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\\

UNIVERSITE DE REIMS1I1I "."•• II " ".ff .

UNITE D'ENSEIGNEMENT ET DE RECHERCHES DE PHARMACIE

•••

ETUDE BlOCH IMIQUE

DES GLYCOPROTE INES MEMBRANAIRES

DES CELLULES CANCEREUSES CULTIVEES IN VITRO

ANALYSES ELECTROPHORETIQUES ET

PERSPECTIVES

le 30 NOVEMBRE 1981

JURY :

Professeur J.C. JARDILLIER,

Professeur J. AGNERAY,

Professeur J.P. BOREL,

Professeur A. DESPLACES.

Président

Examinateurs

A MON PERE,

A MA MERE,

Ce travaLL est Le tLen et représente ma modeste

et faLbLe contrLbutLon au souLagement de tes

peLnes. Tu as su me faLre découvrLr et aLmer

Les scLences natureLLes. Toute ton exLstence a

été au servLce des tLens, et j'entends encore

tes mots: IIALLez Le pLus LoLn possLbLe dans vos

études, et surtout soyez justes, honnêtes et

Lntègres, avec vous-mêmes, votre entouraqe et

avec. tou t ce que vous en treprenez Il.

Je t'en remercLe.

Pour ton dévouement de tous Les Lnstants, tes

prLêres, et surtout pour L'amour dont tu nous

entoures, reçoLs LcL toute mon affectLon et,L'assurance, que je seraL tpujours pres de toL.

•

ABIGAELE,

FRANCO ISE,

La route est encore Longue et pavée d'embûches,

mals je sals que nous tlendrons bon, car "L'arbre

de La douceur et de La vle ne peut produLre que

La douceur et La vLe".

Vous êtes !Aol et je suls Vous.

A MES JUGES,

Vous me faLtes L'honneur de juger ce travaLL.

D'avance je récLame votre LnduLqence, et je

vous en remercLe vLve~ent.

A MES BEAUX-PARENTS,

A MA NOUVELLE FAMILLE,

A TOUS LES MIENS,

Toute mon affection.

A TOUS MES AMIS, et en particulier à

- Eliane

- Dominique (Chevassut)

- Dominique (Sivrière)

- Félix

- Nadine

- Phi lippe

- Raymond

En témoignage de mon amitié et de mon affection.

A MARTINE et MICHELE

Avec mes remerciements et en témoignage de monamit i é.

" ., .

A MES BEAUX-PARENTS,

A MA NOUVELLE FAMILLE,

A TOUS LES MIENS,

Toute mon affection.

A TOUS MES AMIS, et en particuLier à

ELiane

- Dominique (Chevassut)

- Dominique (Sivrière)

- FéLix

Nadine

- PhiLippe

- Raymond

En témoignage de mon amitié et de mon affection.

A MARTINE et MICHELE

Avec mes remerciements et en témoignage de monamitié.

A MARYLENE,

Sans quL ce t~avaLL ne se~aLt pas ce Qu'LL est.

Mon affectLon et ma ~econnaLssance La pLus p~ofonde.

A CAR PEN T1ER, Y., DES 0 1ZE, B., J EANNES Sm~, P., KOU AMOU 0 , J.,

TRENTESSAUX,

Pou~ Leu~ coLLabo~atLon scLentLfLque et technLque.

En témoLqnage de mon amLtLé.

A MARIE-CLAIRE,

CHRISTINE,

CHRISTIANE,

DIDIER,

RAYMOND,

Pou~ Leu~ a Ld e.

En témoLqnooe de mon omLtLé.

l

SOMMAIRE

INTRODUCTION ET PRESENTATION GENERALE •••••••••••••••• p. 1

PREMIERE PARTIE : ETUDE THEORIQUE ET GENERALITES.

- GLYCOPROTEINES DE MEMBRANE ET TRANSFORMATIONMALIGNE.

l - Introduction •••••••••••••••••••••••••• P. 5II Place des çlycoprotéines •••••••••••••• p. 10

III - Rôle biologique des ~lycoprotéines•••• p. 19IV - Pertu~ba~on3 1es glycoprotéines •••••• p. 23

membranaires liées à la transformationmaligne.

V - Méthodes d'approche ••••••••••••••••••• P. 39VI - Conclusion •••••••••••••••••••••••••••• p. 42

DEUXIErlfE PARTIE : MATERIELS TECHNIQUES ET HE'IHODOLOGIES.

l - Produits chimiques ••••••••••••••••••••II - Matériels cellulaires •••••••••••••••••

III - Récolte des constituants membranaires.

3.1. - Trypsination •••••••••••••••••••3.2. - Marqua~e des g,lycoprotéines ••••

3.2.1. - narquage métabolique •••••••3.2.2. - Marquage externe •••••••••••

3.3. - Trypsination suivie d'un •••••••marquage ex terne·

3.4. - Dosage des protéines •••••••••••IV - Techniques d'électrophorèse •••••••••••

4.1. - Introduction •••••••••••••••••••4.2. - Electrophorèse en gel ••••••••••

de polyacrilamide-sodiumdodecyl sulfate (ACRY/SDS).

4.3. - Isoel~ctrofocalisation (I.E.F.)4.4. - Electrophorèse bidimensionnelle

V - Méthodes de révélation ••••••••••••••••5.1. - Méthodes chimiques •••••••••••••5.2. - Méthodes utilisant des •••••••••

radioéléments.5.3. - Ouantification •••••••••••••••••

VI - Techniques de conservation ••••••••••••6.1. - En milieu liquide ••••••••••••••6.2. - Sur support solide •••••••••••••

p. 44p. 45p. 46

p. 47p. 51p. 51p. 52p. 58

p. 58p. 63p. 63p. 72

p. 90p. 102p. 107p. 107p. 114

p .. 117p. 119p. 119p. 119

TROISIF.rΠPAR TIE : RESULTATS EXPERlJiIENTAUX.

l - rUses au point sur des sérum de....... p. 124veau foetal.

II - Glycoprotéines de membrane ••••••••••••

2.1. Approche pénérale ••••••••••••••2 • 2 • L1210 •••••• 0 •••• 0 •••••••••••• 0 •

2.3. 1<562 •••••;••••••••••••••••••••••III - Applications pharmacolo~iques•••••••••

3.1. Introduction •••••••••••••••••••3.2. Descriotfon des droRues ••••••••

(rIfTX-RA) .:3.3. Action dJ méthotréxate sur •••••

les ~lycdprotéines membranairesde L1210.

3.4. - Action du RA 233•••••••••••••••IV - Différenciation !et K562 •••••••••••••••

4 0 1. Introduction •••••••••••••••• o ••

4.2. - Inductiori de la synthèse •••••••d'hémoçlobine en présenced 'h' .emlne oj

4.3. - Variation des glycoprotéines•••membranaires au cours del' induc tion par l' hémine.

V - Applications cl{niques ••••••••••••••••i

QUATRIEME PARTIE : DISCUSSION niTERPRETATION.

l - Techniaues-Méthddolo~ies •••••• o •••• o••1.1 0 ·Trypsination.~ •••••• o••• o ••••••1 0 2. - r-1arquagemétabolique 0 •• 0 ••••• 0 •

1 0 3. - Marquage :externe •••••••••••••••II - Ré sul tats ••••• 0 .i • 0 ••• 0 •• 0 ••••••••• 0 • 0 •

2.1. L1210•••••••• o ••••••••• o •••••••

2 • 2. - K56 2 0 •• 0 0: ••••• 0 ••••••••••••••••

2.3 0 - Effecteuns pharmacologiqueso •••2.3.1 0 L1210 - HTX ••••••••••••••••2.3.2. L1210 - RA•• o••••••••••••••2 0 3.3. K562- Différenciation •••• 0

CINQUIEME PARTIE: CONCLUSION G~NERALE.o ••••••• o•••• o.

BIBLIOGRAPHIE ••••••••' •••••••••••••••• o•••••

II

p. 133

p. 133p. 133p. 165p. 179p. 179P. 179

p. 180

p. 184p. 190p. 190p. 191

po 195

p. 199

Po 206p. 206Po 208P. 213P. 215P. 215p. 219p. 223p. 223P. 226P. 227

p 232

P. 235

INTRODUCTION ET PRESENTATION GENERALE

La membrane plasmique des cellules tumorales est de­

venue un des champs d'investigation les plus fertiles où se

rencontrent de nombreuses et diverses disciplines de la

Biologie. L'intérêt que suscite cette membrane cellulaire

ne cesse de grandir pour plusieurs raisons

Une des principales raisons est due "au comportement

soc i al" des ce Il u les: en e f f et, plu sie urs au te urs (82, 8~ 201) .

pensent que les interactions normales des cellules entre­

elles sont directement liées à leur surface membranaire.

En outre, le déséquilibre constant de l'hom~ostasie tissu­

laire dans les cancers, provient certainement, d'une "dévia­

t ion" des f 0 n c t ion s me mb ra nair es.

- De nombreux travaux commencent maintenant à proposer

la membrane, aussi bien en tant que premier site d'action

des drogues en chimiothérapie, que cible en immunothérapie.

On peut donc espérer que l'élucidation des anomalies de la

membrane des cellules tumorales apportera de nouvelles stra­

tégies thérapeutiques dans cette lutte contre le cancer.

C'est donc dans ce canevas de recherche que se situe

le travail qui va être présenté.

Nous pensons comme beaucoup d'autres, qu'une approche

moléculaire des phénomènes de transformation néoplasique

passe nécessairement par l'acquisition d'une bonne technique

de base pour la séparation et l'identification des consti­

tuants membranaires.

2

C'est dahs cet esp~it que nous avons essayé dans ce

travail, de mettre au point et d'exploiter des techniques

de séparatirlw èt de·réVélation des protéines·et glycopro­

téines membranaires des cellules L 1210 et K 562 cultivées

"in vitro".

Nous avons choisi l'électrophorèse en gel de polya­

crylamide avec toutes ses variantes (Isoélectrofocalisa­

tion, électrophorèse en gel d'acrylamide, électrophorÀse

bidimensionnelle) .

La prépondérance de cette technique aussi bien ana­

lytique que préparative, dans la littérature (17,31,42,

44,141,142 ), est directement liée à son excellent

pouvoir de résolution.

-Nous avons donc utilisé cette technique pour frac­

tionner les constituants membranaires (glycoprotéines)

des cellules L 1210 et K 562, et pour étudier l'action

d'effecteurs exogènes (drogues anticancéreuses) sur ces

mêmes constituants membranaires.

Le travail se présente comme suit

- Oans la première partie consacrée aux généralités,

nous rappelons l'importance des glycoconjugués dans l'or­

ganisation de la membrane cellulaire, et les rôles multi­

ples joués par ces constituants membranaires. Nous décri­

vons ensuite les désordres caractéristiques de la trans­

formation maligne, et les différentes techniques d'appro­

che mises en oeuvre pour mieux comprendre ces mécanismes

complexes.

- La sesonde partie, qui représente l'ossature même

de ce travail est la plus longue.

3

En effet, nous avons porté toute notre attention sur

les aspects et les détails pratiques des techniques d'élec­

trophorèse et de révélation.

Oans cette partie, nous regroupons toutes les métho­

des que nous utilisons. Les techniques que nous avons mises

au point ou que nous avons modifiées sont décrites en dé­

tail avec les considérations qui nous ont guidés dans ce

travail. Pour les autres techniques, nous donnons les élé­

ments pratiques nécessaires ainsi que les références de

base. Cette partie pourra paraître au lecteur fastidieuse,

sinon ennuyeuse par ses détails; nous nous en excusons d'a­

vance car face è la "paillasse", du ~oins en ce qui concer­

ne l'électrorhorèse, la qualité des résultats dépend étroi­

tement du "petit détail technique".

- Oans la p3rtie expérimentale, nous exposons nos

résultats comme suit

1- La mise au ooint technique sur du sérum de veau

foetal.

2- ~'étuue des ~lycoprotéines membranaires des

cellules L 1210 et K 562.

3- Les applications pharmacologiques, c'est-è-diru

l'étude de l'effet des drogues sur ces glycopro­

téines.

4- L_3S problèr1es de la différenciatioll et de la

1<' 562.

5- L'application clinique de ces techniques fonda­

~enta18s è l'étude de myélomes.

Chaque fois oue cela sera nécessaire, nous indiquerofls

le chapitre de lA partie technique 00 le lecteur pourra trou­

ver les indications de technologie qui nous ont permis d'é­

tablir nos résultats.

4

- Dans la quatrième partie, nous exposons les inter­

prétations et les discussions qu'entrainent nos résultats.

- Dans la cinquième partie qui est la conclusion

générale, nous proposons une suite du travail.

PRE MIE R E PAR T l E

5

ETUDE THEORIQUE

et

GENERALITES.

1 Il r' ' 1. '

6

GLYCOPROTEINES DE MEMBRANE ET TRANSFORMATION MALIGNE

l - INTRODUCTION

La membrane qui entoure une cellule vivante est plus

qu'une simple enveloppe ou qu'une barrière. En effet, non

seulement elle définit les limites de la cellule mais elle

contribue également à maintenir une différence entre le mi­

lieu intérieur de la cellule et l'extérieur (10).

De plus, la cellule, élément de base des organismes pluri­

cellulaires, ne vit pas isolément.

Les cellules sont en effet capables de s'associer en

tissus, de se reconnaitre entre elles, de se défendre con­

tre des agresseurs tels que les virus. Ce sont là des mani­

festations d'une "vie sociale" qui implique une participa­

tion de la surface cellulaire, car c'est par leur surface

que les cellules vont être en relation avec le milieu ex­

térieur.

La sur+~ce cellulaire va donc jouer un rôle primordial

dans les interactions entre cellules et dans les réponses

de ces cellules à des agents extérieurs tels que certaines

drogues, des hormones. des antigènes, des toxines ou des

agents infectieux.

Ces interactions entre cellules sont primordiales dans l~s

phénomènes de régulation de la croissance cellulaire

Les cellules cancéreuses se caractérisent par ce qu'on

appelle la perte de l'inhibition de contact, se multiplient

de façon anarchique et sont capables d'envahir d'autres

tissus par métastase 1,~! 3 7 ).

7

Dans un excellent schéma, ROBBINS ET NICOLSON (15l)

( Fig . ont rassemblé toutes les perturbations "possibles"

au niveau de la membrane cellulaire. On peut résumer les

principales d'entre elles de la façon suivante:

-diminution de, l'adhésivité cellulaire,

-abolition du contrôle de la multiplication cellulair

-perturbation de la perméabilité membranaire,

-apparition de nouveaux antigènes membranaires,(ou perte d'antigènes),

-altérations biochimiques au niveau des glycocon­jugués membranaires.

La nature chimique des sites de reconnaissance exis-

tants à la surface cellulaire et responsables de la commu-

nication intercellulaire est maintenant connue: les sucres

présents à la surface des cellules vont jouer un rôle im­

portant dans leur vie sociale.

Deux types de molécules présentes à la surface cellulaire

et renfermant des sucres serviront de signaux de reconnais­

sance: il s'agit de lipides ou de protéines de la membrane,

substitués par un certain nombre de résidus de sucres.

On les désigne sous les noms de glycolipides et de glyco-

protéines ou plus généralement sous le terme de glycocon­

jugués. Ces molécules sont en contact avec le milieu extra­

cellulaire et sont ainsi accessibles aux molécules exogènes.

Les sucres constituant la partie glucidique de ces

glycoconjugués sont au nombre de 6ou7 il s'agit du glu-

cose, du galactose, du mannose, du fucose, de la N-acétyl­

glucosamine, de la N-acétyl-galactosamine et de l'acide

sialique Il apparait donc que le nombre des com-

binaisons possibles de ces différents sucre est considéra­

ble et peut constituer un des facteurs conférant à la sur­

face d'une cellule sa spécificité (3J)

fluidité membranairemod ifi ée

perrnéabili té

transport

de surfacemodifiées

nouveaux antigènes

d'antigènes

perte ou modificationdes glycolipides

perte ou modificationdes glycoprotéines.

phagocytose ou endocytosemodifiées

adhésitivité et inhibition necontact de mouvement modifiées

8

FIG. 1 - PRINCIPALES MODIFICATIONS AFFECTANT LA CELLULEAPRES TRANSFORMATION MALIGNE SELON ROBBINS ETNICOLSON (15-::),

Des altérations au niveau de ces glycoconjugués se

traduiraient par une incapacité de la cellule cancéreuse

à répondre aux facteurs de régulation externe (1 1Q).

Avant d'aborder le problème de ces altérations, et

principalement celles qui concernent les glycoprotéines,

il est nécessaire d'introduire les théories et les modè­

les qui cherchent à expliquer l'organisation et le com­

portement dynamique de la membrane.

9

i n

II PLACE DES GLYCOPROTEINES DANS L'ORGANISATION DE LA

~EMBRANE CELLULAIRE:

~'.1. - Org~I_sation de la membrane

L e 5 me mb r a Il I=; spI a 5 mi que 5 d,! dive r 5 e s cellules a n j : ! a --

les 0 n t p U ê t r e j:3 0 l é e s dan.s u n [; t a t d e pur- e té:: a t i s f aL, El ri 1: •

Elle5 renfarment 50 è 70% de pro~éine5, 30 ~ 50% de lipides,

et ',eulement 2 à 10% cie 5uc;es, constitLan~-5 des glycoccnju-

gU'3S.

fJ n 5 CI i t q 1J 8 l a rT e mbr a :1 13 des LI l' fa cee '" t d~" 1/ m é t [' i q u c

et:] u <3 sa f ace e x I~ e r n e est cil i mi (' u l,: IT, 8 Il t et f' [; ri [ t i 'J il Il El 11 -

mie :-1 t IJ if f é r en t e Cl! sa fa C e :i I-l ter r - 8 (1 -, -) : .

: ,J li j cl' éJ b C! rd c,: q 1 j 13 SIN Gr R 2 t :1iI CJ LS ~l ~ êJ PP éc; l ] '0, rd. l e :=. p r C! -

t é :L l' 8 S CJ LI 1 2 S g l YI: CJ .:J ,- [J -~ el il e ,; i n t (, g r 3 les. q ij i S IJ rie des rn [ l E!

qu:' :j 8 -: [- Lis 8 n t l .".c,. in t ,0, r a (' t j 0 Il:3 h 'j ci [' iJ r: Il I_j J ,-" se,: i :' .- cl ri t

cJ éJ ri sIe C éJ :,. c'': c ,0, 5 P ~ (1 t (; i l, e '.] i, Li g l l' C :J -

Gly,:::cl:;Jide

\\

"-

'"p:iOëÉ~r,e

......

\\•

Rés .dus glycanniqU85

1 1

1Intéracticn avec

.. ~ p ~ '" ... ... '-.... '"' .l ~ ~ e lem e n t 5 e x l. ,.c; r:

du "glycocalyx "

2

lipidioue

111k_.Systèrne

r Contractile1i

F J'. '" 2 .. ~.'J '-,' L<, ,r.· " ,'l, I~.I 'f·.·.'. c·.,,, LI L" '1' L' ,0 E ,', ~ " ,,, .. r';" -' .. [- c r, ~1 """ l ", . • :, L, " ..:J "" '1 i:! r: (, !V ~,~ LJ i::. S

C [ L 'e 1.:: Sil, i ; =:'1 ALE::: S '= 1 0 i'~ r~ l 1: 0 l '.: fJ ~j ( 1 7 ii ) .

12

ROTHr1A~J el: LE~JARD (15 0 ) proposent d'ailleurs une dis­

tinction entre !Jeux types dr~ protéines intégrales: (Fig. <)

Les ectoprotéines, glycoprotéines fortément hydro­

philes, localisées sur la face externe de la cellule. A

cette classe appartiendraient la glycophorine, glycoproté-

i n e ma jeu r e d u g lob u 1er 0 LI g e e t les a Il t i (2: è n e s d 1 il i s toc 0 mp éJ -

tibilité.

Les end~protéines, prottines in~égrales associées

à la face cytop'"JSmiquE de lêl IflE,mbrane.

D'autre~; protéin,:ls Oll gJ'jcoprotéines men:!Jrana1res

in ter Ci gis s 8 n taI/ e c laI' É g ion P [J l él ire dt! 5 mo l écu les l i pi di -

que s E! t pou r r en:: ê t r e dis soc j. é l~ E; ci e l a m''3 mb r ,3 n e par r.: lj G -

mentation de la Force ionique! ou du pH du milieu: il s'a-

git ,jes cCJnstit,Jants extrin!~èquE?5 ou püriphÉ-riques de Ir]

membrane, en particulier des protéines du système contrac

tile de la cellljle

Il," s t do Il C i mp [1 r t 'J n!: cl e il0 ter C; LI El t QI.: s l 8 seo n s t i -

t LI an t~, Glu c ici i q IJ c; s des sI Y CCl COll ~i LI gué s mc~ III br ê na ire s " [1 il t

s i tué s sur l a f ,1 C 8 '0 >: tel' ne, CJ n f ë! i S <3 Il t c,· 0 j EC t i Ci n c! e ri', l 8

miliell extra-ceilulaire.

r e ô c tue Ile e~, t. l agI YC Ci P r CJ:~ (; il: F: rn a j fc, U [' e deI a ri. Q rli b r a l, e [1 u

g lob U :'. e r Cl LI g e , ': g a ] e mE? fi t a l' [J C!] ':. é! [~l Yc Cl P il IJ r j 1 e (F i g. cf) •

e Ile j" e il f (~ r m'" <1 3 Î r 0;; s i (j u s .j'a C j cl e s a ln i ri [',) ete s l -::: r Èi sri chu

en s LI cre s (6 G~; !.' ,., V j r 0 ri). L d G 1 :; c; Cl :J h c' l'i ri 8. C CJ minE V r 6 i se cr. b 1 a -

blem811t Ip.s éJut:'ss glyccjJf'iJt:éiIH:s in~n"b[''''nailesJ est UllB mo-

cul e c: ste 0 n Co t. i': LJ é e cl 1 él c.: i (] 1'- E; a rri '., é s, P CJ lE' r 8 set e s 1: rie h co.

en r85:Ldus de Sll;.~r8::,.

=CT:JP~OTEI~!ES

FACE CYTOPLASMIQUE

( b )

ri;.:3 - ~ =S P J S :::: - ::: ~,~, oc" I\~ S ~ il, r", Er'Î =P.,~ :~ E J:: S :: CT 0 PRO ï El :~ ES

1 4

Double

couc~e

liPidiQ7

CDDH

Phase cytoplasmique

Chaine protéique

Glvcannes

Fig. 4 - SCHEMA fVJDNTRANT L' INTEGR,l\TIDN DE LA

GLYCOPHORINE DANS LA MEMBRANE DU

GLOBULE ROUGE SELON MARCHESI ET COL. (1~7).

1 5

Cette région hydrophile est externe. Puis, l'on

l' e n cori t re une s RCI u e n c e d e 2 3 a cid e sam i nés à car a c t ère

hydropllobe qui pcrmut à la glycophor:ine :de s'ancrer dan~;

la double couche lipidique hydrophobe de la membrane.

Enfin, la réGion carboxylique terminale est également ri­

che en acides aminés polaires et émerge de la face cyto­

plasmique de la membrane.

La région NH2-t~rminale externe pqssède deux types

de chaînes glycanniqu8s

Les unes constituées d'acide sialique, de galacto­

se et de N-acétyl-galactosamine, sont liées à la partie

protéique par l'intermédiaire d'une liaison o-glycosidique

entre un résidu de N-acétyl-galactosami~e et un résidu de

sérine ou de thréonine.

Les Butres, constituées d'acide sialique, de fucose,

de mannose, de galactose, et de N-acétyl-glucosamine sont

liées ~ la partie protéique par l'intermédiaire de liaisons

N-glycosidiqu8s entre un résidu de N-acétyl-glucosamine et

u n rés j. d u (j 1 a spa l' agi. ne.

l l Y Cl IJ ra i t qui n z e cha î n e s rJ u t YP e D- glu cos id i que

pour une chaine de type N-glucosidique par molécule ue

8; l Yc 0 p h 0 l' i n e ( 'j :'. 1? ':J, 1 2 7 J •

Bien que très variables dans leur composition, les

chaînes glycannes des glycoprotéines se classent assez

facilement par un certain nombre de structures typiques

Dans les glycoprotéines à liaison N-osidyle, on trOll"

ve constamm(~nt. la structure générale schématisée (r::ig. 5 J.

Dans ]a partie centrale de ]a molécule à partir de la liai­

son N-osidy]e. on tr·ouve deux résidus de fi N-acétyJ -gJUCU"

samine, et trois résidus de mannose pour former un penta­

saccharide ramifié.

1 6

Dans certains cas, sur les mannoses de ce pentasaccharide

de base, viennent se greffer un nombre variable de chaînes

composées de galactosylfi 1-4-1'J-acétylglycosaminyl.

Enfin, un certain nombre de résidus sialyls ou fucosyls

représentent l'extrêmité non réductrice de ces chaînes gly­

cannes. Ces structures sont dites de type "N-acétyllactosa-

minyl".

Dans d'autres cas, le pentasaccharide central est

substitué par un' nombre variable de chaînes mannosidyles

plus ou moins longues. Ces substances sont dites de type

"oligomannosyl" (135,121)' (Fig. 6.) ..

Dans ces deux types de structure, les différences entre gly­

coprotéines portent surtout sur le nombre, sur la position et

sur la longueur des substituants sur le pentasaccharide de

base. Les mêmes types se rencontrent dans les glycoprotéines

sériques.

Parmi les structures à liaisons O-osidyles. les glyco­

protéines de groupe sanguin présentent également une struc­

ture typique (Fig. 7 ). Chaque groupe sanguin peut se carac­

tériser par un résidu glycannique: par exemple, le groupe A

correspond à une chaine glycannique avec un N-acétylgalacto­

samine~-1-3 supplémentaire sur le galactose terminal. Dans

l e g r 0 u p e B, 0 n t r 0 U v e à l a mê ITJ e pla c e u n gal a c t 0 s e (1 R 1 , ? '1 (1 ) •

La différence héréditaire entre les individus des groupes A

et B correspond à la présence chez les premiers d'une N-acétyl­

galactosaminyl-transférase et chez les seconds d'une galacto­

syl-transférase.

La séquence de très nombreux oligasaccharides de l'u­

rine normale ou de sujets déficients en diverses glycosidases

a été établie (~75,17~. Ces oligosaccharides correspondent au

produit de dégradation partielle des glycoprotéines, et pra­

tiquement toutes les structures correspondent à des fragments

provenant des modèles généraux décrits plus haut.

'_0t}:.

· 1 7

Fig. 5 - STRUCTURE DE TYPE N-ACETYl-lACTOSAMINE

SELON MONTREUIL (135).

Fig. 6 - STRUCTURE DE TYPE OlIGOMANNOSIOE.

NANA

FUC

Gal

GleNAC

Man

Asn

Acide Sialique

Fucose

Galactose

N-acétyl glucosamine

Mannose

Asparagine

CHAINE DE GROUPE CHAINE DE GROUPE

TYP E l SANGUIN TYPE II SANGUIN

Gal (?;(;!-.-.~) .,..GLcNAC-R Gal (3(;!--+4) ..GLcNAC-R

Fuc F uc(I\(~~l)t ( ) ~(A-'~\ @>CA.--> 4)(3 .l~~

.. GLcNAC-R 0 al lPGLcNAC-R 0al

Fuc Fuc

o("'>t d-- (A-+~)

GalNAC o((A~~) al (3(.~~~)...GLcNAC-R A GalNAC o({h~~al (3(A."+u)

~GLcNAC-R AJJ>-'

Fuc Fuc

ol("'\ ol(A-+l)~

Gal "'(..(~3\~, al (3(.A_3) ~LcNAC-R (3(-t _4)B Ga l d(A~;) Ga l ..GLcNAC-R B...

Fig. 7 - DETERMINANTS GLUCIDIQUES DES ANTIGENES DE GROUPE SANGUIN A B 0 SELON HUGGES (82 J.

-"CD

1 9

III - ROLE BIOLOGIQUE DES GLYCOCONJUGUES DE LA MEMBRANE

CELLULAIRE :

La présence à la périphérie d'une molécule de structu­

res spécifiques, dont les positions relatives sont con­

ditionnées par le type de structure glycannique, peut être

à l'origine d'activité biologique tout comme la position

relative de quelques résidus aminoacyls dans une structure

tertiaire de protéines réalise le centre actif d'une enzy­

me et crée l'activité enzymatique ( 4 ).

End' a u t r est e r mes, les 0 ses peu v e ri t se r vi r deI e t ­

tres dans un vocabulaire biologique où les mots se forment

en faisant varier la nature des oses présents, la position

et la configuration 0<. ou ft des liaisons glucosidiques

la présence ou l'absence de chaines latérales (1S7).

3.1 Antigénicité des g:ycoconjuguéy de la surface

cellulaire:

La présence sur la surface externe d'une hématie de

glycoconjugués de groupe sanguin offre au système immuni­

taire un moyen de reconnaitre le "non soi" (,~ ).

A_ la surface des globult"s rouges se trouvent des gly­

coconjugués, déterminants des groupes sanguins A, B, 0 (2-='C,

Il s'agit essentIellement de glycolipides portant des sé­

qUE! nces g l Yc a n n i que s car a c -c é ris t i que s d' u n g r 0 u p e don né.

Cep end a nt, l 8 S g l Yc 0 pro t é i Il es deI a m8 mb j'a n e deI' hé mat i e

semblent comport'3r également des déterminants antigéniques

du système A, B, 0 ( 181).

La glycophorine, et plus particulièrement les chaines gly­

canniques de type O-glycosidique, serait responsable de

l'expressiGn de l'antigènicité. MN.

Les antigènes d'~istocompatibilité constItuant le système

HLA chez l'homme sont des glycoprot~lne~ membranaires (17R

conférant aux tissus de chaquH indi\ljdLJ .Oa propre spécifi­

cité.

20

3.2.- Rôle de récepteurs

Des glycoprotéines telles que la glycophorine, qui

traversent toute la membrane, semblent être impliquées

dans le transfert d'une information reçue à la surface cel­

lulaire vers le cytoplasme.

Ainsi, des récepteurs de l'insuline ont été isolés

à partir de membranes plasmiques d'hépatocytes ou de cel­

lules adipeuses (90 ). Il s'agit de glycoprotéines intégra­

les, selon la nomenclature de SINGER et NICDLSON, qui ne

peuvent être extraites qu'après solubilisation de la mem­

brane par des détergents. Lorsqu'on détruit la partie gly­

cannique de ces molécules par digestion enzymatique, leur

capacité à fixer l'insuline est abolie.

De même, Id neuraminidase abolit la production de

sté r D ï des par les cel Iules a d r é n 0 c.o.r-l.i cal 8 s s t i mu l é 13 par..... ; ,-' " ' .. ':·r~"'''''",

l' hormone adrénocorticotropiqu·.~'>~ÀC·TH:-':/f"~6). Cela démon-.... ~---. .. "t rel a n a t ure g]. y C 0 pro t 8 i n i q t,j ~/~ 13 c 13 ie,c ê:~: t e u l'ho r mon al.

, f ,-.., " \ >'

! : '.' f\ f.'l r- . \ : ;

Parmi ces glYCOprotéin~~\~~p1:j~l~k;~il faut encore<. \. ,Yi!

c i ter 1er é cep t eu l'me mb l'an air e/ d,zA S H.W-E '-0l;:""/( 1 2 J: ils 1 agi t",:"r 1" • S').'5<';-;-·

d'une glycoprotéine présente dà"r-i~~~~g~mémbrane plasmique

des hépatocytes, capable de fixer des glycoprotéines d'o­

rigine sérique, telles que l'orosomucoïde ou la céruléo­

plasmine, partiellement dégradées. Ces glycoprotéines sont

ensuite endocytées par la cellule hépatique et complètement

catabolisées au niveau des lysosomes. En effet, la céruléo­

plasmine marquée au 64 CU , désialidée et injectée en intra­

veineux au Rat est très rapidement éliminée de la circula­

tion sanguine par le foie et on retrouve le 64 CU au niveau

de~3 lysosomes (69 ).

Cette clairance rapide d'une glycoprotéine sérique

désialidée a été confirmée pour l'orosomucoide, la fétuine,

l'haptoglobine, la macroglobulineoC.2' la gonadotrophine

chorionique et la F.S.H. mais non pour la transferrine. De

plus, il s'agit d'un phénomène actif saturable: une forte

concentration en glycoprotéines désialidées peut inhiber

la clairance d'une autre glycoprotéine désialidée ( 137

Les glycannes privées de l'acide sialique présen­

tent un galactose terminal, et c'est ce résidu saccharidi­

que qui est reconnu par un récepteur membranaire.

Cette "Hépatic-Binding-Protein" (HBP) a été isolée à partir

des membranes plasmiques d'hépatocytes de Lapin. C'est une

glycoprotéine de type N-acétyllactosamine (13. BD. 100).

Par le même processus, ce récepteur membranaire serait

également capable de reconnaître les globules rouges et les

lymphocytes circulants §gés, permettant ainsi, leur élimi­

nation.

En fait, ce récepteur reconnait des résidus de galac­

tose démasqués sur ces glycoprotéines ou des cellules ~gées.

Mais, curieusement, si on soumet ce récepteur à l'ac­

tion d'une neuraminidasB, cette glycoprotéine réceptrice

n'est plus capable de reconnaître les glycoprotéines sé­

riques désialidées (13,80 l, d'où l'importance de l'a-

cide sialique souvent terminal sur les chaînes glycanniques.

Un système du même type permet l'excrétion puis la réabsorp­

tion intracellulaire des enzymes lysosomales de nature gly­

coprotéique.

22

3.3.- Rôle dans les phénomènes d'adhésion intercellu­

laire

De nombreux auteurs ont pu isoler à partir de milieux

de culture de divers types cellulaires, des macromolécules

de nature glycoprotéinique ayant pour origine la surface

cellulaire. Ces glycoprotéines purifiées sont capables d'in­

duire la réassociation de cellules préalablement dispersées

( 70) ,

Ainsi, Mc CLAY et MOSONA (131) ont réussi à isoler

à partir de cellules de la rétine une glycoprotéine de

masse moléculaire de 50.000 daltons qui semble intervenir

dans ces phénomènes d'adhésion intercellulaire. Ces gly­

coprotéines auraient les mêmes propriétés que certaines

protéines ou glycoprotéines d'origine diverses appelées

lectines, capables de reconnaitre spécifiquement certains

sucres présents à la surface cellulaire et capables de

provoquer l'agglutination des diverses cellules (1j6).

On voit donc le rôle important joué par ces glyco­

protéines de surface dans le contrôle de la "sociabilité"

des cellules.

23

IV - PERTURBATIONS DES GLYCOPROTEINES MEMBRANAIRES LIEES

A LA TRANSfORMATION MALIGNE

Les glycoprotéines localisées à la surface de la cel­

lule animale jouent un rôle important dans les activités

biologiques de cette surface, comme par exemple le transfert

actif à travers la membrane (154 l, l'inhibition de contact

de mouvement décrit par ABERCROMBIE et HEAYSMAN 2 l, le

rejet des greffes et la suppression des facteurs antigéni­

ques (93 l.

- En outre, le fait que la surface de la cellule soit

riche en hydrates de carbone, et que la plupart des glyco­

protéines soient localisées dans des sites tels qu'elles

sont directement en contact avec le milieu extracellulaire,

a incité de nombreux travaux à s'orienter vers les modifi­

cations que subissent ces glycoprotéines, au cours de la

transformation maligne, et par conséquent les différentes

altérations des activités biologiques liées à la présence

de ces mêmes glycoprotéines.

On sait que la contamination par un virus ou la trans­

formation tumorale entrainent des modifications de la com-

position des glycoprotéines de membrane 21); or, au même

moment, les cellules perdent un certains nombres de proprié­

tés (comme par exemple: l'inhibition de contact ... )

De nombreux rapports ont été faits sur l'augmentation

ou la diminution (et parfois disparitionl de polypeptides

spécifiques, associées à la transformation des fibroblastes

(86, 140, 191, 153).

24

4.1 - Protéoglycannes et glycoprotéines de la matrice

extracellulaire

Les protéoglycannes (acides hyaluroniques, chondroi­

tines sulfates, héparan sulfate) font partie du glycocalyx

ou " cell coat", sorte de matrice extra-cellulaire pauvre en

lipides mais très riches en sucres.De nombreux auteurs ont décrit

les variations du taux de certains protéoglycannes associés

à la transformation. Ainsi, de nombreuses cellules transfor­

mées par des virus, synthétisent plus d'acide hyaluronique

que les cellules normales mais semblent synthétiser moins

d e pro t é 0 g l yc a n n e s sul fat e 3 ( 1 6 2 ). Cep end a n t une g é né raI i ­

sation reste délicate, car les résultats expérimentaux sont

souvent très hétérogènes et trop peu de systèmes cellulaires

ont été étudiés.

-Il semble également que la biosynthèse du collagène,

autre constituant de cette matrice extra-cellulaire, soit

diminuée après transformation 45 ) .

- Eni 9 73, d i Il ers g rOll p e s der e che r che déc r i v ai e n t

simultanément ~ la surface de fibroblastes en culture une

glycoprotéine de haut poids moléculaire (210 - 270.000 dal­

ton s s 8 l 0 Il lep roc é d é d e d é t e c t ion u t il:; s é), t r è s sen s i b l e

aux protéases et disparaissant après transformation.

Il s'agit de l'antigène de surface du fibroblaste

( S FA) (1 ~<) ), de J a gal a ct 0 pro t é i ri e a de HA K0 MOR l

de la LETS protéine (large external transformation sen-

sitive proteinl de HYNES ~7 l, de la protéine de sur-

face ceLlulaire (CSF') de YAMADA ( 21.4), ou du facteur Z

deR 0 BBl NS ( 1:=i 51 .

Inutes ces glycoprotéines possédaient des caractéris­

t i que sel) rn mu Il es, c' i n s i rj' ail leu r s q upd' a u t r e s g l Yc 0 pro t é i ­

nes plasmatiqu3s, d'oG la suggestion faite en 1976 par le

g r 0 u p e f :i Il l a 1-1 d ais cl e F< U0 S '- AHTIde l 3 S r éi s sem b 1er sou sIe

nom de fibroller:tir es -d:J latin nfibra' (fibre) et "nectere"(lier)

25

Ce sont donc des protéines capables de se lier. de

s'associer à des protéines fibreuses. Au niveau des mem­

branes cellulaires. cette fibronectine est un autre élé-

ment du glycocalyx.

La structure (fig. et les propriétés de ces

fibronectines ont fait l'objet de deux revues récentes

101, ?1?-

Cette glycoprotéine qui existe chez la cellule nor­

male. est largement diminuée ou disparait chez la cellule

transformée ;~C, 140, l(H, 154, 85

C'est une glycoprotéine de haut poids moléculaire, (210 ­

270.000 daltons), trouvée dans le sang et les tissus des

vertébrés, et dans les cultures cellulaires adhérentes

-L.'utilisation d'anticorps antifibronectine fluores­

cents a permis de montrer que cette fibronectine constituait

à la surface des fibroblastes en culture un réseau complexe

de fibrilles et d'agrégats particulièrement abondants aux

points de contact entre deux cellules ou entre la surface?1'l

cellulaire et le substrat .. '-) l d'oL l'hypothèse d'un

rôle important joué par ces glycoprotéines dans les phéno­

mènes d'adhésion intercellulaire ou d'adhésion au substrat

dans le cas de cellules en culture.

Le point de départ de l'intérêt porté à ces protéines 8St

l'observation d'une diminution de la quantité de fibronectine

associée à la surface cellulaire des cellules transformées

par un virus oncogène ou par un cancérigène chimique.

Cependant, il faut noter qu'il existe de nombreuses excep­

tions à cette règle. et YAI'1ADA et DL DEN ( 212) ont noté que

sur 89 espèces de cellules transformées. 12 ne présentaient

pas cette diminution du taux de fibronectine.

26

~A[a"'[GfOYr ln

lys

A

_ COOli1

51

S.~ COOH

B

/-1

\ f""ll( ,

1 1......c>"

F j g. G, -- seri 1': r'! A U t ..è, T .~ LI C ~. 1 J R [ 0 E L 1\ F~: f\ R0 NEC T [ 1\1 E

A - SE LI Ir·' 'v A'-1 [R l ( J. :'1 ) .

El - ': ELli [\1 (A '1/\ 0 fi (? 12 ) •

27

De même, le pouvoir oncogène d'une lignée cellulaire

ne semble pas lié de façon absolue à son taux de fibronectine

membranaire, c'est-à-dire qu'une cellule possédant peu de

fibronectine n'est pas forcément oncogène. Par contre, à cet­

te diminution du taux de fibronectine, serait plutôt associée

la tendance qu'ont les cellules transformées à métastaser

( 30 ). Cette observation semble compatible avec un rôle im­

portant de ces fibronectines dans les phénomènes d'adhésion

ce Il u lai r e ( 120, 1 0 1, ? 12, ':;~), :? (,

-Cette fibronectine présente d'ailleurs une grande af­

finité pour le collagène natif, l' héparine et les surfaces

cel luI air e s ( ;'1 n , 1 Cl:1J, e t l' i ncap a c i t é des cel luI est ra n s for ­

mées à synthétiser ou à lier la fibronectine est parallèle

(du moins dans cQrtains systèmes) à l'incapacité de ces mê­

mes cellules à synthétiser ou à lier le collagène et les

protéoglycannes ( 1()1 )

-Cette glycoprotéine adhésive, de haut poids moléculaire

jouerait un rôle important dans l'adhésion cellulaire, les

fonctions du système réticulo-endothélial et la différencia­

tion embryonnaire ( ?l? ).

En effet, l'addition de LETS protéine purifiée dans un mi­

lieu contenant des cellules transformées, entraine l'adhé­

sion des cellules entre-elles et le regain de fibres d'ac-

tine ?~). Elle s'attache aux cellules en un réseau fibril-

laire et ce lien est plus important avec les cellules norma-

les qu'avec les cellules transformées 00).

En conclusion, cette fibronectine semble être une gly­

coprotéine jouant un rôle important dans les interactions

cellule-cellule ou les interactions cellule-substrat dans

le cas des cellules en culture. Sa disparition de la surfa­

ce des cellules transformées serait due à une diminution au

28

niveau de la biosynthèse de mRNA spécifique de cette protéine

:2 ), ou à une dégradation par les protéases, en particulier

par la plasmine présente à la surface des cellules transfor­

mées ou encore à une diminution du nombre de récepteurs mem­

branaires pour cette glycoprotéine, ces récepteurs pouvant

être du collagène ou ses précurseurs associés à la membrane

de surface; cette disparition peut également être la consé­

quence d'une glycosylation imcomplète de la protéine lors de

la biosynthèse. On sait en effet que cette forme de fibronec­

tine incomplète est très sensible à l'action des protéases

( 145 ) .

Si l'absence de cette fibronectine, ne semble pas re­

présenter un marqueur absolu de transformation maligne, il

faut cependant remarquer que dans tous les nombreux articles

qui traitent de la LETS glycoprotéine, les auteurs sont una­

nimes sur le fait que sa disparition ou sa diminution est

un phénomène lié à la transformation.

4.2.- Modifications affectant les glycopeptides mem­

branaires

Les travaux de WARREN et al. en 1978 ont bien démontré

que les glycopeptides du type N-glycosidique, obtenus après

"protéolyse", ont toujours une masse moléculaire moyenne,

légèrement supérieure à celles des cellules normales (MM 4500

pour les cellules cancéreuses: 3700 pour les cellules normales)

lorsqu'on les analyse en chromatographie de tamisage molécu­

laire ( :::?Ol ). Cette différence disparait lorsque les glyco­

peptides des cellules transformées sont préalablement soumis

à l'action d'une neuraminidase ou d'une hydrolyse acide ména­

gée. Donc, l'hypersialylation des glycoprotéines membranaires

semble être un facteur constant dans la cellule transformée

(in vivo et in vitro) quel que soit le type cellulaire étudié

et l'agent transformant.

29

Il faut é8alement signaler que les glycopeptides prépa­

rés à partir de noyaux, des mitochondries,des lysosomes et du ré­

ticulum endoplasmique des cellules transformées, présentent

tous cette hypersialylation ?3). Une autre étude récente

lqO) des comportements chromatographiques des glycopeptides

isolés à partir de 24 glycoprotéines membranaires différentes

de cellules normales et transformées montre que dans vingt

glycoprotéines isolées de cellules transformées, on retrouve

ces glycopeptides de plus grande masse moléculaire.

On les retrouve également chez des cellules non trans-

formées en mitose (196 );cependant VAN BEEK [194 a mon-

tré qu'ils étaient absents de la surface des lymphocytes nor­

maux, de lymphoblastes prelevés à des malades atteints de mo­

nonucléose infectieuse et surtout de lymphocytes normaux sti­

mulés par les phytoagglutinines (ou lectines), alors qu'ils

son t pré sen t s ~" (l :;) à las Ij r f ace deI e u c 0 c Ytes hum a i n s pré-

leucémiques ou prélevés à un stade précoce de la maladie.

