur
Compl.IV
Respiration mito.
Expérimentalement:
Hétérokaryons: Neurospora (synthèse Arg)
JEC
Remarque: le contrôle du flux (pente de la tangente à
la courbe) diminue lorsque la [Enzyme] augmente!
Approche « top down »:
)(
)(
)(
)(
14.000.0
29.0
70.085.030.015.0
ATP
fuite NADH ecosGlu
ATP
fuite ecosGlu
NADH ecosGlu
0.49
0.22
H0.30-0.15
0.49
0.22
H
Diviser la voie en un nombre limité de « blocs » et en étudier le contrôle:
« n » enzymes et « (n-1) » métabolites intermédiaires, donc:
– « n » coéfficients de contrôle de Flux (1 par enzyme E i)
– « n (n-1) » coéfficients de contrôle de [Sj] par Ei,
(1 par enzyme et par métabolite),
Soit: n + n (n-1) = (n + n2 – n) = n2 inconnues
JEi
C
j
i
SEC
Mathématique:
PSSSSSA nEn
EEEE )1(4321 ...4321
Nombre d’inconnues?
Il faut donc trouver (n)2 équations pour déterminer les n2 coéfficients de contrôle inconnus à partir des
élasticités, « connues »…
Théorème des sommes
Théorèmes de connectivité
1. Théorèmes des sommes:
Supposons
1. que nous augmentons « un tout petit peu » la concentration de tous les
enzymes de la voie,
2. que la vitesse de chaque réaction est proportionnelle à la concentration de
l’enzyme qui la catalyse.
....)3()3(
)()2(
)2(
)()1(
)1(
)()( Ed
E
JEd
E
JEd
E
JJd
L’effet total sur le flux va correspondre à la somme des effets de chacune des
augmentations sur le flux:
....)3()3(
)()2(
)2(
)()1(
)1(
)()( Ed
E
JEd
E
JEd
E
JJd
...3
)3(
3/)3(
/)(
2
)2(
2/)2(
/)(
1
)1(
1/)1(
/)()(
E
Ed
EE
JJ
E
Ed
EE
JJ
E
Ed
EE
JJ
J
Jd
obtient On
".E / E"par droiteà
terme chaque multiplier J;par termes deux les Diviser
ii
...3
)3(
2
)2(
1
)1()(321
E
EdC
E
EdC
E
EdC
J
Jd JE
JE
JE
Supposons que toutes les concentrations d’enzymes augmentent du même facteur d(E)/E = α. Cela revient au même que de changer d’échelle de temps : le flux (nombre de moles formées par unité de temps) va augmenter d’un facteur d(J)/J = α.
1
...1
...
:
...3
)3(
2
)2(
1
)1()(
321
321
321
JEi
JE
JE
JE
JE
JE
JE
JE
JE
JE
iC
CCC
CCC
donc devient
E
EdC
E
EdC
E
EdC
J
Jd
Le contrôle du flux est « partagé » par tous les enzymes qui constituent la voie métabolique.
Conséquences:
• On ne peut que très rarement
identifier « UNE » enzyme
limitante, en règle générale le
contrôle est partagé;
• Lorsqu’on augmente l’activité
d’une des enzymes limitantes,
son coéfficient de contrôle
diminue;
• Pour augmenter la production
d’un composé intéressant, il
faudra augmenter la
concentration de toutes les
enzymes de la voie!
Lactate
glucose:
Coéff. contrôle fluxBasale + glucagon
Transport pyruvate
0.00 0.01
Pyruvate carboxylase
0.51 0.83
Transport OAA
0.02 0.04
PEP-CK
(induite)
0.05 0.08
Pyr Kinase (« fuite »)
-0.17 0.00
Enolase + PGK
0.29 0.00
TIM+FbPase 0.27 0.03
PGI+G6Pase 0.02 0.00
On peut faire le même raisonnement pour les coéfficients de
contrôle de concentration:
A l’état stationnaire, changer d’échelle de temps n’affecte
pas les concentrations des différents métabolites (niveau
dans les bassins intermédiaires), donc
0 SjEi i
C
Conclusion: si on augmente la concentration de TOUS les enzymes d’une voie métabolique, la concentration des métabolites intermédiaires ne variera pas.
