Présentation mémoire Master de Recherche en Biologie Fonctionnelle Parcours: Physiologie Appliquée et Physiopathologies

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Comparaison des Profils des Alvéolites Lymphocytaires en Immunocytochimie et en Cytométrie en Flux dans le Lavage

Bronchiolo-Alvéolaire

FACULTE DES SCIENCES DE TUNIS

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

HÔPITAL ABDERRAHMEN MAMI DE L’ARIANALABORATOIRE D’ANATOMIE ET CYTOLOGIE

PATHOLOGIQUE

INSTITUT PASTEUR DE TUNISLABORATOIRE D’HÉMATOLOGIE

RÉPUBLIQUE TUNISIENNE, MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUEUNIVERSITE DE TUNIS EL MANAR

Réalisé et présenté par: Rihem KASMI

Soutenue devant:

Président de Jury: Pr. MARRAKCHI Raja

Examinateur : Pr. MEZNI Faouzi

Encadreurs: Dr. MLIKA Mouna

Dr. SAFRA Inès

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Plan

Introduction : les pneumopathies interstitielles diffuses

Objectif

Patients et méthodes

Résultats et discussion

Conclusions et perspectives

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Les pneumopathies interstitielles diffuses (PID)

Définition des PID

• Groupe hétérogène de pathologies pulmonaires diffuses.

• Caractéristiques histologiques:

Atteinte de l’interstitium pulmonaire

Espaces entre les cellules alvéolaires et les membranes basales endothéliales par de

l’inflammation et de la fibrose

• Autres structures: les lumières alvéolaires les bronchioles les vaisseaux

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Pneumopathies interstitielles diffuses (PID)

Pneumopathies interstitielles idiopathiques

NSIP

COP RB-ILD LIP UIP

AIP DIP

ATS/ERS consensus ERS 2002


Cause connueConnectivite, médicament,

exposition

Cause inconnue, entités bien déterminées

GranulomatoseSarcoïdose

l’alvéolite allergique l’histiocytose X

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Pneumopathies interstitielles diffuses (PID)


ATS/ERS consensus ERS 2012


Formes particulièresHPCL, LAM,

lipoprotéinose alvéolaire, PCIE

GranulomatoseSarcoïdose

Cause connueConnectivite, médicament,

exposition

Pneumopathies interstitielles idiopathiques inclassables

Pneumopathies interstitielles

idiopathiques rares


majeures

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Épidémiologie:

• En Tunisie:2000-2005 : 1707 7.2% des motifs d’hospitalisation. Âge moyen = 51 ans. Sex-ratio = 0,51.


Prévalence 67-81/100 000 Incidence 26-32/100 000/an

Âge moyen 51-69 ans

Coultas et al. Am J Respir Crit Care Med 1994

Cas asymptomatiques non diagnostiqués

Cas symptomatiques =10X


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Physiopathologies des PID

• Mécanismes méconnus:• Origine infectieuse

• Origine immunologique• Origine environnementale

• Origine toxique.

Facteurs génétiques

Facteurs environnementalesPoussières, fumées

Agression

Infections

Tabagisme Radiation

Facteurs immunologiques

Autres maladies

Lésions de l’épithélium alvéolaire

Pneumopathie interstitielle Guérison

Activation du processus de réparation Prédisposition génétique à une altération du processus de réparation

7

8

Démarche diagnostique:

• Processus dynamique résultant d’une concertation multi-disciplinaire • Peut prendre du temps• Peut être révisé à tout moment lors du suivi


Démarche diagnostiq

ue

Radiologues

Pathologistes

Pneumologues

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Démarche diagnostique:

Endoscopie bronchique et Lavage Broncho-Alvéolaire

Imagerie médicale Radiographie standard du

thoraxTDM-HR

Examen cliniqueExplorations respiratoires

Examens biologiques

InterrogatoireHistoire du patient


Démarche diagnostique: Interrogatoire et ATCD

• L’interrogatoire joue un rôle clé:• Recherche de signes d’orientation• Recherche d’une éventuelle exposition• Recherche d’ATCD à valeur dianostique

InterrogatoireHistoire du patient

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• Bilan immunologique:systématiquement en cas:

Atteinte extra-respiratoire Une maladie systémique était suspectée

Selon Cottin: recherche Anticorps anti-nucléairesAnticorps anti-peptides cycliques citrulinés Facteur rhumatoide.

Recherche de précipitines justifiée si notion d’exposition à des antigènes organiques ou suspicion de PHS à l’interrogatoire

• Examen clinique:• selon les dernières recommandations de la

Société Française de Pneumologie, râles crépitants secs et bilatéraux reproduisant le bruit du « velcro » constants et précoces • Hippocratisme digital présent dans près de

50% des cas.