Il semble surtout très important de noter qu'il existe une

relation très étroite entre la présence de ce type de glyco­

peptides à la surface d'une cellule et son pouvoir oncogène

1q r" G3) et selon VAN BEE K :- :"i !:,) , leu r r e che r che, à la

surface des lymphocytes humains aurait ainsi valeur de diag­

nostic.

Les résultats semblent également prouver que cette

altération des structures glycanniques des glycoprotéines

de la membrane représente bien une modification fondamen­

tale primaire associée à la transformation maligne. Oans

d'autres expériences, l'utilisation de ces glycopeptides

dés i a l y lés a p e r mis à WARR E ~J (:c u:~ ) d e met t r e e n é v ide n c e

chez les cellules transformées une sialyltransférase capa­

ble de transférer activement de l'acide sialique à partir

du CMP-acide sialique sur ces glycopeptides désialylés.

30

Quelques exceptions ê cette règle ont cependant été décrites

.17), mais dans ce cas, l'oncogénicité d[~s cellules ne sem­

ble pas avoir été établie avec certitude.

Ces glycopeptides de grande taille lenv.4500 daltons)

ainsi que leurs hCJrnologues "norrnaux" (env. 3/00 daltons) re­

présentent en fait, des populations très hét0rogènes pouvant

être sous-fractionnées rlar chromatographie d'échange d'ions,

par électrophorèse à halJt voltage ou paf' chrc,matographie

d'a f fin i tés u r div 8 r 3 e s colon n e s d E: l,~ c: tin f~ sinsol u b il i sée s

40 ).

Ces g l Yc 0 ppp t:i a e s p ù s S f: der aie n t ai n si P lu~) cJ e br an che~:; ex-

ter ne s que les g l Yc 0 pep i ide s d e cel l u 1:: ~, n [) r n: ale s. 0 GAT A

1/1.3) a d' ai lleur's, SUI' la basl3 du C[J!llportenent de ce~; gly­

co pep t ide s sur co] 0 ri ne cl e S 8 P ha d e x [. ~j:l etc t: rom a t 0 g ra phi e

d' affi ni té. sur concélnavali-!e A , avant et après action d'exogly-

cos i d a ses, p ['op 0 s É! las c h é ma des t rue t J r e

figure 'l.

r t: pré sen t é par la

A c [j t é de CEl S :~ l y c: 0 pep t i d [~ s r~·· g.l Ycos j d j q LJ es, u n au t r e

t y p e des t f LJ (; tu l'e g l Ycar, n i que est r:: l" é ~>:: n t fi J a :> u l'fa c e cel-

luI air e. l l ~,' a g :L t d I~ g J Yc 0 pro t [~ i n e s p ,:' s s é cl a rit des g l YL: a n n e s

ê lia i son (j - g l YC 0 é; i d i qu': e n t r e li n rés i ,j u d [, ~I - a ,~ é t Yl g ü lac t 0 ­

sam in e et II n rés i cl u rJ e é. é l'in e 0 IJ th r I~! 0 '·1 in e J

liaison tri!3 la!.li]e ,"n 'Ililieu alcalin. CI3S strLJ!~tures unt été

mises en évidence:':lu ni.eau de la g.lYI;.'pllorire, glycopr'otéine

majeur" de J d rTIerntJI,:;nl~ dl., globule :-cugn (lB? ), '3t CODHJGTDN

et Coll. o ri t i s 0 ] é, à pal' t Lr d n cel] u 1 es as ci t i que s

TA 3 Ha, une g l Yc Cl pro t i~ i Cl ": qu' ils a p p n l J,:, n t {, P i g] :1 c a n i ne, t l'Ès

ri che en g J Yc a n n e é, l L P. s 0 - g l Yc 0 ~; i d i q lJ El rfl e Il t SI. r l a p r' 0 tÉ, i ne.

6 HAV f, IJ A I~ 0 rI r'J 1 ç~ ] su g g 8 r [~, que l:J P r' é é: e fi ,; e sur ] a par-

t i e pep t id j q l! 8 cl e ri 0 rrl bru x g l YC cl n Il e s li·? l Y[: 0 ~: i cJ Lque s s i a l y lés.

pro t è g E' rai t C 8 l ] El - cidel' a c t i 0 ! 1 d 8 S P:J t é éJ S f: s, d' 0 Ù l 8 U r r e ­

lative grorllJe taiJ lu

Branches

Pentasaccharide de base

1.- _ _ _ _ _ __ __ _ __ _ _ _ ... ~

Fig. ~\ - '3 CHE '''1 A D [ sn JeT Il R E [] E.:· G '1. '( C !~I P EF TI 0 ES IJ E

31

32

Bien que ces structures aient été retrouvées à la surface de

nombreuses cellules normales (40, 46, 13:-J ), elles semblent

être plus abondantes à la surface des cellules cancéreuses,

en particulier au niveau des tumeurs ascitiques ( 33, 199 ).

Co mm e les ug gère SAN FOR 0 (163). l'a bon dan ce de ces g l Yc 0 pro ­

téines O-glycosidiques, à la surface de la cellule cancéreuse

masquerait certains antigènes de surface, en particulier

certains antigènes d'histocompatibilité.

BRAI'1WELL et HARRIS (22 ), utilisant, récemment une

.;echnique de fusion cellulaire ( 20~ entre diverses cellules

tumorales et normales, ont permis de suivre les caractères

restant associés de façon spécifique à la transformation ma­

ligne. Ces caractères doivent exister chez la cellule tumorale

d'origine, disparaître chez des cellules hybrides, et réappa­

raître chez les sous-populations cellulaires présentant un

pouvoir oncogène. Gr~ce à cette technique, BRAMWELL et HARRIS

constatent que la seule modification associée à la transfor­

mation maligne, touche une glycoprotéine membranaire, ayant

une masse moléculaire de l'ordre de 100.000 daltons et un

point isoélectrique égal à 4,0. Cette glycoprotéine, chez les

cellules transformées, fixe plus de concanavaline A et moins

de lectine de germe de blé (W.G.A.) que la même glycopro­

téine présente chez des cellules normales. Sur cette base, les

auteurs concluent à une glycosylation anormale de cette glyco­

protéine 100.000 K et établissent une relation entre le récep­

teur insulinique isolé par le groupe de CUATRECASAS (qO

qui possède une masse moléculaire de 135.000 K et un point

isoélectrique égal à 4 et qui fixe également à la fois la

concanavaline A et la lectine de germe de blé (W.G.A.).

BRAMWELL et HARRIS ( 22 ) émettent l' hypothèse qu'une

anomalie structurale au niveau de ce récepteur serait respon­

sable de la perte des mécanismes de régulation de la crois­

sance caractérisant la cellule maligne.

33

4.3.- Autres altérations de surface où sont impliquées

les glycoprotéines membranaires

4.3.1.- REACTIVITE AUX LECTINES.

On sait que la contamination par un virus ou la trans­

formation tumorale entrainent des modifications de la composi­

tion des glycoprotéines de membrane (201; 140, 4, 21); or.

parallèlement. les cellules perdent un certain nombre de pro­

priétés comme. par exemple. l'adhésion sur des substrats. et

l'inhibition de contact. La concanavaline A (Lectine) ajoutée

au milieu de culture peut rétablir l'inhibition de contact

(~, 165, 166).Par ailleurs. les cellules transformées sont

agglutinées par certaines lectines à des concentrations beau­

~oup plus faibles que les cellules normales.

C'est cette observation de AUB 14 ) qui fut le point

de départ de toutes les recherches actuelles sur les lectines

-Les lectines sont des (glyco) protéines que l'on a d'a­

bord extraites des végétaux. mais on en trouve un peu partout:

dans les extraits de cellules animales. des champignons. des

levures (165, 160, 116)· Ces lectines possèdent la propri-

été de se lier spécifiquement à des sites récepteurs de la

membrane cellulaire. Et. l'interaction de ces lectines avec

les cellules. dans plusieurs cas peut être inhibée spécifique­

ment par de simples sucres (165,lG6 ).

Ceci prouve donc que les lectines se lient spécifiquement à

des saccharides présents à la surface de la cellule (165 ).

Les lectines se li8nt aussi aux mono et oligosaccherides et

elles précipitent spécifiquement les polysaccharides et les

glycoprotéines. Cette précipitation est aussi inhibée par

l'addition de sucres (lG~, 91 ).

-L'agglutination des cellules par certaines lectines

est plus forte chez des cellules transformées par des virus

oncogènes, par des agents chimiques carcinogènes ou trans­

formées spontanément, que chez les cellules normales.

( 140, 14, 165, 166 ).

Ces faits renforcent l'idée que la surface des cellules

transformées diffère de celle des cellules normales, et en

particulier au niveau de la répartition des glycoprotéines.

En effet, les analyses chimiques, ont démontré la nature gly­

coprotéinique des récepteurs qui contiennent des sucres neu­

tres,de l'acide sialique, et de la glucosamine (91 ).

La microscopie électronique a été utilisée pour loca­

liser les récepteurs de lectines, et pour déterminer leur

répartition, et leur relative mobilité, à la surface des

cellules transformées et normales (140 ).

NICDLSDN (lLlO ) avec de la concanavaline A marquée à

la ferritine, a démontré que comparativement aux récepteurs

de concanavaline A des cellules 3T3 qui sont plus dispersés

les récepteurs de concanavaline A à la surface des cellules

SV 3T3 ont une distribution plus regroupée.

MICHAEL INBAR et LED SACHS (P8 ) ont démontré que

environ 85% des sites liant de la concanavaline A, sont exposé~

à la surface des membranes des cellules transformées alors

que ces mêmes sites sont comme "voilés" chez la cellule nor­

male.

Les changements dans les mécanismes de régulation cel­

lulaire associés à la transformation, résulteraient

de changement de structure de la surface membranaire

qui"dé'Joilerait" ses sites récepteurs chez des cellules trans-

formées

35

Comme nous venons de le décrire. l'augmentation de

l'agglutinabilité chez la cellule transformée. n'est pas

due à une augmentation du nombre des sites récepteurs pour

la lectine: ceux sont présents en nombre sensiblement égal

à la surface des cellules normales et transformées. Par

contre. il existe une plus grande mobilité de ces sites chez

la cellule transformée. Ces résultats ainsi que d'autres sem­

blent reflèter une plus grande fluidité de la membrane can­

céreuse par rapport à la membrane normale 105, 1Gb ).

Il faut cependant noter que l'enthousiasme provoqué

par la découverte des lectines a un peu diminué.

On s'est rendu compte en effet qu'il était extrèmement dif­

ficile d'identifier les modifications de la structure de la

surface cellulaire pendant la transformation des cellules

normales en cellules malignes. En outre. l'augmentation de

l'agglutination par les lectines, n'est pas une propriété

commune à toutes les cellules malignes.

Malgré ces aléas, l'utilisation des lectines représente une

technique précieuse pour l'étude de la structure des glyco­

protéines de membrane.

4.3.2.- Glycoprotéines et antigènes de surface

L'apparition de nouveaux antigènes associés à la

transformation maligne est un phénomène important. car ces

antigènes peuvent permettre in vivo à la cellule maligne

d'échapper à l~ surveillance du système immunitaire (75 ).

Ces néoantigènes présenteraient des structures différentes.

des spécificités antigéniques nouvelles. des localisations

différentes. dES mobilités .variables et des rôles différents

dans les phénomènes de rejet (l~O ).

36

Ces antigènes peuvent être des antigènes embryonnaires

tel l'antigène carcinoembryonnaire (C.E.A.) de nature glyco­

protéinique, qui réapparait à la surface des cellules tumo­

rales du colon (je). et aussi de nombreuses autres tumeurs.

Les antigènes nouveaux (néoantigènes) spécifiques aux

transplantation, apparaissent à la surface des cellules trans­

formées par des virus oncogènes ou des cancérigènes chimiques.

Ce sont les T.S.T.A. (Tumor spécifie transplantation antigen)

ou encore appelés T.A.T.A. (Tumor associated transplantation

antigens) .

L'immunogénicité de ces néoantigènes, en particulier

des T.S.T.A. induits par les virus oncogènes a fait l'objet

de nombreux travaux, en particulier ceux de KURTH et BAUER

( lir)). La propriété la plus importante de ces T .S. T .A. sem­

ble être leur rôle dans la protection d'hôtes syngéniques

contre la prolifération tumorale: des animaux immunisés par

ces antigènes sont ainsi capables de rejeter une tumeur trans­

plantée renfermant cet antigène.

Un autre exemple du mode d'action de ces T.S.T.A. nous

est donné par ]a régression, chez le ~hat, des tumeurs indui­

tes par l'inoc~lation du virus du sarcome félin (FeSV) et

par la résistance naturelle de ces animaux au lymphosarcome

induit par le virus de la leucémie féline (FeLV). Cette résis­

tance est liée à la présence dans la membrane d'un antigène

appelé F.O.C.M.A. (Feline Oncornavirus associated cell mem-

b r a n e a n t i g e,,) (," ::' ). Cet a n t i g è n e est den a t ure g l Yc 0 pro ­

téinique et possède une masse moléculaire de 65.000 daltons.

D'autres 1.S.T.A. ont été caractérisés: en particulier

une glycoprotéine, de masse moléculaire 100.000, présente

à la surface des cellules de Poulet infectées par le virus

du sJrcome de ROUS

37

De toutes ces observations qui sont loin d'être exhaus­

tives, il apparait que les processus tumoraux, sont caracté­

risés aussi par l'apparition de nouveaux antigènes, ou l'élé­

vation d'antigènes déjà préexistants à la surface cellulaire;

et ces observations sont en accord avec les modifications

observées au niveau des glycoprotéines, lors de la transfor­

mation maligne.

4.3.3.- Problème de l'acide sialique

La pl~part des cellules en culture, contiennent un

taux important d'acide sialique étroitement lié aux glycopro­

téines et localisé en priorité sur la surface membranaire

( GSt 2 O':) ).

Par suite, de l'intérêt que représente la membrane des cel-

lules, dans le processus de transformation, de nombreux tra­

vaux ont été effectués sur les modifications de l'acide sia-

lique et des sialoglycoprotéines après la transformation.

De tous ~es travaux, il ressort u~e discordance encore

inexplicable en ce qui co~cerne les variations de l'acide

sialique.

En effet. DHTA et coll. (1968) ( 144 ), ont observé

que les cellules 3T3 ou BHK transformées par un virus onco-

gène, contiennent moins d'acide sialique que leurs homologues

non transformées. Ca résultat est en accord avec les obser-

vations de GRIMES (1973) [71 qui trouve qUE les cellules

en culture transformées par un virus contiennent généralement

moins de sialyJtransférase5 que les cellules non transformées.

Par ·:lilleurs. f:AL/~L1T et CDll. trouvent que les cellu-

les cJ E-l S tu me LI r ~i ci' hé pat 0 m8 deR a tind LI i tes par le rH ami no a Z 0 .­

b e ri Z ~ [18, con ~~ i e n [1 f-l r1 t plu s d' a cid e s i a l i que que les cel l LI les

n 0 r mol les d e T 0 j. e cJ e Rat. \j AI~ BEE K e t [: 0 J. l . ( :i. SI 2) () n t cor r 0 -

bo['f~ une expér ic·:r1ce préalable de INARREN et Coll( 2'02)

38

dans laquelle, les cellules transformées in vitro en culture,

possédaient une fraction glycoprotéinique plus riche en acide

sialique que les cellules normales. Dans une série d'expérien­

ces sur les glycolipides des cellules normales et cancéreuses,

de nombreux auteurs ont observé, chez la cellule transformée,

de nombreux exemples de délétion en acide sialique dans la

f r a c t ion g l Yc a n n i que (73. 74. 136)

Il est tentant de relier les modifications de l'acide

sialique, des sialoglycoprotéines et des sialyltransféreses

avec le stade néoplasique des cellules en culture, mais

les discordances dans les résultats ds nombreuses expériences

doivent prévenir de conclusions trop hatives.

Ain s i do 1-, c, les var i a t ion sen cl cid e s i al i que n' a p par a i ci ­

sent pas comme une propriété générale du stade néoplasique

(140 ).

39

v - QUELQUES METHODES D'APPROCHE

Une bonne connaissance de la nature, de la réactivité

biologique, voire de la structure chimique des glycoprotéines

impliquées dans les interactions cellule-cellule et cellule­

substrat, devrait être la base de toute approche rationnelle,

dans l'investigation des phénomènes biologiques complexes,

tels l'inhibition de contact, la reconnaissance tissulaire,

le rejet de greffe et les métastases.

De nombreuses méthodes d'extraction et d'études des

glycoprotéines de membrane ont été proposées abondamment

dans la littérature. Mais chacune d'entre elles possédait

ses limites. La fraction "membrane de surface" obtenue. varie

en fonction de la technique utilisée, à cause des contamina­

tions possibles par les autres fractions subcellulaires, et

des pertes des constituants membranaires.

Il est donc important d'utiliser différentes techniques

de fractionnement basées sur différents principes.

Pour éviter les problèmes de fractionnement de membrane,

certains auteurs ont utilisé, des techniques différentes pour

définir, et localiser des glycoprotéines de membrane. Une des

méthodes utilisées, pour déterminer les variations dans la com­

position des glycopeptides, est de soumettre les cellules à

l'action non-lytique des protéases et ensuite d'analyser les

glycopeptides extraits. En effet, il a été fréquemment obser­

vé, que les glycopeptides extraits des membranes des cellules

transformées étaient de plus "grande taille" que leurs homo­

logues normaux (201,86,193,202)

C'est ainsi

40

donc que entre autres exemples, la trypsine

a été utilisée pour extraire les glycoprotéines porteurs d'an­

t i g è ne s p é ci fi que Mou N deI a sur f ace d' é r y t hroc y tes (36, 185)

KDRNFELD S. et KORNFELD R. ont trypsinisé des érythro­

cytes intacts pour extraire des glycoprotéines comportant

des sites actifs récepteurs de la phytohémagglutinine (106,107)

BUCK et Coll. ont étudié des glycoprotéines extraites

par la trypsine

ques (24)

des cellules en culture et poussant en pla-

CDDINGTON et Coll. ont extrait par la trypsine des

glycoprotéines de la surface de cellules d'ascite d'adenocar­

cinome mammaire de TA3. Ils ont montré que l'utilisation

d'incubations courtes avec la trypsine TPCK, dans laquelle

l'activité chymotrypsique est inhibée, permettait d'extraire

des glycoprotéines de composition et de longueurs différentes

(32,172,33)

D'autres méthodes d'approche qui ont été utilisées

pour l'étude des (glycol protéines de membrane peuvent être

résumées de façon suivante

1-Digestion par des protéases et glycosidases, avec

l'hypothèse que les enzymes étant des macromolécules, ne tra­

versent pas la double couche lipidique de la membrane.

2-Méthodes d'extraction chimique par le lithium

di i 0 dos al i cyl a t e (L l S let 1 e ph é n 0 l (64 1 9 9)

3- Méthodes de marquage externe, comme par exemple

l'iodinatiorl catalysée par la lactoperoxidase (129,148)

ou l'oxydation par la galactose-oxydase suivie d'une réduc-

t ion par 1 [3 lJ 0 r 0 h Ydru l'et rit i é (53, 57]

41

4-Des techniques immunologiques, comme l'immunofluo­

rescence de cellules en culture ou fixées, et l'immunopréci­

pitation.

5-Des méthodes de marquage métabolique, par incorpo­

ration de sucres radioactifs (glucose, fucose, glucosamine ... J.

Toutes ces méthodes citées plus haut, aboutissent à

un dénominateur commun, qui est l'analyse des molécules iso­

lées ou marquées par l'électrophorèse en gel de polyacrylamide

en présence de sodium dodecylsulfate (S.O.S. J. Cette techni­

que avec toutes ses variantes (Isoélectrofocalisation, élec­

trophorèse bidimensionnelle) est actuellement très utilisée

comme méthode analytique car elle possède un

excellent pouvoir de résolution.

42

VI - CONCLUSION

La transformation maligne d'une cellule s'accompagne

de troubles profonds au niveau de sa membrane plasmique

Ces troubles affectent la physiologie cellulaire: perte de

l'inhibition de contact, adhésivité réduite, apparition d'an­

tigènes nouveaux, augmentation de la fluidité membranaire.

A ces troubles fonctionnels de la membrane sont asso­

ciées de nombreuses altérations structurales touchant les

glycoconjugués membranaires protéoglycannes, glycolipides

et glycoprstéines

Un problème important est de savoir quelles sont parmi

ces modifications structurales et fonctionnelles de la mem­

brane, la ou les modifications associées de façon irréfutable

à la transforrnation r;',aligne, c'est à dire à la propriété

acquise par UI18 cellule dl? se multiplier indéfiniment sans

contrôle et d'être fortemGnt oncogène.

L'utili~ation de techniques lourdes telles qua l'isole­

ment des mutants cellulaires, ou la création d'hybrides pro­

d u i t spa r +u s ~L 0 n cel l u 1air e , sem b ] e p 8 r met t r e der é p 0 nd r e ij

ce premier prublème. Ainsi, l'isolement d'une cellule ne

possédant ~as l'enzyme capable d'acétyler la glucosamine-6-

pr,osphate 149 ), absence. se traduisant par une biosynthèse

altérée d~s glycoprotéines, a permis de démontrer que cette

CEllule, ~ion que possédant des caractéristiques de cellules

melir,nes. Il'e!,: pas oncogène. De plus. l'addition au milieu de

c Le l t ure d a r'J - il C é t y 1glu cos cl min e r é t a b lit t 0 u tes ces f 0 net ion s

alté,~ées.

43

De même, l'étude des propriétés restant associées à la

transformation maligne, étudiée selon la technique de fusion

cellulaire de HARRIS (22 semble permettre l'élimination

de certaines caractéristiques retenues jusqu'ici comme mar­

queurs tumoraux; en particulier, la vitesse de croissance des

cellules, leur capacité de se multiplier sur milieux gélosés,

l'inhibition de contact, la production d'enzyme activateur

de plasminogène et l'organisation du système contractile ne

semblent pas représenter des marqueurs spécifiques du stade

néoplasique (175,205).

Selon BRAMWELL et HARRIS ( 22 ), la seule anomalie, donc

le seul indicateur de malignité serait la glycosylation modi­

fiée d'une seule glycoprotéine membranaire de 100.000 daltons.

Selon WARREN et VAN BEEK (201,195 ), la seule anomalie

associée de façon permanente au pouvoir oncogène des cellules

malignes se situe au niveau de certaines structures glycanni­

ques N-glycosidiques des glycoprotéines membranaires.

C'est donc au vue de l'importance des glycoprotéines

de membrane dans la transformation maligne, que nous avons

essayé dans ce travail de mettre au point et d'exploiter des

techniques de séparation (principalement électrophorèse)

et de révélation des (glyco) protéines membranaires, appli­

quées à l'étude des cellules L 1210 et K 562 cultivées in­

vitro.

DEUXIEME PARTIE

MATERIELS TECHNIQUES ET METHODOLOGIES

44

1 - PRODUITS ChI~IOUES.

- Acrylamide (MERCK/SIGMA)

- Ampholines (LKE)

- Ampholines-Pag-Plate (LK8)

- Bis-Acrylamide (N.N'~éth~16n-Diacrylamid) (MERCK)

- Bleu de Brcmophenol (SIGMA)

- Bleu dE [cGmassie R 250 (SIGMA)'<

- Boro~vdrure dB K/Na-~H (K~B4/ Na HB n ) (CEA)

- Dimethyl Sulfoxyds (DMSO) (MERCK)

- D i P h {~ ri yI? - 5 Gx êJ Z CJ l 8 ( F PO) ( MER CK)

- Ether-Mono-P (TETFiA~ETHY-1.1.3.3. BUTYL)

Phénylioue cie Pclyetr:ylène glycol (TRITON >: 1CO)

(MERCK~

- L.Fuccse 14 C [L,) (CEA)

- Galactose Oxydase El 11.3.9. (SI[jf''1P\~

O r; l . 1 4 C (L'I) (' CEP, )- .~ ucosamlne '

- Glycércl qectep~r (PROLARO)

- Inhibiteur de Trypsine (SETI) (SIGMA)

- Mercentc-2-Ethanol (PROLABO)

- M~taperiod6te dG Sodium (ME~CK)

- Neura~iniGaSB [Vibric-Cholér§a) (KOCK-LICHT)

- Non i d et NP - 4 0 (F 1_ U ~.i\ )

- Persulfate d'Ammonium (ME~CK)

- Sodium Dor:iéc~il Sulfate (SDS~ (SIr,MA)

- TRIS-Base: Tris (Hydroxvméthyl) Aminométhane (MERCK)

- T EIV] E0 (~J. ~l • ~; • N. Té t r a n' é n y 1 - Eth Yl 2> n e [j i él min e ) ( M F r~ U', ~

- Try~sin8 -TPeK (WORTHINGTON)

- UrÉ!8 RP (~,IGnfl,)

45

II - MATERIEL CELLULAIRE.

Au cours de ce travail, nous avons utilisé 2 souches

cellulaires cultivées IN VITRO.

2.1. La L1210lyt:

C'est une leucémie murine induite par administration

de 3-~éthyl cholantrène à des souris DBA/2.

J:;:l:j..2.2. La K562 :

Elle est obtenue à partir du liquide pleural d'un

patient 3tteint d'une leucémie myéloide chronique

en crise blastique. ( 123)

Elle a été décrite comme un stade précoce de dif­

férenciation de la lignée granulocytaire (104)

mais à la suite des travaux de i\NDERSON (9) et

RUTHERFORD/( 160) elle s'est révélée être une lignée

érythroleucémique.

2.3. CULTURES.

Ces souches cellulaires sont entretenues en suspension

dans le ~ilieu de EACLE DULBECCO (GIBCD) additionné

de :

'10 ~ de sérum de veau foétal (GIBCO)

- 500 000 unités/L de péniciline (SPECIA)

- 40 mg/L de streptomycine (SARBACH)

- 3 mg/L de fungizone (SQUIBB)

- 50 mg/L de kanamycine (THERAPLIX)

lyt Don du p r ZAGURY, Faculté des Sciences Universi-

taire Pierre, Marie Curie, PARIS

ctDon du 0 C8PPEY, Institut Curie, PARIS.

46

Les cultures sont effectuées en flacons de ROUX,

de 75 ou 150 cm 2 Les volumes de milieu de culture

utilisées, sont respectivement de 30 et 80 ml.

Les cellules sont incubées ~ une concentration de

100 OOrr~~ur les K562 et 200 ooo/ml pour les L121o,

dans une atmosphère saturée en humidité, contenant

5 ~ de CO2

(Etuvg NAPCOl et è 37°[.

Ces deux souches sont des modèles expérimentaux

intéressants en raison de leur cycle de division

rapide: 2 è 2,5 divisions pour la souche L1210, et

1 division pour la souche K562 par 24 heures.

2.4. NUMERATIONS.

Elles sont effectuées au microscope ~ contraste de

phase avec des hématimètres de MALASSEZ.

Les cellules vivantes sont réfringentes. Celles qui

sont rondes et de la même taille, mais non réfringen­

tes, sont comptées comme cellules mortes.

Les numé.rations sont aussi faites è l'aide d'un

compteur de cellules (HYCELl. Cet appareil a l'avan­

tage d'une grande reproductibilité; cependant, il

n'indique pas le nombre de cellules mortes. Pour

apprécier la létalité, nous effectuons une numération

è la cellule de MALASSFZ.

III - RECOLTE DES CONSTITUANTS MEMBRANAIRES.

Notre but étant d'isoler puis d'étudier des (glycol

protéines (ou des fragments de (glycol protéines) de me~-

brane, avant ou aprss action des drogues, nous avons abor­

dé le problème de plusieurs façons

47

- Trypsination douce (4°C) de la membrane cellulaire

et analyse du trypsinat.

ou

- Marquage métabolique "In Situ" par la glucosamine

le fucose marqué au 14 C, et ensuite trypsination douce

1 8

- Marquage externe des glycoprotéines, et étude du

lysat cellulaire après centrifugation.

- Trypsination douce, et marquage externe du trypsinat.

Toutes ces méthodes d'approche sont résumées dans le

schéma général de la Fig.l0.

3.1. TRYPSINATIDN.

L'attaque de la membrane de cellules par des enzymes

protéolytiques nous a semblé au début, la méthode

la plus logiqu~ Dour en libérer les glycoprotéines.

CDDINGTDN et JEANLOZ (32), ont en effet, démontré

qu'une incubation de courte durée n'avait pas d'effet

sur la viabilité des cellules TA3 Ha lorsqu'elles

sont incubées avec une trypsine modifiée pour éliminer

l'activité chymotrypsine, à une concentration de 12 à

rg/ml et à 4°C pendant 20 minutes.

La trypsine est une endopeptidase spécifique qui

hydrolyse les liaisons amides, esters ou peptidiques

impliquant le carboxyle de la L-arginine ou de la

L- lysine.

Nous nous sommes donc inspirés de la méthode de

CDDINGTDN (32) que nous avons modifiée selon le

protocole suivant qui est résumé dans le schéma

de la Fig. 11.

48

0°C/30'

TPCK : 50 ~I/ml

1

1Â.

14C

3, H

GLNH2,FUC

---ï

1111

1

1

TRYPSINATION DOUCE

OXYDASE

~

~TeRo 1L.-__C_E_L_L_U_L_E_s~__I_TT_Re__---,..~MARQUAGE1. . METABOLIQUE

r---'------ ----:; j: NEURAMINIDASE (-), ~.-- - - -- - - - .....- - -- - -

L---T-----T

l Il--------,NaI04 ~ GALACTOSE

~OX

RED

---- -- - .. -----_.

lTRYPSIN.l\T.

,

Cm1PTAGE

LYSE DES CELLULES

~

...•.. ··EnOSAGE ­

1 \\ PROTEINES-1-/-1----....J

, 1, /, /~ r

r--- -- - - --'"------11 1

: CHRO~ffiTOGRAPHIE i1 11 1

L D~ A..fEIliI_T,f: .. :1

y

~I ANALYSE ELECTROPHORETIQUE

lieIEF, ACRY/SDS, BIDIM,

METHODES DE REVELATION ___

Bi. de ~oomassie AUTOI~DIOGRAPHI~.~ 'COMPTAGE

Fig. 10 - SCHEMA GENERAL DES METHODES D' APPROCHE POUR L' ETUDE DES

GLYCOPROTEINES MEMBRANAIRES.

49

PROTOCOLE.

- Centrifuger la suspension cellulaire dans des

tubes coniques (30 mlJ à 400 g (~ 1000 rpmJ pendant

1 0 mn.

- Laver les culots 2 à 3 fois par du tampon Tris PH 7,4,

et rassembler dans des tubes à hémolyse ou des tubes

coniques.

- Centrifuger le "pool" cellulaire à 1000 rpm

pendant 10 mn.

- Relaver par du tampon, compléter ~ 5 ~l, prélever

une partie aliquote pour une numération cellulaire.

- Centrifuger à 1000 rpm pendant 10 mn.

- Reprendre le culot par le tampon Tris QSP 1 ml

pour 50 x 106

cellules et transférer le tout à DoC

dans la glace pilée fondante.

- Ajouter la trYPsine1y!..: 50 ~·11/~1 d'une

solution ~ 7e ~f': /ml (c.a.d. 4 rnU/ml de

suspension cellulaireJ.

- Agiter en continu pendant 30 mn à DOC.

- Ajouter l'inhibiteur trypsique S.B.T.I. (soybeôn

trypsin inhibitorJ à raison de 50 ~l/ml dlune.

solution ~ ~n8 ~~/~l

- Ajouter 3 ml de tampon phosphate PH 7,2 (P.B.S.J

goutte à goutte en agitant au VORTEX.

Centrifuroer à froid (o°CJ à 400 x g pendant 10 ~n.

- Recueillir le surnageant (trypsinatJ.

- Dialyser contre de l'eau distillée et congeler.

- Lycphiliser.

~: TRYPSINE-TPCK (WORTHINGTONJ dont l'activité chy­

motrypsique a été inhibée par la L (1-Tosylamido-2­

phénylj Ethyléhloro~éthyl kétone ou TPCK.

SUSPENSION CELLULAIRE50

centrifugationl, 400 g [1000 rpm x 10 mnl

(dans la glace)

TRIS OS. 1 ml/50 x 10 6 cellules

Surnageant

(à jeter)

Cl..JtoT

lr+ TRYPSINE (50

....._---------------'~ Culot

+Remise en suspension et lavage

2 à 3 x par 'RIS (pH 7,4)

NUM ERA TI 0 N...--------1t

Centrifugation

1000 r1m x 10 mn

surn'ageant

(à jeter)

~l/ml de suspension cellulaire d'une solution

à 70 pg/ml = 4 mU/ml)

agitation 30 mn dans la glace

pg/ml

7 , 4 )

par tamoon adequat

200

[TRYPSINAT r

DIALYSE/eau distillée

1 LYOPHILISAT lI__~Repris,

~l/ml d'une solution à

(3 ml de tampon ohosphate pH

50 ~l)(20 à

dosage protéines

,+ S.B.T.I. (50

~+ P.B.S.

1

Centrilugation à froid 10nn rpm x 10 mn

......---_1-·_------------,+ ,CULOT SURNAGEANT

(à jeter) ~ADI.A.LYSAT

.-------~LOWRY LYOPHILISATION

t

ANALYSE ELECTRoPHORETIQUE ET REVELATION

Fig. 11 - SCHEMA DE LA TRYPSINATION.

51

3.2. MARQUAGE DES GLYCOPROTEINES.

3.2.1. MAR~IUAGE METABOLIQUE.

Une méthode utile d'identification des glycopro­

téines est représentée par le marquage spécifique

résult~nt de l'incorporation par les cellules de

pré c urs e u rs rad i 0 ma r q u é s

fucose) .

(14 C_ slucosamine 1 4ou C-

Nous avons utilisé comme précurseur

- La glucosamine qui est un précurseur spécifique

de la N-acétylglucosamine, de la N-acétylgalacto­

samine et de l'acide sialique (101,114)

qui sont incorrprés dans 19s glyccprotéines.

- Le L-fucose qui est un sucre terminal de la

chaine glycannique et qui a été largement uti-

lisé pour l'étude de la biosynthèse des glycopro­

téines chez les cellules eucaryotes (94,113,134

En outre des études ont montré que le fucose n'est

jamais métabolisé ou converti en d'autres sucres.

mais cu'il est ircorporê. inchangé sous forme de

r~sidus fucoeyls dans les glycoorotéins2

INCUBATION.

94 )) .

Les cellules sont cultivées

présence de 1-5 microcuries

samine ou L- 14 C_ fucose.

en suspension, en1 4

Iml de 0- C- gluco-

Les glycoprotéines radiomarquées sont étudièe5

au bout de 24 heures selon la technique de trypsi­

nation décrite plus haut.

52

3.2.2. MARQUAGE EXTERNE DE GLYCOPROTEINES.

3.2.2.1. oEFINITIIJN.

L'analyse des glycoprotéines de surface, a été

r~cemment facilitée par la "méthode de marquage

externe" qui introduit des éléments radioactifs

spécifiques, dans les fragments oligosacchari­

diques des glycoprotéines et glycolipides exposés

à la surface cellulaire.

Les techniques de marquage galactose oxydase­

NaB3

H4

et périodate - NaB3

H4 sont relativement

aisées à utiliser, car elles nécessitent peu de

cellules, et il n'est pas nécessaire d'isoler

la membrane cellulaire pour étudier les glyco-

conjugués 53,57 )

Cette technique a été employée avec succès pour

l'analyse des glycoprotéines de surface de nom-

breux types cellulaires (54,55,58)

Par exemple, chez les fibroblastes normaux, la

fibronectine (galactoprotéine al est fortement

marquée par la méthode à la galactose oxydase3

NaB H4

, tandis que les fibroblastes transformés

n'incorporent pas de radioactivité au niveau de

la fibronectine ( 27,83 ).

3.2.2.2. P~INCIPES.

3.2.2.2.1. GALACTOSE oXyoASE-BOROHyoRURE (GAO-KB 1 H4l.

- wuand des cellules intactes, sont traitées

par la galactose oxydase, les résidus terminaux

de galactose ou de N-acétyl galactosamine de la

chaîne des glycoprotéines de membrane, sont

oxydés au niveau du carbone 6 en l'aldéhyde cor-

respondant (55) (Fig.12) •

A

a

CHOH

OR

Galactose

Oxydaset n 0

53

H OH

GALACF)~E

CHa

H OH

8orohydrur8

H OH

OR

B

0COH 1°41

HÇOH JI'H C~OH H OR Pêriodate

H

OH H

A.CIIJE S!ALIOUE H

CH CO3

OH H

'f'3orohydrure

OH

AC. C7 HEPTULOSDNIQUE

R,A.c:;:rJ MARr;JUE

",II AL:" 'i r, c: f" - f J X-l", 8 " h

4

* r L ~,J.! i- fj T P ,Ii., C:' l [lA, c.: T l i

54

La masse moléculaire de la galactose oxydase

(75000d.) empêche la pénétration de

l'enzyme dans la cellule. Donc seuls les

glycoconjugués exposés à la surface cellulaire

sont oxydés.

- A cause de la présence fréquente de l'acide

sialique, lié aux résidus galactosyl, un trai­

tement préalable des cellules par la neurami­

nidase (qui désialide les ch~lnes glycanniques)

permet d'obtenir une oxydation efficace (54).

Les cellules sont ensuite lavées, et les aldé-

hydes formés sont réduits par le borohydrure

tritié (Na/KB 3 H4

) pour redonner le sucre de

départ [Fig.12).

REMARQUE.

A ch3que marquage effectué, nous réalisons

sur un lot de cellules un témoin borohydrure

tritié seul, car ce dernier peut provoquer la

réduction de liaisons insaturées de certains

glycolipides ( 53 / 57). Et ce témoin

perMet de vérifier les marquages aspécifiques.

3.2.2.2.2. PERIDDATE-BDRDHYDRU~E.

Sous l'action de faibles concentrations en

periodate [0.1- 2mM) à DoC, et pendant des temps

d'incubation très courts [10 mn), les acides

sialiques des chaines glycanniques sont préfé­

rentiellement et spécifiquement oxydés.

Il se forme un radical aldéhydique qui est

ensuite réduit par le borohydrure tritié pour

former un acide heptulosonique (acide 5 acéta­

mido 3,5 - didéoxy-l- arabino - 2 - heptuloso­

nique) ou un acide octulosonique (54,82)

selon le schéma de la Fig. 12 •

- Ce tra1temBnt par le per1odate-B3

H4

peut-être

précédé par l'act1on de la neuram1nidase qu1

démasquerait d'autres acides s1a11ques de la

chaine glycanniq~e, et qu1 pourront è leur tour

être oxydés.

3.2.2.3, REf\CTH:i.

- Tar'pon PBS (OUi_BECCO) PH = 7,4

- CaCl.)

- K Cl

- K H P (l 6.?

- Mr,r', 61-1 0. r ..J ~ --:~ , 2

- Na C l

F' 0 l.

100 mg/l

200 mg/l

200 mg/l

100 mg/l

BODO mg/l

1150 mg/l

- Gal a c t. 0 S 8 () >: y Ci e] S e (E C . 1 1 3 9 • ) Typ" \} (Sr::;I"IA) 1\ 0

Repre~dre le fle~on de galactose oXJdase (150 U]

::J al' 1, 0 Li 0 rD l [J e ;) BSet ré par t 1 r dan.' 1 3 tub~; s

(ec) iUL/TubE: 1 , 5!J U / Tub e ). 0 nuL lis e 4]~I L

5 U) par [);'vr:Jtion. Donc un tube ciécollge:.é

.3 e r t à =' D X Yri G t : Ij n~; .

- I\J 8 u rd T 1 nid cl s "'" X V 1 b l' 10 c ho l é r a e 1 i<, CJ c: K- L :: GHT ) •

Las 0 lut 1 0 r f) r, 2. " l'; a t 1 que (2 5 0 0 U / ml) 8 s t r é J cl l' t 1 e

::J a raI i [1 u 0 t e ~; L fo' 1 [) tt-l (2 5 U) dan s

.=PP:=:\mOC:~F •

E: S tub 3 ~j

Chaqu r:! tube (!{e·: 19Edé sert ij 2 tra11 ElmE,nts.

S tt:. / T r c 1'. P 'C, '; l t = 1 2 , 5 U / Tl' a 1 t e m.'· ri t ) .

+ +- [3 [J l' 0 ri y d l' l! r f) C 1: Na / K

3( NaB H

4ou

, 3\J 0 usa If c n sui. i li ',e aIt e l' n a t 1 v e men t u rj aB' -i ,

L,

'JU du l'::']H .. LE lorohydrure de pota.:E,ium se~lblE:'i

,3 \/ 0 i. l' l.J I! e fT e:. j .L '. J r est a b i 11 té que s ri ho ['10 ICi f. i..J:

30dr:.

56

Ce radio-élément nous est fourni par les dépar­

tements des radioéléments du C.E.A.SACLAY.

- Activité totale

- Activité spécifique

5 mCI;,I''I!Tlnoule

20 CI;~mole

Chaque ampoule est reprise par 1 ml de NaOH

0,01 N et est répartie dans 10 tubes par fraction

de 100 ~l

congélés.

0,5 mCi) qui sont immédiatement

tube décongelé sert à une réduction

réduction.

- Feriodate (NaI04) (MERCK).

Nous préparons de façon extemporanée une solution

mère 0,1 M dans du tampon PBS.

10 ~l de cette solution sont ajoutés dans le

milieu réactionnel pour obtenir une concentra-

tion finale de 1mM.

- Tampon d8 lyse.

- Triton X 100_ S BT l

- P BS

3.2.2.4. MODE OPERATOIRE.

250

QSP

3.2.2.4.1. GALACTOSE OXYDASE-KB3

H4

.

- Pour chaque expérience de marquage nous utili­

sons un nombre total de cellules variant de6

20 à 50 x 10 cellules.

- Les cellules sont lavées 3 fois par du P.B.S.

et remises en suspension dans 1 ml de P.B.S.

- Dans la plupart des cas, 5 ~l de neuramini­

dase et 40 ~l de galactose oxydase sont ajoutés

à la suspension cellulaire

57

3(expérience N+ GAo+ H).

Pôêfois seule la galactose oxydasE est ajoutée

au milieu (E.xp. 6-r3H).

- Les cellules sont ensuite incubées à 37°C

p8ndant 30 minutes. relavées 3 fois par du PBS

e~ remises en suspension dans 0,5 ml de PBS.

- Ensuite 0.5 mei de

d l~ I\J a 0 HO, 0 1 rJ, son t

3KB H

4contenus dans 100 pl

ajoutés au milieu et la

suspension cellulaire est incubée à température

élrrbiante (sous la hotte) pendant 30 mn.

- Les cellules sont relavée3 3 fois par du PBS.

et le culot cellulaire est repris Dar 0.2-0,5 ml

de tampon lyse à OOC pendant 15 m~.

- Le lysat cellulaire est c~ntrifugé à 2000 rpm

p 8 r1 dan t 5 - 1 0 ;,~ net les u r nage a ntes t r ecu e i IIi .

Pprès avoir prélevé des aliquots ca 10 ~l pour

le compta2e et le dosage des protéines, le

:C' L' l' n age a nt est con gel é e t s e ras 0 u 71 i s à des

E&parations électrophorétiques ultérieures.

::. ;).2.4.2. PERIOOATE - KB3

H------'-----4

- ~o à 50 x ~~6 cellules sont mises en suspension

d ë r1 s ml de PBS.

- Ajouter 10 ~l d'une solution de métaperio­

oele de sodium pour obtenir une co~centration

fir:ale de 1 mITlo:'./l.

- La suspgnsion est incubée dans l~ glace pen­

d 6 r; t 1 0 mnet à l' 0 b s c uri té.

- Arrêter l'action du perio1ate pa~ du glycérol

[:.1 rnmol/l de P:3S).

- Les cellules soot ensuite lavées 3 fois par

du PBS et resus~endues dans 0.5 ml de PBS.

- La réduction ESt réalisée par O,S ~Ci de

KB 3 H et les cellules sont traitées de la4

même façon que dans le marquage à la galactose­3oxydase-KB H

4.

REMARQUE.

- A chaque étape du marquage il est nécessaire

de vérifier l'état des cellules e~ microscope

- Ce type de marquage est résumé dans le schéma

de la Fig.13

3.3. TRYPSINATION DOUCE SUIVIE D'UN MARQUAGE

EXTERNE DES GLYCOPROTEINES.

Pour diversifier nos techniques d'approche, car

chacune d'entre elles possède ses avantages et

58

ses inconvénients cf . Ch. Discussion), nous

avons mis au point, en outre, une méthode d'étude

qui est l'amalgame des techniques citées plus haut.

Elle consiste en une trypsination douce à DOC

suivie de la technique de marquage externe des

glycoprotéines ~galactose-OXYdaSe-KB3H4 (G+ 3 H),

neuraminidaSe-galactose-OXYdaSe-KB3

H4 (N+G+3

H),3 3

periodate-KB H4 (P+ Hl.

Chacune des étapes techniques, ayant été vue en

détail dans les chapitres correspondants, nous

avons résumé la technique de trypsination-marquage

externe dans le schéma de la Fig. 14 .

3.4. DOS.~GE DES PROTEINES.

Le dosage des protéines est effectué selon la

méthode de LOI.JRY (122).

