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Je dédie ce travail
à Sophie, la femme qui partage ma vie
et me supporte tous les jours,
à mes parents pour leur soutien.
Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier le Pr P. Calvas qui m’a fait l’honneur de présider le jury de
cette thèse.
Je remercie également le Dr P. Desprès et le Pr L. Becquemont d’avoir accepté d’être les
rapporteurs de cette thèse, ainsi que pour leurs nombreuses remarques et suggestions sur
l’écriture de ce manuscrit.
Je remercier le directeur de cette thèse, le Pr D. Brassat pour m'avoir fait confiance en me
laissant une grande liberté et en me déléguant plusieurs responsabilités dont j'espère avoir
été à la hauteur.
Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance au Pr R. Liblau pour m’avoir permis de faire
parti de son équipe durant mon année de M2R, mais aussi pour ses nombreux conseils
scientifiques durant les années qui ont suivies.
Pour sa confiance et son soutien financier durant ma thèse je remercie vivement. Pr M.
Clanet.
Je remercie les Pr A. Saoudi et D. Dunia pour m’avoir initié aux Emit et aux sessions
d’immunologie auxquelles ils m’ont permis d’assister et de participer
J’ai aussi une pensée particulière pour le Pr J. Zappulla qui m’a encadré durant l’année de
M2R, ainsi que le Pr. E. Piaggio pour sa présence bienveillante.
Je remercie les deux femmes de mon équipe, Florence et Lise, pour leusr aides et pour leur
bonne humeur.
Je remercie toutes les personnes des équipes Liblau, Saoudi et Dunia qui se reconnaitront
pour tous les bons moments passés à l’heure du déjeuner et des poses.
Je remercie l’ARSEP qui a financé ma thèse et qui m’a permis d’assister à des présentations
passionnantes sur la sclérose en plaques.
Afin merci à toute ma famille, mes amis, et mes compagnons de capoeira pour m’avoir permis
de passer des bons moments en dehors du laboratoire durant cette thèse.
Résumé
Nicolas Couturier
Etude génétique et épigénétique de la sclérose en plaques :
Susceptibilité et réponse au traitement
Directeur de thèse : Pr. David Brassat
Thèse soutenue à Toulouse, le 28 Octobre 2009
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune démyélinisante du système
nerveux central. Cette maladie multifactorielle est la cause majeure de handicap chez le jeune
adulte et affecte préférentiellement les femmes. Bien que sa pathogénie soit encore mal
comprise, la communauté scientifique s’accorde à dire que la SEP se développe chez des
individus génétiquement susceptibles, qui ont été en contact avec des facteurs
environnementaux, qui pourraient modifier les facteurs épigénétiques. Ces derniers seraient
impliqués dans deux étapes de la maladie, auxquelles je me suis intéressé pendant ma thèse:
(1) la susceptibilité à la maladie et (2) la réponse au traitement.
En effet, la composante génétique influence la susceptibilité à la SEP, avec
l’imputabilité de très nombreux loci ayant de faibles effets lorsqu’ils sont pris dans leur
individualité. Historiquement, le complexe majeur d’histocompatibilité fut le premier locus de
susceptibilité à la SEP découvert. Ce n’est qu’avec la généralisation des puces à
polymorphismes et l’utilisation de larges cohortes de patients que de nouveaux gènes ont pu
être découvert. Ainsi, deux gènes ont été identifiés en 2008: IL-2RA et IL-7R. Au cours de
ma thèse, un polymorphisme localisé dans un nouveau gène de susceptibilité à la SEP, TYK2,
a été identifié par une étude génétique dans la population française. Ce gène, codant pour une
tyrosine kinase associée à de nombreux récepteurs aux cytokines telles que l’IFNβ, l’IL-6,
l’IL-10, l’IL-12 et l’IL-23, présente un polymorphisme modifiant sa structure primaire et
possiblement son activité enzymatique. Afin de déterminer les conséquences de ce
polymorphisme sur la signalisation et la réponse immunitaire, une étude fonctionnelle a été
réalisée. Par ailleurs, dans la population française, un autre gène (OAS2) serait associé à une
plus grande susceptibilité à la SEP. Ce gène code pour la 2’-5’-oligoadénylate synthétase 2.
Cependant, ces données restent à confirmer sur des cohortes indépendantes de tailles plus
importantes à celle utilisée dans notre étude.
Résumé
L’autre composante qui peut influencer la susceptibilité à la SEP est la composante
épigénétique. L’épigénétique regroupe toutes les modifications transmissibles et réversibles
de l'expression des gènes ne s'accompagnant pas de changements des séquences
nucléotidiques. L’importance de cette composante est particulièrement marquée chez les
jumeaux monozygotes, qui par définition partagent la même information génétique, mais qui
peuvent être discordants dans leur statut clinique pour la SEP. Le mécanisme d’inactivation
du chromosome X fait partie de cette composante épigénétique. Chez les femmes,
contrairement aux hommes, les cellules possèdent deux chromosomes X. Par un mécanisme
de compensation, chaque cellule va décider d’inactiver un des deux chromosomes X et
conserver ce profil jusqu’à sa mort. Normalement, on retrouve dans le sang 50% de cellules
exprimant le chromosome X d’origine paternelle et 50% celui d’origine maternelle. Il a été
démontré que dans certaines pathologies auto-immunes, cela n’est plus le cas. En comparant
une population de femmes souffrant de SEP à une population de femmes « saines », nous
avons pu observer une différence dans le profil d’inactivation du chromosome X.
Une fois la maladie diagnostiquée, un traitement est proposé aux patients. La
composante génétique peut alors influencer la réponse du patient au traitement. Cela a été
précédemment démontré pour certains médicaments, comme la warfarine, anticoagulant
utilisé dans le traitement des troubles du rythme cardiaque. Dans le cadre de la SEP, il serait
important de mieux comprendre et de prédire la réponse au traitement par l’IFNβ.
L’utilisation de cette molécule immunomodulatrice apporte un réel progrès dans le traitement
de la SEP, mais avec l’apparition de nouveaux traitements il devient impératif pour le
médecin d’avancer vers une approche thérapeutique personnalisée, à la fois plus efficace et
mieux tolérée par le malade. Pour cela, nous avons constitué une cohorte européenne de
patients souffrant de SEP et traités par IFNβ. Les données cliniques disponibles sur ces
patients nous ont permis de les classer en deux groupes : les répondeurs et les non-répondeurs
au traitement. Une analyse préliminaire des polymorphismes contenus dans des gènes de la
cascade de signalisation de l’IFNβ a révélé que plusieurs polymorphismes présents dans la
séquence du gène codant pour l’enzyme 2’-5’-oligoadénylate synthétase 1 (OAS1) et du gène
TRAIL pourraient influencer la réponse des patients atteints de SEP à cette molécule.
Abstract
Nicolas Couturier
Genetics and Epigenetics in Multiple Sclerosis:
Susceptibility and Response to Treatment
Thesis supervisor : Pr. David Brassat
Toulouse, October 28th 2009
Multiple sclerosis (MS) is a demyelinating disease of the central nervous system that
leads to disability in young adults. As other autoimmune diseases, MS is characterized by a
striking female predominance; however its pathogenesis remains elusive. It is widely believed
to occur in genetically susceptible individuals after exposure to undefined environmental
factors that influence epigenetic factors. These factors may act at two different levels: (1) on
the susceptibility to develop MS and (2) on response to MS treatment
Little is known about genes that are involved in MS susceptibility. Over more than 30
years, with the discovery of the association of major histocompatibility complex with MS risk
and it confirmation in a wide range of population, lead us to search whether other new
susceptibility genes are also involved. With the development of genome-wide association
studies, two non-HLA variants (IL-2R and IL-7R variants) have been implicated with strong
confidence in MS susceptibility. Recently genetic association studies have identified a
polymorphism (rs34536443) in TYK2 gene associated with MS susceptibility, and we
confirmed this association in the French population. Rs34536443 polymorphism localizes in
the exon 21 of TYK2 gene, and codes either a proline (major allele) or an alanine at position
1104, in the tyrosine kinase. A functional consequence of this polymorphism could be to alter
kinase function of this protein as suggested by two independent studies. Moreover, TYK2
deficiency revealed an important role in immunity and in lymphocyte differentiation as
demonstrated in mouse model. Given these data, we investigated the potential functional
consequences of the rs34536443 polymorphism on TYK2 activation, and in lymphocyte
polarization. Moreover, our preliminary data suggest association between OAS2
polymorphisms and MS susceptibility. This association has to be confirmed in a new
independent MS cohort.
Abstract
In biology, the term epigenetics refers to changes in gene expression caused by
mechanisms other than modifications in the underlying DNA sequence. These changes may
remain through cell divisions. These epigenetic modifications could be implicated in MS
susceptibility too. Monozygotic twins share the same genetic information but two third of
identical twins are discordant for MS status. In this case, the importance in MS susceptiblity
of epigenetic factors is clearly visible. X-chromosome inactivation is an epigenetic
mechanism occurring only in females. In female mammalian cells, one of the two X-
chromosome is inactivated in early embryonic life. Thus, females are mocaics for two cell
populations, cells with either the paternal or the maternal X in the active form. X-choice is
assumed to be random, and the result is generally 50% of cells expressed the paternal and the
remaining 50% expressed the maternal genes. Studies reported for some autoimmune disease
(lupus, autoimmune thyroid diseases and rheumatoid arthritis) an association with a deviation
from this ratio 50:50%. In MS, ours results revealed a difference in degree of skewing in MS
patients compare to controls.
After MS development, genetic factors may influence patient response to MS
treatment. Pharmacogenetics is a science that provides some clue on how to define best
responders. For instance, variants in the VKORC1 gene could explain why efficient
anticoagulant warfarin dose is variable between patients. Ten years ago, interferon beta
(IFNβ) was the first therapy proposed with a demonstrated efficacy in MS. This
immunomodulatory drug is a major advancement in MS therapy as it allows a 30% decrease
in the relapse rates, in disability progression and in lesion load, and an increase in patient’s
quality of life. But with the development of new drugs, it will be of importance to personalise
medicine. Hence, exploring the degree of variability in candidate genes for direct association
with treatment response represents a promising approach to improve the overall efficacy of
the treatment. For this study, naïve patients to immunotherapy and starting IFNβ treatment
were recruited in the European community. We categorized MS patients on clinical criteria in
two groupes: responders and non-responders to IFNβ treatment. In a preliminary study,
significant associations with OAS1 and TRAIL polymorphisms were found suggesting that
genetic variants in these two genes may be of clinical interest in MS as predictors of the
efficacy to IFNβ therapy.
Sommaire
ABREVIATION ET ANGLICISMES P1
LISTE DES FIGURES P3
INTRODUCTION P7
II .. LL aa sscclléérr oossee eenn ppllaaqquueess P9
I.1. Les différentes formes cliniques de sclérose en plaques et évolution de la
maladie P10
I.2. Conséquences anatomiques de la maladie P13
I.3. Pathogénie de la sclérose en plaques P13
I.4 Critères de diagnostic de la sclérose en plaques ou critères de McDonald P15
I.5. Les méthodes d’investigation paracliniques P16
I.5.1. Imagerie par résonnance magnétique
I.5.2. Analyse du liquide céphalo-rachidien
I.5.3. Examen des potentiels évoqués visuels
I.6. Mesure de la progression du handicap P19
II II .. LL eess ffaacctteeuurr ss ddee ssuusscceepptt iibbii ll ii ttéé àà llaa sscclléérr oossee eenn ppllaaqquueess P23
II.1. Les facteurs génétiques P23
II.1.1. Les éléments soulignant l’importance de la génétique dans la maladie
II.1.2. Etiologie génétique de la sclérose en plaques
II.1.3. Les différentes classes de polymorphismes génétiques chez l’Homme
1.3.1. Les polymorphismes d’un seul nucléotide
1.3.2. Les polymorphismes structuraux
II.1.4. La notion de déséquilibre de liaison entre plusieurs polymorphismes
II.1.5. Les moyens mis en œuvre dans l’identification des gènes de susceptibilité
à la sclérose en plaques
1.5.1. L’approche gène candidat vs l’approche sans à priori
a. Approche gène candidat
b. Approche sans à priori par GWAS
1.5.2. Configuration des cohortes utilisées en association génétique
II.1.6. Importance du complexe majeur d’histocompatibilité dans la susceptibilité
à la sclérose en plaques
1.6.1. Implication du CMH-II dans la susceptibilité à la sclérose en plaques
Sommaire
1.6.2. Implication du CMH-I dans la susceptibilité à la sclérose en plaques
II.1.7. Les autres gènes associés à la susceptibilité à la SEP
1.7.1. Le récepteur à l’IL-7
1.7.2. Le récepteur à l’IL-2
1.7.3. Le CD58
1.7.4. La tyrosine kinase 2
II.2. Les facteurs environnementaux P51
II.2.1. Les risques micro-environnementaux
II.2.2. Les risques environnementaux
2.2.1. Les agents infectieux
a. Le virus d’Epstein-Barr
b. Les autres pathogènes suspectés
2.2.2. L’exposition lumineuse et la vitamine D
2.2.3. La cigarette
II.3. Les facteurs épigénétiques P60
II.3.1. Influence de l’épigénétique dans la susceptibilité aux maladies auto-
immunes
II.3.2. Comment l’épigénétique pourrait modifier la susceptibilité à la sclérose
en plaques ?
3.2.1. Modification épigénétique du locus PAD2
3.2.2. Impact de l’épigénétique sur la différenciation cellulaire
3.2.3. L’inactivation du chromosome X
a. Mécanismes d’inactivation du chromosome X
b. Implication de l’inactivation du chromosome X dans l’expression phénotypique
c. Causes du biais dans l’inactivation du chromosome X
d. Conséquences de l’inactivation du chromosome X
e. Monosomie ou perte du chromosome X
II II II .. TTrr aaii tteemmeenntt eett pphhaarr mmaaccooggéénnéétt iiqquuee ddee llaa sscclléérr oossee eenn ppllaaqquueess P77
III.1. Les traitements de fond disponibles en 2009 P77
III.1.1. L’interféron bêta
III.1.2. L’acétate de glatiramère
III.1.3. L’anticorps monoclonal natalizumab
III.1.4. La mitoxantrone
III.2. Comparaison de l’efficacité des thérapies actuelles P85
Sommaire
III.3. Optimisation des traitements existants P86
III.4. Les nouveaux traitements en cours de développement P88
III.5. Définition de la réponse au traitement dans la sclérose en plaques P93
III.5.1. Traitement de la sclérose en plaques par une approche d’escalade
thérapeutique
III.5.2. Prédiction de la réponse au traitement des patients sclérose en plaques
en vue d’une médecine personnalisée
5.2.1. Recherche de bio-marqueurs prédictifs de la réponse au traitement
5.2.2. Anticiper la réponse au traitement par analyse de l’expression génique
5.2.3. Recherche de marqueurs génétiques prédictifs de la réponse au traitement
IV. Les iinntteerr fféérr oonnss ddee ttyyppee 11 P99
IV.1. La voie de signalisation des interférons de type 1 P99
IV.2. Les protéines antivirales induites par les interférons de type 1 P100
IV.2.1. La protéine MxA
IV.2.2. La voie des OAS et de la RNaseL
IV.2.3. La protéine kinase PKR
IV.2.4. Le facteur ISG15
IV.3. Interférons de type 1 et sclérose en plaques P105
IV.3.1. Evidences de l’importance des interférons de type 1 dans la sclérose
en plaques
IV.3.2. Mécanisme d’action de l’IFNβ dans le traitement de la sclérose en plaques
3.2.1. Effet de l’IFNβ sur la migration des cellules immunes
a. Adhésion à la barrière hémato-encéphalique
b. Migration à travers l’espace péri-vasculaire
3.2.2. Effet de l’IFNβ sur l’activation et la polarisation des cellules immunes
3.2.3. Effet de l’IFNβ sur l’apoptose des cellules immunes
MATERIELS ET METHODES P113
RESULTATS P125
Facteurs génétique et susceptibilité à la SEP P127
Facteurs épigénétiques et susceptibilité à la SEP P153
Facteurs génétiques et réponse au traitement P163
Sommaire
DISCUSSION ET PERSPECTIVES P175
ANNEXES P191
BIBLIOGRAPHIE P197
1
ABREVIATIONS ET ANGLICISMES
APC Cellules présentatrices de l’antigène Mx Myxovirus-Resistance-Protein
ARNdb ARNs doubles brins MZ Jumeaux monozygotes
BBB Barrière hémato-encéphalique Nabs Anticorps neutralisants
BDNF Brain Derived Neurotrophic Factor NO Oxyde nitrique
CMH Complexe Majeur d’Histocompatibilité OAS 2’-5’OligoAdénylate Synthétase
CNV Variation du nombre de copies OPC Oligodendrocyte Precursor Cell
DZ
EAE
Jumeaux dizygotes
Encéphalomyélite Auto-immune
PKR
PLP
Protéine Kinase Régulée par les ARNs
Protéine protéolipide de la myéline
EDSS
Expérimentale
Echelle élargie de progression du
PP-MS
PEV
SEP progressive primaire
Potentiels Evoqués Visuels
handicap PF Paramètres Fonctionnels
EBV Virus d’Epstein-Barr RR-MS SEP rémittente-récurrente
GA Acétate de glatiramère SNC Système Nerveux Central
GWAS Genome-Wide Analysis Study SEP Sclérose En Plaques
HHV6 Virus herpétique humain 6 SNP Single Nucleotide Polymorphism
IFN Interféron SP-MS SEP progressive secondaire
IgG Immunoglobuline d’isotype G S1P Sphingosine-1-Phosphate
IL Interleukine TDT Test de Déséquilibre de Transmission
ILxR Récepteur à l’interleukine x Thx Lymphocytes T-helper x
IRM Imagerie par Résonnance Magnétique TYK2 Tyrosine Kinase 2
ISGF3 IFN-Stimulated Gene Factor 3 VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule-1
ISRE IFN-Stimulated Response Element VD Vitamine D
JAK
KIR
Janus Kinase
Killer cell Immunoglobulin-Like
VLA-4
Xce
Very Late Activating Antigen-4
X-Controlling Element
Receptor XCI Inactivation du chromosome X
LCR Liquide Céphalo-Rachidien Xic X Inactivation Center
LD
LEMP
Déséquilibre de liaison
LeucoEncéphalopathie Multifocale
Xist
XITE
X -Inactive Specific Transcript
X-Inactivation Intergenic Transciption
MAF
Progressive
Fréquence de l’allèle mineur d’un
Xpr
Elements
X-Pairing Region
polymorphisme
MBP Protéine basique de la myéline
MMP Métallo-protéases
MSSS Score de sévérité de la sclérose en
plaques
MTX Mitoxantrone
2
3
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Schéma des principaux symptômes rencontrés dans la SEP.
Figure 2 : Description schématique de l’évolution clinique de la SEP.
Figure 3 : Présence de bandes oligoclonales d’IgG retrouvées uniquement dans le LCR d’un
individu souffrant de SEP.
Figure 4 : Comparaison d’un PEV enregistré chez un individu souffrant de SEP avec celui
d’un individu sain.
Figure 5 : Echelle EDSS simplifiée, ne présentant que les scores principaux de la SEP.
Figure 6 : Score de sévérité de la SEP (MSSS) global.
Figure 7 : Les différentes voies pouvant conduire au développement de la SEP.
Figure 8 : Risque de récurrence intrafamiliale pour la SEP.
Figure 9 : Les variants de faible fréquence et la susceptibilité aux maladies.
Figure 10 : Les différentes catégories de polymorphismes génétiques chez l’Homme.
Figure 11 : Nombre de polymorphismes détectés dans le génome de 4 individus de
différentes ethnies.
Figure 12 : Nombre et caractéristiques des variations structurales détectées dans le génome
d’un individu d’origine caucasienne.
Figure 13 : Les déséquilibres de liaison des variants communs du génome humain diffèrent
entre les populations.
Figure 14 : Association des polymorphismes par une approche directe ou par une approche en
tagSNP.
Figure 15 : Recouvrement des loci contenant les facteurs de risque génétique aux maladies
communes humaines.
Figure 16 : Approche GWAS en plusieurs étapes afin de réduire la taille des échantillons.
Figure 17 : Allèles de l’haplotype du HLA-DR2 associés à la sclérose en plaques
(l’implication des marqueurs entre parenthèse semble due à un déséquilibre de liaison).
Figure 18 : Risque génotypique relatif pour la sclérose en plaques en fonction des
combinaisons d’allèles contenues dans le locus HLA-DRB1.
4
Figure 19 : Association du HLA avec la sclérose en plaques.
Figure 20 : Les gènes associés au risque de développer une sclérose en plaques.
Figure 21 : Récepteurs aux cytokines qui utilisent TYK2 dans leur voie de signalisation.
Figure 22 : Prévalence de la SEP dans le monde.
Figure 23 : Représentation schématique de l’incidence de la SEP en fonction de l’infection
par le virus d’Epstein-Barr.
Figure 24 : Métabolisme de la vitamine D.
Figure 25 : Modèle pour la transmission d’un phénotype en l’absence de mutation du gène
Kit proposé par Rassoulzadegan et al.
Figure 26 : Mécanisme proposé dans le développement de la SEP suite à une dérégulation
épigénétique du gène PAD2 conduisant à la surexpression de la protéine dans les
oligodendrocytes.
Figure 27 : Modèle possible d’inactivation du chromosome X.
Figure 28 : Mécanisme expliquant le biais dans l’inactivation du chromosome X.
Figure 29 : Représentation schématique du mécanisme proposé pour expliquer l’effet
immuno-modulateur de l’acétate de glatiramère.
Figure 30 : Les différents types d’anticorps monoclonaux utilisés en thérapie.
Figures 31 : Les cibles thérapeutiques possibles dans le traitement de la sclérose en plaques.
Figures 32 : La voie de signalisation des interférons de type 1.
Figure 33 : Mécanisme d’action de la protéine MxA.
Figure 34 : La voie antivirale OAS1-RNase L.
Figure 35 : Mécanisme d’action de la PKR.
Figure 36 : Mécanisme de l’ISGylation.
Figure 37 : Le polymorphisme rs34536443 ne modifie pas l’expression protéique de TYK2.
Figure 38 : Le polymorphisme rs34536443 modifie le niveau d’activation de TYK2.
Figure 39 : Le polymorphisme rs34536443 modifie le niveau d’activation de la voie de
signalisation de l’IFNβ.
5
Figure 40 : Le polymorphisme rs34536443 contrôle le niveau d’expression des gènes induits
par l’IFNβ.
Figure 41 : Le polymorphisme rs34536443 influence l’expression des facteurs nucléaires
impliqués dans la polarisation lymphocytaire.
Figure 42 : L’expression des facteurs nucléaires impliqués dans polarisation lymphocytaire
permet de classer les individus en fonction de leur génotype pour le polymorphisme
rs34536443.
Figure 43 : Le polymorphisme rs34536443 influence la sécrétion de cytokines par les
lymphocytes T.
Figure 44 : Etude par cytométrie de l’effet du polymorphisme rs34536443 sur la production
de cytokines par les lymphocytes.
Figure 45 : Comparaison de l’expression des gènes de la voie des IFNs de type 1 chez des
patients SEP par rapport à des témoins.
Figure 46 : Le gène OASL n’est pas associé avec la susceptibilité à la SEP dans les familles
trio françaises.
Figure 47 : Le gène OAS2 est associé avec la susceptibilité à la SEP dans les familles trio
françaises.
Figure 48 : Protocole expérimental permettant de mesurer le profil d’inactivation du
chromosome X chez une femme.
Figure 49 : L’immortalisation des cellules immunitaires par l’EBV modifie leur profil de
XCI.
Figure 50 : Le profil du XCI diffère entre la population de patientes SEP et la population de
témoins.
Figure 51 : Comparaison du coefficient de corrélation pour le profil du XCI au sein de
cohortes de jumelles MZ, en fonction du statut clinique pour la SEP.
Figure 52 : Monosomie du chromosome X au sein de paires de jumelles MZ discordantes
pour la SEP.
Figure 53 : Association du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL avec la réponse au
traitement de la SEP par l’IFNβ.
6
Figure 54 : Association du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec la réponse au
traitement de la SEP par l’IFNβ.
Figure 55 : Invalidation de l’association du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL avec
la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.
Figure 56 : Invalidation de l’association du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec la
réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.
Figure 57 : Le polymorphisme rs34536443 contrôle le niveau d’expression des facteurs
nucléaires de polarisation lymphocytaire en présence d’IFNβ.
Tableau I : Critères de McDonald révisés (2005) pour le diagnostic de la SEP.
Tableau II : Analyse d’association du polymorphisme rs34536443 de TYK2 dans la SEP par
une approche en cas-témoins.
Tableau III : Analyse TDT du polymorphisme rs34536443 de TYK2 dans la SEP sur 640
familles trio françaises.
Tableau IV : Analyse d’association du polymorphisme rs12815666 d’OAS2 dans la SEP par
une approche en cas-témoins.
Tableau V : Analyse d’association du polymorphisme rs1298301 d’OAS2 dans la SEP par
une approche en cas-témoins.
Tableau VI : Analyse d’association du polymorphisme rs34536443 de TYK2 avec la réponse
au traitement de la SEP par l’IFNβ.
Tableau S1 : Liste et localisation sur la plaque de PCRarray des gènes amplifiés.
Tableau S2 : Analyse TDT des polymorphismes rs3741981 et rs10774671 d’OAS1 dans la
SEP sur 591 familles trio françaises.
Tableau S3 : Analyse TDT des haplotypes formés par des polymorphismes rs3741981 et
rs10774671 d’OAS1 dans la SEP sur 591 familles trio françaises.
7
II NNTTRROODDUUCCTTII OONN
Introduction
8
Introduction
9
I. La sclérose en plaques
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire chronique
touchant le système nerveux central (SNC), c'est-à-dire le cerveau ainsi que la moëlle
épinière. Elle affecte environ 2,5 millions de personnes dans le monde (80 000 personnes en
France) et en moyenne 120 personnes pour 100 000 habitants sont nouvellement
diagnostiquées chaque année [Compston et al., 2002]. 70% des nouveaux patients sont des sujets
jeunes, ayant entre 20 et 40 ans. La SEP représente la cause majeure de handicap dans cette
tranche d’âge. La prévalence de la maladie dans la population générale est variable en
fonction des régions du monde étudiées, avec 60-200 patients atteints de SEP pour 100 000
personnes en Europe et en Amérique du nord, alors que dans les zones de faible prévalence
comme le Japon, la prévalence est environ 10 fois moins importante. De façon similaire aux
autres maladies auto-immunes humaines, les femmes sont plus fréquemment touchées que les
hommes, avec un ratio homme : femme de 1:3. De plus, plusieurs études à travers le monde
suggèrent que, durant les 50 dernières années, l’incidence de la maladie a augmenté [Barnett et
al., 2003], et que cette augmentation est plus rapide chez les femmes que chez les hommes,
modifiant encore plus le ratio homme : femme [Wallin et al., 2004; Orton et al., 2006].
Chez la majorité des patients, les manifestations cliniques apparaissent dès le début de
la maladie et indiquent l’implication du système nerveux moteur, sensoriel, visuel et
autonome (Figure 1). Par ailleurs, il existent d’autres symptômes ou signes moins
perceptibles (dépression, fatigue, etc…) qui peuvent passer inaperçus et qui ne seront
diagnostiqués que de manière rétrospective [Compston et al., 2002].
Introduction
10
Figure 1 : Schéma des principaux symptômes rencontrés dans la SEP.
I.1. Les différentes formes cliniques de sclérose en plaques et évolution de la
maladie
Dès le 19ème siècle, trois signes cliniques maintenant connus comme associés à la SEP
- dysarthrie (troubles de l’articulation), ataxie (trouble de l’équilibre) et tremblements - étaient
déjà décrits par les médecins. C’est le neurologue français, Jean-Martin Charcot, qui en 1868
associa tous ces symptômes à une seule pathologie qu’il nomma la « sclérose en plaques »
[Charcot et al., 1868]. Un siècle plus tard, Schumacher et al. définirent le terme de poussées dans
la SEP. Ils les qualifièrent comme la dysfonction localisée d’une fonction, affectant la
substance blanche, et dont l’effet doit perdurer durant au moins 24 heures tout en étant
précédé d’au moins 30 jours de stabilité clinique [Schumacher et al., 1968]. Les poussées de SEP
sont le reflet clinique de la présence de foyers inflammatoires actifs au niveau du SNC. Ces
zones inflammatoires conduisent à des dommages au niveau des fibres myélinisées d’axones
et des neurones, dont la conséquence est d’entraîner des défauts dans la conduction des
signaux neurologiques. Cependant, cette définition originale de poussées n’est pas totalement
vraie. En effet, la substance grise du SNC peut elle aussi être affectée au cours de la maladie,
comme cela est visible en imagerie par résonnance magnétique (IRM ) par une diminution
du volume total de la matière grise [Sanfilipo et al., 2006] et par la présence de lésions [Bo et al.,
2003]. Par ailleurs, les 30 jours d’intervalle de stabilité clinique entre les poussées furent
arbitrairement choisis, sans aucune correspondance avec les connaissances actuelles sur la
Introduction
11
biologie de la maladie. On sait qu’un même patient présente de nombreuses lésions dans le
SNC, à des stades d’évolution différents, qui progressent de manière indépendante, et qui sont
toutes susceptibles d’induire des poussées. Enfin, il existe des pseudo-poussées, qui sont
rapidement réversibles et se déclarent en présence d’un stress physiologique. Ces pseudo-
poussées ne sont pas dues à l’apparition de nouveaux foyers inflammatoires, mais sont plutôt
la conséquence des dommages présents dans d’anciennes lésions et qui perturbent la
conduction du signal en présence d’un stress.
La SEP n’est pas une maladie homogène quant à l’expression des symptômes. En
effet, il est possible de distinguer deux formes cliniques majeures de SEP : les SEP à forme
rémittente-récurrente (RR-MS) et les SEP progressives primaires (PP-MS). Ces deux
formes peuvent être considérées comme deux maladies à part entière car très hétérogènes sur
le plan radiologique [McFarland et al., 1999 ; Rovaris et al., 2003], histologique [Lucchinetti et al.,
2000] et clinique [Sospedra et al., 2005] (Figure 2). La forme la plus fréquente (85% des cas) est
la forme RR-MS qui va présenter une évolution par poussées, tandis que les 15 autres
pourcents des cas sont des formes PP-MS présentant une évolution plus linéaire de la maladie
[Vollmer et al., 2007].
- La forme RR-MS se caractérise donc par des poussées. Une poussée est l’apparition
d’un signe clinique qui généralement perdure dans le temps (entre une semaine et un
mois). Ces poussées sont associées à l’apparition de lésions inflammatoires dans le
SNC, visibles en IRM. Au début de l’évolution de la RR-MS, la majorité des patients,
récupèrent complètement de leur handicap après ces épisodes aigüs de la maladie. On
assiste alors à une alternance dans le temps de poussées suivies de périodes de
récupération plus ou moins longues. Puis avec le temps, les poussées deviennent plus
fréquentes et le patient commence à ne récupérer que partiellement de son handicap ce
qui conduit à l’accumulation de dommages neurologiques [Lublin et al., 1996 ; Thompson
et al., 1990]. Les poussées sont des événements qu’il est toujours difficile de prédire,
cependant des changements environnementaux peuvent influencer le risque de de
survenue d’une poussée. Les changements hormonaux durant la grossesse et après
l’accouchement sont aussi connus pour affecter la fréquence des poussées. Le nombre
moyen de poussées annuelles diminue progressivement durant les 3 trimestres de
grossesse (passant de 0,7 avant la grossesse, à 0,6, puis 0,5 et enfin 0,2 aux 1er, 2ème et
3ème trimestres respectivement). Puis, rapidement après l’accouchement, le nombre
moyen de poussées annuelles augmente fortement (taux annuel moyen : 1,2) pour
Introduction
12
retrouver progressivement une valeur normale un an après l’accouchement [Confavreux
et al., 1998]. Ainsi, bien que cette période dans la vie d’une femme soit susceptible
d’influencer le nombre de poussées, si on prend l’ensemble de la période (grossesse et
post-accouchement) le risque global de progression du handicap n’est pas modifié.
Plusieurs études suggèrent également que les médiateurs inflammatoires associés à
une infection aigüe pourraient précéder le début d’une poussée dans 20 à 30% des cas.
Suite à cette période de RR-MS, environ 65% des patients entrent dans une nouvelle
phase de la maladie, appelée SEP progressive secondaire (SP-MS). A ce stade, la
maladie n’évolue plus par poussées, mais le handicap progresse de manière continue.
- La forme PP-MS se caractérise, dès le début de la maladie, par une lente aggravation
du handicap sans qu’il n’y ait de rémission constatée. Cette forme de SEP se manifeste
souvent comme une atteinte de la moelle épinière même si une atteinte du cerveau
peut aussi arriver. Comparé à la forme RR-MS, le handicap évolue généralement plus
rapidement chez les patients souffrant de cette forme de la maladie.
Il est important de noter que le temps moyen entre le diagnostic de SEP et le décès du patient
est de 30 années environ, ce qui représente une réduction de l’espérance de vie de 5 à 10 ans
[Bronnum-Hansen et al, 2004]. Les patients souffrant de SEP ont aussi un risque accru de suicide,
reflétant une augmentation des périodes de dépression au cours de leur vie [Minden et al., 1990].
Par ailleurs, chez des patients présentant des troubles neurologiques importants, le décès peut
dans 2/3 des cas être attribuable à la maladie, à une augmentation de la susceptibilité aux
pathogènes, ou à un risque de complications sévères de maladies induites par les infections.
Figure 2 : Description schématique de l’évolution clinique de la SEP. D’après Vollmer et al., J. Neurol. Sci.,
2007.
Introduction
13
I.2. Conséquences anatomiques de la maladie
La principale cellule cible du système immunitaire est l’oligodendrocyte. Cette cellule
du SNC synthétise et maintient une gaine de myéline autour de courts segments de 20 à 40
axones avoisinants. La gaine de myéline consiste en une membrane condensée, spiralée
autour de l’axone, et qui forme une gaine isolante segmentée nécessaire à la conduction
saltatoire de l’influx nerveux axonal. Ainsi, on retrouve tout au long de l’axone une alternance
de segments myélinisés et de segments non-myélinisés ou nœuds de Ranvier qui regroupent
des canaux sodium voltage-dépendants. Le potentiel d’action, lorsqu’il se propage le long de
l’axone, passe d’un nœud de Ranvier à un autre et de manière passive dans les segments
myélinisés du nerf (d’où l’utilisation du terme de conduction saltatoire).
La démyélinisation des axones explique en grande partie les signes cliniques que l’on
observe chez un patient souffrant de SEP. La destructuration de la segmentation de l’axone
empêche la conduction saltatoire, ce qui ralentit la vitesse de conduction de l’influx nerveux.
Par ailleurs, les axones démyélinisés peuvent spontanément déclencher des potentiels
d’action. Cela peut se traduire chez le patient par la sensation de décharges électriques ou la
visualisation de flashs lumineux. Enfin, si des axones démyélinisés sont proches, le signal
peut se propager d’un axone vers un autre ce qui entraîne de nombreux signes cliniques
(douleurs, tétanie…).
La caractéristique majeure de la SEP est l’apparition de lésions (ou plaques) dans le
SNC du patient. Ces lésions sont le stade final d’un procédé impliquant l’inflammation, la
succession de démyélinisation et de remyélinisation, la déplétion des oligodendrocytes,
l’astrocytose et la dégénérescence axonale et neuronale [Compston et al., 2008].
I.3. Pathogénie de la sclérose en plaques
Il est généralement admis que la SEP débute par une infiltration de lymphocytes auto-
réactifs, passant du sang vers le SNC à travers la barrière hémato-encéphalique (BBB).
