R. Louis Pneumogie CHU Sart-Tilman, Liege LAnalyse des expectorations et du NO exhalé en Pneumolgie

R. Louis

Pneumogie CHU Sart-Tilman, Liege

L’Analyse des expectorations et du NO exhalé en Pneumolgie

Les expectorations

• Pathologies infectieuses

• Pathologies Tumorales

• Pathologies inflammatoires

• Pathologies de surcharge minérale

Pathologies infectieuses

Expectorations spontanées et infections respiratoires

“Expectorated sputum is among the least clinically relevant specimens received for culture in microbiology laboratories, even though it is one of the most numerous and time consuming specimens”

Bailley and Scott’s Diagnostic Microbiology, 1998

Echantillon obtenu après un effort de toux

Contamination minimale par la salive

Echantillon placé dans un container stérile

Transfert immédiat vers le laboratoire

Critères d’acceptabilité d’un échantillon d’expectorations

Taux de cellules épithéliales squameuses < 10/low power field au microscope

Taux de cellules épithéliales squameuses < 10/low power field et taux de polynucléaires 25/low power field échantillon de qualité

Adéquat Inadéquat

Expectorations (induites) et infections respiratoires basses

Pneumonie à Pneumocystis carinii

Mycobacterioses

Infections mycotiques

Légionelloses

Pneumocystose

• 32 patients SIDA avec Rx Thorax anormale

• Induction d’expectorations avec NaCl 3%

• Fibroscopie avec BAL si pas de Pneumocystis dans expectorations

25 Cas de Pneumocystis Carinii dont 14 détecté par les expectorations sensibilité de 56%

Parmi les 18 patients sans Pneumocystis Carinii dans les expectorations 11 étaient positifs à l’analyse du BAL VPN de 39%

Bigby T et al Am Rev Respir Dis 1986

Tuberculose pulmonaire

Sensibilité: 20 à 80%

VPP: 90%

Frotti d’expectorations coloré au Zielh-Neelsen

Macrophages (mauve) contenant le bacille tuberculeux (rouge)

Aspergillose pulmonaire

Pathologie tumorale

Screening du cancer pulmonaire par analyse morphocytologique

NCI trial-Mayo Lung Project

Homme fumeur > 45 ans

Rx Thorax annuelle conseillée

Rx Thorax + cytologie des expectorations tous les 4 mois

Le nombre de Stade 1 et de cas chirurgicaux étaient plus grand dans le groupe avec screening régulier (respectivement 38% vs 25% et 46% vs 32%)

La survie à 5 ans est de 33%! comparée à 15% dans une population contrôle

Pas de différence en terme de mortalité totale due au cancer du poumon

Incidence de cancer plus grande dans le groupe avec screening régulier ??!!

Contribution relative de l’analyse morphologique des cellules des expectorations vs RxThorax

dans le diagnostic du cancer

• Rx Thorax seule: 76%

• Expectorations seules: 17%

• Rx Thorax et expectorations: 7%

Analyse des expectorations dans la détection du carcinome pulmonaire

L’analyse morphologique est surtout utile dans le carcinome épidermoïde où on peut diagnostiquer des cancers avec RxThorax normale (78 % au stade 1). Une cytologie positive pour d’autres types cellulaires est généralement une indication de stades avançés (NCI trial USA)

Des techniques “d’immunostaining” pour des antigènes fœtaux améliorent la sensibilité de l’analyse morphologique (hnRNP = heterogeneous nuclear ribonucleoprotein)

Détection de mutations géniques (K-ras oncogene ou p53) sur des cellules d’expectorations identiques à celle retrouvées dans le tissu cancereux 1 an avant le diagnostic clinique

Carcinome épidermoïde

Adénocarcinome

Pathologie inflammatoire

Induction des expectorations

Nébuliseur ultrasonique avec un débit de 1-3ml/min

Liquide hypertonique (3-5%)

Spiromètre ou peak flow meter

Prémédication du sujet avec 400 µg salbutamol (MDI+Spacer)

Temps d’inhalation de 10 à 20 min avec collecte toutes le 5 min d’un échantillon d’expectorations qui doivent être “poolés”

Pour entire expectorate into preweighed polystyrene tube and

weigh

Add equal volume of DTT (DTE) 0.1%

Place in shaking waterbath or rocker for 15 min at 22°C

Filter through 48m nylon mesh

Perform manual TCC and assess viability

Centrifugation 1500 rpm 10 min at 4°C

Perform DCC on cytospins stained with GIEMSA(> 400 nonsquamous)

Select viscid or denser portion of the expectorate using an inverted microscope and place in preweighed polystyrene tube