59

CELLULES6

20-50x10

Lavage 3 x 5 mn ptS. PH

2000'RPM.,7,4

BOROHYDRURE FROID CULOT

1 mM en conc. fi. repris par 1 ml de PBS (O°C si PERIODATE)

oOXYDAT O

11,11,

r- - - - - -'- - - - - - - ---1 ;1 NEURAMINIDASE (12,5 U) 11 1

: 30 mnl 37 0 C :.,~------- - - - -- ----- ---{

GALACTOSE OXYDASE

(5 U)

30 mnl 37 0 C

METAPERIODATE DE Na

10 mnl 0 0 1 OBSCURITE

1 mM en Co FINALE

Lavage 3 x 5 mn PBS.L.-----t~

2000 RPM.

tCULOT

LYSE

CELLULAIRE

0,5 mL de PBS.

+ +BOROHYDRURE Na 1 K

0,5 mci

30 mnl T O LABO

..Lavage 3,x 5 mn,

CULOT

0,2 - 0,5 ml de TPON LYSE

5 - 15 mnl 0 0

10 mn

.. SURN1-'_GEANT

300 _. 400 ~L

l ---......MPTAGE DOS. DES PROTEINES

ANALYSES ELECTROPHORETIQUES

REVELATION ( FLUOROGRAPHIE)

3000+.

RPM/

1..........------VCulot

ANALYSE CO

Fig.13 - SCHEMA DU MARQUAGE EXTERNE DES GLYCOPROTEINES DE MEMBRANES.

60

CELLULES

r.f.

Ch.

TrypsinatO

r---------------,1 11 11 TRYPSINATION 11 11 DOUCE 11 11 11 OOC/30-40mn 11 1----------------~ j

1 SURNAGEANT

~Dialyse /PBS/EAU/24-48H

l

cf . Ch. ----.r1 a r q. Ex t .

Dosage des

1- (LOI-JRY)

Protéines

r------------------~---------------------ï

1 MARQUAGE EXTERNE sur 1 ml DE SURNAGEANT 11 333 11 N + G + H G + H, P + H, 1l ' 1

~--_-------------------------------------4

o

Comptage (Scintillation

Liquide)

SEPARATION ELECTROPHORETIQUE

REVELATION

FLUOROGRAPHIE

() Après chaque traitement, dialyser exhaustivement contre

du PBS et ensuite contre de l'eau distillée.

Fig. 14 - TRYPSI NA TION [] 0 UCES UIV l E D' UN MA RQUA GEE XTER NE.

61

3.4.1. PRINCIPE.

La solution de protéines est dosée à la fois

par son pouvoir biurétogène (CUS0 4 en milieu

alcalin) et par le pouvoir réducteur des restes

tyrosyls et tryptophyls sur le réactif phospho­

tungsto-molybdique de FQLIN-CIDCALTEU.

3.4.2. REACTIFS.

- Une solution d'albumine bovine (SIGMA)

A une concentration de 1 mg/ml est utilisée

pour préparer une gamme d'étalonnage de 10 à

60 pg/ml.

- Solution de travail.

Elle est préparée par mélange extemporané des

solutions A et B suivantes, dans le rapport

10/1 v/V) .

- S 0 lu t i 0 Il A

Tartrate de Na et K, 4H2

0

H20 QSP

- Solution B

CLJ.S0 4 , 5H;;0

H2

0 QSP

20 g

5 g

1000 ml

0,1 g

1000 ml

- Réactif de FOLIN-CIOCALTEU~

A utiliser pur, non dilué.

3.4.3. MODE OPERATOIRE.

Ajouter 2 ml d8 solution de travail à l'échantillon

(10-100 ~l). Agiter vigoureusement et laisS8!'

repo"er.

Après 1D mn. ajouter 0.1 ml de réactif de FOLIN et

CIOCALTEU. agiter énergiquement et lire ~ 72D n m

au bllut de 3[J nln passées à l'obscurité.

Les résultats sont exprimés en microgrammes par

millilitre. puis ramenés au volume de l'échantil­

lon.

(;2

63

IV - TECHNIQUES D'ELECTROPHORESE.

4.1. INTRODUCTION.

"Lorsqu'une solution renfermant des particules

chargées est soumise à l'action d'un champ élec­

trique, on assiste à un déplacement de certains

éléments contenus dans la solution. La vitesse

et l'ampleur des mouvements dépendent de la taille

et de la charge des particules présentes".

Les lois régissant ces migrations sont décrites

par les théories électrocinétiques, élaborées en

1880 et 1881 par l'Allemand H. VON HELMHOLTZ.

Différentes techniques d'analyse des solutions

aqueuses furent élaborées en utilisant. les pro­

priétés des particules chargées. RegrQupées sous

le nom générique d'ELECTROPHORESE ou d'IONOPHORESE,

elles ne devinrent véritablement opérationnelles qu'

en 1931, après la thèse de doctorat du biochimiste

Suédois ARNE TISELIUS qui en définit préci-

sément 18s modalités.

Poursuivant ses travaux, A. TISELIUS perfectionna

l'électrophorèse [Electrophorèse Libre, de Frontière

ou en Veine Liquide) et parvint ainsi à séparer

18s protéines du plasma sanguin juste avant la

s8conde guerre mondiale. Il reçut, en 1948, le

Prix Nobel de chimie pour ses recherches dans ce

domain8.

Depuis l'électrophorèse libre, a été largement

supplantéepar d'autres formes d'électrophorèse

dites de ZONE (les composés se séparent en zones)

64

qui sont beaucoup plus simples, ont des pouvoirs

de résolution plus élevés et sont réalisables

avec de plus petits échantillons.

Dans l'électrophorèse de zone, la solution de

particules (protéines) à séparer est immobilisée

dans une matrice ou support solide, matériel poreux

hydraté qui possède une rigidité mécanique élimi­

nant les anomalies dues à la convection ou à la

vibration.

Les plus largement utilisés de ces supports ont été

le papier filtre et les bandes d'acétate de cel­

lulose maintEna~t.

Des résolutions électrophorétiques beaucoup plus

élevées sont obtenues quand le support ou la

matrice peuvent retarder ou exclure des modécules

protéiques selon leur taille moléculaire. Dans

ce but des gels d'amidon et principalement d'acry­

lamide sont habituellement et de plus en plus

utilisés.

En effet, au cours d'une électrophorèse en veine

liquide ou sur papier, les particules sont séparées

essentiellement en fonction de leur charge et, la

nature du milieu intervient peu dans le processus

de séparation.

Un gel, par contre, crée des forces de friction

très élevées et participe donc activement à la

séparation des particules. L'utilisation d'un tel

système permet d'une part de réduire les phénomènes

de diffusion et d'autre part de séparer les parti­

cules en fonction non seulement de leurs charges

65

mais aussi de leur taille. De plus l'importance

relative de ces deux paramètre peut-être modifiée.

4.1.1. SEPARATION SUR GEL DE POLYACRYLAMIDE.

4.1.1.1. DEFINITION.

Parmi les differents types de gels. le polya­

crylamide constitue dans la plupart des cas

le meilleur support. En effet, l'utilisation

de cette substance inerte et très stable vis

à vis des variations de température (182)

permet de contrôler avec précision la taille

des pores du gel qui fonctionne ainsi comme

un véritable "tamis" vis à vis des modécules

à séparer.

L'électrophorèse en gel fut décrite en 1955

par SMITHIES 173 ) qui prenait comme

support le gel d'amidon. De grands progrès

ont pu être réalisés lorsque ORNSTEIN et DAVIS(146,

37) ont proposé le gel de polyacrylamide de

polymères formés à partir de produits chimiques

que l'on peut obtenir à un degré de puretÉ

élevé.

Oepuis ces travaux on distingue en théorie

deux systèmes de fractionnement

Les"systèmes continus" dans lesquels la nature

et le pH du tampon sont identiques dans 18s

différents compartiments de l'appareil, et

les"systèmes discontinus" constitués de deux

types de gels superposés

1)- "Un gel de concentration" dans lequel existe

un gradient de voltage et de pH au niveau de

l'échantillon et qui permet ainsi de concentrer

celui-ci en une fine zone de départ.

2)- "Un gel de séparation". plus concentré en

acrylamide. et de pH plus élevé dans lequel les

modécules se trouvent séparées essentiellement

en fonction de leur taille. En toute rigueur.

le terme d'électrophorèse "en disque" doit être

réservé aux systèmes discontinus (37, 186).

Néanmoins en pratique. on emploie souvent ce

ter8e pour désigner les deux types d'électropho­

rèse.

En ce qui concerne l'appareillage on distingue

deux techniques l'électrophorèse en plaques

et l'électrophorèse en tubes. le verre ou le

plastique pouvant être utilisés dans les deux

cas. Le verre permet d'obtenir un meilleur refroi­

dissement alors que le plastique présente l'avan­

tage de ne pas adhérer au gel ce qui permet de le

manipuler plus facilement.

66

Dans les deux cas.

donne de meilleurs

horizontale ( cf

l'électrophorèse verticale

résultats que l'électrophorèse

Ch. Résultat discussions).

Le choix de l'une ou l'autre technique est par­

fois conditionné par la nature du problème à

résoudre et est aussi souvent fonction des pré­

fèrences personnelles.

67

LE GEL DE POLYACRYLAMIDE

Le gel de polyacrylamide est le résultat d'une

poly~érisation du monomère l'acrylamide avec

une réticulation due à la présence du comonomère

le bisacrylamide.

On prépare le gel à partir de ces deux monomères

l'acrylamide qui est une petite modécule organique

se terminant par un groupe amide (-CDNH2

) et le

bisacrylamide qui comporte deux monomères acryla­

mides liés par leur groupement amide. Les monomères

sont dissous dans l'eau. puis on ajoute à la solu­

tion deux substances supplémentaires pour induire

une réaction de polymérisation en chaîne.

Ces catalyseurs sont le persulfate d'ammonium,

et une modécule organique, le tétramétyl éthylène

diamine (TEMED).

Après la première étape de polymérisation. où le

persulfate d'am~onium réagit avec le TEMED. celui­

ci possède un électron de valence non apparié.

Le T~MED ainsi activé se combine alors avec un

monomère acrylamide ou bisacrylamide dans ce

procéssus, l'électron non apparié est transféré

à l'unité acrylamide. laquelle est alors activée.

Un autre monomère s'y attache et est activé à son

tour. Le polymère continue à croître jusqu'à ce

que le stock de monomères soit épuisé. le centre

actif se déplaçant continuellement à l'extrémité

libre de la chaîne.

Si la solution contenait seulement des monomères

acrylamides. la chaîne serait toujours linéaire

et sans ramifications en revanche. une modécule dB

bisacrylamide peut appartenir à deux chaînes et

les relier de façon permanente.

Le polyacrylamide croit ainsi en un réseau

imbriqué de boucles et de branches plus ou

moins anastomosées en fonction de la quantité

en bisacrylamide (Fig .15 J.

On définit généralement par concentration en

acrylamide (TJ la somme des concentrations en

acrylamide et bisacrylamide. Elle s'exprime en

pourcentage

a + b

68, ;

Tm

x 100

a quantité d'acrylamide (g)

b quantité de bisacrylamide (gJ

m volume du tampon (ml)

b

On définit par ailleurs ca + b

x 100

La quantité de bis par rapport à la quantité

totale en acrylamide + bis.

Le gel d'acrylamide est une matière inerte et

neutre. Il n'y a pas de phénomènes d'électro­

endosmose ni d'interaction entre molécules à

séparer et le support. Ceci a été avancé pour

expliouer l'obtention de bandes étroites et

symétriques, l'asymétrie d'une bande permet

donc de suspecter une hétérogénéité dans sa

composition.

La séparation des protéines est uniquement

basée sur un effet de "crible". La possibilité

pour des molécules de passer à travers un tel

"tamis" dépend d'une part de la taille et de

la forme des pores de ce tamis, et d'autre part

69

BISACRYLAMIOE

==H

'C=C-H/ 1

H CcY 'N-H

1H- C-H

1o N-H~ /

H C, 1C=c-H

/H

II1II

H,C=C-H

/ 1H C-'/ ,

o NH2

ACRYLAMIOE

tLECTRON, H HNON-APPARlt 1 1

• --------C=C1 1H C-'/ ,o NH2

Tt TRAMt THYL t THYL~ NEOIAMINE ITEMEOI

CJ

HJC HHHHHH, 1 1 1 1 1 1N-C-C-C-C-C-C.

/ 1 1 1 1 1 1HJC H N H C H C

/, -'/, -'/,HJC H,C 0 NH2 0 N - H

1H-C-H

1o N- HH ~C/

, 1C-C-H

/H

HJC H H H H H H, 1 1 1 1 1 1N-C-C-C- C 0 ------------C =C

/ 1 1 1 1 1 1HJC H N H ,C H C

/, ij' -'/,HJC HJC 0 NH2 c:::J-ti!!I:!l. 0 N - H

1H-C-H

1o N-HH ~/

, 1C=C -H

/H

HJC H H, 1 1

N-C-C/ 1 1

HJC H N/ ,

HJC CH,CJo

HJC H H CHJ, 1 1 /N-C-C-N

/ 1 l ,HJC H H CHJ

+( NH.12 (50,)2

PERSULFATE O"AMMONIUM

+

Fig.15 - Structure et Polymérisation

(type vinyle) du gel de Polyacrylamide

selon TANAKA (182 J.

70

de la taille et de la configuration spatiale

des molécules la taille c'est-à-dire la masse

moléculaire paraissant être le facteur le plus

important.

Pour une structure spatials donnée, on considère

que la mobilité est inversement proportionnelle

a u log 1 0 deI a ma a s e.m 0 l É: cul air e (2 061 207) .

Nous verrons qu'il y a certains amendements à

apporter à cette notion. Le diamètre des pores

dépend essentiellement de la concentration totale

en acrylamide (T), la concentration en bis n'in­

tervenant que pour une faible part.

Le gel de polyacrylamide présente une certaine

élasticité car l'on constate qu'au cours de

l'électrophorèse, des molécules de diamètre su­

périeur à celui des pores pénètrent dans le gel.

On peut donc supposer qu'il a une certaine "ouver­

ture" des pores au cours de la migration. Ce

phénomène d'élasticité a été rendu responsable par

ailleurs de l'absence de diffusion, après arrêt

de l'électrophorèse, les pores se ressérant sur

les molécules.

4.1.1.2.PRII\JCIPES.

- Le pouvoir de séparation dans un tel système

repose sur un double principe

+ séparation par électrophorèse,

+ et effet de tamisage des molécules.

Les forces de friction dépendent du rapport

entre la dimension de la molécule et le diamètre

des pores du gel.

Ouand le diamètre apparent de la molécule est

petit par rapport à celui des pores du gel, la

résistance de freinage est faible quand le

71

diamètre est voisin de celui des pores, elle

devient pratiquement infinie. Or, pour un gel

à 7,5 ~, le diamètre des pores est d'environo

50 A ( 186 ) et l'on connait le

diamètre et la longueur de la plupart des pro-

téines.

Pour séparer les molécules, on peut jouer sur

deux paramètres

+ la porosité du gel,

+ le tampon dont l'ajustage du pH permet de

modifier la charge des molécules à séparer.

- L'effet de tamisage des molécules est valorisé

par l'emploi d'un gel à gradient continu de

concentration. Ainsi, les protéines migrent pro­

gressivement des pores les plus larges vers les

por8S de plus en plus petits.

L'électrophorèse aide ainsi la migration. ~ais

la séparation terminée, les molécules se trouvent

arrêtées au niveau des pores dont la taille cor­

respond à leur dimension moléculaire.

SLATER ( 171 ) proposa le premier ce pro-

cédé de neilleurs résolution dans la sépdration

des protéines. Il faisait polymériser, entre deux

plaques de verre, un gel de polyacrylamide dont

la concentration suivait une progression linéaire

entre 5 et 20 %.

MARGOLIS et KENRICK 128 utilisent une

conc9ntration de gel croissant de 4 à 20 % ou

de 4 à 24 % et décrivent un procédé de prépara­

tion du gradient de concentration de gel.

72

Pour notre part, nous avons choisi de travailler

en gradient d'acrylamide avec différents interval­

les de concentration selon la nature du problème

à résoudre.

4.2. ELECTROPHORESE EN GEL DE POLYACRYLAMIOE - SODIUM

OODECYL - SULFATE (ACRY /SOS).

4.2,j. OEFI~JITION.

De nombreuses protéines sont oligomériques et contien-

nent plus d'une chaîne polypeptidique. Grâce à une

variante de l'électrophorèse en gel de polyacrylamide,

appelée électrophorèse en polyacrylamide - SOS, une

protéine oligomérique peut-être dinociée en sous-unités

et la masse moléculaire de ses sous-unités déterminée

( 206, 207 ) .

Les protéines à séparer sont traitées avec un détergent,

le sodium dodécyl-sulfate (SOS) qui les dissocie en

sous-unités et déroule complètement chaque chaîne

polypeptidique pour former un complexe entre le poly­

peptide et le SOS. Dans ce complexe, la chaîne poly­

peptidique est recouverte d'une couche de mo!êculs5 de

SOS, dont les chaînes hydrocarbonées sont solidement

liées par des liaisons hydrophobes à la chaine poly­

peptidique ; ainsi, les groupements (sulfate) chargés

(-) du détergent sont exposés au milieu aqueux. Dans

ces complexes existe un rapport constant entre SOS et

protéines (environ 1,4 : en poids). Ces complexes

ne diffèrent donc que par leur masse. Ouand une proté-

ine monomérique traitée par le SOS est soumise à une

électrop~orèse dans un gel contenant du SOS, sa vitesse

de migration n'est fonction que de la masse de l'en­

semble polypeptide-SOS.

73

Pour calibrer le gel, des protéines 6talons

de masse moléculaire connue sont soumises au même

processus.

C'est sur la base de ce principe largement décrit

et utilisé, depuis les premières publications faites

par SHAPIRO et Coll. en 1967 [164 ), !~EBER et

OSBORN en 1969 [ 206 ), LAEMI'1LI en 1970 111 J.

que nous avons choisi de travailler.

4.2.2. TECHNIQUES.

l),u début" nous avons essayé la rrise

au point de cette technique avec du matériel

déjà préexistant au laboratoire. C'est-à-dire

des cassettes de gel de oolyacrylamide déj~ orêtes

~ l'emploie [cassetes PAA 4/30 de chez PHARMACIA).

Cette mise au point s'est avérée peu concluante

cf . Ch. Résultats Discussion}. Nous nous sommes

donc inspirés d'autres méthodes, qui consistaient

en la préparation des gels et au montage des plaques,

sur place au laboratoire.

4.2.2.1. TECHNIQUE COMMERCIALE Electrophor~se

sur gel de oolyacrylamide, gradient de 4 ~ 30

SOS 0,2 ';, PH = 7,4 (PA.A 4/30).

4.2.2.1.1. PL,A,DUES Dt VERRE.

Nous avons utilisé des Dlaques de verre de gel

dont le gradient va de 4 à 30 '; [PAA 4/l0), et

elles sont délivrées toutes prêtes dans le com­

merce [PHARMACIA). Le gel est emDrisonné entre

deux plaqUES de verre garantissant une épaisseur

74

uniforme de 4,9 mm. Leur dimension est de

82 x 82 mm. Elles sont limitées latéralement

par de petites baguettes de caoutchouc maintenues

par de l'adhésif.

4.2.2.1.2. REACTIFS.

TRIS

Acétate de Sodium ..

E D TA .

S D S •••••••••••••

TRIS - HeL .

E D T A.

S D S ...

PM ercapto E ·i::h~nol. ..

0,04fVJ

0,02 M,pH 7,4

2 mM

o, 2 ;

10 mM, pH 8,0

m"1

2 , 5

5

4.2.2.1.3.PREPARATION ET DEPOT DES ECHANTILLONS.

Les échantillons sont solubilisés dans le tampon

échantillon, et chauffés pendant 15 mn à BO°C

ou 3 mn à 100°C. Après voir ajouté quelques

gouttes de saccharosa ou da glyc6rol p des dépots

de, 10 à 30 fI (en fonction de la concentration

en protéines), sont effectués à la micropipette

directement à la surface du gel.

4.2.2.1.4. MIGRATION ELECTROPHORETIOUE.

Les cassettes de gel "PAA 4/30 gradient gel"

75

sont "démoulées" et les gels sont déposés sur

un MULTIPHDR 2117 LKB, alimenté par le généra­

teur LKB type 3371 C,

Des bandes découpées dans du papier filtre sont

appliquées à chaque bord du gel, et assurent le

contact entre le gel et le tampon d'électropho­

rèse.

Après une préélectrophorèse à 70 volts pendant

une heure, les échantillons sont déposés du

côté du pôle négatif (côté du gel le moins con­

centré) et l'électrophorèse est conduite à

150 volts pendant 2 heures 30 minutes.

4.2.2.1.5. REMARQUES.

Il est à noter que les kits PHAR~ACIA (PAA 4/30)

n'ont pas été utilisés dans les conditions ores­

cri tes par le fabricant. C'est-à-dire, l'utili­

sation d'une cuve à électrophorèse verticale

adaotée aux cassettes, d'un appareil Dour déco­

lorer les gels (par plectrophère), et d'un des­

sècheur De plaques. Tous ces accessoires prove­

nant du même fabricant cité plus haut.

Les techniques de fixation, coloration, décolo­

ration des plaques seront vues olus en détail

dans le chapitre qui leurs est consacré (cf"

Ch. Révélation), car gUEl. que soit le tyr:e d'p-

l e c t r 0 0 h è:: se, 0 n r e t r 0 u v e d e plu sen plu s, les

mêMes procédés de révélation.

76

4.2.2.2. TECHNIQUE ADOPTEE.

Nous avons suivi et ~odifié la technique pro­

posée en premier nar LAEMMLI (111] qui elle

même était une Modification des systèmes décrits

par ORNSTEIN (146) et DAVIS (37 J. Elle consiste

en une électrophorèse en système discontinu et

en présence de SOS.

4.2.2.2.1. FORMULE DES REACTIFS.

TRIS - Bi:l!:',p •••••••••••••••••••••

Glycine .

SOS . °,1

Glycérol..................... 10

f->. M 8'" r. a IJ t 0- Eth i3 n <:1 1. • • . . • • . • • • • •. 5

SOS ..........................• 2,3

Oc; ( P IV ]

Oc; (V IV)

TR l S - H rl .

C = ACRY-STOCK :

0,0625 M pH 6,8

Acrylamide 29,2

Bisacrylamide................... 0,8

Eau Distillée Q.S.P 100 ml

TR l S - H rl .

SOS .

0,5

0,4

fVJ pH 6,8 .l:i­

\

TRIS - Hel ...

S D S •••••••.

1 , 5

0,4

77

M pH B,B li-

';

10 ~ dans de l'eau distillée.

Cette solution doit-être préparée toutes les

semaines et conservée à 4°C à l'abri de la lumière.

~ 0,1 ; (PlV) dans de l'eau distillée.

H Solution de fixation

~ ét ha n 0 1 .

Eau Distillée .

Acide Sulfosalicyque.

Acide Trichloroacétique ....

150 ml

350 ml

17,25 g

57,50 g

0,1 '; de Bleu de coomassie R 250 dans 100 ml

de solution de décoloration J.

J "Solution de décoloration

Ethanol ..................•..•

Ac i de Ac é t i qu e .

500 ml

1 60 ml

Eau distillée Q.S.P 2000 ml

JfTE~EO : ê utiliser non dilué.

li-: A conserver à 4°C.

li- li-: Ces formules ne sont données qu'à ti tre

indicatif, car elles peuvent varier comme nous

le verrons dans le"chapitre Révélation':

78

4.2.2.2.2. MATERIEL.

Nous avons utilisé un appareil classique pour

électrophorèse en plaque verticale 179 ).

Nous avons modifié et fait construire cet ap­

pareil par les Usines PLASTIMARNE. La cuve a

été modifiée de telle sorte que nous puissions

utiliser des plaques de hauteur différente

(Réservoir du haut mobile), et faire migrer

simultanément deux plaques d'acrylamide

Fig.16 ).

La présence d'un joint en plastique, sur le

pourtour de l'encoche du réservoir du haut as­

sure l'étanchéité. En effet, les plaques de

verre viennent écraser le joint, et nous évite

l'adjonction d'agarose, comme dans les appareil­

lages de type classique.

Les plaques de verre utilisées pour couler les

gels d'acrylamide ont été découp8es p~r les Ets.

PONSINET selon nos indications, et les dimensions

suivantes (Fig. 17 ).

- Plaque avant 160 x 180 x 5 mm, avec

une encoche profonde de 30 mm et longue de 140

ou 138 mm en fonction du type d'électrophorèse

(10 ou 20).

Dans le cas d'une plaque servant à une séparation

en double dimension 20), l'encoche de la plaque

79

A

B

Fi". 16 - A

S

APPAREIL !-\ F:LECTROPI~onESE En PLAnUE VEHTIC:ALE.

?RESE-,;TATIOiI CEJ.JEHALE DFS APPAHEILLP.{'-ES U'llILHiES.

80

_ 5 'T, rTi

+,m~t

1,1

+..11

4-- --_._.. 4-- •••..-.r---

1-~O rr,['",4-- -------- •. _....

+1,1

1 5 C, :'1"'\ rn ,n"1

1

1

1111,

g 1 !) n ;r,rfl

11111,1,,

[

Î 4Ci r;l rT

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1 CJ rr, 'T,4-····~

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~ - _.1 6 iJ fTl cr, - - - - - -~

;\ D l G " I~ cc .e,' / d n t (P., C: iJ r: S fJ C) - 1 fj ]

o [) ]~ l; .1-- j l t, t Cl C 5 j t i [, fi l , B rrl E ri t d El l a 1 ''': r E r) 5 U c l Cl ;- r.: rr, S :--,

81

avant est biseautée à 45°. [comme nous le verrons

plus loin le biseau n'est pas toujours nécessaire,

(cf. Ch. Discussion).

- Plaque arrière 160 x 180 x 5 mm.

P . l:f- elgnes à 12 dents

à 16 dents

à "1 dent"

1 30 x 1,5 mm

1 0 x 1, 5 mm

- Intercalaires l:f. 180 x 10 x 1,5 mm

3 - Générateurs.

Nous avons utilisé deux types de redresseur

- Le générateur LKB type 3371 C.

- Le générateur SEBIA GD 2200 la tension

est règlable de 0 à 2000 volts de façon continue,

le débit de 0 à 200 mA et la puissance maximum est

de 100 VA..

L'appareil peut fonctionner en tension stabilisée,

en courant stabilisé ou en puissance constante.

Dans tous les cas, les paramètres non stabilisés

·peuvent être limités à une valeur déterminée par

l'utilisateur.

l:f Les peignes et les intercalaires sont en plexiglas

et sont fournis par PLASTIMARNE [Epernay) ou

ASSISTA.I\ICE LABO [Orsay).

82

4.2.2.2.3. ~ODE QPERATOIRE.

Les Dlaques propres ~ sont assemblées (Fig. 18

après disposition des "intercalaires". et mainte­

nues solidement en place par des pinces'

Pour obtenir une bonne étanchéité du "moule"

ainsi réalisé. nous procédons de plusieurs façons

- Soit. comme il est décrit dans la littérature.

en coulant de l'agarose chaude è 1ou2 ~ tout

autour du moule. De façon empirique. nous nous

sommes rendus compte. que pour que ce procèdé

soit efficace il est nécessaire et même conseil-

lé. d'aménager lors de la pose des intercalaires.

une ~8tite riEole sur le pourtour du moule. dans

laque~le l'agarose sera coulée

- Soit. comme nous procèdons le plus souvent. en

coulant directement. et raoidement environ 2 ml

d'aç;:lrose. dans le fond du moule. L'agarose s'in­

filtre dans les fissures. et elle se solidifie en

l'esp~ce de ~ 2 mn

Dans Le cas. les précautions ~ prendre. sont de

travailler rapidement. et de veiller ~ ce que la

surface sur laquelle repose le moule soit bien

plane.

~ Les plaques sont nettoyées de façon classique comme

pour la verrer~e de Laboratoire. c'est-à-dire avec un

détergent et r~ncées ~ l'eau distillée.

r---l. -.._... i .

Pistor',.... ---_ ..

( no u r I~ rCl [1 i E"t e >. :J ,J r '0 r: LiE l J

83

l.

1

! \ II. / \...

..- }L·~~):=~=·.-J::,,::'::=::::===~ll~.'.

A

.. Gco l Cl' i\ [: f=, '.

.~ éj." l. F:: '3! l' i ~:: r ei\

+

8

P""tq'iE-' "

c

riEnt"

f\(~arOSfé

G l ,1 1 lE!

13 " ,'~ c y ;' C; 'j C; 'J ') U r 1 r, r le LI.

84

Des solutions de gel en concentration uniforme

d'acrylamide pouvent être coulées. Pour notre

part, les meilleures résolutions (cf Ch. résul­

tats-discussions) ont été obtenues, après sépa­

ration dans des gradients de gel de polyacrylamide.

Les solutions et les proportions des composants

du gel sont données dans le tableau ci-dessous.

GEL DEGELS DE RESOLUTION CONCENTRATION

5% L 7,5% L 10% L 16% D 4,5%

au distillée 11 ,67 ml 10 ml 8,37 ml 12 ml

~olution C 3,35 ml 5 ml 6,60 ml 10,BO m 3 ml

::iolution E 5 ml 5 ml 5 ml 5 m(pH B,8)

Solution 0 5 ml(pH 6,8)

Glycérol 4,20 mà 75 %

TEMED 10 ~ l '1 0 ~ l 10 ~l 10 fJ 5 ~ l..Persulfate

50 ~ l 50 ~l 50 IJ l 50 P 50 ~ld' NH4+

Volumes 20 ml 20 ml 20 ml 20 m 20 ml

~ Le TEMEDet surtout le persulfate d'ammonium doivent êtretoujours ajoutés en dernier.

L = Solution "légère"

D Solution "dense" contenant du glycérol.

85

Nous avons utilisé des gammes variées de 8radient

A titre d'exemple. nous citerons les gradients

5 -1 6 7 • 5 - '1 E ~ et 10-16 ; que nous avons 18

plus souvent employés.

Le dispositif utilisé pour la réalisation de ces

gradients Est rG~r~senté d6ns la Fi~. 18 •

Il s'agit d'un formateur de gradient (vol. 30 ml de

chez PLASTIMARNE). Deux chambres l et II sont A~ cummu

nication par un mince canal inférieur muni d'un

robinet ~ deux voies. La chambre II communique

avec l'extérieur par un canal étroit et contient

un tJarre.3u méJco;nétique

lanEe.

c'est la chambre de m~-

Les volumes ~ utiliser sont déterminés par la

dimAnsion du gal et la forme du gradien~ (exoo-

nentiel ~u linéaire1.

Four un ~81 dB dimension

". Gra d i el tex p 0 n 8 Il t i e l------------------._-

1 1 0 x 1 4 0 X '1. 5 fT) ITI

on utilise 8 rn l d e3 Cl J. LI .-

tion dense (0) et 16 ml de solution légère (~J.

Les 8 ml de solution dense sont transvasés I:J ans

la chamb0e de mélange. qui est aussitôt obturée

par un piston. de façon è maintenir le volume

constant.

Le rob i n ,~t s? p a r:Hl t les de u x cha mb r es est 0 u 'i e" t

de façon ~ chasser l'air contenu dans le cana~ dB

cornmunic~tion et à permettre le remolissage de

ca n ë l pj' } a s ,0 l ut i r. nIa p l us d en se. L es 1 E ri, l.

ci e sol u tL Cl n 1 [~ g è r f, : 0 n t :Tl 0 n tés dan s l 2 C Cl am brel •

l'32itation est mis2 en route. st la connection

avec l'extérieur est faite. La soluticn de gB1

est cou1 6 e 30 ?ond des plaoues avec un débit

car un r'o:Jinetest ver '; :-: ~j j U :3 qu' ~1

de 3 ml/cr, n.

,-, n v i r 0 n 3 cm d u

La scdutil;rl

bas ci e l a f 8 r' le,

- Gradient linéaire----------------- dans ce cas on utilise

85 bi s

12 ml de solution "dense" (0) et 13 ml de solution

"légère" [L). Nous procèdons de la même façon

que précèdemment. mais sans obturer la chambre

de mélange.

Le gel de résolution est ensuite, recouvert par

un mince film d'eau ou par de l'isobutanol satu­

rée en eau, et laissé à polymériser à température

ambiante. (environ 1 heure).

Après la polymérisation, qui est marquée par

lê formation d'un interface eau/isobutanol, le

mince film est aspiré, et la surface du gel qui

doit-être bien plane est rincée abondamment à

l'eau distillée.

La solution de gel de concentration est alors

coulée [environ 5 ml) et le "peigne" nécessaire

à la formation des puits de dépot est introduit

tout doucement en évitant d'emprisonner des bul-

les d'air. La polymérisation a lieu au bout dei

30 mm environ.-,

Après la polymérisation du 'gel de concentration,

la plaque peut-être immédiatement soumise à élec­

trophère, ou alors être conservée dans une enceinte

humide [réfrigération 4°C) pendant au moins 2 se~

maines avant d'être utilisée. Nous préfèrons

couler le gel de résolution, la veille de son

utilisation.

De nombreuses méthodes de préparation des échan-

86

tillons. sont valables dans ce genre d'électro-

phorèse 207 l. Elles ont en commun. le

fait de travailler en milieu dénaturant. par

l'introduction du mercaptoéthanol qui rompt les

ponts disulfures des protéines.

Les protéines dissoutes dans le tampon échantillon

doivent-être immédiatement soumises à électro-

phorèse.

Nous utilisons des échantillons, qui ont été

déssalés et lyophilisés. Les lyophilisats sont

repris par le tampon échantillon (solution Bl

à une concentration finale variant de 2 à 5 mg/ml.

Les échantillons sont incubés à 100 o[ pendant

2 à 3 minutes. Pour les protéines fragiles,il

est préférable de les incuber à 37°[ pendant 3 h.

Après l'incubation, agiter les solutions au

VORTEX, et ajouter 5 à 10 pl de solution de

Bleu de b romophénol à 1 L en guise de marqueur

de front.

"L'intercalaire" du bas et le "peigne" sont

retirés et les plaques de verre sont montées

dans l'appareil à électrophorèse, en veillant

à ce que le contact entre les plaques et le

joint d'étanchéité soit parfait. Les réservoirs

sont remplis par le tampon d'électrophorèse (so­

lution A, environ 500 mll en évitant d'emprison­

ner des bulles sous le gel dans la cuve du bas.

87

Les solutions d'échantillon sont déposées dans

les puits à l'aide d'une seringue HAMILTON. Les

volumes à appliquer sont fonction de la concen­

tration en protéine, et de la quantité de radio­

activité présente dans le cas des gels qui seront

soumis à autoradiographie ou à une fluorographie.

En général, nous déposons des volumes variant de

10 ~ 30 ~l (50 à 150 ~g/5oo0 à 10000 cpm).

La connection entre les électrodes et le généra­

teur est effectuée (Pôle négatif en haut) et l'é­

lectrophorèse est conduite à 30 mA/gel (ampérage

constant) jusqu'à ce que le front de migration

(matérialisé par le Bleu de bromophénol) atteigne

le bas de la plaque (environ 3 heures). Si le

voltage n'est pas stabilisé, il oscille entre 90

et 180 volts.

5 - Fixation - Coloration - Décoloration.------------------------------------

Après l'arrêt de l'électrophorèse, le gel est

démoulé avec précaution. Le gel de concentration

et le joint d'agarose sont découpés à l'aide

d'un scalp81,Après avoir réalisé une entaille en

bas et à droite du gel, celui-ci est transféré,

en prenant soin de le tenir par le côté le plus

concentré (bas du gel), dans une cuvette conte­

nant le fixateur et le colorant.

Les techniques de fixation coloration et décolora­

tion seront vues en détail plus loin dans le

chapitre consacré à cet e~fet (Ch. Révélation).

88

4.2.2.2'4' RESULTATS ET EXPLDITATIDI\J.

- Après coloration et décoloration, les fractions

protéiques apparaissent sous forme de fines ban­

des colorées, dont le nombre et l'intensité dé­

pendent de la nature et de la concentration de

l'échantillon à analyser.

- L'exploitation première de cette technique est

la dstermination des masses moléculaires relati-

ves des différentes fractions orotéiques. En

effet , SHAPIRO et Co l 1. [164 ont démontré qu'il

existait une relation linéaire entre le loga­

rithme de la masse moléculaire et la mobilité

électrophorétique de chaque chaIne polypeptidique

[expsrience faite sur 11 protéines), lorsque des

protéines sont séparées dans un gel de polyacry­

lamide -- SOS.

La F,énéralisation de ce principe par \<JEBER et

QSBDRN (206), laisse apparaître que par cette

technique, les masses moléculaires oes polypep­

tide peuvent être déterminées avec une précision

de plus ou moins 10 ~o •

Nous proc§dons à la détermination des masses

moléculaires de la façon suivante

Lors de toute migration électrophorétique, des

protéin8s étalons de masse moléculaire connue

sont traitées de la même façon que les échantillons

é analyser. Nous disposons de deux "Kits"dont les

comD~sitions sont les suivantes

89

- Etalons de haute masse moléculaire (PHAR~ACIA)

Thyroglobulin~. 330 000

Ferritine 220 000

Albu-nine. 67 000

Catalase. 60 000

Lactate deshydrogénase 36 000

Ferritine ............ 1 8 500

Phosphorylase B. 9 4 000

Albumine ... 67 000

Ovalbumine. 43 000

Anhydrase carbonique. 30 000

Inhibiteur de trypsine. 20 1 00

Lactalbumine ........... 1 4 400

~ans un premier temps, on déter~ine la mobilité

relative des protéines étalons (= Rf).

Distance de migration

RfHauteur du front de migration

ou avec plus de précision

Distance de mi~ration

RfLon~ueur de gel apr8s décoloration

LCJllgueur avant colorationx

Hauteur du front

Dans un deuxième temps, nous reportons sur un

papier semi-logarithmique en ordonnée coordonnées

logarithmiques) les masses moléculaires, et en

abscisse les "Rf".

supports

en plaque

90

Une fois la droite d'étalonnage établie, on mesure

les distances de migration des polypeptides de

masse moléculaire inconnue et on calcule leurs

Rf. en se reportant à la droite d'étalonnage, on

détermine la masse moléculaire inconnue.

Lors de la mesure des distances de migration, nous

prenons comme point de repère le milieu de la

bande à déterminer.

4.3. L'ISOELECTROFOCALI5ATION (I.E.F.).

4.3.1. DEFINITIDN.

Le processus d'électrophorèse, peut-être le plus

ingénieux et le plus efficace pour séparer les

protéines, est la focalisation isoélectrique ou

électrofocalisation. En effet, depuis les travaux

de SVE'JSSON 180), et de VESTEBERG 197

qui ont défini les principes généraux des gradients

"naturgls" de pH, cette technique est devenue une

méthodg de séparation des plus utilisées-

L'I.E.F. peut-être réalisé sur différents

(liquide, ap;arose, sephadex, acrylamide),

horizontale, ou en tube vertical.

4.3.2. PRI',ICI;:JE.

Si on applique un courant électrique continu à un

milieu non soumis 3 des courants de convection, et

contenant des substances ampholytes (c'est-à-dire

possédant en même temps des charges positives et

négatives) de masse moléculaire faible, il en

résulte la formation d'un gradient de oH.

91

En même temps, les substances ampholytes (ou ampho­

tères) de masse moléculaire élevée (par exemple

les protéines) migrent jusqu'à ce qu'elles aient

atteint la zone de pH égale à leur pH iso&lectrique.

A ce moment leurs charges électriques sont nulles

et elles ne migrent plus.

Cette ~éthode permet donc de séparer les protéines

exclusivement en fonction de leur pH isoélectrique.

Les ampholytes porteurs, utilisés sont des mélanges

d'un grand nombre d'acides polycarboxyliques et de

polyamines la récartitio~ des groupes aminés et

carboxyliques dans la molécule définit le pH iso­

électrique de chaque ampholyte.

On utilise donc toujours un mélange de produits qui

recouvrent ainsi tout un intervalle de pH. et permet­

tent de ce fait la réalisation d'un gradient.

4.3.3. I.E.F. sur plaque commerciale (LKB).

Nous avons utilisé les "ampholines PAG plates"

pH 3,5 - 9,5 prêtes à l'emploi. Ce sont des gels

de polyacrylamide prêts à l'emploi contenant

l'ampholine porteuse d'ampholytes pour l'électro­

focalisation analytique.

Chaque Amoholine PAG plate est dotée de son propre

film support en plastique. Il est possible d'analyser

24-28 échantillons en une seule fois sur une ~laque

entière ou bien de découper la quantité nécessaire

pour analyser un plus petit nombre d'échantillons

et de conserver le reste pour la prochaine manipu­

lation.

92

4.3.3.1. ~ATERIEL.

L'électrofocalisation est réalisée à l'aide

du ~ultiphor LKB 2117 dont les différentes

parties sont schématisées dans la Fig. 19

L'alimentation électrique est assurée par le

générateur LKB type 3371 C.

4.3.3.2. REACTIFS.

H3P04 1 ~

l\JaoH 1 ~

solution de fixation

&olution de coloration

Solution de décoloration

4.3.3.3. MODE OPERATOIRE.

(Anode)

(Cathode)

cf. Ch. Révélation

L'échantillon peut-être déposé à n'importe quel

endroit du gel. Il suffit de plonger un papier

applicateur d'échantillon (petits carrés de

papier filtre) dans la solution échantillon

et de l'étaler sur le gel.

L'échantillon peut-être déposé sous forme de

gouttelettes à l'aide d'une seringue HA~ILToN

(5 ) 20~1) directe~ent à la surface du gel.

Les ~êches d'électrodes sont tremoées dans des

A 8

93

Fig.19- SCHEMA OU IYJULTIPH[IR LKB 2117.

A I.E.F. dans le sens de la largeur (10 cm)

et 2 fils de platine (anode et cèt~ode)

1 supoort des ~lectrodes et c~~vercle du gel

5 plaque de gel de polyacrylamide (1~m d'épaisseur)

6 réfrigération

7 cable de connection au générateur

B couvercle de sécurité

B 1. E. F .

3 et 4

9 et 1 0

dans le sens de la longueur (24 cm)

bandes de papier filtre (anode et cathode)

fils de platine (anode et cathode)

solutions d'électrolytes (H3

P04

1MG. et

NaOH 1MB) et posées le long du gel.

94

Pour obtenir un champ électrique uniforme.

les électrodes en platine sont maintenues

parallèles sur le couvercle d'électrofocali­

sation qui maintient également une humidité

constante à la surface du gel.

Après la mise en route de la réfrigération.

l'électrophorèse est conduite selon le pro­

tocole suivant

o1 0

20

3,l

40

58

68

70

80

91]

200

340

540

900

111 0

11 50

11 80

11 80

11 80

1 1 80

La s~paration est donc effectuée en 1 heure

et 30 minutes.

4 - Fixation. coloration. décoloration.

Après l'arrêt de l'r.E.F .• les plaques sont

fixées. colorées. et décolorées selon les

méthodes que nous exposerons dans le chapitre

"Révélation".

95

4.3.3.4. DETERMINATION DU pH AMPHDLINE.

Il faut connaître avec précision le gradient

de rH contenu dans le gel pour déterminer exac­

tement les pHi. et pour comparer les différentes

bandes de protéines.

Avec l'électrode de surface (LKB) nous mesurons

directement les pH à la surface du gel sans le

retirer de la plaque réfrigérante. immédiatement

après la focalisation et à température égale à

celle de la migration. Les parties actives de

la microélectrode ont un diamètre de 3 mm seu­

lement. ce qui permet de mesurer le pH à des

intervalles de quelques millimètres.

4.3.4. ELECTRDFDCALISATIDN VERTICALE EN TUBE.

Si l'électrofocalisation en plaque offre de nombreux

avantages et notamment. celui de pouvoir faire migrer

simultanément de nombreux échantillons sur la même

plaque; son utilisation comme 1ère dimension. dans

une électrophorèse bidimensionnelle soulève de nom­

breux problèmes (cf. Résultat Discussion).

Nous avons donc choisi l'I.E.F. en tube qui est certes

plus longue. quant à sa réalisation. mais qui est

beaucoup plus maniable. Les protocoles de D'FARRELL (141)

de M'lES et NIKAIDD ( 6 J. et de RIGHETTI et DRYSDALE (151,

152 J. nous ont guidé dans la mise au point et la

réalisation de cette technique.

4.3.4.1. REACTIFS.

Ur é 8 •••••••••••••• 9 ,5 M

NP 40 ............. 2 \. (P /V)0

~ 1, 6\. pH 5 - 7Ampholines ........ 2 1;D

0,4 ~ pH 3 1 0D -

,8Mercapto éthanol 5 \.D

96

Acrylamide .....•..

Bisacrylamide ... , .