Cette transition d’un état de surveillance physiologique vers une cascade pathologique se
produirait suite à un défaut de régulation. C’est ce défaut de régulation qui autoriserait aux
cellules immunitaires de monter une réponse inflammatoire dans le SNC. En effet, il a été
démontré que les cellules régulatrices de patients souffrant de SEP sont moins efficaces dans
la suppression d’une réponse effectrice [Viglietta et al., 2004]. Par ailleurs, les cellules T CD4+
Introduction
14
auto-réactives de ces patients présenteraient une sensibilité moindre à l’apoptose via la
surexpression d’une molécule de signalisation : l’arrestine bêta 1 [Shi et al., 2007]. Ce serait
aussi la défaillance de mécanismes de régulation locaux du SNC qui serait responsable de
l’accumulation périvasculaire de lymphocytes T CD8+ retrouvés à proximité (ou au contact)
d’oligodendrocytes et d’axones démyélinisés [Neumann et al., 2002]. L’importance du rôle
historiquement assigné aux lymphocytes T-helper 1 (Th1) par l’étude chez animal de
l’ encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), modèle murin de la SEP, est
aujourd’hui remise en cause [Sospedra et al., 2005]. L’inflammation serait plutôt montée par un
nouveau sous-type de lymphocytes T capables de sécréter de l’interleukine 17 sous le contrôle
de l’interleukine 23 [Langrish et al., 2005]. Deux interleukines (IL ) sécrétées par les
lymphocytes Th17, l’IL-17 et l’IL-22, seraient impliquées dans l’ouverture de la BBB [Kebir et
al., 2007], permettant l’entrée de ce sous-type de lymphocytes dans le SNC [Tzartos et al., 2008].
Les lymphocytes Th17 pourraient alors directement tuer les neurones ou recruter d’autres
cellules impliquées dans la réponse inflammatoire conduisant à la destruction de la myéline.
Enfin, le système immunitaire inné (microglie, mastocytes…) pourrait aussi jouer un rôle
dans la progression de l’inflammation via la production de composés réactifs de l’oxygène
[Sospedra et al., 2005] ou l’implication de récepteurs membranaires de mort cellulaire [Zajicek et
al., 1992].
La question du ou des antigène(s) spécifique(s) de cette réponse immune n’a pas
encore trouvé de réponse, principalement car des lymphocytes auto-réactifs sont
naturellement présents chez des personnes saines. Historiquement, les protéines composant la
myéline était considérées comme les cibles uniques de la réponse immunitaire à l’initiation de
la SEP. Cependant d’autres composants du SNC, comme la crystalline αB [Ousman et al., 2007]
ou la neurofascine [Mathey et al., 2007] semblent aussi être la cible de la réponse immunitaire.
Les lésions débuteraient par des points focaux d’inflammation du SNC qui, par la suite,
donneraient naissance à des plaques de démyélinisation présentant une expansion radiale
progressant à travers la substance blanche d’apparence normale [Kutzelnigg et al., 2005].
Les phases de rémission dans la SEP sont le reflet d’un mécanisme au cours duquel les
gaines de myéline sont reformées et la conduction saltatoire restaurée : ce phénomène est
appelé remyélinisation [Franklin et al., 2008]. Cette remyélinisation se traduit en IRM par
l’apparition de plaques de remyélinisation dites « fantômes ». Ce phénomène, qui est
généralement plus actif dans les formes RR-MS, peut cependant avoir lieu durant la phase
progressive de la maladie. Par ailleurs, une différence inter-individuelle dans l’efficacité de la
Introduction
15
remyélinisation existe [Patrikios et al., 2006]. Les débris de myéline sont alors phagocytés et des
précurseurs d’oligodendrocytes (OPC), naturellement présents dans le SNC mature [Horner
et al., 2000], peuvent migrer en réponse à des chimiokines telles que les sémaphorines 3A et 3F
[Williams et al., 2007]. Des OPC ont été retrouvés au niveau des lésions de SEP [Scolding et al.,
1998] et pourraient constituer les cellules capables de remyéliniser les axones nus [Chadran et
al., 2008]. Cependant, comme le reflète l’accumulation du handicap tout au long de l’avancée
de la maladie, la succession de cycles de démyélinisation et de remyélinisation semble
progressivement épuiser le système de réparation du tissu. Même si plusieurs hypothèses
peuvent expliquer cet épuisement, comme la présence de facteurs inhibiteurs (ou l’absence de
facteurs activateurs) de la différenciation des OPC en oligodendrocytes ou encore un
épuisement du nombre d’OPC [Franklin et al., 2002 ; Penderis et al., 2003], aucun mécanisme n’a
été clairement démontré.
I.4. Critères de diagnostic de la sclérose en plaques ou critères de McDonald
Il est important de rappeler qu’aujourd’hui encore aucun test reposant uniquement sur
l’analyse d’un seul critère clinique ou biologique ne permet de diagnostiquer de manière
fiable un début de SEP. A l’origine, le diagnostic de la maladie reposait sur des critères
cliniques et parfois paracliniques. En 2001, un regroupement international de neurologues
proposa un nouveau consensus pour le diagnostic de la SEP basé sur des critères cliniques,
paracliniques et IRM. Ce nouveau consensus fut appelé « les critères de McDonald »
[McDonald et al., 2001]. Les critères de McDonald reposent sur le principe que les lésions
doivent être disséminées dans l’espace mais aussi dans le temps afin que le diagnostic de SEP
soit posé de manière non ambiguë. Chose nouvelle, les critères de McDonald incluent aussi
un schéma permettant de diagnostiquer les formes PP-MS qui sont caractérisées, dès
l’apparition de la maladie, par l’absence d’une succession de poussées et de rémissions. A la
suite du diagnostic, le neurologue peut classer les patients en 3 catégories : patients souffrant
de SEP, patients ne souffrant pas de SEP et patients souffrant possiblement de SEP. Dans ce
dernier cas, des examens complémentaires (analyse du liquide céphalo-rachidien, examen des
potentiels évoqués visuels) doivent être pratiqués, et le patient doit être réévalué par la suite.
Ces critères sont internationalement reconnus et ont été rapidement adoptés par l’ensemble de
la communauté de neurologues. En 2005, une révision des critères de McDonald fut apportée
afin de simplifier et de raccourcir le temps de diagnostic de la SEP, tout en maintenant une
Introduction
16
bonne sensitivité et spécificité [Polman et al., 2005]. Comme représenté dans le tableau I, le
neurologue s’appuie sur des informations cliniques qui sont complétées par des informations
IRM ou parfois paracliniques.
Tableau I : Critères de McDonald révisés (2005) pour le diagnostic de la SEP. D’après Polman et al., Ann.
Neurol., 2005.
I.5. Les méthodes d’investigation paracliniques
Les différentes méthodes d’investigation paracliniques permettent d’aider le
neurologue dans son diagnostic en renforçant les observations cliniques lorsqu’elles ne sont
pas suffisantes.
I.5.1. Imagerie par résonnance magnétique
L’IRM conventionnelle est un outil paraclinique précieux pour le clinicien à la fois
dans le diagnostic d’un début de SEP et dans l’évaluation de la progression et de l’activité de
la maladie. Les lésions apparaissent sous forme de taches hypo- ou hyper-intenses reflétant
une inflammation locale ou une destructuration de l’intégrité du tissu. La prise d’images du
SNC se fait en deux temps afin de scanner le cerveau puis la moëlle épinière du patient. Les
données IRM peuvent présenter certains avantages par rapport à une approche purement
Introduction
17
clinique. D’abord, ces données sont beaucoup moins subjectives. De plus, la technique est très
sensible aux changements induits par l’avancée de la SEP [Rovaris et al. 1999] . En effet, les
événements inflammatoires visibles en IRM sont de 5 à 10 fois plus fréquents que les
poussées cliniques [Miller et al., 1996]. Cependant, la corrélation entre les mesures IRM,
l’activité de la maladie, et les manifestations cliniques sont faibles. Cette mauvaise corrélation
pourrait résulter en partie de l’incapacité à quantifier par l’approche IRM l’étendue de la
lésion, mais aussi la nature du tissu atteint.
On peut globalement dire qu’il existe principalement trois séquences d’acquisition des
images en IRM conventionnelle: la séquence T1, la séquence T1 associée à la prise de
contraste au gadolinium, et enfin la séquence T2.
- La méthode la plus sensible pour la détection de l’ensemble des lésions de SEP est
l’acquisition d’images en séquence T2. Cette sensibilité est très utile pour le diagnostic
de la maladie [McDonald et al., 2001] mais aussi pour suivre son évolution (en comptant
le nombre de nouvelles lésions, ou en observant l’extension des anciennes). Les
lésions apparaissent sous la forme de taches hyper-intenses (blanches).
- La méthode donnant des images en séquence T1 est beaucoup moins sensible que la
précédente, et certaines lésions n’y sont pas visibles. Néanmoins, elle présente
l’avantage d’autoriser la visualisation de lésions hypo-intenses (noires) qui ont été
appelées « trous noirs ». Cependant, la définition d’un trou noir n’est pas arbitraire et
dépend fortement de l’opérateur qui analyse les clichés d’IRM. Ces trous noirs sont
des lésions hypo-intenses chroniques qui ont été reportées comme étant des zones où
une très forte démyélinisation et une perte axonale ont eu lieu [Van Walderveen et al.,
1998]. Ce sont les séquelles de lésions anciennes associées à la présence d’une atrophie
locale.
- La séquence T1 associée à l’injection intraveineuse d’un composé à prise de contraste,
le gadolinium, avant l’acquisition d’images permet de distinguer les lésions actives
des lésions inactives. En effet, le gadolinium ne peut normalement pas diffuser dans le
SNC. Une prise de contraste n’est alors possible que dans les zones où la perméabilité
de la BBB est augmentée, révélant ainsi les lésions où l’inflammation a encore lieu.
Toutes ces approches permettent aussi de mesurer l’atrophie qui a lieu au niveau du cerveau et
de la moëlle épinière du patient, ce qui permet au neurologue d’estimer l’étendue de la perte
totale de tissu [Filippi et al., 2002].
Introduction
18
En plus de ces approches conventionnelles, des variations dans les protocoles
d’imagerie IRM permettent aujourd’hui de distinguer de plus en plus de composants
impliqués dans la pathologie de la SEP : l’inflammation, les dommages axonaux, la
démyélinisation, et l’astrocytose par exemple [Compston et al., 2002].
I .5.2. Analyse du liquide céphalo-rachidien
Dans 90% des cas de SEP, l’électrophorèse des protéines contenues dans le liquide
céphalo-rachidien (LCR ) révèle un profil de bandes oligoclonales d’immunoglobulines
d’isotype G (IgG) (Figure 3). Une anormalité du LCR se traduit par la présence de ces
bandes oligoclonales d’IgG qui ne sont pas présentes dans le sérum du même patient. Leur
présence indique une production locale ce qui suppose la présence de lésions immunes et
inflammatoires dans le SNC. Cette pratique fait partie du diagnostic courant de la SEP car il
permet d’éliminer les pathologies aux symptômes proches de la SEP (lupus, autres maladies
auto-immunes systémiques).
Figure 3 : Présence de bandes oligoclonales d’IgG retrouvées uniquement dans le LCR d’un individu souffrant
de SEP.
I .5.3. Examen des potentiels évoqués visuels
Les potentiels évoqués visuels (PEV) désignent un signal électrique produit par le
système nerveux en réponse à une stimulation externe de nature visuelle (flashs lumineux,
motifs à damiers). Chez une personne souffrant de SEP, le PEV enregistré présente une forme
typique : la forme en vague est conservée mais retardée dans le temps (Figure 4). Ils
Introduction
19
permettent de rechercher une atteinte spécifique du nerf optique qui serait passée inaperçue et
de poser le diagnostic de SEP si les critères cliniques et IRM sont insuffisants.
Figure 4 : Comparaison d’un PEV enregistré chez un individu souffrant de SEP avec celui d’un individu sain.
I.6. Mesure de la progression du handicap
La progression de la maladie chez un patient peut être quantifiée en se reportant à une
échelle de mesure : l’échelle élargie de progression du handicap (EDSS) [Kurtzke et al., 1955].
Bien qu’il existe d’autres échelles pour évaluer le handicap, l’échelle EDSS est l’un des
instruments les plus anciens et les plus utilisés par les neurologues pour mesurer le degré
d’invalidité du patient [Sharrack et al., 1996]. L’échelle EDSS se répartit en 20 niveaux (répartis
de 0 à 10 avec des demi-points) [Kurtzke et al., 1983]. Elle débute avec un score de 0 pour un
examen neurologique normal, et finit avec un score de 10 qui correspond au décès de
l’individu comme conséquence de la SEP (Figure 5). Les scores les plus bas évaluent surtout
des limitations fonctionnelles peu visibles, tandis que les scores les plus élevés mesurent
davantage l’invalidité. Cette échelle prend en compte 8 paramètres fonctionnels (PF) du
SNC ainsi que la capacité du patient à marcher. Les 8 PF testés (les 4 premiers sont majeurs
alors que les 4 derniers sont plus mineurs) sont mutuellement exclusifs : (1) fonction
pyramidale, (2) fonction cérébelleuse, (3) fonction du tronc cérébral, (4) fonction sensitive,
(5) transit intestinal et fonction urinaire, (6) fonction visuelle, (7) fonction cérébrale et (8)
autres fonctions [Kurtzke et al., 1984]. L’ensemble des PF couvre la totalité des déficits que l’on
peut retrouver dans la SEP. Chaque PF présente des grades ordonnés de 0 à 5 (ou 6). Jusqu'au
score EDSS de niveau 3,5 ce sont les scores obtenus dans chaque PF qui déterminent
automatiquement le score EDSS. Puis, à partir d’un score EDSS de 4, la définition de chaque
niveau est aussi complétée par la capacité de marche du patient [Sharrack et al., 1996].
Cependant, bien que ce soit le meilleur système de mesure et malgré sa popularité, l’EDSS
Introduction
20
présente plusieurs imperfections. Tout d’abord, cette échelle ne repose pas uniquement sur
des mesures objectives, mais fait appel à des mesures subjectives rendant parfois difficile
l’allocation d’un score EDSS à un patient. De plus, comme cette échelle repose sur une
combinaison de mesures de PF et de mesures ambulatoires, un patient semblant présenter une
maladie plus sévère qu’un autre peut cependant se voir attribuer un score EDSS identique. En
effet, si le score EDSS est validé pour suivre l’évolution de la maladie chez un patient, il l’est
beaucoup moins pour la comparaison de la maladie entre plusieurs patients. Enfin, il est
important de garder en mémoire que l’échelle EDSS n’est pas une mesure linéaire. En effet,
les patients progressent plus rapidement entre les scores 1 à 5 qu’entre les scores 5 à 7 [Myers
et al., 1992].
Figure 5 : Echelle EDSS simplifiée, ne présentant que les scores principaux de la SEP.
Introduction
21
Par ailleurs, la vitesse d’évolution clinique de la SEP est très variable d’un patient à un
autre. Or, en s’appuyant uniquement sur un score EDSS (qui n’est qu’une image de la maladie
au temps T), on ne prend pas en compte cette notion de vitesse d’évolution. La radiologie et le
nombre de poussées annuelles (fréquemment utilisés pour mesurer l’activité de la maladie)
n’y font pas référence eux aussi. Pourtant la durée d’évolution de la maladie est un facteur
important dans l’accumulation des dommages dans le SNC et la sommation des handicaps
physiques. En 2005, une approche basée sur un algorithme fut développée afin de prendre en
compte « l’agressivité » de la maladie : il fut nommé score de sévérité de la SEP (MSSS)
[Roxburgh et al., 2005]. En regardant la grille de MSSS (Figure 6), on se rend compte par
exemple, qu’un score élevé de MSSS peut être aussi bien assigné à un patient ayant
rapidement démontré un score EDSS intermédiaire, ou alors à un patient présentant un
handicap sévère mais après une évolution moyennement longue de la maladie. Il semblerait
que chez un même patient, le score MSSS soit relativement stable sur de longues périodes,
même si certains patients peuvent avoir des variations plus ou moins importantes [Pachner et
al., 2009]. Cette méthode pourrait ainsi être un outil utile pour prédire rapidement la sévérité de
la SEP chez un patient, c'est-à-dire son évolution au cours du temps.
Figure 6 : Score de sévérité de la SEP (MSSS) global. D’après Roxburgh et al., Neurology, 2005.
Introduction
22
Introduction
23
II. Les facteurs de susceptibilité à la sclérose en plaques
La communauté scientifique s’accorde à penser que le développement de la SEP n’est
pas sous la dépendance d’un seul facteur, mais résulte plutôt de l’action globale de plusieurs
facteurs : des facteurs de susceptibilité génétique, des facteurs environnementaux et enfin des
facteurs épigénétiques qui sont à l’interface des deux premiers facteurs cités. La maladie se
développerait chez des personnes génétiquement susceptibles qui auraient été mises en
présence de facteurs environnementaux dont une conséquence serait de modifier le profil
épigénétique du génome (Figure 7).
MS
MS
MS
MS
O1
O1
O1
O1EBV
EBVVD
VD
G
G
G
GPathway #1
Pathway #2
Pathway #3
Pathway #4
MS
MS
MS
MS
O1
O1
O1
O1EBV
EBVVD
VD
G
G
G
GPathway #1
Pathway #2
Pathway #3
Pathway #4
Figure 7 : Les différentes voies pouvant conduire au développement de la SEP. G : facteurs génétiques, VD :
carence en vitamine D, EBV : infection par le virus d’Epstein-Barr, O1-4 : autres facteurs environnementaux
inconnus. D’après Goodin, PLoS ONE, 2009.
II.1. Les facteurs génétiques
I I.1.1. Les éléments soulignant l’importance de la génétique dans la maladie
L’étiologie génétique de la SEP est suggérée par l’augmentation du risque pour un
patient de développer une SEP si un des membres de sa famille en est atteint (Figure 8). Un
outil de mesure de cette agrégation familiale est le λs. Ce paramètre est défini comme le ratio
du risque de développer une SEP chez une personne apparentée au patient SEP (Ks) sur la
prévalence de la maladie dans la population générale (K = 0,1%-0,2%) : (λs = Ks/K)
[Oksenberg et al., 2001]. Ainsi, une valeur de λs égale à 1 indiquerait l’absence d’agrégation
familiale d’une maladie. Dans la SEP, cette valeur de λs varie en général entre 20 et 40 pour
les proches parents de la personne souffrant de SEP. L’utilisation d’une méthodologie
Introduction
24
d’épidémiologie génétique standard et d’une correction du facteur âge a démontré que les
personnes liées aux 1er, 2ème et 3ème degrés à une personne atteinte de SEP présentent un risque
augmenté de développer la maladie par rapport à la population générale. Le risque passe ainsi
de 0,1% à 3% pour une personne apparentée au 1er degré (5% pour les frères et sœurs, 2%
pour les parents et 2% pour les enfants), soit un λs de l’ordre de 15 à 30. Pour les individus
apparentés au 2ème et 3ème degrés, ce risque est moins élevé (proche de 1%) mais reste qu’en
même supérieur à celui de la population générale [Robertson et al., 1996]. Cependant ces données
sont insuffisantes puisqu’elles ne permettent pas de faire la part entre le poids de la génétique
et celui de l’environnement familial [Dyment et al., 2004]. Ce sont des travaux réalisés chez des
enfants adoptés et chez des demi-frères/sœurs qui supportent le concept que les facteurs
génétiques sont majoritairement responsables de l’agrégation familiale de la maladie
[Oksenberg et al., 2001]. Les résultats de l’étude menée sur l’adoption révélèrent que, bien que
des enfants adoptés aient vécu depuis leur enfance avec une personne souffrant de SEP, ils ne
présentaient pas plus de risque de développer une SEP que la population générale (λs = 1)
[Ebers et al., 1995]. Des études furent aussi menées sur les demi-frères et sœurs, ce qui permit de
tester l’effet du partage du patrimoine génétique sur le risque de développer la maladie (les
demi-frères et sœurs partagent seulement 25% de leur information génétique, alors que les
enfants partageant les mêmes parents ont 50% de leur information génétique en commun). Il
fut montré que les demi-frères/sœurs d’un enfant atteint de SEP présentaient un risque
significativement plus faible que celui des « vrais » frères et sœurs (1,3% vs 3,5%, p < 0,001)
[Sadovnick et al., 1996]. Par ailleurs, ce travail démontra que le sexe du parent commun aux deux
enfants n’influençait pas le risque de SEP puisque les demi-frères/sœurs d’origine maternelle
et paternelle partageaient un risque comparable (risques respectifs de 1,4% et 1,2%) [Sadovnick
et al., 1996]. Enfin, des études réalisées sur des familles dont les deux parents souffraient de
SEP démontrèrent que les enfants issus de ces couples présentaient un risque
significativement augmenté par rapport à des enfants provenant de familles dont un seul
parent était atteint [Roberston et al., 1997 ; Ebers et al., 2000]. De plus, les auteurs de ce travail
confirmèrent le rôle majeur de la génétique sur l’environnement en démontrant que les
épouses de personnes souffrant de SEP présentaient un risque de développer la maladie
comparable à celui de la population générale [Ebers et al., 2000]. Enfin, des études réalisées sur
des jumeaux apportèrent la preuve du rôle majeur de la génétique dans la maladie. Alors que
des jumeaux monozygotes (MZ ) partagent 100% de leur information génétique, des
jumeaux dizygotes (DZ) en partagent seulement 50%, comme des frères et sœurs
Introduction
25
« singuliers ». La concordance observée chez les jumeaux MZ était significativement
supérieure à celle observée chez des jumeaux DZ ou frères/sœurs singuliers (concordances
équivalentes à 25% pour les jumeaux MZ, 5% pour les jumeaux DZ et 3% les frères/soeurs)
[Willer et al., 2003]. Ainsi, chez des jumeaux MZ, le risque de récurrence est d’environ 34% ce
qui confère une augmentation du risque (λs) de 170 fois [Dyment et al., 2004]. De plus,
l’importance du sexe des jumeaux fut soulignée puisque les auteurs démontrèrent que la
différence de risque observée entre des jumeaux MZ et des jumeaux DZ n’était pas retrouvée
chez des jumeaux de sexe masculin [Willer et al., 2003]. Cependant, malgré une information
génétique identique la majorité des jumeaux MZ sont discordants pour la SEP (environ 75%
sont discordants) ce qui suggère malgré tout l’importance de facteurs non-génétiques
intervenant dans l’étiologie de la maladie (nous reviendrons par la suite sur les facteurs non-
génétiques impliqués) [Willer et al., 2003].
Figure 8 : Risque de récurrence intrafamiliale pour la SEP. D’après Compston et al., Lancet, 2008.
I I.1.2. Etiologie génétique de la sclérose en plaques
La SEP fait partie de la grande famille des maladies complexes. Il est important de
comprendre la différence qu’il existe entre les maladies génétiques mendéliennes et les
maladies complexes (Figure 9). Dans les maladies génétiques à transmission mendélienne, ce
sont généralement des mutations dans un ou quelques gène(s) qui sont responsables de
l’apparition de la maladie. Par ailleurs, la présence de la mutation est associée à une très forte
pénétrance de la maladie qui est généralement égale à 100% [Prichard et al., 2002]. De plus, la
fréquence des mutations conduisant à l’apparition de la maladie est généralement faible
Introduction
26
(fréquence largement inférieure à 1%) à cause d’une grande pression de sélection visant à
éliminer la mutation au cours des générations [Pritchard et al., 2002]. Contrairement aux
maladies mendéliennes, les maladies complexes (encore appelées maladies communes) sont
mal connues dans leur pathogénie. L’une des raisons de cette méconnaissance est qu’il existe
une interaction entre les gènes et l’environnement, ce qui rend plus difficile la découverte de
facteurs génétiques impliqués dans la maladie. Cependant, on sait que la susceptibilité à la
SEP ne dépend par des gènes mutés codant pour une protéine dotée d’une activité aberrante.
Cette susceptibilité est la conséquence d’une multitude de variations génétiques (ou
polymorphismes ; voir chapitre II.1.3) présentes dans la population humaine générale et peu
soumises à une pression de sélection [Compston et al., 2008]. Ces polymorphismes, pris
individuellement, semblent n’avoir qu’un faible effet sur la prévalence de la maladie. Ils
pourraient agir soit indépendamment soit en épistasie.
Deux hypothèses ont été émises pour modéliser la relation qu’il existe entre le
développement de la SEP et la variabilité génétique. Ces deux hypothèses s’opposent quant au
nombre de variants et quant à leur poids respectif dans l’étiologie de la maladie :
(1) La première hypothèse est appelée « l’hypothèse maladie commune/variant
commun ». Elle repose sur le principe que les maladies complexes sont des maladies
bien plus communes que les maladies mendéliennes. Ainsi, il fut émis l’hypothèse que
la maladie est déterminée par la présence de variants communs à la population
humaine et ayant une pénétrance faible [Prichard et al., 2002]. En effet, les études
intrafamiliales sur le risque relatif de développer la SEP suggèrent que la majorité du
risque est portée par un nombre modeste de loci contenant des allèles de prédisposition
à la maladie ayant une fréquence importante [Reich et al., 2001]. Il est estimé qu’un
nombre compris entre 20 et 100 allèles communs, conférant chacun un risque relatif
faible (de l’ordre de 1,2-1,5), permettrait d’expliquer la susceptibilité aux maladies
complexes [Lindsey et al., 2005 ; Yang et al., 2005].
(2) A cette théorie s’oppose l’hypothèse des variants rares multiples ou de
« l’hétérogénéité ». L’argument de cette théorie est que l’appellation « maladie
complexe» est fausse. Chaque maladie serait en réalité non pas « une maladie » mais
« des maladies » qui regrouperaient une collection de conditions génétiques
hétérogènes, chacune déterminée par un allèle rare mais ayant une très forte
pénétrance [Smith et al., 2002]. La forte pénétrance fait que, chez un individu, peu de
polymorphismes pourraient expliquer la susceptibilité. Par contre, dans la population
Introduction
27
de patients SEP, l’hétérogénéité fait qu’entre les patients ces allèles de susceptibilité
ne seraient pas les mêmes. Cela supposerait que plusieurs centaines, si ce n’est
plusieurs milliers d’allèles rares, sont impliqués dans une seule maladie complexe,
même si chacun d’entre eux confère un risque relatif fort pour la susceptibilité (de
l’ordre de 10 à 20).
En s’appuyant sur cette logique, on pourrait espérer qu’environ 100 variants communs
exerçant un effet modeste sur le risque seraient impliqués dans la susceptibilité à la SEP. Par
ailleurs, chez une faible proportion des patients SEP, la base génétique impliquée dans la
maladie serait différente et reposerait sur l’effet fort d’allèles rares [Sawcer et al., 2008].
Figure 9 : Les variants de faible fréquence et la susceptibilité aux maladies. D’après McCarthy et al., Nat. Rev.
Gen., 2008.
I I.1.3. Les différentes classes de polymorphismes génétiques chez l’Homme
Ce qui ressort de l’analyse du génome de l’espèce humaine est qu’il existe une très
grande similitude entre les individus à travers le monde (si on compare deux individus,
environ 99,9% de leurs génomes sont identiques). Cependant, il existe dans de petites
fractions, réparties sur l’ensemble du génome, des variations génétiques entre les individus
[Kruglyak et al., 2001]. Ces variations génétiques, ou polymorphismes, proviennent de mutations
ancestrales qui ont été fixées dans le génome de notre espèce sous l’effet de la pression de
sélection. Ce sont ces polymorphismes qui sont responsables des différences phénotypiques
entre les individus, comme par exemple : la morphotype, une plus forte susceptibilité à une
maladie ou encore une meilleure réponse à un médicament.
Introduction
28
Ces variants génétiques peuvent être classés en fonction de la fréquence pour laquelle
l’allèle mineur est retrouvé dans la population humaine. Un polymorphisme est considéré
commun lorsque la fréquence de l’allèle mineur (MAF ) est supérieure à 1% dans la
population. Au contraire, un polymorphisme rare se caractérise par une MAF inférieure à 1%.
Les polymorphismes peuvent être aussi regroupés en deux grandes classes en fonction
de leur composition en nucléotides (Figure 10) : la classe des polymorphismes d’un seul
nucléotide (SNP) et la classe des polymorphismes structuraux [Frazer et al., 2009].
Figure 10 : Les différentes catégories de polymorphismes génétiques chez l’Homme. D’après Frazer et al., Nat.
Rev. Gen., 2009.
1.3.1. Les polymorphismes d’un seul nucléotide
Les SNPs constituent la classe la plus importante des polymorphismes génétiques
observés parmi les individus [Kruglyak et al., 2001]. Ce sont des variations dans la séquence
ADN pour lesquelles un seul nucléotide (A, T, G ou C) est altéré. Les résultats d’un
séquençage complet des génomes de 4 individus d’origines ethniques différentes (2 d’origine
caucasienne, 1 d’origine asiatique et enfin 1 d’origine africaine) permirent de mieux estimer
le nombre total de SNPs dans le génome (Figure 11). Environ 3,3 millions de
polymorphismes furent détectés dans les génomes des deux personnes d’origine caucasienne,
et légèrement moins dans le génome de l’individu asiatique. L’analyse globale de ces 3
génomes permit d’identifier 5,2 millions de polymorphismes différents dont la grande
majorité sont référencés dans la base de données dbSNPs. Enfin, le séquençage du génome
africain révéla qu’il possédait environ 1,25 fois plus de SNPs que les génomes caucasiens,
dont la majorité lui sont propres. A l’heure actuelle, on estime qu’il est raisonnable de penser
que le génome humain possède environ 11 millions de SNPs. Sur ces 11 millions de SNPs, la
Introduction
29
répartition serait la suivante : environ 7 millions auraient une MAF supérieure à 5%, les autres
posséderaient une MAF comprise entre 1 et 5% [Frazer et al., 2009].
Figure 11 : Nombre de polymorphismes détectés dans le génome de 4 individus de différentes ethnies. D’après
Frazer et al., Nat. Rev. Gen., 2009.
En plus de ces polymorphismes communs, il existe d’innombrables polymorphismes rares,
qui pour certains ne sont représentés que dans une seule famille d’individus. Ainsi, la
modification d’une paire de bases, pour peu qu’elle soit viable, peut être retrouvée dans au
moins un des 6,5 milliards d’individus présents sur Terre, et ainsi représenter un
polymorphisme rare. Cependant, bien que de tels cas extrêmes existent, il est important de
noter que la majorité des polymorphismes présents chez un individu donné sont ceux
communs à l’ensemble de la population humaine. De plus, si on compare les génomes de
deux individus, la majorité des paires de bases qui diffèrent sont celles localisées dans des
polymorphismes communs à la population dont ils font partis.
1.3.2. Les polymorphismes structuraux
La classe des variations structurales regroupe tous les polymorphismes qui ne sont pas
des variations d’un seul nucléotide. Elle comprend à la fois des variations microscopiques, et
plus communément des variations submicroscopiques telles que les délétions, les duplications
- collectivement appelées variations du nombre de copies (CNV) - ainsi que les insertions,
les inversions et les translocations [Feuk et al., 2006].
En comparaison avec les techniques utilisées pour étudier les SNPs, les technologies
permettant de détecter les variations structurales viennent tout juste d’être développées. Ainsi,
nos connaissances sur leur localisation et sur leur nombre dans le génome humain ne sont
encore qu’approximatives et la majorité des variants structuraux restent à découvrir.
L’analyse du génome humain suggère que les variations structurales comptent pour au moins
20% de toutes les variations génétiques chez l’Homme, et pour plus de 70% des changements
de bases (Figure 12). Si on prenait l’ensemble des variations structurales, cela représenterait
Introduction
30
entre 9 et 25 mégabases du génome (soit entre 0,5 et 1%), ce qui souligne l’importance de
cette classe de variations dans l’évolution du génome humain et la susceptibilité aux maladies.
Figure 12 : Nombre et caractéristiques des variations structurales détectées dans le génome d’un individu
d’origine caucasienne. D’après Frazer et al., Nat. Rev. Gen., 2009.
I I.1.4. La notion de déséquilibre de liaison entre plusieurs polymorphismes
Apparue en 1960, la notion de déséquilibre de liaison (LD ) est l’un de ces termes qui
ne révèlent pas leur signification par leur nom [Lewontin et al., 1960]. Le LD est une notion
caractérisant une association non aléatoire entre 2 polymorphismes [Slatkin et al., 2008]. Il existe
dans le génome des régions dans lesquelles peu de recombinaisons ont lieu (bloc en LD) et
qui sont encadrées par des zones de forte recombinaison (Figure 13). Ces zones de fortes
recombinaisons sont présentes tous les 200 kilobases environ et sont en général moins
importantes en taille que les blocs en LD [McVean et al., 2004]. Ces régions sont le reflet de
l’évolution de l’Homme et des populations. Ainsi, les LD ne sont pas les mêmes entre les
différentes ethnies [Frazer et al., 2009]. Bien que le LD soit un phénomène non quantifiable (il
n’existe pas d’échelle pour le mesurer), deux paramètres (dont les valeurs sont comprises
entre 0 et 1) permettent de l’estimer : le D’ et le r2. En général, l’information conférée par le r2
est similaire à celle du D’. Une valeur de D’ proche de 0 désigne une association aléatoire de
2 polymorphismes alors que la valeur 1 indique une corrélation parfaite. Le r2 est très
informatif dans les études d’association. En effet, il est inversement proportionnel à la taille
de l’échantillon nécessaire pour détecter une association à une maladie. Par exemple, prenons
deux loci dont l’allèle génotypé est proche de l’allèle de susceptibilité avec un r2 = 0,5. Pour
détecter une association avec la maladie, il faudrait alors doubler le nombre d’individus de la
cohorte par rapport à une étude où les 2 polymorphismes présentent un r2 = 1 [Wang et al.,
2005].
Introduction
31
Figure 13 : Les déséquilibres de liaison des variants communs du génome humain diffèrent entre les
populations. D’ = 0 en carré blanc, D’ = 1 en carré rouge. A droite, les triangles gris représentent l’ensemble des
SNPs. Les SNPs ayant un r2 au moins égal à 0,8 sont reliés par une ligne, ceux ayant un r2 inférieur sont en bleu.
CEU : individu d’origine caucasienne. CHB+JPT : individu d’origine asiatique. YRI : individu d’origine
africaine. D’après Frazer et al., Nat. Rev. Genet., 2009.
Ces déséquilibres de liaison permettent en théorie d’étudier l’ensemble des variations
du génome en ne génotypant que peu de polymorphismes appelés « tag SNPs ». En effet, en
génotypant les tag SNPs, il est possible de prédire le génotype des SNPs environnants (Figure
14). Cependant, même si cette approche permet de réduire les coûts des études par GWAS
(pour genome-wide association study), elle pose certains problèmes. En effet, seuls les
polymorphismes communs sont captés par cette approche (perte des polymorphismes rares et
des polymorphismes structuraux). De plus, les polymorphismes trouvés comme associés à une
maladie ne sont que très rarement des polymorphismes fonctionnels [Hirschhorn et al., 2005].
Introduction
32
Figure 14 : Association des polymorphismes par une approche directe ou par une approche en tagSNP. D’après
Hirschhorn et al., Nat. Rev. Genet., 2005.
I I.1.5. Les moyens mis en œuvre dans l’identification des gènes de susceptibilité à
la sclérose en plaques
Contrairement aux maladies mendéliennes, l’identification de gènes impliqués dans la
susceptibilité à la SEP est compliquée. Cet échec dans la découverte de gènes provient
principalement des caractéristiques propres à cette maladie [Tabor et al., 2002].
(1) La SEP est une maladie hétérogène. Cette hétérogénéité rend difficile la sélection
de la meilleure population d’étude. En effet, les patients souffrant de SEP diffèrent par
les formes cliniques de la maladie (RR-MS, PP-MS), l’âge du début de la maladie ou
l’agressivité d’évolution.
(2) L’étiologie de chaque forme de SEP peut impliquer différentes voies biologiques
qui ne sont pas forcement redondantes.
(3) La susceptibilité à la SEP dépend de l’implication de très nombreux gènes de
susceptibilité conférant chacun un risque relativement faible.
