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HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: la place du laboratoirela place du laboratoire
JF SCHVED
Centre Régional de Traitement des Hémophiles
Laboratoire d’Hématologie
CHU Montpellier
● Diagnostic
● Suivi thérapeutique
● Dépistage des complications: inhibiteurs
HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: la place du laboratoirela place du laboratoire
SYNDROME HEMORRAGIQUE: SYNDROME HEMORRAGIQUE:
BILANBILAN
4 Examens: Numération plaquettaire Temps de Quick (‘‘TP’’) Temps de Céphaline + activateur Fibrinogène
ALLONGEMENT DU ALLONGEMENT DU TEMPS DE CEPHALINE + ACTIVATEURTEMPS DE CEPHALINE + ACTIVATEUR
Quand parler d’allongement du temps de céphaline + activateur– Toujours en référer au «temps du témoin», que
le laboratoire doit indiquer– Temps de céphaline + activateur anormal si
TCA malade
TCA Témoin>> 1,2*
* Chez l’enfant: 1,3
XII
XI
IXVIII
VII
X
II
I
Caillot
PL
V
Activateur
EXPLORATION DE LA COAGULATION
XII
XI
IXVIII
VII
X
II
I
Caillot
PL
V
Temps de Quick
Facteur tissulaireCalcium
XII
XI
IXVIII
VII
X
II
I
Caillot
Céphaline
V
Temps de céphaline +activateur
Activateuracide ellagiquesilicekaolin
Calcium
XII
XI
IX
VIII
VII
X
II
I
V
TCA TQ Nl
XII
XI
IX
VIII
VII
X
II
I
V
TCA TQ Nl
Avec syndrome hémorragiqueAvec syndrome hémorragique
FACTEUR VIII : FACTEUR VIII : Différentes techniques de dosageDifférentes techniques de dosage
Dosage fonctionnel (activité)– Chronométrique– Chromogénique
Dosage de la protéine (antigène)
● Le dosage du facteur VIII● Réactifs:
● Plasma déficient en facteur VIII● Réactif TCa● Calcium
● Principe● Droite d'étalonnage: dilutions en tampon pH 7,35
● Dilution 1/20 (100%), 1/40 (50%), 1/80 (25%), 1/160 (12,5%), 1/320 (6,5%)
● Dilutions du plasma à tester
HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: la place du laboratoirela place du laboratoire
DOSAGE FACTEUR VIIIDOSAGE FACTEUR VIII
48,1
53,6
60,3
68,6
78,6
4,55 11,38 22,75 45,5 91,0
O
O
O
O
O
Concentrations (%)
Sec
O
1/4
O
1/2
O
1/1
VARIABLES PRE-ANALYTIQUESVARIABLES PRE-ANALYTIQUES
Tube: type, anticoagulant, remplissage.., hématocrite..
Prélèvement: garrot, matériel à prélèvement, cathéter, place du tube..
Transport: délai, température.. Conditionnement au labo: centrifugation,
congélation, conservation, décongélation..
DOSAGE CHRONOMETRIQUE DOSAGE CHRONOMETRIQUE du FVIIIdu FVIII
Facteurs influençant la précision:– Appareillage
– TCA : réactif utilisé
– Plasma déficient contenant tous les facteurs sauf FVIII (Plasma humain lyophilisé)
– Plasma à tester dilué: 2 dilutions extemporanées (1/10; 1/20 +++)
F VIII: Contrôle de Qualité ECAT
ECAT n° 2/2005
FVIII n moyenne CV %
limites Votre résultat
Groupe total 156 11.5 35.7 4-30 10
Test en 1 temps
Test en 2 temps
141
10
11.7
10.9
35.9
11.9
5-30
9-14
10
Activateur
Actin FSL
Pathromtin SL
PTT autom. stago
21
14
26
11.3
17.5
10.6
22.1
43.4
20.8
8-16
5-30
6-15
Déficit biologique Facteur VIII– Hémophilie A congénitale– Hémophilie acquise– Maladie de Willebrand
Déficit biologique Facteur IX– Hémophilie B congénitale– Hypovitaminose K partielle ou débutante
Déficit biologique en facteur XI– Déficit congénital en facteur XI
TCA TQ Nl
avec syndrome hémorragiqueavec syndrome hémorragique
Classification des hémophiliesClassification des hémophilies
Taux de facteur Classification
< 0.01 IU/ml (< 1%) sévère
0.01-0.05 IU/ml (1%-5%) modérée
> 0.05- < 0.40 IU/ml (> 5%-< 40%) mineure
1 IU/ml = 100% World Health Organization International Standard
T & H 2001 Scientific subcommittee on FVIII and FIX
Valeurs normales = 50- 150% (établies dans chaque laboratoire)
● Diagnostic
● Suivi thérapeutique
● Dépistage des complications: inhibiteurs
HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: la place du laboratoirela place du laboratoire
PHARMACOCINETIQUEPHARMACOCINETIQUE
- Récupération : Taux maximal et evolution dans le temps du taux de FVIII ou IX dans le sang circulant après une perfusion d’une quantité donnée de facteur anti-hémophilique.
- Demi-vie : Temps au bout duquel il reste 50 % du taux maximum de FVIII ou IX circulant.
