Manipuler les protéines membranaires et les membranes à l ......2 Dilution sous CMC (ou biobeads)...

GdR

AM

V

-M

anip

ulat

ion

de m

embr

anes

et

poly

amph

iphi

les-

déce

mbr

e 20

04

ManipulerManipuler les les protéinesprotéines membranairesmembranaires et les et les membranes à membranes à l’aidel’aide de de polyamphiphilespolyamphiphiles..

Physico-chimie des Polymères et Milieux Dispersés

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04

Dispersion de membranes

Manipulation de protéines membranaires.Manipulation de protéines membranaires.

Détergent

Retrait possible des micelles labiles (dilution, dialysis, biobeads...)

-STABILITE DU COMPLEXE SANS EQUILIBRE AVEC LA PHASE AQUEUSE

-DISPERSION CONTROLEE DE MIXTES LIPIDES/PROTEINES

1

3

2

Polyamphiphile(Amphipol)

Purification / étude

(chromato, dialyse, centri …)EN PRESENCE DE DETERGENT!

Multiautors review, Cell Mol. Life Sci 60 (2003) 1-16

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04 Assemblages Assemblages polymèrespolymères / membranes/ membranes..

Fluidité / réorganisation des structures:Membranes lipidiques

Vers un boîte à outils membranaires:

+

Adsorption Adsorption DistorsionDistorsionSolubilisationSolubilisationPermPermééabilitabilitééRupture Rupture MicellisationMicellisation

hydrophobe

hydrophile

C. Ladavière, C. Tribet, S. Cribier, Langmuir 2002, 18, 7320F. Vial, S. Rahbi, C. Tribet, Langmuir 2004, in press

pores transitoires rupture ou fuite

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04

Membranes lipidiques

Modulation des morphologies membranaires.Perméabilisation

Dispersants et stabilisants de protéines.

Extraits membranaires

Quelques polyamphiphiles synthétiques

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04 Polymères modifiés hydrophobe (HMPAs)Polymères modifiés hydrophobe (HMPAs)

structures ajustablesstructures ajustables

code y (mol%)150-1C18 0.9± 0.2

long 150-3C18 3.3 ± 0.3copolymers 150-5C18 5.0 ± 0.4

150-7C18 7.2 ± 0.45-3C18 3.0±0.2short

polymers 5-5C8 5.0±0.1

- long HMPA Mn 150 000; Ip~6

⇒ gels

- Dispersions HMPA courts Mn 5000 ou 20000, Ip~2

Amphipol 5-25C8-40C3

(Mw-yCn-zCm)

Modification de PAA ⇒ même squelette, copolymère aléatoire

Ajustment d’ hydrophobie & densité chargeCH2 CH CH2 CH CH2 CH

C C CO O O

O NH NH

CnH2n+1 C3H7

Na

100-z-y zy

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04 Autres « amphipols » typiques

(CH2 CH)y (CH2

C O

CH)z

C O

(CH2 CH)u

C OCH)x

NH

(CH2)7CH3

NH3C CH3

OHNOH

OHCH2OH

OH

(CH2

C OO- +Na

mphipols anioniques, quasi-neutres ou bien solubles à bas pH

20[15C8-34C2]

20[15C8-50C2]

20[15C8-58C2]

20[20C8-50C2]

20[15C8-78C2] (quasi neutre)

20[33C8-55C2]

20[32C8-25Glu]

télomères neutres avec R1 = chaîne n-heptyle ou n-undécyle. R2 = H ou β-D-galactopyranosyle

N6[18C7,5C12]

N8 [28C7,3C12]

N7[18C7,79Gal,3C12]

N3[25C11,4C12]

N5[22C11,9C12]

N28[17C11,1C12]

(CH2 CH)x

C O

(CH2 CH)y H

C O

NH

C12H25S

NH

O OH OH OH OH OR2

HN

O

R1

C. Prata, F. Giusti, Y. Gohon , B. Pucci , J.-L. Popot , C. Tribet, Biopolymers (2001)

Greffage

Co-télomères

ATRP : (N. Pantoustier)

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04

Membranes lipidiques

Modulation des morphologies membranaires.Perméabilisation

Dispersants et stabilisants de protéines.

Extraits membranaires

Quelques polyamphiphiles synthétiques

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04 Vésicules lipidiques étudiées

Car

acté

risat

ions

Car

acté

risat

ions

SUV : Rh ≈ 60 nm (sonication) ou GUV: 20-30µm (electroformation)

- Mw : diffusion de lumière statique

- Rayon : diffusion de lumière dynamique

- Perméabilité : fuite de calcein, de Dextran, de protéines

- Adsorption du polymère: NRET , électrophorèse

-Microscopie (épifluorescence)

- Conductance de films noirs (dynamique des pores)

O

P OO

O

CH2CH

O

C O

CH2

O

C O

C15H31 C15H31

CH3

NH3C CH3

CH2

CH2

O

P OO

O

CH2CH

O

C O

CH2

O

C O

C15H31 C15H31

DPPA

eggPC = mélangeR1 60% palmitate 16:0, 30%stearate 18:0

R2 66% oleate 16:1 and 34% 16:2.