Cependant, depuis quelques années les moyens mis en œuvre pour découvrir les gènes
de susceptibilité à la SEP commencent à porter leurs fruits. Ce succès repose notamment sur
l’avancée des techniques de génotypage et sur la disponibilité de cohortes adéquates.
1.5.1. L’approche gène candidat vs l’approche sans à priori
A l’heure actuelle, deux types d’approches existent dans la découverte de gènes
impliqués dans le développement d’une maladie complexe : (1) l’approche gène candidat et
(2) l’approche sans à priori reposant sur l’utilisation de puces détectant une haute densité de
polymorphismes. Cette méthode est aussi appelée GWAS. Bien que différentes dans leur
façon d’appréhender la découverte de nouveaux gènes de susceptibilité, ces deux types
d’approches sont complémentaires.
Introduction
33
a. Approche gène candidat
L’approche gène candidat repose sur la sélection d’un gène ou d’un polymorphisme
choisi par rapport à des à priori sur la maladie étudiée. En effet, de nombreuses pathologies
humaines partagent des gènes de susceptibilité (Figure 15). Goh et al. inventèrent le terme de
« diseasome » pour parler du réseau de relations génétiques qu’il peut exister entre les
maladies [Goh et al., 2007]. Ce concept est particulièrement vrai pour les maladies auto-
immunes dont l’étiologie repose en grande partie sur une dérégulation de la composante
immunitaire. Un exemple majeur de l’application de ce concept est la région du CMH qui est
retrouvée comme associée à de très nombreuses maladies auto-immunes [Hewagama et al.,
2009]. Une fois le gène sélectionné, les polymorphismes à étudier ne doivent pas être choisis
au hasard. Ils doivent être localisés en priorité dans les régions du gène où ils ont le plus de
chance de modifier l’expression ou la fonction de la protéine (régions codantes ; régions
régulatrices : promoteur, 5’UTR, 3’UTR, domaine d’épissage).
Le principal avantage de cette approche est qu’elle nécessite une puissance statistique
relativement faible et donc une cohorte d’individus peu importante par rapport aux GWAS.
En effet, comme le génotypage est réalisé sur peu de polymorphismes, les corrections
statistiques ne sont que peu stringentes. L’autre avantage de cette technique est que les
polymorphismes choisis sont généralement des polymorphismes fonctionnels qui modifient
l’expression ou l’activité de la protéine codée.
Cependant, son principal inconvénient réside dans le concept d’à priori de l’approche.
Les polymorphismes sont choisis dans des voies connues pour être impliquées dans la
maladie. Cela suppose que nos connaissances actuelles sur la maladie sont suffisantes pour
prédire les voies impliquées. Ainsi, de nouvelles voies intervenant dans l’étiologie de la
maladie ont peu de chance d’être mises en évidence par cette approche [Tabor et al., 2002]. Un
autre inconvénient lié à ce type d’approche est qu’il est difficile pour l’expérimentateur de
distinguer les véritables associations des faux positifs.
Ce type d’approche est généralement utilisé pour confirmer de nouveaux gènes trouvés
comme associés à une maladie dans des cohortes indépendantes.
Introduction
34
Figure 15 : Recouvrement des loci contenant les facteurs de risque génétique aux maladies communes
humaines. D’après Frazer et al., Nat. Rev. Gen., 2009.
b. Approche sans à priori par GWAS
L’approche par GWAS n’est possible que depuis quelques années. Les études par
GWAS permettent de génotyper 500 000 à 1 million de polymorphismes en même temps
chez un même individu. Cependant, avant qu’une telle approche ne devienne
possible, plusieurs conditions devaient être remplies:
(1) Il devait être créé une base de données accessible à l’ensemble de la communauté
scientifique et regroupant de très nombreux polymorphismes. En effet, pour pouvoir
génotyper 1 million de polymorphismes par GWAS, il est nécessaire de disposer d’une
base de données comprenant beaucoup plus que 1 million de polymorphismes qui
sont, si possible, répartis sur l’ensemble du génome. Ce travail de création d’une base
de données fut entrepris par le consortium international HapMap. L’objectif de ce
projet de grande ampleur était de répertorier la variabilité du génome humain. Le
premier rapport de ce projet contenait un peu plus de 1 million de SNPs dont la MAF
des allèles répertoriés était au moins égale à 5% [HapMap, 2005]. L’étude fut réalisée
sur l’ADN de 269 individus de différentes origines : Européenne, Africaine et
Asiatique. Ce premier rapport permit de dresser une carte des LD entre les différents
polymorphismes présents dans le génome. Plus récemment, la seconde phase du projet
référença plus de 3 millions de SNPs, ce qui correspond à environ 25-35% des SNPs
communs [HapMap, 2009]. Cette base de données est régulièrement étoffée par de
nombreuses études indépendantes. Si l’on considère les LD existant entre les SNPs, le
Introduction
35
génotypage de seulement 500 000 SNPs permettrait de connaître, en théorie, celui de
la majorité des SNPs ayant une MAF supérieure à 5% [Kruglyak et al., 2008].
(2) Les études d’association devaient disposer de cohortes de tailles très importantes à
cause de la correction des tests multiples. En effet, il est important d’obtenir des
valeurs statistiques très faibles afin d’éliminer au maximum les faux positifs. On peut
s’en rendre compte dans cet exemple : si on fixe le seuil de significativité à p = 0,05 (5
faux positifs tous les 100 tests), une puce génotypant 500 000 SNPs donnerait environ
25 000 faux positifs. Ainsi, une valeur statistique inférieure à 5x10-7, avant la
correction des tests multiples, semble indispensable pour assurer que les résultats
obtenus ont plus de chance d’être vrais que faux [Oksenberg et al., 2008]. Des études
proposèrent de déterminer la taille nécessaire à une cohorte pour identifier, par une
approche GWAS de 500 000 SNPs, l’association d’un allèle de MAF égale à 10% et
conférant un risque relatif de 1,5 à une maladie. Suivant un tel modèle, il faudrait une
cohorte cas-témoins composée de 2 000 - 3 000 individus dans chaque groupe afin
d’obtenir une puissance statistique de 80% conférant une détection d’association de
significativité p = 5x10-7. Si on voulait conserver une puissance statistique équivalente
mais identifier un risque relatif de 1,25 alors il faudrait agrandir la cohorte à 8 000 cas
et 8 000 témoins [Todd et al., 2006]. Ces résultats sont à rapprocher du fait que la
majorité des gènes de susceptibilité à la SEP confère un risque relatif de 1,15 - 1,5.
Cependant, le grand nombre de SNPs à génotyper ainsi que la nécessité d’une cohorte
de taille suffisante pour éliminer la majorité des faux positifs posent un problème de coût. En
effet, le prix des études par GWAS reste relativement élevé bien qu’il ait relativement baissé
ces derniers temps. Son coût en 2005 était de 0,5 US$ par génotype, à concilier avec les
500 000 polymorphismes et la taille de la cohorte [Hirschhorn et al., 2005]. Pour concilier ces
deux impératifs tout en gardant à l’esprit ce problème de financement, une stratégie fut
proposée (Figure 16). Cette approche est composée d’une succession de 2 ou 3 étapes de
génotypage qui permettent de réduire la taille de la cohorte tout en éliminant au mieux les
faux positifs [Lowe et al., 2004]. Tout d’abord, l’ensemble des polymorphismes sont génotypés
sur une première cohorte en fixant un seuil de significativité autorisant la détection de loci
conférant un risque relatif faible pour la maladie. Par cette approche, un nombre important
mais contrôlé de faux positifs passeront le seuil de significativité. Puis, l’ensemble des
marqueurs qui ont passé cette première étape de sélection sont alors re-testés sur une cohorte
Introduction
36
indépendante de taille similaire voire plus importante. Le seuil de significativité des deux
étapes de sélection doit être choisi de telle sorte que moins de 5% des marqueurs qui
franchissent ces deux étapes soient des faux positifs. Pour augmenter l’intransigeance du test,
une troisième étape avec une nouvelle cohorte peut être ajoutée.
Figure 16 : Approche GWAS en plusieurs étapes afin de réduire la taille des échantillons. D’après Hirschhorn et
al., Nat. Rev. Genet., 2005.
1.5.2. Configuration des cohortes utilisées en association génétique
Les études d’association génétique associent un polymorphisme à une maladie quand
le polymorphisme influence le risque de susceptibilité. Concrètement, l’allèle du gène
impliqué dans la maladie voit sa fréquence modifiée dans la population de patients par rapport
à la population témoin. Même si toutes les études génétiques reposent sur ce concept,
l’approche utilisée peut différer dans la structure des cohortes utilisées :
(1) L’approche cas-témoins : l’utilisation de telles cohortes dans des études génétiques
repose sur la comparaison de la fréquence allélique d’un gène dans une population de
patients par rapport à une population de témoins. Le principal intérêt de l’approche
cas-témoins est qu’il est très facile de réunir de larges cohortes composées de plusieurs
milliers d’individus. A l’heure actuelle, les consortia internationaux utilisent, dans les
études d’association génétique à la SEP, des cohortes comprenant plus de 2 000 cas et
plus de 3 000 témoins [ANZgene, 2009]. Cependant, le principal inconvénient conféré
par l’approche cas-témoins est le fort risque de détecter des faux positifs [Voight et al.,
2005]. La génération de faux positifs provient en général d’un biais dans le choix des
Introduction
37
individus composant les deux groupes (témoins et patients). Ce biais est une
hétérogénéité non liée au phénotype maladie [Risch et al., 2000]. En effet, la principale
cause d’hétérogénéité est la présence d’individus de différentes ethnies au sein de la
même cohorte. En fonction des ethnies, la fréquence d’un allèle peut varier
sensiblement jusqu’à parfois devenir significativement différente entre deux ethnies
[Morie et al., 2005]. De plus, l’inclusion par erreur de personnes apparentées dans une
même cohorte peut aussi conduire à des biais [Voight et al., 2005].
(2) L’approche famille nucléaire : cette approche repose soit sur l’utilisation de
familles trio (ou simplex), soit sur l’utilisation de familles multiplex. La différence
entre ces deux types de familles nucléaires est le nombre d’individus souffrant de la
maladie au sein de la famille. La structure classique d’une famille trio comprend 2
parents ne souffrant pas de la maladie et un enfant atteint, alors que la famille
multiplex comprend au moins 1 individu atteint de plus et peut inclure plusieurs frères
et sœurs. Les études génétiques utilisent généralement des familles trio car elles sont
plus faciles à réunir puisque plus féquentes. L’analyse des résultats de génotypage
consiste à réaliser un test de déséquilibre de transmission d’un allèle (TDT). Le
principe du TDT dépend de l’observation de la transmission d’un allèle des parents
vers les enfants souffrant de la maladie étudiée. Si la transmission s’éloigne d’une
transmission mendélienne alors la maladie est en liaison avec le locus analysé. Par
ailleurs, le TDT élimine de l’analyse tous les parents homozygotes pour l’allèle étudié
[Laird et al., 2006]. Originellement utilisé dans les tests de liaison de régions génomiques
à une maladie [Spielman et al., 1993], il fut par la suite étendu aux études d’association
génétique [Hirschhorn et al., 2005]. L’utilisation de cohortes de familles fournit une
approche robuste pour prévenir la présence de stratification au sein d’une cohorte.
Cependant, réunir une cohorte famille requiert plus de temps et d’argent que la
collecte d’individus composant les cohortes de cas-témoins [Laird et al., 2006]. L’autre
inconvénient important est la perte rapide de puissance statistique. En effet, tous les
parents homozygotes sont systématiquement retirés de l’étude, et l’absence du
génotype d’un enfant conduit à la perte de la famille trio entière.
Ces deux structures de cohortes présentent chacune des avantages et des
inconvénients. Ainsi plutôt que de les opposer, il est important de les voir comme
complémentaires [Laird et al., 2006]. A l’heure actuelle, les études génétiques « modernes »
utilisent de larges cohortes de cas-témoins en combinaison avec des collections de familles,
Introduction
38
plus modestes en taille. Combiner les deux structures de cohorte dans une même étude permet
de réduire sensiblement les risques de faux positifs.
II.1.6. Importance du complexe majeur d’histocompatibilité dans la susceptibilité
à la sclérose en plaques
Historiquement étudié pour son importance dans le rejet de greffes de tissus et
d’organes, le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH ) révéla par la suite son
importance dans le développement de maladies auto-immunes humaines via ses fonctions
dans la réponse immunitaire. Chez l’Homme, le domaine du CMH se localise sur le bras court
du chromosome 6 (6p21), où il s’étend sur un domaine de 3,5 mégabases. Un concept récent
étendit le domaine du CMH à 7,6 mégabases, lui faisant contenir pas moins de 252 gènes dont
ceux du CMH de classe I (CMH-I ) et de classe II (CMH-II ). Les gènes du CMH ont des
fonctions diverses impliquées dans l’activité du système immunitaire (développement,
maturation et fonction) [Horton et al., 2004]. Des études d’association révélèrent que plusieurs
allèles du CMH étaient associés à diverses maladies auto-immunes (diabète de type 1,
polyarthrite rhumatoïde, SEP…). La région du CMH est une région du génome humain qui
présente un fort LD, ce qui rend difficile la recherche du variant ou de l’haplotype
directement responsable de l’association avec une maladie comme la SEP par exemple
[Ramagopalan et al., 2009a].
1.6.1. Implication du CMH-II dans la susceptibilité à la sclérose en plaques
Dès 1972, une association entre le locus du CMH et la SEP fut détectée. Cette
association était le premier rapport d’une association génétique entre le CMH-II et une
maladie humaine. Bien que d’abord rattachée au CMH-I, l’association s’avéra par la suite être
sous la dépendance du CMH-II et en particulier de l’haplotype HLA-DR2 [Ramagopalan et al.,
2009a] (Figure 17). Par la suite, lorsque le typage du sérum fut possible, il apparu que le
déterminant DR2 incluait deux sous-types sérologiques : HLA-DR15 et HLA-DR16. Plus
tard, les gènes correspondant aux sous-types sérologiques furent clonés. Il fut démontré que
chaque sous-type pouvait également être séparé en deux : HLA-DRB1*1501 et 1502 pour
DR15, HLA-DRB1*1601 et 1602 pour HLA-DR16. Aujourd’hui, nous savons que le facteur
Introduction
39
critique dans l’association entre HLA-DR2 et la SEP est l’allèle HLA-DRB1*1501 [Svejgaard
et al., 2008].
Mais, en réalité, la situation est un peu plus compliquée que cette vision simpliste.
Cette situation est principalement due à un fort LD présent dans le domaine du CMH. En
effet, la chaîne bêta de HLA-DR est codée par deux loci HLA-DR qui contiennent chacun
plusieurs allèles. L’allèle HLA-DRB5*0101 est retrouvé en déséquilibre complet de liaison
avec l’allèle HLA-DRB1*1501. Ces deux allèles sont présents ensemble dans un même
haplotype associé à la SEP [Fogdell et al., 1995]. Un travail récent essaya de dissocier les effets
respectivement portés par les loci HLA-DRB1 et HLA-DRB5 [Caillier et ail., 2008]. Cette étude
suggéra que le locus HLA-DRB1 était le locus directement responsable de la susceptibilité à
la SEP alors que le locus HLA-DRB5 aurait, quant à lui, un rôle dans l’atténuation de la
sévérité de la SEP.
Deux allèles supplémentaires, localisés dans deux autres loci, sont en déséquilibre
complet de liaison avec les allèles HLA-DRB1*1501 et HLA-DRB5*0101. Il s’agit des
allèles HLA-DQA1*0102 et HLA-DQB1*0602. Bien que le LD soit complet entre l’allèle
HLA-DRB1*1501 et l’allèle HLA-DQB1*0602 chez les Européens, les personnes d’origine
africaine présentent une diversité haplotypique plus importante. Cette diversité accrue fait que
ces deux allèles ne sont pas toujours retrouvés dans le même haplotype. Caballero et al.
utilisèrent une population afro-brésilienne afin de dissocier les effets des loci HLA-DRB1 et
HLA-DQB1 [Caballero et al., 1999]. Dans cette population, l’allèle HLA-DQB1*0602 fut trouvé
comme associé à la SEP en l’absence de l’allèle HLA-DRB1*1501. L’allèle HLA-
DRB1*1501, peu présent dans cette population, était remplacé par l’allèle HLA-DRB*1503.
Oksenberg et al. réalisèrent un travail similaire dans une population d’afro-américains
[Oksenberg et al., 2004]. Dans cette seconde étude, le résultat obtenu allait en faveur d’un effet
du locus HLA-DRB1 associé à la susceptibilité à la SEP de manière indépendante de l’allèle
HLA-DQB1*0602. Enfin, une troisième étude associa l’allèle HLA-DQB1*0602 avec une
susceptibilité à la SEP chez les Brésiliens d’origine africaine, alors que l’allèle HLA-
DRB1*1501 fut associé à un risque augmenté de SEP dans la population brésilienne d’origine
européenne [Alves-Leon et al., 2007]. En conclusion, malgré des résultats parfois contradictoires,
on peut dire que l’allèle HLA-DRB1*1501 et/ou l’allèle HLA-DQB1*0602 sont presque
toujours associés à la susceptibilité à la SEP. De plus, il existe un effet dose visible pour
l’allèle HLA-DRB1*1501. Si on compare des personnes ne possédant pas d’allèle HLA-
DRB1*1501 à des personnes possédant une seule copie de cet allèle, on observe un risque
Introduction
40
relatif augmenté pour la SEP (OR = 2,7). Cependant, cette augmentation du risque est moins
importante que chez les personnes homozygotes pour HLA-DRB1*1501, avec une différence
de plus de 2 fois (OR = 6,7). Cet effet dose pourrait s’expliquer par une présentation plus
efficace de l’antigène chez les personnes homozygotes pour cet allèle, chez qui la protéine
serait deux fois plus présente [Barcellos et al., 2003].
Figure 17 : Allèles de l’haplotype du HLA-DR2 associés à la sclérose en plaques (l’implication des marqueurs
entre parenthèse semble due à un déséquilibre de liaison). D’après Svejgaard et al., Immunogenetics. 2008.
Cependant, il existe une exception au monopole de l’haplotype HLA-DR2 dans la
susceptibilité à la SEP. Dans la population sarde, l’association avec la maladie implique le
HLA-DR3 et le HLA-DR4. Les haplotypes respectifs sont les suivants : HLA-DRB1*0405
DQA1*0501 DQB1*0301 et HLA-DRB1*0301 DQA1*0501 DQB10201 [Marrosu et al., 1998].
Dans cette population, l’haplotype HLA-DR2 classiquement associé à la SEP (HLA-
DRB1*1501 et HLA-DQB1*0602) est plus rare (3%) que dans le reste de la population
européenne (15%) [Lernmark et al., 2002]. Par ailleurs, l’haplotype DR2 le plus fréquent contient
l’allèle HLA-DRB1*1601 ne prédisposant pas à la SEP.
En plus des allèles agissant seuls sur la susceptibilité à la SEP, il peut exister des
phénomènes d’épistasie entre les différents loci présents dans le domaine du CMH (Figure
18). En effet, certains allèles ont peu d’effet sur la susceptibilité à la SEP lorsqu’ils sont
retrouvés seuls, mais entraînent une modification du risque lorsqu’ils sont en combinaison
avec un autre allèle. Ces modèles d’épistasie peuvent avoir soit un effet de synergie
augmentant alors la susceptibilité à la SEP, soit à l’inverse un effet de dominant négatif sur le
risque [Ramagopalan et al., 2009b]. Par exemple, l’effet de synergie peut être retrouvé avec
l’allèle HLA-DRB1*08. En effet, cet allèle, lorsqu’il est seul, n’augmente que modestement
le risque de SEP (OR = 1,2). Cependant, lorsqu’il interagit avec l’allèle HLA-DRB1*1501
présent en trans, le risque est fortement augmenté. Le risque est presque doublé par rapport à
celui conféré par une seule copie de l’allèle HLA-DRB1*1501 (OR passant de 1,64 à 2,39)
[Dyment et al., 2005]. La situation inverse peut être démontrée avec l’effet dominant négatif
conféré par l’allèle protecteur HLA-DRB1*14 [Ramagopalan et al., 2007a]. La présence d’un
Introduction
41
allèle HLA-DRB1*14 en combinaison avec un allèle HLA-DRB1*15 diminue d’environ 3
fois le risque conféré par l’allèle HLA*DRB1*15.
Figure 18 : Risque génotypique relatif pour la sclérose en plaques en fonction des combinaisons d’allèles
contenues dans le locus HLA-DRB1 (le risque basal de valeur 1 est arbitrairement donné au génotype HLA-
DRB1*X/X). D’après Ramagopalan et al., Neurology, 2009b.
L’utilisation du modèle animal de la SEP, l’EAE démontra l’implication directe de
l’haplotype HLA-DR2 dans la susceptibilité à la maladie. Ceci fut démontré en utilisant des
souris humanisées exprimant le HLA-DRB1*1501 soit seul, soit en combinaison avec le
HLA-DRB5*0101, et possédant des lymphocytes spécifiques d’une protéine de la myéline (la
protéine MBP, pour protéine basique de la myéline) [Gregersen et al., 2006]. Les animaux
exprimant seulement l’allèle HLA-DRB1*1501 développaient une maladie spontanée très
sévère. Par contre, l’ajout de l’allèle HLA-DRB5*0101 en combinaison avec l’allèle HLA-
DRB1*1501 diminuait à la fois l’incidence et la sévérité de la maladie. Ces données
confirment les résultats d’association obtenus chez l’Homme. De plus, il fut suggéré que
l’effet de protection partielle conféré par l’allèle HLA-DRB5*0101 ne provenait pas d’une
tolérance centrale (élimination ou inactivation des cellules auto-réactives lors de leur
maturation dans le thymus), mais plutôt de leur délétion en périphérie. Par ailleurs, il fut
démontré qu’un TCR provenant d’une personne souffrant de SEP avait la capacité de
Introduction
42
reconnaître d’une part la MBP présentée par l’allèle HLA-DRB1*1501, d’autre part un
peptide du virus d’Epstein-Barr (EBV) présenté par l’allèle HLA-DRB5*0101 [Lang et al.,
2002]. Ces résultats laissent penser qu’une infection par l’EBV permettrait l’activation, via la
présentation de peptides viraux par HLA-DRB5*0101, de cellules réagissant contre la
protéine MBP présentée par le HLA-DRB1*1501. Cela pourrait conduire à une réaction auto-
immune [Svejgaard et al., 2008]. Nous reviendrons par la suite sur l’éventuelle existence d’une
association entre la SEP et l’EBV.
1.6.2. Implication du CMH-I dans la susceptibilité à la sclérose en plaques
Bien que l’importance du CMH-II dans la susceptibilité à la SEP soit aujourd’hui bien
établie, l’implication du CMH-I semble toutefois moins claire. Trente ans auparavant, une
association entre le CMH-I (les allèles HLA-A*03 et HLA-B*07) et la SEP fut identifiée
[Ramagopalan et al., 2009a]. Mais rapidement il apparut que le signal obtenu était dû à l’existence
d’un fort LD avec le CMH-II. Cependant, des études récentes suggérèrent que le CMH-I
pourrait avoir un rôle direct dans la susceptibilité à la SEP (Figure 19). En effet, même si
l’association entre HLA-B*07 et la SEP fut confirmée comme la résultante du LD avec HLA-
DR15, l’allèle HLA-A*03 semblait réellement associé à la maladie [Harbo et al., 2004 ; Burfoot et
al., 2008]. La présence de l’allèle HLA-A*03 conférait une augmentation du risque de
développer une SEP avec un risque relatif d’environ 2,8 [Burfoot et al., 2008]. Par ailleurs,
l’allèle HLA-A*03 augmentait le risque porté par l’haplotype HLA-DR15 lorsqu’ils étaient
combinés [Harbo et al., 2004]. Brynedal et al. associèrent négativement l’allèle HLA-A*02 du
CMH-I à la susceptibilité à la SEP. [Brynedal et al., 2007]. Le risque relatif obtenu (OR = 0,63)
n’était pas dû à un LD avec le CMH-II. La comparaison entre le génotype conférant le plus de
susceptibilité à la SEP (homozygote pour DRB1*15, mais sans A*02) et celui conférant le
plus de résistance (homozygote pour A*02, mais sans DRB1*15) révéla une différence de
susceptibilité à la maladie de 23 fois environ. Un autre allèle du CMH-I fut lui aussi associé
négativement avec la susceptibilité à la SEP [Yeo et al., 2007]. Là aussi, le risque relatif observé
(OR d’environ 0,55) porté par l’allèle HLA-C*05 n’était pas la conséquence d’un LD avec un
autre allèle du CHM-II. Comme pour le HLA-A*02, la comparaison entre le génotype
conférant le plus de susceptibilité à la SEP (homozygote pour DRB1*15, mais sans C*05) et
celui conférant le plus de résistance (homozygote pour C*05, mais sans DRB1*15) révéla une
différence de susceptibilité à la maladie d’environ 5 fois.
Introduction
43
Figure 19 : Association du HLA avec la sclérose en plaques. D’après Friese et al., Brain, 2005.
Les molécules de CMH-I sont des marqueurs de surface exprimés par la majorité des
cellules de l’organisme. Elles permettent la présentation des antigènes aux lymphocytes T
CD8+ cytotoxiques. Dans un premier temps, le rôle des lymphocytes T CD8+ dans la SEP fut
négligé face à la contribution majeure des lymphocytes T CD4+ dans la maladie. Puis, grâce à
l’étude de l’EAE l’importance de cette population cellulaire fut mise en évidence. Comme
observé chez les souris atteintes d’EAE, les lymphocytes T CD8+ sont majoritaires dans les
lésions de SEP comparé aux lymphocytes T CD4+ [Martin et al., 2008]. Une étude proposa alors
de confirmer l’implication directe du CMH-I dans l’EAE chez des souris doubles
transgéniques exprimant l’allèle HLA-A*03 ainsi que le TCR humain 2D1 spécifique de la
protéine de la gaine de myéline (PLP, pour protéine protéolipide de la myéline) présentée
par le HLA-A*03 et HLA-A*02 [Friese et al., 2008]. Une EAE spontanée se développa chez 4%
des souris doubles transgéniques. Après induction de l’EAE chez ces mêmes animaux
transgéniques, 71% d’entre eux furent malades. A l’opposé les souris contrôles simples
transgéniques (soit pour le CMH, soit pour le TCR) étaient totalement résistantes à l’EAE. De
plus, les données suggérèrent que les lymphocytes T CD8+ étaient suffisants pour initier la
première attaque du SNC, mais que les lymphocytes T CD4+ étaient essentiels pour la
progression de la maladie. Par ailleurs, l’étude confirma le pouvoir protecteur porté par
l’allèle HLA-A*02. En effet, l’introduction de l’allèle HLA-A*02 chez les souris doubles
transgéniques pour HLA-A*03 et le TCR-2D1 les protégeait de l’EAE spontanée ou induite.
De plus, si l’implication directe du locus HLA-C dans la SEP se confirmait, une
nouvelle voie dans la pathogénie de la maladie, montrant l’importance du système
immunitaire inné serait identifiée. Les molécules d’HLA-C chargées avec un peptide
interagissent avec les killer cell immunoglobulin-like receptors (KIR ) [Rajagopalan et al.,
2005]. Les KIR sont des récepteurs membranaires qui ont des fonctions soit inhibitrices soit
activatrices chez les cellules NK et les lymphocytes T qui les expriment. Les différents allèles
retrouvés dans le HLA-C peuvent être répartis en deux groupes : le HLA-C1 et le HLA-C2.
Introduction
44
Ces deux groupes se lient à des récepteurs KIR non redondants. Cependant, l’association
observée entre HLA-C et la SEP ne semble pas dépendre d’un groupe particulier du HLA-C
mais serait plutôt due à l’effet d’un allèle. En effet, seul l’allèle HLA-C*05 est associé à la
SEP, ce qui semble indiquer que la susceptibilité à la SEP serait conférée par une fonction du
HLA-C indépendante de l’interaction avec les récepteurs KIR [Yeo et al., 2007].
I I.1.7. Les autres gènes associés à la susceptibilité à la sclérose en plaques
Bien que la région du CMH puisse revendiquer le titre d’être la seule région du
génome conférant un risque majeur dans le développement de la SEP, il est maintenant
reconnu que d’autres gènes non-CMH contribuent aussi au risque, mais avec un effet
moindre. Mis à part le CMH, au moins 16 gènes ont été identifiés comme associés à la SEP au
cours de ces deux dernières années (même si ce chiffre semble sous estimé ; Figure 20).
Cependant, beaucoup de ces gènes n’ont pas été confirmés génétiquement ou leur contribution
dans la maladie reste encore à comprendre. Ces gènes peuvent être classés en 3 catégories :
(1) gènes impliqués dans l’immunité, (2) gènes ayant un rôle neurologique et (3) gènes ayant
une fonction difficile à lier avec l’étiologie de la SEP [Fugger et al., 2009].
Introduction
45
Figure 20 : Les gènes associés au risque de développer une sclérose en plaques. D’après Fugger et al., Nat. Rev.
Immunol., 2009
1.7.1. Le récepteur à l’IL-7
Ce n’est que récemment qu’un gène n’appartenant pas à la famille du CMH fut associé
à la SEP. En 2007, un travail de grande ampleur (334 923 polymorphismes testés) mené sur
l’association de polymorphismes avec la susceptibilité à la SEP identifia un polymorphisme
du gène codant pour la chaîne alpha du récepteur à l’IL-7 (IL-7Rα) comme un facteur à risque
[Hafler et al., 2007]. Gregory et al. démontrèrent eux aussi qu’il existait une transmission
excessive de l’allèle C du polymorphisme rs6897932 des parents vers les enfants souffrant de
SEP [Gregory et al. 2007]. Ce polymorphisme est localisé dans l’exon 6 où il induit le
changement d’un tryptophane en isoleucine en position 244 de la protéine (changement
Introduction
46
T244I). Par ailleurs, ce polymorphisme révéla un effet indépendant de l’effet du CMH. Si le
pourcentage attribuable au CMH pour le risque de développer une SEP est de 40,1%, il est de
16,4% pour le génotype G/G du polymorphisme rs6897932 et de 49,6% pour la combinaison
des deux facteurs. Une autre équipe confirma simultanément l’association de ce
polymorphisme à la SEP [Lundmark et al., 2007]. Cette association fut par la suite répliquée dans
de nombreuses populations indépendantes [Weber et al., 2008]. Une méta-analyse reprenant les
données sur ce polymorphisme évalua le faible risque qu’il conférait à environ 1,2 [Harley et
al., 2007]. Par ailleurs, une étude démontra qu’un autre haplotype (dont certains
polymorphismes se situaient en région 5’UTR et 3’UTR) était fortement associé à une
diminution de l’expression du transcrit codant pour la forme soluble de l’IL-7R dans les
cellules immunitaires [McKay et al., 2008].
Le changement T244I, induit par le polymorphisme rs6897932, affecte le domaine
transmembraire de l’IL-7Rα. Ce domaine est soumis à un épissage alternatif ayant des
conséquences fonctionnelles importantes pour le récepteur. En effet, si le transcrit de l’IL-
7Rα possède l’exon 6, il codera pour la forme transmembranaire du récepteur présent à la
surface des cellules, alors que celui ne possédant pas cet exon codera pour la forme soluble de
la protéine [Harley et al., 2007]. Bien que Gregory et al. suggérèrent que ce polymorphisme
pouvait être responsable de l’augmentation de la forme soluble du récepteur, Lundmark et al.
démontrèrent une augmentation de l’IL-7R et de l’IL-7 dans le LCR de patients SEP par
rapport à des témoins. Le voie de l’IL-7 semble importante à la fois dans le développement
des lymphocytes T, mais aussi dans le maintien et l’activation des cellules immunitaires en
périphérie [Mazzucchelli et al., 2007]. Les polymorphismes touchant le gène de l’IL-7Rα
pourraient avoir des conséquences à la fois sur la réponse immunitaire innée et adaptative.
Cependant, les conséquences exactes de ces polymorphismes sur la voie IL-7/IL-7R ainsi que
sur la susceptibilité à la SEP restent encore soumises à investigation.
1.7.2. Le récepteur à l’IL-2
L’équipe qui identifia l’association entre le polymorphisme de l’IL-7Rα et la SEP
démontra par ailleurs une association entre deux autres polymorphismes (rs12722489 et
rs2104286) et la maladie. Ces deux polymorphismes se localisent dans le gène codant pour la
chaîne α du récepteur à l’interleukine 2 (IL-2Rα) et présentent un fort LD [Hafler et al., 2007].
Comme pour l’IL-7Rα, le risque conféré par les deux polymorphismes de l’IL-2Rα est faible,
Introduction
47
avec des risques augmentés de 1,34 et 1,26, portés respectivement par les polymorphismes
rs12722489 et rs2104286. Par la suite, l’association de ces deux polymorphismes avec la SEP
fut confirmée par plusieurs travaux indépendants qui leur attribuèrent eux aussi des risques
faibles [Ramagopalan et al., 2007b ; Weber et al, 2008 ; ANZgene, 2009]. Une étude suggéra que le
risque était majoritairement porté par le polymorphisme rs2104286 [IMSGC, 2008].
Suite à une activation cellulaire, la molécule de surface IL-2Rα subit un clivage
enzymatique entraînant son détachement de la membrane [Rubin et al., 1990]. Chez les patients
SEP, la concentration sérique en IL-2Rα est augmentée par rapport à des témoins, avec des
concentrations respectives de 2,3 ng/ml et 2 ng/ml [Maier et al., 2009a]. Il fut par la suite
démontré que les deux polymorphismes associés à la SEP affectaient l’expression sérique de
l’IL-2R α à la fois chez les patients SEP et chez les personnes témoins [Maier et al., 2009a ; Maier
et al., 2009b]. Le génotype du polymorphisme rs12722489 explique à 15% la variance sérique
en IL-2Rα chez les témoins (2% chez les patients SEP), alors que le génotype du
polymorphisme rs2104286 compte pour 18% de la variance chez les patients SEP (5% chez
les patients SEP) [Maier et al., 2009a]. Un troisième polymorphisme se localisant dans la région
3’UTR du gène révéla une association avec la SEP. Mais cette association étant très faible (P
= 0,04), elle reste à confirmer [Matesanz et al., 2007]. Enfin, un quatrième polymorphisme déjà
associé au diabète de type 1 fut associé à la SEP. Il fut démontré que ce dernier
polymorphisme influençait lui aussi l’expression sérique de l’IL-2Rα [Maier et al., 2009b]. L’IL-
2Rα libre (non lié à la membrane) conserve la capacité de se lier à l’IL-2 ce qui empêche
l’interaction de la cytokine avec son récepteur membranaire. Ainsi, l’IL-2Rα libre agirait
comme un antagoniste de l’IL-2 [Maier et al., 2009a]. Cependant, des études complémentaires
sont encore nécessaires pour modéliser l’effet liant l’IL-2Rα avec la SEP. L’importance de ce
gène repose sur des à priori sur la fonction de la protéine. En effet, l’IL-2Rα est aussi mieux
connu sous le nom du marqueur de surface CD25. Les lymphocytes humains qui expriment de
façon constitutive le CD25 à leur membrane ont généralement des fonctions régulatrices. Ceci
est à mettre en relation avec le fait que les cellules régulatrices des patients souffrant de SEP
semblent avoir des fonctions immuno-modulatrices altérées par rapport à celles provenant de
personnes témoins [Viglietta et al., 2004].
Introduction
48
1.7.3. Le CD58
L’équipe qui identifia pour la première fois l’association des gènes de l’IL-2Rα et de
l’IL-7R α avec à la susceptibilité à la SEP identifia par ailleurs de nombreux autres gènes
potentiels. Si l’IL-2Rα et l’IL-7Rα faisaient partie des 2 premiers gènes non-CMH présentant
les meilleurs valeurs statistiques, le gène codant pour le CD58 sortait en 6ème position. Le
polymorphisme rs12044852 du gène CD58 confère un risque relatif de 1,24 [Hafler et al., 2007].