« Méthode Universelle » de Kacser…
Augmentation de la synthèse du Trp?
Gène surexprimé <Augmentation>
de [E]
Augmentation
du flux, JTRP2 TRP4 TRP1 TRP3 TRP5
- - - - - 1 1.0
- - + + - 58 2.0
+ + - + - 35 2.4
µ - + + - 34 1.2
µ + + + - 30 2.1
+ + - + + 19 8.2
µ + + + + 23 8.8µ : surexpression d’un allèle muté, résistant à la rétroinhibition par le Trp
Niederberger et al., Biochem. J. 287:473-9, 1992
2. Théorèmes de connectivité:
j
jvS
i
i
j
jvS
i
i
i
i
S
Sd
E
Ed
S
Sd
E
Ed
v
vd
i
j
i
j
)()(
0)()()(
Imaginons qu’on modifie simultanément la concentration d’une enzyme quelconque « Ei » ET celle du substrat « Sj », de telle
façon que la vitesse de la réaction catalysée par Ei ne change
pas:
Si la vitesse de chaque réaction ne change pas, le flux ne change pas:
0...)()()(
3
3
2
2
1
1
j
jvS
JE
j
jvS
JE
j
jvS
JE
S
SdC
S
SdC
S
SdC
jjj
S
SdC
S
SdC
S
SdC
J
Jd
devient
j
jvS
JE
j
jvS
JE
j
jvS
JE jjj
0...)()()()(
:
3
3
2
2
1
1
0...)()()()(
3
3
2
2
1
1321
E
EdC
E
EdC
E
EdC
J
Jd JE
JE
JE
i
vS
JE
i
jiC 0:
S
d(S ommeC
j
j 0)
i
vS
SE
j
jvS
SE
j
jvS
SE
j
jvS
SE
j
j
SE
SE
SE
j
j
C donc
S
SdC
S
SdC
S
SdC
S
Sd
devient
E
EdC
E
EdC
E
EdC
S
Sd
i
j
j
i
j
j
j
j
j
j
jjj
1
...)()()()(
:
...)()()()(
3
3
2
2
1
1
321
3
3
2
2
1
1
La concentration du substrat « j » a changé: donc
i
vS
SE
j
jvS
SE
j
jvS
SE
j
jvS
SE
k
k
SE
SE
SE
k
k
jk si C donc
S
SdC
S
SdC
S
SdC
S
Sd
devient
E
EdC
E
EdC
E
EdC
S
Sd
i
j
k
i
j
k
j
k
j
k
kkk
0
...)()()()(
:
...)()()(
0)(
3
3
2
2
1
1
321
3
3
2
2
1
1
La concentration des autres substrats n’ a pas changé:
Au total = n2 équations?• 1 somme de coéfficients de contrôle du flux par Ei:
• (n-1) sommes de coéfficients de contrôle des substrats par Ei (1 par métabolite):
• (n-1) équations de connectivité entre le contrôle du flux par chaque enzyme et l’élasticité
de chaque vitesse en réponse aux (n-1) métabolites;
• (n-1)2 équations de connectivité entre le contrôle de la concentration de chaque (n-1)
métabolite par chaque enzyme et l’élasticité de chaque vitesse en réponse aux (n-1)
métabolites:
• Soit: 1 + (n-1) + (n-1) + (n-1)2 = 1 + 2n – 2 + (n2 -2n +1) = n2 équations
i
JE C
i1
i
vS
JE 0 C i
ji
i
vS
SE
j kpour 0jkpour
C i
j
k
i
1
i
SE
j
iC 0
Intérêt de ces relations?
• n2 équations à n2 inconnues… Il « suffit » d’évaluer tous les coéfficients d’élasticité in vitro, aux
conc. physiologiques de substrat, pour calculer les coéfficients de
contrôle de concentration et de flux;
• Permettent de répondre aux questions
– « quelles conditions faut-il remplir pour que l’enzyme contrôle
efficacement le flux? »
– « quelles conditions faut-il remplir pour maintenir les
concentrations des métabolites à peu près constantes? »
Quelles conditions faut-il remplir pour que l’enzyme contrôle efficacement le flux?
