HEMOPHILIE: la place du laboratoire JF SCHVED Centre Régional de Traitement des Hémophiles...

HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: la place du laboratoirela place du laboratoire

JF SCHVED

Centre Régional de Traitement des Hémophiles

Laboratoire d’Hématologie

CHU Montpellier

● Diagnostic

● Suivi thérapeutique

● Dépistage des complications: inhibiteurs

HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: la place du laboratoirela place du laboratoire

SYNDROME HEMORRAGIQUE: SYNDROME HEMORRAGIQUE:

BILANBILAN

4 Examens: Numération plaquettaire Temps de Quick (‘‘TP’’) Temps de Céphaline + activateur Fibrinogène

ALLONGEMENT DU ALLONGEMENT DU TEMPS DE CEPHALINE + ACTIVATEURTEMPS DE CEPHALINE + ACTIVATEUR

Quand parler d’allongement du temps de céphaline + activateur– Toujours en référer au «temps du témoin», que

le laboratoire doit indiquer– Temps de céphaline + activateur anormal si

TCA malade

TCA Témoin>> 1,2*

* Chez l’enfant: 1,3

XII

XI

IXVIII

VII

X

II

I

Caillot

PL

V

Activateur

EXPLORATION DE LA COAGULATION

XII

XI

IXVIII

VII

X

II

I

Caillot

PL

V

Temps de Quick

Facteur tissulaireCalcium

XII

XI

IXVIII

VII

X

II

I

Caillot

Céphaline

V

Temps de céphaline +activateur

Activateuracide ellagiquesilicekaolin

Calcium

XII

XI

IX

VIII

VII

X

II

I

V

TCA TQ Nl

XII

XI

IX

VIII

VII

X

II

I

V

TCA TQ Nl

Avec syndrome hémorragiqueAvec syndrome hémorragique

FACTEUR VIII : FACTEUR VIII : Différentes techniques de dosageDifférentes techniques de dosage

Dosage fonctionnel (activité)– Chronométrique– Chromogénique

Dosage de la protéine (antigène)

● Le dosage du facteur VIII● Réactifs:

● Plasma déficient en facteur VIII● Réactif TCa● Calcium

● Principe● Droite d'étalonnage: dilutions en tampon pH 7,35

● Dilution 1/20 (100%), 1/40 (50%), 1/80 (25%), 1/160 (12,5%), 1/320 (6,5%)

● Dilutions du plasma à tester

HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: la place du laboratoirela place du laboratoire

DOSAGE FACTEUR VIIIDOSAGE FACTEUR VIII

48,1

53,6

60,3

68,6

78,6

4,55 11,38 22,75 45,5 91,0

O

O

O

O

O

Concentrations (%)

Sec

O

1/4

O

1/2

O

1/1

VARIABLES PRE-ANALYTIQUESVARIABLES PRE-ANALYTIQUES

Tube: type, anticoagulant, remplissage.., hématocrite..

Prélèvement: garrot, matériel à prélèvement, cathéter, place du tube..

Transport: délai, température.. Conditionnement au labo: centrifugation,

congélation, conservation, décongélation..

DOSAGE CHRONOMETRIQUE DOSAGE CHRONOMETRIQUE du FVIIIdu FVIII

Facteurs influençant la précision:– Appareillage

– TCA : réactif utilisé

– Plasma déficient contenant tous les facteurs sauf FVIII (Plasma humain lyophilisé)

– Plasma à tester dilué: 2 dilutions extemporanées (1/10; 1/20 +++)

F VIII: Contrôle de Qualité ECAT

ECAT n° 2/2005

FVIII n moyenne CV %

limites Votre résultat

Groupe total 156 11.5 35.7 4-30 10

Test en 1 temps

Test en 2 temps

141

10

11.7

10.9

35.9

11.9

5-30

9-14

10

Activateur

Actin FSL

Pathromtin SL

PTT autom. stago

21

14

26

11.3

17.5

10.6

22.1

43.4

20.8

8-16

5-30

6-15

Déficit biologique Facteur VIII– Hémophilie A congénitale– Hémophilie acquise– Maladie de Willebrand

Déficit biologique Facteur IX– Hémophilie B congénitale– Hypovitaminose K partielle ou débutante

Déficit biologique en facteur XI– Déficit congénital en facteur XI

TCA TQ Nl

avec syndrome hémorragiqueavec syndrome hémorragique

Classification des hémophiliesClassification des hémophilies

Taux de facteur Classification

< 0.01 IU/ml (< 1%) sévère

0.01-0.05 IU/ml (1%-5%) modérée

> 0.05- < 0.40 IU/ml (> 5%-< 40%) mineure

1 IU/ml = 100% World Health Organization International Standard

T & H 2001 Scientific subcommittee on FVIII and FIX

Valeurs normales = 50- 150% (établies dans chaque laboratoire)

● Diagnostic

● Suivi thérapeutique

● Dépistage des complications: inhibiteurs

HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: la place du laboratoirela place du laboratoire

PHARMACOCINETIQUEPHARMACOCINETIQUE

- Récupération : Taux maximal et evolution dans le temps du taux de FVIII ou IX dans le sang circulant après une perfusion d’une quantité donnée de facteur anti-hémophilique.