Par la suite, l’implication du CD58 dans la SEP fut confirmée par deux autres études
indépendantes qui associèrent deux autres polymorphismes aux risques relatifs comparables :
rs1335532 [ANZgene, 2009] et rs2300747 [De Jager et al., 2009a]. Il fut démontré que dans le LCR
des patients SEP, l’expression du CD58 était diminuée par rapport à des témoins [Brynedal et
al., 2009]. Bien que le CD58 soit exprimé à la surface de nombreux types cellulaires, De Jager
et al. suggérèrent que les conséquences fonctionnelles du polymorphisme rs2300747 seraient
d’altérer les fonctions du système immunitaire [De Jager et al., 2009a]. Ce polymorphisme, qui
localise dans le premier intron du CD58, est associé à une modification de l’expression du
CD58. En effet, l’allèle associé négativement à la SEP est également associé à une
augmentation de l’ARN messager du CD58 dans les cellules sanguines. Par ailleurs, les
patients présentant une rémission clinique de la SEP présentent une augmentation de l’ARN
messager du CD58 par rapport aux patients en phase de poussées. Le CD58, aussi connu sous
le nom de LFA-3, est une molécule de co-stimulation qui se lie au CD2. Cette interaction peut
augmenter le signal délivré par le TCR. Il fut démontré que l’engagement du CD2 exprimé à
la surface des lymphocytes T régulateurs augmentait l’expression de FOXP3, un récepteur
nucléaire fortement impliqué dans les fonctions régulatrices des cellules T. Ces données
suggèrent que l’effet protecteur du locus CD58 dans la SEP passe par les fonctions
régulatrices des lymphocytes T. Par ailleurs, le CD58, en plus de son implication dans la
signalisation, est une molécule d’adhésion. Ainsi, suggérer que le CD58 intervient dans la
susceptibilité à la SEP par cette seule voie biologique reste soumise à caution [De Jager et al.,
2009a].
1.7.4. La tyrosine kinase 2
Un récent GWAS associa la protéine tyrosine kinase 2 (TYK2) avec la susceptibilité
à la SEP [Ban et al., 2009]. L’allèle G majoritaire du polymorphisme rs34536443 présentait une
Introduction
49
fréquence augmentée chez les patients souffrant de SEP par rapport aux témoins, conférant un
risque relatif de 1,32. L’association du gène TYK2 à la SEP fut par la suite confirmée dans
une étude de GWAS indépendante. Mais ce second travail associa un autre polymorphisme
(rs8118449) de TYK2 à la SEP [ANZgene, 2009]. Cependant, aucune de ces deux études
n’apportèrent d’explication fonctionnelle sur les possibles rôles de TYK2 dans l’étiologie de
la SEP.
TYK2 est une protéine à activité tyrosine kinase qui interagit avec le domaine
intracellulaire de plusieurs récepteurs aux cytokines [Schindler et al., 2008]. Cette protéine est
activée par phosphorylation [Gauzzi et al., 1996]. La fonction kinase de TYK2 est requise pour la
transmission du signal à la suite de l’interaction d’une cytokine avec son récepteur [Ghoreschi
et al., 2009]. Bien qu’initialement découverte comme associée aux récepteurs aux interférons
de type 1 (IFNα et IFNβ), TYK2 fut récemment définie comme interagissant avec de
nombreux récepteurs aux cytokines : IL-12, IL-23, IL-10 et IL-6 (Figure 21) [Watford et al.,
2006]. Ainsi, des modifications de la fonction de TYK2 pourraient avoir des conséquences
multiples sur le système immunitaire. Des souris déficientes pour TYK2 ont permis de
démontrer l’importance de cette tyrosine kinase dans la fonction des cellules dendritiques
[Tokumasa et al., 2007], des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques [Simma et al., 2009] et des
lymphocytes T γδ [Nakamura et al., 2008]. De plus, cette souche de souris présente une résistance
à certains modèles de maladies auto-immunes comme l’EAE [Spach et al., 2009] ou l’arthrite
auto-immune induite par l’injection de collagène [Shaw et al., 2003]. Chez l’Homme, un seul cas
de déficience pour TYK2 fut décrit [Minegishi et al., 2006]. Le patient présentait un syndrome
d’hyper-IgE. De plus, les cellules immunitaires de ce patient présentaient des défauts de
réponse à de nombreuses cytokines (IFNβ, IL-6, IL-10, IL-12 et IL-23) ainsi qu’une
différenciation cellulaire favorisant la voie Th2. Bien que chez la souris et chez l’Homme la
déficience en TYK2 confère des phénotypes légèrement différents vis-à-vis de la réponse aux
cytokines, on retrouve toujours une modification dans la polarisation Th1/Th2 des cellules
immunitaires. La déficience en TYK2 défavoriserait la réponse Th1 en faveur d’une réponse
de type Th2 [Ghoreschi et al., 2009].
Le polymorphisme rs34536443, qui localise dans un exon, est responsable du
changement d’une proline en alanine en position 1104 de la protéine. Ce changement d’acide
aminé touche le domaine kinase de TYK2 et il pourrait donc avoir des conséquences
importantes sur la fonction de la protéine comme l’avait suggéré Kaminker et al. [Kaminker et
al., 2007]. Par ailleurs, il fut démontré que le changement de la proline en position 1104 par
Introduction
50
une valine (et non pas par une alanine comme induit par le polymorphisme rs34536443) avait
pour conséquence de diminuer la phosphorylation de TYK2 et par conséquent son état
d’activation [Tomasson et al., 2008]. Afin de comprendre l’importance de TYK2 dans l’étiologie
de la maladie, il serait important de confirmer que le polymorphisme rs34536443 modifie la
réponse immune.
Figure 21 : Récepteurs aux cytokines qui utilisent TYK2 dans leur voie de signalisation. D’après Watford et al.,
Immunity, 2006.
Parmi les nombreux gènes récemment identifiés comme associés à la susceptibilité à la
SEP, peu présentent une réplication positive dans une cohorte indépendante à celle utilisée
dans la première étude. De plus, même si l’association à la SEP est confirmée pour un gène,
une approche fonctionnelle est indispensable afin de mieux comprendre l’étiologie de la
maladie [Chanock et al., 2007]. En effet, cela permet de :
(1) Valider que le polymorphisme associé à la maladie est bien le polymorphisme
« fonctionnel ». En effet, le polymorphisme initialement découvert comme associé à la
maladie peut avoir un fort LD avec un autre polymorphisme réellement fonctionnel.
(2) Mieux comprendre la ou les voie(s) conduisant au développement de la SEP et de
découvrir de nouvelles voies jouant un rôle important dans la maladie.
L’identification certaine du gène conférant une susceptibilité accrue à la SEP ne signifie pas
que la voie de signalisation impliquée dans la maladie est clairement définie. En effet, certains
gènes ont des fonctions dans de nombreuses voies de signalisation. Suite à la découverte
d’une association génétique, des approches expérimentales complémentaires sont
indispensables afin d’étudier les effets, qualitatifs et quantitatifs, des variants sur le gène.
Elles permettent également de mieux comprendre comment ces variants affectent une voie de
signalisation ou des interactions cellulaires [Fugger et al., 2009].
Introduction
51
II.2. Les facteurs environnementaux
Dans la SEP, la composante génétique est importante car elle permet par exemple
d’expliquer l’augmentation du risque de développer la maladie dans les familles dont un des
membres en souffre. Cependant, si on pensait que la composante génétique était le seul
facteur impliqué, il serait alors impossible d’expliquer certaines particularités de cette maladie
comme : les variations de fréquence de la maladie en fonction de la géographie, mais aussi les
modifications du risque liées à la migration d’individus [Ascherio et al., 2007a ; Ascherio et al.,
2007b]. Par ailleurs, plusieurs études, dont celle d’Orton et al., reportent une rapide et récente
augmentation de l’incidence la maladie uniquement chez les femmes [Orton et al., 2006]. Une
augmentation si rapide pourrait être le reflet de changements environnementaux. Il est
important de faire la différence entre les facteurs micro-environnementaux qui agissent sur les
individus au sein d’une famille, et les facteurs environnementaux qui agissent sur une
population entière.
II.2.1. Les risques micro-environnementaux
L’identification de facteurs micro-environnementaux capables de déclencher le
développement de la SEP représenterait une avancée majeure dans la prévention de la
maladie. Il serait alors possible de prévenir l’exposition à ces facteurs et ainsi de diminuer le
nombre de personnes développant la SEP. L’hypothèse hygiéniste fut alors évoquée pour
expliquer l’augmentation de l’incidence des maladies auto-immunes, dont la SEP [Fleming et
al., 2006]. Cette hypothèse repose sur le concept que l’absence de contact avec certains agents
pathogènes durant l’enfance pourrait, plus tard dans la vie, expliquer une prédisposition de ces
individus aux maladies auto-immunes. Dans les pays développés, l’utilisation massive
d’antibiotiques et de vaccins, mais aussi la mise en place de périodes de quarantaine,
réduisent le contact avec des agents pathogènes durant l’enfance. Le résultat serait que le
système immunitaire échouerait dans son développement normal. Ces mêmes pathogènes,
lorsqu’ils solliciteraient plus tardivement le système immunitaire, pourraient conduire à
l’apparition d’une réponse auto-immune [Giovannoni et al., 2007]. En s’appuyant sur les grandes
lignes de ce concept hygiéniste, il fut proposé d’étudier si un enfant partageant son
environnement familial avec un autre enfant d’âge proche présentait une diminution du risque
de développer une SEP une fois adulte. Cela reposait sur l’idée que l’enfant cadet serait en
Introduction
52
contact avec plus (et plus tôt) de pathogènes responsables de maladies infantiles que des
enfants uniques ne le seraient. Cette exposition permettrait une meilleure éducation de leur
système immunitaire. Par ailleurs, l’enfant ainé verrait son système immunitaire
régulièrement restimulé par des infections. Un travail rapporta que le contact avec un enfant
de 2 ans son cadet durant les 6 premières années de sa vie suffisait à réduire le risque de
développer une SEP [Ponsonby et al., 2005a ; Ponsonby et al., 2005b]. Cependant, ces résultats furent
réfutés par d’autres études ne trouvant pas d’association entre la SEP et le nombre de frères et
sœurs, le fait d’être l’ainé ou le cadet, ou la différence d’âge entre les enfants [Sadovnick et al.,
2005 ; Bager et al., 2006]. Une étude se proposa d’étudier la relation qu’il existait entre la
prévalence de la SEP et la prévalence d’un parasite (Trichuris trichiura) choisi comme
marqueur de l’état sanitaire du lieu de vie et de l’infection par d’autres macro-parasites
[Fleming et al., 2006]. Il fut montré que la prévalence de la SEP chutait drastiquement chez les
populations humaines où les prévalences de ce parasite dépassaient le seuil des 10%.
Cependant, il est important de pondérer ce résultat car il ne montre aucune causalité directe
entre ces deux variables et qu’il pourrait n’être que le reflet d’autres facteurs
environnementaux ou sociaux.
Mais jusqu’à aujourd’hui, les approches d’épidémiologie utilisant des cohortes de
familles n’ont pas réussi à démontrer la transmission de facteurs non-génétiques. On peut
donc dire que l’environnement semble capable d’influencer le risque de SEP au niveau d’une
population et non pas au niveau d’un individu [Giovannoni et al., 2007].
I I.2.2. Les risques environnementaux
Il existe des différences dans le risque de SEP en fonction des régions du monde. La
maladie est plus rare dans les zones tropicales que dans les régions tempérées (Figure 22)
[Marrie et al, 2004]. Des variations de la prévalence de la SEP sont aussi visibles sur de relatives
courtes distances géographiques, ce qui reflète en partie l’influence de l’environnement sur
une même ethnie. De plus, l’influence d’un ou de plusieurs facteurs environnementaux sur la
susceptibilité à la SEP a été envisagée suite aux résultats obtenus par des études de migration
d’individus. Ces études suggèrent que l’exposition à des facteurs environnementaux, dont la
nature reste encore à déterminer, doit se faire tôt au cours de l’adolescence pour avoir un effet
sur la maladie [Marrie et al, 2004]. En effet, les individus migrant d’une région du globe vers
une autre, avant leur adolescence, présentent un risque de développer une SEP comparable à
Introduction
53
celui de leur lieu d’immigration. En comparaison, ceux qui migrent après leur adolescence
emportent avec eux l’incidence de SEP du pays d’où ils viennent. Des études réalisées sur
l’immigration au Royaume-Uni montrèrent que les immigrants pakistanais (zone de faible
risque) qui arrivaient avant l’âge de 15 ans avaient significativement plus de risque de
développer une SEP que les individus arrivant après l’âge de 15 ans [Dean et al., 1997]. Par
contre, les enfants nés au Royaume-Uni de cette première génération d’immigrants avaient un
risque de SEP du même ordre que la population générale du Royaume-Uni [Elian et al., 1990].
Figure 22 : Prévalence de la SEP dans le monde. D’après Compston et al., Lancet, 2008.
2.2.1. Les agents infectieux
Depuis longtemps les agents infectieux sont suspectés comme jouant un rôle dans la
SEP [Gilden et al., 2005]. Dans ce contexte, deux grandes théories s’affrontent. Cependant, elles
reposent sur un concept commun, à savoir que l’agent pathogène responsable de la SEP serait
largement répandu [Ascherio et al., 2007a]. La première hypothèse, appelée « hypothèse de la
poliomyélite », pose le postulat qu’il existerait un virus capable d’augmenter le risque de
développer une SEP lorsqu’il serait tardivement rencontré durant l’enfance ou à l’âge adulte.
Par contre, une infection par ce même virus durant l’enfance serait moins néfaste et pourrait
conférer une protection immunitaire. La deuxième hypothèse est « l’hypothèse de la
prévalence », qui suggère que la SEP est causée par un pathogène qui serait plus
communément répandu dans les zones de grande prévalence de la maladie. L’hypothèse
« poliomyélite » semble avoir gagné les faveurs de la communauté scientifique, bien qu’elle
Introduction
54
reprenne par beaucoup d’aspects une théorie plus ancienne, la théorie hygiéniste. Cette théorie
est intéressante car elle permettrait d’expliquer le gradient de latitude de la SEP mais surtout
l’apparente protection des personnes nées dans les zones de faible risque de SEP et qui
migreraient par la suite vers des zones de haut risque.
a. Le virus d’Epstein-Barr
L’EBV est un virus de la famille des herpès qui infecte les lymphocytes B. Il est
considéré comme une cause plausible dans le développement de la SEP car : (1) il infecte la
quasi-totalité de la population mondiale, (2) il persiste dans la cellule sous la forme de virus
dormant, mais peut se réactiver et donner lieu à la production de nouvelles particules virales
(3) il peut moduler le système immunitaire. Bien que la quasi-totalité de la population
mondiale soit infectée par l’EBV, si on compare des patients SEP à des personnes témoins, on
retrouve des différences entre les deux groupes. Presque 100% des patients SEP sont infectés
par le virus alors que « seulement » 90% des personnes saines pour la SEP sont séropositives
à l’EBV [Ascherio et al., 2007a]. Cette différence est encore plus marquée chez les enfants,
comme l’a montré une étude des formes infantiles de SEP [Pohl et al., 2006].
La mononucléose virale est la manifestation clinique d’une infection aigüe par l’EBV.
Cette manifestation est plus commune chez les adolescents et les adultes que chez les jeunes
enfants chez qui l’infection primaire par l’EBV est généralement cliniquement silencieuse. Il
est intéressant de noter que la SEP et la mononucléose virale partagent des distributions
géographiques de prévalence similaires : accroissement de la prévalence avec l’éloignement
de l’équateur [Ascherio et al., 2007a]. Une méta-analyse de l’association entre la SEP et la
mononucléose infectieuse révéla un risque relatif 2,3 fois plus élevé de développer la SEP
chez les personnes ayant eu une manifestation clinique, par rapport à des personnes infectées
de manière silencieuse par le virus [Thacker et al., 2006]. Une autre étude reproduisit ce résultat
avec un risque relatif comparable, et démontra que ce risque augmentait dans les 5 ans faisant
suite à la mononucléose virale, pour rester élevé même 30 ans après [Nielsen et al., 2007]. Si on
analyse ces résultats dans leur globalité, cela pose le problème d’un grand paradoxe avec
l’hypothèse de la poliomyélite : l’infection par le virus serait plutôt associée à une plus grande
susceptibilité à la SEP. Cependant, la proposition d’un modèle de relation entre l’infection par
l’EBV et la SEP permit de réconcilier les données avec l’hypothèse de la poliomyélite :
même si le risque de SEP est presque nul pour les personnes non infectées par le virus, le
risque est intermédiaire pour les personnes infectées par l’EBV durant leur enfance (infection
Introduction
55
silencieuse), mais surtout le risque augmente encore plus pour devenir un risque fort chez les
personnes infectées durant leur adolescence ou à l’âge adulte (manifestation de mononucléose
virale) (Figure 23) [Pohl et al., 2009].
De manière intéressante, une récente étude a montré la présence de lymphocytes B et
de plasmocytes infectés par l’EBV dans le cerveau de patients ayant souffert de SEP. De
telles cellules ne furent pas retrouvées dans le cerveau de personnes souffrant d’autres
maladies neurologiques inflammatoires [Serafini et al., 2007]. Cependant, ces résultats restent à
confirmer car certains patients souffrant de SEP avaient reçu des traitements
immunosuppresseurs et qu’il n’y avait que peu d’individus témoins souffrant d’une
inflammation chronique du SNC. Il est aussi possible de retrouver les traces d’une réaction
immunitaire dirigée contre l’EBV dans le SNC de patients souffrant de SEP. La présence
d’IgG intrathécales est le reflet d’une réponse inflammatoire localisée dans le SNC, car les Ig
ne peuvent pas passer la BBB. Une étude montra que certains anticorps contenus dans les
bandes oligoclonales d’IgG de patients atteints de SEP présentaient une spécificité dirigée
contre des protéines du virus de l’EBV. Qui plus est, leur quantité était significativement plus
importante chez les patients SEP que chez des témoins [Cepok et al., 2005]. Cependant, ce
résultat reste à confirmer car il est bien connu que les patients SEP développent une synthèse
intrathécale d’anticorps dirigés contre de nombreux pathogènes (herpes simplex, virus de la
varicelle…) [Pohl et al., 2009]. Dans le sang aussi, les anticorps dirigés contre l’EBV sont
davantage présents chez les patients SEP que chez des témoins, et cette augmentation a lieu
bien des années avant que les premiers signes de SEP apparaissent [Levin et al., 2005]. Un autre
indice soulignant l’éventuelle implication de l’EBV est la présence d’une réponse immunitaire
dirigée contre l’EBV impliquant les lymphocytes T CD4+ [Lünemann et al., 2006] et T CD8+
[Jilek et al., 2008] plus forte chez les patients SEP que chez des témoins. Une infection par
l’EBV pourrait initier une réponse auto-immune par une réactivité des lymphocytes T à la fois
contre les protéines du virus et contre des auto-antigènes. En effet, la reconnaissance croisée
des lymphocytes T pour les peptides de l’EBV et pour des protéines de la myéline a été
prouvée. Cependant, il a été aussi montré que la fréquence des lymphocytes T ayant une
double reconnaissance, à la fois des protéines du soi et des protéines virales, était similaire
entre les patients souffrant de SEP et les personnes saines [Lünemann et al., 2008].
Introduction
56
Figure 23 : Représentation schématique de l’incidence de la SEP en fonction de l’infection par le virus
d’Epstein-Barr. D’après Thacker et al., Ann. Neurol., 2006.
b. Les autres pathogènes suspectés
Bien que l’EBV soit l’agent pathogène privilégié dans l’hypothèse d’une implication
virale, d’autres pathogènes ne peuvent pas être exclus. Ces dernières années, l’éventuelle
implication de deux autres pathogènes fut également favorisée : Chlamydia pneumoniae et le
virus herpétique humain 6 (HHV6). La découverte de l’ADN de Chlamydia pneumoniae
dans le LCR d’un patient souffrant de SEP fit grand bruit [Sriram et al. 1998] mais cette
hypothétique association ne dura pas très longtemps par l’absence de confirmation sûre [Bagos
et al., 2006]. Au contraire, le rôle de HHV6, virus en partie neurotrope [Braun et al., 1997], est
encore fortement supposé comme influençant la susceptibilité à la SEP [Ascherio et al., 2007a].
Chez les patients SEP, l’ADN de HHV6 est plus fortement retrouvé au niveau du SNC
comparé à un individu sain. Par ailleurs, la présence de cet ADN viral est augmentée
localement au niveau des lésions inflammatoires par rapport à la substance blanche
environnante [Cermelli et al., 2003]. Cependant, ce virus est aussi capable d’infecter les cellules
immunitaires. Comme la nature des cellules infectées par HHV6 au niveau des lésions n’a pas
été caractérisée, on ne peut pas exclure que l’augmentation de l’ADN de HHV6 observée soit
le reflet d’un recrutement massif de cellules inflammatoires au niveau des lésions. Une autre
étude nota une activité virale de HHV6, avec la production d’ARN, confinée aux
oligodendrocytes à la fois chez les patients SEP et des personnes saines. Cependant, cette
Introduction
57
activité virale semblerait beaucoup plus importante dans le SNC des personnes souffrant de
SEP [Opsahl et al., 2005].
Il est qu’en même important de rappeler que malgré les troublantes associations
trouvées entre divers pathogènes et la SEP, on ne peut pas exclure que les changements
observés soient tout simplement la conséquence de changements biologiques mis en place lors
de l’apparition d’une SEP plutôt que les causes de la maladie.
2.2.2. L’exposition lumineuse et la vitamine D
L’augmentation de la prévalence de la SEP avec l’éloignement progressif hors des
régions équatoriales du globe [Kurtzke et al., 2000] a rapidement suggéré l’implication de
facteurs environnementaux. L’un des facteurs environnementaux directement associé avec cet
effet latitude fut l’exposition lumineuse. En effet, les régions équatoriales reçoivent une
intensité lumineuse plus importante et de plus longue durée que les régions australes. Dans ce
sens, une étude montra que l’intensité lumineuse d’une zone était inversement corrélée avec la
prévalence de la SEP [Van de Mei et al., 2001].
Le rôle possible de la vitamine D (VD) dans la susceptibilité à la SEP fut pointé du
doigt [Goldbers et al., 1974] lorsque les travaux de l’équipe du Dr Holick montrèrent que la
l’exposition au soleil était le principal élément régulant la concentration de cette vitamine
[Holick et al., 2008]. Pour beaucoup de personnes, l’exposition au soleil est la source majeure de
VD. Dans les régions de fortes latitudes, les radiations solaires en hiver sont trop faibles pour
permettre une synthèse suffisante de VD [Stewart et al., 2009]. Chez l’Homme, la production de
la forme active de la VD se fait au niveau de la peau à partir d’un dérivé du cholestérol. La
forme pré-VD nécessite un clivage par les rayons ultraviolets B du soleil pour devenir
biologiquement active (Figure 24) [Smolders et al., 2008]. Sans réellement le démontrer,
quelques rares et anciennes études essayèrent de montrer que les faibles taux de VD sériques
pouvaient favoriser une plus grande susceptibilité à la SEP. D’autres études montrèrent que
les patients souffrant de SEP présentaient un taux sérique en VD plus faible que des personnes
issues d’une population témoin [Ozgocmen et al., 2005 ; Orton et al., 2008 ; Correale et al., 2009].
Cependant, ces études furent contredites par d’autres, et ne purent jamais démontrer que le
faible taux en VD pouvait être la cause de la SEP et non une conséquence de la maladie
(problèmes ambulatoires ne favorisant pas les sorties à l’extérieur par exemple) [Van der Mei et
al., 2007]. Une étude pratiquée sur un très grand nombre de personnes vivant dans
Introduction
58
l’hémisphère Nord montra qu’il y avait significativement moins de personnes atteintes de SEP
nées au mois de Novembre, mais significativement plus lorsqu’elles étaient nées au mois
d’Avril. Cette observation que le mois de naissance et le risque de développer une SEP
pourraient être associés implique une interaction avec l’environnement. Une hypothèse serait
que « l’effet mois de naissance » est lié à la concentration sanguine en VD chez la mère, qui
varie au cours des saisons [Willer et al., 2004].
La VD peut aussi être absorbée via la nourriture. Sous cette forme, le clivage par
l’exposition au soleil n’est plus nécessaire. Cependant, son apport est limitée à la
consommation de rares aliments comme les poissons gras, les champignons de type shiitaké,
et le contenu de l’estomac des rennes, donc autant dire restreint aux poissons gras pour la
majorité d’entre nous [Ebers et al., 2008]. Chez l’animal, dans le modèle EAE, l’injection intra-
péritonéale quotidienne de la forme active de la VD [Muthian et al., 2006] ou la
complémentation de l’alimentation en VD [Spach et al., 2006] sont capables de diminuer
significativement les signes cliniques de la maladie. Une étude réalisée sur des souris délétées
pour le récepteur à la VD montra que ce récepteur était indispensable pour l’effet protecteur
de la VD dans l’EAE [Meehan et al., 2002]. Chez l’être humain, une étude américaine s’intéressa
à une cohorte de femmes supplémentées dans leur régime alimentaire avec un complément
multivitaminé, contenant de la VD. Cette cohorte présentait un risque 40% plus faible de
développer une SEP que les femmes non complémentées [Munger et al., 2004]. Cependant,
l’effet des autres vitamines contenues dans le complément alimentaire ne pouvait pas être
exclu. La même équipe suggéra plus tard l’effet réel de la VD seule, en démontrant qu’une
forte concentration sanguine en VD était associée à un risque moindre de développer une SEP
[Munger et al., 2006]. Des études pratiquées sur des populations dont l’alimentation comprenait
des aliments naturellement riches en VD (Finlandais, Inuits) suggèrent que cette hygiène
alimentaire pourrait expliquer la faible incidence de la SEP dans cette population [Ebers et al.,
2008].
Introduction
59
Pre-Vitamin D
1.25(OH) D
Vitamin D
UV-lightSkin
Diet
Active Metabolite
Pre-Vitamin D
1.25(OH) D
Vitamin D
UV-lightSkin
Diet
Active Metabolite
Figure 24 : Métabolisme de la vitamine D. D’après Smolders et al., J. Neuroimmunol., 2008.
Le récepteur de la VD fait partie de la superfamille des récepteurs aux stéroïdes. Une
fois lié à la forme active de la VD, il peut se fixer au niveau des éléments de réponse à la VD
en amont de nombreux gènes. La découverte de l’expression du récepteur à la VD dans les
monocytes, les cellules présentatrices de l’antigène (APC) et les lymphocytes activés
suggère un effet de la VD sur le système immunitaire [Veldman et al., 2000 ; Chen et al., 2007].
Plusieurs études mettent en évidence un modèle suivant lequel la VD serait capable d’orienter
la réponse immunitaire vers une réponse anti-inflammatoire [Smolders et al., 2008]. La VD
inhiberait la polarisation des lymphocytes T CD4+ vers un profil cytokinique Th1 (IFNγ et
TNFα) [Muthian et al., 2006] et favoriserait une polarisation vers un profil cytokinique Th2 (IL-
4, IL-5 et IL-13) [Boonstra et al., 2001]. Plus important, la VD pourrait induire des lymphocytes
T régulateurs produisant de l’IL-10 et du TGFβ [Dong et al., 2003].
2.2.3. La cigarette
Bien que la cigarette ne puisse pas expliquer le gradient de latitude observé dans la
SEP ainsi que la modification du risque de développer la maladie lors de migrations, cette
habitude sociale a souvent été testée comme un facteur de risque. Déjà en 1965, un article
présentait la cigarette comme un possible facteur de risque [Antonovsky et al., 1965]. Par la suite,
des études plus récentes démontrèrent aussi un risque augmenté de développer une SEP dans
la population de fumeurs comparé à une population de non-fumeurs [Hernan et al., 2005 ;
Introduction
60
Pekmezovic et al., 2006]. Le regroupement des données de plusieurs études prospectives rend
compte d’un risque relatif poolé 1,25 (P < 0,01) fois plus important chez les fumeurs que chez
les non-fumeurs [Hawkes et al., 2007]. Par ailleurs, la cigarette aggraverait les symptômes de
SEP et serait aussi capable d’accélérer le passage de la forme RR-MS vers la forme SP-MS
[Hernan et al., 2005]. La cigarette contient plus de 4 500 composés qui peuvent expliquer une
susceptibilité accrue à la SEP, mais aussi la progression plus rapide de la maladie chez les
fumeurs. Certains de ces composés sont connus pour avoir un effet neurotoxique : c’est le cas
de l’oxyde nitrique (NO). Il est connu que fumer augmente le niveau de NO plasmatique
[Zhou et al., 2000]. Il est raisonnable de penser que cette augmentation se fait aussi au niveau du
SNC et des lésions de démyélinisation. Dans le SNC, les neurones sont des cellules qui sont
très sensibles à la présence de NO [Kapoor et al., 2003]. Le NO peut ainsi conduire à une
dégénérescence axonale ou à un blocage du signal électrique. Enfin, la cigarette, de par son
grand nombre de composés, affecte le système immunitaire [Stämpfli et al., 2009], la
perméabilité de la BBB [Hawkes et al., 2007] et le risque de développer plus d’infections virales
et bactériennes [Stämpfli et al., 2009]. Cependant, les résultats d’association entre la cigarette et
la SEP doivent être interprétés avec beaucoup de précautions [Hawkes et al., 2005]. En effet,
cette association n’est pas retrouvée dans toutes les études [Warren et al., 1982 ; Casetta et al.,
1994]. Ces contradictions dans l’association peuvent être dépendantes de problèmes dans la
méthodologie, comme l’homogénéité des cohortes étudiées ou l’absence de corrections
statistiques. Ainsi l’effet de la cigarette sur le développement de la SEP, et l’effet possible du
tabagisme passif attendent toujours une confirmation [Sundström et al., 2008]. Enfin, une
association claire de la cigarette comme facteur impliqué dans la récente augmentation de
l’incidence de la maladie chez les femmes n’a toujours pas été démontrée.
II.3. Les facteurs épigénétiques
Si l’information génétique était l’unique facteur déterminant la susceptibilité à la SEP,
on pourrait penser que des jumeaux MZ, par définition génétiquement identiques, partagent le
même risque de développer la maladie et donc présentent un statut clinique concordant pour
la SEP. Or, ce n’est pas le cas puisque seulement 20 à 30% des jumeaux MZ sont concordants
pour la SEP [Willer et al., 2003 ; Hansen et al., 2005]. A défaut d’avoir d’autres causes pouvant
expliquer ces variations, on les attribuait habituellement à un effet de l’environnement [Wong
et al., 2005]. Cependant, l’environnement ne semble pas pouvoir expliquer pleinement de telles
Introduction
61
différences de statut clinique chez des jumeaux MZ. Ainsi, des clones animaux, qui possèdent
la même information génétique et partagent le même environnement, peuvent présenter des
phénotypes très différents (croissance aberrante, couleur du pelage, mort précoce…). Ces
divergences résulteraient d’un défaut dans la reprogrammation épigénétique lors de la
fécondation de l’œuf [Rideout et al., 2001]. Par ailleurs, de nombreuses études se proposèrent
d’évaluer l’importance de l’environnement chez l’Homme en comparant des jumeaux MZ
ayant partagé le même environnement durant l’enfance à des jumeaux MZ ayant grandi
séparément. Sur les différents traits testés, comme la personnalité [Bouchard et al., 2003] ou la
susceptibilité aux céphalées [Svensson et al., 2003], la corrélation obtenue pour des jumeaux MZ
ayant grandi séparément n’était pas plus mauvaise que celle obtenue pour des jumeaux MZ
ayant partagé le même environnement. Pour expliquer les discordances cliniques des jumeaux
MZ dans la SEP, l’implication d’une troisième composante fut alors suggérée : la composante
épigénétique. L’épigénétique permet de compléter l’équation suivante dans l’acquisition de la
susceptibilité à la SEP : P = G + E + EpiG (avec P : phénotype, G : génétique, E :
environnement et EpiG : épigénétique) [Petronis et al., 2006].
A l’origine, le terme épigénétique définissait les interactions des gènes avec
l’environnement qui conduisaient à l’expression d’un phénotype. Cette définition fut par la
suite améliorée en définissant l’épigénétique comme la modification de l’expression des gènes
sans que des changements visibles dans la séquence ADN n’aient lieu. Cette modification
d’expression est la conséquence de méthylations de l’ADN au niveau d’îlots CpG mais aussi
du remodelage de la chromatine (modification des histones) [Jirtle et al., 2007]. En effet, alors
que le génome de toutes les cellules somatiques d’un organisme complexe renferme
exactement les mêmes gènes, les facteurs épigénétiques permettent aux cellules de se
différencier en un lignage défini via l’expression ou l’inhibition spécifique de certains gènes
[Brena et al., 2006]. Dans le futur, cette définition pourrait encore être élargie avec la découverte
de nouveaux mécanismes épigénétiques [Cuzin et al. 2008]. De plus, certaines modifications
épigénétiques sont transmissibles au cours des divisions cellulaires, voire même de génération
en génération. Ainsi, le concept d’épigénétique rompt avec celui d’une transmission
mendélienne d’un phénotype. De plus, cela suggère que les gènes pourraient avoir une sorte
de mémoire de l’environnement. Se pose alors la question suivante : l’environnement et la
façon de vivre de mes ancêtres proches pourraient-ils directement influencer ma susceptibilité
à une maladie ? La réponse est oui car, du moins chez la souris, des phénotypes particuliers
sont transmissibles au cours des générations sans qu’il n’y ait présence d’une mutation
Introduction
62
génétique. Rassoulzadegan et al. démontrèrent qu’un trait phénotypique (le bout de queue
blanc de la souris), initialement dû à une mutation non-sens dans le gène Kit, était conservé
pendant au moins deux générations sans que la mutation responsable du phénotype ne soit
encore présente chez les souris présentant ce phénotype (Figure 25) [Rassoulzadegan et al., 2006].
Le mécanisme proposé fut que la mutation du gène Kit induisait à la synthèse d’un ARN
défectueux qui serait transmissible à la génération suivante via les spermatozoïdes. Cet ARN
inhiberait l’expression du gène Kit ce qui conduirait à l’expression du phénotype mutant,
même chez des souris sauvages [Soloway et al., 2006]. Par un mécanisme comparable, une autre
étude démontra qu’il était possible d’induire une hypertrophie cardiaque via l’introduction
d’un ARN inhibiteur exogène dans la première génération de souris. Cette pathologie
cardiaque est transmissible pendant au moins trois générations sans manipulation extérieure
des animaux [Wagner et al., 2008].
Figure 25 : Modèle pour la transmission d’un phénotype en l’absence de mutation du gène Kit proposé par
Rassoulzadegan et al. D’après Soloway et al., Nature, 2006.
Introduction
63
II.3.1. Influence de l’épigénétique dans la susceptibilité aux maladies auto-
immunes
Plusieurs médicaments, tel l’Hydralazide et la Procaïnamide, peuvent avoir des effets
indésirables graves chez des personnes génétiquement prédisposées. Dans certains cas, ils
peuvent conduire à l’apparition d’une maladie auto-immune dont les symptômes sont proches
de ceux du lupus. Le mode d’action de cette classe de médicaments repose sur la modification
des méthylations de l’ADN [Cornacchia et al., 1988]. Ces effets délétères causés par une
modification des méthylations du génome soulignent la possible implication des facteurs
épigénétiques dans la susceptibilité aux maladies auto-immunes. Une étude démontra que si
des jumeaux MZ étaient épigénétiquement indistinguables durant leurs premières années de
vie, des jumeaux MZ plus âgés présentaient de nombreuses différences à la fois quantitatives
et qualitatives dans leur profil épigénétique (distribution des méthylations sur le génome)
[Fraga et al., 2005]. On ignore encore si de tels changements épigénétiques s’accumulent sous la
pression de facteurs extérieurs (environnement, régime alimentaire…) ou/et de facteurs
internes ou stochastiques (division/différentiation cellulaire) [Poulsen et al., 2007]. Il a été
montré que des changements épigénétiques sont capables d’induire des changements
phénotypiques. La discordance des jumeaux MZ pour la SEP pourrait résulter de
modifications épigénétiques non similaires. Dans ce cas, la SEP serait une maladie à
composante épigénétique. Cependant, contrairement à d’autres maladies auto-immunes,
l’implication de la composante épigénétique dans la SEP n’a pas encore été étudiée
[Hewagama et al., 2009]. Mais en partant du postulat que les maladies auto-immunes partagent
une base commune, dont la dérégulation du système immunitaire, il est possible de faire le
rapprochement entre les découvertes faites dans d’autres maladies auto-immunes et la SEP.