Add DTT (DTE) 0.1% solution equivalent to 4 times the weight of the plug

Whole sputum Plug

Differential sputum cells on cytospins

1

2

3 4

51. Macrophage

2. Neutrophil

3. Eosinophil

4. Epithelial cell

5. Lymphocytes

Cytologie des expectorations induites

Cellule Pathologie

Eosinophiles

Neurophiles

Lymphocytes

Asthme

Bronchite chronique non tabagique

Exposition à des aéroallergènes ou des sensibilisants professionnels

BPCO sensible aux corticoïdes

Tabagisme

BPCO

Exposition aux endotoxines, à l’ozone

Asthme résistants aux corticoïdes

Infection

BBS

Chlamydia Pneumoniae

Curschmann’s Spirals Charcot-Leyden cristal

Asthma

Chronic bronchitis

Asthma

Eosinophilic pneumonia

Fungal infection

Severe asthma COPD

GERD Left ventricular dysfunction

100 µm

Lipid laden macrophages Haemosiderin laden macrophages

Massive eosinophiliaMassive neutrophilia

Pin I et al Thorax 1992

Induced sputum in asthma

Mild to moderate steroid naive asthma

Louis R et al Allergy 2002

1

10

100

1000

10000

Eosin

op

hil

s (

X 1

03 /

g)

p<0.05

p<0.001

p<0.01

Control

group

Intermittent

asthma

Mild to moderate

asthma

Severe

asthma

p<0.001

Louis R et al Am J Respir Crit Care Med 2000

Sputum eosinophil counts in asthma

70

80

90

100

110

0 5min

15min

30min

60min

2 h 3 h 4 h 5 h 6 h

FEV1

(% co

ntro

l)

Sal Dpt

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Sput

um E

osin

ophi

ls (%

)6 h

Sal Dpt

Sputum eosinophil influx during a late phase bronchospasm

Bettiol J et al Allergy 2002

Jatakanon A et al Am J Respir Crit Care Med 2000

Solid symbols: Exacerbation

Open symbols:

No exacerbation

Baseline sputum cell counts before tapering Inhaled corticosteroids

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Spu

tum

eos

inop

hils

(% c

hang

e)

No Exacerbation Exacerbations

Effect of exacerbation of asthma on changes in sputum eosinophils and FEV1

Jatakanon A et al Am J Respir Crit Care Med 2000

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

FE

V1

(% c

hang

e)

No Exacerbation Exacerbations

Giannini D et al Clin Exp Allergy 2000

Sputum eosinophilia and withdrawal of inhaled steroids

Proportion of mild to moderate asthmatics with raised sputum eosinophilia

Sputum eos < 2%

Sputum eos > 2%

69% 31%

Steroid naive patients

N = 118

Louis R et al Allergy 2002

< 2 >2-5 >5-10 >10-15>15-20 > 200

10

20

30

40

Pro

po

rtio

n o

f p

atie

nts

(%

)

Sputum Eosinophils (%)

PC

20M

< 8

mg

/ml

Sp

utu

m e

os

> 1

%

FE

V1/

FV

C <

76.

6 %

BD

res

pons

e >

2.9

%

PE

FA

%M

> 2

1.6%

Blo

od e

os >

6.3

%

0

25

50

75

100

Ac

cu

rac

y (

%)

Accuracy of several tests to diagnose mild to moderate asthma

Hunter G et al Chest 2002

< 3% > 3%

Age (yrs) 53 45

Atopy 2 8

FEV1( % pred) 81 86

PEF (amplitude % mean) 20 19

Symptom VAS (mm) 44 47

PC20 (mg/ml) 1.6 0.8

Sputum Eosinophils (%) 0.7 11

Non eosinophilic corticosteroid unresponsive asthma

Pavord I et al Lancet 1999

-40

-30

-20

-10

0

10

20Eos > 3%

Eos < 3%p<0.05

NS

Ch

ang

e in

sym

pto

ms

VA

S (

mm

)

Pavord I et al Lancet 1999

Sputum eosinophilia as a predictive factor for response to inhaled corticoids in asthma

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0Eos > 3%Eos < 3%

p<0.05

NS

Ch

ang

e in

PC

20 (

DD

)

Pavord I et al Lancet 1999

Sputum eosinophilia as a predictive factor for response to inhaled corticoids in asthma

ANTI-INFLAMMATORY TREATMENT:1.) Low dose inhaled steroid (100-200g BDP bd) 2.) Moderate dose inhaled steroid (200-400g BDP bd) 3.) High dose inhaled steroid (400-1600g BDP bd)4.) High dose inhaled steroid (400-1600g BDP bd) plus leukotriene antagonist 5.) Higher dose inhaled steroid (1600g BDP bd) plus leukotriene antagonist6.) Higher dose inhaled steroid (1600g BDP bd) plus leukotriene antagonist plus oral Prednisolone 30mg 2/52, then titrating dose reducing by 5mg/week