La somme des coéfficients de contrôle de flux = 1:
le contrôle est partagé par tous les enzymes de la voie
i
JE C
i1
Cascade de réactions irréversibles:
A
B
C
Enzyme 2
Enzyme 3
Enzyme 1
Pour accélérer le flux à travers toute la cascade: l’idéal: augmenter simultanément toutes les activités enzymatiques!
Voie comportant deux enzymes:
Quelles conditions faut-il remplir pour que la demande (E2) contrôle efficacement le flux?
Valeurs des coéfficients de contrôle?
demandeoffre EEM
0 Mdemande
Moffre CC
1 demandeM
Mdemande
offreM
Moffre CC
0 demandeM
Jdemande
offreM
Joffre CC
1 Jdemande
Joffre CC
(3)
(4)
(2)
(1)4 inconnues
( CJfourniture et CJ
demande,
CMfourniture et CM
demande )
donc: 4 équations?
2 équations de sommes
(ΣCJ et Σ CM) et deux
équations de connectivité
(Σ CJεM et Σ CM εM)
demandeM
offreM
offreMJ
demande
demandeM
offreM
Jdemande
offreM
demandeM
offreM
Jdemande
offreM
demandeM
Jdemande
offreM
Jdemande
C
C
C
CC
0
01
Jdemande
Joffre
Jdemande
Joffre CC CC 11
0 demandeM
Jdemande
offreM
Joffre CC (1)
(2)
Le contrôle exclusivement par un des deux blocs est-il possible?
offreM
demandeMdemande
MoffreM
Joffre si C
:même De
1
1
1
Pour que le flux soit contrôlé « uniquement » par la demande,
il faudrait que son élasticité, |εM|, soit nulle et l’élasticité de
l’offre, « infinie »: c’est l’enzyme ou le bloc d’enzymes qui a la plus petite élasticité qui contrôle le flux.
siC demande
MoffreMdemande
MoffreM
demandeM
offreMJ
demande
1
1
Pourquoi?L’élasticité mesure l’effet de [M] sur la vitesse des 2 réactions (offre et
demande). Imaginons que l’augmentation de M inhibe énormément l’offre
(grande élasticité de l’offre):
• Si on augmente la concentration des enzymes qui synthétisent M (offre):
dès que M augmente il va inhiber les enzymes qui le produisent: la vitesse
ne changera pas…
• Imaginons au contraire qu’on augmente la concentration des enzymes qui
utilisent M (demande): dès que M diminue, son inhibition sur les enzymes
de synthèse sera levée, et la vitesse de production de M augmentera.
• Le flux est donc bien contrôlé par la demande si l’élasticité de l’offre, en
valeur absolue, est très grande et l’élasticité de la demande, très petite!
Rappel: élasticités des enzymes « Michaeliennes » catalysant des réactions irréversibles:
• Si la réaction est irréversible,
la vitesse de la réaction
augmente avec la
concentration de substrat tant
que [S]/KM est petit.
Dès que le substrat devient
saturant, v≈Vmax, et (valeur
relative, d(v)/v tend vers 0.
• L’élasticité est donc grande
pour [S]/KM petit, faible pour
[S]/KM grand…
Elasticité d'une réaction Michaelienne irréversible:
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101
[S]
Ela
stic
ité
• Si au contraire la réaction est
réversible, la vitesse résiduelle
s’annule à l’approche de
l’équilibre;
une faible modification de [S] ou
[P] entraînera une grande
modification de la vitesse
résiduelle;
• Attention: le produit aura
également une très grande
élasticité (inverse) près de
l’équilibre!
Elasticité d'une réaction Michaelienne réversible:
-30
-20
-10
0
10
20
30
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91 101
[S]El
astic
ité Equ
ilibr
e
Elasticités des enzymes « Michaeliennes » catalysant des réactions réversibles:
Elasticité d’enzymes coopératives:
Dans le cas d’enzymes
coopératives, la vitesse de
la réaction augmente plus
vite que [S] aux faibles [S];
l’élasticité est alors >1.
