MOYENS ACTUELS D’IDENTIFICATION B et C - SFMC...• L’immuno PCR : - permet de détecter l’ADN...

MOYENS ACTUELS D’IDENTIFICATION B et C

NRBC-EActualités B et C

10 juin 2016, Ecole du Val de GrâceVendredi 10 juin 2016

Médecin en chef François TOPIN Médecin principal Sébastien BEAUMEfrancois.topin@bmpm.gouv.fr sebastien.beaume@bmpm.gouv.frfrancois.topin@intradef.gouv.fr

INTRODUCTION

INTRODUCTION

• Menace biologique représentée par:– tout tissu, microorganisme ou protéine pouvant constituer un

danger pour la santé humaine,– naturel : émergent ou résurgent, pandémies– accidentel : LSB-3 ou 4, AES…– intentionnel : bioterrorisme

• Intérêts identification agents biologiques:– mise en place d’un traitement prophylactique efficace dans les

plus brefs délais – réduction des opportunités de transmission de l’agent dans le

cas d’un agent transmissible – délai de survenue des premiers symptômes (phase incubation)

≠ effets immédiats des agents chimiques

• Menace chimique représentée par– agents létaux de guerre,– toxiques industriels, agriculture,– possibilité de production « rustique » d’agents chimiques,

d’une pureté variable et dispersés par des moyens rudimentaires.

• Intérêts identification des agents chimiques– protection des personnes exposées (militaires ou civils)

– adaptation des thérapeutiques selon le toxique

– accident : toxique connu ≠ attentat

INTRODUCTION

PLAN

- Identification des agents biologiques- Identification des agents chimiques- Moyens d’identification de terrain

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

- Contexte- Méthodes de détection moléculaire- Méthodes de détection immunologique- Futur

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESCONTEXTE :

Historique utilisation armes biologiques

En 1346, siège du port de Caffa (aujourd’huiFeodossia en Ukraine) par les Mongols

catapultage de cadavresdes pestiférés par dessus

les murs de la ville

↓20 à 30 M de morts

par la peste

1ère arme biologique virale: Variole sur des couvertures distribuées aux Indiens 1764

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESCONTEXTE :

Historique utilisation armes biologiques

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESCONTEXTE :

Historique utilisation armes biologiques

- Avril –Mai 1979, épidémie inhabituelle de charbon pulmonaire à Sverdlosk en URSS

- oubli de changement d’un filtre- fuite de 4.10e9 spores- 96 patients dans un rayon de 2-4

km- 64 décès (66% mortalité)

Bacillus anthracis

Les lettres au bacille du charbon aux USA 2001

• Septembre et octobre 2010• Juste après les attaques du 11/09• 28 victimes :

– 11 charbon pulmonaire

– 17 charbon cutané

– 5 morts

• 33.000 personnes traitées

• Suicide d’un suspect

Bruce Ivins (2008)

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESCONTEXTE :

Historique utilisation armes biologiques

© DGSCGC 2011

Circulaire 750Plis et colis suspects

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

- Contexte- Méthodes de détection moléculaire- Méthodes de détection immunologique- Futur

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Amplification exponentielle d’une portion spécifique du génome

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESMéthodes de détection moléculaire

- Sensibilité; excellente

- Spécificité: « 100% »

- Procédure « rapide » (quelques heures)

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESMéthodes de détection moléculaire

Cinétique de la PCR

Choix des séquences génomiques cibles pour le diagnostic par la PCR

Grande variabilité

Régions mieux conservées

Génome viral

(Idéal pour séquences cibles PCR)

Méthodes de détection moléculaire IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

Méthodes de détection moléculaire IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

mise en évidence des Tests PCR / PCR multiplexé

Bacillus anthracis • facteurs de virulence spécifiques (toxines et capsule)• gènes pagA, cya, lef (toxines), du gène capC (capsule) et un marqueur chromosomique (Ba813)→ identifier un isolat virulent, atténué ou avirulent

Yersinia pestis • gène pla et caf1

Francisella tularensis • gènes codant pour l’ARN 16S

Brucella • ARN ribosomique 16S, • région intergénique 16S-23S, • gènes codant pour des protéines de membrane externe (BCSP31, OMP31, OMP2) et l’IS711 spécifique du genre Brucella

Limites de la PCR

• Requiert un minimum de copies de génome viral (manip. de l’échantillon)

• Flux de travail unidirectionnel (contaminations)

