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Familial et de la Protection Sociale

Madagascar

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Génotypage de Plasmodium sp :

Applications dans l’évaluation de l’impact des interventions dans la

lutte contre le paludisme

Sabiti IDRISSA et Nicolas STEENKESTE

EVALUATION

par les FACILITATEURS

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Plan

• Les Techniques de Biologie Moléculaire :

• Le Diagnostic d’Espèce

• La Résistance aux Antipaludiques

• Le Polymorphisme

• Analyse Dynamique

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L’ADN

En 1953, J. Watson et F. Crickdécouvre la structure de

l’ADN :

Acide DésoxyriboNucléique

Localisation de l’ADN :

� Eucaryote : Chromosome

mitochondrie …

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PCR : Polymerase Chain Reaction

Mise au point en 1985 par Karry Mullis.

But :�Amplifier une partie spécifique d'un

acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter.

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Polymerase Chain Reaction

D’après Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article Réaction en chaîne par polymérase

Augmentation exponentielle du nombre de copie

94°

72°

Extraction de l’ADN

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Post PCR

• Gel d’agarose ( positif / négatif )

• Séquençage

Grâce à la méthode de Sanger, on peut avoir la séquence d’un produit PCR.

• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Utilisation des enzymes de restriction(ex: AluI = 5'-A G^C T-3' ) pour mettre en évidence

un polymorphisme.

• Puce à ADN

Permet de mettre en évidence notamment des mutations ponctuelles.

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Le Diagnostic d’espèce Plasmodiale

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La microscopie

P. falciparum P. vivax

P. ovale P. malariae

Photographie prise par le laboratoire d’Epidemiologie Moleculaire de l’IPC

sensibilité =~10-50 parasites/ul

ADVANTAGES :

• Faible coût,

• Adapté au terrain,

• Donne des informations sur la parasitémie.

INCONVENIENTS :

• Besoin d’une formation spécifique et d’une grande expérience,

• Identification entre les espèces difficiles,

• Pas adapté à une analyse d’un grand nombre d’échantillon

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PCR d’identification d’espèce

PRINCIPE :

EXEMPLE :m F V M O

#14

205bp

787bp

144bp

#14 = infection avec

P. falciparum (F, 205 bp),P. vivax (V, 117 bp),P. ovale (O, 787 bp).

VARIABLE AREA

FALCIPARUM

VIVAX

MALARIAE

OVALE

PCR primaire

4 nested PCR

PLASMODIUM

SSU rRNA gene CONSERVED AREACONSERVED AREA

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117bp

Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain

reaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med

Hyg 90, 519-21 (1996).

Incardona, S. et al. Large-scale malaria survey in

Cambodia: Novel insights on species distribution and risk

factors. Malaria Journal 2007, 6:37 (27 March 2007).

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La sensibilité de la PCR

Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chain reaction amplification of

dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med Hyg 90, 519-21 (1996).

• 8 échantillons qui étaient négatifs en microscopie sontdétectés positifs par PCR.

• Inversement, 3 échantillons n’ont pas été détectés par la PCR.

• 1 échantillon est passé d’un diagnostic Pf à Pf+Pv.

• 90 échantillons sur les 120 analysés sont négatifs en PCR et microscopie.

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Avantages de la PCR

• Très grande sensibilité; Mise en évidence :

� des asymptomatiques ( faible parasitémie )

� des infections mixtes

• Impact pour la lutte :

� Avoir une idée plus juste de la prévalence

� Connaître les espèces (infection mixte comprise)

Par exemple : Alerte pour la mise en place d’un traitement spécifique à P. vivax

� Traiter un grand nombre d’échantillon

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LA RESISTANCE :

L'analyse des mutations ponctuelles(SNP) liées à la résistance

chez Plasmodium falciparum

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La Résistance

6 gènes d’intérêts ont été associés aux résistances :

– Pfdhfr à la Pyriméthamine, cycloguanil

– Pfdhps aux sulfadoxines

– Pfcrt à la chloroquine

– Pfmdr1 à la chloroquine (par nombre de copie : méfloquine)

– Pfcytb à l’Atovaquone

– Pfatpase6 candidat associé aux résistances aux dérivés de l’artémisinine

Au total, 34 SNP liés à la RésistanceAndreas Crameri et al. A rapid microarray-based method for monitoring of all currently known single

nucleotide polymorphisms associated with parasite resistance to antimalaria drugs. J. Clin. Microbiol.