28,38 ~ (P/V)

1 1 62 ;

M Solution stock de Nonidet P40 :

NP4D , .. 1 0

40 ~ (P/V)

H3

PO 4' •••••••••••

Na 0 H•.......•...•

0,0:l M

0,02 M

Ur é e ••••••.•.••••

Ampholines •.....•

9 M

\.D

97

4.3.4.2. APPAREILLAGE.

L'I.E.F. est réalisé dans un appareil classique

pour électrophorèse en tube vertical : cet ap­

pareil a été modifié par RIGHETTI et DRYSDALE

(lS1) pour obtenir une réfrigération suffisante,

et l'utilisation de petits volumes d'électrolytes

(Fig. 20 ).

Nous utilisons un appareil similaire (BUCHLER

INSTRUMENT] composé de deux compartiments dont

celui du bas est réfrigéré par une circulation

d'eau (Fig. 21 ).

4.3.4.3. MODE OPERATOIRE.

Les solutions de gel sont coulées dans des

"cannas de verre" (130 mm x 2,5 mm de diamètre

intérieur). Les tubes sont hermétiquement bou­

chés en bas par du ~arafilm~ et disposés verti­

calement sur portoir plan.

- Pour préparer 10 ml de solution de gel (envi­

ron 0,5 ml par tube), mettre dans Un Erlen de

50 ml :

Urée. ... . .... .. . .. .. 5 ,5 g

Solution L . .... . . . .... 1 ,33 ml

1\1 P 40 •.• . . ... . ... . . . .. 2 ml

H2 0 .• .+1 .97 ml• • Il • ••••••••••••• 1

Ampholine ( 5 - 7) ••• .. 0,4 ml

Ampholine ( 3 - 10) ... . o, 1 ml

98

Fig.20 - Appareil pour électrophorèse

en tube selon RIGHETTI et

ORYSOALE (151,152 )

- Compartiment cathodique ---- ---

2 - Enceinte refrigérée _

3 - Tub e s d e gel d' l . E . F . - - - _

4 - C0 mpar t i men tan 0 d i que - __ -- -

-- --

----

-~---- -----4 - Réservoir anodique~

---- ---

Fig.21 - Appareil commercial

(BUCHLER INSTRU~ENT)

3 - Tubes d'I.E.F. _

1 Electrodes-

2 - Rés e r v 0 i r ca t ho d i que - - - - ---- - -

99

- Dissoudre l'urée par agitation douce à 37°[.

- Ajouter T Er1 ED 7 iJ.l\

persulfate d'NH + 1 0 ~l ( 1 0 S)4

et mélanger rapidement.

- Après addition du persulfate d'ammonium, la

solution de gel est immédiatement coulée dans

les tubes. La solution est coulée 3 l'aide d'une

seringue sur laquelle a été adaptée un fin

capillaire.

Les tubes sont remplis (en évitant de faire

des bulles) jusqu'~ environ 1 cm du bord supérieur.

- Recouvrir délicatement le gel d'un mince film

d'eau et laisser la polymérisation complète du

gel s'effectuer pendant 1 heure.

- Après la oolymérisation complète du gel (inter­

face eau/gel visible et bien net), aspirer tou­

jours délicatement l'eau, et recouvrir les gels

par 20 à 25 (LI de solution K, qui sont à leur

tour recouverts par un peu d'eau.

- Laisser équilibrer pendant 1 heure.

2 - ~~~~_~~_e!~~~_~~~_~~~~~_~~_~!~~~~~­

l2t2Q!::§~§'

- Après avoir retiré le parafilm (extrémité des

tubes), les tubes sont disposés dans l'apoareil

à électrophorèse de telle sorte que la hauteur

maxi~um des gels soit contenue dans la chambre

de réfrigération. LEls emplacements non occupés

sont oblit~rés soit par des bouchons (en plastique)

ou par des tubes de verre.

100

- La chambre inférieure de l'appareil est

complètement remplie par la solution 0 (H 3 P0 4 ).

La solution au-dessus des gels est aspirée et

remplacée par 20 ~l de solution K, eux-mêmes

recouverts par la solution P (NaoH).

- Pré-électrophorèse

200 volts ..

300 volts ..

400 volts ..

15 minutes

30 minutes

30 minutes

Après la

rejetée,

aspiré.

pré-électrophorèse, la solution Pest

et le liquide recouvrant les gels est

- Les échantillons (lyophylisés) sont repris

par la solution K, et des dépots de 10 à 50 ~l

sont effectués à l'aide d'une seringue HAMILTON.

Une goutte de Bleu de Bromaphénol est ajoutée

dans chacun des dépôts ainsi réalisé.

- Les échantillons sont recouverts par 10 ~l

de solution Q, eux-mêmes recouverts oar la solu­

tion P.

- Le réservoir du haut est ~ nouveau rempli par

la solution P, et la connection électrique est

effectuée (cathode en haut et Anode en bas).

- L'électrophorèse est réalisée pendant

14 heures à 400 volts ou

18 heures à 300 volts

et la focalisation est cornplètée par une heure

:3 800 volts.

1 01

- Ce protocole d'électrophorèse peut-être varié

sans que la qualité des gels soit affectée. Mais

néanmoins le produit du voltage et du temps

[en heure), doit-être supérieur à 5000 et inférieur

à 10000 volts heures pour des gels de cette di­

mension, tandis que le voltage d'électrophorèse

doit-être au maximum égal à 400 volts (141,142 ).

La focalisatior achevée (anneau jaune en bas),

les gels sont aussitôt démoulés après avoir

décollé délicatement les extrémités du gel avec

une ~iguil18 fine, le5 gels sont expulsés par

pression lente et continue à l'aide d'une serin-

gue spéciale [20 ml).

Les gels démoulés seront traités des façons sui-

vantes

- Fixes et colorés (cf. [: h. Révélation)

- Equilibrés (dans la solution B) en vue

d'une seconde dimension (cf. Ch. Bidimensionnelle)

- Equilibres et congelés (pour 2 D. ultérieure)

- Montés directement sur une seconde dimen-

sion sans traitement préalable.

4.1.4.4. RESULTATS ET EXPLOITATIONS.

- Aorès la coloration-décoloration, les protéines

apparaissent sous forme de disques dont l'inten-

sité de coloration est Çonction de la concentration.

A l'extrémité acide du gel appara~t toujours une

bande jaune bisn nette, qui est due à la disso-

ciation du Blgu de Bromoohénol (bleu en zone basi-

que et iaune en zone acide).

102

Cette bande jaune, revêt toute son importance,

quand on pense, aux difficultés qu'il y a à

reconnaître les extrémités du gel, quand il

est démoulé. Cette bande jaune, nous sert donc

comme "indicateur de l'extrémité acide" point

de repère important, pour l~ séparation

ultérieure en électrophorèse bidimensionnelle

(2 [J).

- En ce qui concerne la détermination du ~ra­

dient de pH, l'utilisation d'électrode de surface

(cf. tech. commerciale) étant impossible, nous

procèdons de la façon suivante

Lors de toutes les expériences, deux "gels con­

trôles" ou "boudins blancs" sont "isoélectro-

focalisés" pour la détermination des pH.

Après l'électrofocôlisation, ces gels sont dé­

COUP9S en sections de 5mm, qui sont disposées

individuellement dans des flacons contenant 2 ml

d'eau distillée (dégazée) ou d'urée 9,2 M (pré­

parés extemporanément). Ces flacons sont bouchés

et agités pendant 5 ou 10 minutes (141,142 )

ou 2 heures 147 À température ambiante.

Les ~H sont alors mesurés à l'aide d'un pHmètre,

et une courbe d'étalonnage est tracée avec en

ordonnée les pH mesurés et en abscisse, les sec­

tions en millimètres.

4.4.L'ELECTRDPHORESE BIQIMENSIDNNELLE.

4.4.1. Définition.

Dans l'étude électrophorétique de la structure

des protp-ines, l'étape suivante qui

103

s'impose est le coupla~e des différentes techniques

que nous venons de décrire.

Nous avons donc utilisé l'électrophorèse bidimen­

sionnelle. avec en première dimension la sépara­

tion des protéines en fonction de leurs pHi (I.E.F.

en tube) et en seconde dimension. leur séparation

en fonction de leur masse moléculaire (ACRY-SOS en

plaque verticale).

Cette technique hautement résolutive. est de plus

en plu sut i lis é e (17, 3 1( 16, 7 8, 21 1 ) •

Elle permet d'attribuer simult~n6m8nt à une pr~téine

donnée, son pnint isoélectrinue et sa masse mnl~cu­

laire.

Elle est bas~e essentiellement sur les travaux de

IJ ' FAR REL L ( 14 1 ); Arvl ESet 1\] ICA l 0 0 6 ).

L'adaptation et les modifications que nous y avons

apDort~es. ont déj3 ~té décrites dans un travail

préicérlerit (35).

dLa première dimension est ef+ectuée enrtube ( cf.

Ch. Electrofocalisation verticale en tube). et la

seconde dimension est réalisé en olaque verticale

( cf. Ch ..A,CRY /SOS technique adoptée), avec dif-

férents gradients de gels de polyacrylamide (10-16

7.5-16 5 -15 ,, . 5-20 ;, 5-25 ; ) J et l'utilisation

parfois de gels homog~nes en concentration (7.5

10 ;.12.5 ';).

4.4.3. ~OOE OPERATOIRE.

Elle est identique ~ la technique décrite plus

haut (cf.

suivante

Ch. ACRY/SnS). ~ la seule différence

104

Le gel da concentration est coulé jusou'~ la

base de la fente biseautée et dans un coin on

i nt r 0 d u i t le" pei g n e à u nad a nt" pou l~ d 'n é na l! e r

un 'f-pu l L , lequel seront déposés des ét~lons

de masse moléculaire.

l_ a s gal s d' l • E • F. qui s e rOll t sou mis Fi u n 8 ,-1 (3 L! :< i ème

dimension. sont démoulés dans un tube à essai con-

tenant environ 10 ml de solution B [cont~nent du

S.O.S. et du ~erc3ptDét~a~ol auxquels on ~1Dute

quelques gouttes de Aleu de 6romophénol.

Les sels sont ainsi a.~ i tés '3 t 8 mp é rat ure arl Dia n t e

pendant au moins 30 minutes de meilleurs résul-

tats sont obtenus lorsque l'agitation d~r8 aL! moins

~z heures.

Aorès ce temos d'équilibration, les gel~ p~uv8nt

('; t r e d ire c t 8 'Tl E, r: t SOU en i S l LI 'l e d eux i è rl e ,j i m·: :1 S ion ,

ou être congelés tel quel pour une s~paratinn

u l t ér i e LI r 8 •

3 - Transfert de la 1ère dimension SUI la

2 ème d i ITI e ri S ion .

- Après l'équ:ilibratior;, le gel d'I.l:.!'. 8':1: étalé

sur une feuille de plastique rigide.

- 0,5 ml d'a~arose ~ 2 ~ dans la solution S, sont

cou l É; s da rl s l co ri go 1 e am é n a g é eau - d 8 :; sus d, g ,0 1 de.) ,._ 8 r~ e

- Le" b (J u d i ri" d' l . E . F. 8 S t t r éJI 2 f é r r! r él 'J ide 1·1 f'! rit

d a l' s l a f E' nt'?, a t Fi n li LJ V eau 0, 5 rn l ci 1 éJ fi .:0 r [J .-: le? S (J n t

cou]~s par-dessus.

105

- L'agarose se gélifie très rapidement, et main­

tient en place la 1ère dimension'

Les plaques de verre sont montées dans l'appareil

à électrophorèse (PLASTI~ARNE).

Les cuves sont remplies par le tampon A et l'élec­

trophorèse est conduite à 30 ou 40 mA/olaque

(ampérase constant), jusqu'à ce que le front de

migration attei~ne le bas de la plaque (environ

4 heures).

- Pour matérialiser le front de migration, de nom­

breux auteurs de la littérature, ajoutent quelques

gouttes de Bleu de Bromophénol ~ 0,1 ; dans le

réservoir du haut. Nous préférons équilibrer nos

1ères.dimensions en présence de quelques gouttes

de Bleu de Bromophénol.

Le "boudin" avant son transfert sur la 28me dimen­

sion est donc légèrement coloré en Bleu, et nous

obtenons Binsi dans ]a 2è~e migration, un front

plus ho~og~ne et plus fidÀle à la vitesse de migra­

tion.

- Lors du transfert de la 1ère dimension, il est

préfèrable de disooser le bout basique du gel

(pauvre en orot~ines) contre le Duit orévu pour le

dépôt des étalons de masse moléculaire.

106

- Le "boudin" peut-être disposé en contact étroit

avec le gel de concentration, et ensuite seulement

être recouvert par 1 ml d'agarose à 2 ; dans la

solution B.

4.4.4. RESULTATS ET EXPLOITATION.

- Après la révélation des plaques (cf. Ch. Révélation],

une multitude de taches apparaissent avec des ré­

partitions plus ou moins homogènes (en fonction des

ampholines utilisÉes], sur toute la surface du

gel.

Bien ou'il n'existe aucune corrélation entre la

charge d'une protéine et sa masse moléculaire, le

nombre maxi. des taches qu'on paut révéler en théorie

est égal au

par chacur-)e

59 , 141,

produit des bandes mises

des dimensions utilisées

142 ] .

en évidence

toutes seules

En oratique, et en fonction de la techni~ue d'ex­

traction des protéines, utilisée nous nous trouvons

en présence de 200 è 300 taches de polypeptides

(cf. Résultats-Discussion].

- Pour individualiser ces taches, nous avons établi.

un système de "q;rille de lecture". Les coordonnées

de cette grille sont en abscisse, les PHi déterminés.

et en ordonnée les masses moléculaires étalons.

Cha~ue tache s'insère donc dans une case délimitée

par la grille, et 00 on peut lui attribuer, et son

point isoélectriqu8 et sa masse moléculaire.

1 07

v - METHODES QE REVELATION.

Le choix de la méthode de révélation dépend naturellement

du but de l'expérience et de la nature chimique (orotéique

ou ~lycoprotéiau8) des comoosants à révéler,

5.1. METHODES CHIMIQUES.

5.1.1. REVELATIof\1 GENER.A.LE DES PROTEINES PAR LE

gLEU DE COOMASSIE.

Nous avons choisi le Bleu de Coomassie è cause de

son extrème sensibilité vis ~ vis des protéines.

Nous avons utilisé plusieurs méthodes de coloration

et décoloration, lar~ement décrites dans la lit­

térature.

lJ.. Méthode 1 selon Il! EBER e t 0 S 90 R f\1 [207).

- Solution de coloration.

Bleu de Coomassie R 250 .. 2,5 mg

Mé t ha n 0 1 .

Acide Acétique ...

Eau Distillée Q.S.P.

- Solution de décoloration.

5 [J 0

70

10CI[J

ml

ml

ml

Mé t han 0 l . . . . . . . . . . . . . . . . 400 ml

Acide Acétique.......... 7[J ml

Eau Distillée Ci.S.P 1000 ml

Après l'électrophorpse. les ~els sont immergés

dans la solution de coloration (les "boudins"

d'I.E.F. sont démoulés dans des tubes à essai

contenant déjà le colorant. et les plaques dans

des bacs ~ coloration). pendant 3 heures sOUs

agitation.

108

Les gels sont ensuite décolorés par la solution

de décoloration. avec des changements répétés

de la solution jusqu'à ce que le fond des plaques

soit transparent (environ 6 à 12 heures).

~ Méthode 2 selon VESTEBERG (198) ~EIS~JE~ et Coll. (150).

Dans cette technique qui présente plusieurs va­

riantes, les fixations et les colorations sont

effectuées à 60° C. Les solutions et les variantes

sont exposées dans le tableau de la Fig. 22 •

- Oans les variantes A et E, il est préférable

de dissoudre le Bleu de Coomassie, d'abord dans

le méthanol.

- Dans les protocoles B,C et 0, dissoudre d'abord

le Bleu de Coomassie (G 250) dans environ 800 ml

d'eau, et ajouter l'acide perchlorique ~outte ~

goutte en agitant vigoureusement la solution.

- Il est ~ noter que la variante B est très raoide,

car elle ne nécessite OAS de temos da j 6 coloration J

et dans cette procèdure, pour éviter que les bandes

ne s'estompent trop rapide~ent, immerger les gels

dans la solution de coloration à 1 ; dans de l'eau

distillée.

J1. "1éthode 3 selon LAEM:Yï!~I (111).

- Les gels sont immédiatement fixés et colorés

pendant 20 minutes dans une solution de Bleu de

Coomassie à 0,1 ; dans 50

acétique.

d'acide trichloro-

- Ils sont ensuite décolorés par agitations répé-

tées dans de l'acide acétique à 7 ", .

109

VARIAI\JTES

r-- 11

1SOlUT Iû i~ [JE FIXATION A B C 0 E

'~

Ac. Trichloroacétique [ g ) - 147 1 47 1 147 -

Ac. Sulfosalicylique [ g ) - 44 44 44 -

Eau [m l ) - 910 910 910 -

Temps d'incubation en mn 30 :30 J LI

t----'--f--SOLUTION DE COLORATION

11

1

1

11

Coomassie G 250 [ g J - 0,4 0,4 IJ.4

1

-Bleu de

Bleu Coomassie R 250 [ g ) 0,9 - - - 0,9de1Trichloroacétique [ g ) 32 - - - 32Ac.

[ g ) 107 - - - 1 n 7Ac. Sulfosalicylique- - - 39 -

Urée [g)

[ rn l ) 268 - - - 268frlf~thanol

E'au [m l ) 664 970 970 932 664

- 3D 30 29 -li c . Perchlorique [ 70 > F' IV ml),

Temps d'irlcubation en mn :30 30 30 3D :'\0

1SOLUTION DE DECOLO~ATION

Ac. Acstioue [m 1) 50 - 50 50 80

Ethanol [ ml J 70 - 70 70 255

Ethylacétete (m 1) '100 - 1 00 1 00 -Eau [m 1) 780 - 780 780 665

--f------

iTemps total Heure s 24-481 en 6H3o 1 7 -24 5-23

148 H

Fig.22 Tableau des différentes procèdures de la

méthode 2.

~ Méthode 4 Note d'aoplication LKB 250 (117:,.

110

- Solution de fixation.

Ac. Sulfosalicylique ..

Ac. Trichloroacétiau8.

1 7 ,5 g

57.5 g

r1éthanol .

Eau distillée 8.S.P.

- Solution de coloration.

150

500

ml

Ml

0.115 g de Bleu de Coomassie dans 100 ml de

solution de décoloration.

- Solution de décoloration.

Eth a n 0 l . . . . . . .

Ac. Acétique ..

Eau distillée Q.S.P.

500 ml

1 60 ml

2000 Illl

Les gels sont incubés dans la solution de coloration

toute une nuit, et décolorés par changement répétés

de la solution d8 décoloration.

- Chacune de ces méthodes de coloration donnant

de bons résultats, nous les avons utilisées alter-

nativement sans altération dans la reproductibilité

des e x ri é rie n c es le choix de l'une ou l'autre de

ces techniques étant surtout conditionné oar le

temps qui nous est imparti.

- Les ~els décolorés avec les protéines apperais­

sant e~ Bleu, sont photographiés et traités en vue

d'une conservattor1 (cf Ch. Technique cons~rvation).

5 . ') . ;:. R EVE LAT l 0 ~J 0 ES GLye 0 p RCl TEl NES •

L fi t (ê! c h n i que ,j e col 0 r él t ion cJ E-! S g lys 0 p r CI t é i ne:; est

1 1 1

cel18 décrits par FAIRBANKS 44 techn::que

al: P.A.S. (Pg,iodic-Acid-Scl1iff).

':; .i . 2 . 1 R E il, CTIF S .

Solution de fixation.

fI é -;..:. han 0 J. • • • • • • • • • • .. • •

~c. Su~fosalicyliqu8.

AC. Trichloro,3c~;tique.

tau [Jist·lll~~e .

F3:srosanil1~a [FUSCHINE GURR)+

:/'!.',=j~liSLJlfi~:(? cJ;,> ~,Ja /K

1 r 1 C 0 fi C e n t r ,S • • • • • • • • • • •

1 58 ml

1 7 , ;'5 'J6

5 7 , ~; a",

35D ml

ml

,~. r;,: t El r ~: 1J ~o:i u l ,3 U c h él n g 8 mg rl i: d 8 t e i n te.

[h~rbon 3ct1f . U, 2 G

;. il t r E r S i) lut ion i ,n col 0 :' ~~ ) ,

-- 'i >: e r l 8 3 ;:, <0) l~, cJ;, "1 5 l a :i C 111 t i 0 ri (! 8 fi>' =j t :L 0 n

:Jp,ndant '~c 'J,n"

,- l'ince)":J l'2fl!.i eJ:Lc:cill IJc 2 )<' 1(1 G:n.

J3in (J'Hf'], ,°1 1"

dans l'acide aC:F:ti'~1ue à

Cj r! l'n,~ 2' LOC El t ,j l' Cl b s c uri t {~ .

l ' ? ci 1,1 dis t i l l 2 E-, , U '1 qu',~ c: e q!j' i ln' y

p l IJ~; cJ CCl ::' r r:: c :i pit § ,3 'J ,_ C 'AgNO]

- Ajouter le réactif de SCHIFF

et à l'obscurité.

50 mn à 4° C

1 1 2

- Rincer avec du Na2

S2

05

à 1 ~. 3 à 4 fois et

conserver dans cette solution ou dans le SCHIFF.

5.1.2.3. GELS CONTENANT OU S.O.S.

Les difficultés de coloration des gels contenant

du S.O.S .• avec la méthode ci-dessus. nous ont

contraint à modifier celle-ci de la façon sui­

vante

- Fixer les gels pendant 24 heures. dans la so­

lution de fixation sous agitation. et en renou­

velant 3 à 4 fois la solution.

- Laver abondamment à l'eau du robinet. en continu.

et vérifier la diminution du sodium au photomètre

de flamme (vérification de l'élimination du S.O.S.).

- Oxydation par HI0 4 à 1 ~ dans l'acide acétique

à 7 ~ pendant 1 heure à l'obscurité.

- Laver à l'eau du robinet en continu pendant

48 heures et continuer avec de l'eau distillée

jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de pré~iDiLé des

eaux de rinçage par l'AgN03

.

- Ajouter le réactif de SCHIFF. 1 heure à l'obs­

curité et à 4° C.

- Laver 3 à 4 fois par Na 2S 205

à 1 ~ dans Hcl

0.1 N et conserver dans cette solution ou dans

le réactif de SCHIFF.

Après ces traitements. les glycoprotéines appa­

raissent colorées en rouge-orangé.

5.1.3. REVELATIol\J SIMULTANEE DES PROTEINES ET DES

GLYCOPROTEINES EN ACRY/S.D.S. : COLORATION

AU " STAINS-ALL" ( SA"~h.

La technique utilisée est celle décrite par

L.E. KING Jr. et M. MoRRISol\J (119).

113

Fixation des gels dans l'isopropanol 10-25 ~o •

- Lavage intensif avec de l'isopropanol à 25 ~

18 - 36 heures. On peut chauffer à 56° C pendant

1 - 2 heures pour éliminer le S.O.S. (bien élimi-

ner le S.O.S. car des traces supérieures à 0,001

P811v'8nt inhiber la coloration).

- Coloration :

- Solution mère

rnamide.

SA 0, 1 ; ( P IV) dan s For-

- Solution de coloration:

Solution mère. .. 2,5 ml

Formamide. · . . . 1 0 ml

Isopropanol. · . . . . . 50 ml

TR IS .. . . . . . . ·. . . . . 1 5 mM

Ajuster le pH à 8,5

Coloration 12-18 heures à l'obscurité.

- Décoloration dans l'isopropanol à 10 ;, 18­

36 heures à l'obscurité.

Les protéines apparaissent colorées en rouge, et

les glycoprotéines en bleu (si elles contiennent

au moins 10-100 ng d'acide sialique) .

• SA 1 - ETHYL - 2 - 3 - 1 - ETHYLNAPHToL (1,2 d)

THIAZoLINE - 2 - YLIoENE - 2 METHYLPRoPENYL ­

NAPHTO (1,2 d - BRolVIURE DE THIAZoDIUI"I)

(KODAK) .

114

5.2. METHODES UTILISANT DES RADIOELEMENTS.

Devant les difficultés de détection des glycopro­

téines par les procédés de coloration chimiques

(cf. Ch. Résultats discussion), nous avons mis au

point et adopté les techniques d'autoradiographie

et de fluorographie décrites par SONNER et LASKEY (20,112).

5.2.1. AUTORADIOGRAPHIE-FLUOROGRAPHIE.

Les radioisotopes que nous avons utilisés sont

le carbone 14 (14 C) et le tritium (3 H). Les deux

isotQoes sont émetteurs de particules ~, avec

14 .. d 5730 'pour 19 C, une demle-vle e . annees et une

énergie maximum (I: max ) de 156 KeV, et pour le 3 H,

une demie-vie de 12 années et une Bnax de 18.6 KeV.

5.2.1.1. PRINCIPES.

Les particules ~ émises par des radioisotopes

sont capables d'impressionner une émulsion pho­

tographique lorsque leur Emax est suffisante.

14Lorsque des gels d'acrylamide contenant du C

sont mis en contact avec un film sensible aux

rayons X, les particules @ émises impressionnent

directement l'émulsion photographique: dans ce

cas il3du H,

s'agit d' AUTORADIOGRAPHI5 Dans le cas

la trop faible énergie (E max : 18,6 KeV)

des oarticules ~, ne permet pas une imoression

satisfaisante des films, lorsqu'ils sont mis

directement en contact.

Par contre, la converBion des particules ~ en

photons lumineux, par l'intermédiaire d'un li­

quide scintillant (PPO), permet d'obtenir une

impression satisfaisante des films dans ce

115

cas il s'agit d' AUTORADIOGRAPHIE EN SCINTIL­

LATION ou FLUORoGR~pHIE.

Pour notre part, quel que soit le type de

radioélément présent dans les gels (14 C ou 3 H),

nous procédons ~ une fluorograpnie, ce çci nous

pernet de racourcir le temps de contact.

5.2.1.2. REACTIFS.

- oiméthyl Sulfoxyde (D.~.S.o.) pur

- Diphényl 2-5 oxazole (PPO) à 20 ; (P/P) ou

à 22,2 ; (P/V) dans du D.M.S.O.

5.2.1.3. MODE OPERATOIRE.

- Juste aorès l'électrophorèse ou après la

décoloration, tremper le gel dans environ 20 fois

son volume en D.M.S.o. pur (1er bain) 30 mn.

2 - 2ème bain de D.M.S.o. pur, 30 mn.

3 - Tremper le gel dans 4 volumes de P.P.O. à

20 ; (P/P) dans D.M.S.o. pendant une nuit ou

3 h e lJ r e s a u 'Tl i ni fTl um.

4 - Tremper le gel dans un bain à 50 ; d'eau

et 50 ; de D.M.S.o. pendant environ 10 mn.

5 - Immerger le gel dans de l'eau pure pendant

heure.

6 - Dessécher le gel sous vide ( voir"technique

de conservation").

'116

7 - Mettre le film en contact et placer le tout

è - 20° C ou - 70° C (voir "~ise en contact").

5.2.1.4. MISE EN CONTACT.

Nous avons testé différent films è RX, et nous

utilisons couramment le"X-OMAT-R" de chez

KODAK. La mise en contact étroit du gel et du

film s'opère dans un système de presse.