II.3.2. Comment l’épigénétique pourrait modifier la susceptibilité à la sclérose en
plaques ?
La composante épigénétique pourrait au moins intervenir à 3 niveaux dans le
développement de la SEP : (1) en faisant apparaître des auto-antigènes capables d’activer une
réponse auto-immune, (2) en rendant la gaine de myéline plus susceptible aux agressions ou
en empêchant une remyélinisation correcte des axones, (3) en modifiant les cellules du
système immunitaire pour les rendre auto-réactives.
Introduction
64
3.2.1. Modification épigénétique du locus PAD2
Une modification du profil épigénétique est visible dans la substance blanche des
patients SEP. Il a été démontré que l’ADN de la substance blanche de ces patients contenait
environ 3 fois moins de cytosines méthylées comparé à des témoins [Mastronardi et al., 2007]. Ce
changement épigénétique observé serait le reflet d’une augmentation de l’activité
enzymatique des ADN-déméthylases chez les patients SEP [Mastronardi et al., 2007]. De plus
cette hypo-méthylation de l’ADN est spécifique au SNC puisqu’elle n’est pas retrouvée dans
d’autres tissus comme le thymus [Mastronardi et al., 2007].
Une des cibles de cette hypo-méthylation serait le locus PAD2 qui code pour une
enzyme à l’activité arginine déiminase [Moscarello et al., 2007]. La région promotrice du gène
PAD2 contient 74% de GC qui sont des résidus méthylables. Cette région est retrouvée
comme hypo-méthylée dans le cerveau des patients SEP comparé à des témoins [Mastronardi et
al., 2007]. La méthylation d’une région promotrice d’un gène est un phénomène épigénétique
qui permet de diminuer l’expression des gènes. Moscarello et al. démontrèrent que l’hypo-
méthylation du promoteur de PAD2 était associée à une quantité 3 fois plus importante de la
protéine dans la substance blanche des patients SEP par rapport aux témoins [Mastronardi et al.,
2007]. PAD2 est une enzyme impliquée dans la modification post-traductionnelle des
protéines. Elle transforme les acides aminés arginines en citrullines qui sont des acides aminés
non codés par le génome. Une des cibles de PAD2 est la MBP constituant la gaine de myéline
entourant les axones [Casaccia-Bonnefil et al., 2008]. Alors que la forme citrullinée de la MBP est
faiblement représentée chez les témoins (environ 20%), elle constitue environ 45% de la MBP
totale dans le cerveau des patients SEP [Moscarello et al., 1994]. Cette forme citrullinée de la
MBP se distingue de la MBP « classique » par la modification de 6 arginines en citrullines.
Pour chaque arginine perdue, la MBP perd une charge positive, ce qui la fait passer d’un état
électriquement neutre vers un état chargé négativement. Ce changement de la charge
électrique globale de la protéine a pour conséquence d’affecter son interaction avec les autres
composants de la gaine de myéline. La gaine de myéline est ainsi moins compacte et surtout
moins stable [Moscarello et al., 2007].
Pour expliquer le lien qu’il existe entre l’augmentation de la forme citrullinée de la
MBP dans le cerveau des patients SEP et le déclenchement d’une réponse immunitaire dirigée
contre le soi, deux mécanismes furent proposés (Figure 26) :
Introduction
65
(1) La citrullination de la MBP pourrait induire une sensibilité accrue de la protéine
aux clivages enzymatiques, créant ainsi plus de peptides immuno-dominants
capables de déclencher une réponse immunitaire. En effet, deux études
démontrèrent que la MBP des patients souffrant de SEP étaient plus facilement
dégradées par la cathepsine D [Cao et al., 1999] et par la métalloprotéase 3 [D’Souza
et al., 2006] que la MBP de témoins. Par ailleurs, il est important de rappeler que
ces deux enzymes sont généralement plus exprimées dans les lésions de patients
souffrant de SEP. Chacune de ces deux protéases est capable de cliver la MBP
générant ainsi des peptides immuno-dominants. Cette formation de peptides
immuno-dominants pourrait sensibiliser les lymphocytes T contre les antigènes du
soi et ainsi déclencher une réponse auto-immune [Casaccia-Bonnefil et al., 2008].
(2) Une autre mécanisme serait que la citrullination de la MBP, en changeant les
propriétés physico-chimiques de la protéine, pourrait modifier la localisation des
différentes protéines au sein de la gaine de myéline. Musse et al. démontrèrent que
la citrullination de la MBP entraînait des changements conformationnels de la
protéine capables de rendre accessible des néo-épitopes normalement cachés dans
la MBP « classique » [Musse et al., 2006]. Le concept actuel est que seuls des
épitopes enfouis dans la gaine de myéline, et donc normalement inaccessibles aux
cellules immunitaires, seraient capables de déclencher une réponse auto-immune.
La citrullination de la MBP pourrait donc induire une redistribution des
composants de la myéline faisant ainsi apparaitre des épitopes normalement
masqués [Casaccia-Bonnefil et al., 2008].
Par ces différents mécanismes la dérégulation épigénétique du gène PAD2 pourrait expliquer
la mise en place d’une réponse auto-immune au début du développement de la SEP.
Introduction
66
Figure 26 : Mécanisme proposé dans le développement de la SEP suite à une dérégulation épigénétique du gène
PAD2 conduisant à la surexpression de la protéine dans les oligodendrocytes. D’après Casaccia-Bonnefil et al.,
Prog. Neurobiol., 2008.
3.2.2. Impact de l’épigénétique sur la différenciation cellulaire
Certains mécanismes épigénétiques sont directement impliqués dans la maturation
cellulaire et le choix d’un lignage particulier. En effet, des mécanismes épigénétiques
reposant sur l’inactivation ciblée de gènes permettent de privilégier l’expression de certains
gènes par rapport à d’autres.
Nous avons vu précédemment que les épisodes de poussées cliniques associés à
l’apparition de lésions inflammatoires dans le SNC étaient encadrés dans le temps par des
phases de rémission caractérisées par une réparation du tissu. Cette cicatrisation du tissu
résulte de la migration de précurseurs des oligodendrocytes, présents dans le SNC, vers les
sites lésés [Chang et al., 2000] au niveau desquels ils se différencient en cellules matures.
L’efficacité de la remyélinisation est sous le contrôle étroit de la maturation des
oligodendrocytes. Cette maturation dépend de facteurs micro-environnementaux du SNC et
notamment de l’interaction entre les récepteurs membranaires Notch et Jagged1 [John et al.,
2002]. Cependant, l’efficacité du phénomène de remyélinisation spontanée est variable en
fonction des individus. Une cicatrisation incomplète des lésions peut être due à un défaut dans
la différenciation de précurseurs des oligodendrocytes [Brück et al., 2003]. La persistance de ces
précurseurs dans un état indifférencié pourrait être due à une régulation épigénétique
inappropriée de l’expression des gènes du développement [Casaccia-Bonnefil et al., 2008]. En
Introduction
67
effet, l’utilisation de drogues bloquant les histone-déacétylases empêche la différenciation en
oligodendrocytes matures [Marin-Husstege et al., 2002 ; Shen et al., 2005].
Les méthylations de l’ADN sont aussi essentielles pour maintenir les fonctions des
cellules T. De nombreuses études ont démontré qu’une défaillance dans le maintien d’un
certain profil de méthylation pouvait entraîner le développement de cellules T auto-réactives
in vitro et d’une auto-immunité in vivo [Richardson et al., 2003]. L’immunopathologie de la SEP
est caractérisée par la dominance d’une réponse de type Th1 associée à une production d’IFNγ
sur une réponse de type Th2 associée à une production d’IL-4. Des mécanismes épigénétiques
sont impliqués dans la différenciation des lymphocytes Th1 et Th2, mais aussi dans la
sécrétion de cytokines telles que l’IFNγ, l’IL-2, l’IL-4 et le TNFα [Makar et al., 2004 ; Wilson et
al., 2005]. En effet, chez les lymphocytes Th1, qui produisent beaucoup d’IFNγ, le promoteur
du gène de l’IFNγ est hypo-méthylé alors qu’il est fortement méthylé chez les lymphocytes
Th2, faibles producteurs de cette cytokine. Un traitement des lymphocytes Th2 par un
inhibiteur des méthylations convertit ces cellules en cellules productrices d’IFNγ [Young et al.
1994]. Les facteurs épigénétiques seraient donc capables de modifier la balance Th1/Th2 de la
réponse immunitaire et de l’orienter vers une réponse de type pro-inflammatoire favorable à
l’apparition d’une réponse auto-immune [Kürtüncü et al., 2008]. Par ailleurs, l’effet direct de la
composante épigénétique sur le développement de cellules auto-réactives a été démontré en
traitant des lymphocytes Th1 et Th2 avec un inhibiteur des méthylations. Les cellules T ainsi
traitées ont acquis la capacité à tuer les cellules du soi in vitro [Yung et al., 2001].
Le traitement de la SEP par des molécules modifiant des marqueurs épigénétiques est
donc soumis à caution. En effet, il est important de garder à l’esprit que ces modifications
épigénétiques peuvent avoir de nombreuses répercussions sur différents sous types cellulaires.
Par exemple, en pensant promouvoir la remyélinisation au niveau des lésions inflammatoires
du SNC via l’amélioration de la maturation des progéniteurs des oligodendrocytes, on peut
par la même occasion modifier la polarisation des lymphocytes T et orienter la réponse
immune vers une réponse pro-inflammatoire aux effets délétères.
3.2.3. L’inactivation du chromosome X
D’un point de vue cellulaire, les femmes se différencient des hommes par la présence
de 2 chromosomes X dans leur génome. Bien que les hommes possèdent un chromosome Y à
la place du deuxième chromosome X, seulement 54 gènes présents sur le chromosome Y sont
Introduction
68
partagés avec le chromosome X qui en possède environ 1100 [Migeon et al., 2007]. Afin
d’équilibrer l’expression des gènes présents sur le chromosome X entre les hommes et les
femmes, un des deux chromosomes X est inactivé chez ces dernières. En effet, les gènes
présents sur le chromosome X inactivé voient leur expression inhibée. Cependant, cela n’est
pas totalement vrai puisqu’il a été démontré que quelques gènes (environ 15%) pouvaient
maintenir leur expression malgré cette inactivation [Carrel et al., 2005]. Ces gènes contribuent à
l’existence de dimorphismes sexuels homme/femme. La possible implication de
l’ inactivation du chromosome X (XCI ) dans les maladies auto-immunes complexes fut
suggérée par l’hypothèse de Kast-Steward qui repose sur deux observations simples : (1) la
majorité des maladies auto-immunes touchent préférentiellement les femmes, (2) le XCI est
une régulation biologique fondamentale qui n’a lieu que chez les femmes [Ozcelik et al., 2008].
a. Mécanismes d’inactivation du chromosome X
Le XCI est un mécanisme qui a lieu très tôt au cours de l’embryogénèse. Durant
l’ontogénie des cellules germinales, l’unique chromosome X présent dans chaque cellule est
inactivé. Puis lorsque les gamètes sexuels se rencontrent, les deux chromosomes X perdent
leur état d’inactivation. C’est au stade blastocyste que chaque cellule somatique du fœtus
femelle choisit d’inactiver l’un des deux chromosome X sans prêter attention à l’origine de
celui-ci [Migeon et al., 2007]. Les femmes sont ainsi composées d’une « mosaïque » de cellules :
des cellules qui expriment le chromosome X d’origine maternelle et d’autres qui expriment le
chromosome X d’origine paternelle. Le procédé du XCI étant un phénomène aléatoire, la
majorité des femmes sans pathologie particulière ont une quantité environ égale des deux
populations cellulaires. Cependant, environ 5% des femmes présentent un très fort biais du
XCI, c’est à dire qu’au moins 90% de leurs cellules sanguines expriment un chromosome X
de même origine [Knudsen et al., 2009]. Nous reviendrons par la suite sur les causes et les
conséquences d’un tel biais du XCI. Par la suite, une fois que la cellule a fait son choix dans
le chromosome X à inactiver, elle maintiendra ce profil d’inactivation sans en changer. De
plus, le profil d’inactivation est maintenu au cours des mitoses ce qui fait que les cellules
provenant d’une cellule progénitrice présentent toutes le même chromosome X inactivé
[Migeon et al., 2007]. Dans le noyau de la cellule, le chromosome X alors inactif forme une
structure visible en microscopie que l’on appelle le corps chromatinien de Barr.
Introduction
69
Le mécanisme qui conduit à l’inactivation de l’un des deux chromosomes X est un
mécanisme complexe dont toutes les subtilités ne sont pas encore cernées [Thorvaldsen et al.,
2006]. Le XCI est composé de plusieurs grandes étapes qui sont les suivantes : (1) comptage
du nombre de chromosomes X présents dans la cellule (1 ou 2 ou même plus si la cellule est
anormale), (2) détermination du ratio « nombre de chromosomes X par rapport au nombre
d’autosomes », (3) choix du chromosome X à inactiver, (4) initiation de l’inactivation, (5)
extension progressive de l’inactivation sur toute la longueur du chromosome X, (6) maintien
de cet état d’inactivation. Le mécanisme du XCI est contrôlé par une région présente au sein
même du chromosome X. Cette région, appelée Xic pour X-inactivation center, contient 3
gènes/domaines importants : le gène Xist (X-inactive specific transcript), le gène Tsix et le
domaine Xce (X-controlling element) [Plath et al., 2002]. Les gènes Xist et Tsix codent pour
des ARNs nucléaires qui ne sont pas traduits en protéines. Xist, qui est exprimé uniquement
par le chromosome X inactivé, joue un rôle crucial dans l’inactivation du chromosome X par
son action en cis [Brow et al., 1991]. Son ARN va progressivement recouvrir le chromosome X
dans son intégralité. Cela permet de recruter des histones-déacétylases et des histone-
méthylases qui vont remodeler la structure de la chromatine rendant ainsi le chromosome
transcriptionnellement inactif. Le deuxième gène, Tsix, agissant également en cis, est
indispensable pour réprimer l’expression de Xist par le chromosome X activé. Le gène Tsix
code pour un ARN antisens du locus Xist [Sado et al., 2001]. L’expression de Tsix est
maintenue dans un premier temps afin d’inhiber la production d’un ARN stable du gène Xist,
et donc la réversion du chromosome X vers un état inactif. Par la suite, cette expression n’est
plus nécessaire lorsque l’état inactif du chromosome X devient irréversible [Wutz et al., 2000].
Tsix, qui ne code pas de protéine, agirait en modifiant la structure de la chromatine au niveau
du locus Xist ce qui conduirait à réprimer ce gène [Sado et al., 2005]. Enfin, le domaine Xce
influence la probabilité dans le choix du chromosome X à inactiver en altérant l’asymétrie
dans l’expression de Tsix. Le gène ou l’élément contenu dans le domaine Xce qui lui confère
cette propriété n’a pas encore été déterminé avec certitude. Cependant, une équipe suggéra
que la fonction du domaine Xce dépendait de la présence d’un élément de transcription
intergénique appelé Xite (X-inactivation intergenic transciption elements), placé
génétiquement en amont du gène Tsix [Ogawa et al., 2003]. Enfin, une nouvelle région du
domaine Xic fut récemment suggérée comme impliquée dans le phénomène de XCI. Cette
région appelée Xpr , pour X-pairing region, permettrait le rapprochement de deux
Introduction
70
chromosomes X. Ce rapprochement est une étape nécessaire à l’initiation du mécanisme du
XCI (Figure 27) [Augi et al., 2007].
Figure 27 : Modèle possible d’inactivation du chromosome X. D’après Augui et al., Science, 2007.
b. Implication de l’inactivation du chromosome X dans l’expression phénotypique
L’effet de l’inactivation du chromosome X sur l’expression phénotypique d’un trait fut
évoqué au cours d’études menées sur des maladies génétiques à transmission récessive liées
au chromosome X. Ces maladies monogéniques, dont le gène muté est porté par le
chromosome X, ne s’expriment normalement pas chez les femmes ne portant qu’une seule
copie du gène mutant. Or cela n’est pas toujours vrai. Deux études réalisées sur le syndrome
de l’X fragile (maladie responsable d’un retard mental héréditaire) [Kruyer et al., 1994] et sur le
daltonisme [Jørgensen et al., 1992] prouvèrent qu’il était possible d’observer chez des jumelles
MZ une discordance anormale dans l’expression clinique. Les auteurs suggérèrent que cette
discordance était la conséquence d’une différence dans le profil du XCI. Par la suite, plusieurs
travaux réalisés sur d’autres maladies génétiques récessives liées au chromosome X
démontrèrent qu’il pouvait exister une expression phénotypique de la maladie même chez des
femmes portant un allèle sauvage du gène [Parolini et al., 1998 ; Bicocchi et al., 2005]. Toutes ces
études mirent en évidence un fort biais du XCI. L’orientation de ce biais allait toujours vers
une inactivation préférentielle du chromosome X portant l’allèle sauvage du gène responsable
de la maladie.
L’implication d’un tel phénomène épigénétique dans le développement des maladies auto-
immunes complexes est plus difficile à évaluer. En effet, contrairement aux maladies
monogéniques précédemment citées, la susceptibilité aux maladies complexes repose d’une
part sur l’implication de plusieurs gènes et d’autre part sur des gènes dont la localisation
génomique est encore inconnue. Cependant, un travail réalisé sur une maladie auto-immune
complexe, la sclérodermie, démontra que la proportion de femmes présentant un fort biais du
XCI dans le sang était fortement augmentée dans le groupe des femmes souffrant de cette
Introduction
71
maladie comparé au groupe de témoins (64% vs 8%) [Ozbalkan et al., 2005]. Par la suite, cette
étude fut répliquée avec une différence moins marquée entre les deux groupes (34% vs 8%)
[Uz et al., 2008]. Un résultat similaire fut retrouvé dans la thyroïdite auto-immune avec un plus
grand nombre de femmes présentant dans les cellules sanguines un fort biais du XCI chez les
patients (34%) par rapport au groupe des témoins (8%) [Ozcelik et al., 2006]. Par ailleurs, chez
un même patient, le biais du XCI visible sur les cellules sanguines, était généralisable à
d’autres tissus comme la thyroïde ou la muqueuse buccale [Ozcelik et al., 2006]. Brix et al.
démontrèrent, chez des jumeaux discordants pour la thyroïdite auto-immune, que le jumeau
malade présentait un plus fort biais du XCI que son jumeau témoin [Brix et al., 2005]. Dans la
SEP, l’implication du XCI ne fut que peu évaluée. Une étude démontra que bien que la
proportion de personnes présentant un fort biais du XCI soit augmentée chez les patients SEP
par rapport aux témoins (17% vs 11%), cette différence n’était pas significative (P = 0,137)
[Knudsen et al., 2007]. Dans le contexte des maladies auto-immunes complexes, il est important
de rappeler que même si une proportion plus importante de femmes présente un fort biais du
XCI par rapport à des femmes témoins, cela ne signifie pas qu’à l’état d’individu, une femme
présentant un fort biais du XCI développera systématiquement une maladie auto-immune.
Dans les maladies auto-immunes précédemment citées comme associées à un fort biais du
XCI, ce biais est visible dans plusieurs tissus dont les cellules sanguines. Ozcelik et al.
émirent l’hypothèse excluant le fait que le biais du XCI soit la conséquence d’une
prolifération cellulaire due à la réaction auto-immune [Ozcelik et al., 2008].
c. Causes du biais dans l’inactivation du chromosome X
Même si la majorité des femmes présentent une inactivation aléatoire du chromosome
X, c'est-à-dire environ 50% des cellules sanguines exprimant un chromosome X d’origine
paternelle et 50% exprimant un chromosome X d’origine maternelle, il est possible d’observer
chez certaines femmes un fort biais du XCI. Ce biais peut être expliqué par plusieurs
mécanismes qui ont lieu de manière primaire ou secondaire (Figure 28):
Les mécanismes primaires responsables du biais dans le XCI sont tous les
mécanismes qui ont lieu lors du choix du chromosome X à inactiver [Minks et al., 2008].
Ce biais du XCI peut être la cause d’un phénomène totalement aléatoire. En effet, le
phénomène de XCI a lieu très précocement au cours de l’embryogenèse c'est-à-dire
quand un nombre limité de cellules sont présentes [Brown et al. 2000]. Bien que le
nombre exact de cellules au moment du mécanisme de XCI soit encore inconnu, des
Introduction
72
études l’estiment entre 10 et 20 [Monteiro et al., 1998]. Ainsi une inactivation légèrement
biaisée à l’initiation de l’inactivation peut avoir par la suite des conséquences
importantes sur le profil du XCI. De plus, nous avons vu que le domaine Xce modifie
la probabilité qu’un chromosome soit inactivé. Certains allèles du domaine Xce
pourraient donc avoir des effets très forts et être la cause d’un biais du XCI [Minks et al.,
2008]. Enfin, des mutations dans les gènes Xist et Tsix ou simplement différents allèles
de ces gènes pourrait également être la cause d’un biais du XCI [Brown et al., 2000].
Les mécanismes secondaires responsables du biais du XCI sont tous les phénomènes
qui apparaissent après que la sélection du chromosome X à inactiver ait eu lieu [Minks
et al., 2008]. Les mécanismes secondaires peuvent être perçus comme une sélection
préférentielle d’une population cellulaire. En effet, une mutation portée par un gène du
chromosome X peut avoir un effet sur la survie ou la prolifération des cellules
exprimant la mutation. C’est le cas de la mutation du gène FMR1 responsable du
syndrome de l’X fragile [Sun et al., 1999] ou de la mutation du facteur VIII dans les cas
de dyskératose congénitale [Devriendt et al., 1997], qui sont des mutations délétères pour
la survie. A l’inverse, la mutation portée par un gène du chromosome X peut conférer
un avantage sélectif à la population cellulaire qui l’exprime. C’est généralement le cas
dans les cancers où les cellules tumorales sont des clones d’une même cellule mère,
exprimant donc toutes un chromosome X de même origine [Braunstein et al., 2006].
Figure 28 : Mécanisme expliquant le biais dans l’inactivation du chromosome X. D’après Minks et al., J. Clin.
Invest., 2008.
Introduction
73
d. Conséquences de l’inactivation du chromosome X
Même si la corrélation entre certaines maladies auto-immunes et un fort biais du XCI
est clairement établie, le mécanisme qui les relie est encore inconnu. De nombreuses études
partent du principe que le biais du XCI est la cause de l’apparition de la maladie auto-immune
et non sa conséquence. Ainsi de nombreuses hypothèses ont été formulées dans ce sens.
Une hypothèse fut proposée par Stewart et al. pour expliquer la mise en place d’une
réponse auto-immune [Stewart et al., 1998]. Cette hypothèse peut être résumée en 3 événements
conduisant à la mise en place de l’auto-immunité : (1) le fort biais du XCI a aussi lieu dans le
thymus, (2) le thymus est un organe important dans l’éducation des lymphocytes T vis-à-vis
de la tolérance envers les antigènes du soi. Ainsi, les lymphocytes T pourraient être rendus
tolérants uniquement envers les allèles des gènes portés par le chromosome X
préférentiellement exprimé dans le thymus. (3) Les cellules T, après leur maturation, circulent
dans la totalité de l’organisme. Elles pourraient alors réagir contre des antigènes du soi codés
par les allèles des gènes portés par l’autre chromosome X, qui sont présentés par des cellules
périphériques. Cela pourrait conduire à l’apparition d’une réponse immune. Cette hypothèse
présume de l’existence d’antigènes codés par le chromosome X possédant des différences
alléliques. Par ailleurs, elle suppose qu’il existe des variations du profil du XCI au sein des
différents tissus d’un même individu. Dans le cas de la SEP, un gène répondant à tous ces
critères est le gène codant pour la PLP. La PLP est le composant principal de la gaine de
myéline. Elle existe sous deux isoformes obtenues par épissage alternatif : la forme longue
appelée PLP, la forme courte appelée DM20 et pour laquelle il manque une boucle de 35
acides aminés [Steinman et al., 2000]. Chez l’Homme, l’expression thymique de la PLP est
réduite à la forme DM20 [Klein et al., 2000]. Il existe de nombreux polymorphismes répartis sur
l’ensemble du gène codant pour la PLP. On peut donc imaginer que dans des situations de fort
biais du XCI, l’allèle exprimé majoritairement dans le thymus est incapable de rendre les
lymphocytes T tolérant vis-à-vis des épitopes de la PLP exprimée dans le SNC.
L’autre hypothèse repose sur le fait que le chromosome X contient de
nombreux gènes ayant une fonction dans le développement du système immunitaire ou la
mise en place d’une réponse immune. Des mutations contenues dans certains de ces gènes ont
déjà été directement impliquées dans le développement de maladies auto-immunes [Molina et
al., 2006]. C’est par exemple le cas du gène FOXP3 pour lequel des mutations peuvent
conduire à l’apparition de désordres auto-immuns tels l’IPEX [Gambineri et al., 2003]. Un autre
Introduction
74
exemple est le gène codant pour le ligand du CD40. Des mutations dans ce gène sont
associées à un syndrome d’hyper-IgM ou à des désordres auto-immuns [Gulino et al., 2003]. Des
forts biais du XCI forcent le système immunitaire à exprimer majoritairement un seul allèle
des gènes. L’hypothèse serait que certains allèles peuvent conduire à un système immunitaire
moins tolérant vis-à-vis des antigènes du soi, ce qui autoriserait le développement d’une
réponse auto-immune.
e. Monosomie ou perte du chromosome X
En plus du phénomène épigénétique du XCI, les cellules d’une femme peuvent
présenter une perte d’un des deux chromosomes X. On parle alors de monosomie du
chromosome X. Le chromosome X éliminé par la cellule n’est pas choisi au hasard car c’est
toujours le chromosome X inactif qui est éliminé [Miozoo et al., 2007]. Par ailleurs, le
pourcentage de cellules sanguines présentant une monosomie du chromosome X n’est pas
stable car il tend à augmenter lentement avec l’âge. Ainsi, alors que des femmes pré-pubères
possèdent dans leur sang 1,5 à 2,5% des cellules sanguines ayant un seul chromosome X, des
femmes plus âgées peuvent présenter une monosomie du chromosome X dans 5% de leurs
cellules sanguines [Guttenbach et al., 1995]. En 2004, pour la première fois, Invernizzi et al.
démontrèrent une augmentation significative de la proportion de cellules sanguines présentant
une monosomie du chromosome X chez les patients souffrant d’une maladie auto-immune, la
cirrhose biliaire primitive, comparé à des témoins (5% vs 2,8%) [Invernizzi et al., 2004]. Cette
monosomie du chromosome X n’était pas un artéfact reposant sur la présence de cellules
mâles contaminantes (micro-chimérisme présent dans le sang de femmes ayant accouché d’un
garçon) car aucun chromosome Y n’était détecté dans les cellules ne possédant qu’un seul
chromosome X [Invernizzi et al., 2004]. Par ailleurs, les cellules composant le système
immunitaire adaptatif semblaient plus affectées par cette monosomie du chromosome X que
les cellules du système immunitaire inné [Invernizzi et al., 2004]. Des résultats similaires furent
obtenus pour deux autres maladies auto-immunes connues pour présenter un biais dans le
XCI : la thyroïdite auto-immune et la sclérodermie. En effet, les cellules monosomiques pour
le chromosome X étaient plus nombreuses chez les femmes souffrant de l’une de ces maladies
(6,2% pour la thyroïdite auto-immune et 4,3% pour la sclérodermie) comparé à une
population témoin (2,9%) [Invernizzi et al., 2005]. Il fut retrouvé que les cellules du système
immunitaire adaptatif étaient plus touchées par la monosomie du chromosome X que les
Introduction
75
cellules du système immunitaire inné [Invernizzi et al., 2005]. Bien qu’une proportion plus
importante de cellules présentant une monosomie du chromosome X soit retrouvée dans le
sang de patients souffrant d’une de ces maladies, aucun mécanisme pouvant expliquer une
plus forte susceptibilité ne fut proposé ou testé. Les auteurs suggérèrent l’effet éventuel d’une
haplo-insuffisance des gènes portés par le chromosome X sur une susceptibilité accrue aux
maladies auto-immunes. Cependant, ce phénomène de monosomie du chromosome X ne peut
pas être généralisé à toutes les maladies auto-immunes puisque d’autres études démontrèrent
que ce phénomène n’était pas plus marqué chez les patients souffrant de lupus érythémateux
systémique [Invernizzi et al. 2007]. Jusqu’à aujourd’hui, l’implication du phénomène de délétion
du chromosome X dans la SEP n’a jamais été évaluée.
Introduction
76
Introduction
77
III. Traitement et pharmacogénétique de la sclérose en plaques
Avant 1995, aucune molécule n’avait reçu d’accréditation pour le traitement de la SEP
[Compston et al., 2008]. L’autorisation de mise sur le marché de la première molécule eu un
impact significatif sur le patient en améliorant sa qualité de vie. La première ligne de
traitement s’appuya tout d’abord sur des molécules immuno-modulatrices (IFNβ, acétate de
glatiramère) au spectre d’action large. Aujourd’hui encore, malgré une efficacité modérée, ces
molécules sont majoritairement utilisées dans le traitement de la SEP. Cela principalement à
cause d’une balance bénéfice/risque largement en leur faveur. Cependant, les connaissances
scientifiques actuelles sur les mécanismes impliqués dans la pathogénie de la maladie ont
permis d’envisager de nouvelles cibles biologiques. Ainsi, de nombreuses molécules
thérapeutiques à l’action plus restreinte et plus efficace sont actuellement en développement.
Le natalizumab fait partie de ces nouvelles molécules.
III.1. Les traitements de fond disponibles en 2009
A l’heure actuelle, 6 agents sont utilisés dans le traitement des formes RR-MS de SEP
: 3 préparations différentes d’IFNβ (Betaferon®, Avonex® et Rebif®), l’acétate de glatiramère
(Copaxone®), l’anticorps monoclonal natalizumab (Tysabri®) et enfin la mitoxantrone
(Elsep®).
I II.1.1. L’interféron bêta
L’IFNβ a démontré son efficacité dans de nombreux essais cliniques. C’est en 1995
que cette molécule obtint une autorisation de mise sur le marché pour le traitement des formes
RR-MS de SEP. A l’heure actuelle, il existe 3 formulations différentes d’IFNβ qui sont les
suivantes : l’IFNβ-1b injecté en sous-cutané (Betaferon®), l’IFNβ-1a injecté en
intramusculaire (Avonex®) et l’IFNβ-1a injecté en sous-cutané (Rebif®).
Une étude multicentrique se proposa d’évaluer l’effet de l’injection sous-cutanée
d’IFNβ-1b à deux doses différentes (1,6 et 8 millions d’unités) comparé à un placebo [IFNβ MS
Study group,1995]. Les deux doses d’IFNβ-1a réduisèrent le nombre de poussées, avec un effet
plus prononcé pour le plus fort dosage (taux annuel moyen de poussées : 1,22 et 0,96 pour 1,6
Introduction
78
et 8 millions d’unités respectivement), par rapport au placebo (1,44) dès la première année, ce
qui correspond à une réduction de 33% pour la plus forte dose. Cette étude démontra ainsi un
effet dose de l’IFNβ dans le traitement de la maladie. Cet effet bénéfique sur l’évolution de la
maladie était maintenu jusqu’à la 5ème année mais sans atteindre une significativité statistique
(certainement dû à la forte diminution de l’effectif de patients ayant poursuivi l’étude). De
plus, une absence d’évolutivité des signes radiologiques de la maladie fut perçue suite à
l’administration d’IFNβ-1b. Enfin, la plus forte dose d’IFNβ-1b démontra un effet bénéfique
sur la progression du handicap, un effet n’atteignant toutefois pas la significativité statistique.
Une étude similaire fut conduite afin d’apprécier l’effet d’un traitement par l’IFNβ-1a
injecté en intramusculaire, chaque semaine, à 6 millions d’unités [Jacobs et al., 1996]. Ce travail
fut arrêté plus tôt que prévu car seulement 57% des patients complétèrent les 2 ans de suivi.
Cependant, une estimation du pourcentage de patients présentant une progression du handicap
suggéra un effet bénéfique de l’IFNβ-1a (21,9%) par rapport au placebo (34,9%). Par ailleurs,
il fut observé une baisse significative du nombre de poussées annuelles d’environ 20% pour
l’IFN β-1a par rapport au placebo (taux annuel moyen de poussées : 0,82 contre 0,67). Une
nouvelle analyse des données, réalisée avec des critères cliniques plus stricts, montra un effet
bénéfique robuste de l’IFNβ-1a sur la progression du handicap dans la SEP [Rudick et al., 1997].
Par ailleurs, le traitement par IFNβ-1a démontra une efficacité sur les lésions présentes dans
le SNC. En effet, il fut observé, par IRM, une réduction du nombre et du volume des lésions
inflammatoires dans le SNC des patients traités par IFNβ-1a comparé au placebo [Simon et al.,
1998].
Enfin, l’efficacité de la dernière formulation d’IFNβ fut étudiée sur deux ans. Le
traitement reposait sur une injection sous-cutanée, trois fois par semaine, d’IFNβ-1a à deux
doses, 6 et 12 millions d’unités [PRISM, 1998]. La plus forte dose d’IFNβ-1a réduisit de 33% le
nombre moyen de poussées par rapport au placebo (taux annuel moyen de poussées : 1,73
contre 2,56). De plus, des améliorations furent observées sur le plan radiologique suite à
l’administration d’IFNβ-1a comparé au placebo [Li et al., 1999]. Après deux ans de traitement,
le nombre de lésions actives était lui aussi diminué (réduction de 67% et 78% pour 6 et 12
millions d’unités respectivement).
Alors que l’efficacité de l’IFNβ dans le traitement des formes RR-MS de SEP est
largement démontrée, son efficacité dans les formes SP-MS semble beaucoup moins évidente
[Kappos et al., 2004]. Il semblerait que le traitement par l’IFNβ soit efficace uniquement au
Introduction
79
début de la conversion de la forme RR-MS vers la forme SP-MS, c'est-à-dire au moment où la
maladie présente encore une activité inflammatoire. L’utilité de l’IFNβ chez les patients ayant
une forme SP-MS ne présentant plus de poussées est encore incertaine [Kieseier et al., 2008].
Cependant, l’avantage du traitement par l’IFNβ est que cette molécule entraîne des effets
secondaires généralement peu importants et ne nécessitant pas l’arrêt du traitement. Les effets
secondaires majoritairement rencontrés sont des syndromes pseudo-grippaux et des réactions
inflammatoires au site d’injection. Nous reviendrons sur les mécanismes d’action de cette
molécule dans le traitement de la SEP au prochain chapître.
III.1.2. L’acétate de glatiramère
L’acétate de glatiramère (GA) est un polypeptide synthétique, de masse moléculaire
comprise entre 4 700 et 11 000 Da, composé d’une succession aléatoire de 4 acides aminés
(L-glutamate, L-lysine, L-alanine et L-tyrosine) au ratio moléculaire de 4,2 : 3,4 : 1,4 : 1,0
[Schrempf et al., 2007]. Ce copolymère fut découvert en 1960 lors d’études sur les propriétés
immunologiques de copolymères développés pour mimer la MBP. Le copolymère 1,
maintenant connu sous le nom de GA, n’induisait pas d’EAE chez l’animal. Au contraire, il
prévenait et diminuait la sévérité de la maladie. En 1991, la production du GA fut
standardisée et c’est en 1996 que la molécule fut approuvée par la FDA dans le traitement des
formes RR-MS de SEP. Le traitement de la SEP par le GA consiste en des injections sous-
cutanées quotidiennes de 20 mg de GA.
