Méthode de détection directe simplifiée par PCR sur tache de sang séché de la mutation...

Immunoanal Btol Sp~c (1991) 28, 29-31 29 © Elsevier, Paris

Strategies d'exploration fonctionnelle et de suivi therapeutique

Methode de detection directe simplifiee par PCR sur tache de sang seche

de la mutation principale responsable de la mucoviscidose

G Lucotte 1, F David 2, JL P~rignon 3

i Laborato#re d'anthropolog#e phys#que, Coll~ge de France, 11, place Marcehn-Berthelot, 75005 Par#s, 2 Laborato#res Eurobto, ZA de Courtaboeuf, 7, avenue de Scandmawe, 91953 Les Uhs,

3 laboratotre de btochtm#e m~d#cale, facultd de mddecme Necker-Enfants-Malades, 156, rue de Vauglrard, 75015 Parts, France

(Regu le 28 d~cembre 1990, accept~ le 16 mai 1991)

Rdsum~ m Nous ddcrivons une m~thode de d~tect~on de la ddl6tlon, nomm~e AF508, par une r~actton de polymdrisa- t~on en cha~ne (PCR) fatsant mterven~r deux comblnaisons d'amoroes oligonucl~ot~ques, qui peuvent permettre la d~s- traction des alleles mutants et normaux Cette amphfication sp~cifique d'all61es constltue une m~thode rap~de, non radtoact~ve et tr~s fiable de d~tection g~n~que directe sur les taches de sang s~ch~

mucoviscidose / d(H(~tion &F508 / PCR / ARMS / taches de sang s~ch~

Summary - - A direct detection method by means of a simplified PCR procedure of the main cystic fibrosis mutation on dried blood spots A method is described for the detectton of the so-called AF508 deletton wa a polyme- rase chain reaction (PCR) wtth 2 combinations of ohgonucleotide pnmers which differentiate between mutant and wild- type alleles This allele-specific amplification provides a rapid, non-radioactive and very reliable method for direct geno- typing on dried blood spots

cystic fibrosis / AF508 deletion / PCR / ARMS / dried blood spots

In t roduct ion

On a r~cemment d~couvert qu'approx~mat~ve- ment 80% de pattents mutants pour la mucovtsc~- dose (CF = cyst#c f#brosls) en France [4], corres- pondent & une d~l~tion spdcffique de trois patres de bases (pb) en position de I'actde amind 508 (nomm6e AF508) du produtt putatif du g~ne CF[3] Deputs, un certain nombre de m~thodes ont ~t~ propos6es pour la d~tectton rap~de de cette mutation Toutes ces m~thodes utihsent la techntque de Polymerase Chain Reaction (PCR), mais dtff~rent entre elles par des modaht6s de d~tatl Nous d~crivons ici une m~thodologie partl- cuh~re s~mpllfi6e, car ne faisant mtervenlr ni hybridatton du produit d'amphficatlon avec un couple d'ohgosondes sp~cifiques des chromo- somes normaux (N) et mut~s (S), ni enzyme de restnct~on, ni marquages radioact~f ou frotd, cette

m6thode est tout spdc~alement apphqu~e tct & la d~tection d~recte de la mutatton AF508 au niveau des taches de sang s~ch6 sur papier buvard

Principe

C'est la technique ASPC (Allele SpeclDc POEt), nomm~e aussi ARMS (Amphflcated Refractory Mutation System), qu~ est utihs6e dans notre cas particuher [6, 8] Son pnncipe r6stde dans le fait que certams ohgonucl6ottdes, mcapables de s'ap- paner par leur extr6mit6 3' avec la matrice d'ADN, ne peuvent server d'amorce Iors de I'amphficat~on, parmt les couples d'amorces synth~tis~es, cor- respondant aux chromosomes normaux ou mut~s, seules peuvent ~tre utJhs6es Iors de la PCR celles qu~ sont homologues des fragments d'ADN correspondants, de telle sorte que la stra-

30 G Lucotte et al

t~gie de d~tectlon dans cette technique part~cuh~- re conslste & determiner le g~notype de I'mdiwdu ~tudi~ gr&ce & la seule presence/absence des produits d'amphficatlon Iors des d~verses combi- naisons entre ces couples Une telle m~thodolo- gie de d~tection apphqu~e ~. la mise en ~vtdence de la mutation AF508 a d'allleurs d~j& ~t~ propo- s~e [7], et plusieurs couples d'amorces ont fa~t I'objet d'~tudes pr~hmmatres, deux d'entre eux [1] ~tant utflis~s act