- !~~_~l~~~~~ le gel desséché sur un support

solide (WHATMAN 3), et le film sont pris en

"sandwich" entre deux plaques de verre épaisses

(découpées à la dimension du gel), et mainte­

nus solidement en place par du sparadrap

Le tout est emballé dans une feuille d'alumi­

nium, puis dans un cache noir, lui même emballé

è nouveau dans de l'aluminium.

- ~~~~_~~~~~~~ Le gel et le film sont maintenus

étroitement en contact dans une "cassette spéciale

film radiologique" (COMPAGNIE GENERALE DE

RADIOLOGIE) 13 x 18 cm, munie d'écrans renfor-

9ateurs (Micron 5,13 x 18 CGR). Le tout

est emballé dans 2 ou 3 feuilles d'aluminium.

Les systè~es de contact ainsi formés, sont

entreposés ~ - 20° C ou - 70° C. Les délais

d'expDsition pour obtenir des fluorogrammes

corrects varient de 3 à GO jours, en fonction

de la nature du radioélément, et de la quan­

tité de radioactivitR déposée.

Toutes ces manipulations peuvent être effectuées

en éclairage inactinique. Pour des raisons de

définition de l'image (Résultats-Discussion)

nous avons choisi d'opérer dans le Œ~!~_~~~~!~t.

117

5.2.1.5. REVELATION.

Après les délais d'exposition, les films sont

révélés comme en photographie classique à 20° C.

1 - Révélateur (KODAK LX 24) 5 mn

2 - Bain d'arrêt [Ac. Acétique 1 ~/H20) 30 sec.

3 - Fixateur (KODAK AL 4) 1 0 mn

4 - Lavage abondant à l'eau du robinet 20 à ~o mn.

5 - Séchage à température ambiante.

- Les deux premières étapes sont effectuées

dans l'obscurité la plus complète. A partir

de la 3ème étape, on allume la lampe inacti­

nique (orange), et le film n'est exposé à la

lumière du jour, qu'après un premier rinçage

à l'eau (10 mn).

- Lors des manipulations, il faut éviter de

toucher la surface du film avec les doigts.

Il faut le prendre toujours par les extrémités.

- Après la révélation du film, le gel peut-être

reexposé à nouveau (voir "mise en contact"),

si l'on estime que la définition de l'image

n'est Das suffisante.

5.3. QUANTIFICATION.

5.3.1. DETECTION DE LA RADIOACJIVITE.

Après électroDhorèse et décoloration, les gels

décoUDPS en sections fines ~ l'aide d'un scalpel

( Les "boudins" d'I.E.F. en section de 5 mm, les

plaques en sections de 10 x 5 mm).

Les sections de gel sont traitées des façons

suivantes

- Introduire les sections de gels dans des

fioles et les traiter suivant l'un ou l'autre

des procédés suivants

a - Ajouter 1 ml de Soluène 350 (PACKARD) et

laisser dissoudre à 50° C, puis ajouter le mélan­

ge scintillant (5 ml).

b - Dissoudre les gels dans 1,5 ml d'ammoniaque

à 10 ; et ajouter le mélange scintillant.

Les préparations en milieu alcalin (Soluène,

Ammoniaque) ont tendance à donner de la chimi­

luminescence. Pour l'éviter ou la réduire, neu-

lU

tralissr par 0,1 ml d'Hel 1 N, ou bien utiliser

un mélange scintillant comme le Dimilune (PACKARD)

bien adapté aux échantillons basiques (169 ).

2 - Dissoudre les gels à 37° C dans un mélange

(1 ml) constitué par 19 volumes de H2

02

à 30

et volume d'ammoniaque à BB ~o •

Ajouter ensuite le liquide scintillant (5 ml)

( 1 1 2 ).

- Le 'Tl é l a n g e sei nt i lIa nt est le" REA 0 Y- S 0 1_ V EP "

de chez BECK,I'1,l\N.

- La radioactivité est déterminée par passags

dans un compteur à scintillateur liquide type

SL 400~ INTERTECHNIOUE.

5.3.2. ENREGISTREMENT DENSITOMETRIOUE.

Des essais de quantification ont été réalisés par

119

passage des gels décolorés, desséchés sur un support

transparent (voir "technique de conservation") ou

des fluorogrammes sur un densitomètre (CELLDMATIC 2

SEBIAJ.

VI - TECHNIOUES DE CONSERVATION.

Les besoins d'exploitation ultérieure des gels d'acryla­

mide nécessitent des méthodes de conservation bien adap­

tées à la nat~re du gel.

6.1. CONSERV~TION EN MILIEU LIQUIDE.

Les gels en tube (I.E.F.) après décoloration suf­

fisante, sont introduits dans des tubes en verre

(150 x 5 mm de diamètre intérieur),

l'eau pure ou du glycérol à 3 ou 10

contenant de

~o •

Les tubes sont bouchés aux deux extrémités et le

gel peut être conservé ainsi plusieurs mois sans

altération de la coloration.

6.2. CONSERVATION SUR SUPPORT SOLIDE.

La nécessité d'avoir des gels bien secs, lors des

techniques d'AUT~RADIDGRAPHIE et de FLUOROGRAPHIE,

nous a poussé ~ rechercher des techniques de sécha­

ge [qui sont en même temps des techniques de con­

servation) .

6.2.1. METHODE LI<B (117 ).

* Apr~s la décoloration, le gel (en plaque) est

immerf,é pendant 1 heure dans la solution de con­

servation qui est du glycérol à 10 ; dans la solu­

tion de décoloration (voir méthodes de Révélatioll

méthode 4).

1 20

- Poser le gel sur une plaque de verre et le

laisser sécher à température ambiante pendant

une nuit, ou pendant 3 à 5 heures à 50° C. Le

gel doit présenter alors une surface collante.

- Prendre une feuille de plastique, et l'appli­

quer sur la surface collante du gel, en évitant

toute bulle d'air entre le plastique et le gel,

à l'aide d'un rouleau de caoutchouc (tels ceux

utilisés en photographie).

~ Le sel est immergé dans une solution de gly-

eérol à 3 ( V IV ) , et déposé sur une plaque de

verre entre deux feuilles de cellophane. La pla­

que est mise à 40° C (étuve) pendant 1 nuit.

Les feuilles de cellophane sont retirées le len­

demain, et on obtient un film dracrylamide rigide.

Les procédp.s que nous venons de décrire sont très

bien adaptés à des gels en plaque, très fins en

épaisseur (type LKB "PAG PLATE").

L'application de ces méthodes, à des gels plus

épais 1ue nous préparons nous mêmes (type gels

d'AC~Y/SDS, 1,5 mm d'épaisseur), nous a conduit

à des déconvenues. En effet, les gels rigidifiés

par le glycérol, craouent, se recroquevillent et

deviennent complètement inutilisables.

6.2.2. ~ETHODE MISE AU POINT AU LABORATOIRE.

Par cette technique, le gel sans traitement pré­

alable est désséché sous vide, dans un sac en

plastique, et sur un support solide (WHATMAN 3 ~M

ou CELLOPHANE). L'ooération de séchage dure entre

et 2 heures.

1 21

6.2.2.1. MATERIEL.

- Rouleau de plastique (souple)

- Soude-sac (CALOR)

Papier WHATMAN 3

- Feuille de Cellophane

- Trompe à vide

- Support rigide poreux (150 x 150 x 20 mm)

- Sèche-cheveux (CALOR)

6.2.2.2. PROTOCOLE.

- A l'aide du soude-sac, réaliser une enceinte

en plastique (300 x 300 mm) ouverte sur un côté.

2 - Réaliser sur une face de l'enceinte, une

petite entaille, par laquelle sera introduit

un -embout en plastique rigide dirigé vers l'ex­

térieur.

3 - Disposer le gel sur une pile (environ 10-20

feuilles) de papier WHAT~AN 3 (150 x15D mm) et

ajuster la pile sur le suoport rigide poreux.

Si l'on veut obtenir un gel sur support trans­

parent, la première feuille de papier, en con­

tact avec le gel, sera enveloppée dans 2 feuilles

de Cellophane (mouillées au préalable et bien

te nd U2 S ) •

4 - Introduire délicatement le support rigide

dans l'enceinte en plastique et souder l'extré­

mité béante.

5 - Poser le tout sur un support, et brancher

la trompe à vide sur l'embout en plastique (Fig. 23).

Enceinte en

Plastique

souple

122

.~ SECHE-CHEVEUX

GEL

Pile de Papier

h/H,I'lTMA N 3

Support Rigide

Poreux

Embout en

Plastique rigide

Vide Poussé

(vers trompe à vide)

Fig.23 - SCHE~A OU SECHAGE DES GELS D'ACRYLAMIDE

EN PLAqUE.

1 2 3

6 - Mettre en route le vide (le plastique s'écrase

contre le gel), et chauffer la surface du gel à

l'aide d'un sèche-cheveux disposé à environ 20 cm

au-dessus.

7 - Vérifier l'absence de fuite (sifflements) et

laisser sécher pendant 1 à 2 heures. On peut lais­

ser aussi le gel se déssécher ô temoérature du

laboratoire toute une nuit (sans sèche-cheveux).

8 - Arrêter le séchage lorsque le gel et la pre-,mière feuille de WHATMAN ou de Cellophane, ne

font qu'un. C'est-g-dire lorsqu'on passe la main

sur la surface du gel, on doit sentir une surface

plane, uniforme et sans aspérités sur les bords.

- Les gels traités par le P.P.O. en vue d'une

autoradiographie, ne nécessitent pas de précau­

tions particulières. En effet, la présence de

P.P.O. rigidifie le gel qui se déssèche très bien.

- Par contre, pour des gels classiques non traités,

l'on devra vérifier que les bords sont réguliers

car la moindre fissure sur l'un des bords, se

transforme lors du sécha~e, en véritable réseau

de failles qui parcourt tout le gel, et le fait

éclater.

6.2.2.3. RESULTATS.

Les gels traités ainsi se présentent sous forme

de film très fins, montés sur un support solide

(WHAT~AN ou CELLOPHANE). Ils peuvent se conserver

indé-finiment.

TRDISIEME PARTIE

R~SULTATS EXPERI~ENTAUX

124

l - MISES AU POINT TECHNIQUES SUR DU SERUM DE VEAU FOETAL

(S.V.F.l.

Nous avons choisi le sérum de veau foetal (SEROMED-BIOPROl

à cause de sa richesse en protéines, et de la facilité

d'approvisionnement.

1.1. - UTILISATION DE PLAQUES COMMERCIALES.

1 . 1 . 1. - 1. E . F. 0 ES. V . F. ( Am ph 0 lin e sPA G-P lat e LKB1 •

Le S.V.F.dilué au 1/5 e est utilisé comme échantillon

et des dépôts de 15 à 20 l sont effectués sur les

papiers filtres.Après électrophorèse, la révélation

au Bleu de Coomassie nous montre une multitude de

bandes inégalement réparties avec une forte concen­

tration dans les zones de pH de 4 à 6 (Fig. 24

donnant lieu à une interprétation difficile.

L'utilisation de concentrations moins élevées en

protéines dans les dépôts, nous donne toujours le

même profil électrophorêtique avec une disparition

des bandes qui s'étalent entre les zones de pH de

5 à 7.

Cette technique présente un avantage certain, qui

est celui de la rapidité d'exécution (1 h 3ol,

très aooréciable en biochimie clinique. Mais le

tout est de savoir si la rapidité d'exécution

d'une technique doit primer sur la qualité d'in­

terprétation des résultats.

Dépôts

pH

4 .2

5.6

6.7

8.00

8 .5

9.2

pH

125

Fiç.r,. 24 - I.E.F. DU S.V.P. (l/S) SUn. N1PHOLINES (3,5-9,5)

PAG PLATE L.K.B.

126

1.1.2. - PREMIERS ESSAIS DE DOUBLE DIMENSION.

Les premiers essais de séparation en double di­

mension utilisant en 1ère dimension l'I.E.F.

(PAG-Plate LKE) et en 2éme dimension l'ACRY/SDS

(PAA 4/30 PHARMACIA), nous ont donné des résultats

plus que décevants. En effet, la séparation du

S.V.F. selon la première technique de double di­

mension ((.hOf.Mél-hode,)nous donne 3 grosses taches

ininterprétables (Fig.25 ) et de nombreuses trai-

nées.

Il est à noter aussi que la décoloration du gel

PAA 4/30 est extrêmement longue (2 semaines).

Ces résultats peu encourageants nous ont poussé

à rechercher des méthodes de séparation plus per­

formantes.

1.2. - UTILISATION DE GELS COULES EN LABORATOIRE.

1.2.1. - I.E.F. EN TUBE.

L'isoélectrofocalisation en tube nous a donné de

meilleurs résultats. quart à la séparation des

protéines et à la reproductibilité de la méthode.

les m8mes conditions de séparation (voir matériels

et méthodes) étant bien entendu respectées.

En effet. la séparation des différents constituants

du S.V.F. nous donne 4 groupes de protéines dont

les pHi approximatifs sont les suivants

- 1er groupe : de 7,00 à 6.40 : 3 bandes

2ème groupe de 6.30 à 5.60 10 bandes

- 3ème groupe de 5.50 à 5.30 5 bandes

- 4ème groupe de 5.20 à 4,80 1 0 bandes

(voir Fig. 26 ) .

127

------t

l".". ; FiQ. 25 1er ESSAI de

SEPARATION endouble di~ension

du S.V.F.

.. l.... •\

41 8..l . S (j

pli

1. E. F. en tubedu S.V.F. et colo­ration Dar le B.C.

Fip,. 26:, . ~,( .

/1 • .'1'

,',,.~.

i 1,: , ,," J 'C- l

P' rl

Fir"':. 27 I.E.F. comoaratifdu S.A.B. , S.V.f.et S.H.Coloration Dar len.c.

1 28

1.2.2. - DETERMINATION DU pHi.

Un des problèmes sur lequel nous avons longuement

discuté est celui de la détermination précise des

pHi selon la méthode décrite (Matériels et méthodes).

En effet, les fractions du S.V.F. (groupe 2) ayant

la même mobilité électrophorétique que les fractions

de sérum-albu~ine bovine cristallisée (SIGMA) ont

des pHi nettement supérieurs à ceux rencontrés dans.la litt 6 rature ou la sérum_albumine a un oH, de

4. 9 1 1 5 (Fic:>;. 27).

La sérum albumine bovine pure cristallisée sou~ise

à l'électrofocalisation en tube, révèle après co­

loration au Bleu de Coomassie, 5 bandes dont les

pHi sont respectivement de 5.8 - 5.8 - 5,75 -

5,45 - 5,40. La bande majeure en intensité de

coloration se trouve dans la zone de pHi 5 • 8 n .

Il est donc difficile de faire une détermination

précise du gradient de pHi à cause de la forte

concentration en urée ~ 10 M) qui entraîne de

grandes variations dans les pHi des protéines (141)

( Fig. 2 B, 29, COLe r b e!l CE 0 H,

). Ces variations peu-

vent aller jusqu'à 1 unité de pH.

La mesure du ~radiEnt de pH au pôle acide du gel

est moins précise. à cause de la diffusion de l'urée

hors du gel et à cause de la forte influence de

l'urée sur le oka des groupements carboxyliques (19).

Par contre l'introduction d'une solution d'acide

aspartique 0,05 M + acide glutamique 0,05 M dans

la préparation des ~els, entraîne une stabilisation

du gradient de pH (147) mais n'entraîne pas d'amé­

lioration sensible de la résolution mais au contraire

pH

12 9

7

6

5

4

o 2 4 6 8 10 12 Cm

Fi~.2 8 - Courbe "1oyenne de néter"lination du Gr"!dient de

OH (I.E.F. en Tube)

A~PH1LI~ES : pH 5 -

0-0 '1esures effectuées dans l'eau distillée.

............ "1 ''; 5 U r F. s e f f e c t u P e 5 dan 5 l' ur 6 ~ q', 2 IYI

~ hal.t ou "gel" est ~ ~Bcc~le.

pH

9

8

7

6

5

4

130

o 2 4 6 8 10 12 cm

Fig.29 - CDURB~ MnYE~~E DU GRADIENT DE pH (I.E.F. TU~El

- AMPHlLI~ES : pH 0,5 - 1n

- ~ESURES EFFECTUEES DANS L'EAU DISTILLEE.

1 3 1

un tassement des bandes, (35)

En dépit de ces désagréments, il est clair que le

pouvoir de résolution de la technique d'I.E.F. en

tube est nettement supérieur à celui obtenu avec

le Kit LKB (PAG-Plate AMPHOLINE), tout au moins

en ce oui concerne la séparation du S.V.F.

Nous ne parlerons donc dans l'exposé, que de "point

isoélectriques apparents".

1.2.3. - SEPARATION EN DOUBLE DIMENSION.

Alors 1ue la séparation du S.V.F. en électrophorèse

unidi~ensionnelle en gel d'acrylamide et en pré­

sence de SOS, n'apporte que peu de renseignements

3 5 ) la séparation en double dimension, ré-

vèle une multitude de taches (Fig.30 ) dont l'in­

terprp.t~tion devient, à la limite, extrêmement

difficile.

Une approche a été faite par l'établissement d'une

grille de lecture (Matériels et Méthodes).

1.2.4. - ESSAIS Of DETERMINATION C1UANTITATIVE DES

PROTEINES APRES I.E.F. EN TUBE.

Des essais de détermination quantitative ont été

effectués par passage des gels sur un densitomètre

(CELLOMATIC 2 SE8IA).

On retrouve biEn les 4 groupes de bandes décrites

précédemment, mais l'appareil ne détecte pas les

bandes rapprochées [ 3 5 ) .

Pour un rendement optimal, il faudrait des gels

parfaite~ent d~colorés et un densitomètre ~ réso­

lution plus fine.

Etalons de PM

!1. E. F. -----~)

132

---- --- -

S.D. s.

l

--"r:IIP_-- -

---.- ". ~-.=-"":;':::':-.-="_ ..._""':":".,--

I-------- ~ _J'I/

- Fi·~. 20

Electrophorèse bidi~ensionnelle

du S.V.F., selon la ~éthode adoptée (141)

~radient d'Acry : 10-16 ~

- coloration par le B.C.

133

II - GLYCOPROTEINES DE MEMBRANE.

2.1. - APPROCHE GENERALE.

Avant d'entreprendre l'étude de l'action des effecteurs

exogènes sur la membrane plasmique,il était nécessaire

et primordiale de localiser les (glyco)protéines à la

surface de cette même membrane. Ces déterminations,

comme nous le verrons seront variables, en fonction

du système d'approche utilisé (trypsinat ou lysat cel­

lulaire] .

C'est dans cette ootioue que nous avons essay?' d'obtenir

le profil général des (~lyco)protéines de membranes,

des cellules L121D et K562, en fonction des différen­

tes mRthodes d'aoproche (trypsinat ou lysat cellulaire)

et des diverses techniques de sRparation et de révéla­

tion (I.E.F., ACRY/SDS, 9idimensionnelle).

:~.2. - L121 rJ.

2.2.1- S~PARATIOI'J OU TRYPSINAT ME"1BRANI\IRE OES

CELLULES L121D PAR I.E.F. EN TU8E.

- L'I.E.F. est réalisée selon la technique décrite

plus haut (Ch. Matériel, Technioue et ~éthodolo~ie).

- Après la reprise du trypsinat lyophilisé par le

tampon échantillon (solution K) des déoôts de 10 ~

15 ~l (soit environ 100 ~g de orotéines) sont ef­

fectués au-dessus des gels.

- Après la séparation électrophorétique et coloration

par le Bleu de Coomassie (cf. Ch. Révélation), le

trypsinat de L1210 révèle de façon reproductible( 35

une série de bandes. Ces handes sont au nombre de

32 (Fig. 31

4,80.3 7,10.

~vec des n~i aonarents qui varient de

. ._•..__.---_.- P Hi 7 , 1 ni--·--·- 2 7 , 013

3 7 ,1J54 7 , on5 6 , 139

.~ 6 6 , 8n7 6 , 713

--_. - R 6 , 72-._ .... - - ...... :'1 6, 65- - - ----*-----_ ... 1 IJ Fi Sil,

1 1 " 6 5 11,

1 2 " f3 55- - - --- ,1 l 6 .50

- - - -- - -- 1 4 6 , 40,~:1..~._. 1 5 6 40,-------- 1 6 " 5 ,q 0

1 7 5 ,q n-- _. - - _.- - .. - ... - - 1 !3 5 135,

1 q 5 , SR20 " 5 B6.

C....,

--" .. -._- 21 5 , 130,~') 5 ,q nL'. '..

21 5 , 70-"--- .- 24 5 , 6 ri- -- ---

25 5 45- - - -- -- ,26 S , /n27 5 , ;;n211 5 , 1 r;--.2q 4 ,90_. - -- - - --".3n 4 ,0, R,

__'1:- ~ .;t.. .;;a.:.- 11 4 AS,

+ "'~ 4 , 13 [}'/.

Fi~.31 - I.E.~. DU T~YPSINAT DE L121n.

134

134 bis

1 f

Il

1

1

I~1

130

~ . iIl 1

fJ1 i(

\ r

\ r~1i1 -

1

~2

\

\

iJ

21

20 --

19

12J3 ~-. !-

V 14.15 1~

1

l!'vl~ 17.18

1 \ .1 \ 1

1J \ \ (

1 V1

1

S 11 /

~V

7.8

i11

1

1

1

~ .. _.. ~. ... __ . __ . L_UIO._ LE.F._.~ __ __ _ __ ._. _._._ .. __ ._~ 1

1 Re.1 pH = 7.10 ~ 4,801. ---·t··· -.----- ---- --- .------.- -- _o. -- ...- -- ..-.

1

1

l. .-........- .- --.1

i 1 2 ~41i

. 1 . \ 5 6

1

FIG 31 bisiiii

. 1

13 5

Les bandes majeures (intensité de coloration au B C)

sont les bandes nO 1,8,13,14,15,23,24,25,26.

29, 32 ayant deS p~i apparents de 7,10 - 6,72 - 6,50 ­

6,48 - 6,40 - 5,70 - 5,60 - 5,45 - 4,90 - 4,80

(Fig.31).

On remarque que dans un tel système de séparation,

la majorité des protéines se focalise dans une zone

acide vericnt de 6,72 à 4,80.

2.2.2. - SEPARATION EN GEL O'ACRYLA~IOE/SOS.

Les électrophorèses sont conduites selon les pro­

tocoles déjà décrits (~atériels Techriques 8t Mé­

thodologies) .

Pour avoir des résolutions plus fines nous avons

utilisé différents gradients de gel d'acrylamide

les plus usités étant les 5-15 "o , 7,5-15 ';, 10-15

2.2.2.1. - PROFIL DU TRYPSINAT APRES COLORATION

AU BLEU DE COOMASSIE.

Le orofil électrophorétique du tryosinat de

L121D révèle plus d'une cinquantaine de bandes

polypeptidiques (Fio;.32. 33).

L'utilisation d'étalons de masses moléculaires

connues (KITS PHARMACIA) nous a permis d'attri-

buer une masse moléculaire apparente (voir ré-

sultat et exploitations Ch. ACRY-SOS) ~ chacune

de ces fractions polypeptidiques.

L'étude comparative de cinq gels, résumée dans

le tableau de Fig.34 révèle 3 groupes de po­

lypeptides

136

A B

~94

Fir'. 32 Trypsinat deL1210 - ACI~Y/S.D.S.

7,5-15 S;Coloration par leB.C.A dépôt de 150 ::JB: " "100 ~

~M ,." §

AWi",43

..-30

.. 20-14

E:'JFŒGlS TRE':El'f'l'DEHS l 'rOi TE 'rH IOUF.

(C~LLO~hTIC-2-SEBIP

+

1

\~

~1

, j1 1

1

{\

P42

P 37

P 30

P20

l, r

i94. !

A.! ;!;f:i

i 11 1

1

P84

1

1

, 1!

L 1210

TRYP. SENSIBUE

(ACRY) B. C.

67.

~:\

1 \

P 68

i ! ~1 ; 1, "

\ 1 \i

i ·'1 'l" P9Q\: i:.... 1\,... '. '1; ; .' ,

VL ,. fi {\ li, 'l,fIrrV\fI.J!' '\,. "~, '.; "' ~' 'v 'J \!

\\

\\

4/ \

,1

4 3.

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\ ~ ! ~~ 1

iJ' 1\ (\-I:{I(\ ~ ;V!0vJ\,., 1~JVi \ 1 ..! \"\ , v

I, V\.--; \:

-3MM x 10 = ~

A, 1

1 \, \, ,

1

1.1

30 •

1

)1

P27

\ ;~ l'

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11

1

1

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P 19

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11

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Iv ~ ;, li1 v

\1

111

11

1i1

__- -----J

N° M• M. AP- N° 1'1. M• AP-

BANDES PARENTES B C BA 1\10 ES PAREI\JTES B C

( x 10- 3 J ( x 10- 3 )

1 21 0 + 32 61 +-2 180 + 33 60 +-3 1 70 + 34 57 +-4 1 60 + 35 53 2 +-5 155 + 36 52 2 +-6 140 + 37 49 2 +-7 1 35 + 38 47 +-8 130 + 39 45 +-9 128 + 40 42 3- +

1 0 1 25 +41 41 +

1 1 1 23 + 42 3g +

1 2 1 20 + 43 38 +

1 3 11 7 + 44 37 3 +

1 4 11 0 + 45 36 +

1 5 1 00 2 + 46 34 +

1 6 96 2 + 47 3;; 3 +

1 7 g4 2 + 48 31 3 +

1 8 9fJ'J +) 49 3[1 3 <-

1 9 84 3 + 50 28 +

20 81 3 + 51 27 2 +

21 80') + 52 25 +

22 78 2 + 53 24 +

23 76 + 54 23,5 +

24 75 + 55 22,5 +

25 74 + 56 21 , 5 +

26 73 + 257 20 +

27 68 3 + 258 1 9 , 5 +

28 67 2 + 59 21 9 +

28 65 + 60 1 8 +

30 64 + 61 1 5 +

31 62 + 62 1 4 +

Fig.34 - TABLEAU DES M.M. MOYENNES DES CONSTITUANTS

DU TRYPSINAT DE L121D.

INTENSITE DE COLORATION AU BLEU DE COOMASSIE

(B C).

137

138

- Le 1er groupe constitué de protéines de haute

masse moléculaire (210 000 à 128 000 daltons)

est plus ou moins + -(-) colore par le BC et

parfois non détectable.

- Le 2ème groupe constitué des ~.M. de 125 000

à 110 000 daltons est faiblement coloré par+

le f=\C (-).

- Le 3ème groupe de polypeptides dont les M.M.

varient de 100 000 À 14 000 daltons est tou­

jours détectable par le RC, et oeut-être sub­

divisé en sous-~roupes d'intensité de colora­

tion variable (3+, 2+ ou +).

De ces groupes de protéines, il ressort inva­

riablement quel que soit le type de ~radient

utilisé, q protéines majeures (3+) dont les M.M.

sont de 90 000,84 000,R1 000, 6R 000, 42 000,

37 000, 32 000, 31 000, et 30 000 daltons.

Ce pro~il au BC ne reorésente qu'un asoect ~ua­

litatif de la répartition des chaines polvoep­

tidi1ues extraites de la membrane par la trypsine.

Nous avons essayé de quantifier ces bandes oar

lecture sur un densitomètre (Fi~. 33 ) classique

(CELLm"ATIC- SEBIA).

Nous nous sommes heurtés 3 des problèmes dus au

pouvoir de résolution trop moyen du densito~ètre.

En effet, la multiplicité des bandes obtenues

par ACRY/SDS nécessite pour leur intégration

quantitative des lecteurs de ~el olus oerformants.

1 3 9

2.2.2.2. - PROFIL OU TRYPSINAT APRES MARQUAGE

METABOLIQUE.

Les résultats peu encourageants de détermination

des glycoprotéines Dar la méthode de coloration

au P.A.S. et au S.A. nous ont conduit à recher­

cher des techniques basées sur l'utilisation de

radioéléments.

La première approche de caractérisation des

glycoprotéines, s'est donc effectuée par marquage1 4 1 4

métabolique au C - GlcNH 2 ou au C-fucose,

suivi d'une trypsination douce. (~atériels Tech-

ninU8S et M~thorlnlo~ies).

Après révélation par autoradiographie, le profil

électrophorétique laisse apparaître un nombre de

bandes et un marqua~e plus intense avec la GlcNH 2qu'avec le Fucose. (Fig. 35).

Nous avons mis en évidence 12 fractions ~lyco­

protéiniques dont les M.M. vont de 140 000 à

28 000 daltons. Ces 12 fractions incorporent1 4

toutes de la C - G1 cNH2

avec des intensités de

marquage différentes [Fig. 36).

De ces ~lycoprotéines extraites par la trypsine,

6 fr~ctions ressortent nettement sur l'autoradio-

gramme par leur richesse en GlcNH2

(3+).

Ces ~lycoprotéines ont une M.M. de 120 000, 60 000,

56 OOQ, 47 000, 32 000 et 28 000 daltons.

Les fractions 135 000, 120 000, 60 000, 56 000,

47 800, 32 000 et 28 000 présentent à la ~ois

dans leur structure, de la glucosamine et du

Fucose (cf. Fig. 36)

Il est à noter que les glycoprotéines 60 000,

56 000 et surtout 47 000 révèlent une intensité

de ~arquage équivalente en glucosamine et en

Fucose (2+ ou 3+).

1 L1(' '" l . r~._I•. , n; 12

14 -C-:fucose

14C ~l l'-1.T n12

(C)O x ::'

(C) 0 x 2

140

Tr:rDsinat de LJ)IOft ' ,.pres ~araun-c netRholique

A Lysat cellulairen Trypsinat

C Il

D Idem B

E Idenî C

Ec 0A B

94

220

60433020

A B

ACRY == 5-20%

A ::::

B =

14Trypsinat:::: C-fuc.

Il :::: 14C GlnH2 94

67

. 43

..1

3020

141

----

N° MASSf fV] [j LEe ULP, IRE1

14C-GlcNH 14 JC-fucoseAPPARENTE 2

1 GP 14[I.OOD + +

2 GP 135.000 + + +

3 GP 120.000 + + + +

4 GP 90.000 +

5 GP 77.000 +

6 GP 68.00C', +

7 GP 60.['00 + + + + +

B GP 56. rlOCi + + + + +

9 GP 52. DOC! + +

1 0 GP 47.000 + + + + + +

1 1 GP 32.00n + + + +

~_2__LGp 29.00[J + + + +

Fig. 36 - Tableau des M.M. Moyennes des constituar,tE

du Tryosjnat de L1210 après "1arouage Métabolique.

GP = Glycoprotéines.

142

On remarquera aussi par comparaison avec le

profil Bleu de Coomassie, que plus la oartie

glycamique est importante (G l cNH2

+ ou Fuc +)

et moins les fractions sont détectables par+

le BC (- ou +) de façon générale.

Il existe cependant des exceptions comme par

exemple la fraction 32 nno qui est fortement

marquée ~ la G1 cNH2

(3 +), faiblement au Fucose

+ et fortement colorée au BC (3 +).

2.2.2.3. - MARQUAGE EXTERNE OES GLYCOPROTEINES.

Les tehniques fines de GAHMBE~G et HAKOMORI

[53.57) nous ont permis d'aborder, l'identifica­

tion des glycoprotéines membranaires sous un

autre aspect.

le lysat cellulaire

Techniques 8t Mét~odclog15s) les3

in situ (N+G+ H.glvcoprotéines sont mar~uées

G + 3H ou P + 3H) t 'te enSUl e

En effet, comme nous l'avons décrit plus ~aut

(cf. Matériels.

est soumis ~ l'lélectrophor~se. et révélé par

fluoro~raphie.

Donc, dans l'exposé ~ui va suivre, il aooaraitra

r~rement des profils Bleu de Coomassie, car nous

opérons sur des lysats cellulaires où toutes

les nrotéines cellulaires sont présentes.

1 - I~CORPORATION DE RADIOACTIVITE.

L'incorporation de la radioactivité dépend du

traitement par la galactose oxydase. Le trai­

tement préalable des cellules par la neuramini­

dase, multiplie cette incorporation par un fac-

teur de 2 .~ 3 (Fig. 37) c..a r 0 n lib pre

de nOuveaux résidus r-~lactosyls accessibles ~

la galactose oxydase.

TYPE CELLULAIRE ET corn/ ~P.; PROTEINE JTRAITEMENTEXP. 1 EXP. 2 EXP.3 EXP. 4 EXP. 5

L1 21 0 + N + G + 3 H 800 1362,3 1347,75 1314,21 1056,89

L1 21 0 + G + 3 H 250 640,28 657,30 796,51 662,33.

L1210 + P + 3H 1453,88 1556,21 1661,71 - -

L1 71 0 + 3 H 289,70 438,71 280,30 302,20 440,13

Fig.37 - TABLEAU OU MARQUAGE EXTERNE DES CELLULES L121o.

N + G + 3H

1G + H

P + 3H

3H

NEURAMINIDASE + GALACTOSE OXYDASE +BOROHYDRURE TRITIE.

GALACTOSE OXYDASE + BOROHYDRURE TRITIE.

PERIODATE + BOROHYDRURE TRITIE.

CELLULES TEMOIN TRAITEES UNIOUEMENT PAR LE BOROHYDRURE TRITIE.

~

CA)

144

Aprés l'action du periodate, la radioactivité

incorporée, est supérieure à celle obtenue

après action de la neuraminidase plus la galac-

tose oxydase (Fig. 31 J. Et sans traitement

enzy~atique, on observe oue les cellules incor­

porent une certaine ouantité de radioactivité

en présence de borohydrure tritié seul.

2 - FLUOROGRAMME DES GLYCOPRnTEINES APRES

'3 G 3N+G+ H et + H.

Sur la me~brane de la cellule L1210, nous avons

mis en évidence 22 glycoprotéines nettement

marquées après traitement N+G+3

H (Fig. 3839 J.,Les ~lycoprotéines majeures (]+J ont une masse

moléculaire de 86000, 80000, 760nO, 7nOOO, 54000,

50000 et 23000 daltons.

Ces glycoprotéines sont faiblement ou presque

pas marquées après traitement G+ 3 H.

3 - FLU~ROGRAMME APRES P+ 3 H.

L'action du periodate révèle 20 ~lycoprotéines

1

[ Fig;. 40! 40 parmi lesquelles 5 sont majeures,

ce s~nt les ~lycoprotéines

4600'] et 31["lOO.

86000, 68000, 54000,

On observe aussi que les ~lycoprot§ines ont des

M.M. infprieures à celles des glycoDrotéines

révélées aprps traitement N+G+3

H. Ce ~arouage

Dar le periodate révèle une richesse des glyco­

protéines en radicaux sialyls.

Dans toutes les expériences effectupes, on ob­

serve une incorporation de radioactivité dans

les cellules traitées uniquement par Na/K8 3 H4.

14 5

A 8 C 0

3 30

~, -,

... 20..

6744

60 4

4

*' 4 4

4 4

36

4

18 'j

v v X1 -3

T'arquag;e ex terne des .--;. p.de 1210

ft. n + '" + H= \:-

'1 = '::'e3

H~

C = G + \-iF-I

ACHY = 7t5-15~;

EoB_1l'lIIIIl-1VPJ~···....~•• ".,- ~" •. ,.'

A

ACRY = 5-15%

" 6Î

A = rJ + G + ')H

-:J.

C = r; + '-'rI 60

D = G + 3Lj

E Te 3'1= r

36

18.:5

V~. 1

lU - J -- ' ..

MASSES MOLECULAIRES

APPARENTES N + G +3 H G +

3 H Te 3 H

( x 1 0 '-3)

GP 1 35 2 + -

GP 1 25 2 + -

GP 120 2 + +

GP 105 2 + +

GP 96 2 + -

GP 90 2 + +

GP 86 3 + +

GP 80 3 + +

GP 76 3 + +

GP 70 3 + +

GP 62 + +

GP 60 + +

GP 54 3 + -

GP 50 3 + -

GP 48 3 + 3 + 3 +

GP 45 3 + 3 + 3 +

GP 36 2 + +

GP 3Cl + +

GP 26 + +

GP 23 3 + -

GP 20 2 + -

Fig.39 - TABLEAU DES M.M. MOYENNES DES GLYCOPROTEINES

MEMBRANAIRES DE L1210 APRES MARQUAGE EXTERNE

Te 3H : TEMOIN BOROHyoRURE SEUL.

1 4 6

147

20

:::0

4]

')4

67

1" - 3

-1.•~ 1

_1

~""I"-

""1;0. ·0

.<1

•, .. '.' 'x~ ::

:,..,.'..'.

-43

67

31 -2. .0li;l&

14 .......1.

94

Fi,:> • 40 L 1210 = P + 3"II

((auche = f3.C.

droi te = fluororrarr.me

ACRY = 7,5-157:;

'~arouaR;e a;pécifioue

A = p2 + 3)-J

F' i r~. 41 : L 1210

A c-~

DMMX

1() - 3

B "1 + r; + 31-J, ,J

C (' 3° 1= .:1 + l'

D = Te 3H

ACHY = 7,5-15 (!f,

7 Jours a - ~oor.

94

68

30

2014

148

MASS ES MOLECULAIRES

APPARENTES P +3

H BC

( x 1 0 - .j )

GP 97 + +

GP 96 + +

GP 90 + +

GP eE 2 + 2 +

GP 68 3 + 2 +

GP fJ3 + +

GP 60 + +

GP :: 4 l + 2 +

GP 50 + +

GP 49 + +

GP 46 2 + 2 +

+GP 4 ~l +

+GP 40 +

GP 31 2 + +

GP 28 + 2 +

GP 26

GP 2:1 +

+

1

GP 23 +

+

1GP 21 7 +

L:-~~+

2 +

----

Fig.40: TAfO'Ll,AU DE'3 l''.M. J\PF'M'UJTES DES GLYCOPROTEINES

MEMBRANAIPES DE L121D APRES ~AROUAGE EXTERNE

AU PERIOOATE (F' + ~'H).

BC : INTENSITE DE CCLDRATIDN AU BLEU DE COOMASSIE.

149

Ce marquage asoécifique porte sur des fractions

de 48000 et 45000 daltons (Fig. 39 et sur

des fractions probablement lipidioues qui se

confondent avec le front de miqration.- .,

On retrouve toujours les fractions 48000 et

45000 qui sont fortement marquées aorÀs traite­

ment N+G+3

H. G+ 3 H ou 3 H. Ce marquage aspécifique

est ~oins intense après trAitement p+3 H• en

effet. la fraction 45000 n'existe plus et la

fraction 48000 est faiblement perceptible.

(Fig. 41).

2.2.2.4. - ~AROUAGE EXTERNF DU TRYPSINAT.

Fort de la technique du marquage externe. nous

avons dans une série d'expériences. soumis les

cellules L1210 à une tryosination douce (cf.

Ch. Tryosination). suivie du marqua~e externe3

du trypsinat obtenu pôr la ~6thode N+G+ H et

G+ 3 H.

Le profil radioactif du tryosinat sché~atisé

dans la Fig. 421

43 ~ontre une incorpo-

ration de radioactivité très forte quand le

trypsinat est traité par la neuraminidase plus

galactose oxvdase.

Ce qui laisse supposer que les fractions déta­

chées de la ~embrane sont tràs riches en acide

sialique. ~ais néanmoins. le nombre de fractions

glycoorotéiniques extraites Dar la tryosine est

inférieur ô celui obtenu lorsqu'on ~arque direc­

tement les cellules in situ.

En effet. sur le fluorogramme du trypsinat. nous

avons mis en évidence 8 glyconrotfines dont les

'0 • '"1 son t de 1 '35 00 O. 1;/ fl [lO n. 9 [1000; 6 8000. 6 [l" n n •

30n O'], 20fll""l et 19rJrin.

94

67

43

30

20

·A

/Il."'1,... " 1

f;'i~. 42

B

Marqua~e Externe

du Try~sinat de L 1210

3A = N + r; + H

3R = G + Il

1 5 0

dpm)(

10.394.v

67.v

43.v

3),.. 20. 14.

v , -3.. MM x 10

1 5 1

3.

2.

1. v v

l~ P 20

13119751

'------1- -4----- --+---+--+---+---+---.---I-------1I--~f_____t-__+-_+I-~

sect ionscm

0--0 ,Co:', '( ~ : Ï\~ A T L Î / Î l' f, + G + H

- C<e-----e T ;) 'i le cc l "~iI

r 1 .!- 1 ' , H" L, ,

152

Il est intéressant de noter que ces mêmes gly-3

coprotéines marquÉes par la N+G+ H, sont aussi

mises en évidence après marquage métabolique

suivi d'une trypsiration douce (cf. Fig. 44 ).

Les glycoprotéines 135000,120000, 60000 et

30000 qui sont des fractions majeures après mar­

cuage ~étabGliqu8. sont aussi des fractions pré­

dominantes lorsoue le trypsinat de me~brane est

marqué par la méthode N+G+3

H. Cette observation

laisse donc supposer. que les glycoprotéines ont

des structures ~lyc6nniques ramifiées et finies

car elles contiennent de la glucosamine (~-acétyl

glucosamine) du fucose. Gu galactose (N-acétyl

galactos3~ine) 8t des 9cides sialiques.

La glycoprotéine 60000. comporte dans sa struc­

ture, une partie peptidioue importante (BC 3+),

de la glucosamine [1+), du fucose (2+) et des

restes galactosyls liés ~ des restes sialyls

[ 3 + ) •

Le fucose et l'acide sialique qui sont des sucres

terminaux, se trouvent simultanément, en intensi_

té importante dans la glyccorotéine 60000.

On p8ut conc penser que cette glyco~rot8ine

60nG~, possède une structure complexe et très

ramifiée.

Les glycoprotéines mises en évidence dans le

trypsinat sc nt très peu marqu~es par le m~thode

3G+ H, à l'exception des glycoprotéines 68000,

30ncr, 20000 et 19000, qui ~rés8ntent tans leur

structure ces restes galactosyls libres, et des

restes galactosyls liés à des restes sialyls.

M. M. x10- 3 BC 14C-GLcNH 1 4 32 C-LFucose N+ G+ G

G+ 3 H

+GP 135 - 2+ + + -

GP 120 + 3+ + + -GP 90 + + - 2+ -

GP 68 3+ + - 3+ 2+

GP 60 3+ 3+ 2+ 3+ -

GP 30 3+ 3+ + 2+ +

GP 20 3+ - - 2+ +

GP 19 3+ - - 2+ +

Fig.44 - TABLEAU CUMULATIF DES GP D~ L1210 EXTRAITES

PAR LA TRYPSINE APRES DIFFERENTS MARQUAGES.

1 5 3

154

2.2.3. - SEPARATION BIDIMENSICNNELLE.

Pour accroître notre capital d'informetion sur

la structure des (glycoJprotéines de membrane,

nouS avons sssôyé de correler les cHi et les M.M.

par électroohorèse bidimensionnelle.

Après des dépôts de 100 à 300 ~g de protéines

dans la 1ère dimension (cf. I.E.F. en tutsJ, les

protéines sent soumises è une 2à,me séparation en

ACRY/SDS (cf. ~atériels Techniques et MéthoGologiesJ.

2.2.3.1. - CARTE BIDIMENSIONNELLE DU TRYPSINAT

APRES COLORATION AU BC.

La s§paration du trypsinat membranaire de cel­

lules L121Q, après coloration par le 9C nous

~et en pr~sence de très nombreuses fractions

peptidinues, dont la description et la classi­

fication deviennent très difficiles. (Fig. 4 5).

L'établissement d'une grille de lecture nOGS

permet 08 constater qUE la majorité des prct~ines

se rpparti[sent dans des zones de pHi de 4,7 à

7,0f], et de l'l.M. de 94000 à 14000 (Fig. 45 J.

L'étude comparative de olusieurs gels nous a

per~is de mettre en évidence plus de 200 taches

détectables par le BC.

De cette multitude de taches, il ressort inva­

riablement quel que soit la quantité de protéines

déposées dans la 1ère dimension, les protéines

majeures suivantes

- I1

pHi 6, 7 - 6, B, ~ . M. 68000

K1

pHi 5 , 6 - 6 , 1 , M. M. 90000

- R1 pHi 4, 7 5 , 6 , "1. M. 60000

155

7 • 1 7 . n 6 . fJ 6. 7 6. 1 5 . 6 4. 7

A c o • E 1 F

..

~--I~,

-,---- ..-..--, - - -

1

-....,-,-.....:~1 -__ ...J _

•,1

11

11 Z h1

Zf

- -~-1-.ZB

G - - -- '-ri- - T l -- r j -.--.:~-... -'-L ------l ' ''"'' -1 1 1 J '

1 - - ---- ......---~~~-- -1- -- ---,- -------• .. - 1-- - 1- 1.'.1'18 N-t tJ '0 --p. · [J .R'... ,.' __ • '- 'll. 1._ J..:.,~..::.'\ Jo - .... - 1 .. _ _1 -?"._ •. '. ........ - _ .......__ .l... _ ,~A.' 1. _

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- 1 _ 1 pa -- ~ C _S - 1 1.-. -, u - .. 1 v# L~ ~_~ '" - '"_ ~_.,. .... 1 -1a..1 ~

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r 'L -: ~ ~ :-Zb 1~ _ 1 Zd 'l

1 1 _ ,.:- ., ~,111

- .....1.-.

. .., z!?;...______ : ~ J_I 11 1

43

14

30

68

-3"'1"1x1G

7 . 1 7 • fJ 6.8 6.71

6 .11

5 . 61

4.7

.4 5 -

1 56

M1 pHi 7 , 1 M. M. 56000

- P1 pHi 6 , 1 6, 7 , M. M. 47000

Zq = pHi 6 , 7 6 , 8 , M. M. 200001

Il est à noter que dans les cases W et X, se

répartit un ensemble de protéines acides, dont

les pHi sont compris entre 4,7 et 6,1, et les

M.M. entre 43000 et 30000 daltons.

Il est indéniable, que cette technique apporte

beau COUD plus de renseignements, que chacune

des dimensions séparées. En effet, si on consi­

d ère les pro t é i n e s Wl' W2' W3' \>J 4' e Ile s s e

focalisent (1ère 0) au même pHi, alors qu'elles

ont des M.M. différentes (20). De même les pro­

téines N1

, N2

, N3

qui ont la même rv'J.M., ont des

pHi différents.

La richesse de la double dimension, en fait

paradoxalement toute sa difficulté d'interpré­

tation.

2.2.3.2. - PROFIL BIDIMENSIONNEL OU TRYPSINAT

APRES MARQUAGE METABOLIQUE.

1 4Apr~s ~arquage métabolique au C - GLcNH

2,

1 4 C-L-+uc0se, le fluorogramme révèle un profil

pauvre en glycoprotéines. Nous avons mis en évi­

dence 7 à B glycoprotéines dont la majorité se

situe dans des zones de pHi de 4,7 à 5,6 (Fi~.46/47)

GP F ;JHi 5 , 6 - 6 , 1 , M. M. 135000-1GP F pHi 4, 7 - 5 , 6 , M. r'1. 120000

1GP L1

pHi 4 , 7 5 , 6 , M. r'1. goooo- GP R

1pHi - 4, 7 - 5 , 6 , M • M. 60000

- GP X1oHi 4, 7 - 5 , 6 , M. r'1. 47000

1 5 7

7 • 1 7 .0 6.8 6 . 7 6. 1 5 . 6 4 • 7pH

A 9 i.1

1 FQi :.. ',

_ _ .t_

I\j

11

---.- ----,------K ~ ~ ca. l '1.

11

__ .1 __ -

- - ... 1 __

;.::

-1.

11

- - _.... -HG

-------------1

6'3

94

43 _ .. _---_.- - - - - -T

11 J 'i "1 xII;S

30 - - - - -1- - - - - ~ -i\-1

Y 1 l 7 Zb le,_ é3 , .'1.1

1

20 . 1~- - - - ,- - -1

lB lf Z~ 1 7h 7' 7'1 _ l~.l

1 1 1

1 4 -- - - -1- - - -I- I- - -1-

-3 ï 1 1

"1"1x10,. •

7 • 1 7 .0 6. B 6. 7 6. 1 5 .6 4. 7

Ge '

~.t; .'

,1

158

7 • 1 7 . n f3 • P- 6. 7 6 . 1 5 . S 4 -;1

pH

19 C 1 'J E B F

-, 11

1 1 11 1 11 1......

1 1 ,1q4 - _l_ ' .2- ___ J __ - J _ - - '- - .,_ ..-

1 1 1r :i l 1 r<- ILJ 1 1 -

1 1 1 L.... '.

68 ------ -- - - - - ,- - - "j1'1 !~

11:.) F 1

CJ R1 1

J~1 11 1

"1 , - ,43 ,- - - - - - - 1- - -1 1

~-.:: 1 ,-,1 1

1 1 1 11

130 - - - . _L - - - - - - ., - - 1 - - - - - -

1 1

Y Z 1 Za Zb Ze Zd

1

1 1, 1 ,2LJ - - - - - - -,- -I- ,- - - - - .-

1

Ze Z.,:- 1Z~ 1 Zh li 7 .

1... J

1

1 4 1 1- - - - - - - - - - - - - - - - - - - -1 , 11

1

-3,

!"IMx10 ,

17 . 1 7 . 0 6 . '1 6 . 7 6 . 1 5 . 6 4 . 7

1

-' .47

1 5 9

Les ~lvconrot6ines A1

(oHt 7.nn.~.M. 14nnnn,

et Zd 1 (oHi. 4,7 - 5.6. M.~. 28000) ne sont

mises en évidence qu'après marquage métabolique1 4

au C - GlcNH2

.

Cette approche de révélation bidimensionnelle

des glycoprotéines est ardue et nécessite une

lon~ue incubation (environ 2 à 3 mois de contact

à 80°) pour avoir des taches. pas toujours inter­

prétables (cf. Ch. Discussion).

2.2.3.3. - PROFIL BIDI~ENSIDNNEL APRES MARQUAGEl 3

EXTERI\IE. (N+G+ H - G+ H).

Apr~s un marquage externe par les méthodes déjà

décrites (~atériels Techniques et Méthodologies)

le lysat cellulaire après centrifugation est sou­

mis à une électrophor~se bidimensionnelle avec

des dépôts dans la 1ère 0 (I.E.F. tubes) de l'or­

dre de 100 à 300 ~g de protéines/10~000 à

200000 cpm.

Le p!'ofil ~31eu de Coomassie (Fig.48 ) qui révèle

toutes les protéines nous sert de témoin de bonne

répartition.

Après 2 mois d'exposition à-70° C. le fluoro­

gra~me (Fig.49 ) ne révèle que très peu de taches

dont la majorité se situe dans les zones de pH

4.7 à 6,B et de M.M. 94000 à 43000 daltons.

D'apros la nomenclature que nous avons adootée.

les taches majeures sont les suivantes

160

7 • 1 7.0 6.FJ 6. 7 6 • 1 5 . 6•

4. 7oH

, 9 fJ-

r F

-copo

•

o

-1-,.. -1 ~

- -1--L~

11

1

....

- '-1o.,

1o

7b

1

11

~ 14bJo~ '" -=:::::. 1-;. ClIlIIJoo"'" - - - - -, -o. c;J 1 ~ C7

<,.:' 1 014

c::::> "'1'"1

1

f IJ

1

1

1

- /-01·

~

-1--1

•

l

'01

1"

7

1

(---- - - - ~

s

30

43

94

68

20

1 4

"1l'1x1G

Ze1

1__ L

1

7 F

11 ~a-

-' -1 Zn1

1 2',J

11

-, ,1 • 1 7 • 5.8 6. 7

,6 • 1

i

S .6•

4 • 7

. 48 -

161

7 . 1 7 • n 6 • B 6.7 6. 1 5.6 4. 7ph

9 l: 1)

6

Z i

x

Zd

1

1 -

1

4d R1

1

- - - -, Z i1

1 7 c1

1

1- - -

1- - =...1.- -4 .c:::r k',

.t C=t-'1- - - -

Zl,Za,

- -,Za Zb

11 1_ ...J _ -

y 1 Z 1

1

- 1- -Ze Zf

,

'~1 L:-1- -- -,- -

',J n 1 l1 1- 11 ----.,

