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Place de la biologie moléculaire dans la prise en charge des

hémopathies malignes

Alice Marceau-Renaut

Laboratoire d’hématologie

CHRU Lille

Hémopathies malignes

• Hémopathies myéloïdes– LAM (leucémies aiguës myéloïdes)– SMP (syndromes myéloprolifératifs)

• LMC (leucémie myéloïde chronique)• Autres : PV (polyglobulie de Vaquez), TE (thrombocythémie

essentielle), MFP (myélofibrose primitive) …

– SMD (syndromes myélodysplasiques)

• Hémopathies lymphoïdes– LAL (leucémies aiguës lymphoblastiques)– LLC (leucémie lymphoïde chronique)– lymphomes

Biologie moléculaire

• Étude de l’ADN (génome) et de l’ARN (transcriptome)

• Matériel biologique : sang, moelle osseuse, LCR, biopsies

• Aide au diagnostic

• Contribution à l’évaluation du pronostic

• Suivi thérapeutique (maladie résiduelle)

MRD : maladie résiduelle

Leucémie myéloïde chronique

• Prolifération maligne de la lignée granulocytaire sans blocage de maturation– Hyperleucocytose avec PNN et myélémie sur

hémogramme

• Anomalie cytogénétique associée– Chromosome Philadelphie au caryotype t(9;22)

LMC et biologie moléculaire

LMC et biologie moléculaire

Diagnostic

Dépistage des transcrits BCR-ABL

LMC : suivi MRD

Maladie résiduelle

LMC : suivi MRD

LMC et échec de traitement

Séquençage direct de Sanger

Autres SMP

1ère intention

La mutation JAK2 V617F (exon 14)

Dépistage et quantification de JAK2 V617F

Autres SMP

Séquençage direct 2ème intention

Autres SMP

Mastocytose

Mutation de c-KIT (exon17) dans + 50% des formes systémiques et 30-40% des formes

cutanées

Critère mineur de diagnostic

Mutation D816V � résistance à l’imatinib

Autres SMP

Syndrome d’hyperéosinophilieessentielle

Transcrit FIP1L1-PDGFRαprésent dans le variant myéloïde

RT-PCR nichée

Leucémie aiguë myéloïde et biologie moléculaire

Classification cytogénétique et moléculaire des LAM

Leucémie aiguë myéloïde et biologie moléculaire

LAM du groupe CBF

t(8;21) : transcrit AML1-ETO• Transcrit bien visible au

caryotype• Biologie moléculaire : suivi de

MRD• 8% des LAM• Pronostic favorable

inv(16) : transcrit CBF β-MYH11• Transcrit difficile à voir au

caryotype • Biologie moléculaire :

dépistage et suivi de MRD• 8% des LAM• Pronostic favorable

Leucémie aiguë myéloïde et biologie moléculaire

Mutations c-KIT

• Mutations activatrices localisées surtout dans les exons 8 et 17

• <2% de toutes les LAM• 10-20% des LAM t(8;21)• 20-30% des LAM inv(16)• Facteur pronostique défavorable

Mutations N-RAS et K-RAS

• Mutations activatrices

• Pas de valeur pronostique• 5% de toutes les LAM

• 20-30% des LAM-CBF

Leucémie aiguë myéloïde et biologie moléculaire

FLT3-ITD

• Duplication en tandem dans le domaine juxta-membranaire

• 20% de toutes les LAM

• 30% des LAM-CN et LAP• Facteur pronostic défavorable• Mutation instable à la rechute

FLT3-TKD

• Mutation ponctuelle dans le domaine tyrosine kinase (D835 et I836)

• Mauvais pronostic dans les LAM-CBF

Mutations de NPM1

• Mutations hétérozygotes (insertion de 4 bp)

• 30% de toutes les LAM

• 50% des LAM-CN (caryotype normal)

• Valeur pronostique favorable (en l’absence de FLT3-ITD)

• Mutation stable à la rechute � suivi MRD des mutations

A, B et D � détection précoce des rechutes

Mutations de CEBPA

• Mutations N-terminales : PP1• Mutations C-terminales : PP2• 10% de toutes les LAM• 15-20% des LAM-CN• Valeur pronostique favorable

Impact du génotype dans les LAM-CN

Recommandations ELN

Évaluer le statut mutationnel NPM1, FLT3-ITD et CEBPA dans les LAM-CN en pratique courante

Leucémie aiguë myéloïde et biologie moléculaire

Pronostic défavorable

Leucémie aiguë myéloïde et biologie moléculaire

Mutations au niveau des

exons 7 et 9

Pronostic ?

Leucémie aiguë myéloïde et biologie moléculaire

Suivi MRD sur expression WT1

• Surexpression de WT1 au diagnostic dans 80 à 90% des LAM

• Fait au diagnostic de toutes les LAM (hors CBF) traitées par chimiothérapie intensive

• Permet de suivre la maladie résiduelle

Leucémie aiguë lymphoblastique

LAL au diagnostic : marqueurs moléculaires

• ARN : transcrits chimériques dans 30% des cas– LAL-B : BCR-ABL, MLL-AF4, E2A-PBX1,

TEL-AML1

– LAL-T : HOX11, HOX11L2, SIL-TAL, NUP214-ABL

• ADN : clonalité– réarrangement VDJ des gènes codant pour

les Ig et TCR

– au moins un marqueur dans 90% des cas

LAL et transcrits chimériques

Diagnostic : impact pronostique

Suivi MRD

Suivi MRD : exemple AF4-MLL

GHILLEBAERT Jean-Marietranscrit e11e4

06/0

9/06

04/1

0/06

(sg

)

05/1

2/06

04

/04

/07

08/0

7/06

03

/05

/07

09/0

3/07

0,001

0,01

0,1

1

10

100

08/07 /06

08/10/06

08/01/07

08/04/07

Nom

bre

de

copi

es (

AF

4-M

LL/A

BL)

x

100

/ pla

smid

e

LAL au diagnostic : étude de la clonalité

Réarrangement de l’ADN du lymphocyte = réarrangement génique TCR et Ig

PCR ciblant la zone de diversité jonctionnelle entre les domaines VDJ

= empreinte de chaque lymphocyte

LAL au diagnostic : exemple de résultats de la clonalité

Suivi MRD sur marqueur de clonalité

Design d’amorces spécifiques pour chaque patient

Biologie moléculaire et syndrome lymphoprolifératif

Biologie moléculaire et syndrome lymphoprolifératif

Lymphome du manteau et Bcl1

• Associé à t(11;14)(q13;q32) dans 80% des cas

• Hyperexpression de Bcl1

Lymphome folliculaire et Bcl2

• Associé à t(14;18) dans + 90% des cas• Fusion IgH et Bcl2

Conclusion

• Biologie moléculaire dans les hémopathies malignes– Aide au diagnostic

– Valeur pronostique– Suivi thérapeutique