Interactions entre Mycobacterium...

Interactions entre Interactions entre MycobacteriumMycobacterium tuberculosistuberculosis

et les cellules phagocytaireset les cellules phagocytaires

CCééline line PujolPujol et Franck et Franck BietBiet -- IASP INRA ToursIASP INRA ToursOlivier Olivier NeyrollesNeyrolles

Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale -- ToulouseToulouse

Infectious diseases14.9 million (>25%)45% in developing countries63% in 0-4 yo children

Others

Cardiovascular diseases

Neoplastic diseases

Injuries

Asthma & chronic obstructive pulmonary diseases

Annual deaths (WHO, 2002)

Respiratory infections

HIV / AIDS (2.77 million)Diarrhoeal diseases

Tuberculosis (1.56 million)

Childhood diseases

Malaria (1.27 million)

Others

Annual deaths due to infectious diseases (WHO, 2002)

Emerging diseases

Legionnaire’s diseaseToxic shock syndrome

Lyme diseaseHIV

Nipah virusHantavirusEbola virus

Marburg virusE. coli O157:H7

Re-emerging diseases

CholeraTuberculosisDengue feverYellow fever

Malaria

~4 billion non-infected

~2 billion infected

TB 14 million† 1.6 million

19521957

19621921

Public health measures

2007

Isoniaside

INH

Pyrazinamide

Ethionamide ETHEthambutol

ETMB

Rifampicine

The DOTS strategyDirectly Observed Therapy, Short course

Peru, 1980-2000

1/ Government commitment to sustained TB control activities

2/ Case detection by sputum smear microscopy among symptomatic patients self-reporting to health services.

3/ Standardized treatment regimen of six to eight months for at least all sputum smear- positive cases,with directly observed therapy (DOT) for at least the initial two months.

4/ A regular, uninterrupted supply of all essential anti-TB drugs.

5/ A standardized recording and reporting system that allows assessment of treatment resultsfor each patient and of the TB control programme performance overall.

Estimated number of new TB cases by country (WHO, 2005)

Brazil60/100,00068% DOTS

Paraguay68/100,00054% DOTS

Argentine41/100,000100% DOTS

Bolivia211/100,00047% DOTS

Peru172/100,000100% DOTS

Uruguay28/100,000100% DOTS

Ecuador131/100,00070% DOTS

Colombia45/100,00050% DOTS

Venezuela42/100,000100% DOTS

Chile15/100,000100% DOTS

New vaccine

New drugs

WHO projections by 2020

• 1 billion people newly infected• 200 million people sick• 35 million deaths

Future prospects

The Mycobacterium genus

From Filliol et al. 2006 J Bacteriol

M. canettiiM. africanumM. bovis (incl. BCG)M. microtiM. tuberculosis

W-Beijing lineage

12

34

5

6

Physiopathologie

Caractéristiques cliniques et histologiques conjonction de 2 types de facteurs

Facteurs virulence du bacille Nature et intensité des mécanisme de défense de l’hôte

Tuberculose paradigme des maladies dont l’immunité protectriceest de type cellulaire

Deux axes d’évolutions formation du granulome et la nécrose tissulaire

Contamination (individus contagieux)

Infection des voies respiratoires gouttelettes de « Pflugge » chargées de Bacilles

Véhicule efficace non capturé par le tapis mucociliaire

Survie jusqu’au alvéoles pulmonaire ou elle rencontre le macrophage alvéolaire

Après phagocytose

* tuberculose disséminée, 1-5% la plupart du temps fatale ; la dissémination des cellules infectées se poursuit par le sang dans tout le corps. On voit apparaître de petits tubercules contenant les bacilles qui se multiplient activement. nodules tuberculeux au niveau des alvéoles détectés par une radiographie pulmonaire. Cette forme de la maladie n'apparaît que chez les enfants et des personnes très affaiblies.

* tuberculose latente : 90 % c'est l'issue la plus fréquente dans les pays industrialisés. Les personnes infectées ne sont pas malades. Du point de vue clinique cette phase correspond à une hypersensibilité cutanée. Activation du macrophage, formation de granulome, produit de nécrose appelé caséum (solide) c’est la nécrose tissulaire

* tuberculose active : 5-10 % on observe une extension progressive des tubercules pulmonaires avec une dégénérescence des alvéoles pulmonaires et des sinus (zone de confluence vasculaire) sanguins. Les personnes sont alors contagieuses et la mort survient en absence de traitement. Le diagnostic peut être fait par test cutané, par radio pulmonaire ou par l'observation de crachats et la culture des bacilles qu'ils contiennent. Caséum liquide favorise la multiplication cellulaire