Une importante étude multicentrique suivit, pendant au moins 2 ans, des patients SEP
traités par du GA afin de comparer son effet à un placebo [Johnson et al., 1998]. Il fut alors
prouvé que le GA diminuait significativement le nombre de poussées (29%) mais n’avait que
peu d’effet sur la progression du handicap. Par ailleurs, cette amélioration clinique corrélait
avec une réduction de l’inflammation, évaluée par IRM, dans le SNC des patients [Comi et al.,
2001]. En effet, l’imagerie révéla une diminution plus importante du nombre de lésions chez
les patients traités au GA par rapport à ceux traités avec le placebo (diminution de 29%). Ceci
fut renforcé par l’observation d’une réduction de l’étendue des lésions et de leur émergence.
De manière intéressante, l’effet bénéfique conféré par le traitement au GA n’est pas détectable
dès la mise en place du traitement mais 6 mois après environ. Cet effet bénéfique du GA sur
lésions du SNC fut confirmé par une autre étude qui démontra que le changement d’un
traitement initial placebo par un traitement à base de GA réduisait les signes radiologiques de
Introduction
80
la maladie [Wolinsky et al., 2002]. Enfin, une équipe publia récement les résultats du suivi sur 22
ans de patients SEP traités au GA [Miller et al., 2008a]. Cette étude confirma que le traitement
par le GA diminuait la progression du handicap ainsi que le nombre de poussées. De plus, elle
permit d’apprécier la sureté du produit. Le GA est une molécule généralement bien supportée
par le patient entraînant toutefois des réactions au site d’injection (rougeur, gonflement).
Le traitement de la SEP par le GA est une approche thérapeutique basée sur
l’utilisation d’antigènes. Bien qu’aujourd’hui encore le mécanisme d’action du GA ne soit pas
très bien compris, cette molécule agit préférentiellement sur le système immunitaire à
plusieurs niveaux :
(1) Sur les APC. Le GA, initialement synthétisé pour mimer la MBP, entre en
compétition avec cette dernière pour la fixation au CMH à la surface des APC [Fridkis-
Hareli et al., 1994]. Cette compétition a pour conséquence d’empêcher l’activation des
lymphocytes auto-réactifs spécifiques de la MBP [Gran et al., 2000]. Cependant, le GA a
la capacité d’inhiber des maladies auto-immunes expérimentales autres que l’EAE ce
qui suggère l’existence de mécanismes d’action supplémentaires. Le GA peut
notamment moduler profondément la production de cytokines par les macrophages et
les cellules dendritiques [Jung et al., 2004]. Cette molécule, qui induit la sécrétion d’IL-
10, entraîne indirectement une suppression de la sécrétion du TNFα (molécule pro-
inflammatoire) par les macrophages et les cellules dendritiques. Cette modulation des
cytokines sécrétées peut orienter la réponse immunitaire vers une réponse anti-
inflammatoire bénéfique dans l’évolution de la SEP.
(2) Sur les lymphocytes T (Figure 29). Le GA favorise la différenciation des
lymphocytes T vers un profil Th2 et donc l’orientation vers une réponse anti-
inflammatoire [Duda et al., 2000]. Par ailleurs, 10% des lymphocytes spécifiques pour le
GA reconnaissent aussi la MBP. Les cellules spécifiques du GA, après reconnaissance
de la MBP, ne proliférèrent pas mais sécrètent de l’IL-4 ou de l’IFNγ en faible
quantité [Neuhaus et al., 2000]. L’hypothèse serait que les cellules spécifiques du GA
sont activées en périphérie puis migrent vers le SNC où elles entrent en contact avec la
MBP ce qui déclenche leur production de cytokines immuno-modulatrices. Par
ailleurs, une étude suggéra que le GA pouvait exercer un effet régulateur sur les
lymphocytes T périphériques par un mécanisme pro-apoptotique [Ruggieri et al., 2006].
En effet, un ratio Bax/Bcl-2 à orientation pro-apoptotique fut retrouvé dans les
PBMCs de patients SEP sous traitement GA. Ce mécanisme pourrait expliquer, du
Introduction
81
moins en partie, la déplétion en cellules Th1 pro-inflammatoires observée chez les
patients SEP traités par GA. Enfin, les cellules T réactives pour le GA peuvent
sécréter du BDNF (pour brain-derived neurotrophic factor ). Cette molécule,
appartenant à la famille des neurotrophines, confère aux cellules la produisant un rôle
neuroprotecteur [Aharoni et al., 2003]. Le BDNF sécrété peut empêcher la
dégénérescence neuronale mais aussi favoriser la remyélinisation et la croissance
axonale.
Figure 29 : Représentation schématique du mécanisme proposé pour expliquer l’effet immuno-modulateur de
l’acétate de glatiramère. D’après Blanchette et al., J. Neurol., 2008.
I II.1.3. L’anticorps monoclonal natalizumab
Le natalizumab fait partie de ces nouveaux traitements utilisés dans la SEP qui ont une
action très spécifique. Le natalizumab est un anticorps recombinant humanisé dirigé contre
une intégrine présente à la surface des leucocytes (Figure 30). Autorisé aux Etats-Unis en
novembre 2004, le natalizumab fut rapidement retiré du marché en février 2005 après que 2
patients aient développé une leucoencéphalopathie multifocale progressive (LEMP). En
2006, cet anticorps fut de nouveau autorisé aux Etats-Unis et en Europe dans le traitement des
formes RR-MS chez les patients ne tolérant pas les immuno-modulateurs traditionnels
[DeAngelis et al., 2008].
Le traitement par natalizumab consiste en des injections intraveineuses mensuelles de
l’anticorps. Deux études cliniques de phase III, l’étude AFFIRM [Polman et al., 2006] et l’étude
SENTINEL [Rudick et al., 2006], confirmèrent l’excellente efficacité du natalizumab dans le
Introduction
82
traitement des formes RR-MS. Le natalizumab diminuait significativement la progression du
handicap, mais aussi le taux annuel de poussées de 68%. Le nombre de patients n’ayant pas
présenté de poussées était plus important dans le groupe traité par le natalizumab que dans le
groupe traité avec le placebo (77% contre 56%). Par ailleurs, sur 2 ans, cet anticorps réduisait
de 83% l’apparition de nouvelles lésions dans le SNC et de 92% l’apparition de lésions
inflammatoires par rapport au placebo [Polman et al., 2006]. Des résultats cliniques et
radiologiques comparables furent obtenus avec la thérapie combinant l’IFNβ et le
natalizumab [Rudick et al., 2006]. Par ailleurs, il fut confirmé que la thérapie par ces deux agents
était plus efficace qu’une monothérapie par IFNβ.
Le natalizumab est dirigé contre la chaîne alpha 4 de l’intégrine α4β1, connue aussi
sous le nom de VLA-4 (pour Very Late Activating antigen-4) et exprimée à la surface de
tous les leucocytes (excepté les neutrophiles) [Rommer et al., 2008]. Cet anticorps n’est pas un
anticorps déplétant mais il empêche l’interaction de VLA-4 avec ses ligands. Les ligands
connus de VLA-4 sont VCAM-1 (pour Vascular Cell Adhesion Molecule-1) et la
fibronectine présents à la surface des vaisseaux sanguins. Ces molécules de surface
interviennent dans le mécanisme de sortie de la circulation sanguine des leucocytes. Ainsi,
dans la SEP, le natalizumab empêcherait la migration des leucocytes du sang périphérique
vers le SNC, via la BBB [Stüve et al., 2008]. En effet, une étude démontra une diminution du
nombre de leucocytes (lymphocytes T CD4+, T CD8+, lymphocytes B et plasmocytes) dans
le LCR de patients SEP traités par natalizumab par rapport à des patients SEP non traités
[Stüve et al., 2006]. Par ailleurs, il fut observé une augmentation du nombre de lymphocytes dans
le sang des patients traités, un nombre qui diminuait lentement au cours des mois suivant
l’arrêt du traitement.
Le traitement par natalizumab semble être relativement bien toléré puisque chez la
majorité des patients, peu d’effets délétères sont observés. Cependant, trois cas graves de
LEMP furent rapportés dans des études cliniques de phase III. Ces cas correspondaient à deux
patients SEP traités par l’immuno-modulateur IFNβ en combinaison avec le natalizumab
[Kleinschmidt et al., 2005 ; Langer-Gould et al., 2005], et à un patient souffrant de la maladie de
Crohn sous traitement par natalizumab en combinaison avec des immunosuppresseurs [Van
Assche et al., 2005]. Deux des trois cas de LEMP se révélèrent mortels. La LEMP est une
maladie rare causée par le virus JC appartenant à la famille des Polyomavirus. Cette maladie a
pour particularité de se développer chez des personnes immuno-déprimées, telles que des
personnes infectées par le VIH ou sous traitement immuno-suppresseur. L’apparition de cas
Introduction
83
de LEMP dans le traitement par natalizumab fut mise sur le compte d’une
immunosuppression locale du SNC conférée par l’anticorps. Cependant, cette association ne
put être clairement démontrée. A l’heure actuelle, 9 nouveaux cas de LEMP ont été rapportés
au cours d’un traitement de la SEP par natalizumab. On estime que le risque est de 1,2/10 000
patients traités.
Figure 30 : Les différents types d’anticorps monoclonaux utilisés en thérapie. La partie animale (noire)
composant l’anticorps passe de 100% (souris), à 25% (chimérique), puis à 3% (humanisé) et 0% (humain).
D’après Rommer et al., J. Neurol., 2008.
I II.1.4. La mitoxantrone
Initialement, la mitoxantrone (MTX ) était utilisée dans le traitement de divers
cancers (leucémies, lymphomes, cancers du sein…). Depuis 2000, la MTX est la seule
molécule approuvée aux Etats-Unis et dans certains pays européens comme traitement des
formes progressives de SEP (PP-MS et SP-MS) et des formes à poussées (RR-MS) évoluant
rapidement [Fox et al., 2006]. La MTX est un immunosuppresseur dérivé de l’anthracycline qui
s’insère dans l’ADN par des liaisons hydrogènes, ce qui a pour conséquence de conduire à des
repliements et à des cassures de l’ADN.
Plusieurs études cliniques, réalisées à différentes phases du processus d’autorisation de
la MTX comme traitement de la SEP, confirment son efficacité. Une étude de phase III,
réalisée sur une période de 2 ans, se proposa de tester l’efficacité de l’injection trimestrielle de
MTX, à la concentration de 5 ou 12 mg/m2, par rapport à un placebo [Hartung et al., 2002].
L’injection de MTX améliora sensiblement l’évolution globale de la SEP par rapport au
placebo. Une efficacité accrue fut observée pour la concentration de 12 mg/m2. Seul 8% des
patients traités par la MTX à 12 mg/m2 présentaient une augmentation d’au moins 1 point à
l’EDSS contre 25% chez les patients traités avec le placebo. De plus, 57% et 36% des patients
traités respectivement par la MTX à 12 mg/m2 ou par le placebo ne développaient pas de
poussées. L’observation radiologique indiqua que la MTX diminuait le nombre de lésions
Introduction
84
présentes dans le SNC par rapport au placebo [Krapf et al., 2005]. Par ailleurs, en fonction de
l’analyse pratiquée, il fut observé de manière significative ou non, une diminution du nombre
de lésions inflammatoires. L’efficacité de cette molécule fut prouvée à la fois dans le
traitement des formes RR-MS agressives, et dans celui des formes SP-MS. Il fut également
suggéré que l’effet bénéfique de la MTX persistait pendant 12 mois après l’arrêt du
traitement.
La MTX est un immunosuppresseur qui agit sur une longue période de temps. In vitro,
la MTX inhibe la maturation des cellules dendritiques et la prolifération des lymphocytes
activés. Ce mécanisme semble principalement être la conséquence de l’apoptose induite par la
MTX sur les cellules dendritiques, les lymphocytes T et les lymphocytes B [Neuhaus et al.,
2005]. Par ailleurs, un autre mécanisme d’action de la MTX serait d’inhiber les capacités
migratoires des lymphocytes T CD4+, des T CD8+ et des monocytes. Ainsi, la MTX
inhiberait l’expression de métalloprotéases par ces cellules inflammatoires ce qui empêcherait
leur entrée dans le SNC et leur migration à l’intérieur du tissu [Kopadze et al., 2006]..
Cependant, le traitement par la MTX n’est pas sans danger. En effet, cette molécule est
séquestrée dans les tissus profonds et s’y accumule. Bien qu’elle soit lentement relâchée dans
la circulation sanguine pendant la phase terminale de son élimination, la MTX est moins
concentrée dans le sang que dans les tissus [Fox et al., 2006]. L’utilisation de la MTX présente
des risques délétères cumulés tels que des risques d’infections et cardiaques augmentés. En
effet, des patients ayant reçu une dose cumulative de MTX inférieure à 100 mg/m2 ont moins
de risque d’avoir des dysfonctions cardiaques (mesuré par la fraction d’éjection ventriculaire)
que des patients ayant dépassé ce seuil (pourcentage de risque égal à 1,8% pour moins de 100
mg/m2 par rapport à 5% pour plus de 100 mg/m2) [Ghalie et al., 2002]. Même si, dans cette
étude, l’analyse statistique par régression ne démontra pas de relation significative entre la
quantité de MTX accumulée et l’incidence des dysfonctions cardiaques, il est aujourd’hui
conseillé de ne pas dépasser une dose cumulative de MTX équivalente à 140 mg/m2, ou une
durée de traitement supérieure à 3 ans [Fox et al., 2006]. Par ailleurs, cette molécule peut
entraîner l’apparition d’aménorrhées secondaires, souvent définitives, chez les femmes de
plus de 35 ans ainsi que l’apparition de leucémies.
Introduction
85
III.2. Comparaison de l’efficacité des thérapies actuelles
Jusqu’à récemment, il n’existait pas d’étude, réalisée sur au moins deux ans en
conditions strictes, qui comparait l’effet des 6 traitements actuels entre eux. Ce n’est que
dernièrement que deux études, REGARD et BECOME, ont fourni des données comparatives
entre l’efficacité de l’IFNβ et du GA.
L’étude REGARD compara l’efficacité de l’injection sous-cutanée d’IFNβ-1a par
rapport au traitement par GA dans le traitement des formes RR-MS [Mikol et al., 2008]. Sur le
plan clinique, il ne fut mis en évidence aucune différence significative d’efficacité entre les
deux traitements (délai avant la première poussée, pourcentage de patients sans poussées, taux
annuel de poussées et progression du handicap). Cependant, sur le plan radiologique, le
nombre moyen de lésions actives était supérieur chez les patients traités par le GA par rapport
à ceux traités à l’IFNβ-1a (avec des chiffres respectifs de 0,41 et 0,26). De même, le
pourcentage de patients ne présentant pas de lésions inflammatoires actives était plus
important chez les patients traités par l’IFNβ-1a par rapport aux patients traités par le GA
(81% et 67% respectivement). Enfin une mesure combinée des lésions actives (lésions
positives au gadolinium + nouvelles lésions visibles en séquence T2) démontra aussi une
efficacité supérieure de l’IFNβ-1a par rapport au GA. Cependant, tous les paramètres
radiologiques étudiés ne présentaient pas de différences significatives entre les deux
groupes tels que le nombre de lésions hypo-intenses en séquence T1 (0,23 contre 0,24 pour
l’IFN β-1a et le GA respectivement) et le nombre de lésions hyperintenses en séquence T2
(0,67 pour l’IFNβ-1a contre 0,82 pour le GA). Enfin, aucun des deux traitements ne semblait
mieux toléré que l’autre puisque le nombre et la sévérité des effets secondaires étaient
comparables.
La deuxième étude comparative, portant le nom de BECOME, compara l’efficacité de
l’IFN β-1b injecté par voie intramusculaire à celle du GA [Cadavid et al., 2009]. Cette étude
s’appuya principalement sur une analyse radiologique. Bien que l’étude REGARD identifia
une légère différence dans les mesures radiologiques en faveur de l’IFNβ, l’étude BECOME
ne parvint pas à mettre en évidence de différences significatives. En effet, l’analyse combinée
des lésions actives et des nouvelles lésions inflammatoires ne démontra pas une efficacité
supérieure d’un des deux traitements. Par ailleurs, sur des critères cliniques, l’IFNβ-1b et le
GA, ne présentèrent là aussi pas de différence d’efficacité avec un nombre moyen de poussées
annuelles comparable (0,37 pour l’IFNβ-1b et 0,33 pour le GA).
Introduction
86
On peut donc dire que les trois formulations d’IFNβ et le GA ont une efficacité
comparable avec une diminution du nombre de poussées annuelles de 30%. Ainsi, le choix
parmi la première ligne de molécules disponibles pour le traitement de la SEP devra se faire
en prenant en considération l’aspect pratique de chaque traitement (type et fréquence
d’injection) et les effets secondaires respectifs, sans tenir compte de la différence d’efficacité
qui, si elle existe, est vraiment très faible [Fox et al., 2009]. A l’opposé, le natalizumab et la
MTX sont des traitements beaucoup plus efficaces mais ayant des effets secondaires
sensiblement plus importants (pour le natalizumab et la MTX), voire incompatibles avec un
traitement de longue durée (pour la MTX). Cependant, bien que tous ces traitements
diminuent le nombre de poussées, ils sont peu efficaces sur la progression de la maladie à
cause d’au moins deux paramètres [Lopez-Diego et al., 2008] :
(1) ces molécules affectent les effecteurs inflammatoires du système immunitaire
adaptatif qui prédominent pendant la phase de poussées de la maladie. Cependant, leur
effet est limité sur la régulation des fonctions du système immunitaire inné.
(2) ces molécules n’ont pas d’effet significatif sur la neuro-dégénérescence qui touche
le SNC des patients SEP. Or, la neuro-dégénérescence est directement impliquée dans
l’apparition des handicaps fonctionnels qui se développent durant la phase progressive
de la maladie. Ainsi, ces molécules n’ont pas d’effet bénéfique dans le traitement des
formes PP-MS et SP-MS, où la maladie progresse non pas par inflammation mais par
une neuro-dégénérescence [Kieseier et al., 2008].
III.3. Optimisation des traitements existants
Avant la mise sur le marché du natalizumab, les praticiens ne disposaient pas de
molécules plus efficaces que les immuno-modulateurs pour le traitement de la SEP. La seule
approche pour améliorer les traitements consistait à modifier la prescription des thérapies
existantes. Cela se traduisit par des changements de posologie ou par des combinaisons de
plusieurs molécules.
Des chercheurs se proposèrent d’étudier l’influence de la dose sur l’efficacité du
traitement. Dans le traitement de la SEP par le GA, la dose quotidienne de 20 mg est la dose
actuellement préconisée pour sa sureté et son efficacité. Cohen et al.évaluèrent l’efficacité
conférée par l’injection du double de la dose préconisée, soit 40 mg [Cohen et al., 2007]. Ils
démontrèrent que l’efficacité du traitement était plus importante dans le groupe recevant la
Introduction
87
plus forte dose. Le pourcentage de patients sans poussées était augmenté dans le groupe « 40
mg » par rapport au groupe « 20 mg » (76,1% et 52,3% respectivement). Le délai d’apparition
de la première poussée était aussi retardé (213 jours contre 80 jours). Par ailleurs, le nombre
de lésions actives était, dès le 3ème mois, plus fortement diminué dans le groupe recevant 40
mg de GA.
Comme la SEP implique plusieurs processus biologiques hétérogènes, il fut proposé
d’associer plusieurs molécules dans un même traitement [Gold et al., 2008]. Pour espérer obtenir
un effet synergique ou additif, les molécules doivent avoir des mécanismes d’action uniques
[DeAngelis et al., 2008b]. L’approche par multi-thérapie fut suggérée pour traiter les formes très
agressives de SEP et/ou résistantes aux traitements couramment utilisés. Les deux immuno-
modulateurs, l’IFNβ et le GA, utilisés en première ligne dans le traitement de la SEP ont des
mécanismes d’action différents. Leur association dans une même thérapie parut donc
évidente. Cependant, une étude pratiquée sur le modèle animal de la SEP signala une
interaction délétère entre les deux molécules [Brod et al., 2000]. En effet, alors que la
monothérapie à base d’IFNs de type 1 ou de GA conférait une amélioration des signes
cliniques, la combinaison des deux molécules dans une même thérapie était beaucoup moins
efficace avec des scores cliniques presque deux fois plus mauvais. Par ailleurs, chez
l’Homme, une étude préliminaire réalisée sur un petit groupe de patients SEP montra que la
combinaison de l’IFNβ avec le GA n’était pas plus efficace qu’une monothérapie standard
[Ytterberg et al., 2007]. L’autre combinaison possible est d’associer l’IFNβ, ou le GA, avec la
MTX. La monothérapie par MTX ne peut pas être maintenue sur de longues périodes à cause
de sa cardio-toxicité. Ramtahal et al. évaluèrent l’effet d’un prétraitement par MTX, suivi
d’un traitement à base de GA introduit lorsque les patients ne présentaient plus de poussées ni
d’augmentation d’EDSS depuis 6 mois. Ces patients souffraient de formes RR-MS très
agressives [Ramtahal et al., 2006]. Il fut observé une réduction du nombre de poussées annuelles
(d’un nombre moyen de 2,7 avant traitement à un nombre de 0,16 après traitement) et une
stabilisation, voire une amélioration du handicap maintenue en moyenne 36 mois après le
début du traitement. En revanche, un autre travail ne parvint pas à prouver une meilleure
efficacité d’un traitement successif de MTX puis de GA par rapport à une monothérapie au
GA sur l’ensemble des critères cliniques et IRM [Vollmer et al., 2008]. Cependant, même si le
nombre moyen de poussées annuelles et l’évolution de l’EDSS étaient comparables entre les
deux groupes, il fut observé une meilleure évolution des lésions inflammatoires et des lésions
visibles en séquences T1 et T2 dans le groupe sous bithérapie [Arnold et al., 2008 ;Vollmer et al.,
Introduction
88
2008]. Une approche similaire consiste à prétraiter avec de la MTX puis à poursuivre le
traitement par de l’IFNβ. Un travail rétrospectif, mené sur les formes agressives de RR-MS,
démontra que la MTX, en prétraitement ou en combinaison avec l’IFNβ, avait un effet
bénéfique sur l’évolution du handicap et sur les poussées [Zaffaroni et al., 2008]. Par ailleurs, les
résultats d’une étude reposant sur le suivi de patients SEP pendant 3 ans allèrent dans le sens
d’une meilleure efficacité de l’IFNβ chez les patients prétraités par MTX par rapport à une
monothérapie par IFNβ (avec des nombres moyens de poussées annuelles respectifs de 0,44 et
1,14) [Edan et al., 2007 ; DeAngelis et al., 2008].
III.4. Les nouveaux traitements en cours de développement
Les avancées scientifiques et une meilleure compréhension de l’étiologie de la SEP
ont fourni des pistes dans le développement de nouvelles thérapies. Alors que les traitements
existants ont une action large sur le système immunitaire (mis à part le natalizumab) les
nouveaux traitements devraient avoir une action beaucoup plus ciblée. Ces nouvelles
molécules, encore en cours de développement pour la majorité d’entre elles, se proposent de
cibler divers mécanismes comme :
(1) La circulation des cellules immunitaires dans l’organisme. Les leucocytes dans
leur recherche d’agents pathogènes, contrôlent l’intégrité de l’organisme en circulant
dans l’ensemble des tissus. Ainsi, les poussées et l’apparition de nouvelles lésions
dans le SNC sont associées à une infiltration active de lymphocytes auto-réactifs et de
monocytes. Une approche thérapeutique dans la SEP serait de bloquer la circulation
des leucocytes ou la migration vers le SNC par franchisement de la BBB. C’est dans
cet objectif que le natalizumab, nouvel agent thérapeutique utilisé en clinique, a été
développé. Un immunosuppresseur oral est en cours de développement : le FTY720
ou fingolimod. Cet analogue synthétique est un agoniste du récepteur à la sphingosine
1 phosphate (S1P). Le S1PR est exprimé à la surface des lymphocytes et permet, en
interagissant avec le S1P, la sortie des lymphocytes T activés hors des tissus
lymphoïdes secondaires [Cyster et al., 2005]. Le fingolimod, en interagissant avec le
S1PR, conduit à son internalisation. Les lymphocytes sont donc séquestrés dans les
glanglions, ce qui entraîne une lymphopénie [Cyster et al., 2005]. Par ailleurs, cette
molécule semble être moins efficace dans la séquestration des lymphocytes T
régulateurs CD4+ CD25+, ce qui induit une augmentation du ratio des cellules
Introduction
89
régulatrices dans le sang. D’ailleurs une amélioration des fonctions régulatrices a été
observée [Sawicka et al., 2005 ; Daniel et al., 2007]. De plus cette molécule, en mimant
l’effet du S1P, pourrait avoir une action plus large notamment en activant les cellules
dendritiques de sorte à ce qu’elles orientent les lymphocytes T vers une polarisation
Th2 [Idzko et al., 2002]. Cette molécule pourrait aussi activer les cellules neurales
comme les astrocytes [Pebay et al., 2001]. Un essai clinique de phase II réalisé par
Kappos et al. démontra qu’une prise orale quotidienne de fingolimod avait un effet
positif dans le traitement des formes RR-MS [Kappos et al., 2006]. Après 6 mois de
traitement, il fut observé une diminution de l’inflammation du SNC chez les personnes
traitées (1 ou 3 lésions actives pour respectivement 1,25 mg et 5 mg de fingolimod)
par rapport au placebo (5 lésions), ainsi qu’une diminution du nombre moyen de
poussées annuelles (0,35 et 0,04 pour respectivement 1,25 mg et 5 mg de fingolimod,
contre 0,77 pour le placebo).
(2) Cibler spécifiquement les cellules immunitaires dans leurs fonctions ou leur
activation. Les lymphocytes sont les cellules majoritairement représentées dans les
lésions démyélinisantes actives. L’IL-2 est le principal facteur de croissance des
lymphocytes T activés. Cette cytokine stimule à la fois leur expansion et leur
maturation. Bien que le récepteur à l’IL-2 soit, à l’état basal, faiblement exprimé à la
surface des lymphocytes T, l’activation de ces cellules conduit à sa surexpression. Le
récepteur à l’IL-2 est composé de 3 sous-unités, dont la chaîne alpha (ou CD25) qui a
été retrouvée comme associée à la susceptibilité à la SEP [Hafler et al., 2007]. Un
anticorps humanisé dirigé contre l’IL2-Rα fut testé dans le traitement de la SEP
[Bielekova et al., 2004]. Cet anticorps, appelé daclizumab, démontra son efficacité chez
des patients souffrant d’une SEP particulièrement active et résistante à des traitements
à base d’IFNβ. Chez ces patients traités, il fut observé une diminution importante
(78%) de l’inflammation du SNC ainsi qu’une amélioration des signes cliniques.
Cependant, le mécanisme d’action du daclizumab ne semble pas être celui imaginé. En
effet, la molécule ne semble pas directement inhiber l’activation des lymphocytes T,
mais agirait plutôt sur des cellules NK exprimant fortement le récepteur CD56 à leur
surface [Bielekova et al., 2006]. Ce sont ces cellules NK qui inhiberaient les lymphocytes
T présents dans les lésions inflammatoires. Par ailleurs, les auteurs suggérèrent le
possible effet du daclizumab sur les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ sans le
démontrer. Un essai clinique de phase II est en cours pour tester les propriétés de cette
Introduction
90
molécule dans le traitement de la SEP. Les résultats préliminaires laissent penser que
ce traitement est efficace puisqu’il diminue l’apparition et la progression des lésions
inflammatoires actives du SNC [DeAngelis et al., 2008a]. Un certain nombre d’éléments
semblent impliquer les lymphocytes B dans la SEP. Cette implication est visible par la
présence de bandes oligoclonales d’IgG dans le LCR de patients souffrant de SEP.
Certaines de ces IgG sont dirigées contre des composants de la gaine de myéline
[O’Connor et al., 2005]. Un agent ciblant les lymphocytes B parait être une approche
raisonnable dans le traitement de la SEP. Un agent proposé est le rituximab qui est un
anticorps humanisé ciblant l’antigène CD20 exprimé à la surface des cellules pré-B et
des lymphocytes B matures [DeAngelis et al., 2008b]. Une étude clinique de phase II
démontra l’efficacité de cette molécule [Hauser et al., 2008]. En effet, les patients traités
présentaient une diminution significative du nombre total de lésions inflammatoires,
ainsi qu’une réduction d’apparition de nouvelles lésions. Par ailleurs, la proportion de
patients présentant des poussées était moins importante dans le groupe de patients
traités par rituximab que dans le groupe sous placebo.
(3) Cibler la neuro-dégénérescence du SNC. Une dégénérescence axonale, neuronale
et oligodendrocytaire est retrouvée dans les lésions mais aussi dans la substance
blanche d’apparence normale des patients souffrant de SEP. Cette neuro-
dégénérescence semble corréler avec la progression de la maladie, indépendamment
des événements inflammatoires [Lopez-Diego et al., 2008]. Le glutamate semble jouer un
rôle dans cette neuro-dégénérescence, en effet l’activation d’une voie de signalisation
par le glutamate est un mécanisme impliqué dans la neurotoxicité de certaines
pathologies du SNC, comme la SEP [Groom et al., 2003]. Tout d’abord, il fut démontré
une augmentation de la concentration en glutamate dans le LCR de patients SEP par
rapport à des témoins. Cette augmentation était majorée durant les périodes de
poussées de la maladie [Sarchielli et al., 2003]. Les macrophages et les cellules
microgliales, qui colocalisent avec les dommages axonaux, seraient impliquées dans la
forte production de glutamate au niveau des lésions [Werner et al., 2001]. De plus, une
trop forte concentration en glutamate entraîne un excès de signalisation ce qui conduit
à une mort neuronale et oligodendrocytaire. [Matute et al., 2006]. Or, dans la substance
blanche du SNC, les oligodendrocytes sont les cellules responsables de la
détoxification et du maintien d’une concentration sub-toxique en glutamate
extracellulaire. Chez les patients SEP, cette clairance du glutamate extracellulaire par
Introduction
91
les oligodendrocytes semble être défectueuse ce qui peut expliquer l’augmentation du
glutamate observée [Pitt et al., 2003]. La minocyline fut proposée comme agent
thérapeutique contre l’élévation de la concentration en glutamate dans le LCR des
patients SEP. Cette molécule dérivée de la tétracycline présente l’avantage de pouvoir
être administrée par voie orale. De plus cette molécule est sûre puisqu’elle est utilisée
sur de longues périodes pour traiter l’acné. La minocycline fut testée en combinaison
avec les immuno-modulateurs classiquement utilisés dans le traitement de la SEP.
Dans le modèle animal EAE, l’association de la minocycline avec l’IFNβ [Giuliani et
al., 2005a] ou le GA [Giuliani et al., 2005b] entraîna une amélioration significative des
symptômes de la maladie (inflammation moins importante du SNC et perte axonale
moins marquée) comparé à une monothérapie. Un essai clinique préliminaire fut
pratiqué chez l’Homme. Malgré l’inclusion de peu de patients et le suivi sur une
courte période, l’étude révéla que l’ingestion quotidienne de minocycline par voie
orale réduisait l’activité de la maladie chez les patients souffrant de la forme RR-MS
[Metz et al., 2004]. Un autre composé, le riluzole, agissant sur la concentration en
glutamate en empêchant sa libération synaptique, fut proposé dans le traitement de la
SEP. Cette molécule pourrait diminuer l’excitotoxicité ainsi que l’activation et la
transmigration des lymphocytes T activés par le glutamate. Chez l’animal, il a été
montré que la prophylaxie du riluzole sur l’EAE provenait d’une diminution de
l’inflammation du SNC et d’une atténuation de la démyélinisation et de la perte
axonale [Gilgun-Sherki et al., 2003]. Chez l’Homme, les résultats obtenus sur de petites
cohortes de patients sont plus mitigés [Kalkers, 2002 ; Killestein et al., 2005]. Cependant, les
patients choisis présentaient une forme PP-MS qui implique peu la réaction
inflammatoire. Dans ces études, même si l’apparition de « trous noirs » (régions de
forte démyélinisation) était diminuée, le nombre total de lésions visibles en séquence
T2 était inchangé. Ces résultats indiquent que le riluzole agit sur l’évolution de la
lésion et sur la perte axonale, mais ne semble pas avoir d’effet sur la formation de
nouvelles lésions.
Introduction
92
Figures 31 : Les cibles thérapeutiques possibles dans le traitement de la sclérose en plaques. D’après Lopez-
Diego et al., Nat. Rev. Drug. Discov., 2008.
Les avancées récentes dans la compréhension de la pathogénie de la SEP permettent
de cibler de nombreuses voies (Figure 31). Ainsi, devant l’explosion des nouvelles molécules
testées dans le traitement de la SEP, seule une infime partie a pu être traitée dans ce chapître.
De plus, de nouvelles approches non médicamenteuses sont maintenant envisagées. Ces
approches reposent sur l’utilisation de cellules souches qui permettraient soit de réparer les
dommages présents dans le SNC des patients SEP, soit d’éliminer l’ensemble du système
immunitaire du patient, dont les cellules auto-réactives, avant de le reconstituer [Lopez-Diego et
al., 2008].
Introduction
93
III.5. Définition de la réponse au traitement dans la sclérose en plaques
Depuis plusieurs années, il apparaît à la communauté scientifique qu’une seule
molécule n’est pas suffisante pour traiter l’ensemble des patients SEP. La forte hétérogénéité
de la maladie entraîne de fortes différences dans la réponse du patient au traitement. Ainsi, les
praticiens vont devoir progressivement passer de l’idée du traitement d’une maladie vers
l’idée du traitement d’un patient et devoir se tourner vers une médecine personnalisée [Miller et
al., 2008b]. En effet, même si l’IFNβ réduit de 30% en moyenne le nombre de poussées, cette
molécule est peu efficace chez 30% des patients que l’on considère comme mauvais
répondeurs [Tremlett et al., 2003]. A l’heure actuelle, il n’existe aucun moyen de prédire la
réponse du patient à priori. Une telle approche est un réel défi car on ne sait pas encore sur
quels critères cliniques et/ou radiologiques il faut s’appuyer pour caractériser un patient qui
répond bien à son traitement.
III.5.1. Traitement de la sclérose en plaques par une approche d’escalade
thérapeutique
La SEP est une maladie qui touche le jeune adulte et qui ne réduit que faiblement
l’espérance de vie. Ces paramètres sont importants dans le choix du traitement. En effet, il est
nécessaire pour le médecin de prescrire un agent efficace mais qui ne soit pas trop délétère
pour le patient par ses effets secondaires. Le traitement de la SEP par une approche d’escalade
thérapeutique est une stratégie où l’agent présentant le meilleur rapport bénéfice/risque est
préféré dans un premier temps. Puis dans un second temps, en raison d’une inefficacité ou
d’une intolérance au premier agent, des agents plus puissants mais aussi plus toxiques seront
successivement utilisés jusqu’à l’obtention du meilleur compromis d’efficacité [Zaffaroni et al.,
2006]. Dans le traitement de la SEP, sur les 6 agents dont dispose le praticien, tous ne sont pas
à mettre au même niveau [Rieckmann et al., 2009]. En effet, les trois préparations d’IFNβ et le
GA forme la première ligne thérapeutique car, même si ces molécules présentent une
efficacité modérée (une réduction moyenne des poussées de 30%), les effets secondaires sont
peu importants et la sécurité à moyen et long terme est excellente. La deuxième ligne
thérapeutique comprend le natalizumab dont l’efficacité sur la fréquence des poussées est 2
fois supérieure à celle des médicaments précédents. Cependant, les complications possibles à
moyen terme, comme les LEMP, constituent le problème majeur. Enfin, la troisième et
Introduction
94
dernière ligne de traitement contient la MTX. Si dans la SEP son effet sur la réduction des
signes cliniques et radiologiques est majeur, des complications importantes à court terme ne
sont pas à négliger (toxicité cardiaque et aménorrhées souvent définitives).