c;; - ,- - - - - - -:=-=---=-_1 _ -1

--=:~'1 1 ~J 1r-J

~~ 1

RF" 1~ -:, 1 ,

1 1~-4 -cCIf1 -~ "1 T 1 Il \1

-11

_ _ 1 __

7 • Î 7 . 0 il . B D.7 5 . 6 4. 7

.. 49 -

1 6 2

GP M pHi ~ , F\ - 7 , n "'l. M • f=;rnnr1

,

r,p 1"12

pHi 7 , 0 , fvl.M. 54000

GP 01

pHi 6, 7 - 6, B , M. f'Il. 48000

GP S 1 pHi 7 , 0 - 7 , 1 , fvl. M. 45000

La ~lycoDrotéine f'Il1

(ou N1

) se sépare en une

tache allon~ée qui recouvre plusieurs zones de

pHi.

Après action de la neuraminidase, et 1 mois

d'exposition à -70 0 C, le fluorogramme est plus

riche en taches. Elles se répartissent pour un

premier ~roupe dans les zones pHi 5,6 - 6,8,

M.M. 94000, 30000, et pour un deuxième groupe

dans les zones pHi 7 - 7,1, M.M. 6BOOO, 41000.

On assiste aussi à une altération dans les pHi

des slycoorotéines. En effet, les glycoprotéines

qui apparaissent sous forme allongée aorès

G + lH, se retrouvent sous forme circulaire dans

la plupart des cas.

La glycoprotéine la plus représentative de ce

phénomène, est la GP f'Il1

, qui après marquage

G + 3 H se situe dans les zones pHi 6,8 - 7,1,

alors qu'après N + G + 3 H, elle se situe à pHià

7 , 1 •

f'Ilalgré ces aléas inéran~s à la tecQnique même

de marqua8e (N + G + 3 H) nous avons réussi, par

comoaraison avec des profils monodimensionnels

(ACRY/SDS) à attribuer des M.M. et pHi aoparents

aux glycoprotéines ainsi révélées.

Les glycoorotéines Majeures que l'on retrouve

fré~uemment avec des positions constantes sont

les suivantes

163

ï . 1 6 . P, 6, 7 6 • 1 5 , fi 4, 7

A 9 L o E F

1

1 ~~t. 1-GE:> , ~

.. 5,~ ...

1

l_

x

Zd

1

~

'j

Ze- - -

1lb

-'-

\­'/

l"'"t1

:;r.,. 1, --:;a;::::::'î- - -Id 'i~~F&... ~4.

ft \1lI> ..11

1

1 ~6> 1

1-,-_2.-

l

:J

cs:::- -.- -

1 !:l1

1-_l-

I

z

H

~ 1 -;-

- -,--

-'- 1-l '-

. le 1

..... Ilb'i,

20

43

68

30

94

- ,:1l'1x1 Il

7 • 1 7 .' [1 6 " P, 5'.6 4 ,"7

. 50 -

- GP

- GP

- GP

- GP

- GP

- GP

- GP

- GP

- GP

- GP

- GP

- GP

- GP

pHi

pHi

pHi

pHi

pHi

pHi

pHi

pHi

oHi

pHi

fJHi

pHi

pHi

6 , 1

6, 1

6, 1 ,

6, 7

5 , 6

7 , 0

7,0,

7 , 0

6 , 7

7 , 0

5 , 6

6 , 7

6, 7

6,7, M. M.

fVI. M.

R , 13, M. M •

6,1, M.i'J.

7 , 1, M. M .

fVI. M•

7 , 1, M. M •

6,13, M. M.

7,1, l''LM.

6,1, M. i'1 .

6,8, fV1.M.

6,13, M.fVI.

86000

80000

76non

63000

60000

54000

50000

4BOOO

45000

41000

36000

31000

164

Cefluorogramme bidimensionnel ( Fig.5 0 ) nous

permet de mettre en évidence une hétérogénéité

dans les glycoprotéines majeures. En effet, la

glycoprotéine 68000 qui apparaissait en une

forte bande homogène, après séparation monodi­

mensinnnelle (ACRY/SOS) se répartit, en 2 taches

bien distinctes sur le fluoro~ramme bidimension-

nel, avec la même fV1.fV1. et des pHi différents

GP 02 = pHi = 6,7 - 6,8, M.M. 68000, GP P1

=

pHi = 7,0, M.M. 68000).

Il en est de même pour les GP 02 (pHI = 5,6 - 6,1,

fV1.M. 63000 et GP 04 = pHi = 5,6, i'1.M. 63000).

On note aussi que le marquage aspécifique déjè

rencontré (fluorogramme monodimensionnel) porte

sur des composés à pHi bien distincts :

GP M4

(pHi 7,0 - 7,1, M.M. 450(0) et GP 01

(pHi = 6,7 - 6,8, M.f'1. 48000).

165

2.3. - K562.

2.3.1. - MAROUAGE EXTERNE DES GLYCOPROTEINES

i'1EM8RANAI~ES .

Sur la cellule K562 d'origine humaine, nous avons

basé essentiellement. notre étude sur des sépara­

tions en ACRY/SoS. Les cellules sont au préalable

marquées in situ par la méthode N + G + 3 H 1

G + 3 H. et les glycoprotéines sont révélées par

fluorograohie [cf. Méthodes Révélation).

2.3.1.1. - INCORPORATION DE RADIOACTIVITE.

Après comptage de parties aliquotes, les résultats

montrent que l'incorporation de radioactivité dé­

pend du traitement par la galactose oxydase. Le

prétraitement des cellules par la neuraminidase

[N + G + 3 H) augmente cette incorporation de radio­

activité totale dans des oroportions lé~prement

supérieures au traitement G + 3 H (Fig.51).

Cette différence se confirme lorsqu'on ptablit le

profil radioactif après section du gel d'acryla­

mide (Fig.52).

2.3.1.2. - PROFIL ELECTRoPHoRETIOUE APRES3 3

MARQUAGE N + G + H / G + H.

Le fluorogramme (N + G + ~H) après électroohorèse

sur ~el constant à 10 ~. montre une simulitude

frapoante entre le profil des K562. et des Ery-

throcytes normaux (Fig 53). En effet. on

retrouve dans les 2 profils,3 bandes fortement

marquées qui ont des M.M. approximatives de 85000,

54000 et 40000 daltons.

TYP E CELLULAIRE ET cnm / ~g PROTEINE

TRAITEMENTEXP. 1 EXP. 2 EXP. 3 EXP. 4 EXP. 5 EXP. 6

K562 + N + . G +3 H 9112 gn1,46 902,99 940,21 846,83 859,48

K562 + G +3

H 741. f1:'i 736,75 72Cl,84 687,41 6Q7,19 635,33

-+-

Fig. 51 - TABLEAU OU MARQUAGE EXTE~NE DES CELLULES K562.

3N + G + H

lG + H

NEURAMINIDASE + GALACTOSE OXYDASE + BOROHYDRURE TRITIE.

GALACTOSE OXYDASE + BOROHYDRURE TRITIE.

(J')

(J')

2­CP" 1< 10 -

16 7

220 '4 51 43 30 20 14

I----J--__'- - _,__ - j - _ J_ - _ J - Y- ----~I'll'l )( 10- 35

4

3

2

1

o 2 4 6 8 10 12 14 S,ct ion. du

C,l en c",

Fig. 52 - PRr]F'IL RAOHJACTIF DES GLYCOPRfJj-EI~~ES DE f~,S62

APRES MAR~UAGE EXTERNE.

*-* <5'32 + N + G +3

H.

3G + H.

~'. .JI!'.

,"

f. é'""fi

,j; i7 ",;-

168

Fig. 53 MarquageExterne des G.P. de K 562

et des Erythrocytes (GR)

ABC--Cll'bilD!5JD

o

ACRY/SOS = 10 %

PAS A, C GR 31 = = N+G+ H

3B, D = K 562 = N+G+ H

';, ,]

PAS2

abc dr

ACRY-SDS = 5-15 %

A,C = K 562 = rI + G + 3i-{

B,D = K 562 = G +3

H-94

- 68

o

.' 30

~.20

.. ,14

U'j......0tx:lCl)

ASP44 ASP53

GP 85

K 562

MARQUAGE EXTERNE DES GP

3 G~9ro u g e = N + G + H3bleu = G + H

GP ~37.39

GP66.62

U'j.-.0

MIf)

GP 291

., 1

GP 115

Â.220

Â9460 67

AA

i

\ r_F

, ~j\\ . \ Î \-'.J - \ r- ;

\,,/\ r F \'\ /'\. .~. ,"-.,..r~-.--._\ "

\

LÂ Â.36 43

.GP34 1. 1

1

1 .)

, VI 1

A' . 1 \1!1 1 1 1

lJ\jJ V

A30

~

Front,

~

•

/;)J)

CoL.,

._ '0*.-

\.. '~/' '~" ' r ~_~-.~J-~-_../

M Mi X 10-3

..•

169

Dans le cas des Erythrocytes. par comparaison

avec les travaux de la littérature (44,126)

la bande 85000 correspond à la bande PAS1

(44

ou glycophorine A. (dimère) qui est la glycopro­

téine majeure de l'érythrocyte. La bande 40000

correspond à la bande PAS2

( 44 ) qui est vrai­

semblablement le monomère de glycophorine A.

Ces simulitudes observées. nous avons essayé

d'a+finer le profil des glycoprotéines de K562

en les séparant dans un gradient d'acrylamide

de 5 à 15 ;.

Après marquage N + G + 3 H . la K562 révèle ô

sa surface 21 bandes radiomarquées dont les

M.M. calculées. vont de 260 à 16.000.

Parmi ces bandes on compte 8 bandes d'intensité

majeure (3+ ou 2+. Fig. 54). Ce sont les

bandes 115000 (2+), 85000 (3+),53000 (3+),

49000 (2+). 44000 (3+). 39000 (2+). 37000 (2+)

et 29000 (2+).

Apr~s marquage à la G + 3 H seules apparaissent

de f3çon nette (3+ ou 2+) les bandes 53000 (3+).

49000 (2+); 44000 (3+). 39000 (2+), 37000 (2+)

et 29000 (2+). (Fig. 53).

Les bandes 53000 et 44000 sont considérées co~me

des marquages aspécifiques. puisqu'on les retrou­

ve toujours en l'absence de tout traite~ent en­

zymatique. c'est-à-dire en présence de borohy­

drure tritié seul.

Contrairement au profil dans un gel à 10 ~o • la

bande 40000 (PAS2

) n'existe plus dans un gradient

(5-1S ;) plus résoluti+. mais nous avons mis en

évidence 2 bandes d'intensité moyenne avec des

~.~. de 39000 et 37000.

1M. M. APPARENTES

-3 3H

3H( x 1 0 ) N + G + G +

+GP 260 - -

+GP 230 - -

+GP 21 0 - -

+GP 1 60 - -

GP 11 5 2 + -

GP 90 + -+

GP 85 '3 + -+

GP 78 + -+

GP 72 + -+

GP 66 + -+

GP 62 + -

GP 5 '3 3 + 3 +

GP 49 2 + 2 +

GP 44 3 + 3 +

GP 39 2 + 2 +

GP 37 2 + 2 +

GP 34 + +

GP 29 2 + 2 +

+ +GP 22,5 - -

+ +GP 21 - -

+ +GP 1 6 - -

Fig. 54 - TABLEAU DES M.M. MOYENNES DES GLYCOPROTEINES

DE K562 APRES MARQUAGE EXTERNE.

170

1 7 1

Par comparaison avec le profil des Erythrocytes

la hande 85000 correspond au dimère de la gly­

coprotéine A, et les bandes 39000 et 37000 aux

monomères.

2.3.2. TRYPSINAT DE ME~BRANE DE K562.

2.3.2.1. - PROFIL BLEU DE COOMASSIE APRES

ACRY !SDS.

Aor8s action de la try~sine dans les conditions

déj~ décrites (cf. Ch. Tryosination) le tryo­

sinat de meMbrane est soumis ~ une séparation

électrophorétique en ACRY!SDS (5-15 5).

Le profil Bleu de Coomassie qui ne révèle que

les protéines, met en évidence une soixantaine

de bandes plus ou moins colorées.

Les masses moléculaires des fragments protéiques

détachés

daltons.

oar la trypsine vont de 190 à 15000

Dans le tableau représenté dans la Fig.55,

on peut subdiviser ces bandes en 3 groupes d'in­

tensité de coloration variable.

Le 1er groupe constitué de protéines de M.M.

variant de 190 8 132000 daltons est très fai-+

blement coloré par le BC (-).

Le 2éMe ~rouoe qui recouvre les protéines de

130 à 1Q8000 daltons est faiblement coloré par

le RC (+).

Le 3eme groupe qui va de 105 à 15000 daltons,

est toujours détectable par le BC, et rév81e

des bandes d'intensité majeures (3+ ou 2+).

1

--

l'J 0 M. M. N° M. M.

BA l'JO ES APPARENTES B C BA NO ES APPARENTES B C

( x 10 -3) ( x 1 0 - 3 )

1 190 31 61 ++

2 1 80+ 32 5g +-

3 170+ 33 56,5 3 +-

4 160 + 34 54 3 +-5 150

+ 35 52 +-+

6 140 + 36 50 -+

7 135 37 48 -+

8 132+ 38 47 3 +-

9 130 39 43 3 ++

1 0 128 40 40 ++

1 1 1 25 41 39 1+

+

12 11 5 + 42 37 +

1 3 11 0 + 43 36 +

1 4 1 0 P, 44 34 ++

1 5 1 05 2 + 45 32,5 3 +

1 6 1 00 2 + 46 29 3 +

1 7 96 2 47 27 , 5 3 ++

1 8 95 48 26 3 ++

1 9 94 + 49 24 2 +

20 92 2 50 23 2 ++

21 56 3 + 51 22 +

22 82 + 52 21 ,5 +

2'3 80 53 20 ++

24 77 2 + 54 19 2 +

25 76 2 55 1 8 2 ++

26 73 + 56 1 7 ,5 +

27 70 + 57 1 7 +

28 69 2 + 58 1 5 , 5 +

29 67 59 1 5 ++

30 65 +

Fig.55 - TABLEAU DES M.M. MQYENNES DES CONSTITUANTS

O~~TEICUES ~U -R~cI~AT DE K562.

INTENSITE DE COLORATION AU ALEU DE COOMASSIE

(B C).

1 7 2

A

MM X

10- 3

94

67

- .- _.

1 73

43

30 l-e1

~,-,. '''!'à'.... ,.;..wr,

20 "--

14 bD

..... ,

P.1.·

,:'-~i; ..( i-~.·~·~ ':.' << '-.~

'"; .. " : ..~.. ",......... ':

B

... \ l'.

Fip-. 56 Trypsinat de 1-<: 562 (ACRY: 5-15%)

A = Coloration au B.C.

D Enre~istrement densitom~trinue

(CELLOMATIC -SEBIA)

174

Les bandes d'intensité majeure (3+). qui ont étp.

confirmpes par un enregistrement densitométrique

(Fig. 56 ) ont des 1'1.1'1. approximatives de 86000.

56000. 54000. 47000. 43000. 32000. 29000. 28000

et 26000 daltons.

2.3.2.2.3

- FLUOROGRAMME APRES MARQUAGE N+G+ H /

G+3

H ET SEPARATION EN ACRY/SDS.

Nous avons mis en évidence les glycoprotéines

présentes dans le trypsinat. par la méthode de

trypsination douce suivie d'un marquage externe3 3

par N + G + H ou G + H (cf. Matériels. Techni-

ques et ~éthodes).

aussi

Le fluorogramme révèle

(Fig.57 ).

une trentaine de bandes:3

N + G + Hbien marquées après traitement

G + 3 H à l'exception de 3 bandes.que

Les 1'1.1'1. déterminées. montrent qu'on retrouve

des bandes intensément marquées (3+) aussi bien

dans les fragments de hautes M.M .. que dans les

fragments de basses M.M. (Fig. 58 ).

La bande 72000 (GP 72) domine le profil par son

intensité de marquage (4+) aussi bien après3 3N + G + H que G + H. On peut donc supposer que

sa structure gl~cannique contient aussi bien de

nombreux résidus ~alactosyls liés ~ des résidus

sialyls. ~ue des nombreux résidus galactosyls

libres. Cette bande semble correspondre au dimère

de la glycophorine A (PAS,). que nous avons trouvé

à 85000 daltons lorsque les cellules K562 sont

marquées directement in situ (cf. Marquage Externe).

Les bandes 6400Cl (GP 64) et 52000 (GP 52) ne sont

mises en évidence qu'uniquement après traitement

N + S + 3 H. Leur structure glycannique doit com~

porter en majorité des résidus galactosyls liés à

des restes sialyls.

175

A B c D

""'il( 94

"<!( 3 0

-<C 67

,t ~ Gp 57

.-1;.

fi'

1;..,~,'•

-,'b, ~......

Gp64 ~ ,.. '

-<lii( L~ 0

-<il!( , 4

MM X

10 - 3

Fig. 57 i\1arquac;e

A,C

B,D

Externe du Trypsinat de3= N + G + rI

3= G + H

K562

ACHY -SDS = 5-16%

Â94

i

\ r,~j\ 1\

\ 1:\\'1

\1 \ /"\.,'" \.". , 1 v \

\.. ) ''''',,'""'-'\

"'-"', /' /\ '_'- .' \,. ,.' ..f'. , .. \

\

_3 \\~ M.M.xlO .

i1

11·

1

\

'\\i11

c.Il

1

.-

1.D

....U'l

0Jj.-u..1

GP64V

GP72y

A67

(1

1\

1\, \i \1 1

1 \1 1

1 :, \l ,

\ i '1 .'

G~57);." ,

\ /'w!

GP54,

A43

ASP ...44

A30

~IIl".lili1,lii\~ '1

( II

~ ~:\ r,GP 34 'il: !':

i: 1: 1, ! J!

~ \ i), 1:i' "

1 \1

1 \

ii '[ 1 GP40 I~

1

~,\i\

i \. \ i·" ,'.. : \ .

\ l " 1 1.' " .. 1 \

\ 1 \ \1\j \ J

\ r,i

GP DE LA

SENSIBLE

Â.20

Â14

Front

l

f\ f\1 \) \ f\1 \ \' \ l'.

.....~j .i

\ 0 !' ",." \ i\ ,. \ :

\.. ....,-, --~"

K 562

. )\... /'

, ....~../

MARQ. EXT. DES

FRACTION TRYP.rouge G + 3 H

3bleu N+G + H

c.Il

.DU'lt-~

1M.M. APPARENTES

-3 N G 3H G +

3H( x 1 0 J + +

GP 125 + +

GP 120 + +

GP 11 5 2 + 2 +

GP 108 2 + 2 +

GP 100 2 + 2 +

GP 96 3 + 3 +

GP 85 ? + " +

GP 79 2 + 2 +

GP 72 4 + 4 +

GP 64 3 + -

GP 60 + +

GP 57 - 2 +

GP 54 + -+

GP 52 l + -

GP Sr) 7 + 2 +

1 GP 46 l + 3 +

1GP 41 , 5 + -

GP 41 + +

GP 40 l + 3 +

GP 33 + -

GP 35 + +

GP 34 2 + 2 +

GP 31 + +

GP 29 + +

GP 28 + +

GP 22 + +

GP 21 , 5 ;;' + 2 +

GP 20 + +

GP 1 9 , 5 + +

GP 1 8, 5 2 + 2 +

Fig. 58 - TABLEAU DES M.M. M'HENNES ["JES r::'-:'L=P~TIEINES

DU TRYPS=~JT DE K562 APRES ~ARQUAGE EXTE~NE.

17 6

La GP 57, n'apparaît qu'après traitement G + 3 H

177

et elle est totalement inexistante après

de la neuraminidase (N + G + 3 HJ , ce qui

action

suppose

une structure ou une réactivité particulière de

ce glycanne (cf. Ch. DiscussionJ.

Le marquage aspécifique porte sur une fraction

de M.M. 46000 daltons (GP 46J.

2.3.2.3. - SEPARATION 8IDIMENSIDNNELLE.

La carte (BCJ bidimensionnelle du trypsinat

révèle environ 200 taches détectables. Elles se

répartissent pour un premier ensemble, dans les

zones de pHi 4,7 À 6,8, et de M.M. Q4000 3

19000 daltons, et pour un 2ème ense~ble dans

les zones pHi 7,0 3 7,1, et de M.M. 100000 è

lOOO'] daltons.

Les taches majeures de ce profil sché~atisé

dans la fiq,.59 sont les suivantes d'après la no-

~enclature adoptée 01

(pHi = 6,7 - 6,8, M.M.

6QnooJ, P1

(oHi = 6,7, '''1.M. 670[]0], 02 (pHi =

6,7 - 6,8, M.M. 3g000J, U2

(pHi = 6,7 - 6,8,

M • r1. 3 7 0 0 [] J •

On re~arqu8 ~ussi que dans les intervalles de

pHi 6,1 à 6,8, se focalisE la majorité des

protéines avec des M.M. variant de 94000 à

20000 daltons.

•'78

7.1 7.[1 u." C. 6.~ 5.6 4.7"". L- ....... .... L· L'__....... pH

1 ._ F

ZD

f"'.-x. _1'-

1-;:..

,1

I_<:"~~~ -

1 7.1

,;• -;.,J..

-' -

--.:-....71 Ze

.i i

, \.....1

-11 Z 0

/ h

1 V"l '"

1 Z n

- -~

!.- ~ I-

!-._~- ---:-" J..., _. -t

-!..--_1_1 _ _ __ ,_

1

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1

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1 -- C> r-'~ -1 -ç;

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. ,- - - - • .-: - -. r -

.... '-1--~~1) ..)

-1

t: u_

--- -.. --'I......J: __ ~_

1 -1---- -- - - - - - - -~ -

L. Zô7- • ZL) Ze1-- "L

- 1

_1 _

Z l

["i..... ---1-

7e

L4 -1.. -= -=

-~- ... - ---.- -::r--- - ·r·- ,

4 )

2rJ

1 4

T i~ Y '-)3 :;: f\I/', T ij c K5 6 2 - C[j :.. 'J P A. r l fj ~~ f, LJ 9 c.:.

III - APPLICATIONS PHARMACOLOGIQUES.

3.1. - INTRODUCTION.

Nous avons utilisé, les techniques électrophoréti­

ques comme moyen d'étude de l'action d'effecteurs

exogènes sur les (glyco)protéines de membrane.

En effet, à la suite des travaux effectués dans le

laboratoire, sur l'action de médicaments anticancé-

reux sur le ~étabolisme énergétique de la cellule

1.:.1210, (26,188,109 ), nous avons basé essentiellement

notre étude sur cette lignée c811ulaire.

Les drogues que nous avons utilisées sont le

METHOTREXATE (MTX) et le RA 233.

3.2. - DESCPIPTIONS DES DROGUES.

3.2.1. - LE METHOTREXATE (MTX).

Le Méthotréxate est un antimitotique utilisé comme

anta~oniste de l'acide folique dans le traitement

des leucémies ly~phordes argues. Ce produit qui

présente aussi un spectre d'action plus large, ap­

partient à la famille des dérivés ptérorques et

répond à la formule développée suivante

179

Acide ptéroyl-gluta~ique OH

Acide amino 4, ~éthyl 10,

Ptéroyl gluta~ique.

H Acide Folique

'1éthotréxate

180

Il agit au niveau de la dihydrofolate réductase

en inhibant celle-ci et empêchant ainsi la ré­

duction du dihydrofolate en tétrahydrofolate.

La synthèse d'ADN se trouve bloquée par inhibi­

tion de la biosynthèse de thymidine monophosphate

à partir de desoxy-uridine monophosphate (Fig.60).

Les effets du ~TX sont antagonisés par la thvmi-

dine exogène avec l'adénosine, l'inosine, l'hy-

poxanthine ou par l'acide folinique (183).

3.2.2. - LE RA 233. (BDEHRINGER INGELHEPlJ.

Ce produit de structure pyrimido-pyrimidique

(voisine du dipyridamole), est

prDposé comme antim~t~stati1ue. Certains de ses ~f­

fets sur les cellules cancéreuses ont dé1à été

décrits 60 sans que le mode d'action précis

ait été fSlucidé.

3.3. - ACTION OU MTX SUR LES (GLYCO)PROTEINES

MEMB~ANAIRES DE L121o.

3.3.1. - CONDITIONS DE MISE EN CULTU~E.

Les cellules sont incubées

et Mpthodolor,ies) ~ raison

en prpsence de ~TX à une

(~atériels, Technioues5

de 2 x Hl cell./ml,-8

C )0 d'ertviron 1n mol/l.

Elles sont récoltées au bout de 24 heures.

Pour l'étude des ohénom~nes membranaires les doses

de MTX que nous avons utilisées sont des doses voi­

sines de la 0150 (1,5 x 10- Bmol/l) mais inférieures-B

à la en 10 (1 x 10 "loI/l}, (25).

Elles se situent donc entre 10-9

et 10- 8 mol/l.

dUMP

~ TH Y iY1 lU Y L1\ l' r: Sy N·r H E TA SE

+

1 8 1

THY.eXQ.

, ,

(METHYLENE

FH4-

FH Z

AClDEFOLINIQUE

G

MTX

Fig.50 - ~ECA~ISME D'ACTIO~ ou ~TX.

FH 4 TétrahydrofolatB.

FH2

oihvdro+olate.

TH Y ex 0 = Th \1 mi d i n e ex 0 g è ne.

dUMP oésoxy uridine monophosphate.

dTMP oésoxy thymidine monophosohate.

182

3.3.2. - ACTION SUR LES PROTEINES ME~BRANAIRES.

3.3.2.1. - I.E.F. (TUBE).

Après trypsination (cf. Ch. Trypsination) des

membranes. les trypsinats témoins et traités

sont soumis à une isoélectrofocalisation.

La coloration par le BC révèle des modifications

qualitatives quant au profil des cellules témoins

et traitées.

En effet. les cellules soumises au MTX présen­

tent dans leur profil. une duplication de la

bande 15 (pHi = 6.4) en faisant apparaître une

nouvelle bande 15 (pHi = 6.2). Parallèlement.

on assiste à une atténuation de la bande 16

(pHi = 5.9) (cf. Fig. 61).

3,3,2,2, - ACRY/SDS.

Après séparation du trypsinat en ACRY/SDS et

coloration par le BC. les différences entre

témoin et traité sont plus nombreuses.

Au delà des protéines de 100000 daltons de M.M.

on observe des modifications qui sont variables.

Par contre. la modification la plus nette et la

plus constante est l'intensification d'une bande

de 53000 daltons de ~.M .. Cette bande à 53000

est très +aiblement colorée ou parfois inexistan­

te chez les cellules témoins. (Fig.62).

183

15

16

,__1/---------

1

--~-

----

15

15 ' 16

.. . ll(l

b . 20

5.80

5.30

4.80

pH

Témoinmembrane

~1.T.X.

Fiq;. 61 L 1210 + i.TTX

I.E.F. en tube

A 8 c D

Fig. 62MM x

10 - 3L 1210 + è1TX

ACHY-SOS - (5-15%)

2"0

43

20

14

~ 100 ..~'" 94

A,C = Te

67 B,D r-1'IX

.,53---

"

3.3.3. - ACTION SUR LES GLYCOPROTEINES.

Les études ont été effectuées en ACRYISDS après

marquage ~8tabolique ~ la 14 C GLcNH2

(donc étude

dut r :1 psi n a t) 0 u a p r 8 s ma r qua g e e x ter neau 0 e rio -33)date + KB H

4[P +H .

Le profil après marquage métabolique ne présente

aucune différence aopréciable. En effet, on ob­

serve un ~arquage intense dans les témoins et les

traités, dans la zone de M.M. allant de 94000 à

184

43000. [Fig. 63 ).

, P 3Apr8s marqu~ge externe au + H, qui porte sur

les résidus sialyls terminaux, le profil des cel­

lules traitées révèle par rapoort aux cellules

témoins, 3 bandes supplémentaires ayant des M.M.

de 105000, 100000 et 45000 daltons.

3.4. - ACTIDN OU RA 233 SUR LES [GLYCO)PROTEINES.

3.4.1. - "1ISE EN CULTURE.

Apr~s 24 heures de culture (2 x 105cell./ml) en

présence ou en absence de RA 233, les cellules

sont récoltées par centrifugation et ramenées ~

. 6une concentratIon de 5Qx10 cell./ml. Elles sont

ensuite soumises à une trypsination douce (cf.

Trypsination), et le trypsinat [dialysé et lyo-

phi lis f, ) est soumis fJ des séparations électronho-

réti1ues. Les-4

doses de Ri\, 233 (10 ['101/1) uti-

lisées sont voisines de la DI 50 ( '2 , 5 x 10- 4 mol/l)

mais inférieurs à la DL 1 0 [ 2 x 1 0 - 4 molill ·

14C-GlnH2

ACHY/SDS = 5-15~;

A = Te r'''Iarquagemétabolique

B = MTX à la

. "c T(. 1'"\,... llt<.l?)"'. ~.....

A B

30

20

14

Fig. 63

185

Action du MTXsur les GP.

A B c D

~araua7e Externe3au P + H

A,C = Te

B,D = ITTX

ACRy/SDS = 5-15%

MM X

'10 - 3

94

67

43

30

20 .,

186

3.4.2. - PR~TEINES LIBEREES.

Avant les sép3rations électrophorétiques. nous

évaluons toujours la quantité des protéines ex­

traites par la trypsine (LOWRY).

La quantité des ~rotéines ~g) est ramenée au

nombre de cellules (en million). Dans le cas des

exoériences effectuées avec le RA 233. la quantité

de protéines extraite par la trypsine est 3 à

4 fois supp.rieure dans les trypsinats de cellules

traitées Que dans les trypsinats de cellules té­

moins. Ces déterminations effectuées sur 6 exoé­

riences sont rÉsumÉes dans le tableau ci-dessous

---Protéines '?n ~g/10 CELLULES

_- \' ::J 1 EXP. 2 EXP. 3 EXP. 4 EXP. 5 EXP, 6

. , ; - f e ~ , 31 2. S 6 1 .46 0,93 1 , 1 3 1 .46

:;: , (1 + '10, -, . 5 S • ~ 6 7. 42 2.88 3.28 1 .59

---

~ig.64 - fABl.EAU UE VARIATION DES PRO, TEIUES APRES

l~AITEMENT PAR LE RA ET TRYPSINATIDN.

18 7

3.4.3. - SEPARATION EN ACRY!SDS.

Après des dépôts équivalents en protéines [150 ~g)

dans les témoins et les traités, les trypsinats

sont soumis à une séparation monodimensionnelle en

ACRY!SDS.

La coloration par le BC révèle un profil bien

particulier. En effet, comparativement aux témoins,

les cellules traitées au RA 233 présentent dans

leur profil, une augmentation générale des produits

de faible ~.M. < 40000 daltons.

Parallèlement, on assiste à une variation quanti-

tative [en intensité de coloration) de certains

constituants de M.M. voisine de 70000 daltons.1

[Fig.64).

3.4.4. - SEPARATION BIDIMENSIONNELLE.

Après focalisation en tube [I.E.F.), les trypsinats

témoins et traités] sont soumis ~ une seconde sépa-

ration e~ ACRY!SDS.

La carte bidi~ensionnelle [BC] établit, accentue

et précise les différences déjô observées entre

témoins et traités. Les différences apprpciables

portent sur les pHi des 3 taches majeures Gue nous

avons Qualifiées de 11

[oHi = 6,7 - 6,8, M.M. 6ôOQO],

M1

[pHi = 7,1, M.M. 5601JO) et P1 [p~i = 6,1 - 6,7,

M.M. 47QOn] [cf. Profil Bidimensionnel du trypsinat

de L1210)

En effet, ce5 taches qui apparaissent bien nettes

dans les témoins, exhibent des taches supplémentai­

res adiacentes, rie ~ême M.M. mais de pHi légère~ent

différents [Fig. 65).

a b

188

67

60

36

18

Fi<:1~. 64' L 1210 + RA

SEPARATION en ACRY/SDS

Coloration ~ar le BoC.

A = Te

B = RA

,dJJJ ,.w.r'

fi

..r' •

Il '.\ft.

~'I' •'.40 , -

188 bis

sos, IEF li!>

'-

Fip:. 65 SEPIÜtATIO~J BID IIVlENSIONNELLE

après action du RA 233

189

La superposition des profils bidimensionnels BC3 3

et N + G + H (cf. BIDl L1210 - N + G + H), ré-

vèle que les modifications observées, portent

sur des constituants majeures qui sont de nature

glycoprotéinique. En effet, la tache 11

correspond

à la GP 11

(pHi = 6,7 - 6,8, M.M. 76000), ~1 à la

GP M1

(pHi = 7 - 7,1, ~.~. 60000) et P1

à la GP

P4

(pHi = 6,1 - 6,7, "1.M. 45000).

Ce phénomène semble être général puisque de nom­

breuses taches sur le profil traité sont dédoublées

mais de façon moins précise.

189

La superposition des profils oidimensionnels BC3 3

et N + G + H (cf. BIDI L1210 - N + G + H), ré-

vèle que les modifications observées, portent

sur des constituants majeures qui sont de nature

glycoprotéinique. En effet, la tache 1 1 correspond

à la GP 11

(pHi = 6,7 - 6,8, M.M. 76000), i'11

à la

GP M1

(pHi = 7 - 7,1, 1'1.i'1. 60000) et P1

à la GP

P4

(pHi = 6,1 - 6,7,1111.1'1.45000).

Ce phénomène semble être général puisque de nom­

breuses taches sur le profil traité sont dédoublées

mais de façon moins précise.

190

IV - DIFFERENCIATION ET K562.

4.1. - INTRODUCTION.

Les érythroleucémies sont utilisées dans de nombreux

travaux comme moyen d'étude des mécanismes de contrô­

le de la différenciation cellulaire

La lignée K562, obtenue à partir du liquide pleural

d'un patient atteint d'une leucémie myelofde chro-

nique en crise blastique ( 123) a été décrite

comme un stade précoce de différenciation de la li­

gnée granuloytaire (104).

"1ais À la suite des travaux de .t\NDERSSON ( 9 ) et

RUTHERFORD ( 160 ), elle s'est révélée être une lignée

érythroleucémique. En particulier, ces cellules con­

tiennent dans leur membrane de la glycophorine et

de la srectrine (95).

De plus, en présence d'agents différenciants comme

l'Hémine et le Butyrate, elles synthétisent de l'hé­

moglobine de type embryonnaire et foetale (5).

Alors qu~ ce modèle de différenciation est utilisé

comme un moyen d'étude de la régularisation de la

biosynthp.se de l'hémoglobine, aucune recherche n'a

été entreprise sur l'incidence au niveau des glyco­

protéines membranaires d'un tel processus de diffé­

renciation.

Nous avons donc essayé dans ce travail préliminaire

de :

- déterminer les conditions ootimales d' inid'Jction

de la synthèse d'hémoglobine par l'hémine pour la

lignée K562 dont nous disposons. Nous suivons la

synthèse d'hémoglobine par spectrophotométrie qua­

litative et quantitative.

1 9 1

- Suivre le profil des ~lycoprotéines de membrane au

cours de l'induction en présence de différentes

doses d'hémine. Ce profil est établi après marqua-3 3

ge externe (N+G+ H / G+ H) et séparation par élec-

trophorèse en ACRY/SDS.

4.2. - INDUCTION DE LA SYNTHESE D'HE~OGLOBINE EN

PRESENCE D'HEMINE.

4.2.1. - CULTURE CELLULAIRE.

Les cellules K562 sont ~aintenues en culture

dans le ~ilieu de EAGLE DULBECC~ comme il B été

déj~ décrit [cf. Matériels, ~éthodes, ~éthodologies).

Pour l'étude de l'induction d'hémoglobine, les

cellules sont récoltées en phase de croissance

exp 0 n e n t ie l 1 Ret a jus t é e s à une con c e n t rat ion d e

5 x 10 4 cellules/ml dans du milieu neuf additionné

de l'agent inducteur en l'occurence l 'hemine.

(Type I, BOVINE SIGI'1A).

La solution d'hémine est préparée selon la mé-

thode de RUTHERFORD 1 6 1 ) 13 mg d'hpmine

sont dissouts dans 0,2 ~l de NaOH 0,5 M et 0,5 ml

de Tris (pH 7,81 0,5 M qu'on ajuste à un volume

final de 5 ml avec de l'eau distillée.

Pour l'induction, l'hémine est utilisée à une

concentration finale de 12,5 ~~ ou 50 ~~.

4.2.2. - CONTENU EN HEMOGLOBINE.

Après la culture en présence d'hémine, les cellules

sont récoltées par centrifugation à faible vitesse,

et lavées 3 fois par du PBS (pH 7,21 froid.

192

Le culot cellulaire est remis en suspension dans

de l'eau distillée à une concentration finale de

5 'x 1 06

cel luI es lm l .

Après 15 minutes dans la glace, le lysat cellu­

laire est centrifugé (5000rpm, 15 minutes) et le

surnageant est filtré (filtre millipore O,22p).

La présence d . hémoglobine dans le surnageant

est déterminée par l'établissement du spectre

d'absorption dans le visible ( 160 J.

4.2.3. - .RESULTATS.

Nous avons confirmé la présence d'hémoglobine

par l'identification d'une absorption maximum

à 415, 540, 576 nm, absorption qui varie à

417, 537 et 568 nm après traitement par l'oxy­

de de carEJone. (Fig. 66).

Toujours par la même technique, et à 415 nm,

nous avons q~antifié la synthèse d'hémoglo­

bine pendant 4 jours (cf. Fig. 67 A ).

Alors que les cellules traitées par l'hémine

( 1 2, 5 M) ont un taux d'hémoglobine qui varie

de 1,8 pg/cellule ('!jour de culture) à 4,5 pgl

cellule (4jours), les cellules témoins ont un

taux d'hémoglobine qui est inférieur à 1 pgl

cellule.

Ces résultats qui confirment l'induction de la

synthèse d'hémoglobine par l'hémine sont en

parfait accord avec ceux de DEAN et Coll. ( 38).

En effet, ces derniers ont montré une accumu­

lation d'hémoglobine dans les K562 en présence

d'hémine 10 ~M, 20~M et 30pM (cf. Fig.67B).

193

. ~--'--"--'--Î

B lJJ

A 0, yhtmoglob1n 1

B Me1hemoQIOb,n lC Cyonmelhrmoglob,n J

iï

1~1

:': . 1:. 1: ::: :,

1111111,\\\\\\ ,

0.1 A

.:. . ......._-

0.0 :-::~:;--~:-'-'7.,:-:-~:-::-~~--=---,"'-:c'._••.....,•••-'.••_••_.----1

700

02

0.0,

A:ti4+Jlli! !ml ! 1

~.:i i .tm!T.i ri:' ;-j; ;·;"1 j l ! '11 ;-, l- ; 1

: ~ 1.1 l.. ;. . i . i r! ~:

• - t 1 .~.. ; : 1" ~.:-.; ~ -~­.1; i':::: i ~ ~.~ - - .. ," -,' '" +-" ._-

: , • J

~-,- --

Fig.66 - SPECTRE D'ABSORPTION DE L'HEMOGLOBINE.

A LYSAT CELLULAIRE DE K5E2 APRES 4 JOURS

D'INDUCTION PAR L'HEMINE 12.5 ~M.

8 SPECTRE DE L'HEMOGLOBINE SELON FRIEND.( 48

oHb.

P91cell.

5

4

:3

2

A

°----0_--~oTé

, 194

Fig. 67 - Détermination quantitative

de l'hémoglobine.

3 4 Tps.( joorsJ

B Selon DEAN 8,t Coll. 38 )

~ K562 + He 30 ~ r1

~ K562 + He 20 p M

-0 K562 + He 1 0 ~ M

-0 K562 Témoins

Te K562 Têmoins

A He K552 + Hémine 12.5 p-M6

5-'"()...Cl 40---C

..030

00ECl 2:I:

1 2 3 ~

Timo ln culture (doya)

DO [en 1/1000) x 0.13 x 10 3

Hb en pg/cell.Nbre de cell. en fVlillion·s

195

4.3 - VARIATION DES GLYCOPROTEINES MEMBRANAIRES

AU CQURS DE L'INDUCTION PAR L'HEMINE.

4.3.1. - EFFETS PRECOCES.

Par élsctrophorèse en ACRY/SDS. et après révéla­

tion fluorographique (Méthode-Révélation) nous

avons établi le profil des glycoprotéines de mem­

brane aprss 1 jour d'induction en présence d'hé-

mine 50 f i'i.

Le fluorogramme (Fig. 68) après la détermi-

nation des M.M .. révèle une glycoprotéine majeure

(4+ Fig. 69) fortement marquée après traitement

N+G+ 3 H. Cette glycoprotéine de 130000 daltons de

M.M. est totalement inexistante dans les profils

témoins. Par contre les bandes 49000.39000 et

37000. faiblement marquées ou inexistantes après

1 jour d'induction, sont parfaitement mises er. pvi-

dence dans les témoins (Fig.68, 69).

Ce profil électrophorétique est confirmé lorsq'on

établit la courbe de radioactivité après découpage

de gel en section de 0.5 cm et comptage en scintil­

lation liquide (Fig. 70).

4.3.2. - EFFETS TIIRDIFS.

Le profil des glycoprotéines a été réalisé après

4 jours d'induction en présence d'hémine 12.5 ~M.

Alors que la production d'hé~oglobine est maxiMale

(4.5 PIS/cell. Fio;.67A), la distribution des glyco­

protéines est rigoureusement la même que dans les

témoins ( Fi9' 68)3 lN+G+ H que G+-H.

aussi bien après marquage

19 6

~ 8 C D le<>.' A 8 C 0 E .\

fi ll>'il \!. j

~

~ -&' 94--~4 .. ""1-:t_ i8 68 - .; ; ,~H

ft <fi!!!JP .." 1...& '-. a 1\>

-, -- - ~~ ..• CllI> ..... 43_ - : r:,~;.

3@ Il> ,jt">

,:,.\"

2UJ30_ ..- _,.ffl'

'ô~

1Il 1Ml)t~~Gllii

~ ~1\1 10 -3 ·1

10 .... 3 S'"" ) ,';1

~'_L _____~Jj

Fip-. 68 Variation des GP de K 562 au coursde l'induction par l!hémine.

Gauche ACRY-SDS 5-15%

Droi te ACRY-SDS 8°1/0:)

A He' 24 Heures ( 5 Op j'i1) N + r, +3H

B He' 4 Jours ( 12 , 5~JY: ) : N G3~"

+ + H

C He 4 Jours (12 ,5~r-1) : G + 3I-{

D Te N + r;. +3

H,.,E Te G + °11

M. M. APPARENTES ~J + G +3

H G +3

H

( x 1 0 - 3)He 1 He4 Te4 He4 T84

+ + +GP 260 - - - - -

+ + +GP 230 - - - - -

+ + +GP 210 - - - - -

+G? 190 - - - - -

+ + +GP 160 - - - - -

GP 130 4 + - - - -GP 11 5 + 2 + 2 + - -

GP 90 + + + - -+ +

GP 85 Cl + 3 + 3 + - -'-'

+ +GP 78 + + + - -

+ +GP 72 + ... + - -

+ +GP 66 + + + - -

+ +GP 62 + + + - -GP 53 3 + 3 + 3 + 3 + 3 +

GP 49 + 2 + 2 + 2 + 2 +

GP 44 2 + 2 + 2 + 2 + 2 +

GP 39 - 2 + 2 + 2 + 2 +

GP 371

- 2 + 2 + 2 + 2 +

GP 34 ... + + + +

GP 29 2 + 2 + 2 + 2 + 2 +

+ + + + +GP 22,5 - - - - -

+ + + + +GP 21 - - - - -

+ + + + +GP 1 6 - - - - -

Fig.59 - TABLEAU DES MODIFICATIONS DES GLYCnPROTEINES

DE MEMBRANE DE LA K562 APRES TRAITEMENT

PAR L'HEMINE

He1 K562 TRAITEES PENOANT 24 H.

He4 K562 TRAITEES PENQANT 4 JOURS.

Te4 K562 TEMOINS.

1 9

198cpm

li_2

10

r67. 43. 30. 14.

__ V __ 1 ' , , -'---------~HM )(10- 3

Fig.70 - PROFIL RADIOACTIF DES GLYCOPROTEINES DE K562

APRES TRAITEMENT PAR L'HEMINE ET MARQUAGE EXTERNE.

*-* K51J2 +- HFi1PJE (1 j C' (J r)- '" ~I "'" G :3"'" H.

(4 1ours) N + G 3+- tL

@-.@ " K56? TEMOIN N +- G 3+ H.

199

4.3.3. - REMARQUES.

Il est ô noter que la glycoprotéine B5000 qui est

vraisemblablement le di~ère de la glycophorine A.

par comparaison avec les travaux de GAHMEERG st

ANoERSJN (9,95) est toujours r::;résente à la

surface quels que sOient les effets étudiés (précoces

ou tardifs).

Dans des systèmes peu résolutifs (gel à B ~o • cf.

Fig. 68) le glyco~rotéine 130000 daltons

qui apparait lors des effets précoces. pourrait

être confondue avec la GP 115000 alors qu'elles

sort nettement distinctes dans Ln gredient plus ré­

solutif (5-15 ~ par exemple).

v - APPLICATIONS CLINIQUES ~ ELECTROPHORESE

BIDIMENSIONNELLE DES PROTEI~ES SERIQUES

ETUOE O'UN MYELOME A IgA.

5.1. - I~TROOUCTION.

Après ces études fondamentales. il nous a paru inté­

ressant d'appliquer les performances des différents

systR~es de séparation aux protéines sériques.

Contrairement à certains ëluteurs (124/ 125 ) qui

étudient les protéines sériques en milieu non déna­

turant. nous avons choisi d'opérer selon les techni-

ques d'électrophorèse déjà décrites (ACRY/SoS. bidi­

mensionnelle) ; c'est-à-dire en présence d'urée 10M.

SOS 0.4 ~. et de ~ ~ercaptoéthanol 5 ~o •

Ce choix a été motivé par le fait que nous désirions

mettre en évidence simultanément les différents com-

posants [chaînes lourdes et chaînes légères) d'im­

munoglobulines de ~alades atteints de myelome.

Nous rapportons ici les premiers résultats obtenus

en illustrant l'intérêt de cette technique électro­

phorétique. par la présentation du cas d'un malade

atteint d'un myelome à IgA type ~ .

200

5.2. - DESCRIPTION ET PREPARATION DES ECHANTILLONS.

5.2.1. - DESC,~IPTION.

- Le tsmoin utilisé est un mélange de 20 sérums

provenant de donneurs apparemment sains et ayant

chacun un profil électroDhor~tique normal.

- Le sérum du patient étudié. présente une hypsr-

gammaglobulinsmie avec une bande monoclonale

importante è l'électrophorèse de zone sur acétate

de céllulose.

L'immunoélectrophorèse de ce sérum. révèle une

diminution des arcs IgG. IgM et des chaines K.

Les arcs des IgA et des chaînes lé~ères À sont

aug~entps et défor~és, signant une oaraorotéiné-

mie IgA de tvpe ,'.1 •

( F i fi . 7 1 A ) .

5.2.2. - PREPARATION DES ECHANTILLONS.

- A,eRY /SOS.

L_ e "p 0 0 1" s é rio u e t é moi n. e t les é r u m é t u d i é ,

sont dilués au 1/20ème dans du tampon échantil­

lon [solutir'r' 5).

Les échantillons sont chauffés 2 minutes è 100 0 C

et des [Jépôts de 10 et 20 ~ sont effectués

dans les Duits.

- ELECTROPHORESE BIDIMENSIONNELLE.

Les sérums sont dilués au 1/2Dème dans le tampon

é cha n t i l Ion (s (] lut i il n K! 8 t des dép Ô t s de 30 fIsont éf~ectués dans la 1?re ~imension (I.E.F. tube)

Pour la 1ère dimension. nous avons utilisé 2 gammes

d'al";lpholir,8s

- un mélan~8 oH 3,5 - 10 + pH 5 - 10.

- une gamme olus large pH 3,5 - 10.

201

5 .3.- RESULTATS.

5 . 3 . 1. - 1; CRY /S DS (7, 5 - 1 6 S).

L'électrophorèse monodimensionnelle en gradient

d'ACRY/SOS, fait apparaitre dans l'échantillon

myelomateux deux bandes nettement accentuées après

coloration au BC (Fig. 718). Les masses molécu­

laires apparentes de ces deux protéines, sont res­

oectivement de 61000 et 24008. Ces bandes accentuées

correspondent donc vraisemblablement aux chaînes

lourdes (~.~. 63000) des IgA, et aux chaînes lé-

gères (~.M. 22000).

5.3.2. - BIDIMENSIONNELLE.

Après révélation (au BC), la carte électrophoré-

tique du sérum témoin (Fig;. 72 est en accord

avec celle obtenue par ANDERSON et ANDERSON 7

dans leur étude bidimensionnelle des protéines

plasmatiques.

L'analyse du sérum myelomateux, révèle dans la

zone des chaînes lourdes, une série de taches for­

tement colorées, ayant la même M.M. apparente (M.M.

61000) mais des oHi variant de 5,6 i'J 6,2 (Fig. 73 ).

Les résultats indiqués dans la Fig 74 confirment

cette hétérogénéité des chaînes ~

L'utilisation d'un gradient de pH élargi (3,5 - 10)

vers les zones alcalines permet de visualiser une

tache importante au niveau des chaînes légères

(M.M. 24080) avec un pHi supérieur ou égal à 8,5.

,."

A

B

T M

--...---_.~ ..-­!ef! .. ". __ ~

19G

TigA

M

19M:T

k

M~

T

94

67

43

30

20

Fig, 71 A I~1UNOELECTROPHORESE

T = Témoin sainM = Malade

B ACRY - SDS 7,5-10 0 170

T = TémoinM = I\lalade

sd s

a

203

ie[

b\

..,.­~"""'d·.E

....,..~ ..~---::

serum

-="

-.­-

')

94

67

43

30

20

plasma

~e IonAnde rson

_Acldk

80,000

83.000

".000.41.000

4:2.000

(7 )

23.000

17,000

..• 0~ M.I."OCIClII••'<IloI.I.

o 0 01 C>

.. 1" UCIIl'(J4ol.l1r1

8'g)~O ~~

13.000

Fiq. 72

'-------------_ .._-_ ....__ ....

Electrophorèse Bidimensionnelle..J

sds

l'

~

ief ~

4 4 '";.06" .

204

serum myelomateux

Fic. 73

1

1

1

1

clectrophorèse Bidlmensionnelle1

1ère D : N,1PHOL1NF:! : PH 3,5-10

1

205

5 • 4- REM ARQUE S •

L ' e xa men de plu sie urs f ra ct ion n e nit s é l e c t r 0 p h 0 r é ­

tiques a confirmé que les chaînes lourdes apparais­

sent sous forme de taches multiples. démontrant

ainsi l<hétérogénéité des chaînes ~ des protéines

monoclonales. Cette hRtérogénéité ne peut pas être

révélée par les autres mAthodes électrophorétiques.

et elle ne porte que sur la charge des molécules.

la neu-

multiples

les tout premiers résultats.

Après traitement du séru~ myelom

raminidase (12,5 U/24 heures), l

Il est vraisemblable que ceci est dO è une différen­

ce de sialylation des copules glycanniques comme

cela a déjà été évoquA pour d'autres problèmes (124,125,133, 62)

Pour confirmer cette différence de sialylation, nous

avons entrepris une série d'expé iences dont voici

apparues dans la région des chaînes ~ changent de

conformation. En effet, le nombr de taches se réduit,

et elles semblent se regrouper e~ une tache unique.

(Fig.74). 1

Des études plus fines sont en co~rs sur diverses

paraprotéinémies et paraprotéinu~ies. pour savoir

si cette hétérogénéité de taches Iréflêts rêsllement

une hétérogénéité des fractions "monoclonales".

Dans ce cas, il est vraisemblable que cette hétéro­

généité proviendrait des chaînes glycanniques.

'. ~ '... ,--.. -i ri

te· \1

""

,.......

••

,...,.

( .

•

205 Bis

Fi;-r. 74 Electrophorèse Bidimensionnelleaprès trai temen t Dar la T'Jeurqminidase

QUATRIEME PARTIE

DISCUSSION - INTERPRETATION

206

1 - TECHNIQUES-METHODOLOGIES.

1.1. - TRYPSINATION.

Aborder l'étude des glycoprotéines de membrane par

une digestion trypsique douce à 4° C représente une

approche séduisante. car les cellules restent viables(34)

En fait, c'est une technique qui quant à sa réali­

sation pose beaucoup de problèmes. Elle nécessite

d'pnorme quantité de cellules au départ (100 à

600 x 10 6 cellules), avec un rendement en protéines6

~g/10 cellules) faible et très aléatoire.

Ouand on observe le tableau de la Fig. 7 5 , aucune

corrélation n'est possible d'une exoérience ~ l'au-

tre, entre le nombre de cellules et la quantité de

protpine extraite par la trypsine. Les mêmes condi­

tions d'extraction étant respectées, les quantités

de protéines e~traites varient pnormément d'une ex­

périence à l'autre.

Du tableau de la Fi~. 75 si on exclut les valeurs