Physiopathologie : Trois évolutions sont possibles

Paroi assimilée à un G+

Interactions avec l’hôte nécessaire à l’infection

Inhibe maturation du phagosome

Résistance à de nd antibiotiques

LAM ou LPS mycobactérien important facteur de virulence

hétérogène de taille et de structure

Impliqué pour la pathogénie

Coiffe de mannose chez les espèces à croissance lente ManLAM

Module la réponse immunitaire induction de nb

cytokines Th1 et inflammatoire TNF-α, GM-CSF IL-1α IL-1b, IL-12 IL-10, TGF-β

Chimiokine IL-8 Gro-α

Paroi Mycobactérienne : clef de la pathogénie tuberculeuse

ETH

INH

EMB

STR

Ethionamide ETH, Isoniazid INH, Ethambutol EMB et Steptomycine STR

Site d’action des antibiotiques utilisés contre les mycobactéries

Les mycobactéries préférentiellement phagocytée par les macrophagespar au moins trois mécanismes:

* en présence des protéines du complément activé la phagocytose facilitée par opsonisation, les protéines du complément se fixent sur la paroi bactérienne (fractions C3b et C3bi) et facilitent ainsi l'adhérence du bacille avec les récepteurs (dits CR) de la membrane du macrophage

* lorsque le complément est inactif le bacille libère lui-même une enzyme (C3-convertase) capable d'activer les fractions du complément nécessaires à sont opsonisation (C3b à partir de C2a)

* enfin, les résidus mannose de la paroi de la bactérie peuvent adhérer àdes récepteurs sépcifiques de la membrane du phagocyte (récepteurs MR).les récepteurs CR et MR +/- exprimés à des moments différents de la maturation et de l'activation du macrophage

Phagocytose des mycobactéries

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E+07

1,E+08

0 2 4 6 8 10Time post-infection (days)

CFU

s/50

0,00

0 ce

lls

M. tuberculosis(td~25h)

Growth inside macrophages

From DG Russell

N

E. coli

Phagocytosis and degradation

Exocytosis

Phagosome

Late endosomesLysosomes

pH~4,5

Phago-lysosome

N

ER

CMH-II

Proteasome

CMH-I

T CD4+

IFN-γ

T CD8+

Cytolysis / IFN-γ

Phagocytosis and antigen presentation

Phagosome biogenesis

Kiss and Run

Kiss and Run

Recyclingendsome

Late endosomepH 5.5

LysosomepH 4.5-5

EarlyendosomepH 6.3

Golgi

The « kiss and run » model(M Desjardins)

Phagosome maturation

Maturation

phagosome precoce

0-5 min

Kiss and Run

Recyclingendosome

EarlyendosomepH 6.3

Pi3P

* EEA1

Rab5

Tf

Trans-Golginetwork

Phagosome maturation

Maturation

phagosome précoce

phagosome tardif

5-30 min

0-5 min

Kiss and Run

Kiss and Run

Recyclingendosome

Late endosomepH 5.5

EarlyendosomepH 6.3

Pi3P

* EEA1

Rab5

Tf

LAMP1

Rab7

Trans-Golginetwork

Phagosome maturation

Maturation

phagosome precoce

phagosome tardif

phagolysosome

40-60 min

5-30 min

0-5 min

Kiss and Run

Kiss and Run

Recyclingendsome

Late endosomepH 5.5

LysosomepH 4.5-5

EarlyendosomepH 6.3

Pi3P

* EEA1

Rab5

Tf

LAMP1

Rab7

v-ATPase

Cathepsin D

Trans-Golginetwork

Intracellular survival strategies

StrategyMaturation arrest

Escape from phagosome

Other / Unique

PathogenSalmonella

Mycobacteria

Leishmania

Shigella

Listeria

Rickettsia

Trypanosoma

Chlamydia

Legionella

Toxoplasma

MechanismsSPI2-mediated inhibition of vesicle fusion

Modulation of SNARE proteinsInhibition of EEA1 acquisition by ManLAMOthers…

Inhibition of actin depolymerizationLipophosphoglycan-mediated inhibition of fusion

Lysins and phospholipases

Inclusion vacuole

Association with ER

Association with mitochondria and ER

Intracellular survival strategies

StrategyMaturation arrest

Escape from phagosome

Other / Unique

PathogenSalmonella

Mycobacteria

Leishmania

Shigella

Listeria

Rickettsia

Trypanosoma

Chlamydia

Legionella

Toxoplasma

MechanismsSPI2-mediated inhibition of vesicle fusion

Modulation of SNARE proteinsInhibition of EEA1 acquisition by ManLAMOthers…

Inhibition of actin depolymerizationLipophosphoglycan-mediated inhibition of fusion