BRONCHODILATOR TREATMENT1.) Long acting 2 agonist2.) Long acting 2 agonist plus theophylline3.) Long acting 2-agonist plus theophylline plus nebulised bronchodilator   

Step down anti-inflammatory treatment Step down bronchodilator

treatment 

Step down anti-inflammatory treatment

Step up bronchodilator treatment  SPUTUM EOSINOPHILS 1-

3% 

Step up anti-inflammatory treatment

No change in bronchdilator treatment

No change in anti-inflammatory treatment

Step up bronchodilator treatment  SPUTUM EOSINOPHILS

>3%

No change in anti-inflammatory Step down bronchodilator

treatment  

Step up anti-inflammatory treatmentStep up bronchdilator treatment once

on maximum anti-inflammatory treatment

SPUTUM EOSINOPHILS <1% 

Symptomscontrolled

Symptoms notcontrolled

Green et al. Lancet 2002

Sputum guided treatment adjustment

BTS guidelines

sputum guidelines

120

100

80

60

40

20

0

Sev

ere

exac

erb

atio

ns

(cu

mu

lati

ve n

um

ber

)

0 1 2 3 4 5 6 987 10 11

Time (months)

12

‡p=0.01

1 asthma admission

6 asthma admissions

Green et al. Lancet Lancet 2002

17051660Inh corticosteroids (mcg/day)

3.02.6Oral corticosteroids (mg/day)

1212Theophylline (n)

1513Leukotriene antagonists (n)

11*4Nebulised beta2 agonists (n)

1212Long acting beta2 agonists (n)

Traditional management

Sputum management

Treatment

*p<0.05 Green et al. Lancet in press

Induced sputum in asthma

• Sputum eosinophilia is present in 70% of steroid naive asthmatics

• Measuring sputum eosinophil count together with methacholine bronchial responsiveness are the best ways to diagnose mild to moderate asthma

• Non eosinophilic asthmatics with prominent sputum neutrophilia seems to resist to inhaled corticoids

• Exacerbation of asthma is often associated with sputum eosinophilia

• Targeting sputum eosinophil count for adjusting the dose of inhaled corticoids in moderate to severe asthmatics help in reducing asthma exacerbation

Sensitivity is lower in sputum than in BAL 75-100 % vs 25%

Specificity is higher in sputum > 95%

Asbestos body

Asbestose pulmonaire

Le NO exhalé

Le NO dans les voies aériennes

7. Analyseur de NO (Monoxyde d’Azote)

Mesure « on line » par chemoluminescence au cours d’une expiration de 10 sec contre une résistance

Valeur moyenne normale :

21 ppb (part per billion)

Valeur significativement accrue:

> 45 ppb

Exhaled NO in children

Mesure du NO exhalé

• Flux expiratoire constant durant 10’’

• Débit expiratoire fixé à 50 ml/sec

• Contre une résistance

• Mesure durant les 4 dernières secondes

• 3 mesures réalisées et moyenne de ces 3 mesures

Nasal vs bronchial NO

Karadag et al 1999

Kharitonov S et al AJRCCM 2001

Raised ExNO in asthmatics

Healthy subject Asthmatics

Epithelial activation as a source of exhaled NO in asthma

Berlyne G et al JACI 2000

Performance of sputum eosinophil count vs exhaled NO for diagnosing asthma

Steroid naive patients Steroid treated patients

Solid line: sputum eosinophils

Dashed line: exhaled NO

Solid line: sputum eosinophils

Dashed line: exhaled NO

Cut-off: 0.3%

Cut-off: 17 ppb

Cut-off: 15 ppb

Cut-off: 0.08%

Smith A et al Am J Respir Crit Care Med 2004

Performance of PEF variability, exNO and sputum eosinophil count to diagnose asthma

Solid line: NO (best cut-off 20 ppb)

Dashed line: Sputum Eosinophils (best cut-off 3%)

Solid line: variability in PEF

Dashed line: change in mean morning PEF after inhaled steroids

3%20 ppb

PEF

Sp Eo

Ex NO

Use of exNO to guide treatment in asthma

Smith A N Engl J Med 2005

Use of exNO to guide treatment in asthma

Smith A N Engl J Med 2005

With the use of FeNO measurements, maintenance doses

of inhaled corticoids may be significantly reduced without compromising asthma control

Use of exNO to guide treatment in asthma

Smith A N Engl J Med 2005

Nasal and exhaled NO in children

with PCD

Karadag et al 1999

Factors affecting exhaled NO levels

+

-

Airway viral infection

Allergic rhinitis

Nitrate-rich diet

Spirometric maneuvres

Exercise

Alcohol

Bronchoconstriction

Ciliary dyskinesia

Hypertension

Smoking