Elle diminue lorsque
l’enzyme approche de la
saturation.
offreM
demandeM
Jdemande
Joffre
C
C
demandeoffre M
Pour que l’activité (la concentration) d’une enzyme contrôle le Flux, il faudrait que son élasticité soit la plus faible possible en valeur absolue:
• De préférence: réaction loin de l’équilibre, voire même irréversible; enzyme saturée
• De préférence PAS: enzyme réversible près de l’équilibre, ou enzyme coopérative!
Fonction des enzymes coopératives, allostériques dans le contrôle des voies métaboliques?
Les enzymes coopératives ont une grande élasticité, ce qui n’est pas idéal pour que leur concentration puisse contrôler le flux. (Si on augmente la [Enzyme coopérative], [S] va chuter, et la vitesse de la réaction à l’état stationnaire variera peu).
Conclusion: il est inutile d’augmenter la [ ] de ces enzymes pour augmenter le flux!
Voie comportant deux enzymes:
Quelles conditions faut-il remplir pour que la concentration des métabolites soit à peu
près constante? (homéostasie)
Dans quelles conditions la concentration du métabolite intermédiaire (M) restera-t-elle constante?
0 Mdemande
Moffre CC
1 demandeM
Mdemande
offreM
Moffre CC
Mdemande
Moffre CC (3)
(4)
1 demandeM
Moffre
offreM
Moffre CC
1 demandeM
offreM
MoffreC
demandeM
offreM
MdemandeC
1
demandeM
offreM
MoffreC
1
Coéfficient de co-réponse:
Mi
JiMJ
iC
CO , L’idéal: coéfficient de co-réponse le plus grand
possible (variation du flux, pas du métabolite)
demandeM
offreM
Mdemande
demandeM
offreM
offreMJ
demande
C
C
1
offreMM
demande
JdemandeMJ
demandeC
CO ,
Fonction des enzymes coopératives, allostériques: homéostasie!
Pour que le flux soit contrôlé par la demande (c’est-à-dire par les besoins de l’organisme), il faut que l’élasticité de l’offre vis-à-vis des métabolites intermédiaires soit la plus grande possible. D’où l’intérêt en début de voie d’enzymes coopératives et régulées allostériquement par le produit final de la voie!
Exemple d’enzyme coopérative : Aspartate transcarbamoylase bactérienne
0 20 400
0.5
1
[SUBSTRAT] (mM)
VIT
ES
SE
0 5 100
0.5
1
[SUBSTRAT] (mM)
VIT
ES
SE
ZOOM:
+ATP
+CTP
Controle +ATP
+CTP
Controle
Élasticité et contrôle du flux:
Si l’élasticité de l’offre est grande (réactions réversible, enzymes allostériques,…) la voie est contrôlée par la demande. Donc, pour augmenter le flux, il est inutile de surexprimer les premières enzymes de la voie (surtout pas les enzymes allostériques).
Il vaut mieux surexprimer les derniers enzymes d’une voie très contrôlée, pour augmenter la demande…
Augmentation de la synthèse du Trp?
Gène surexprimé <Augmentation>
de [E]
Augmentation
du flux, JTRP2 TRP4 TRP1 TRP3 TRP5
- - - - - 1 1.0
- - + + - 58 2.0
+ + - + - 35 2.4
µ - + + - 34 1.2
µ + + + - 30 2.1
+ + - + + 19 8.2
µ + + + + 23 8.8µ : surexpression d’un allèle muté, résistant à la rétroinhibition par le Trp
Niederberger et al., Biochem. J. 287:473-9, 1992
Ultrasensibilité:
• En pratique, l’élasticité d’enzymes coopératives est rarement supérieure à 2.0 comment parvenir à obtenir un coéfficient de covariance de 50 , 100 dans certaines conditions?
• Comment diminuer la sensibilité de la réponse à de très faibles signaux pour éviter les « faux départs »?