• La cible est spécifiée

• Adaptation des PCR pour certains virus variables

Méthodes de détection moléculaire IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

PCR en temps réel

Basée sur la détection d'un "reporter" fluorescent Signal proportionnel à la quantité d'amplicons Signal détecté "en temps réel"

1- Extraction (manuelle ou automatisée)

2- Amplification et détection synchroniséeSystème fermé, pas de manipulation post-amplification

● Rapidité

● Faible risque de contamination

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESMéthodes de détection moléculaire

PCR en temps réel - Quantification

Valeurs de fluorescence corrélées à la quantité de produit amplifié Concept de "cycle seuil" (Ct) : base de la quantification

Ct ( Cycle threshold) = nombre de cycle d'amplification nécessaire pour obtenir un signal fluorescent statistiquement significatif par rapport au bruit de fond (valeur seuil).

→ Plus le Ct est petit, plus l'échantillon est concentré

Seuil fixé au

dessus du bruit de fond

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESMéthodes de détection moléculaire

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESMéthodes de détection moléculaire

Définition:ADN déposé sur la lame: sonde (probe)ADN (ou ARN) marqué, en solution: cible (target)

Le microarray: outil qui permet d’effectuer un très grand nombre de mesures en simultané en une seule manipulation.Délai: 2 à 6 heures

Conséquences: • vision globale, qui permet une nouvelle façon d’analyser les phénomènes biologiques• détection sensible (50 CFU/ml), spécifique et permet de dépister simultanément plusieurs agents potentiels du bioterrorisme : B. anthracis, F. tularensis et Y. pestis

Les microarrays

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

- Contexte- Méthodes de détection moléculaire- Méthodes de détection immunologique- Futur

Méthodes de détection immunologique  IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

IMMUNOCHROMATOGRAPHIE

Représentation schématique d’un test immunochromatographique

• diagnostic rapide d’agents comme la peste ou le charbon• peu sensible

Ag circulant dans le sérum et divalent (ex: Ag bactériens, viraux, parasitaires)

+Ag divalent recherché

+E

E + Substrat SignalSignal

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESMéthodes de détection immunologique 

ELECTROCHEMILUMINESCENCE (ECL)

Révélation par émission de Révélation par émission de lumière et impression de lumière et impression de films photographiques : films photographiques :

Electrochemiluminescence Electrochemiluminescence (ECL)(ECL)

• technique automatisable, très sensible,• rapide (environ 30 minutes par échantillon)• utilisable pour tous les agents potentiels de bioterrorisme;• utilisable pour des échantillons biologiques aussi bien qu’environnementaux,• seule limite: disponibilité d’anticorps de haute affinité

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUESMéthodes de détection immunologique 

• détection rapide, simultanée de plusieurs pathogènes (B. anthracis, F. tularensis, Y. pestis, B. melitensis)• sensible• rapide (60 à 90 minutes)

puces à anticorps avec unmarquage direct de l’échantillon

puces à anticorps en “sandwich”, où la détection repose sur un deuxième

anticorps marqué

MICROARRAYS PROTÉIQUES (PUCES à ADN)

Méthodes de détection immunologique  IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

IMMUNO-HISTOCHIMIE

Les techniques d'immunohistochimie permettent la mise en évidence d'antigènes tissulaires ou cellulaires grâce à l'utilisation d'anticorps spécifiques.

• diagnostics rapides,• détectées dans des sécrétions, des coupes d’organes ou des biopsies;• fréquemment utilisé pour la détection de F. tularensis, R. prowazekii, R. rickettsii, ainsi que pour B. anthracis, Y. pestis et pourrait être utilisé pour C. psittacii.

Diagnostic sérologique

IgM (patient)

Coloration

IgM capture IgG indirect

Coloration

IgG (patient)

Antigènespécifique

Antigène

Human anti-IgG

Anti-IgM

Les Tests ELISA

Méthodes de détection immunologique  IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

• très sensibles• très utilisés pour la détection de nombreuses bactéries potentiellement utilisables pour un acte bioterroriste

Tests ELISA / Diagnostic sérologique: limites

- Le patient doit avoir développé une réponse humorale

- IgM: Attention aux réactions croisées avec des anticorps auto-immuns (IgM)

- IgG: Attention aux problèmes de réactions croisées avec certaines familles virales

Exemple des Flavivirus: Dengue, encéphalite à tique, West Nile, Fièvre jaune, etc.