10.1128/JCM.01178-07

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Analyse de la résistance par SNP

• Etude In vitro, In vivo

� Les échantillons doivent être traités immédiatement

� Nécessité d’un fort investissement :

• en temps

• en personnel

• Etude Moléculaire

� Recueil plus souple(lors d’une enquête de prévalence ou démographique…)

� Analyse extemporanément

� Analyse possible pour un grand nombre d’échantillon

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La Résistance

– Pfdhfr à la Pyriméthamine, cycloguanil

– Pfdhps aux sulfadoxines

– Pfcrt à la chloroquine

– Pfmdr1 à la chloroquine (par nombre de copie : méfloquine)

– Pfcytb à l’Atovaquone

– Pfatpase6 candidat associé aux résistances aux dérivés de l’artémisinine

– Et…

Possibilité de faire du

Monitoring de l’évolution de drogue suite àl’introduction.

On a besoin d’une

définition stricte de la résistance.

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LE POLYMORPHISME :

msp1, msp2, glurp

Microsatellites

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Polymorphisme des Antigènes

Exemple de msp2

Gène de la « Merozoïte Surface Protein 2 »

2 familles alléliques :

3D7 = bloc 3 variable en taille (6 à 30 bp), en séquence et en nombre de copie

FC27 = 2 séquences répétées : l’une d’1 à 4 copie d’un motif de 32-mer qui

est suivi d’une région conservée d’un fragment de 7-mer ; l’autre de 0 à 5

copies d’un motif de 12-mer.

Domaines avec variations de séquence et de longueur

Bloc 1

Conservé

Bloc 5

ConservéRépétition en tandem

Smythe et al., 1990, 1991 ; Snewin et al., 1991 ; Felger et al., 1997 et 1999

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Para

sitém

ieRecrudescence ou ré-infection

Après le 15eme jour

temps

Recrudescence ou Ré-infection

A B

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Recrudescence :

msp1 msp2 glurp

A B

A B

A B

Ré-infection :

msp1 msp2 glurp

A B

A B

A B

Recrudescence ou Ré-infection

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Analyse Dynamique :

Exemple de Pfcrt

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Pfcrt dans le Monde

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Pfcrt dans le MondeP. falciparum

PfcrtSéquençage

pour identifier les mutations

ponctuelles

Sauvage

Mutant

Un allèle de Pfcrt est arrivéen Afrique.

Il faut suivre l’évolution des gènes de résistance pour éviter leurs propagations.

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Références

Site Internet :

• Wikipedia [accédé le 24/03/08] ; article sur la Réaction en chaîne par polymérase

Article :

• Singh, B. et al. Detection of malaria in Malaysia by nested polymerase chainreaction amplification of dried blood spots on filter papers. Trans R Soc Trop Med Hyg 90, 519-21 (1996).

• Incardona S et al. Large-scale malaria survey in Cambodia: Novel insights on species distribution and risk factors. Malaria Journal 2007, 6:37 (27 March 2007).

• Andreas Crameri et al. A rapid microarray-based method for monitoring of all currently known single nucleotide polymorphisms associated with parasite resistance to antimalaria drugs. J. Clin. Microbiol. 10.1128/JCM.01178-07.

• Smythe JA et al. Structural diversity in the Plasmodium falciparum merozoitesurface antigen 2. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Mar 1;88(5):1751-5.

• Snewin VA et al. Polymorphism of the alleles of the merozoite surface antigensMSA1 and MSA2 in Plasmodium falciparum wild isolates from Colombia. Mol Biochem Parasitol. 1991 Dec;49(2):265-75.

• Felger I et al, Genotypes of merozoite surface protein 2 of Plasmodium falciparum in Tanzania.Trans R Soc Trop Med Hyg. 1999 Feb;93 Suppl 1:3-9.

• Frédéric Ariey et al. Invasion of Africa by a single pfcrt allele of South East Asian type. Malaria Journal 2006, 5:34.

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Et si vous utilisiez la biologie moléculaire dans votre PNLP ?

Merci de votre attention