Materiel et methode

Extract#on de I'ADN

La tache de sang sur le papter buvard est dissoute dans 500 ILl de tampon, comprenant 2 mg/ml de prot~l- nase K et 0,5% de SDS La digestion est ensuite r~ah- s~e 3 h & 37°C L'extractlon de I'ADN se falt trois fois au ph~nol-chloroforme, suivte d'une extraction au chlo- roforme seul Puis I'ADN est pr~cipit~ dans I'~thanol absolu sur la glace, le culot ~tant enfln resuspendu dans 200 ILl d'H20 Une prise de 20 ILl est r~ahs~e pour chaque r~actlon d'amphficatlon

Dans ces conditions, nous obtenons en moyenne (calcul~e sur 30 ~chantlllons) 1,6 ILg d'ADN total par papter Un contr61e sur gel a permis d'~tabhr qu'tl s'agissatt bien d'ADN long bnn non d~grad~

Couples d'amorces ut#hs~s

Deux couples d'amorces sont uttlis~s le premier couple (AB) permettant I'amphficatlon du chromosome N, et le second (AC) celle du chromosome A

Les formules des trois amorces utihs~es [1] sont les sulvantes - A (016D) 5' - GTTGGATGCTTTGATGACGCTTC - 3', - B (1468) 5'-GGCACCATTAAAGAAAATATCATCTT- 3', - C (1469) 5' - GGCACCATTAAAGAAAATATCATTGG - 3'

PCR

Sont amphfi6s 500 ng d'ADN g~nomiques punfi~ dans un volume r~actionnel total de 100 ILl, comprenant dans le tampon PCR (20 mmol Tns-HCI, pH = 8,3, 2 mmol MgCI2, 25 mmol KCI, 0,05%, Tween 20, 100 ILg/ml BSA) 250 mmol de dNTP, 25 pmol de chacune des amorces A et Bet A et C, et 2,5 U de Taq polym~- rase Lors d'exp~nences pr~hmma~res, le t~mo~n inter- ne d'amphflcation KM 19 a ~t~ syst~matiquement intro- dult dans chaque tube Pour la d~tection des h~t~rozygotes cependant, les couples d'amorces ABet AC constituent leurs propres t6moms internes, puts- qu'au morns I'un des deux chromosomes (normal ou mut~) est present dans la r~action

La d~naturation inittale est r~alis~e & 95°C pendant 5 mm L'ADN est amphfi~ automatiquement sur appareil thermocycle pendant 30 cycles, les 29 premiers com- portant les phases successlves de d~naturatlon (94°C, 45 s), d'hybndatlon (60°C, 1 ram) et d'extension (72°C, 1 mm), Iors du 30 e cycle, rextenslon est r~ales~e pen- dant 7 min

R(~sultats

Les dtverses combmatsons des produits d'amphfi- cat~on peuvent ~tre wsuahs~es d~rectement apr~)s migration sur gel d'agarose par coloration au bet (bromure d'~thidium) Pour ce fatre, 25 ILl du pro- duit d'amphflcation de chaque ~chanttllon sont d~pos~s sur un gel d'agarose & 2% (tampon Tns- borate) et sont mis & megrer pendant 3 h & 100 V

Pour chaque ~chantillon, sont ~tud~s les pro- duJts de la PCR par les couples d'amorces ABe t AC (fig 1) Cette figure montre que les ~chan- tillons h6t~rozygotes N/A correspondent ~. deux bandes en bet par la m~thode d~cnte ~c~ Iors des PCR A B e t AC, les ~chantillons normaux N/N ne montrent qu'une seule bande, en AB (les mutants ~,A ont uniquementla bande AC)

La m~thode d~cnte ~c~ a ~t~ ut~hs~e & la d~ter- mmatJon du g~notype de 57 pap~ers buvards dif- f6rents La m6thode a ~t~, dans un premier temps, vahd6e sur I'ADN d'6chantfllons sangums de 12 nouveau-n~s de g~notypes d~termm~s par PCR classlque [5] comportant une amplification avec deux amorces sttu~es de part et d'autre du site mut~, suivie d'une hybndation sur dot-blot avec un couple d'ohgosondes sp~ctfiques de chaque allele, et marquees de fa(;on "y-termmale