• Comment obtenir une réponse « tout ou rien » (apoptose, division cellulaire) à un stimulus?
Trends in Biochem. Sci. 21:460-466, 1996
« Ultrasensibilité »:
Zo
ne
tam
po
n
Réponse « tout ou rien »
RE
PO
NS
E
STIMULUS
• Enzyme coopérative• Phosphorylations multiples• Inhibiteur “stoechiométrique” (à très
haute affinité mais en faible concentration)
• Cycle futile kinase - phosphatase: à certaines conditions seulement!– inhibition de la phosphatase et activation
simultanée de la kinase– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Comment l’obtenir?
• Enzyme coopérative• Phosphorylations multiples• Inhibiteur “stoechiométrique” (à très
haute affinité mais en faible concentration)
• Cycle futile kinase - phosphatase: à certaines conditions seulement!– inhibition de la phosphatase et activation
simultanée de la kinase– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Comment l’obtenir?
Phoshorylations multiples?
• MAPK et MAPKK requièrent une double phosphorylation pour être activées:
2
• Enzyme coopérative• Phosphorylations multiples• Inhibiteur “stoechiométrique” (très haute affinité, faible concentration)• Cycle futile kinase – phosphatase (à certaines conditions seulement!)
– inhibition de la phosphatase et activation simultanée de la kinase
– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Comment l’obtenir?
Ultrasensibilité due à un inhibiteur à très haute affinité:
En présence d’un inhibiteur à très haute affinité pour l’enzyme activée: il faut que la [Ea] dépasse la [Inhibiteur] avant de voir apparaître l’enzyme active…
• Exemples: cdk, P phosphatase I (glycogène synthase et phosphorylase), …
• Enzyme coopérative• Phosphorylations multiples• Inhibiteur “stoechiométrique” (à très
haute affinité mais en faible concentration)
• Cycle futile kinase – phosphatase à certaines conditions seulement!
– inhibition de la phosphatase et activation simultanée de la kinase
– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Comment l’obtenir?
Imaginons 2 réactions irréversibles indépendantes et opposées:
• Phosphatase en concentration constante (pointillés): v ÷ [S-P]
• Kinase en concentration (ou activité) variable (traits pleins): v ÷ [S]
L’intersection des deux courbes donne le % (S-P) à l’état stationnaire…
« Ultrasensibilité d’ordre zéro »?
• Si deux enzymes concurrentes catalysant des réactions
irréversibles sont toutes les deux à très bas KM ou
associées à leur substrat (donc saturées) : l’intersection
des deux courbes lorsque l’activité de l’une d’elles est
augmentée donne une courbe sigmoïde, très raide…
• Enzyme coopérative• Phosphorylations multiples• Inhibiteur “stoechiométrique” (à très
haute affinité mais en faible concentration)
• Cycle futile kinase – phosphatase à certaines conditions seulement!
– inhibition de la phosphatase et activation simultanée de la kinase
– “ultrasensibilité d’ordre zéro”
• Régulation par l’AMP
Comment l’obtenir?
Ultrasensibilité de la réponse à l’AMP:
ATP
ADPAMP
ADP
AMPATPK
AMPATPADP
eq
kinase adénylate
2
21
2
AMPK~PO4
AMPKK
AMPK
PP2C
AMP
AMP
AMP
Cibles ~PO4
Cibles
Amplification de la sensibilité:
Ultra- et sub-sensibilité de voies « bifurquées »
S
Non Régulée
Régulée
total
indind
v
v
total
dirdir
v
v
Si une des voies est saturée par S, sa vitesse est proportionnelle à [E] mais indépendante de celle de l’autre voie, qui ne peut utiliser que le substrat « résiduel »…
totalv
Exemple de bifurcation : synthèse cholestérol…
AcAcCo-A +AcCoA MévalonateHMG-CoA
IPPDMAPP
Géranyl PP
Farnésyl PP
Squalène
Cholestérol
« Statines »
Protéines géranylées, Protéines farnésylées,
Coenzyme Q, Dolichol PP,
Vitamine K,Chlorophyle,
Carotènoïdes,terpenes
etc.