supérieures à 10 tJg/106 cellules(dues certainement

à des contaminants intracellulaires) il n'en est pas

moins vr3i que le rendement en protéines est tr~s faible.

Ce rendement très faible semble être inérant à la

technique, quand on se réfère aux résultats obtenus

technique appliquée à des

par CODINGTON et JENLOZ

109

cellules, par la même

3 2 34 ). A partir de

cellules cancéreuses vivantes d'ascite TA3-Ha, ils

obtiennent des rendements qui varient de 1,3 à6

2,6 tJf;/10 ceilules.

On voit donc toute la difficulté qu'il y a à carac­

tériser les résidus glycônniques, quand on pense ~

la composition de la membrane où on retrouve environ

207

CELLULES PROTEINES TOTALES PROTEINES ~g/MILLION

( x 1 0 6 ) APRES TRYPSINATo DE CELLULES

( tJ- g )

300 1 6 B 0,56

150 260 1 , 73

600 6900 11, 50

400 702 1 , 75

420 1 B9 0 4,50

3BO 50D 1 , 31

200 B77 , 5 4,38

44 2100 47,72

400 960 2,40

152 243 1 , 59

180 725 4,02

200 420 2,10

20D :28 2,64

200 576 2,88

44 11 :3 0 25,68

55 3280 59,63

86 840 9 ,76

86 300 3,48

100 645 6,45

100 225 2,25

60 445,3 7,42

150 219 ,61

1 , 46

350 1008,6 2,88

250 233,7 0,93

400 7540 1 q , 9 7

450 8 9 70 19 ,93

Fig.75 - TABLEAU DE LA QUANTITE DE PROTEINES EXTRAITES

DES MEMBRANES DE L1210 APRES TRYPSINATION.

208

52 ~ de orotéines, 40 ~ de lipides et 8 ~ de sucres.

Dans les 8 ~ de sucres, 7 ~ sont liés à des lipides

(glycolipide), et il ne reste qu'1 ~ qui entre

dans la composition des glycoprotéines (115).

De surcroît GAH!"IBERG (53 a montré qu'après tryp-

sination des erythrocytes, plus de 50 ~ de glyco­

protéines demeuraient attachées à la membrane. Il

émet donc l'hypothèse que la partie protéique de

certaines glycoprotéines. est profondément ancrée

dans la membrane, et se trouve ainsi protégée par

les résidus glycanniques de l'action des enzymes.

En fait, par cette méthode que nous avons utilisée

au début. nous n'avons qu'une vue partielle de l'en­

semble des glycoprotéines de membrane.

Après trypsination nous n'analysons donc par élec­

trophorèse que des glyconrotéines ou fragments de

glycoprot~ines ~tryosino sensibles~.

1.2. - MlI,ROUAGE r<JETABOLIQUE.

Pour révéler (aorès ~lectrophorèse et autoradio­

graphie) les glycoprotéines dans la fraction "tryp­

sino sensibles". nous avons utilisé l'incorporation

dans les glycoorotéines de 2 précurseurs radiomar-

qués la glucosamine et le fucose.

La glucosamine et le fucose ont été choisis parce­

qu'ils sont 2 constituants des glycoprotéines qui

ne se situent pas au même endroit.

La glUcosamine est à la fois un précurseur de la

N-acétyl-glucosamine qui s'incorpore dans le corps

de la molécule, et de l'acide sialique qui consti­

tue avec le fucose les 2 seules extré~ités en prin­

cipe possibles des glycoprotéines [ 114 ).

209

D-GLUCOSAMIr-:E

NADH

l-ASCORBATE

-21H11

.. H101l-xylulose 0 NAD l-gulonate

NAUH t l l~ INOSITOL~ COl NADPH

xylitolNADPt D-gluc~ronate~ UDP-1()-sa,acturonate

o

ATP I! NAD UDP-L-iduronatePENTOSES---.... D-pentose-5-P /

,~ o-glucuronale-I-P~ NADNADP r ~ COl o-GALACTOSE UDP-u-glucuronate +l Z6-P-gluconate t NAD{P)ç...C02 W

ATP /" 1 ATP UDP-o-xylose -- • ~7 t/,o a-D-galactose-I-P~ UDP(a)-o-galactose 2NAD g:

o-GLU.5.0NATE NAOPt K 1 8/-2IHI NAD ~

Il-D-GLUCOSE Il-D-glucopyranose-6-P Cl1 ATP t

• 1 gl IP UTP ô'-D-GL\C~::'H ~D-g ",Dpy"",~·6-P~o-~ r\~ -. :u DP~)~gl",D~ ~

\ An' • ADP-ta)-D-glucose -----+i ~SOR nnOL dTTP dTDP-(a)-D-glucose t3(0 D-mannoseZATP D-MANNOSE dTDP~4-keto-6- g/1'1) / ------... deoxy-o-glucose a "

o-FRUCTOSE AT!' • D-fruct0se-6-P • D-mannose-I-P tNAO(PJH <\ATP ATP l~ ~Ulamine ~GTP dTDP-l-rhamnose' §

\ NAn~ N~ ~ GDP-o-mannose ~D-fructose-I-Pt n-fructose- 1,6-diP mannitol-P' n-o-glucosamine-6-P t ::;

J t l GDP-J-ketofucose 22.celyl CoA 1

MANNITOL ~NAD(P)H 0

o-glyceral- ATP u-glyceral- N-acetylclucos- GDP-l-f:Jcose ~

dehyde =-- dehyde-J-P amine-6-P UDP-N-acetylmuramic acid'

/ J ATP t f P-<:nolp)'ru'.'e 8, N-acctylglucos-~ UDP-N-acetyl-o- :J

dlhydroxyacetone-P... amine-I-P glucosamme 0

~DP-~etYI- ~ ~1 o-galactosamine CIl

N-acetyl-D-mannosamine-6-P 8~ P-enolpyru\oa((' ~

N-acet)'lneurarninic (sialic) acid-9-P ClH,Q ~ crI' CMP-N-acetyl

sialic aci<l~ neuraminic acid

GLYCEROL~a-glycerol-P _.-----------..;CT:;.:,.:P-------.. CDP-gl~,cerol

Fig.76 INTERCONVERSION DES SUCRES

210

L'incorporation de cette osamine rend ainsi compte

de la synthRse globale des glycoprotéines et aussi,

mais à un degré moindre des glycolipides. Il faut

signaler que le glucose serait même préférable

dans ce sens, malheureusement au contraire de la

glucosamine, il se retrouve dans de nombreux autres

constituants cellulaires (Fig.76).

Le L-fucose est incorporé non métabolisé (94)

comme sucre ter~in~l des glvcorrot~ines et des

glycolipides (113,189).

De façon ~énéral~, l'interpr~tation et le calcul

des ~.M. des glycoprot~ines Htrvosin~ sensibles"

après électrophorèse (ACRY/SDS), posent des problè­

mes. La révélation après marquage à la GLcNH 2 donne

des trainées radioactives difficilement interpré

tables (Fig. 77 ).

La qualité des s~parations électrophorétiques n'est

pas en cause, puisque les profils "BC" montrent des

séparations parfaites. Cette observation soulève

deux questions

- La fraction "trvosino sensibles" est-elle conta-

minée par des protéines du SVF ayant fixée de la

radioactivité?

- Existe-t-il une radioactivité aâsorbée sur les

membranes ?

En effet, tant pour le fucose que pour la gluco-

samine, les travaux de CARPENTIER (25) ont

démontré qu'une certaine radioactivit 6 6tait adsorbée

sur les protéines du SVF en présence ou en l'absence

de cellules. Cette adsorotion a d'ailleurs été

décrite par KASPAR et KALTENBACH ( 98 ). Cette

adsorption sur les protéines du SVF, n'explique

pas à elle seule, cette trainée qu'on observe sur

les autoradiogrammes. car les cellules sont exhaus­

tivement lavées pendant les étapes de trypsination.

A B -C 0

94

67

43

30

20

14

MM x10 - 3

Fi~. 77 : Trypsinat ~e L 1210aprôs maraua~e mêtaboli~ue

A,C = 14C - GlnH214

P,D = C - fucose

2 11

,

212

De plus, on n'observe ce ph~r.omène qu'avec la gluco­

samine. En fait, l'explication la plus satisfai­

sante serait l'existence d'une adsorption de radio­

activit~ directement sur les membranes.

En effet, il ne faut pas écarter la possibilité

d'une liaison de glucosamine éventuellement poly­

mérisée avec les membranes cellulaires comme l'ont

décrit TERRY et ZUPNIK 184 J. Dans ce cas, un

grand nombre de cellules présent dans le milieu,

pourrait entrainer une quantité plus importante de

glucosamine liée à la membrane.

En fait, dans une telle voie d'approche des glyco­

protéines, le fucose serait le marqueur de choix

puisqu'il est incorporé no~ métabolisé, et il pré­

sente un flux métabolique constant (25J. Mais hélas,

il se trouve être un sucre terminal sur les chaînes

glycanniques, mais de façon inconstante. La f.ai­

blEsse du marquage qu'on observe avec le fucose

contrairement à la glucosamine, Dourrait s'expliquer

par une augmentation de la taille de la fraction

glycannique. Cette augmentation pourrait-être due,

soit à des chaînes glycanniques de plus grande

longueur, soit ~ des chaînes plus ramifiées, toutes

les ramifications n'étant pas nécessairement ter­

minées. ( 103 ).

Cette epproche des glycoprotéines de membrane, souf­

fre de plusieurs faiblesses

- Faiblesse due à la tec~nique de trypsination qui

nécessite un grand nombre de cellules, et qui

n'est pas constante d'une expérience à l'eutre.

- Faiblesse due aussi au cAoix du traceur radioac­

tif, dont l'utilisation nécessite beaucoup ce

précautions pour éviter des artéfacts dûs essen­

tiellement à des ~hénomènes d'adsorption et de

contamination.

213

Et par cette méthode. nous n'étudions par électro­

phorèse que Des glycoprotéines ~trypsin 0 sensibles~.

Nous n'avons donc qu'une vue partielle de l'ensemble

des glycoprct~ines De membrane.

Nous avons donc recherché d'autres ~éthodes d'ap­

proche qui nous donneraient une vue globale. notqm­

ment les ffiéthodes de marquage ~ la galactose oxydase.

1.3. - MARC)U,l'lGE EX1ERNE.

Par cette rrétrode. nous avons abordé l'étude des

glycoorotéines de membrane. sous un autre angle.

Par ce biais. nous analysons la structure profonde

et totale des glycoprotéines puisque les glycann85

sont marqués in situ. et les glycoprotéines sont li­

bérées dans le milieu par lyse cellulaire.

Cette mnthode à la galactose oxydase est largement

utilisée dans l'étude des molécules de surface de

différents types cellulaire5 (8) 174) 58).

Cette méthode est spécifique de la surface cellulaire.

puisque la galactose oxydase qui a une M.M. de 75000

daltons. apparemment ne traverse pas la membrane

olasmique des cellules vivantes ( 57). Ouand

modifications comme le souligne i'lNDERSSfJN ( 8).

sialique peut entrainer des

Cela

elle est associée à un ~r~tr'aitement par la neura­

minidase. les résidus galactosyls liés à de5 restes

sialyls sont aisément ~is en évidence. ~ais néammoins.

comme nous le verrons plus bas (Discussion Résultatsl.

le fait de retirer l'acide

peut af~8cter ~'organisation des ~lycoprotéin~5 ~ l~

surface cellulaire. et se traduire nar la réduction

des mobilit6s électroDhor~tiques.

Sans traitement par la neuraminidase. les glycoprotéi­

nes sont en général très feiblement marquées.

2 14

Cette observation indique dans les sD~ches cellulai­

res que nous avens étudiées, que la ~ajorité des gly­

coprotéines marquées, contiennent dans leur etruc­

ture en avant dernière position, dee r~sidus galac­

tosyls/N acetyl galactosaminyls liés 3 des acides

sialiques terminaux.

En l'absence de galactose oxydase, et en présence

De ooronydure tritié seul, une certaine quantité de

radioactivité était incorporée dars les protéines

57 1 531-__ 54 ).

Nous avons retrouvé ce merqua~e asopcifique dans les

2 souches cellulaires étudiées. Sur la L121D le

marquage porte sur des fractions 48000 et 45000 daltons

chez la K552 cette iGcorooration aspécifique a lieu

dans les fractions 51000 et 44000.

ANDERSS~~ et GAHMBERG o , 5 8 cnt d'ail-

leurs retrouvé ce ~arquage asoécifique sur une frac­

tion 57~on daltons dans leur étude des r,lvcoDrotéines

de membrane oe cellules lvmphoIdes murines ou humaines.

Ils émettent l'hypoth~se ou'un tel ~arquage aspéci­

fique, serait dû à la formation de bases de schiff

entre l'aldhéhyce et la fonction amine d'une enzyme

conteGant du pyrido~al phospnate. en sait par ailleurs,

que des enzymes telles l'orntthine d~carboxylase sent

fortement activées dans les cellules malignes 1 3 8 ).

Dans cette technique ~e ~arquage, il est dOGC toujours

nécessaire d'inclure ur let de cellules té~oins uni­

quement marquées au bcrchydrure tritié.

Nous avone donc acoptr cette techrique de marquage,

parce qu'~lle ~st spécifioue des glycoprotéines de

sur~ace, et elle r.P. nécessite que très peu de cellules

au départ. (20 è 50 x 106

cellules).

215

II - RESUL TATS.

2.1. - L121D.

2.1.1. - GLYCOPROTEINES TOTALES (N+G+3

H/G+3

H/P+ 3 H).

Sur la membrane de la cellule L1210, nous avons

mis en évidence 22 glycoprotéines dont les majeures

(86 000, BD 000, 76 000, 54 000, 50 000, 23 000

daltons):1N+G+ H,

sont fortement marquées après traitement

et faiblement révélées après G+3

H. Ces

résultats démontrent que la majorité des glyco­

protéines de surface de la cellule L1210 sont ter­

minées par des résidus sialyls liès à des restes

galactosyls en position pénultième.

A côté de ces structures coexistent des chaînes

glycannioues à galactosyl terminal puisqu'on ob-3

serve un léger marquage après G+ H.

Le traitement par N+G+3

H/G+3

H révèle l'absence de

galactosyls libres (terminaux) dans les glycopro­

téines majeures. En fait, toutes les glycoprotRines

Mises en évidence À la surface de la cellule L1210,

présentent dans leur structure, de nombreuses chaî~

nes glycanniques terminées par des résidus sialyls.

Cette richesse en acide sialique, expliquerait le

nombre restreint (six) de glycopro~pines mises en

évidence par CHEN et CANELLAKIS ( 28, 29) sur

la membrane de L1210. Ils ont en effet, utilisé un

maroua~e externe uniquem~nt à la G+3

H qui ne révèle

que les galactosyls libres.

Par le marquage au periodate (P+ 3 H), qui ne révèle

que les restes sialyls nous avons confirmé la pré­

sence de glycoprotéines riches en radicaux sialyls.

216

Mais comparativement au marqua~e ~ la N+G+3

H. les

M.M. déterminées après P+3

H sont inférieures aux

M.M. calculées après N+G+3

H. En effet. lorsque3

les cellules sont marquées par la N+G+ H. les M.M.

calculées vont de 135 000 ~ 2~ 000 daltons. tandis3

que par le P+ H. elles vont de 97 000 à 19 000

daltons ( cf. Fig.4040"').J

Cette observation met en évidence une des limites

du marqua~e à 1\J+G+ 3 H. De nomhreux auteurs 3 1 ,

1 3 3 • 8 soulignent leNcomportement anormal"

des glycoprotéines lors de leurs séparations en

ACRY/SDS. En effet. la désialydation entraîne des

modifications dans la charge totale des glvcooro­

téines donc par la même occasion une diminution

de leur mobilité électrophorétique. Cette diminu­

tion de mobilité. entraine donc des erreurs par

excès lors de la détermination des M.M. On voit

donc t0ute la difficulté qu'il y a à déterminer

avec précision les M.M. des glvcoprotéines après

séparation en ACRY/SDS. En fait. les M.M. calculées

ne représentent que des M.M. apoarentes.

Les altérations structurales des glycoprotéines.3

aorès marquage à la ~+G+ H. sont fortement mises

en évidence lorsque les glycoprotéines sont sou­

mises à une électrophorèse bidimensionnelle.

En effet. les glycoprotéines qui apparaissaient, , 3

sous forme allongee apres G+ H. se retrouvent

sous forme circulaire. et dans des zones de oH

plus basioue après action de la neuraminidase. La

glycoprotéine la plus reorésentative de ce phéno­

mène est la GP M1 (60 000) qui après marquage G+3

H

se situe dans les zones oHi 6.B - 7.1 (Fi~.4950)'

"'3alors qu'après N+G+ H. elle se situe dans des zones

de pHi ~ 7.1. Cette GP M1 est très riche en rési­

dus sialyls. puisqu'elle est fortement marquée après3

N+G+ H (ACRY/SDS). Le traitement I=ar la neurarrinidase

fer ait don c dis par e î t rel a m,'(roh été r 0 g é n é i t éd' li n E

glycoprotéine si elle est due à divers degrés de

sialylation.

217

Mc GREGOR et CLEr'IETSDN ( 133 ), utilisant la même

technique (N+G+ 3 H/G+3H/Bidimensionnelle) à propos

des glycoprotéines de membrane de plaquettes san­

guines, ont mis en évidence des altérations dras­

tiques dans les pHi des glycoprotéines après mar-3quage N+G+ H.

Malgré ces aléas inérants à la technique même de

marquage, l'électrophorèse bidimensionnelle met en

évidence lrhétérog~néité des glycoprotéines membra-

na ires de L1210. En effet, les GP 68 000, GP 63 000,

qui apoaraissaient majeures [3+) et homogènes après

ACRY/SJS, se répartissent en des taches bien dis­

tinctes, sur le fluorogramme bidimensionnelle,

ayant la même ~.M. et des pHi différents.

Cette h~térogénéité mise en évidence serait due à

des dif+érences dans la partie glycannique, ou à

des variations dans la séquence peptidique des gly­

coprotéines (133, 62 ).

Cependant, de grandes précautions doivent-être

prises quant à l'interprétation de tels résultats,

quand on pense aux effets possibles que peut avoir3 3

la technioue de marouage [N+G+ H/G+ Hl sur les pHi

et les M.~. des glycoprotéines.

Contrairement à HOURANI et Coll. 79 qui n'ont

en évidence que 4 glycoprotéines (84 000, 63 000,

44 000 et 33 000) 3 la surface de la L1210 Dar les

méthodes de coloration au PAS, nous avons révélé

plus d'une vingtaine de glycoprotéines ~ la surface3de cette même cellule (ACRY /SOS+N+G+ H).

La forte incorporation de radioactivité obtenue3après traitement par la neuraminidase (N+G+ H) ou

"1par le periodate (P+~H) semble indiquer que la ma-

joritp des constituants membranaires sont de nature

glycoDrotéinique.

218

Cette observation est un accord avec les tests

d'inhibition d'agglutination par les lectines. En

effet, HOURANI ( 7 9 ), JANSON et BURGER ( 92,

9 1 ) ont démontré que les extraits membranaires

(GP) de L121o, inhibent leur agglutination par la

concanavaline A l'agglutinine de germe de

blé et par l'agglutinine de lentille

Cette variété d'interaction avec les lectines rend

compte de l'hétérogénéité dans la structure des

glycoprotéines présentes à la surface de la membrane.

2.1.2. - GLYCOPROTEINES "TRYPSINO SENSIBLES".

Si la trypsine détache de nombreuses fractions pro­

téiques (cf. Profil BC/ACRY/SOS), en fait, très peu

de ces fractions sont de nature glycoprotéinique.

En effet, après marquage métabolique, nous n'avons

mis en évidence qu'une dizaine de glycopeptides.

Ces glycoprotéines contiennent toutes de la gluco­

samine, ce qui est comoatible avec la position qu'oc­

cupe cette osamine dans le "corps" des glycoprotéi-

nes ( 1 3 5 ). La fraction "trypsino sensibles"

regrouoe aussi bien des fragments de hautes ~.M. (140

à 128 000) ~ue des fragments de basses M.M. (§O 000 à

28000 qaltonsl. Mais il est vraisemblable comme

l'ont souligné COOINGTON et JENLOZ ( 32 ) que ces

différents fragments pourraient provenir de glyco­

protéines de ~.M. encore plus élevées.

3 3Le marquage externe (N+G+ H/G+ H) du trypsinat

recoupe le marquage métabolique (14 C GINH2

fuc) puisqu'

on retrouve des glycopeptides de 135 000, 120 000,

90000, 68000, 60000 et 30000. Les fractions 135,

120, 60 et 3D 000 qui sont des fractions Majeures

après marouage métabolique, sont aussi des fractions

prédomi~antes lorsque le trypsinat est marqué par

la N+G+ 3 H.

219

Cette observation laisse donc supposer que ces

glycoprotéines ont des structures glycanniques

ramifiées et finies car elles contiennent de la

glucosamine N-acetyl glucosamine, du fucose, du

galactose!N-acetyl galactosamine et des acides sia­

liques.

La GP GO 000, comporte dans sa structure, une partie

peptidique imoortante (BC 3+), de la glucosamine

(3+) du fucose (2+) et des restes galactosyls liés

à des restes sialyls (N+G+3

H = 3+). Le fucose et

l'acide sialique qui sont des sucres terminaux, se

trouvent simultanément en intensité importante dans

cette GP GO 000.

On peut donc penser que cette GP GO 000 possède des

struc~ures glycanniques complexes très ramifiées avec

de nombreyx résidus sialvls (G+3

H = -).

Les GP G8 nOD et GP GO 000 pourrAient-être rapprochées

des transporteurs du ~TX (G700J et G3000) mis en évi­

dence par ~c CQRMICK et FREISHEIM (132) à la surface

de la L1211 mais par des techniques différentes.

La mise en évidence de radicaux sialyls dans les

glycoprotéines "tryosino sensibles", permet de noter

que la orésence d'acide sialique, n'inhibe pas com­

plètement l'attaque de la chaine peptidique par la

trypsine, comme l'avaient observé GOTTSCHALK et

FAZEKAS de St GROTH (68 oour les ~lycoprotéines

isolées du plasma ou de sécrétion.

2.2 - K562.

2.2.1. - GLYCOPROTEINES TOTALES (N+G+ 3 H/G+ 3 H).

Aprqs marquage externe 3(N+G+ H) les glycoorotéines

de la surface des cellules K562, présentent après

ACRY/SQS, des similitudes frappantes avec les ~lvco­

protéines des érythrocytes normaux (cf. Fig. 53 ).

220

Cette similitude a d'ailleurs été décrite par plu-

sieurs auteurs (9,95). Nous avons donc retrou-

vé dans les deux profils (ACRY = 10 6) 3 bandes

fortement marquées [N+G+3

H) avec des ~.M. approxi-

matives de 85 000, 54 000 et 40 000 daltons. La

bande 54 000 correspond~nt à un marquage aspécifi­

que, les bandes 85 O~O et 40 000 correspondent res-

pectivement au dimère (PAS1

de la glycophorine A, qui est

et au monomère (PAS2

)

la glycoprotéine ma-

jeure de l'érythrocyte normal.

un accord avecLe profil des

Cette dimérisation quiest un caractère spécifique

des protéines érythrocytaires, a été mise en évi-

dence par MARTON et GARVIN [ 130 ).

, G '1K562 apres N+~+ H est

les résultats de ANDERSON et GAHMBERG ( 9 ) qui

ont mis en évidence sur la K562, trois bandes ma-

jeures avec des M.M. de 105, 85 et 42 000 daltons,

les bandes 85 et 42 000 correspondant respective­

ment au dimère et au monomère de la ~lycophorine A.

Lorsqu'on affine le profil des glycoprotéines par

s é par a t ion dan sun g rad i e n t d' ACRY [ 5 - 15 0J" ), l e

fluoro 5 ramme révèle 21 bandes radiomarquées dont

les M.M. vont de 26CJ à 16 000 (cf. Fig. 53/54).

En fait ,il est vraisemblable que ces 21 bôndes ne

représentent pas des entités individuelles. Certaines

d'entre elles seraient le résultat de diffusion de

bandes majeures. JOKINEN et GAHMBERG ( 95 ) ont

d'ailleurs noté que la glycophorine A donnait en

ACRY/SDS une bande large et diffuse. Nous avons

aussi observé ce phénomène, puisque autour de la

bande 85 000, sur le fluorogramme existe une zone

diffuse où ont été mises en évidence les bandes

90 000, 78 000 et 72 000 qui peuvent être assimilées

à des diffusions de dimère de glycophorine A.

221

Ce phéno~8ne expliquerait la disoarition de la

GP 40 000 mise en évidence dans un gel à 10

et l'apparition des GP 39 000 et 37 000 (monomèreJ

dans un gradient 5-15 ~.

Lorsqu'on analyse le fluorogramme sur un densi-

tomètre performant type UVICON 810 ou 820 (KONTRONJ

le profil devient simple et compatible

avec les résultats de ANDERSSON et Coll. 9 J •

En effet, on retrouve les pics majeures à 115 000,

85 000, 53 000, 49 000, 44 000, (39-37 OOOJ, et

29 000 daltons. Les pics 53 000 et 44 000 étant

des marquages aspécifiques puisqu'on les retrouve

en l'absence de tout traitement enzymatique.

Compte tenu des + 10 ~ d'erreurs inérants à la

méthode de détermination des ~.M. selon WEBER et

OSBDRN (206), la GP 11J5 de ANDERSSON et Coll. (9 J

corresDond vraisemblablement à la GP 115 000 que

nous avons mise en évidence.

Les glycoorotéines mises en évidence à la surface

de la K562 sont trà.s riches en acide sialique,

puisqu'elles ne sont presque pas marquées après. 3traltement G+ H 3 l'exception des GP 49 000,

(39-37 OOOJ et 2g 000, qui doivent contenir dans

leur structure des chaînes glycanniques à galac­

tosyl terminal, et des chaînes à sialyl terminal.

2.2.2. - GLYCDPROTEINES »TRYPSINO SENSIBLES».

Le marquage externe du trypsinat de K562 après

ACRY/SOS révèle une trentaine de bandes aussi3 3

bien marquées après traitement N+G+ H que G+ H.

'f Fig. 5 7 ). Cam par a t ive men tau pro fil des le; l y c 0 ­

protéi~es totales après marquage externe, il est

vraise~blable que les nombreuses fractions obtenues

proviennent du clivage de glycoprotéines plus lon­

gues en de petits fragments Deptidiques porteurs

de chaînes glycanniques

222

A côté de ces fragments glycoprotéiniques, une

bande estimée à 72 000 daltons domine le profil

électrophorétique par son intensité de marquage3 3

aussi ~ien après N+G+ H que G+ H. Cette bande par

son comportement électrophorétique (Diffusion) et

son marquage intense, correspond vraisemblablement

au di~ère de la glycophorine A. Cette glycophorine

exposée à la surface membranaire peut-être détachée

par la trypsine 1 27 ) et sa M.M. est réduite.

Le marquage équivalent aDr~s N+G+ 3 H que G+ 3 H pour­

rait s'expliquer par le fait que les fragments

glycoprotéiniques, une fois détachés de la membrane,

sont moins sujets au problème d'encombrement stéri­

que. Ce qui rend les galactosyls libres plus acces­

sibles au marquage. Les GP 64 et GP 54 ne sont uni­

que~ent marquées qu'apr8s action de la neuraminidase

(Fig. 57 ). Elles ne contiennent dans leur structure

que des chaînes ~lycanniques 3 sialvl terminal lié

à un ~ésidu ~alactosyl.

La GP 57 n'apparait qu'après traitement G+3

H et

elle est totalement inexistante apr8s action de la

neura~inidase. Ce comportement anormal s'exolique,

si on considère que les acides sialiques ne sont

pas tous sensibles aux neuraminidases bactériennes

( 62 ) •

En e~~et, ROSEMBERG et SCHENGRUND 157 ) ont dé-

montré que les glycoconju~ués où la ~-acetylgalac­

tosamine est liée en position 4 à un galactose qui

porte un acide sialilue en position 3, présentent

une grande résistance à l'action des neuraminidases.

Ils émettent l'hypothèse que le N-acetylgalactosa-

mine pourrait agir comme un inhibiteur compétitif

des sialidases. On peut donc penser que la GP 57

D c; :; 'ë ses j -:: c,:; :=::3 st:'"' U c t urs d 8 S 0; l Yc ô " r; S S à ,~ - a c s t \1 l -

. -' - .,... =----- - --

- =- .

223

L'action négative du traitement par la N+G+ 3 H,

pourrait s'expliquer par l'inhibition compétitive

due à la N-acetylgalactosamine, ou par la substi­

tion du radical N-acetyl de l'acide sialique, qui

entrainerait une rRsistance à l'action de la neu-

raminidase de vibrio cholerae. (157 ).

2.3 - EFFECTEURS PHARMACOLOGIQUES.

2.3.1. - L1210 - MTX.

A des doses non létales, le MTX altère les profils

électrophorétiques de la fraction »trypsino sensi­

ble» des membranes de L1210. Par I.E.F. et colora-

tion au BC, nous avons mis en évidence la duplica­

tion d'une bande majeure (bande 15 = pHi = 6,4) en

faisant apparaître une nouvelle bande (15') avec

un pHi = 6,2 et parallèlement on assiste à une at­

ténuation de la bande 16 (pHi = 5,9).

Par corrélation avec le profil bidimensionnel

(Fig. 45 ), cette bande 15 correspond à la tache

P1

qui se situe dans les zones de pHi 8,1 à 6,7 et

de M.M. 47 000. Cette observation devient signifi­

cative quand on observe le profil des membranes

témoins et traitées après ACRY/SOS.

Dans les tout

entrepris 35

premiers travaux que nous avons

), nous avons mis en évidence

l'augmentation nette de 2 protéines membranaires

après traitement par le MTX. Les M.M. de ces pro­

téines ont été estimées à 47 000 et 39 000. Par la

suite la seule modification associée de façon ir­

réfutable au traitement par le MTX est l'augmenta­

tion d'une protéine membranaire estimée à 53 000

daltons apr8s coloration au BC.

224

Le marquage par le periodate (p+3 H) qui révèle

les résidus sialyls met en évidence dans le fluo­

rogramme des cellules traitées, 3 glycoprotéines

supplémentaires ayant des M.M. estimées à 105 000,

100 000 et 45 000. Compte tenu de l'approximation

(MM ~ 10 ~) de la méthode de détermination des

M.M. selon WEBER et OSBORN (206), les bandes

47 000, 53 000 et 45 000 correspondent vraisembla­

blement à la même glycoprotéine. A côté des glyco­

protéines> 100 000 daltons dont la présence ou

l'absence est souvent variable, les modifications

majeures s'opèrent toujours quel que soit le type

de gradient dans les zones 43 000 à 67 000 daltons

(étalons de M.M.).

Cette zone de M.M. prend toute son importance au

regard des travaux de Mc CORMICK et FREISHEIN (132).

Ils ont en effet, mis en évidence à la surface de

la L1210, 3 polypeptides capables de se lier au

MTX. Ces polypeptides ont une M.M. estimée à 67 000,

63 000, 56 000 et seraient des sous unités d'une

protéine complexe avec une M.~. >à 100 000 daltons.

Par ailleurs, on sait que le MJX pénètre dans la

cellule par un phénomène de transport ( 67 ).

Ces modifications observées dans les profils élec­

trophorétiques des Elycoprotéines sont à rapprocher

des travaux effectués au sein du laboratoire, notam-

ment sur le métabolisme énergétique de la cellule

L1210 (188,25,108). Ces travaux ont en effet,

montré que le ~TX provoque une élévation de la con­

sommation du ~lucose, n'altère pas le transport du

glucose et inhibe la resoiration mitochondriale.

La glycolyse et la modification des glycoprotéines

de me~brane représentent deux phénomènes qui peuvent

être reliés ne serait-ce que, parce que le trans­

port du ?lucose à l'intRrieur de la cellule est as­

suré par un transporteur qui n'est autre qu'une

glycoorotéine.

225

Un autre lien a été montré par SHIU et Coll. ( 168 1

qui ont observé dans des fibroblastes d'embryon de

poulet transformés par le virus du sarcome de ROUS

(RSV1. l'augmentation de 2 protéines membranaires

parallèlement à la consommation du glucose. En fait.

l'augmentation de ces protéines n'est pas une con­

séquence de la transformation mais est consécutive

à la chute rapide de la concentration de glucose

dans le milieu de culture. On peut relier aussi

cette modification des ~lycoprotéines à l'action

inhibitrice du MTX sur la respiration mitochondriale

car de nombreuses relations ont été démontrées entre

l'intensité du métabolisme aérobie ou le fonctionne-

ment ries mitochondries et les constituants de mem­

brane des cellules transformées (210).

Cette apparition de glycoprotéines. mise en évidence

aprRs séparations électrophorétiques est certes qua-

litative. mais néanmoins elle est en accords avec

les trôvaux de CARPENTIER

des glycoprotéines.

25 1 sur le métabolisme

En effet, ces travaux ont montré qu'en présence de

MTX, l'incorporation de ~lucosamine et de fucose

radiomarqués dans les macromolécules intracellulaires

par l'acide phosphotungstique (indice

de biosynthèse des glycoorotéines). est augmentée.

D'autres approches de l'influence d'antimitotiques

en général et du MTX en particulier, sur la membrane

plasmique ont été rapportées. HWANG et SARTORELLI

84 ont décrit une augmentation du taux d'ag-

glutination. induit par des lectines de cellules de

sarcone 1AO par 60 ~mol/l de MTX pendant 2 heures.

HOFFMANN et Coll. 77 ont observé par microscooie

électronique ~ balaya~e. une oerte de microvillosités

6 heures après l'administration de 5 x 10-B molll

de MTX à des lymphocytes stimulés par la phytohémag­

glutinine.

226

Toutes ces observations renforcent l'idée que les

modifications membranaires que nou, avons obtenues

en présence de MTX ne sont point artéfactuales.

Mais néanmoins pour correler plus étroitement les

profils MTX et Témoins, il serait judicieux de

disposer d'un témoin lui aussi en phase S témoin

bloqup en phase S par un procédé non chimique), car

le MTX bloque les cellules en phase S et l'on sait

que les structures membranaires varient au cours du

cycle cellulôire (61)

2.3.2. - L121D - ~A.

Par électrophorèse et après action du RA 233, nous

avons mis en évidence des modifications profondes

entre le profil des protéines membranaires des cel­

lules témoins et des cellules traitées.

Contrairement au MTX, le RA 233 semble affecter les

protéines membranaires d'une façon générale et non

ponctuelle. En effet, les séparatio~ en ACRY!SDS

après coloration au BC révèle une intensification

générale des bandes de faible M.M. Ces modifications

entre cellules témoins et traitées sont accentuées

quand les protéines membranaires sont séparées par

électrophorèse bidimensionnelle. En effet, la carte

bidimensionnelle des cellules traitées. exhibe des

taches dédoublées à la place des constituants ma­

jeures (GP 11

, GP M1 , GP P4) qui sont de nature

glycoprotéinique. Ce phénomène semble être général

puisque de nombreuses taches sur le profil traité

sont d8doublées mais de façon moins précise.

Ces profils font penser à une adsorotion de la

drogue à la surface membranaire. Cette hypothèse

ne peut pas être retenue, puisqu'un simple lava~e

des cellules fait disoaraître les effets biologi­

ques du RA 233, et avant trypsination les cellules

sont exhaustivement lavées.

227

On oeut nlutôt 8nvisa~er nue la ~?13 induit une

désorganisation de la structure ou de la cohpsion

des glycoprotéines membrenaires, ~ui serait aussi

responsable de l'augmentation du taux de protéines

"trypsino sensibles" et qui se traduit aussi par

une inhibition non co~pétitive des transporteurs

me~branaires. Cette idée est renforcée par le fait

que le RA 213 est un puissant antiagrégant plaquet­

taire (6, 105) et on sait que les glycoprotéines

~embranai"es n~rticipent active~ent à l'agrégation

des pla~uettEs sanguines ( 162). Cette désor­

ganisation des glycoprot~ines est appuyée par les

résult~ts des tests d'agglutinabilité par les lec-

tines. En effet, TRETESSAUX 188 a montré que

l'agglutinabilité des cellules L121D par la conca­

navaline A est retardée et ralentie nar le RA 211.

Par ailleurs HWA~G et Coll. ( 84 ) ont montré que

c e r t a i n e :3 Co r 0 gue sin d Li i sen t [j e~, e l t é rat ion s a uni ­

veau des glvcoorotpines d8 ~e~brane des cellules

cancéreuses, oui présentent alors des réactivités

différentes vis-3-vis des lectines. Ces ~odifica­

tions structurales au niveau de la membrane se

trouvent aussi confirmées par l'étude en microsco­

pie électronique de balayage.

La membrane des cellules traitées Dar le RA 233,

prr?sente un aspect en "choux-fleur" (Fig. 78 ).

La su"face cellulaire est beaucoup plus cre'lossée,

et on observe des protubérances massives et irré­

gulières de telles inages ne s'observent que dans

des cellules en souffrance. Par exemple des aspects

du même genre ont été publiés avec des cellules

cancéreuses attaquées nar des cellules immunitaires.

(215,72).

2.3.3. - K562 - DIFFERENCIATION.

Dans ce trav~il Dréliminaire sur la différenciation,

nous avons d'abord vérifié que la lignée K562 dont

nous disoosons, répond bien aux critères de la lignée

érythroIde retenus par ANDERSSON et GAHMBERG 9 ) .

ACTION DU RA 233 SUR

227bis

0.0. A 546 nm

1300

1200

1100

1000

900

L'AG G LUTINABI LITE DES

L 1210 par LA CON _ A

,v

'(V ,.

'('(

" V

5 10 1 5 20temps en mn

Dé croissance de la densité optique au

Cicours du temps à 37c.__ 8

L 1210 témoin

*-* L 1210 + RA

0_0 L 1210 + con A

y-, L 1210 + RA + con A

228

A

B

FiF.. 78 A = L 1210 Témoin

B L 1210 + RA 233.

229

Ces critères sont notam~ent la présence de glyco­

phorine A qui est spécifique de la surface des

érythrocytes humains (44,9,95 / 127), et la synthèse

d'hémoglobine embryonnaire et foetale en présence

d'agent inducteur tel que l'hélTline 160 ) .Dans ce nouveau canevas de recherche, les études

électrophorétiques entreprises, n'ont visé qu'à

mettre en évidence les chaînes de globine après

induction de la syr,thèse d'hémoglobine (160.J5,15J.

Nous avons donc montré, après avoir établi le pro­

fil général des glycoorotéines de membrane, que la

souche K562 dont nous disposons sécrète de large

quantité d'hémoglobine en présence d'hémine (12,5 ~~

ou 50 rJM). Cette hémoglobine a été qualifiée et

quantifiée par l'étab~issement du spectre d'absorp-

tion dans le visible (Fig.66, 67). Le sujet de-

vient ~rometteur quand on établit le orofil des

glycoprotéines de membrane au cours de l'induction.

Pour étudier les variations précoces, nous nous

sommes placés dans des conditions telles que la

cellule synthétise de l~rges quantités d'hémoglo­

bine (1- 4,5 pg/cell.) au bout de 24 heures. Nous

avons donc incubé les cellules en présence d'hémine

50 ~M. Les effets tardifs ont été étudiés après

4 jours d'incubation en présence d'hémine 12,5 ~~.

Après 24 heures de culture en orésence d'hémine

50 p~, le fluorogralTIme révèle une glycoprotéine

hypersialidée dont la M.M. a été estilTlée 3

130 O~O daltons. Par contre les GP 49 000, (GP 37-

39 000) sont inexistantes. ~près 4 jours de culture

en présence d'hémine 12,5 ~M, alors Que la produc­

tion d'hémoglobine est lTIaxilTIale (4,5 ~g/cell.) la

distribution des glycoprotéines est rigoureusement

la même que dans les témoins. Le dimère de la glyco­

phorins A (GP 85 000) est toujours présente quel que

soit le type d'effet étudié (précoce ou tardi~)

alors que le monomère (GP 37-3q 000) est absent dans

les effets précoces.

230

Cette observation est encourageante quand on se

réfère aux travaux de GAHMBERG et ANDERSSDN ( 52 J.

Ils ont en effet, démontré qu'en plus de sa pr~­

sence à la surface de l'érythrocyte, la glycorho­

rine A était aussi présente dans les premières

étapes de l'érythropoiese (51/52 J. Ils ont aussi

montré que la glycophorine A était déjà présente

à la surface des normoblastes basophiles, indiquant

ainsi ~ue son expression à la surface membranaire

précédait le départ de la synthèse d'hémoglobine

détectable 52 ). Ils ont aussi montré que les

cellules leucé~iques blastiques, exprimaient les

deux formes de ~lyconhorine A (dim~re ou monomère)

dans certains cas, et dans d'autres cas, seule la

forme dimérique était exprimée à la surface. Mais

néanmoins, la corrélation entre ces différences et

le degré de différenciation reste à prouver ( 11 J.

L'apparition de la GP j10 000, dans les effets oré-

coces, pourrait s'expliquer au regard des travaux

de HQFFMAN et Coll. 76 J. Ils ont en effet, rrlon-

tré que des concentrations d'hémine variant de 50

à 100 pM entrainent, une augmentation de l'activité

des enzymes responsables de la synthèse de l'hème,

et surtout une augmentation de l'expression des

marqueurs de surface des cellules érythroides em-

bryonnaires et foetales. DEAN et Coll. 38 J ont

montré par ailleurs, que l'accumulatton d'h~~oglo­

bine lors de l'induction par des faibles concentra­

tions d'hémine (12,5 ~M par exemple), est réversible

et ne s'accompa~ne pas d'une différenciation termi­

nale.

Cette observation pourrait expliquer les profils

identiques des glycoprotéines, que nous obtenons

entre cellules induites par 12,5 ~M d'hémine et

cellules témoins.

23 1

Toutes ces expériences préliminaires. nous encou­

ragent à rechercher par les techniques électropho­

rétiques des nouveaux critères de différenciation

qui pourraient être des glycoprotéines de surface.

Les travaux de KENJI et Coll. 1 0 2 nous confor-

tent d~ns ce sens. En effet. sur les cellules de

leucé~ie myeloide de souris (~1)' en présence d'a­

gents inducteurs de différenciation. ils ont mis

en évidence une GP 180 000 qui n'est présente qu'à

la surface des granulocytes et des macrophages.

Or. on sait que cette souche M1

peut se différencier

en granulocyte et en macrophage sous l'action d'a-

gents inducteurs 102 ). Cette expérience certes

encore isolée. apporte l'espoir que des a~ents

inducteurs de différenciation peuvent "normaliser"

les glycoprotéines de membrane des cellules cancé­

reuses et leur faire perdre ainsi leurs principales

Dropri~tés de malignité.

CINQUIEME PARTIE

CONCLUSION GENERALE

232

Le but de ce travail était de nous doter d'une bonne

technique de fractionnement et de révélation des glyco­

protéines de membrane des cellules cancéreuses cultivées

in vitro. En effet. dans un travail précédent 35

nous avons adapté et mis au point des techniques électro­

phorétiques. notamment l'isoélectrofocalisation (en tube).

l'ACRY/SDS et l'électrophorèse bidimensionnelle qui couple

les deux techniques précédentes. Nous nous sommes heurtés

à d'énormes problèmes dans la révélation des glycoprotéines.

Nous utili~ons alors des techniques de coloration au P.A.S.

et au S.A. Nous nous sommes donc tournés vers des techni­

ques de révélation utilisant des radioéléments.

Nous avons donc adapté et mis au point les techniques

de marquage externe à la galactose oxydase de GAHMBERG et

HAKDMDRI 57 et les techniques de révélation par auto-

radiographie ou fluorographie de BONEY et LASKEY 20).

Nous nous sommes donc attardés sur les petits détails tech­

niques et oratiques que nécessitent les électrophorpses

et les procédés de révélation. Car nous nous sommes rendus

compte que la Dualité des résultats était étroitement liée

au "petit détail technique" comme par exe~ple le séchage

parfait des gels d'acrylamide, sans lequel aucune fluoro­

graphie n'est possible.