- Demi-vie : Temps au bout duquel il reste 50 % du taux maximum de FVIII ou IX circulant.

CINETIQUE FAH: CINETIQUE FAH: ProtocoleProtocole

Doses à injecter prélèvements

-pour le FVIII :

25 U/kg

-pour le FIX :

50 U/kg

-avant le prélèvement

-à 10 min

-à 30 min

-à 1h

-à 6h

-à 12 h

-à 24h

DOSAGE F VIII DOSAGE F VIII pour CINETIQUEpour CINETIQUE

Technique: – Méthode de coagulation en 1 temps

Particularités– Dosage de Refacto R

Préférer le dosage chromogénqique Standard Refacto

CINETIQUE F VIIICINETIQUE F VIII

0

20

40

60

80

100

avant 15

mn

30

mn

1h 6h 12h 24h

FVI I I c

Injection de25UI/kg

FVIII; ½ vie 8 hRécupération 2U/dl/U/kg;

FIX; ½ vie 12 hRécupération 1U/dl/U/kg

EXEMPLE DE CINETIQUE F VIIIEXEMPLE DE CINETIQUE F VIII

Patient de 90 Kg

Temps en heures

Activité F VIII (en %)

5 10 15 20 25 30

10

20

30

40

50

6049

FVIII 2250 UI

1

- Calcul de la récupération =(49-1)x90 : 2250 =1.92 % par U/ kg

- Demie vie = 9 h

Pharmacocinétique: limitesPharmacocinétique: limites

Méthodes de dosage– FVIII:C et FIX:C

Recommandations FVIII/FIX subcommittee of SSC of the ISTH

Récupération in vivo– Volume de distribution = vol. plasmatique du patient

Faux pour le FIX non constant dans le temps activation post-perfusion

Demi-vies– 2 ou 3 phases

Rapide = équilibre distribution vol. plasmatique (3-6h) Plateau = taux initial Finale = dégradation du FVIII (15-17h)

● Diagnostic

● Suivi thérapeutique

● Dépistage des complications: inhibiteurs

HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: Les inhibiteursLes inhibiteurs

DEPISTAGE des INHIBIBITEURS: DEPISTAGE des INHIBIBITEURS:

Quand le faire?Quand le faire?

Systématiquement tous les 3 mois ou toutes les 5-10 substitutions chez l'hémophile sévère et jusqu'à 100 jours cumulés d'exposition au produit (JCPA), puis 1-2 fois par an

Avant (15j) et après une chirurgie ou un traitement intensif

Inefficacité ou efficacité partielle d'une perfusion de FAH

Mise en évidence d'un Mise en évidence d'un inhibiteur: comment?inhibiteur: comment?

Mise en évidence d'un effet inhibiteur in vitro – Bethesda

Courbe de récupération

Les premières méthodesLes premières méthodes

Principe : mesure de la capacité à inhiber l’activité procoagulante du FVIII

Dépistage puis Titrage Qualitatif : dilution de plasma contenant

l’inhibiteur + quantité fixe de FVIII New Oxford

1973

Bethesda 1975

Plasma concentré

Pool de plasma normaux

DEPISTAGE des ANTI F VIII

Incubation (1:1, 2 h à 37°) : – Plasma titré à 100% de F VIII + plasma à tester– Plasma titré à 100% + tampon

Dosage du FVIII résiduel – Dans le mélange plasma 100% + plasma à tester– Dans le mélange plasma 100% + tampon

Dans ce mélange, le taux de VIII attendu est environ de 50%

InterprétationLa présence d’un anti VIII se traduit par une diminution

du taux de FVIII dans le mélange « référence+malade »En l’absence d’Ac le taux de FVIII est identique a celui

retrouvé dans le mélange « référence+tampon »

Biologie: Dépistage anti FVIII

T°

1 vol.

1 vol.

1 vol.

1 vol.

Plasma malade Tampon

Plasma titré à 100%

50% de FVIII< 50 % de FVIII

TITRAGE de l'Anti FVIII (Bethesda)

Taux de FVIII résiduel (malade+référence) Taux de FVIII résiduel (tampon+référence) Taux de FVIII résiduel corrigé

- Taux résiduel corrigé reporté sur un abaque reliant les UB et les taux résiduels corrigés

- 1UB = quantité d’Ac neutralisant 50% du plasma de référence

= 50% d’activité résiduelle corrigé

X 100

Modification de NijmegenModification de Nijmegen

Technique classique : manque de spécificité – notamment sur les valeurs basses

Tamponner le plasma normal ainsi que le mélange contrôle Remplacer le tampon de l’échantillon contrôle par du

déficient FVIII immunodéplété – pour éviter la chute du pH pendant l’incubation : faux + par

inactivation du FVIII:C indépendant des Ac

HEMOPHILIE : HEMOPHILIE : Rôle du laboratoireRôle du laboratoire

Indispensable pour diagnostic– Permet aussi de classer les hémophilies

– Problèmes de variabilité inter-laboratoire

– Mais la sévérité est un paramètre clinique

Indispensable pour dépistage , titrage et suivi des inhibiteurs

Indispensable pour adaptation thérapeutique– Cinétique à mise en place d'un traitement, lors d'un

changement de traitement, avant chirurgie

Parfois nuisible en urgence