Le traitement de la SEP par une escalade thérapeutique nécessite d’utiliser un
protocole standardisé d’évaluation de la réponse afin de déterminer quand il devient impératif
de passer d’une ligne de traitement à une autre [Rieckmann et al., 2009]. Les facteurs pris en
compte dans la définition d’une réponse sub-optimale au traitement de la SEP sont de 3
ordres [Zaffaroni et al., 2005] :
(1) Données cliniques. Un des paramètres cliniques à prendre en compte est le nombre
de poussées annuelles. Un échec dans la réduction de ce nombre peut être perçu
comme une réponse sub-optimale. Cependant, il est important de ne pas négliger que
le nombre de poussées diminue naturellement avec l’avancée de la maladie.
L’examination de la progression du handicap via l’EDSS peut aussi être un moyen de
détecter une réponse sub-optimale. Cependant, ce score fluctue dans le temps
indépendamment de la SEP : la dépression, la maladie et la douleur modifient par
exemple le score EDSS, ce qui peut être une source d’erreur. Rio et al. définirent
l’augmentation de 1 point d’EDSS, confirmée à 6 mois, comme un critère spécifique
et sensible pour définir une mauvaise réponse au traitement [Rio et al., 2002].
(2) Données radiologiques. Les événements inflammatoires visibles en imagerie sont 5
à 10 fois plus fréquents que les poussées. Par ailleurs, les traitements à base d’IFNβ et
de GA ont démontré un effet sur l’apparition de nouvelles lésions. Toutefois, de
nombreuses informations radiologiques sont disponibles (nombre de lésions hypo-
intenses en séquence T1, prise de contraste au gadolinium, atrophie…) et aucune ne
peut être favorisée par rapport à une autre. Par ailleurs, l’apparition de nouvelles
lésions n’est pas forcément signe de mauvaise réponse, ce qui pose la question du seuil
à fixer.
(3) Données de tolérance à la molécule. Comme aucun traitement ne permet de guérir
la SEP, le patient devra être sous traitement toute sa vie. Il est donc impératif de
prescrire un traitement bien supporté par celui-ci.
Ainsi, avant la mise en place de tout traitement, il est indispensable pour le médecin
d’examiner le patient de manière exhaustive afin d’établir un « niveau de référence » sur la
base duquel l’efficacité du traitement pourra être jugée dans le futur. La mise en place du
traitement débute par un traitement de première ligne. Le patient doit être suivi tous les 3 mois
Introduction
95
durant la première année, puis tous les 6 mois afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Si la
maladie semble stable et que le traitement est bien supporté par le patient alors la première
ligne de traitement peut être poursuivie. Par contre, si une détérioration neurologique est
perçue au cours de deux consultations successives, ou si la fréquence des poussées n’est pas
réduite, ou encore si les effets secondaires sont jugés comme non tolérables par le patient, il
est impératif de changer de traitement [Rieckmann et al., 2009].
Cependant cette approche pose de nombreux problèmes :
(1) Elle suppose qu’un patient qui répond mal à un traitement de première ligne
répondra surement mieux à un traitement de deuxième ou troisième ligne. Or cela n’a
jamais été démontré dans la SEP.
(2) Actuellement on ignore si un patient qui répond bien à un traitement à court terme
(c'est-à-dire au cours des 2 premières années de traitement) restera un bon répondeur à
long terme [Miller et al., 2008].
(3) On fait le postulat qu’il existe seulement deux catégories de patients : les « bons
répondeurs » et les « non répondeurs ». Or, ce n’est pas le cas car il existe toute une
déclinaison de réponses entre ces deux cas extrêmes, ce qui rend d’autant plus délicate
l’interprétation de l’efficacité du traitement.
III.5.2. Prédiction de la réponse au traitement des patients sclérose en plaques en
vue d’une médecine personnalisée
Le principal inconvénient d’une approche par escalade thérapeutique est que le patient
doit tester généralement plusieurs traitements avant de trouver celui qui lui convient le mieux.
Cela implique plusieurs mois d’attente avant que le médecin confirme ou non l’efficacité du
traitement, ce qui retarde d’autant plus la mise en place d’un traitement adéquat. Ce délai a
toute son importance quand on sait qu’un retard de 2 ans dans la mise en place d’un traitement
efficace peut avoir un impact significatif sur la progression de la maladie, mais aussi sur la
conversion d’un événement neurologique isolé vers une SEP déclarée [DeAngelis et al., 2008a]. Il
est donc nécessaire de trouver des marqueurs permettant de déterminer plus rapidement la
réponse au traitement, voire de la prédire.
Introduction
96
5.2.1. Recherche de bio-marqueurs prédictifs de la réponse au traitement
La recherche d’un bio-marqueur est un véritable challenge car il doit être à la fois très
sensible et spécifique de l’activité de la SEP. De plus, ce marqueur doit être facilement
détectable dans les liquides biologiques, qui doivent eux-mêmes être facilement prélevables.
L’urine, le sang et la salive permettent aisément l’identification de molécules sécrétées, de
protéines plasmatiques ou sériques, d’ARN et de protéines exprimés par les cellules
sanguines. Par contre, l’utilisation du LCR n’est pas réaliste pour des diagnostics routiniers
[Miller et al., 2008].
Un des marqueurs corrélé avec une diminution de l’efficacité du traitement est
l’apparition dans le sang d’anticorps neutralisants (Nabs) dirigés contre la molécule
traitante [Rudick, et al., 2009]. Dans les traitements par IFNβ, jusqu’à 35% des patients traités
vont développer des Nabs. Ces derniers apparaissent généralement entre 6 et 24 mois après le
début du traitement [Noronha et al., 2007]. Cependant, il est important de noter que la présence
de Nabs n’est pas toujours très stable. En effet, plus de 30% des patients détectés positifs pour
les Nabs peuvent par la suite redevenir négatifs [Sorensen et al., 2005]. De nombreux travaux ont
indiqué que les Nabs réduisent, voire inhibent, l’efficacité du traitement par IFNβ. Une équipe
étudia l’influence des Nabs, présents dans le sérum de patients traités pendant 3 ans par
IFNβ, sur l’évolution de la SEP [Malucchi et al., 2008]. Si 55,8% des patients dépourvus de Nabs
n’avaient pas eu de poussées pendant 2 ans, seulement 17,6% des patients présentant des
Nabs se retrouvaient dans un cas similaire. D’autres traitements, comme le GA [Salama et al.,
2003] et le natalizumab [Calabresi et al., 2007], peuvent aussi induire l’apparition d’anticorps.
Cependant, l’effet des ces anticorps sur l’efficacité du traitement fut beaucoup moins étudié.
Environ 50% des patients traités par le GA développaient des anticorps dirigés contre la
molécule (33% avec des titres élevés et 14% avec des titres faibles). Salama et al.
démontrèrent que ces anticorps avaient la capacité d’inhiber, in vitro, l’activité biologique du
GA sur les cytokines sécrétées par les lymphocytes T. Dans le traitement par natalizumab, 6%
des patients traités développent de manière persistante des anticorps. La présence de ces
anticorps est associée à une réduction significative de l’efficacité du traitement. En effet, les
patients ayant des anticorps anti-natalizumab dans leur sérum présentent des signes cliniques
(nombre de poussées, évolution du handicap) et radiologiques (apparition de nouvelles
lésions, nombre de lésions inflammatoires) plus mauvais que les patients séronégatifs, mais
aussi une mauvaise tolérance au traitement.
Introduction
97
Des études suggérèrent l’existence d’autres bio-marqueurs comme prédictifs de la
réponse au traitement de la SEP. Ce fut notamment le cas du gène MxA (pour Myxovirus-
resistance-protein A) dont l’expression est activée par l’IFNβ (nous y reviendrons dans le
prochain chapître). Dans l’étude de Malucchi et al., l’expression de MxA par les cellules
sanguines semblait un meilleur biomarqueur que la présence de Nabs pour mesurer la réponse
au traitement par IFNβ [Malucchi et al., 2008]. Les patients considérés comme négatifs pour
l’expression de MxA présentaient en moyenne une poussée 7 mois après la mise en place du
traitement alors que les patients positifs avaient en moyenne un délai supérieur à 3 ans. En
outre, il y avait une plus forte proportion de patients ne présentant pas de poussées chez les
patients positifs pour l’expression de MxA que chez les patients négatifs (57,5% contre 21%).
A l’heure actuelle, la mesure de la présence de Nabs dirigés contre l’IFNβ est
recommandée lors du suivi du traitement du patient. Dans le futur, l’analyse d’autres
biomarqueurs plus précis, comme MxA, pourrait se développer afin d’évaluer la réponse du
patient face au traitement choisi.
5.2.2. Anticiper la réponse au traitement par analyse de l’expression génique
L’analyse de l’expression de gènes est une approche couramment utilisée en recherche
mais aussi en clinique. En cancérologie, la classification de l’expression des gènes permet de
fournir des informations cruciales quant au pronostic d’évolution du cancer et quant à la
stratégie thérapeutique à adopter [Cheang et al., 2008]. Ces dernières années, des kits
commerciaux reposant sur ce principe ont été développés afin d’établir un pronostic après une
chimiothérapie. Dans la SEP, la recherche de tels marqueurs est beaucoup moins avancée.
Des approches similaires sont en cours d’investigation afin d’établir un profil d’expression de
gènes qui permettraient de prédire la réponse au traitement. Par exemple, dans le cas d’un
traitement à base d’IFNβ, plusieurs centaines de gènes ayant leur expression modifiée par
l’IFN β sont susceptibles de fournir de tels renseignements. Cependant, les résultats obtenus
dans le traitement par l’IFNβ sont très variables d’une étude à l’autre [Baranzini et al., 2005 ; Van
Baarsen et al., 2008 ; Weinstock-Guttman et al., 2008]. Le manque de reproductibilité est certainement
attribuable au protocole expérimental (caractéristiques des patients inclus dans les cohortes),
au type d’analyse et surtout à la taille des échantillons [Rudick, et al., 2009]. A l’heure actuelle,
dans la SEP, il n’existe pas de profil d’expression de gènes qui permette de prédire la réponse
Introduction
98
à un traitement. Cependant, on peut espérer que dans le futur, comme en cancérologie, cette
approche soit accessible au neurologue [Miller et al., 2008].
5.2.3. Recherche de marqueurs génétiques prédictifs de la réponse au traitement
Le concept d’utiliser l’information génétique d’un individu pour prédire sa réponse au
traitement afin de l’adapter au mieux est maintenant reconnu. Alors que les deux approches
précédentes permettaient d’estimer la réponse du patient après la mise en place du traitement,
l’approche génétique autorise une prédiction avant même la mise en place de celui-ci. Pour
certains traitements, comme les maladies cardio-vasculaires avec la warfarine [Takeuchi et al.,
2009] ou le clopidogrel [Collet et al., 2009 ; Mega et al., 2009], cette approche permet de prédire
l’efficacité du traitement. En effet, pour ces deux agents, la dose efficace à utiliser est très
variable d’un individu à un autre. Ainsi, une dose standard ne peut pas être fixée pour
l’ensemble des patients : si la dose est trop faible le traitement sera peu efficace, à l’inverse si
elle est trop forte on augmentera les risques d’effets secondaires indésirables. Dans la SEP, la
majorité des études de pharmacogénétique publiées reposent sur une approche gène candidat
et se basent sur le mécanisme d’action présumé de la molécule (par exemple l’étude de
polymorphismes contenus dans les gènes codant pour les récepteurs à l’IFNβ) [Cunningham et
al., 2005 ; Grossman et al., 2007]. Des travaux plus récents utilisent une approche GWAS qui
autorise la découverte de nouveaux effecteurs génétiques insoupçonnés impliqués dans la
réponse au traitement [Byun et al., 2008]. Cependant, l’ensemble des études d’associations
génétiques pour la réponse au traitement dans la SEP pose le problème d’une absence de
réplication des gènes impliqués [O’Doherty et al., 2007]. Cette non-réplication peut s’expliquer
par des tailles de cohortes trop faibles et par l’utilisation de critères hétérogènes pour la
définition de la réponse au traitement. Tout dernièrement, une étude confirma l’association
entre le locus GPC5 et la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ découverte par Byun et
al. [Cénit et al., 2009]. Ce locus code pour le glypicane 5 qui est un protéoglycane exprimé à la
surface des cellules. Cependant, le mécanisme d’action de ce protéoglycane dans la réponse
au traitement n’a pas encore été testé. Sans une confirmation forte d’une association entre un
polymorphisme et la réponse au traitement, on ne peut raisonnablement pas envisager la mise
en place d’une telle approche prédictive en clinique.
Introduction
99
IV. Les interférons de type 1
L’IFN β est un interféron de type 1 ayant des propriétés immuno-modulatrices. Il est
d’ailleurs prescrit en routine dans le traitement de la SEP. Cependant, bien qu’il ait été
découvert il y a plus de 50 ans, son mode d’action dans la thérapie de la maladie reste encore
mal compris [Borden et al., 2007]. De façon générale, on sait que les IFNs sont des protéines
sécrétées, à activité autocrine et paracrine, stimulant les réseaux intracellulaires et
intercellulaires impliqués dans la régulation de l’immunité et des infections virales.
IV.1. La voie de signalisation des interférons de type 1
Les IFNs sont classés en fonction du récepteur auquel ils se lient pour induire un
signal intracellulaire. Jusqu’à aujourd’hui, 3 classes d’IFNs ont été identifiées : les IFNs de
type 1, de type 2 et de type 3. Chez l’Homme, la classe des IFNs de type 1 comprend l’IFNβ,
l’IFN ω, l’IFNε, l’IFNκ et 13 sous types d’IFNα [Borden et al., 2007] ; chaque molécule étant
codée par un gène différent (soit 17 gènes codant pour les IFNs de type 1 au total).
Historiquement, les IFNs de type 1 ont été découverts grâce à leurs propriétés antivirales : il
fut observé que les cellules qui les exprimaient étaient résistantes à certaines infections virales
[Borden et al., 2007]. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes sont les cellules qui produisent la
plus grande quantité d’IFNs de type 1 [Coccia et al., 2004]. Tous les IFNs de type 1 activent le
même récepteur de surface, IFNAR, qui est exprimé de façon constitutive. Le récepteur
IFNAR est composé de 2 sous unités protéiques transmembranaires : IFNAR1 et IFNAR2.
Bien que ces deux chaînes soient indispensables à la transduction du signal, la molécule
d’IFN de type 1 se lie d’abord à la chaîne IFNAR2, chaîne pour laquelle il possède le plus
d’affinité, puis à la chaîne IFNAR1 [Theofilopoulos et al., 2005]. Aux domaines intracellulaires
d’IFNAR sont associées deux tyrosines kinases de la famille des Janus kinases (JAKs) :
TYK2 est liée à IFNAR1, JAK1 à IFNAR2. La liaison de l’IFN de type 1 à IFNAR induit un
rapprochement des deux chaînes du récepteur, ce qui autorise une trans-phosphorylation de
JAK1 et de TYK2 [Schindler et al., 2007]. Les deux JAKs alors activées vont phosphoryler des
domaines intracellulaires des sous-unités d’IFNAR, créant ainsi des sites de recrutement pour
les protéines STAT1 et STAT2. Une fois phosphorylé par les protéines TYK2 et JAK1,
l’hétérodimère STAT1/STAT2 se décroche du récepteur, s’associe à IRF9 et entre dans le
noyau. L’oligomère STAT1/STAT2/IRF9 forme un complexe appelé ISGF3 pour IFN-
Introduction
100
stimulated gene factor 3. Dans le noyau, ce complexe ISGF3 va se fixer sur le promoteur de
gènes possédant une séquence consensus appelée ISRE pour IFN-stimulated response
element afin d’induire leur expression (Figure 32) [Theofilopoulos et al., 2005].
De nombreux mécanismes peuvent inhiber cette voie de signalisation [Schindler et al.,
2007]. L’internalisation puis la dégradation des récepteurs IFNAR, la déphosphorylation des
JAKs et des STATs par des phosphatases ou encore l’induction de protéines SOCS en
constituent des exemples [Vlotides et al., 2004].
Figure 32 : La voie de signalisation des interférons de type 1. D’après Borden et al., Nat. Rev. Drug Discov.,
2007.
IV.2. Les protéines antivirales induites par les interférons de type 1
La liaison des IFNs de type 1 à leur récepteur initie une cascade de signalisation
induisant l’expression de plusieurs centaines de gènes possédant un élément de réponse aux
IFNs dans leur région promotrice [De Veer et al. 2001]. Ces gènes codent pour des protéines
impliquées dans divers mécanismes cellulaires : le remodellage du cytosquelette, l’apoptose
ou encore la régulation d’événements post-transcriptionnels ou des modifications post-
traductionnelles [Sadler et al., 2008]. De plus, certaines de ces protéines induites par les IFNs de
type 1, comme la GTPase MxA, le couple OAS/RNase L, la PKR et l’ISG15, ont démontré
des fonctions d’effecteurs antiviraux chez des souris délétées pour ces gènes.
Introduction
101
IV.2.1. La protéine MxA
Les protéines Mx font partie de la superfamille des grandes GTPases. Chez l’Homme,
seules deux GTPases Mx existent : MxA et MxB. Ces protéines sont exprimées par de
nombreuses cellules des tissus périphériques, comme les hépatocytes, les cellules
endothéliales ou les monocytes [Sadler et al., 2008 ; Fernández et al., 1999]. Chez l’Homme, MxA
et MxB sont toutes les deux cytoplasmiques, mais seule MxA possède une activité antivirale.
La protéine MxA est retrouvée à proximité du réticulum endoplasmique [Accola et al., 2002] où
elle forme de larges complexes oligomériques [Kochs et al., 2002]. Cette localisation sub-
cellulaire de MxA lui permet de surveiller les mécanismes d’exocytose et le trafic
vésiculaire : elle peut ainsi capturer des composants viraux essentiels [Kochs et al., 1999]. La
cible principale des protéines Mx semble être des composés viraux présentant une structure
homologue aux nucléocapsides [Kochs et al., 1999]. La protéine MxA possède deux domaines,
CID (pour central interacting domain) et LZ (pour leucine zipper), qui sont indispensables
pour la reconnaissance de certaines cibles virales et le blocage du transport intracellulaire
(Figure 33).
Figure 33 : Mécanisme d’action de la protéine MxA. D’après Sadler et al., Nat. Rev. Immunol., 2008.
IV.2.2. La voie des OAS et de la RNaseL
Les 2’-5’oligoadénylate synthétases (OAS) sont des enzymes responsables de
l’inhibition de la synthèse protéique en présence d’ARNs doubles brins (ARNdb) viraux.
Introduction
102
Purifiées à partir de cellules traitées à l’IFN, les OAS démontrèrent la capacité de synthétiser
de petits oligomères d’adénylate liés en 2’-5’. Ces oligomères d’adénylate (trimériques ou de
plus grande taille) se lient à une endo-ribonucléase latente, la RNase L. Cette interaction
entraîne une dimérisation de la RNase L aboutissant à son activation. Il en résulte une
dégradation des ARNs viraux et cellulaires (Figure 34) [Hovanessian et al., 2007]. Les OAS sont
constitutivement exprimées par la cellule, à un faible niveau, et servent de senseurs aux
ARNdb viraux. Chez l’Homme, les gènes OAS qui ont été identifiés localisent sur le
chromosome 12 [Hovnanian et al., 1998]. Il existe 3 gènes codant pour les formes majeures
d’OAS : le gène OAS1 qui code pour les petites isoformes de 40-46 kDa, le gène OAS2 qui
code pour les isoformes moyennes de 69-71 kDa et le gène OAS3 qui code pour la grande
isoforme de 100 kDa. A côté de ces formes majeures, il existe un gène codant pour une OAS-
like (OASL) [Sarkar et al., 2004]. Pour chacun des gènes OAS des épissages alternatifs
produisent de nombreuses isoformes qui diffèrent par leurs extrémités C-terminales. De plus,
chaque isoforme d’OAS présente des caractéristiques propres qui font sa singularité
[Hovanessian et al., 2007] :
(1) Les gènes OAS1 et OASL ne possèdent qu’un seul domaine d’homologie OAS,
alors que les gènes OAS2 et OAS3 possèdent respectivement 2 et 3 domaines OAS.
(2) Seules les formes OAS1, OAS2 et OAS3 sont capables de synthétiser des
oligomères d’adénylate. Le domaine OAS de la forme OASL est quant à lui inactif.
(3) La protéine OASL est retrouvée sous forme monomérique, OAS1 sous forme
tétramérique, OAS2 sous forme dimèrique et OAS3 sous forme trimérique.
(4) La longueur des oligomères d’adénylate synthétisés varie en fonction des
isoformes [Marié et al., 1997]. Seuls les oligomères produits par les isoformes d’OAS1 et
d’OAS2 possèdent la capacité d’activer la RNase L.
(5) La forme OAS3 est plus sensible à l’activation par les ARNdb (1µg/ml) que les
formes OAS1 et OAS2 (100 µg/ml) [Marié et al., 1997].
(6) La localisation sub-cellulaire varie en fonction des isoformes d’OAS. Les
isoformes d’OAS3 sont majoritairement associées aux ribosomes, alors que les
isoformes d’OAS1 et d’OAS2 sont en plus retrouvées avec les mitochondries et les
fractions nucléaires [Besse et al., 1998 ; Hovnanian et al., 1998].
Plus récemment, un rôle non-enzymatique des OAS a été identifié. Le gène OAS1 code pour
3 isoformes : E16, E17 et E18. L’isoforme E17 serait impliqué dans des phénomènes
d’apoptose. Cette isoforme contient un domaine BH3 capable d’interagir avec les protéines
Introduction
103
anti-apoptotiques de la famille Bcl-2. En effet, la forme E17 colocalise dans la cellule avec
Bcl-2, mais surtout co-immunoprécipite avec Bcl-2 et BclXL. De manière surprenante, cette
action pro-apoptotique de l’isoforme E17 ne nécessite pas d’oligomérisation, ni la présence
d’ARNdb, d’activité enzymatique ou de la RNase L [Ghosh et al., 2001].
Figure 34 : La voie antivirale OAS1-RNase L. D’après Sadler et al., Nat. Rev. Immunol., 2008.
IV.2.3. La protéine kinase PKR
Comme les OAS, la protéine kinase régulée par les ARNs (PKR) est une protéine
qui inhibe de la synthèse protéique. Cette kinase cytoplasmique est constitutivement
exprimée, à un niveau basal, dans tous les tissus. Son expression est augmentée par les IFNs
de type 1 [Samuel et al., 2001]. En conditions « normales », la PKR est majoritairement
retrouvée sous une forme monomérique inactive repliée sur elle-même. La présence de
ligands activateurs, tels que des ARNdb viraux ou des molécules polyanioniques [Nanduri et al.,
2000], induit un changement conformationnel de la protéine qui expose alors son domaine
kinase situé en C-terminal [Gelev et al., 2006]. Une fois dépliée, la PKR s’homodimérise et
s’autophosphoryle sur plusieurs résidus [Devy et al., 2005]. C’est cet homodimère phosphorylé
qui constitue la forme active de la PKR.
Introduction
104
La PKR appartient à la famille des protéines kinases qui répondent aux stress
environnementaux en régulant la synthèse des protéines. La principale activité antivirale de la
PKR passe par la phosphorylation du facteur de transcription EIF2α [Devy et al., 2005], ce qui
entraîne la séquestration du facteur limitant EIF2β, un facteur d’échange de nucléotides
guanyliques. L’inhibition du recyclage du GDP a pour conséquence d’empêcher l’initiation de
la traduction [Sadler et al., 2008].
Figure 35 : Mécanisme d’action de la PKR. D’après Sadler et al., Nat. Rev. Immunol., 2008.
IV.2.4. Le facteur ISG15
L’expression du gène codant pour l’ISG15 est aussi fortement activée par les IFNs de
type 1 lors d’une infection virale. Ce motif peptidique, qui est un homologue de l’ubiquitine,
intervient dans un phénomène appelé l’ISGylation (Figure 36) [Loeb et al., 7806]. Les
phénomènes d’ubiquitylation régulent de nombreux aspects de la réponse immune. Il n’est
donc pas surprenant de retrouver un motif peptidique, dont l’expression est régulée par les
IFNs, possèdant une fonction similaire à celle des ubiquitines [Liu et al., 2005]. Comme dans
les phénomènes d’ubiquitylation, plusieurs protéines interviennent au cours des processus
d’ISGylation. L’enzyme HBE1L à l’activité E1-like active l’ISG15. Puis, deux enzymes E2-
like, UBCH6 et UBCH8, servent de transporteurs pour les molécules d’ISG15 activées. Enfin,
HERC5 et TRIM25, homologues de l’E3 ubiquitin-ligase, vont coupler l’ISG15 aux protéines
Introduction
105
cibles [Sadler et al., 2008]. Au moins 158 protéines sont des cibles potentielles de l’ISGylation.
De plus, de nombreux substrats d’ISGylation possèdent des fonctions importantes dans la
réponse aux IFNs de type 1 (comme JAK1, STAT1, MxA, PKR, RNase L …) [Zhao et al.,
2005]. Contrairement à l’ubiquitylation, l’IGSylation n’entraîne pas une dégradation de la
protéine, mais mime une activation induite par l’ubiquitylation. En effet, l’IGSylation
prévient la dégradation d’IRF3 ce qui augmente l’induction de l’expression de l’IFNβ. Par
ailleurs, l’ISGylation peut moduler l’activité enzymatique soit positivement, soit
négativement.
Figure 36 : Mécanisme de l’ISGylation. D’après Sadler et al., Nat. Rev. Immunol., 2008.
IV.3. Interférons de type 1 et sclérose en plaques
IV.3.1. Evidences de l’importance des interférons de type 1 dans la sclérose en
plaques
Déjà mise en évidence pour d’autres maladies auto-immunes, l’importance de l’IFNβ
dans la SEP fut montrée par de nombreux travaux [Theofilopoulos et al., 2005]. Des animaux
invalidés pour le gène codant pour l’IFNβ [Teige et al., 2003] ou pour le gène codant pour son
Introduction
106
récepteur (IFNAR1-/-) [Prinz et al., 2008] développaient une EAE aux signes cliniques plus
sévères que les animaux sauvages. De plus, les animaux déficients pour l’un de ces gènes
présentaient une inflammation et une démyélinisation excessive de leur SNC. Chez l’Homme,
des études génétiques sur la susceptibilité à la SEP soulignèrent l’association de certains
gènes de la voie des IFNs de type 1 (TYK2 et IFIH1) avec la maladie [Ban et al., 2009, Martínez
et al., 2008]. Cependant, ces associations ne furent pas toujours répliquées. Une récente étude
sur la susceptibilité à la SEP, réalisée par GWAS, associa le locus IRF8 à la maladie [De Jager
et al., 2009b]. L’allèle du gène IRF8 conférant une plus grande susceptibilité à la SEP était
associé à une plus forte expression de nombreux gènes appartenant à la voie de signalisation
des IFNs. Un autre travail montra que l’expression de plusieurs gènes induits par les IFNs de
type 1 était augmentée chez environ 50% des patients souffrant de la forme RR-MS. C’était
notamment le cas des gènes OAS1, OAS2, MxA, MxB et ADAR1 [Van Baarsen et al., 2006].
Cette augmentation de l’expression des gènes induits par les IFNs de type 1 est retrouvée dans
de nombreuses maladies auto-immunes dont le lupus érythémateux [Rönnblom et al., 2001] et le
diabète de type 1 [Devendra et al., 2004]. Chez les patients souffrant de lupus érythémateux,
l’activité de la maladie corrélait avec une augmentation de l’IFNα sérique [Bengtsson et al.,
2000]. Cependant, contrairement à ces deux dernières pathologies, l’injection d’IFNβ permet
de traiter les patients SEP [O’Doherty et al., 2007]. En effet, nous avons vu au chapître précédent
que cette molécule réduisait les signes cliniques de la SEP tout en améliorant les résultats
d’IRM des patients. La régulation de la SEP par l’IFNβ est un mécanisme complexe, dont
toutes les subtilités ne sont pas encore connues, car la molécule semble intervenir à de
nombreuses étapes de l’inflammation.
IV.3.2. Mécanisme d’action de l’IFNββββ dans le traitement de la sclérose en plaques
Le traitement des patients SEP par l’IFNβ a un effet complexe sur l’expression de
nombreux gènes appartenant à diverses voies métaboliques [Markowitz et al., 2007]. Une étude
montra que la majorité de ces gènes codaient pour des protéines ayant des fonctions
immunitaires et apoptotiques [Fernald et al., 2007]. Des travaux démontrèrent que l’effet
bénéfique de l’IFNβ dans le traitement de la SEP pouvait résulter de son effet sur la migration
des cellules immunitaires vers le SNC, l’activation et la polarisation des lymphocytes,
l’apoptose cellulaire [Billiau et al., 2004].
Introduction
107
3.2.1. Effet de l’IFNββββ sur la migration des cellules immunes
Afin de rejoindre le SNC, les lymphocytes doivent traverser la BBB. Les lymphocytes
circulent dans le sang en roulant à la surface des cellules endothéliales. Se roulement
s’effectue grâce à une interaction faible entre les sélectines des cellules endothéliales et leurs
ligands glycosylés exprimés à la surface des cellules immunitaires. Ce n’est qu’une fois
activés par des chimiokines que les lymphocytes vont adhérer fortement à la paroi vaculaire
par une interaction impliquant les intégrines. Ils peuvent alors sortir de la circulation sanguine
par une voie péricellulaire puis se retrouver dans l’espace périvasculaire, avant de pénétrer
dans le cerveau et rejoindre les sites d’inflammation. Les lymphocytes, les monocytes et les
macrophages produisent des métallo-protéases (MMP s). Ces MMPs sont indispensables au
passage des leucocytes à travers cet espace périvasculaire via la dégradation de la matrice
extracellulaire [Man et al., 2007]. L’IFNβ pourrait avoir un effet bénéfique sur l’évolution de la
SEP en intervenant à, au moins, 2 étapes clés de ce processus : l’adhésion aux cellules
endothéliales et le passage à travers l’espace périvasculaire.
a. Adhésion à la barrière hémato-encéphalique
La migration des lymphocytes depuis la circulation sanguine vers les tissus est
facilitée par l’interaction des intégrines VLA-4 et LFA-1, avec leurs ligands VCAM-1 et
ICAM-1, exprimés par les cellules endothéliales [Man et al., 2007]. De nombreux travaux
démontrèrent que le traitement par IFNβ avait pour conséquence de diminuer l’expression de
l’intégrine VLA-4 à la surface des lymphocytes T CD4+ et T CD8+ [Jensen et al. 2007]. Cette
réduction était visible dès 1 mois par rapport à ces mêmes patients avant traitement, et dès 3
mois comparé à des témoins. Par ailleurs, Soilu-Hänninen et al. suggérèrent que la diminution
de l’expression de VLA-4 par les lymphocytes pouvait servir de marqueur pour estimer la
réponse à long terme du patient vis-à-vis du traitement par IFNβ [Soilu-Hänninen et al., 2005]. Il
est raisonnable de penser que l’effet bénéfique de l’IFNβ pourrait passer majoritairement par
l’inhibition de l’expression de VLA-4 à la surface des lymphocytes. En effet, l’utilisation du
natalizumab, qui est un anticorps dirigé contre cette intégrine, a clairement démontré son
efficacité dans la maladie.
Les travaux étudiant la protéine de surface endothéliale VCAM-1, le ligand de VLA-4,
ont aussi abouti à des résultats intéressants. Ils montrèrent que le traitement des patients par
Introduction
108
l’IFN β augmentait la concentration sérique de la forme soluble de VCAM-1[Graber et al., 2005 ;
Jensen et al. 2007]. Or, cette forme soluble est produite par un clivage protéolytique de la forme
membranaire de VCAM-1. Il fut alors émis l’hypothèse que la forme soluble de VCAM-1
pouvait interagir avec VLA-4, ce qui empêcherait la migration des leucocytes vers le SNC
[Graber et al., 2005]. Par ailleurs, dans le modèle animal de la SEP, il fut retrouvé une
diminution de la forme membranaire de VCAM-1 [Floris et al., 2002].
Il fut également observé une diminution de l’expression de l’ARNm LFA-1 chez les
patients traités par IFNβ, mais uniquement chez les patients considérés comme « bon
répondeurs » au traitement [Muraro et al., 2004]. Cependant, dans cette étude il ne fut pas
retrouvé d’effet sur l’expression de surface de la protéine. L’effet de l’IFNβ sur le ligand de
LFA-1, ICAM-1, fut lui aussi étudié par plusieurs équipes qui tirèrent des conclusions
opposées. Alors que Floris et al. démontrèrent que l’IFNβ avait pour effet de diminuer
l’expression d’ICAM-1 à la fois in vitro et in vivo [Floris et al., 2002], Kawanokuchi et al.
n’observèrent aucun effet de l’IFNβ sur l’expression de l’ARNm d’ICAM-1 par les
microglies [Kawanokuchi et al., 2004].
Nous avons vu que différents travaux suggèrent que l’IFNβ empêchait, par divers
mécanismes, l’entrée des leucocytes dans le SNC des patients souffrant de SEP. Une autre
étude suggèra que l’IFNβ pouvait aussi modifier la sortie des lymphocytes hors des organes
lymphoïdes secondaires [Shiow et al., 2006]. Il fut démontré que l’IFNβ, en induisant
l’expression de CD69 à la surface des lymphocytes, empêchait leur sortie des ganglions
lymphatiques. En effet, le CD69 a la capacité d’interagir avec le récepteur aux sphingosines,
S1PR, ce qui a pour conséquence d’inhiber son expression membranaire. Or, nous avons vu
précédemment que ce récepteur est important dans la sortie des lymphocytes depuis les
organes lymphoïdes vers la lymphe.
b. Migration à travers l’espace péri-vasculaire
Les leucocytes activés produisent une grande variété de MMPs dont, MMP-1, MMP-2,
MMP-9 et MMP-12, qui dégradent la matrice extracellulaire et facilitent ainsi la migration
cellulaire [Man et al., 2007]. En effet, il fut montré chez l’animal que l’activation de la MMP-9
était associée à une altération de la perméabilité de la BBB [Fujimura et al., 1999]. Plusieurs
études in vitro démontrèrent, que l’IFNβ diminuait l’effet de la MMP-9 en inhibant sa
sécrétion par les lymphocytes T [Stüve et al., 1996 ; Leppert et al., 1996]. Ces résultats furent
Introduction
109
confirmés in vivo puisque la concentration sérique en MMP-9 diminuait chez les patients SEP
suite au traitement à l’IFNβ [Yushchenko et al., 2003]. Par ailleurs, il fut démontré que cette
inhibition de MMP-9 était accompagnée d’une baisse de la migration des lymphocytes T à
travers une lame basale synthétique [Stüve et al., 1996 ; Uhm et al., 1999]. Il est donc raisonnable
de penser qu’un des mécanismes d’action de l’IFNβ serait de bloquer la pénétration des
leucocytes dans le SNC en inhibant leur sécrétion de MMPs.
3.2.2. Effet de l’IFNββββ sur l’activation et la polarisation des cellules immunes
L’effet de l’IFNβ sur l’activation et la sécrétion de cytokines par les cellules
immunitaires n’est pas un mécanisme simple. Les nombreuses publications sur le sujet
présentent des résultats parfois divergents. L’activation des cellules T requiert deux signaux
de la part des APCs: (1) l’interaction du TCR avec l’antigène présenté par les molécules de
CMH, (2) le signal non spécifique des molécules de co-stimulation. Les molécules de co-
stimulation, CD80 et CD86, présentes à la surface des APCs, interagissent avec le CD28 et
CTLA-4 présents à la surface des lymphocytes T. Si l’interaction CD28/CD86 est la
combinaison prédominante pour la co-stimulation, l’interaction CTLA-4/CD80 est impliquée
dans un signal de régulation négative [Bugeon et al., 2000].