Par ces différents procédés. nous avons établi le

profil général des glycoprotéines de membrane des cellules

L121D et K562.

Parallèlement. nous avons montré que des effecteurs

exogènes (~TX-~A) oouvaient entrainer des modifications

des glycoprotéines de memhrane. Ces résultats certes qua­

litatifs demandent à être aporonfondis afin de pouvoir en

déterminer le retentissement biologique. et voir si cet

effet de produits anticancpreux reorésente un épiphénomène

ou au contraire s'il est ~ossible de tirer parti de cette

2 33

~ction pour essayer de sélectionnar d~autres drogues anti­

cancéreuses actives sur les glycoprotéines de membranes.

Car aux troubles fonctionnels de la membrane des cellules

cancéreuses sont associées de profondes altérations des

glycoprotéines membranaires. Et selon WARREN et VAN BEEK

(201,1951 la seule anomalie associée de façon permanente au

pouvoir oncogène des cellules malignes se situe au niveau

de certaines structures glycanniques N-glycosidiques des

glycoprotéines membrônaires.

Avec la K562 qui est une lignée humaine, nous avons

abordé le problème de la place des glycoprotéines de mem­

brane dans les phénomènes de différenciation. Les résultats

exposés dans ce travail ne représentent qu'un "coup de

sonde" 'dans ce nouvel axe de recherche. En effet, avec

l'hémine utilisé comme modèle tyoe d'agent inducteur de

différenciation. nous avons montré que la souche K562 dont

noUs disposons. synthétise de l'hémoglobine. Parallèlement

on observe des modifications dans le profil des glycopro­

téines. Des travaux sont en cours pour affiner le modèle

d'étude et pour essayer de s~lectionner des drogues anti­

cancéreuses, qui en plus de leur impact sur 185 glycooro­

téines membranaires, aurôient des effets différenciants.

Car WARREN et BUCK 2001 pensent que si une drogue pou-

rait "normaliser" les glycoprotéines membranaires, elle

"normaliserait" ainsi les cellules cancéreuses.

Cette nouvelle approche de l'action des mpdicaments

anticancéreux est réconfortante pour l'esorit, car on ne

chercherait plus ~ tuer la cellule mais à la rendre

" no r mal e" ~T 'c" par la on éviterait les limites actuelles de

la chimiothéraoie, dues aux effets cytotoxiques vis-à-vis

des cellules normales de l'organisme.

BIBLIOGRAPHIE

1 - ABERCROMBIE M., AMBROSE J.E.The surface properties of cancer cellsCancer Res., 1962, 2~, 525.

a review.

235

2 - ABERCROMBIE M., HEAYSMAN J.E.M.Observations on the social behavior of cells in tissueculture. I. Speed of movement of chick heart fibroblastsin relation to their mutual contacts.Exp. Cell. Res., 1953'2' 111.

3 - ADAMS S.L., SOBEL M.E., HOWARD B.H., OLDEN K.,YAMADA K.M., DE CROMBRUGGHE B., PASTAN I.Levels of translatable mRNAs for cell surface protein,collagen precursors and two membrane proteins are alteredin Rous Sarcoma Virus-tra~sformed chick embryo fibroblasts.Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, 74, 3399.

4 - AGNERAY, J.Glycoprotéines: structures et activités biologiques.Rencontre biologique, 1977, Expansion Scientifique,Paris, Edi t.

5 - ALTER, B.P o and GOFF, S.C.Electrophoretic separation of human embryonic globindemonstrates.",.', -Thalassemia" in humam leukemia cell line K562.Biochem. Biophys. Res o Commun., 1980, ~, 843.

6 - AMES, G.F.L., and NIKAIDO, KoTwo-dimensional gel &lectrophoresis of membrane proteins oBiochemistry, 1976, 15, 616.

7 - ANDERSON, L. and ANDERSON, N.G.High resolution two-dimensional electrophoresis of humanplasma proteins.Proc. Natl. Acad. Sei. U.S., 1977, 74, 5421.

8 - ANDERSSON, L.C. and GAHMBERG, CoG.Surface glycoproteins of human white blood cellso Analysisby surface labelling.Blood, 1978, 52, 57.

9 - ANDERSSON, L.C.,NILSON, K., GAHMBERG, C.G.K562 - A human erythroleukemic cell line.Int. Jo Cancer, 1979, 23, 143.

10 - ANDERSSON, L.c., WASASTJERNA, C. and GAHMBERG, C.G.Different surface glycoprotein patterns on human T-, B­and leukemic-Iymphocytes.Int. J. Cancer, 1976, 11, 40 0

236 :

11 - ANDERSSON, L.C., GAHMBERG, C.G., TEERENHOVI, L. andVUOPIO, P.Glycophorin A, as a cell surface marker of earlyerythroid differen t: .:~.tion in acute leukemia.Int. J. Cancer, 1979, 23,717.

12 - ASHWELL G., MORELL A.G.The role of surface carbohydrates in the hepaticrecognition and transport of circulating glycoproteins.In, Advances in Enzymology, MEISTER A., WILEY J.,N.Y. Academie Press, 1974, 41, 99.

13 - ASHWELL G., MORELL A.G.Membrane glycoproteins and recoRnition phenomena.T.LB.S., 1977, ~, 76.

14 - AUB. J.C., SANFORD B.H., COTE M.N.Studies on the reactivity of tumor and normal cells toa wheat germ agglutinineProc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1965, 54, 396.

15 - BENZ, E.J., MURNANE, M.J., TONKONOW, B.L.EmbryomiC-fetal erythroid characteristics of a humamleukemic cell line.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1980, 77, 3509.

16 - BHAKDI, S., KNUFERMANN, H. and WALLACH, D.F.H.Separation of EDTA-Extractable erythrocyte membraneprotein by isoelectric-focusing linked to electrophoresisin sodium dodecyl sulfate.Biochim. Biophys. Acta•• 1974, 345, 448.

17 - BHAKDI,S., KNUFERMANN, H. and WALLACH, D.F.H.Separation of hydrophobic membrane proteins by isoelectri­focusing linked to sodium dodecyl sulfate gel electro­phoresis.In : Progress in isoelectric-focusing and isotachopho­resis, Ed. P.G. RIGHETTI, 1975, 281.

18 - BHAVANANDAN V.P., DAVIDSON E.A.Characteristics of a mucin type sialoglycopeptide producedby B16 mouse melanoma cells.Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, 70, 139.

19 - BOBB, D., and HOFSTEE, B.M.J.Gel ~soelectric-focusing for following the successivecarbamylations of amino-groups in chymotrypsinogen A.Anal. Biochem., 1971, 40, 209.

20 - BONNER, W.M., and LASKEY, R.A.A film detection method for tritiumlabelled proteins andnucleic acids in polyacrylamide gels.Eur. J. Biochem., 1974, 46, 83.

237

21 - BOSSMANN, H.B.Biosynthesis of glycoproteins in normal and oncogene virustransformed cells.In : MONTREUIL J. : Methodologie de la structure et dumétabolisme des glycoconjugués.Acte du colloque international nO 221 du CNRS, Villeneuved'Ascq, 20-27 juin 1973, Vol. II, 909-920, Edit. CNRS PARIS.

22 - BRAMWELL M.E., HARRIS H.An abnormal membrane Blycoprotein associated with malignancyin a wide ranRe of different tumours.Proc. R. Soc. Lond. Biol., 1978, 201, 87.

23 - BUCK C.A., FUHRER J.P., SOSLAU G., WARREN L.Membrane glycopeptides from subcellular fractions of controland virus-transformed cells.J.Biol. Chem., 1974, 249, 1541.

24 - BUCK, CoA. 1I GLICK,M.C. and WARREN, L.A comparative study of glycoproteins from the surface ofcontrol and ROUS sarcoma virus transformed cells.Biochemistry, 1970, ~' 4567.

25 - CARPENTIER, Y.Utilisation de la cellule L1210 en culture comme modèlede mesure de flux métaboliques. Application à l'étude dedrogues anticancéreuses.Thèse, Doct. 3ême cycle, Pharm., REIMS 1981.

26 - CARPENTIER, Y., KOUAMOUO, J., DESOIZE, B. and JARDILLIER,J.C.Relation-ship between glycolysis and prolifération of L1210cells in .vitro : effect of a new pharmacological effector :RA-233.Biochemical Pharmacolo~y, 1980, 29, 2690.

27 - CARTER, W.G., FUKUDA, M., LINGWOOD, C., HAKOMORI, S.I.Chemical composition, gross structure, and organization oftransformation sensitive glycoproteins.N.Y. Acad. Sei., 1978, 75, 160.

28 - CHEN, K.Y., KRAMER, R.H., and CANELLAKIS, E.S.Isolation and characterization of surface glycoproteinsfrom L1210, P-388 and Hela cells.Biochim. Biophys. Acta, 1978, 507, 107.

29 - CHEN, K. Y., TSAI, C. M., and CANELLAKIS, E. S.Comparison of physical and immunological properties ofplasma membranes of two mouse leukemia cell lines, P-388and L1210.Cancer Research, 1975, 35, 2403.

238

30 - CHEN, LoB., BURRIDGE, D., MURRAY, Ao , WALSH, M.L.,COPPLE, C.D., BUSHNELL, A., Mc DOUGALL, J.K., GALLIMORE, ~.H.

Modulation cf cell surface glycocalyx. Studies on largeexternal transformation. Sensitive proteineIn, Annals of the N.Y. Academy of Sciences, 1975, 312, 366.

31 - CLEMENSTON, KoJ., CAPITANIO, A. and LUSHER, E.F.High resolution two-dimensional gel electrophoresis ofthe proteins and glycoproteins of human blood plateletsand platelet membranes.Biochim o Biophys. Acta 1979, 553, 11 0

32 - CODINGTON, J.F., SANFORD, B.H. and JEANLOZ, R.W.Glycoprotein coat of the TA3 cellel - Removal of carbohydrate and protein material fromviable cells.J. Natl. Cancer Inst., 1970, 45, 637.

33 - CODINGTON, J.F., SANFORD, B.H., JEANLOZ, R.W.Isolation and partial characterization of a sialic acidcontaining glycoprotein fraction.Biochemistry, 1972, !!' 2559.

34 - CODINGTON, J.F., TUTTLE, B. and JEANLOZ, R.W.Methods for the removal, isolation and characterizationof glycoprotein fragments from the TA3 tumor cell surface.Actes du Colloque International nO 221 du C.N.R.S.,Villeneuve d'Ascq, 20-27 juin 1973, Vol. II, 793-801,Ed. CoN.R.S., PARIS.

35 - COMOE, L.Etude électrophorétique des protéines membranaires descellules L1210 cultivées in vitro.D.E.A., Pharm., Paris, 1979.

36 - COOK, G.M.W.A sialomucopeptide liberated by trypsin from the humanerythrocyte.Nature, 1960, 188, 1011.

37 - DAVIS, B.J.Disc electrophoresis : method and application to humansserum proteins.Ann. NoY. Ac ad. Sci., 1964, 121, 404 0

38 - DEAN, A., ERARD, F., SCHNEIDER, A.B., SCHNEIDER, A.N.Induction of hemoglobin accumulation in human K562 cellsby hemin is reversible.Science, 1981, 212, 459.

39 - DEBRAY, H.Les glycoconjugués de la membrane des cellules normaleset cancéreuses.Bull. Cancer (Paris), 1979, 66, 353.

23 9

40 - DEBRAY, H., MONTREUIL, J.Isolation and characterization of surface glycopeptidesfrom adult rat hepatocytes in an established line.Biochimie, 1978, 60, 697.

41 - EMMELOT, P.Biochemical properties of normal and neoplasic ce Ilsurface : a review.Euro J. Cancer, 1973, ~, 319.

42 - EPSTEIN, H.F. and WOLF, J.A.Peptide mapping of contractile proteins : two-dimensionalanalysis of cyanogen bromide fragments on polycrylamidegel.Anal. Biochem., 1976, 76, 157.

43 - ESSEX, M.Horizontally and vertically transmitted oncornavirusesof cats oIn, Advances in Cancer Research,KLEIN, G., WEINHOUSE, S., N.Y. Academie Press, 1975, ~, 319.

44 - FAIRBANKS, G., STECK, T.L. and WALLACH, D.F.H.Electrophoretic analysis of the major polypeptides of thehuman erythrocyte membrane.Biochemistry, 1971, 10, 2606.

45 - FAULK, W.P., CONOCHE, L.B., TEMPLE, A., PAPAMICHAIL, M.Immunobiology of membrane-bound collagen on mousefibroblasts.Nature (Lond.), 1975, 256, 123.

46 - FINNE, J.Structure of the O-glycosidically linked carbohydrateunits of rat brain glycoproteins.Biochim. Biophys. Acta, 1975, ~, 317.

47 - FISH~~N, P.H., BRADY, R.O., AARONSON, S.A.A comparison of membrane glycoconjugates from mouse cellstransformed by murine and primate RNA sarcoma viruses.Biochemistry, 1976, 15, 201.

48 - FRIEND, C., SHER, W., HOLLAND, J.G. and SATO, T.Hemoglobin synthesis in murine virus-induced leukemiccells in vitro: stimulation of erythroid differentiationby dimethyl sulfoxide.Proc. Natl. Acad. Sei., 1971, 68, 378.

49 - FUKUDA, r-l.K562 human leukaemic cells express fetal type (i) anti.p:enon different glycoproteins from circulating erythrocytes.Nature, 1980, 285, 405.

50 - FURTHMAYR, H.Structural analysis of a membrane glycoproteinglycophorin A.J. Supramol. struct., 1977,2, 121.

240

51 - GAHMBERG, C.G. and ANDERSSON, L.C.K562-A Human leukemia cell line with erythroid features.Seminars in Hematology, 1981, 18, 72.

52 - GAHMBERG, C.G., JOKINEN, M., and ANDERSSON, L.C.Expression of the major sialoglycoprotein (glycophorin)on erythroid cells in human Bone Marrow.Blood, 1978, 52, 379.

53 - GAHMBERG, C.G.External labelin~ of human erythrocyte glycoproteins.Studies with galactose oxidase and fluorography.J. Biol. Chem., 1976, 251, 510.

54 - GAHMBERG, C.G., ANDERSSON, L.C.Selective radioactive labeling of cell surface sialo­glycoproteins by periodate-tritiated borohydride.J. Biol. Chem., 1977, 252, 5888.

55 - GAHMBERG, C.G. P and ANDERSSON, L.C.Identification and characterization of normal and malignanthuman blood leukocytes by surface glycoprotein patterns.N.Y. Acad. Sci., 1978, 75, 240.

56 - GAHMBERG, C.G., HAKOf'.lORI, S.Altered growth behavior of malignant cells associatedwith changes in externally labeled glycoprotein andglycolipid.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1973, 70, 3329.

57 - GAHMBERG, C.G., and HAKOMORI, S.I.External labeling of cell surface galactose and galacto­samine in glycolipid and glycoprotein of human erythrocytes.J. Biol. Chem., 1973, 248, 4311.

58 - GAHMBERG, C.G., HAYRY, P., ANDERSSON, L.C.Characterization of surface glycoproteins of mouselymphoid cells.J. Celle Biol., 1976, 68, 642.

59 - GARRELS, J.I.Computer-analysed two-dimensional gel electrophoresisof proteins.T.I.B.S., 1980, Nov., 281.

60 - GASTPAR, H.Inhibition of cancer ce Il stickiness by anticoagulants,fibrinolytic drugs and pyrimido-pyrimidine derivatives.Hemat. Rev., 1972, ~, 1.

61 - GERNER, E.W., GLICK, M.C., and WARREN, L.Membranes of animal cells.V - Biosynthesis of the surface membrane during the cellcycle.J. Celle Physiol., 1969, 75, 275.

241

62 - GLENNEY, J.R., and WALBORG, E.F. Jr.Accessibility of olasma membrane sialoglycoconjurratesof Novikoff tumor cells to exor;enous neuraminidase andproteases.Biochim. Biophys. Acta, 1980, 599, 493.

63 - GLICK, C.A., RABIJ\lOVlITZ, Z., SACHS, L.Surface membrane glycopeptides corrolated with tumori­genesis.Biochemistry, 1973, 12, 4864.

64 - GLICK, r1.C.Isolation and characterization of surface membraneglycoproteins from mammalian cells.In : Methods in membrane biology, 1973, ~' 157.

65 - GLICK, M.C., COT-1STOCK, C.A., COHEN, r.1.A., and WARREN, L.Membranes of animal cells.VIII - Distribution of sialic acid, hexosamines, andsialidase in L CelleBiochim. Biophys. Acta, 1971, 233, 247.

66 - GOLD, P., GOLD, r-1., FREEMAN, S. O.Cellular location of carcino-embryonic antigens of thehuman digestive system.Cancer Res., 1968, ~' 1331.

67 - GOLDMAN, I.D.The characteristics of the membrane transport of Amethop­terin and the naturally occuring folates.N.Y. Acad. Sci., 1971, 186, 400.

68 - GOTTSCHALK, A., FAZEKAS de st GROTH, S.On the relation ship be~leen the indicator profile andprosthetic group of mucoproteins inhibitory for influenzavirus heamagglutinin.Biochem. Biophys. Acta, 1960, 43, 513.

69 - GREGORIADIS, G., MORELL, A.G., STERNLIEB, I.,SCHEINBERG, I.H.Catabolism of desialylated ceruloplasmin in liver.J. Biol. Chem., 1970, 245, 5833.

70 - GREIG, R.G., JONES, M.N.Mechanisms of intercellular adhesion.Biosystems, 1977, ~' 43.

71 - GRIMES, W.J.Glycosyltransferase and sialic acid levels of normaland transformed cells.Biochemistry, 1973, ~' 990.

72 - GRH1T-1, E.A. and BONAVIDA, B.Studies on the induction and expression of T-cell-midiateimmuni ty.VI - Heterogeneity of lytic efficiency exhibited byisolated cytotoxic T-lymphocutes prepared from hiqhlyenriched populations of effector-target cell conju?ates.J. Immunol., 1977, 119, 1041.

73 - HAKOMORI, S.I.structures and organization of cell surface glycolipids.Dependency on ce Il ~rowth and malignant transformation.Biochim. Biophys. Acta, 1975, 417, 55.

242

74 - HAKOMORI, S. 1., and rmRAKAMI, W. T.Glycolipids of hamster fibroblasts and derived malignanttransformed cell lines.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., 1968, 59, 254.

75 - HERBEMAN, R.B.Immuno,r;enici ty of tumor anti~ens.

Biochim. Biophys. Acta, 1977, 473, 93.

76 - HOFFHAN, R., l BRAI-lIJ'.'l, N., MURNANE, r·T.J., DIAMOND, A.,FORGET, B.G., LEVERE, R.D.Hernin control of hene biosynthesis and catabolism in ahuman leukemia cell line.Blood, 1980, 56, 567.

77 - HOFFMANN, C.C., MOORE, X.C., SHIH, C.Y., BLAKLEY, R.L.Scanning electron microscopy of human lymphocytes duringtransformation and subsequent treatment with methotrexate.J. Celle SCi., 1977, 28, 151.

78 - HORST, M.N., and ROBERTS, f'1.Analysis of polypeptide turnover rates in chinese hamsterovary cell plasma membranes using two-dimensional electro­phoresis.J. Biol. Chem., 1979, 25, 5000.

79 - HOURANI, B.T., CHACE, l'J.H., and PINCUS, J.H.Pasma membrane glycoproteins from nucleated cells.l - Preparative techniques for isolation and partialcharacterization of a membrane glycoprotein extractfrom L1210, cells with lectin receptor activity.Biochim. Biophys. Acta, 1973, 328, 520.

80 - HUDGIN, R.C., PRICER, W.E., ASHWELL, G., STOCKERT, R.J.,MORELL, A.G.The isolation and properties of a rabbit liver bindingprotein specific for asialoglycoproteins.J. Biol. Chem., 1974, 249, 5536.

81 - HUGHES, R.C.Glvconroteins as components of cellular membranes.Prog. in Biophysics and ~olecular Biology, 1973, 26, 191.

82 - HUGHES, R.C.The complex carbohydrates of mammalian cell surfaces andtheir bioloBical roles.Essays Biochem., 1975, !!, 1.

243

83 - HUGHES, R.C., and NAIRN, R.Labeling, solubilization, and peptide mapping o~ ~ibroblast

sur~ace glycoprotein oN.Y. Acad o SCi., 1978, 75, 192 0

84 - ffivANG, KoM., SARTORELLI, A.C.Use o~ plant lectin-induced agglutination to detect alte­rations in sur~ace architecture o~ sarcoma 180 caused byantineoplasic ag,ents.Biochem o Pharmacol., 1975, 24, 1149 0

85 - HYNES, RoD., DESTREE, AoT., MAUTIJER, V.M., and lU, A.Synthesis, secretion and attachment o~ LETS glycoproteinin normal and trans~ormed cells.J. Supramol. Struct o , 1977, 2, 397.

86 - HYNES, R.O.Cell sur~ace proteins and malignant trans~ormation.

Biochim. Biophys. Acta, 1976, ~, 73.

87 - I-IYNES, R00., BYE, J. 1,1.Density and cell cycle dependence o~ ce Il sur~ace proteinsin hamster ~ibroblasts.

Cell., 1974, ~, 113.

88 - UmAR, j,l., SACH S , L.Structural di~~erence in sites on the sur~ace membraneo~ normal and trans~ormed cells.Nature, 1969, 223, 710.

89 - lU, A., and J-lYNES, R.O.E~~ects on LETS ~lycoprotein on cell mobilityoCell, 1978, .!1, 439.

90 - JACOBS, So, SHECHTER, Y., BISSEL, K., CUATRECASAS, PoPuri~ication and properties o~ insulin receptors ~rom ratliver membrane.Biochem. Biophys. Res. Commun, 1977, 77, 981.

91 - J A.l\JSONS, V. K0 and BURGER, T'I.Isolation and characterization o~ agglutinin receptor sites.II - Isolation and partial puri~ication o~ a sur~ace mem­brane receptor ~or wheat germ agglutininoBiochim. Biophys. Acta, 1973, 291, 127.

92 - JANSONS, V.K., SAKAl/[OTO, C.K .. , and BURGER, T'T.H.Isolation and characterization o~ agglutinin receptor sites.III - Studies on the interaction with other lectins.Biochim. Biophys. Acta, 1973, 291, 1360.

93 - JEANLOZ, RoI" .. , CODINGTON, J.F. and SANFORD, B.H.Cell sur~ace glycoproteins o~ two sublines o~ the TA 3tumor.Jo Natl. Cancer Inst o , 1973, 51, 585 ..

94 - JOHNSEN, S. and STOKKE, T.Hela cell plasma membranes.III - Incorporation o~ (3H) ~ucose into plasma membraneglycoproteins during the cell cycle ..ExptL CelL Res., 1977, 109, 53. ~

95 - JOKlNEN, fit., GAHfiTBERG, C.G., AJ\IDERSSON, L.C.Biosynthesis of the major human red cell sialo~lyco­

protein, glycophorin A in a continuous cell line.Nature, 1979, 279, 604.

96 - JUSTISZ, M., LLOSA, P.Glycoproteins as hormones and as enzymes.In : GOTTSCHALK A. Edi t. ELSEVIER, Amsterdam,1972, Part B, 1019.

97 - KALANT, H., t10NS, H. and GUTTI1AN, H.Sialic acid content of normal rat liver and of DAB­induced hepatoma.Cano J. Physiol. Pharmacol., 1964, 42, 25.

98 - KASPAR, D.H., KALTENBACI-I, J.B.Incorporation of glucosamine-3H into extracellularglobulin by Ehrlich ascites tumor cells.Experimental and molecular pathology, 1975, 23, 500.

99 - KATMAH, R.H., IolHIZLER, R.J. and JOHSOlJ, C.A.Preparation of an inhibitor of viral hemagplutinationfrom human erythrocytes.J. Exptl o !1ed., 1961, 113, 37.

100 - KN'IASAKI, T., ASHvlELL, G.Carbohydrate structure of 81ycopeptides isolated fromhepatic membrane bindinp, protein specifie for asialo­rrlycopro te ins.J. Biol. Chem., 1976, 251, 5992.

101 - '!...A\'JASAKI, T., and YAT1ASHH!A, 1.!1etabolic s tud ie s of Rat liver pl asma membrane usi n,r, D­(I-14C) glucosamine.Biochim. Biophys. Acta, 1971, 225, 234.

102 - KENJI, S., TmnDA, 111., HOZmn, n.Differentiation-associated chanpesin membrane proteins ofmouse myeloid leukenia cells.Biochim. Biophys. Acta, 1979, 587, 169.

103 - T\H', Y.S., ':!HITEI-lEAD, J.S., and PERDOMO, JoGlycoproteins of cultured epithelial cells from humancolonie adenocarcinoma and fetal intestine.Eur. J. Cancer, 1979,1:2,725.

104 - KLEIN, E., BEN-BASSAT, H., NEUMANN, H., RALPH, P.,ZEUTHEN, J., POLLIACK, A., VANKY, F.Properties of the K562 cell line, derived from a patientwith chronic-myeloid leukemia.Int. J. Cancer, 1976, 18,421.

105 - KOCH, H.j'·10pidamol : a tumor cell aggregation inhibi tor.In, Pharmacy international, Elasvier/North-HollandBiomedical Press, 1981,25.

244

245

106 - KORNFELD, S.The nature of cell surface receptor site for lens culinarisphytohemagglutinin.J.Biol. Chem., 1971, 246, 6581.

107 - KORNFELD, S., and KORNFELD, R.Solubilization and partial characterization of a phyto­hemagglutinin receptor site from human erythrocytes.Proc. Natl. Sei., 1969, 63, 1439.

108 - KOUN~OUO, J.Effet du methotrexate sur le metabolisme énergétique dela cellule L1210 in vitro.Thèse, Dct 3ème cycle, Pharm., Reims, 1980.

109 - KOUAMOUO, J., CARPENTIER, Y., DESOIZE, B., andJARDILLIER, J.C.Methotrexate-induced alterations of aerobic metabolismand biosynthesis of glycoconjugates in L1210 cells.In, Drug Measurement and Drug Efferts in LaboratoryHealth Science. SIEST G. and YOUNG D.S. Edit., KARGER p 1980.

110 - KURTH, R., BAUER, H.Avian RNA tumor viruses. A model for studying tumorassociated cell surface alterations.Biochim. Biophys. Acta, 1975, 417, 1.

111 - LAEf1MLI, U.K.Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriopha~e T4.Nature, 1970, 227, 680.

112 - LASKEY, R.A., and MILLS, A.D.Quantitative film detection of 3H and 14C in polycrylamidegel by fluorographie.Eur. Jo Biochem., 1975, 56, 335.

113 - LAZO, J .S., H\'IANG, K.T',1. and SARTORELLI, R.C.Inhibition of L-fucose incorporation into glycoprotein ofsarcoma 180 ascites cells by 6-Thiop,uanine oCancer Research, 1977, 37, 4250.

114 - LEBLOND, C.P., BENNETT, G.Biogenesis of glycoproteins as show by radioautographyoJ. Histochem o Cytochem., 1979, 27, 1185.

115 - LENHINGER, A.L.Biochimie.Edit. Française, FLN~MARION, 1977 0

116 - LIS, Ho, SHARON, N.The biochemistry of plant lectins.In, Annual Review of Biochemistry, SNELL E.E. Palo ALTO,Annual Reviews Inc, 1973, 42, 541.

246

117 - LKB : Application note 250, Déc. 1977.

118 - LLOYD p C.W.Sialic acid and the social behaviouz of celleBiol. Rev., 1975, 50, 325.

119 - LLOYD, E. KGf Jr. and rTORRISON, IIt.The visualization of human erythrocyte membrane proteinsand glycoproteins in SDS-Polyacrylamide gels employinp, asingle staininq procedure.Analytical Biochemistry, 1976, 2l, 223.

120 - LODISH, H. et ROTHTtltN, J.L'assemblap,e des memhranes cellulaires.Pour la Science, 1979, !Z' 22.

121 - LOUISOT p p.Biochimie structurale.l - Glucides.Simep Edi tions, Lyon, 1976, 123.

122 - LO'.·TRY, O.H., ROSENBROUGH, N.J., FARR, A.L., and RANDALL, R.J.Pro teins measurement with the folin phenol reagent.J. Biol. Chem., 1951, 193, 265.

123 - LOZZIO, C.B., LOZZIO, B.B.Human chronic myelo~enous leukemia cell line with positivePhiladelphia chromosome.Blood, 1975, 45, 321.

124 - i1ArJABE, T., TACHI, K., KOJIHA, K. and OKUYAHA, T.Two-Dimensional electrophoresis of plasma pro teins withoutdenaturing agents.J. Biochem., 1979, 85, 649.

125 - !',TANABE, T., TAKAHASHI, N., KOJIHA, K., SHINODA, T., andOKUYAJ.1A, T.~~o-Dimensional electrophoresis of immunoglobulin myelomaproteins in the absence of denaturinr; ar;ents.J. BiochemGf 1980, 87, 451.

126 - HARCHESI, V. T., FUHTHTlAYR, H., Torn TA , rTeThe red cell membrane.Annual Review of Biochemistry, 1976, 45, 667.

127 - T,IARCHESI, V.T., TILLACK, T.l:i., JACKSor;, R.L.,SEGREST, J.p., ~COTT, R.E.Chemical characterization and surface orientation of themajor alycoprotein of the human erythrocyte membrane.Proc. NatL Acarl. Sel. U.S.A., 1972, 69,1445.

128 - TTARr;.OLIS, J., ;:E;m.ICiC, K. (;.Elec trophoresi s in poly acry lamide concen tration rtrad ien t.Biochem. Biophys. Res. C;omrnun., 1967, 27, 68.

247

129 - J'v1ARKvlELL, f1.A.K., and FOX, C.F.Surface-Specifie Iodination of membrane proteins of virusesand eucaryotic cells usin~ 1, 3, 4, 6, Tetrachloro-36 - diphenyl-~lycoluril.

Biochemistry, 1978, ~' 4807.

130 - f-1ARTOf.T, L.S.G., and ~&~.vnT, J.E.Subunit structure of the major human erythrocyte plyco­protein : depolyrnerization by heating ghosts with sodiumdodecyl sulfate.Biochem. Biophys. Res. Commun., 1973, ~' 1457.

131 - ~c CLAY, D.R., ~OSCONA, A.A.Purification of the specifie cell-aRp,regatinr: factor fromembryonic neural retina cells.Exp. Celle Res., 1974, 87, 438.

132 - Mc CORMICK, J.L, SUSTEN, S.S., RADER, J.I. andFREISHED.1, J.H.Studies of a methotrexate binding protein fraction fromL1210 lymphocyte plasma membrane.Eur. J. Cancer, 1979, 12, 1377.

133 - Mc GREGOR, J.L., CLEMETSON, K.J., JAMES, E., LUSHER, E.F.,and DECHAVANNE, r·1.Characterization of human blood platelet membrane proteinsand glycoprote ins by the ir isoe lec tric point (p 1) andapparent molecular weiBht usinr: two-dimensional electro­phoresis and surface-Iabellinr: techniques.Biochim. Biophys. Acta, 1980, 599, 473.

134 - MILENKOVIC, A.G., RACH!·1F.LER, r1., and JOHNSON, T.C.Grouth and metabolism of fucosylated plasma-membraneglycoproteins in mouse neuroblastoma N2a cells.Biochem. J., 1978, 176, 695.

135 - MONTREUIL, J.Recent data on the structure of the carbohydrate moietyof glycoproteins. f·1etabolic and biological implications.Pure and Applied Chemistry, 1975, 42, 431.

136 - f\WRA, P. T., CUMAR, F .A. and BRADY, R. O.A common biochemical change in SV 40 and polyoma virustransformed mouse cells coupled to control of cellrsrowthin culture.Virology, 1971, 46, 60.

137 - MOflELL, A.G., GREGORIATIS, G., SCHEINBERG, I.H.,HIC!C!·1AN, J., ASHi'JELL, G.The role of sialic acid in determining the survival ofglycoproteins in the circulation.J. Biol. Chem., 1971, 246, 1461.

248

138 - r,WRRIS, D.R., and FILLINGN-Œ, R.H.Re~ulation of amino acid decarboxylation.Ann. Rev. Biochem., 19 74, 43, 303.

139 - NE1:!T'TA1\T, R.A., GLOCKl\,JER, 1:!."!., UHLErŒRUCK, G.Immuno-chemical detection of the Thomsen-FriedenreichAntiq:en (T-an tigen) on the pif' lymphocyte plasma membrane.Eur. J. Biochem., lCJ76, ~, 373.

140 - NICOLSON, G.L.Trans-~embrane control of the receptors on normal andtumor cells.II - Surface chan~es associated with transformation andmalignancy.Biochim. Biophys. Acta" 1976, 458,1.

141 - O'FARRELL, P.H.Hir::h resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.J. BioL Chem., 1975, 250, 4007.

142 - O'FARRELL, P.F!., and 0' FARRELL, P.Z.Two-dimensional polyacrylamide [",:el electrophoreticfractionation.In methods in cell biolopy : chromatin and chromosomalresearch.Academie Press ~.Y.

G.S. STEIN, J.L., STEIN EDITORS 1975, 407.

143 - OGATA, S.I., MURAMATSU, J., KOBATA, A.New structural characteristic of the lar~e ~lycopeptides

from transformed cells.:'Jature (Lond.), 1976, 259,580.

144 - OHTA, N., PARDEE, A.B., T'1c AUSLAi\J, B.R., and BURGER, iT.TT.Sialic acid contents and controls of normal and controlsof normal and malignant cells.Biochim. Biophys. Acta, 1968, 158, 98.

145 - OLDEN, K., PRATT, R.;:., YM1ADA, K.rT.Role of carbohydrates in protein secretion and turnover :effects of tunicaw-ycin on the major cell surface glycopro­tein of chick embryo fibroblasts.Cell, 1978, 13, 461.

146 - ORNSTEIN, 1.Dise electrophoresis.Ann. N.Y. Acad. SeL, 1964, 121,321.

147 - PE~A, S.D.J., MILLS, G., and HUGHES, R.C.~~o-dimensional electrophoresis of surface plycoproteinsof normal BH/( cells and ricin resistant mutants.Biochim. Biophys. Acta 1979, 550, 100.

148 - PHILLIPS, D.R. and HORRISOn, i-f.EXDosed protein on the intact human ervthrocyte.Diochemistry,lQ71, 10, 1766.

nucleic acidsçel.

249

149 - POUYSSEGUR, J., WILLINGHAH, f:1., PAS TAN , I.Role of ce Il surface carbohydrates and pro teins in cellbehavior : studies on the biochemical reversion of anN-acetyl-,r;lucosamine deficient fibroblast mutant.Proc. Natl. Acad. SeL U.S.A., 1977, 74,243.

150 - REISNER, A.H., NEMES, P., BUCHOLTZ, C.The use of coomassie brilliant blue G250 perchloric acidsolution for stainins in electrophoresis and isoelectricfocusinp: on polyacr\rlamide ReIs.Anal. Biochem., 1975, 64, 509.

151 - RIGHETTI, p.G., DRYSDALE, J.W.Isoelectric focusinr in polyacrylanide ~els.

Biochem. Biophys. Acta, 1971, 236, 17.

152 - RIGliET'I'[, p.r.. DHYSDALE, J .1,1.smal-SCr

lle fractionation of proteins and

by isoe ectric focusinr in polycrylamideAnn. il.Y. Acad. SeL, 1973, 209, 163.

153 - ROBBINS, J.C., NICOLSON, G.L.Surfaces of nornal and transformed cells.In Biolo~V of tumours : surfaces inmunolo~y and conparativepathology.M.Y., Plenum Pluhishing Corporation, 1975, 1, 3.

154 - ROBB pTS, J. C., and rHCOLSmI, r.. L.Surfaces of normal an~ transformed cells.In : Cancer 4, 1975. A comprehensive Treatise. Plenu~

Press. N.Y. and Londo~.\,i

155 - ROBRINS~ P.W., WICKUS, G.G., GRA~JTON, P.E., GAFFNEY, B.J.HIRSCHBERG, C.B., FUCllS, P., BLUf:TI3ERG, p.r,~.

The chick fibroblast cell surface after transformation byROUS Sarcoma Virus.In, co Id sprinq harbor symposia on quantitative biology.N.Y., Cbld Sprin~ Harbor Laboratory, 1974, 39, 1173.

156 - ROHRSCHl'JEIDER, L.R., KURTH, R., BAUER, H.Biochemical characterization of tumor-specific cell surfaceanti~ens on avian oncornavirus transformed cells.virolopy, 1975, 66, 481-

157 - ROSPJBERG, A., and SCl-lENGRUND, C. L.SIALIDASES.In, Biolo~ical roles of sialic acid Edit. Ey A. ROSENBERGand C.L. SCHErlr.RUND, Plenum Press. N.Y., Lond.,1976, CH 10, 195.

158,- RO:THHAN, J.E., LE1'JARD, J.Membrane asymmetry. The nature of membrane asymmetryprovides clues to the puzzle of how membranes are assemhled.Science, 1977, 195, 743.

250

159 - RUOSLAHTI, E., VAHERI, A., KUUSELA, P., LINDER, E.Fibroblast surface antigen : a new serum proteineBiochim. Biophys. Acta, 1973, 322, 352.

160 - RUTHERFORD, T.R., CLEGG, J.B., WEATHERALL, D.J.K562 human leukaemic cells synthesize embryonic haemo­globin in response to haemin.Nature, 1979, 280, 164.

161 - RUTHERFORD, T.R., and WEATHERALL, D.J.Deficient heme synthesis as the cause of noninducibilityof hemoglobin sunthesis in a Friend erythroleukemia cellline.Cell., 1979, 16, 415,

162 - SAlTO, H., UZMAN, B.G.Production and secretion of chondroitin sulfates anddermatan sulfate by established mammalian cell lines.Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, 43, 723.

163 - SANFORD, B.H., CODINGTON, J.F., JEANLOZ, R.W., PALMER, r.D.Transplantability and antigenicity two sublines of the TA 3tumor.J. Immunol., 1973, 110, 1233.

164 - SHAPIRO, A.L., VINUELA, E., and MAIZEL, J. V. Jr.Molecular weight estimation of polypeptide chains byelectrophoresis in SDS-polyacrylamide gel.Biochem. Biophys. Res. Commun., 1967, 28, 815.

165 - SHARON, N.Lectins = Cell-a~glutinating and sugar specifie proteins.Sciences, 1972, 177, 949.

166 - SHARON, N.Lectins.Scientific American, 1977, 236, 108.

167 - SHARON, N.Les glucides.Pour la science, 1981, 39, 12.

168 - SHIU, R.P.C., POUYSSEGUR, J., PASTAN, I.Glucose depletion accounts for the induction of twotransformation sersitive membrane proteins in ROUSSarcoma virus-transformed chick embryo fibroblasts.Proc. Natl. Acad. Sei., 1977, 74, 3840.

169 - SIMONET, G., ORlA, M.Les mesures de radioactivité à l'aide de compteur àscintillateur liquide.Edit. EYROLLES, 1977, PP. 157-179.

251

170 - SINGER, S.J., NICOLSON, G.L.The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.Science, 1972, 175, 720.

171 - SLATER, G.G.Pore-limit electrophoresis on a gradient of nolyacrylamidegel.Anal. Biochem., 1968, 24, 215.

172 - SLAYTER, H.S., and CODINGTON, J.F.Size and confiRuration of glycoprotein fragments cleavedfrom tumor ce Ils by proteolysis.J. Biol. Chem., 1973, 248, 3405.

173 - SMITHIES, O.Zone electrophoresis in starch ReIs : group variationsin the serum proteins of normal human adults.Biochem., J., 1955, ~' 629.

174 - STECK, T.L., DM/SON, G.Topographical distribution of complex carbohydrates in theerythrocyte membrane.J. Biol. Chem., 1974, 249, 2135.

175 - STRAUS, D. S., JONASSON, J., HARRIS, H.Growth in vitro or tumor cell X fibroblast hybrids in wichmalignancy is suppressed.J. CelI. SeL, 1977, 25,73.

176 - STRECKER Q G., FOURNET, B., BOunUELET, S., [\WN'TREUIL,J.,DHONDT, J.H., FARRIAUX, J.P.Etude chimique des mannosides urinaires excrétRs au coursde la mannosidose.Biocnimie, 1976, 5S, 579.

177 - STRECKER, G., TRENTE SAUX-CHAUVET, C., POITAU, A.,rlONTREUIL, J.Etude des oli~osnccharides riches en fucose présents dansles urines de su,i e ts sains et [:lé l i turiques de groupes ABet O.Biochimie, 1976, 58, 805.

1713 - STROTHi'.IGER, J. L., CRESShTELL, ?, GREY, H., ~nJITPHIŒYS, Ti. F.. ,f{ANN, D., >1c CUNf:, J., PAHIlAi1, P., ROBB, H., SANDEHSOl i ,A.n.,S?RINGER, T.A., ~ERHO~ST, C., TURNER, ~.J.

Transplant Rev., 1974, 21, 126.

179 - STUDIER, F.H.Analysis of bacteriophaue T7 larly RirAS and nroteins onslah crel.J. iToI. THol., F)'73, 79, 237.

. ,

252

180 - SVENSSON, H.Isoelectric fractionation.Analysis and characterization of ampholytes in naturalpH r'Tadients.l - The differential equation of solute concentrationsat a steady state and its solution for simple cases.Acta. Chem. Scand., 1961, 12, 325.

181 - TAKASAKIS, S., YN~ASHITA, K., KORATA, A.The sugar chain structures of ABO blood group activeglycoproteins obtained from human erythrocyte membrane.J. Biol. Chem., 1978, 253, 6086.

182 - TANAKA, T.Les gels.Pour la Science, 1981, 41, 62.

183 - TATTERSALL, H.H.N., JACKSOl'J, R.C., JACKSON, S.T.~:1., andHARRAP, KoR.Factors determining cell sensitivity to methotrexate :studies of folate and deoxyribonucleoside triphosphatepooling five mammalian cell lines.Europ. J. Cancer, 1974, 10, 819.

184 - TERRY, T.M., ZUPNIK, J.S.Weak association of glucosamine containing polymer withthe Acholeplasma laidlawii membrane.Biochim. Biophys. Acta, 1973, 291, 144.

185 - THOr''IAS, D.B. and HINZLER, R.J.Oligosaccharides from A-active sialoglycopeptides ofhuman ery throcyte.Biochem. Biophys. Res. Corn., 1969, 35, 811.

186 - TIOLLAIS, P., GALIBERT, F., LEPETIT, A., AUGER, f-1.A.L'électrophorèse des acides ribonucleiques en gel depolyacrylamide.Biochimie, 1972, 54, 339.

187 - TOMITA, M., MARCHESI, V.T.Amino acid sequence and olip,osaccharide attachment sitesof human erythrocyte p,lycophorin.Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1975, 72,2964 •

188 - TRENTESAUX, C., CŒIfOE, L., KOUAMOUO, J., JARDILLIER, J.C.Action d'une drogue anticancéreuse sur les protéinesmembranaires et les mécanismes transporteurs de thymidine,d'uridine et de 2-désoxyglucose chez la cellule L1210cultivée.Regard sur la Biochimie, 1980, ~' 54.

189 - TU, S.H., NORDOUIST, R.E., GRIFFIl'J, N.J.Membrane changes in hela cells srown vith cortisol.Biochim. Biophys. Acta, 1972, 290, 92.

253

190 - TUSZINSKI, G.P., B~<ER, S.R., FUHRER, J.P., BUCK, C.A.,WARREN, L.Glycopeptides derived from individual membrane glyco­proteins from control and ROUS Sarcoma virus-transformedhamster fibrohlasts.J. Biol. Chem., 1978, 253, 6092.

191 - VAHERI, A., and rrOSHER, D.LHigh molecular wei~ht, cell surface associated glyco­protein (Fibronectin) lost in malignant transformation.Biochim. Biophys. Acta, 1978, ~' 1.

192 - VAI~ER, H., and BUSSEL, A.Altered platelet surface plycoproteins in chronic myeloid .leukemia.Int. J. Cancer, 1977, 19, 143.

193 - VN:J BEEK, H.P., Sf'ŒTS, L.A., and Ef'T11ELOT, P. ~Increased sialic acid density in surface rrlycoprotein oftransformed and malirrnant cells-A rreneral phenomenon ?Cance r Res., 1 9 73 , 33, 29 13 •

194 - VAN BEEK, \'l.P., SfTETS, L.A., ET·1T.1ELOT, p.Chanq:ed surfac~ o:lycoprotein as a marker of malir~nancy

in human leukemic cells.Nature (Lond.), 1975, 253, 457.

195 - VAN BEEK, \:J.P., STTETS, L.A., E>1i'ŒLOT, P.,ROOZENDAAL, )'~.J., REHREi'IDT, H.Early recop:nition of hurnan leuker11ia by cell surfaceglycoprotein chan~es.

Leukemia Res., 1978, ~, 163.

196 - VAN NEST, G.A., GRIMES, W.J.A comparison of membrane components of normal and trans­formed BALB/C cells.Biochemistry, 1977, ~' 2902.

197 - VESTEBERG, O.Synthesis and isoelectric fractionation of carrierampholytes.Acta Chem. Scand., 1969, 23, 2653.

198 - VESTERBERG, O.Isoelectrkfocusinp: of proteins in polyacrylamide p:els.Biochim. Biophys. Acta, 1972, 257~ 11.

199 - HALBORG, E.F.J.R., DAVIS, E.T~., GILLJAT,1, E.D., ST-TITH, D.LCellular membranes and tumor cell behavior.Baltimore, \1illiams and viilkins Company, 1975, 337.

200 - WARREN, L., BUCK, C.A.The membrane r,lycoproteins of the malip,nant cellaClin. Biochem., 1980, 13, 191.

2541

.'

201 - WARREN, L., BUCK, C.A., and TUSZYNSKI, G.P.Glycopeptides changes and malisnant transformation.A possible role for carbohydrate in malignant behaviour.Biochim. Biophys. Acta, 1978, 516, 97.

202 - WARREN, L., FUHRER, J.P., and BUCK, C.A.Surface glycoproteins of normal and transformed cells :A difference determined by sialic acid and a prowth-depen­dent sialyl transferase.Proc.NatL Acad., SeL U.S. 1972, 69, 1838.

203 - WARREN, L., Fm~RER, J.P., BUCK,C.A.Surface r:;lycoproteins of cells before and élfter trans­formation by onco~enic viruses.Fed. ?roc., 1973, 32, 80.

204 - V1ATKINS, l'I. 1..7.

Blood ~roup specifie substances.In : GOTTSCHALK, A., Edit. Elsevier, Amsterdan,1972, Part B, P30.

205 - vlATT, F.H., HARRIS, II., OSBORrj, H., v!EnER, K.The distrihution of actin cab les and microtuhules inhybrids be"btreen mali(Tnant and non-malir:nant cells allcJin tumours derived from them.J. Celle SeL, FJ78, ~?, 419.

206 - HEBER, J(., and 0::180R1'), n.The reliahili ty of molecular weio:ht determinations bvdodecvl sulfate-oolvacrylamide ~el electrophoresis.J. Biol. Che~., 196~, 244, 4406.

207 - WEBER, !:., PPPlrèLF., J.H., and OSBORN, 1.;.1 - ~easurement of molecular weights by electrophoresison SDS-Acrylamide (1el.In : Pethods in Enzymoloçry, 1970, XXVI, 3.

208 - HEHJSTIUN, D.R., TTAR8H, J.B., r;.LICK, TiJ.C., andWARREN, L.T~emhranes of animal eells.VI - The (Tlycolipids of the L cell and its surface nemhrane.J. BioL Chem., 1970, 245, 32R.

209 - '.HENER, F., KLEIN, G., HARRIS, H.The analysis of malipnancy hy cell fusion.III - Hyhrids between diploid fibroblasts and other tumourcells.J. CelL Sei., 1971, ~, 681.

210 - WILKIE, D., E~ILSON, V., FVA~S, I.ll.Mi tochondria in oneor:enesi s •the lance t, 1975, 27, 697.

211 - \'1U, B.C., SPOHN, V/.H., and BUSH, H.Two-dimensional ~el electrophoresis of cytosol phospho­proteins of novikoff hepatoma and regenating liver.Cancer Research, 1979, ~, 116.

255

212 - YArtlADA, K.H., OLDEN, K.Fibronectins : Adhesive glycoproteinsand blood.Nature (Lond.), 1978, 275, 1 79.

of cell surface

, .

71, 3492.

213 -

214 -

YAI·1ADA, K.r'.1., and POUYSSEGUR, J. /::: '\\Cell surface 9,lycoproteins and malignanti~rahst6rmation~

~~I~~»"Biochimie, 1978, 60, 1221. ::r. .-, / .~'

YAMADA. K.H•• WESTON. J.A. '\"."~J,fIsolation of a major cell surface glycoprot~iDn~~~furv

......c'-"~fibroblasts.Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1974,

215 - ZAGURY, D., BERNARD, J., JEANNESSOl\J, P., THIERNESSE, N.,and CEROTTINI, C.Studies on the mechanism of T cells-mediated lysis atthe single effector cell level.l - Kinetie analysis of lethal hits and.tarp.:et cell lysisin multicellular conju~ates.

J. IMMUNOL., 1979, 123, 1604.