Méthodes de détection immunologique  IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

Méthodes de détection immunologique 

Protéomique: couple l’électrophorèse bidimensionnelle à la spectrométrie de masse;

permet d’étudier B. anthracis, Y. pestis, F. tularensis, B. melitensis, C. burnetii;

Immunoprotéomique: - séparation des antigènes selon poids moléculaire, - transfert sur support solide, - Incubation avec les anticorps et révélation.

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

PROTÉOMIQUE et IMMUNOPROTEOMIQUE

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

SYNTHESE

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

- Contexte- Méthodes de détection moléculaire- Méthodes de détection immunologique- Futur

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

FUTURES TECHNOLOGIES

• La plate-forme Ibis T5000- identification et la quantification d’un large spectre de pathogènes dans échantillons bio et environnementaux,- entièrement automatisé- analyse chaque PCR en moins d’une minute- permet l’identification et la quantification d’un large spectre de pathogènes, incluant toutes les bactéries connues à ce jour en quatre à six heures.

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

FUTURES TECHNOLOGIES

• L’immuno PCR :- permet de détecter l’ADN d’agents pathogènes à des

quantités de l’ordre du femtogramme et l’utilisation d’une sonde nucléotidique marquée à la biotine augmente la spécificité par rapport à la PCR conventionnelle

• La cytométrie en flux : utilisée pour une détection simultanée de plusieurs

bactéries comme B. anthracis et Y. pestis dans des échantillons d’air;

Technique rapide qui permet une analyse quantitative sur des échantillons cliniques et environnementaux.

IDENTIFICATION AGENTS BIOLOGIQUES

• Le Miniature Analytical Thermal Cycler Instrument (MATCI), est un appareil portable de la taille d’une valise qui donne de bons résultats en PCR en temps réel.

• Les fragments d’anticorps mono- et divalent (Fab’ et F[ab’]2) pourraient offrir une sensibilité, une spécificité, comparable aux anticorps et peuvent être modifiés grâce à des techniques recombinantes.

• La surface plasmon resonance (SPR) biosensor technology : détection de l’agent recherché par mesure du

changement d’indice de réfraction qui se produit quand la cible rencontre des anticorps préalablement fixés sur une puce en métal.

Détection rapide en 40 minutes.

FUTURES TECHNOLOGIES

IDENTIFICATION AGENTS CHIMIQUES

IDENTIFICATION AGENTS CHIMIQUES

Détection et évaluation du risque chimique

IDENTIFICATION AGENTS CHIMIQUES

Détection et évaluation du risque chimiqueÉtablir la famille d’appartenance de l’agent chimique

IDENTIFICATION AGENTS CHIMIQUES

Identification des produits sur le terrain

MOYENS D’IDENTIFICATIONDE TERRAIN

Des capacités graduées

IDENTIFICATION DE TERRAIN

Véhicules « risques technologiques »

- Détection chimique : AP4C, PDF1, papier pH…

- Kit de prélèvement

IDENTIFICATION DE TERRAIN

VDIP « véhicule détection identification prélèvements »

IDENTIFICATION DE TERRAIN

VDIP « véhicule détection identification prélèvements »

• Identification chimique– Couplage TD/GC/MS : chromatographie

gazeuse, spectrophotométrie de masse

– Spectrophotomètre à émission de flamme

– Infra-rouge à transformée de Fourrier

– Spectromètre UV

– Détecteur par photo-ionisation

– Explosimètres, toximètres

– Tubes colorimétriques

– Sondes de contrôle des paramètres

physico-chimiques de l’eau

…

IDENTIFICATION DE TERRAIN

VDIP « véhicule détection identification prélèvements »

• Identification biologique– Tickets détecteurs

« KDTB Gold Assay ® »

Ricine, toxine botulique A, B, E,

SEB, anthrax, peste, tularémie

IDENTIFICATION DE TERRAIN

CONCLUSIONCONCLUSION• Diversité des situations rencontrées complexifie la détection et identification des agents biologiques ou chimiques ;

• Cinétique chimique ≠ biologique

• Nécessité de combiner plusieurs techniques d’analyse

• Obligation de disposer :• de banques de données spécialisées, et préférentiellement de bibliothèques réalisées en interne • de disposer d’une capacité de synthèse, pour pouvoir compiler les banques de données recommandées;• d’opérateurs expérimentés et entraînés, susceptibles d’exploiter les données à leur disposition pour effectuer une identification.

MERCI DE VOTRE ATTENTION