Démarche diagnostique: Examen Clinique, Bilan biologique et explorations respiratoires

Examen cliniqueExamens biologiques

Explorations respiratoires

Explorations respiratoires

Gazométrie arterielleHypocapnie au repos: plus fréquente et plus

précoce.

Test de marche de 6 minutes

Selon Cottin, moyen fiable pour évaluer

la fonction respiratoire au cours

de l’exercice.

Exploration fonctionnelle respiratoire

Selon les recommandations de la Société Française de

Pneumologie: il faut évaluer la CVF et la TLco

chez tout patient présentant une PID au moment du diagnostic à

la recherche d’un trouble ventilatoire restrictif et d’une diminution de la Tlco, souvent

seules anomalies détectées lors du diagnostic précoce de PID.

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Démarche diagnostique: Examen Clinique, Bilan biologique et explorations respiratoires

Imagerie médicale Radiographie

standard du thoraxTDM-HR

Radiographie du thoraxSelon Brauner:90%: diagnostic positif Images pulmonaires anormales diffuses dont l’évolution est supérieure à 3 mois. 10% des cas infra-radiographiques: le diagnostic positif de PID repose sur la TDM + LBA + EFR. Diagnostic correct avec haute probabilité que dans 25% des cas

Tomodensitométrie thoracique• Place importante à toutes les étapes de prise

en charge. • Elle permet:• Diagnostic positif et étiologique des PID• Surveillance évolutive et pronostique.• Éviter le recours aux méthodes invasives de

diagnostic de PID, telles que la biopsie, et d’éviter de ce fait le risque non négligeable de complications. • Certaines études ont mis en évidence un

apport contributif de la TDM dans le choix du site de lavage en l’orientant vers les zones à priori les plus lésées. 12

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Le lavage broncho-alvéolaire

Outil diagnostique peu invasif d’exploration du poumon profond.

Informations fiables sous couvert d’une technique rigoureuse:Endoscopie bronchique.

Analyse dans le laboratoire d’anatomie pathologique.

Analyse de la cytologie alvéolaire normale Corrélation avec les données radiologiques


Endoscopie bronchique et Lavage

Bronchiolo-Alvéolaire

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• Détection :Des cellules (inflammatoire, néoplasiques …)

Du matériel acellulaire anormal (lipoprotéines)

• Mise en évidence de nombreux agents pathogènes (Pneumocystis carinii …)• Suivi de l’évolution du processus

pathologique• Évaluation la réponse à un traitement


Acte non invasif, rapide, peu onéreux

Entreprendre devant tout signe de PID avant d’envisager d’autres

moyens diagnostiques plus invasifsBiopsie Trans-pariétale ou Trans-

bronchiqueBiopsie chirurgicale


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Réalisation et interprétation du LBA:

• Endoscopie bronchique • Instillation du liquide isotonique stérile par

fraction (40-50 ml). Récupération du liquide dans des aliquots LBA

• Pas de contre-indication.• Complications:

Douleurs thoraciques dues au liquide résiduel du LBA dans les alvéoles.Pneumothorax.



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Analyse du LBA chez un sujet adulte, sain et non-

fumeur

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Orientation diagnostique selon le profil cellulaire trouvéCertitude diagnostique Les pneumopathies infectieuses Les hémorragies intra-alvéolaires Les lipoprotéinoses alvéolaires

Les pneumopathies chroniques à éosinophiles Les tumeurs

Alvéolites à polynucléaires neutrophiles

Alvéolites macrophagiques

Alvéolites lymphocytaires

Alvéolites à polynucléaires éosinophiles

Immunocytochimie Cytométrie en flux


Lavage Broncho-Alvéolaire

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Immunocytochimie

• Détection in situ d’un antigène à l’aide d’anticorps spécifiques• Visualisation du complexe immun à l’aide d’un marqueur morphologique:

• Plusieurs méthodes possibles Mise en évidence d’une activité enzymatique.

la peroxydase extraite de raifort (cruciféracée) disponible en grande quantité

peu couteuse détectable par plusieurs chromogènes

couplée de façon stable à des protéines

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Peroxydase:

Décomposition de l’H2O2

Présente de façon endogène dans certains tissus biologiques

Signal non spécifique

Technique immuno-peroxydasique

Immunocytochimie

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Systèmes d’amplification:

Système d’amplification polymérique: Conjugués polymériques-HRP

anticorps de liaison

Immunocytochimie

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Apport de l’immunocytochimie :

Diagnostic en: Oncologie, Pneumopathies

diagnostic des PID

Immunocytochimie

Confirmation d’un diagnostic suggéré

CD1a Histiocytose X

Orientation du diagnostic devant un profil cellulaire lymphocytaire

Marquage anti CD3/CD4/CD8

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Cytométrie en Flux

Analyse qualitative et quantitative de multiples paramètres à l’échelon cellulaire dans une population hétérogène en suspension dans un liquide.