1 2 3 4 AB AC AB AC AB AC AB AC

79pb 76pb

+ + + + + - - + +

Fig 1 Coloration au bet des couples de PCR pour les amorces AB et AC de quatre ~chanhllons M marqueur de tallle (pBR diger6 par Haelll), d d~pSt, a amorces reslduelles Les echantlllons 1,2 et 4 sont h~terozy- gotes N/D,, et le 3 normal N/N (intensite de la bande doublee) La distinction entre les produits amplifies de 79 et 76 pb est mieux resolue en gel d'acylamlde & 15%

Mutation responsable de la mucovlscldose 31

au 32p, dans tous les cas, une correspondance absolue a ~t~ not6e entre les r~sultats obtenus par notre m~thode et la techn=que de r~f~rence La reproduct=bdlt~ a ~t~ test~e sur les 25 pre- miers ~chantlllons de paplers buvards, un dlsque de 1 mm de dlarn~tre pr~lev~ & I'emporte-pl~ce dans la tache correspondant & une quant=t~ d'ADN suffisante pour le bon fonctlonnement de la PCR dans nos conditions, dans tousles cas, le m~me g~notype a ~t~ retrouv~ pour chacun des deux ~chantlllons du couple d'exp6rlences r~ah- sdes sur le m~me sang

Discussion

Au terme de la pr6sente 6tude, nous avons mls au point une m~thode rap~de, flable et reproduc- t=ble, de d~tect=on de la mutat=on AF508 sur tache de sang s6chd Le type de d~tect~on, coupl~ ~. la mesure de la trypslne immunor6actlve [2], paraTt tout part=cuh~rement =nt~ressant pour le d6plsta- ge ndonatal de la mucoviscidose En effet, la m~se en dvldence d'une hypertrypsin~mle persls- tante n~cess~ta=t deux pr~l~vements, dont un tar- dlf, vers le 30 e jour de vie II est malntenant pos- sible de remplacer ce deuxl~me pr~l~vement par une d~tectlon d=recte de la mutat=on CF pnnclpale sur le papler buvard initial Une large dtude r~trospect~ve est actuellement entrepnse pour ~valuer cette nouvelle strat~g~e de d~p=stage n~onatal de la mucowscldose

Remerciements

Nous remerc~ons pour sa collaboration technique ~. ce trava=l, le Dr S Berrlche Les amorces utfllsdes ont ~t~

synth~tlsdes dans le laboratolre du Pr Igolen, de I'lnst~- tut Pasteur de Paris La m~thodologle de ddtectlon de la mutation AF508 a falt I'objet du d~p6t de brevet d'ln- ventlon FR 51849A (Laboratolres Euroblo)

Ref6rences

1 Ballablo A, Gibbs RA, Caskey CT (1990) PCR test for cystic fibrosis deletion Nature 343, 220

2 Bowling FG, Mc Gill J J, Sheperd RW, Danks DM (1990) Screening for cystic fibrosis use of AF508 mutation Lancet 335, 925-926

3 Kerem BS, Rommens JM, Buchanan JA, Markle- wlcz D, Cox TK, Chakravartl A, Buchwald M, Tsul LC (1989) Identification of the cystic fibrosis gene, genetic analytls Science 245, 1073-1080

4 Lucotte G (1989) Mucovlscldose fr~quence de la mutation pnnclpale dans les families fran(~alses Ophon/B#o 24, 13-14

5 Lucotte G, Barr~ E, Bernche S (1990) D~tectlon de la mutation prlnclpale de la mucovlscldose ~tude sur soixante et une families (soumls pour publica- tion)

6 Newton CR, Graham A, Heptlnstall LE, Powell S J, Summer C, Kalshekr M, Smith JC, Markham AF (1989) Analysis of any point mutation in DNA the amphficatlon refractory mutation system Nucle#c Aclds Res 17, 2503-2515

7 Wagner M, Schloesser M, Relss J (1990) Direct gene diagnosis of cystic fibrosis by allele specific polymerase chain reactions Mol B#ol Med 7, 359- 364

8 Wu DY, Ugozzoh, Pal B J, Wallace RB (1989) Allele- specific enzymatic amphflcatlon of beta-globm DNA for diagnosis of s~ckle cell anemia Proc Natl Acad Sc# USA 86, 2757-2760