Lysins and phospholipases

Inclusion vacuole

Association with ER

Association with mitochondria and ER

N

M. tuberculosis

LE/Ly

pH~6.3 RE

TfR/Tf

vATPase

M. tuberculosis: « the indigestible microbe »

pH~6.3

vATPase

Mtb / vATPase Mtb / DAMP

pH~5.0-5.5

vATPase

Killed Mtb / DAMP

M. tuberculosis blocks phagosome acidification

The latex bead phagosome(M. Desjardins)

The Mycobacterial phagosome

SapM

Mycobacterial attributes contributing to phagosome maturation arrest

PknG

PI3P PI

↑[Ca2+]c/CaM

hVPS34 (p150)

PI3P-EEA1

Phagosome maturation

From Walburger et al. 2004. ScienceVergne et al. 2005. PNAS

Verge et al. 2003. J Exp MedFratti et al. 2003. J Biol Chem

Cavalli et al. 2001 Mol CellFratti et al. 2003 PNAS

Bach et al. 2008. Cell Host Microb

Vps33B-[P]

Vps33B

PtpA

Man-LAM

p38MAPK

GDIGDP

Rab5-GDP

EEA1-PI3P/Stx6-

mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery

PI3P is necessary for phagosome maturation

LAMP1 (-WT)

LAMP1 (+WT)

From Vieira et al. 2001 J Cell Biol

SapM

Man-LAM inhibiting Pi3P formation

PknG

Man-LAM

PI3P PI

↑[Ca2+]c/CaM

hVPS34 (p150)

From Vergne et al. 2005. PNASVerge et al. 2003. J Exp MedFratti et al. 2003. J Biol Chem

Cavalli et al. 2001 Mol CellFratti et al. 2003 PNAS

Vps33B-[P]

Vps33B

PtpA

hVPS34 (p150)

PI3P-EEA1

Phagosome maturation

p38MAPK

GDIGDP

Rab5-GDP

EEA1-PI3P/Stx6-

mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery

SapMPknG

PI3P PI

↑[Ca2+]c/CaM

hVPS34 (p150)

Vps33B-[P]

Vps33B

PtpA

hVPS34 (p150)

PI3P-EEA1

Phagosome maturation

Man-LAM

Mycobacteria secrete a PI3P-hydrolizing phosphatase (SapM)

EEA1

From Vergne et al. 2005 PNAS

p38MAPK

GDIGDP

Rab5-GDP

EEA1-PI3P/Stx6-

mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery

Mycobacteria secrete a PI3P hydrolizing phosphatase (SapM)

From Vergne et al. 2005 PNAS

SapM

PknG

(ser/thr kinase)

PI3P PI

↑[Ca2+]c/CaM

hVPS34 (p150)

From Walburger et al. 2004. Science

Vps33B-[P]

Vps33B

PtpA

hVPS34 (p150)

PI3P-EEA1

Phagosome maturation

Man-LAM

Protein Kinase G promotes mycobacterial survival wthin macrophages

p38MAPK

GDIGDP

Rab5-GDP

EEA1-PI3P/Stx6-

mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery

A M. tuberculosis Ser/Thr kinase (PknG) confers resistanceto P-L fusion when introduced into M. smegmatis

From Walburger et al. 2004 Science

SapMPknG

PI3P PI

↑[Ca2+]c/CaM

hVPS34 (p150)

Bach et al. 2008. Cell Host Microb

Vps33B-[P]

Vps33B

PtpA

hVPS34 (p150)

PI3P-EEA1

Phagosome maturation

Man-LAM

PtpA is a tyrosine phosphatase dephosphorylating VPS33B

p38MAPK

GDIGDP

Rab5-GDP

EEA1-PI3P/Stx6-

mediated V0H+ ATPase & lysosomal enzyme delivery

Frmo Bach et al. 2008. Cell Host Microb

PtpA colocalizes with VPS33B and inhibits P-LE fusion

From Cole et al. 1998 Nature

The M. tuberculosis genome

699

2190102

1200

444

Sequences with a 3DhomologueFunction assigned by clearhomologyFunction assigned bytentative homologyHomologue found but nofunction assignedNo homologue found

Function unknown41%

The M. tuberculosis genome

Genome comparison Mutant library screening Transcriptomics & proteomics

Gene candidate

High throughput drug screeningKnowledge-based approach

Genomics for virulence gene & drug target discovery