Analyse des signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser.

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Cytométrie en Flux

Champ d’application très largeHématologieCancérologie

Génétique

Diagnostic et suivi clinique Typage des leucémies

Suivi du SIDATraitements immunosuppresseurs

Immunophénotypage des alvéolites lymphocytaires

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Comparaison du profil en immunocytochimie et en Cytométrie en flux des alvéolites lymphocytaires dans

le lavage bronchiolo-alvéolaire.

Objectif

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32 cas d’alvéolites lymphocytairesSex-ratio (H/F) = 0,44

Âge moyen = 46,5 [6-68]Tabagisme : 2 cas de sexe masculin

22 femmes

10 hommes


Patients

Asthme

Milia

ire fé

brile

Scléro

dermie

PHS tra

itée

Sarco

idose tr

aitée

Pas d'antécé

dents re

spira

toires

0%10%20%30%40%50%60%70%80%

7% 3% 3% 3%9%

75%

Les antécédents respi-ratoires

Les antécédents respiratoires

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Toux

Dyspnée d'effort

Douleurs thora

ciques

Expecto

rations

Fiévre

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70% 66%

40%

6%

13% 13%

Signes cliniques

Signes cliniques

Sarco

idose PID PHS

Pneumoconiose

BOOP0%

10%

20%

30%

40%

50%

60% 53%

17%12% 12%

6%

Diagnostics radio-clin-iques suspectés

Diagnostics radio-cliniques suspectés

Patients

Étude statistique

Marquage par Cytométrie en flux

Marquage immunocytochimique

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Analyse cytologique du LBA


Méthodes

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Richesse cellulaire Cellule de MalassezCellularité normale: 150-300 000 cellule/ml

Vitalité cellulaire

Bleu de Trypan Vitalité cellulaire normale : ± 86%

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Cytocentrifugation et préparation des

lames

Cytochambres maintenues contre des lames Super Frost par des cytoclips métalliquesVolume mis selon la richesse cellulaire Cytocentrifugeuse SHANDON CYTOSPIN4Cytocentrifugation 650 tours/min ( 10 min)

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Coloration Trois colorations standards: MGG – Perls - Papanicolaou

MGG

Papanicolaou

Perls

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Inclusion du culot dans de la paraffine

Centrifugation 1500 tours/min ( 3 min)Fixation AFA ( 3 heures)Cassette à inclusion Enrobage en paraffine

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Marquage immunocytochimique

Marquage sur des étalements cytologiques fraisMarquage sur des coupes incluses en paraffines ( Cytoblocs)

Marquage immunocytochimique sur des étalements frais ( Anticorps anti CD4)

Marquage immunocytochimique sur des Cytoblocs ( Anticorps anti CD4)

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Méthodes : Protocole de marquage immunocytochimiqueÉtapes particulières aux coupes incluses en paraffine ( Cytoblocs)

Déparaffinage• 3 bains toluène ( 5 min chacun)• Réhydratation: 3 bains d’alcool

100°, 70°, 50° ( 5 min chacun)• Lavage à l’eau distillée

Démasquage antigénique• Tampon citrate (pH=6)- Four à Micro-ondes – Deux

cycles : 5’ - 90°/10’ - 97°• Rinçage à l’eau

Rompre les liaisons moléculaires crées par le fixateurAccessibilité des sites antigéniques

Délimitation des coupes – Crayon hydrophobe

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Blocage des peroxydases endogènes

Incubation avec le H2O2à 3% 10 minutes

Lavage avec TBSTrois bacs de 5 minutes chacun

Incubation avec Post Primary Block

30 minutes

Incubation avec Polymère Peroxydase (anticorps

secondaire)30 minutes

Immunomarquage Anticorps primaires : anti CD3-

CD4-CD8Chambre humide

Température ambiante1 heure

Révélation avec le Chromogène DAB coloration brune

Rinçage à l’eau




Contre coloration Hématéine de Mayer

Montage

Étapes communes aux étalements et aux coupes incluses en paraffine ( Cytoblocs) Méthodes : Protocole de marquage immunocytochimique

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Méthodes : Protocole de marquage par Cytométrie en flux

Centrifugation 1200 tours/min

10 minutes

100-200 µl de PBS au culot

CD8-FITC, CD4-PE et CD3-PerCP-Cy5.5 20 minutes +4° à

l’abri de la lumière

Lavage 2 ml PBS

Centrifugation 1200 tours/min

10 minutes

Fixation 300 µl de fixateur 1X ( 3g de para-formaldéhyde dans 100 ml de PBS 1X, dilué)