CINETIQUE FAH: CINETIQUE FAH: ProtocoleProtocole
Doses à injecter prélèvements
-pour le FVIII :
25 U/kg
-pour le FIX :
50 U/kg
-avant le prélèvement
-à 10 min
-à 30 min
-à 1h
-à 6h
-à 12 h
-à 24h
DOSAGE F VIII DOSAGE F VIII pour CINETIQUEpour CINETIQUE
Technique: – Méthode de coagulation en 1 temps
Particularités– Dosage de Refacto R
Préférer le dosage chromogénqique Standard Refacto
CINETIQUE F VIIICINETIQUE F VIII
0
20
40
60
80
100
avant 15
mn
30
mn
1h 6h 12h 24h
FVI I I c
Injection de25UI/kg
FVIII; ½ vie 8 hRécupération 2U/dl/U/kg;
FIX; ½ vie 12 hRécupération 1U/dl/U/kg
EXEMPLE DE CINETIQUE F VIIIEXEMPLE DE CINETIQUE F VIII
Patient de 90 Kg
Temps en heures
Activité F VIII (en %)
5 10 15 20 25 30
10
20
30
40
50
6049
FVIII 2250 UI
1
- Calcul de la récupération =(49-1)x90 : 2250 =1.92 % par U/ kg
- Demie vie = 9 h
Pharmacocinétique: limitesPharmacocinétique: limites
Méthodes de dosage– FVIII:C et FIX:C
Recommandations FVIII/FIX subcommittee of SSC of the ISTH
Récupération in vivo– Volume de distribution = vol. plasmatique du patient
Faux pour le FIX non constant dans le temps activation post-perfusion
Demi-vies– 2 ou 3 phases
Rapide = équilibre distribution vol. plasmatique (3-6h) Plateau = taux initial Finale = dégradation du FVIII (15-17h)
● Diagnostic
● Suivi thérapeutique
● Dépistage des complications: inhibiteurs
HEMOPHILIE: HEMOPHILIE: Les inhibiteursLes inhibiteurs
DEPISTAGE des INHIBIBITEURS: DEPISTAGE des INHIBIBITEURS:
Quand le faire?Quand le faire?
Systématiquement tous les 3 mois ou toutes les 5-10 substitutions chez l'hémophile sévère et jusqu'à 100 jours cumulés d'exposition au produit (JCPA), puis 1-2 fois par an
Avant (15j) et après une chirurgie ou un traitement intensif
Inefficacité ou efficacité partielle d'une perfusion de FAH
Mise en évidence d'un Mise en évidence d'un inhibiteur: comment?inhibiteur: comment?
Mise en évidence d'un effet inhibiteur in vitro – Bethesda
Courbe de récupération
Les premières méthodesLes premières méthodes
Principe : mesure de la capacité à inhiber l’activité procoagulante du FVIII
Dépistage puis Titrage Qualitatif : dilution de plasma contenant
l’inhibiteur + quantité fixe de FVIII New Oxford
1973
Bethesda 1975
Plasma concentré
Pool de plasma normaux
DEPISTAGE des ANTI F VIII
Incubation (1:1, 2 h à 37°) : – Plasma titré à 100% de F VIII + plasma à tester– Plasma titré à 100% + tampon
Dosage du FVIII résiduel – Dans le mélange plasma 100% + plasma à tester– Dans le mélange plasma 100% + tampon
Dans ce mélange, le taux de VIII attendu est environ de 50%
InterprétationLa présence d’un anti VIII se traduit par une diminution
du taux de FVIII dans le mélange « référence+malade »En l’absence d’Ac le taux de FVIII est identique a celui
retrouvé dans le mélange « référence+tampon »
Biologie: Dépistage anti FVIII
T°
1 vol.
1 vol.
1 vol.
1 vol.
Plasma malade Tampon
Plasma titré à 100%
50% de FVIII< 50 % de FVIII
TITRAGE de l'Anti FVIII (Bethesda)
Taux de FVIII résiduel (malade+référence) Taux de FVIII résiduel (tampon+référence) Taux de FVIII résiduel corrigé
- Taux résiduel corrigé reporté sur un abaque reliant les UB et les taux résiduels corrigés
- 1UB = quantité d’Ac neutralisant 50% du plasma de référence
= 50% d’activité résiduelle corrigé
X 100
Modification de NijmegenModification de Nijmegen
Technique classique : manque de spécificité – notamment sur les valeurs basses
Tamponner le plasma normal ainsi que le mélange contrôle Remplacer le tampon de l’échantillon contrôle par du
déficient FVIII immunodéplété – pour éviter la chute du pH pendant l’incubation : faux + par
inactivation du FVIII:C indépendant des Ac
HEMOPHILIE : HEMOPHILIE : Rôle du laboratoireRôle du laboratoire
Indispensable pour diagnostic– Permet aussi de classer les hémophilies
– Problèmes de variabilité inter-laboratoire
– Mais la sévérité est un paramètre clinique
Indispensable pour dépistage , titrage et suivi des inhibiteurs
Indispensable pour adaptation thérapeutique– Cinétique à mise en place d'un traitement, lors d'un
changement de traitement, avant chirurgie
Parfois nuisible en urgence