DPPC

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04

Influence d’une adsorption de polymère

sans polymère5-3C18

0.125g/L5-3C180.5 g/L

↑ polymer concentration (16h at 4°C pH 7.0)

• Perte de souplesse

• Formation de spots sombres

G × 25

+ GUV unilamellaires (electro-formation)

egg-PC + NBD-PC•Bis Tris/HCl 10mM pH7• (Polymer / Lipid)wt ≥ 10• Nb C18 / lipid ≈ 3

10 µm

NH

NO

N

NO2

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04 Réorganisation en domaines

phase contrast Fluorescence (488 nm)

Formation of facets

eggPC : NBD-PC + 5-25C8 (0.5g/L) 4°C 1h

a, c : sharp depth of field : periphery b, d : large depth of field: upper crown

+T > Tc

C. Ladavière, C. Tribet, S. Cribier, Langmuir 2002, 18, 7320

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04

Contrôler la perméabilité membranaire

NBD-PC (fluorescence at 488nm) RITC-Dextran (9300 g/mol; fluorescence at 514 nm)

Surface:Surface: Volume:Volume:

10µm

+ 5-25C8-40C3 + 150-3C18

BisTris/HCl 10mM pH7 // (polymer / lipid)wt/wt≥ 16 // [Dextran]f ≈ 1 g/l

a et b) 1H45 at 4°C, c) 3days, 4°CUnilamellar: 1-2h

Multilamellar: no leakagebefore 24h (& // breakdown…)

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04

Calcein leakage of egg-PC/DPPA SUV in presence of 5-25C8-40C3(10mM BisTRIS-HCl buffer pH 6.8 and NaCl, 25°C).

Calcein (25mM)

Calcein (10µM)

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 5 10 15 20 25time (min)

I flu

o -Io

no added saltNaCl 25 mMNaCl 50 mMNaCl 100 mM

c.a. 100% release at20% change by SLS

Contrôler la perméabilité membranaire

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04 BILAN :

+

Rh polymer

~1mono/10 lipids

conditions critiques (Solvant, pH, sel)

Permeabilisation sans translocation du polymère

30-50nm

10nm

Cinétiques lentes:heures /jours

hydrophobie

Absence de structure intrachaine

Polydispersité

3-20 « ancres» hydrophobes

Association

monomère/lipide

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Membranes lipidiques

Modulation des morphologies membranaires.Perméabilisation

Dispersants et stabilisants de protéines.

Extraits membranaires

Quelques polyamphiphiles synthétiques

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04

BR

OmpF RC

0

20

40

60

80

100

Heca

meg

buffe

rpr

ecur

sor

A 8-

75A

8-35

A 34

-75

A 34

-35

% o

f pro

tein

in su

pern

atan

t

0

20

40

60

80

100

0.05% 0.005 %

Other proteins

b6 f

A 8-75A 8-35

buffer

A 34-75

A 34-35

AmphipolsAmphipols & protéines: solubilité& protéines: solubilité

Dispersion de complexes protéine/détergent

Amphipol

1

2 Dilution sous CMC (ou biobeads)

Séparation des agrégats

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Dark-field Scanning transmission electron microscopy image of an unstained cytochrome b6 fcomplexed with the amphiphilic short polyanions A8-75 (a C8 modified poly(acrylic acid) of Mw8000). Dark bar: tobacco mosaic virus added as an internal standard of diameter 18 nm. Dots:complexes of diameter c.a. 10-15 nm.

0 2 4 6 8 10 12 14 160 2 4 6 8 10 12 14 160.0

0.1

0.2

0.3

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4TOP BOTTOM

pelle

t

pelle

t

BOTTOMTOP

OmpF

b6 fBR

RC

Prot

ein

conc

entra

tion

(a.u

.)

Fraction number

AmphipolsAmphipols & membrane & membrane proteinsproteins: : dispersitydispersity

Rate zonal Ultracentrifugation (in sucrose gradient)

Complexes with 5-25C8-40C3

S T E M (extensively washedcomplexes on a carbon grid)

Complex with 5-25C8

Faible dispersité en taille.

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04

-1

3

7

11

15

-1 4 9 14 19 24elution volume (ml)

mD

O (U

.A à

554

nm

)

-1

1

3

5

7

9

11

13

15

17

mD

O (U

.A. à

280

nm

)

BR/deuteratedpolym.

BR/hydrog.polym.

(buffer PNa 20 mM pH 7.1, 100 mM NaCl)

ref:catalase (Mw 220 kDa)

Rs app(BR/Apol)=5,1 +/- 0,7 nm

BR/DA8-35 - 85% D2O

-3

-2

-1

0

0 0,002 0,004 0,006 0,008

q2

ln I

Guinier plot of SANS at conditions that match or not the polymer contribution

GPC: low polydispersity

BR/DA8-35 - 0% D2O

-3

-2

-1

0

1

0 0,002 0,004 0,006 0,008

q2ln

I

Complex Rg = 3.0 nm

Protein Rg = 2.4 nm

Catalase

AmphipolsAmphipols & membrane & membrane proteinsproteins: size : size andand structure.structure.

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04 Complexes Complexes amphipolsamphipols / protéine membranaire intégrale/ protéine membranaire intégrale

Polymère amphiphile flexible très hydrophobes ⇒ association multipoints

Métastabilité

“Amphipol”

Tribet R. Audebert, J.-L.Popot, PNAS (1996) C.Tribet, R. Audebert, J.-L.Popot, Langmuir (1997).K. Martinez, Y. Gohon, PJ Corringer, C Tribet, F. Merola, JP Changeux, JL Popot FEBS Lett. (2002)

Avantages: stable à la dilution (CMC=0)

mais association renversable

- Développements: NMR, structures Xtal

- Piégeage de super-complexes ou de Rafts

Multiautors review, Cell Mol. Life Sci 60 (2003) 1-16

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04 Remerciements

Les responsables :-S. Cribier (IBPC, Paris)

-C. Ebel (IBS, Grenoble)

-D. Engelman (Yale)

- M. Haider(EMBL, Heidelberg)

-J.L. Popot (IBPC, Paris)

- P.Timmins (ILL, Grenoble)

……

Les courageux:-Y. Gohon

- C. Ladavière

-S. Rahbi, M. Toustou (DEA)

- F. Vial