Acquisition des données et analyse des échantillons

Contrôle 100 µl LBA

Contrôle Marquage

Contrôle Marquage

Marquage

69%

12%

19%

Hype-rcelluleire Normo-cellulaire Hypo-cellulaire

72%

16%

12%

Opalesent Clair Rosé

Cellularité

Résultats et Discussions Résultats du LBA

Aspect du LBAOpalescent

Hypercellulaire

Volume total récupéré Entre 27 et 163 mlVitalité cellulaire 58%

36

Macrophages Lymphocytes PNN PNE

45% 45%

8%

2%

formule

Lymphocytaire: moyenne 45% [18-78]

Résultats et Discussions Formule cellulaire

37

Concluants Non concluants

87,5%

12,5%

Résultats Immunocytochimie sur étalements

Problèmes d’acheminements et de conservation ?

Problèmes de fixation ?

Résultats et Discussions Immunocytochimie sur étalements

38

Concluants Non concluants

58,8%

41,2%


Réalisée chez 17 patients (53,1%)Autres cas Absence du culot lors de l’inclusion en paraffine

Fixation insuffisante des lames?Mauvais séchage?

Démasquage insuffisant secondaire à Tampon de pH inapproprié?

Résultats et Discussions Immunocytochimie sur cytoblocs

39

Concluantes Non concluantes

75%

25%


Hypo-cellularité du liquide?Faible vitalité?

Résultats et Discussions Cytométrie en flux

40

41

Comparaison entre Immunocytochimie sur étalements et en Immunocytochimie sur cytoblocs

4 cas discordants sur 8 cas

Immunocytochimie sur étalements

TotalCD4/CD8<1 1<CD4/CD8<1,6 CD4/CD8>1,6

Immunocytochimie sur cytoblocs

CD4/CD8<1 2 2 2 6

1<CD4/CD8<1,6 0 1 0 1

CD4/CD8>1,6 0 0 1 1Total 2 3 3 8

Coefficient de concordance kappa = 0,7

Bonne concordance entre les deux techniques

Même LaboratoireMêmes conditions d’acheminement

et de conservation

Résultats et Discussions

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Comparaison entre Immunocytochimie sur étalements et en Cytométrie en flux


Immunocytochimie sur étalements


Cytométrie en flux

CD4/CD8<1 5 1 0 6

1<CD4/CD8<1,6 0 2 1 3

CD4/CD8>1,6 2 5 7 14Total 7 8 8 23


Reproductibilité médiocre entre les deux techniques


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Comparaison entre Immunocytochimie sur cytoblocs et en Cytométrie en flux


Immunocytochimie sur cytoblocs


Cytométrie en fluxCD4/CD8<1 2 0 0 2

1<CD4/CD8<1,6 1 0 0 1CD4/CD8>1,6 1 0 1 2

Total 4 0 1 5


Reproductibilité médiocre entre les deux techniques


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• Mauvaise reproductibilité entre Immunocytochimie et Cytométrie en flux:• Comparables à plusieurs études:

Comptage lymphocytaire par immunocytochimie fait sur un nombre bien limité de cellules (maximum de 400 éléments).

Fiabilité des résultats dépend fortement de l’expérience de l’observateur.Signal non spécifique détecté sur les PNN peut donner lieu à une fausse interprétation

Cytométrie en flux plus apte à détecter des épitopes faiblement présents dans les cellules.


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Selon d’autres études

l’immunocytochimie énumère plus de cellules que l’analyse par

cytométrie en flux même si le LBA est hypo-cellulaire.

« La cytométrie en flux ne peut être aussi sensible que l’œil humain avec

un microscope dans la détection d’une cellule légèrement colorée ».


Autres études

Bonne reproductibilité entre ces deux techniques.

Pourtant, les auteurs ont préféré la cytométrie en flux par rapport à

l’immunocytochimie vu qu’elle nécessite beaucoup moins de temps (4 heures pour l’immunocytochimie vs. 40 min pour la cytométrie en flux dans notre

étude).

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un opérateur expérimenté

Conclusion et Perspectives

Conclusions

• Deux techniques comparées non réalisées dans les mêmes conditions expérimentales• Cas discordants non corrélés aux diagnostics cliniques

retenus

Perspectives

• Réaliser les 2 techniques dans notre laboratoire

• Consulter les dossiers médicaux pour les cas discordants afin

d’évaluer la justesse des résultats

un matériel de très bonne qualité avec une préservation

cellulaire optimale

Fiabilité dépend de plusieurs facteurs

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Merci pour votre attention

Science

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