Des expériences, pratiquées in vitro, démontrèrent une diminution de l’expression du
CMH-II à la surface des cellules traitées par l’IFNβ [Kawanokuchi et al., 2004 ; Lande et al., 2008].
Quant à l’effet de l’IFNβ sur l’expression des molécules de co-stimulation, les études
réalisées fournissent des résultats parfois contradictoires. Plusieurs travaux rapportèrent une
diminution de l’expression de CD80 au niveau ARN et protéique dans de nombreuses cellules
traitées par l’IFNβ telles que les microglies [Kawanokuchi et al., 2004], les monocytes [Shapiro et
al., 2003] et les lymphocytes B [Liu et al., 2001]. Cependant, d’autres études démontrèrent
l’inverse [Marckmann et al., 2004 ; Wiesemann et al., 2008]. L’effet de l’IFNβ sur l’expression de
CD86 n’est pas plus clair. En effet, il fut d’une part démontré que l’IFNβ ne modifiait pas
l’expression de CD86 à la surface des leucocytes de souris [O’Doherty et al., 2007] ni à la surface
des lymphocytes B de patients SEP traités [Liu et al., 2001]. D’autre part, des travaux
prouvèrent que l’expression de la molécule était augmentée à la surface des monocytes
[Marckmann et al., 2004, Wiesemann et al., 2008] et des microglies [Kawanokuchi et al., 2004]. Par
ailleurs, l’IFNβ ne semblait pas modifier l’expression de CD28 à la surface des lymphocytes
Introduction
110
T [Liu et al., 2001]. Enfin, il fut rapporté une augmentation de l’expression de CD40 à la surface
des monocytes traités par l’IFNβ [Shapiro et al., 2003 ; Wiesemann et al., 2008].
Si les résultats divergent concernant l’effet de l’IFNβ sur l’expression des molécules
de co-stimulation, c’est aussi le cas quant à son effet sur l’activation des lymphocytes par les
APCs. L’IFNβ est capable d’influencer la maturation des APCs. Un travail suggéra qu’un
défaut de maturation des APCs avait pour conséquence de diminuer leur capacité à induire la
prolifération des lymphocytes T [Lande et al., 2008]. De plus, l’IFNβ modifie la sécrétion
cytokinique des APCs. En effet, il fut démontré une augmentation de la sécrétion d’IL-10 par
les microglies [Kawanokuchi et al., 2003] et les monocytes [Liu et al., 2001] traités par l’IFNβ.
Cependant, pour l’IL-6 et le TNFα, les résultats varient en fonction du type cellulaire étudié
[Lande et al., 2008 ; Kawanokuchi et al., 2003]. Par ailleurs, les lymphocytes mis en présence
d’IFNβ, ou d’APCs pré-traitées par l’IFNβ, voient leur sécrétion cytokinique modifiée. Il fut
observé, par Liu et al., une augmentation de la sécrétion de l’IL-10, in vitro mais aussi ex vivo
chez des patients SEP sous traitement [Liu et al., 2001]. Toutefois Lande et al. démontrèrent
l’inverse [Lande et al., 2008]. Pour ce qui est de l’effet de l’IFNβ sur la polarisation Th1/Th2 des
lymphocytes T, là encore, les résultats obtenus par différentes équipes semblent se contredire.
Si certains montrèrent que l’IFNβ avait un effet pro-Th2 [Luca et al., 1999] ou encore anti-Th1
[Kawanokuchi et al., 2003], d’autres ne détectèrent aucun biais dans la polarisation lymphocytaire
[Lande et al., 2008].
En conclusion, l’IFNβ est capable de modifier l’activation et la sécrétion cytokinique
des APCs mais aussi des lymphocytes. Cependant, la forte divergence des résultats obtenus
par les travaux menés dans ce domaine peut s’expliquer par la diversité des protocoles mis en
place, mais aussi par l’utilisation de différents types cellulaires.
3.2.3. Effet de l’IFNββββ sur l’apoptose des cellules immunes
La pathogénie de la SEP pourrait s’expliquer par un échec du programme de mort, ou
apoptose, permettant d’éliminer les cellules potentiellement pathogéniques. En effet, les
lymphocytes T des patients SEP expriment plus fortement des inhibiteurs d’apoptose, tels que
IAP-1, IPA-2 et XIAP, comparé à des lymphocytes T de personnes témoins, ou souffrant
d’autres maladies neurologiques inflammatoires [Sharief et al., 2001a]. Par ailleurs, il fut prouvé
que la forte expression de ces inhibiteurs s’accompagnait d’une plus grande résistance à
l’apoptose. Un des mécanismes d’action de l’IFNβ dans le traitement de la SEP pourrait
Introduction
111
passer par une induction d’apoptose cellulaire. En effet, une équipe a mis en évidence que les
IFNs de type 1 étaient capables de modifier l’expression de gènes impliqués dans l’apoptose
[Chawla-Sarkar et al., 2003]. De plus, Sharief et al. démontrèrent que l’ajout d’IFNβ dans le
milieu de culture augmentait l’apoptose des lymphocytes T [Sharief et al., 2001b]. Cette
augmentation de l’apoptose corrélait avec une diminution de l’expression de la protéine anti-
apoptotique FLIP et avec l’induction de l’expression de la caspase-8. Par ailleurs,
l’importance des lymphocytes Th17 a été démontrée dans la pathogénie de l’EAE. De façon
interessante, chez l’Homme, les périodes actives de la maladie s’accompagnent d’une
augmentation du nombre de lymphocytes Th17 dans le sang [Durelli et al., 2009]. Durelli et al.
démontrèrent en outre que l’IFNβ réduisait le nombre de lymphocytes Th17 circulant dans le
sang, et que ces cellules présentaient in vitro une forte susceptibilité à l’apoptose induite par
l’IFN β. Une autre étude suggéra que les propriétés thérapeutiques de l’IFNβ passait par
l’induction de l’apoptose des cellules dendritiques matures via l’expression des caspases 3 et
11 [Yen et al., 2009]. Par ailleurs, les patients sous traitement IFNβ présentaient une forte
apoptose des cellules immunitaires périphériques [Gniadek et al., 2003]. Etrangement, cette
apoptose s’accompagnait d’une augmentation permanente de l’expression de la protéine anti-
apoptotique Bcl-2 et d’une augmentation transitoire de l’expression de la protéine anti-
apoptotique Bag-1. Les auteurs suggèrent que cette augmentation pourrait être un mécanisme
compensatoire de l’induction de l’apoptose induite par l’IFNβ. Ainsi, un des mécanismes
bénéfiques du traitement par l’IFNβ passerait par l’induction de la mort des cellules
pathogéniques, mais aussi des cellules dendritiques indispensables à la réactivation des
lymphocytes T au niveau du SNC [Miller et al., 2007].
Introduction
112
113
MM AATTEERRII EELL SS EETT
MM EETTHHOODDEESS
Matériels et méthodes
114
Matériels et méthodes
115
Cohortes de patients
Les patients SEP et les individus composant les familles trio françaises d’origine
caucasienne, composées d’un patient SEP et de ses deux parents (avec au moins 4 générations
précédentes d’origine européenne caucasienne), ont été recrutés lors d’une campagne
nationale. Le diagnostic de SEP est posé suivant les critères de Goodkin et al. [Goodkin et al.,
1991] et de Poser et al. [Poser et al.,1983]. Les individus témoins sont des donneurs de sang sains
ou des étudiants en médecine. Les jumelles saines ont été recrutées suite à un appel national à
la participation. Tous les sujets ont fourni leur consentement éclairé et le Comité Consultatif
de Protection des Personnes dans la Recherche Biomédicale de Paris-Pitié-Salpêtriere a
approuvé l’étude.
Définition du statut de réponse au traitement de la SEP par l’IFNββββ
Les patients inclus dans la cohorte d’étude de la réponse au traitement de la SEP par
l’IFNβ présentent uniquement la forme RR-MS de la maladie. Le statut de réponse des
patients a été défini en utilisant les critères suivants :
(1) Patient répondeur : pas de poussée ni de progression du handicap suivant l’échelle
EDSS pendant les 2 ans après la mise en place du traitement.
(2) Patient non-répondeur : 2 poussées ou plus et/ou une progression du handicap d’au
moins 1 point sur l’échelle EDSS pendant les 2 ans après la mise en place du traitement.
(3) Patient intermédiaire : patient dont les poussées ou l’évolution du handicap se situe
entre les deux classes précédantes.
Les patients intermédiaires sont retirés de la cohorte afin de diminuer les risques de mauvaise
classification. Cela permet de ne conserver que les groupes extrêmes de réponse.
Extraction des ADNs/ARNs
L’ADN est extrait sur du sang frais prélevé en tubes EDTA à l’aide du QIamp DNA
Blood Maxi Kit (Qiagen®). Cette extraction est réalisée suivant les instructions préconisées
par le fabricant. Les ADNs extraits sont conservés à -20°C jusqu’à utilisation.
L’ARN est extrait sur du sang frais prélevé en tubes EDTA à l’aide du QIamp RNA
Blood Mini Kit (Qiagen®). L’extraction est réalisée suivant les instructions préconisées par le
fabricant. Comme suggéré dans le kit, la digestion de l’ADN génomique à la DNaseI
(Qiagen®) est systématiquement réalisée. Les ARNs extraits sont conservés à -80°C jusqu’à
utilisation.
Matériels et méthodes
116
L’ARN des lymphocytes amplifiés est extrait à l’aide du RNeasy Mini Kit (Qiagen®).
L’extraction est réalisée suivant les instructions préconisées par le fabricant, comprenant
l’étape additionnelle de digestion de l’ADN génomique à la DNaseI (Qiagen®). Les ARNs
extraits sont conservés à -80°C jusqu’à utilisation.
La concentration en ADN ou ARN extrait est évaluée par lecture de la DO260nm par
spectrophotomètrie.
Reverse transcription et quantification de l’expression par PCR
quantitative en Sybr Green
Les ARNs totaux sont reverse transcrits en ADNc en utilisant le kit RT SuperScript III
(Invitrogen®). L’hybridation est réalisée dans un volume de 10 µl contenant 1 µg d’ARNs
totaux, 1 µl de dNTPs (0,1 M), 1 µl d’hexamères oligonucléotidiques aléatoires (50 ng/µl), et
de l’eau complétant le volume à 10 µl. La réaction s’effectue à 65°C durant 5 min avant d’être
arrêtée sur glace. Sont ensuite ajoutés 10 µl d’une solution de synthèse d’ADNc (2 µl de RT
buffer 10X ; 4 µl MgCl2 25 mM ; 2 µl DTT 0,1 M ; 1 µl Rnase OUT 4U/µl ; 1 µl SuperScript
III RT 20U/µl). Afin d’assurer la polymérisation des brins d’ADNc, le mélange est incubé 10
min à 25°C, 50 min à 50°C, et 5 min à 85°C. Pour augmenter la sensibilité des PCR, une
étape de digestion des produits de RT à la RNase H (2U) est réalisée à 37°C durant 20 min.
Les solutions d’ADNc sont conservées à -20°C.
Le niveau d’expression des gènes est déterminé par PCR quantitative en temps réel à
l’aide du système de détection ABI PRISM 7000 Sequence detection system (Applied
Biosystems®). Tous les oligonucléotides, synthétisés chez Invitrogen®, localisent dans deux
exons différents (quand c’est possible) et sont ainsi spécifiques des ARNm. Les
oligonucléotides utilisés dans les études sont listés dans le tableau ci-dessous. 1,2 µl de la
réaction de RT sont mélangés avec une solution comprenant des concentrations finales de 1X
du réactif SYBR Green (Eurogentec®), 300 nM de primer sens (100 nM pour GAPDH), 300
nM de primer antisens (100 nM pour GAPDH) et de l’eau dans un volume final de 25 µl. Les
conditions de PCR sont les suivantes : 2 min à 50°C, 10 min à 95°C, suivies de 40 cycles de
15 s à 95°C et de 1 min à 60°C. Pour chaque gène étudié, les amplifications sont réalisées en
duplicat pour chacun des échantillons.
Matériels et méthodes
117
Gène amplifié Primers oligonucléotidiques sens Primers oligonucléotidiques antisens
GATA3 5’-CAGACCACCACAACCACAC-3’ 5’-TGCCTTCCTTCTTCATAGTCAG-3’
GAPDH 5’-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3’ 5’-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3’
IRF1 5’-CAAATCCCGGGGCTCAATCTGG-3’ 5’-CTGGCTCCTTTTCCCCTGCTTTGT-3’
MxA 5’-TTCAGCACCTGATGGCCTATC-3’ 5’-GTACGTCTGGAGCATGAAGAACTG-3’
MxB 5’-GCGTACTCATTCATTCTAAGG-3’ 5’-GCATGCTCTGATGCTGAGG-3’
OAS1 5’-TGCGCTCAGCTTCGTACTGA-3’ 5’-GGTGGAGAACTCGCCCTCTT-3’
OAS2 5’-GCTTTGATGTGCTTCCTGCCTT-3’ 5’-ACCCCTTTGGCTTCAGTTTCCTT-3’
OASL 5'-GGACCGTGGAGGAGTTTCTG-3' 5'-GAGCCCACCTTGACTACCTTC-3'
RORγt 5’-TGAGAAGGACAGGGAGCCAA-3’ 5’-CCACAGATTTTGCAAGGGATCA-3’
SOCS3 5’-TGATCCGCGACAGCTCG-3’ 5’-TCCCAGACTGGGTCTTGACG-3’
T-bet 5’-CAGAATGCCGAGATTACTCAG-3’ 5’-GGTTGGGTAGGAGAGGAGAG-3’
Les données de PCR quantitative en temps réel sont représentées sous forme de
valeurs de Ct, où la valeur de Ct est définie comme le cycle de PCR seuil pour lequel le
produit amplifié est pour la première fois détecté. L’amplification de l’ARNm de la GAPDH
sert de contrôle interne. ∆Ct est la différence pour un même échantillon entre la valeur de Ct
du gène testé et la valeur de Ct de la GAPDH. ∆∆Ct représente la différence entre le ∆Ct de
l’échantillon à tester et le ∆Ct moyen de tous les échantillons. Le différentiel d’expression de
N fois pour l’échantillon étudié comparé à la moyenne de tous les échantillons est exprimé par
2-∆∆Ct.
Reverse transcription et quantification de l’expression par PCRarray
Les ARNs totaux sont reverse transcrits en ADNc en utilisant le kit de RT Reaction
Ready First Strand cDNA synthesis (SuperArray®). L’hybridation est réalisée avec 1 µg
d’ARNs totaux, 1 µl de tampon P2, et de l’eau complétant le volume à 10 µl. La réaction
s’effectue à 70°C durant 3 min avant d’être arrêtée sur glace. Sont ensuite ajoutés 10 µl d’une
solution de synthèse d’ADNc (4 µl de RT buffer 5X ; 4 µl d’eau ; 1 µl d’inhibiteur de RNase ;
1 µl d’enzyme de RT G38). Le mélange est incubé 1 h à 37°C puis 5 minutes à 95°C afin
Matériels et méthodes
118
d’assurer la polymérisation des brins d’ADNc. La solution d’ADNc est diluée dans 80 µl
d’eau avant d’être conservée à -20°C.
Le niveau d’expression des gènes étudiés est déterminé par plaque PCRarray
(SuperArray®) à l’aide du système de détection ABI PRISM 7000 Sequence detection system
(Applied Biosystems®). Une plaque de PCRarray permet de quantifier, simultanément par
PCR quantitative, l’expression de 96 gènes chez un même individu. La liste des gènes
amplifiés et la localisation des primers sur la plaque sont détaillées dans le chapitre
« Annexes » (Figure S1). 98 µl de la réaction de RT diluée sont mélangés avec une solution
comprenant 1225 µl de réactif MasterMix SYBR Green 2X (SuperArray®) et 1127 µl d’eau.
25 µl de ce mélange sont disposés dans l’ensemble des puits de la plaque de PCRarray,
excepté le puits H9 servant de contrôle de digestion dans lequel est placé 1 µl d’ARN initial
avec 12,5 µl SYBR Green 2X (SuperArray®) et 11,5 µl d’eau. Les conditions de PCR sont les
suivantes : 10 min à 95°C, suivies de 40 cycles de 15 s à 95°C et de 1 min à 60°C. Les
produits de transcription des gènes de la GAPDH, de la HPRT1 et de la RPL13A, considérés
comme « gène de ménage », sont amplifiés dans le but de normaliser les échantillons. Les
données de PCR quantitative en temps réel sont interprétées comme précédemment décrit.
Génotypage des polymorphismes par PCR TaqMan
L’ensemble des expériences de génotypages des polymorphismes par PCR TaqMan
ont été effectuées au sein de la plateforme Génopole (INRA, Toulouse). Les échantillons
d’ADNs, dilués à une concentration de 10 ng/µl, sont répartis sur des plaques 384 puits par un
robot pipeteur (Tecan®). A ces ADNs sont ajoutés 4 µl du mix pour PCR TaqMan composé
du Genotyping TaqMan MasterMix 1X (Applied Biosystems®) et des sondes TaqMan
spécifiques du polymorphisme étudié 1X (Applied Biosystems®). Chaque sonde spécifique
d’un allèle est couplée soit au fluorochrome FAM, soit au fluorochrome VIC. La réaction de
PCR est réalisée à l’aide d’un Thermocycleur 384 puits (Applied Biosystems®) dans les
conditions suivantes : 10 min à 95°C, suivies de 40 cycles de 15 s à 92°C et de 1 min à 60°C.
La lecture de la fluorescence FAM et VIC est réalisée en « lecture en point final » sur un ABI
Prism 7900 Sequence detection system (Applied Biosystems®) et les données analysées à
l’aide du logiciel SDS 2.2.2 (Applied Biosystems®).
Matériels et méthodes
119
Amplification des lymphocytes isolés du sang périphérique
Les cellules mononucléées humaines du sang périphérique ont été isolées à partir de
sang frais de donneurs en utilisant un gradient de FICOLL (Gibco®) selon les instructions
données par le fabricant. Les cellules isolées sont conservées dans du SVF (Invitrogen®)
contenant 10% de DMSO (Gibco®) et placées dans de l’azote liquide jusqu’à utilisation.
Les cellules sont rapidement décongelées et lavées, avant d’être mises en culture à
37°C et 5% de CO2, sur plaque 48 puits à une concentration de 106 cellules/ml dans 1 ml de
milieu complet (milieu RPMI 1640 (Gibco®) avec 10% de SVF (Biowest®), 2 mM de L-
glutamine (Gibco®) et 10 U/ml de pénycilline/streptomycine (Gibco®)). 75 µl de Dynabeads
CD3/CD28 T Cell Expander (Invitrogen®) sont ajoutés aux cellules pendant 3 jours. Puis au
3ème jour, de l’IL-2 recombinante humaine (AbCys®) est ajoutée à une concentration finale de
50 U/ml. Au 4ème jour, les cellules sont récupérées puis diluées à une concentration de
500 000 cellules/ml dans du milieu complet contenant de l’IL-2 recombinante humaine à une
concentration de 50 U/ml. Les cellules sont amplifiées entre 15 et 20 jours, en étant
régulièrement passées, jusqu’à leur utilisation pour des analyses fonctionnelles.
Quantification des protéines par Western-Blot
Les cellules sont lysées sur la glace dans du tampon de lyse (3,5 ml de tampon de lyse
2X ; 350 µl de NaF 1 M ; 70 µl de Na4VO4 100 mM ; 7 µl de DTT 1 M ; 3 ml d’eau ; 1
tablette mini d’inhibiteur de protéases (Roche®)). Le lysat cellulaire est laissé en agitation à
4°C pendant 20 min, puis centrifugé à 20 000 g pendant 20 min à 4°C. Le surnageant
contenant les protéines est conservé à -80°C jusqu’à utilisation.
50 µg d’extraits protéiques (quantifié par la méthode de BradFord) bouillis sont
séparés par électophorèse sur des gels 10% Bis-Tris Nu-PAGE (Invitrogen®) dans du tampon
de migration, puis transférés sur des membranes de nitrocellulose (Amersham Biosciences®).
Après saturation des membranes (tampon TBS-T contenant 5% de lait) pendant 1 h à
température ambiante, les membranes sont incubées sur la nuit, à 4°C, avec les anticorps
primaires (voir tableau ci-dessous). Les membranes sont ensuite lavées à plusieurs reprises
dans du tampon TBS-T, puis incubées pendant 1 h, à température ambiante dans l’obscurité,
avec les anticorps secondaires couplés à un fluorochrome : IRDye 680 IgG de mouton anti-
souris (Li-Cor Biosciences®) et IRDye 800CW IgG de mouton anti-lapin (Li-Cor
Bioscience®). L’acquisition de l’image la membrane et l’analyse quantitative sont réalisées en
utilisant le système Odyssey (Li-Cor Biosciences®). La quantification des protéines
Matériels et méthodes
120
phosphorylées est effectuée en mesurant l’intensité de fluorescence de la bande correspondant
à la proteine phosphorylée normalisée sur l’expression de l’actine β. En parallèle, sur une
autre membrane, la quantité totale de la protéine est déterminée par une approche similaire.
Protéine humaine détectée Dilution Produit chez Référence
anti-TYK2 1/500 souris #61073 (BD Biosciences®)
anti-P-TYK2 1/500 lapin #9321 (Cell Signaling®)
anti-STAT1 1/1000 lapin #9172 (Cell Signaling®)
anti-P-STAT1 1/1000 lapin #9171 (Cell Signaling®)
anti-STAT2 1/1000 lapin #4594 (Cell Signaling®)
anti-P-STAT2 1/1000 lapin #4441 (Cell Signaling®)
anti-actine β 1/1000 souris #612656 (BD Biosciences®)
Quantification de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine
tritiée et mesure de la sécrétion de cytokines par approche Luminex®
100 000 lymphocytes amplifiés sont mis en culture pendant 3 jours à 37°C avec 5% de
CO2 dans des plaques de 96 puits contenant 200 µl de milieu complet (milieu RPMI 1640
(Gibco®) avec 10% de SVF (Biowest®), 2 mM de L-glutamine (Gibco®) et 10 U/ml de
pénycilline/streptomycine (Gibco®)) et de l’IL-2 à une concentration finale de 50 U/ml. De la
[3H]thymidine (1 µCi/puit) est ensuite ajoutée pendant 1 jour. Après lyse des cellules et
plusieurs lavages, la radioactivité incorporée par les cellules est comptée. L’expérience est
réalisée en duplicat pour chacun des échantillons. Au nombre de coups comptés pour chaque
échantillon est retranché le bruit de fond (expérience réalisée avec du mileu de culture sans
cellule).
Avant l’ajout de la thymidine tritiée, 100 µl du surnageant cellulaire sont récupérés
afin de quantifier la sécrétion des cytokines suivantes : IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13,
IL-15, IL-17, IFNγ, IP-10 et TNFα. Les cytokines sont quantifiées à l’aide de la technique
Luminex® (Millipore®) par le service de phénotypage de la plateforme Anexplo de Toulouse.
Cette technique permet de mesurer des cytokines dans une gamme de concentration
s’étendant de 3,2 pg/ml à 10 ng/ml.
Matériels et méthodes
121
Mesure des cytokines intracellulaires par cytométrie en flux
Pour chaque individu, 1 million de lymphocytes amplifiés sont cultivés, pendant 4 h à
37°C, dans des plaques de 24 puits dans 400 µl de milieu composé de 200 µl de milieu
complet (milieu RPMI 1640 (Gibco®) avec 10% de SVF (Biowest®), 2 mM de L-glutamine
(Gibco®) et 10 U/ml de pénycilline/streptomycine (Gibco®)) et de 200 µl de milieu de
stimulation (milieu complet contenant 10/00 de GolgiSTOP (BD Biosciences®), 20/00
ionomycine (Sigma®) et 10/00 de PMA (Sigma®)). Après cette stimulation, les cellules sont
lavées au tampon FACS (PBS 1 X, 1% de BSA, 0,2 g/l d’azide de sodium) avant que les
récepteurs Fc ne soient saturés au Fc Block (BD Biosciences®). Les cellules sont de nouveau
lavées au tampon FACS avant de marquer le marqueur de surface CD8 à l’aide d’un anticorps
anti-CD8 couplé au Pacific Blue (BD Biosciences®) dilué au 1/50, pendant 20 min à 4°C dans
l’obscurité. Les cellules sont ensuite lavées et perméabilisées au cytofix/cytoperm (BD
Biosciences®) pendant 20 min à 4°C avant d’être lavées au Perm/Wash (BD Biosciences®).
L’IL-4 intracellulaire est marquée à l’aide d’un anticorps anti-IL-4 couplé PE (BD
Biosciences®) qui est mis à incubé 30 min à température ambiante dans l’obscurité. Après
marquage, les cellules sont lavées au Perm/Wash puis reprises dans du tampon FACS à 4°C
jusqu’à analyse. Les cellules sont passées en cytométrie en flux sur un LSRII (BD
Biosciences®) qui est localisé au sein de la plateforme de cytométrie de l’INSERM U563. Les
résultats sont analysés à l’aide du logiciel Diva (BD Biosciences®).
Mesure du profil du XCI
600 ng d’ADNs génomiques sont mis en présence de l’enzyme de digestion HhaI
(New England BioLabs®), ou du tampon seul, pendant 22h à 37°C. La digestion est réalisée
dans un volume final de 50µl. L’enzyme HhaI est inactivée à 65°C pendant 20 min. 2 µl de la
réaction de digestion sont mélangés à une solution de concentration finale de 1X de tampon
pour Taq polymérase sans MgCl2, 200 µM de dNTP, 800 nM d’oligonucléotide sens marqués
au fluorochrome FAM en 5’ (5’-FAM-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC-3’), 800 nM
d’oligonucléotide antisens (5’-GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT-3’), 2U de Taq
polymérase (New England BioLabs®) et de l’eau complétant le volume final à 20 µL.
L’amplification est réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Eppendorf®) dans les
conditions suivantes : 94°C durant 15 min, suivi de 35 cycles de 20 s à 94°C, 30 s à 57°C et 1
min à 72°C avant de terminer par 3 min à 72°C. Les oligonucléotides sont spécifiques du gène
codant pour le récepteur aux androgènes. Le produit de réaction PCR est dilué au 1/10e dans
Matériels et méthodes
122
de l’eau puis 2,5 µl de cette dilution sont ajoutés à 10,5 µl de Formamide/GeneScan 500
(Applied Biosystems®). Le produit final est ensuite dénaturé pendant à 96°C pendant 3 min.
Les échantillons sont confiés à la plateforme de Génotypage et de Séquençage (CNRS,
Purpan) pour une migration sur micro-capillaires à l’aide du séquenceur ABI 3100 (Applied
Biosystems®).
La taille et l’intensité des amplicons de PCR sont analysées à l’aide du logiciel
GeneScan (Applied Biosystems®). La mesure du profil du XCI est obtenu par la formule
suivante : biais du XCI = [RN / (RN + 1)] X 100. Avec RN = RH / RM, pour lequel R(H ou N )
correspond au ratio de l’intensité de l’amplicon de grande taille / l’intensité de l’amplicon de
petite taille (RH réaction en présence de HhaI et RM réaction en présence du tampon de
digestion seul).
Le profil du XCI est calculé sur une moyenne de 3 expériences. Par ailleurs, un témoin
positif de digestion (ADN isolé à partir d’un homme) permet de contrôler la digestion totale
du chromosome X actif.
Détermination génétique de la zygotie
50 ng d’ADN sont mélangés à une solution de concentration finale de 1X de tampon
pour Taq polymérase avec MgCl2 (2 mM), 200 µM de dNTP, 250 nM d’oligonucléotide sens
marqué au fluorochrome FAM ou HEX en 5’, 250 nM d’oligonucléotide anti-sens, 1U de Taq
polymérase (New England BioLabs®) et de l’eau complétant le volume final à 20 µl.
L’amplification est réalisée dans un thermocycleur (Mastercycler Eppendorf®), dans les
conditions suivantes : 94°C durant 2 min, suivi de 35 cycles de 30 s à 94°C, 30 s à (1) 55°C,
ou (2) 57°C, ou (3) 59°C et 30 s à 72°C avant de terminer par 5 min à 72°C.
Localisation chromosomique
Identification du microsatellite
Fluorochrome en 5’ Protocole PCR utilisé
Chr. 6 D6S1564 HEX 3
Chr. 6 D6S300 FAM 3
Chr. 7 D7S2496 HEX 1
Chr. 11 D11S1886 HEX 3
Chr. 11 D11S4108 FAM 3
Chr. 17 D17S802 HEX 3
Chr. 17 D17S1839 HEX 2
Chr. X DXS1003 FAM 3
Matériels et méthodes
123
400 ng d’ADN sont mélangés à une solution de concentration finale de 1X de tampon
pour Taq polymérase avec MgCl2 (2 mM), 200 µM de dNTP, 1 µl de la solution de primers
Linkage Mapping (Applied Biosystems®) 0,6U de Taq polymérase (New England BioLabs®)
et de l’eau complétant le volume final à 15 µl. L’amplification est réalisée dans un
thermocycleur (Mastercycler Eppendorf®), dans les conditions suivantes : 94°C durant 2 min,
suivi de 30 cycles de 15 s à 94°C, 15 s à 55°C et 30 s à 72°C avant de terminer par 5 min à
72°C.
Localisation chromosomique
Identification du microsatellite
Fluorochrome en 5’ Protocole PCR utilisé
Chr. 1 D1S450 FAM Linkage
Chr. 2 D2S140 FAM Linkage
Chr. 3 D3S1569 FAM Linkage
Chr. 14 D14S972 FAM Linkage
2,5 µl de ce produit de réaction PCR sont ajoutés à 10,5 µl de Formamide/GeneScan 500
(Applied Biosystems®) et dénaturé à 96°C pendant 3 min. Les échantillons sont confiés à la
plateforme de Génotypage et de Séquençage (CNRS, Purpan) pour une migration sur micro-
capillaires à l’aide du séquenceur ABI 3100 (Applied Biosystems®). La taille des amplicons
de PCR est analysée à l’aide du logiciel GeneScan (Applied Biosystems®) ce qui permet de
déterminer la zygotie d’une paire de jumelles par la présence de différences dans la taille des
microsatellites.
Mesure du pourcentage de monosomie
Les cellules mononuclées du sang sont mises en culture, à 37°C avec 5% de CO2, à
une concentration de 300 000 cellules/ml dans du milieu complet (milieu RPMI 1640
(Gibco®) avec 20% de sérum AB humain (Biowest®), 2 mM de L-glutamine (Gibco®) et 10
U/ml de pénycilline/streptomycine (Gibco®)). Afin de synchroniser les cellules, du FrDU (5
Fluoro 2’ DéoxyUridine ; Sigma®) à 10-7 M, de l’Uridine (Sigma®) à 4x10-6 M et de la PHA
(Phytohémagglutinine ; Sigma®) à 1 µg/ml sont ajoutés pendant 17 h. Après ces 17 h, de la
thymidine (Sigma®) est ajoutée à 10-5 M pendant 30 h. Enfin, de la colcémide (Roche
Diagnostics®) est ajoutée pendant 10 min à une concentration de 60 ng/ml. Les cellules sont
alors récupérées, culottées par centrifugation et soumises à un choc hypotonique de 18 min à
Matériels et méthodes
124
37°C par ajout d’une solution de KCl à 0,75 M. Après centrifugation, le culot cellulaire est
fixé dans une solution contenant 2 volumes d’acide acétique 100% (Sigma®) pour 3 volumes
de méthanol (Sigma®). Les cellules fixées sont conservées à 4°C jusqu’au marquage.
Une goute de la suspension de cellules fixées est étalée sur une lame de verre. Les
cellules sont ensuite progressivement déshydratées par des bains d’éthanol de concentrations
croissantes (70%, 80%, 90% et 100%). Puis, après ajout de 5 µl des sondes Poséidon
fluorescentes spécifiques soit du chromosome X, soit du chromosome Y (Kreatech
Diagnostics®), la lame est placée à 75°C pendant 5 min pour dénaturation. L’hybridation
s’effectue sur la lame couverte d’une lamelle placée à 37°C en chambre humide durant toute
une nuit. Enfin, la lame est lavée par deux bains successifs de 0,4X SSC / 0,3% Igepal (3 min
à 72°C, Kreatech Diagnostics®) puis de 2X SSC / 0,1% Igepal (3 min à 72°C, Kreatech
Diagnostics®) avant que les noyaux cellulaires ne soient marqués au DAPI. La lame
recouverte d’une lamelle est conservée à 4°C à l’abri de la lumière.
Les lamelles sont lues sur la plateforme d’imagerie de l’INSERM U563 à l’aide d’un
microscope à champ large. Les images prises sont ensuite analysées à l’aide du logiciel Image
J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Une moyenne de 750 noyaux sont analysés pour chaque individu.
Le pourcentage de monosomie pour le chromosome X correspond au nombre de noyaux ne
possédant qu’un seul chromosome X sur le nombre total de noyaux analysés multiplié par
cent. Une monosomie du chromosome X est constatée en l’absence d’un chromosome Y.
Analyse statistique des résultats
Les analyses statistiques sont réalisées à l’aide du logiciel d’analyse Graphpad Prism
v5 (www.graphpad.com). Pour les groupes dont les effectifs sont inférieurs à 20 échantillons,
un Mann-Whitney test est appliqué, ou un Wilcoxon matched pairs test en cas d’appariement
des groupes. Pour les groupes supérieurs à 20 échantillons, présentant une distribution
normale et des variances non significativement différentes, un t test est appliqué. La
classification des échantillons en fonction de leur expression d’ARNm et la représentation en
Heatmap a été faite à l’aide du logiciel d’analyse R (http://cran.r-project.org/). Les analyses
d’association génétiques et les tests TDT sont réalisés à l’aide du logiciel d’analyse
Haploview v4.1 (www.broad.mit.edu/mpg/haploview).
125
RREESSUULL TTAATTSS
Résultats
126
Résultats
127
FFAACCTTEEUURRSS GGEENNEETTII QQUUEESS EETT
SSUUSSCCEEPPTTII BBII LL II TTEE AA LL AA SSEEPP
Résultats
128
Résultats
129
I. Etude de l’effet d’un polymorphisme de TYK2, associé à la
susceptibilité à la SEP, sur la voie de signalisation de l’IFNββββ et sur
la polarisation lymphocytaire.
I.1. Objectifs
Le premier objectif de cette étude était de confirmer les résultats génétiques obtenus
par les travaux de Ban et al. sur l’association de TYK2 avec la susceptibilité à la SEP [Ban et
al., 2009]. Pour cette investigation, une population indépendante, d’origine française, composée
de cas-témoins SEP et de familles trio fut réunie.
Par ailleurs, une analyse fonctionnelle fut accomplie afin de comprendre les
conséquences fonctionnelles que le polymorphisme rs34536443 pouvait avoir. Dans ce but,
des cellules du sang périphérique furent isolées de patients SEP dont le génotype était connu
pour le polymorphisme rs34536443. Afin de disposer d’assez de matériel pour les différentes
approches analytiques, la population lymphocytaire fut amplifiée (cf chapitre « Matériels et
Méthodes »). Tout d’abord, il fut étudié si le polymorphisme rs34536443 pouvait modifier
l’intensité d’activation de la voie de signalisation des IFNs de type 1 lors d’une stimulation
par l’IFNβ. Cette activation fut quantifiée, à plusieurs étapes de la cascade de signalisation,
par différentes approches analytiques (RT-PCR et Western-blot). En outre, de nombreux
travaux ont montré une implication de TYK2 dans la balance lymphocytaire Th1/Th2
[Ghoreschi et al., 2009]. Une déficience de la protéine TYK2 conduit à un défaut de
différenciation des lymphocytes Th1 alors que la polarisation en Th2 est augmentée. Afin
déterminer si le polymorphisme rs34536443 influençait la polarisation du système
immunitaire, l’expression des facteurs de transcription T-bet [Szabo et al., 2000], GATA3 [Zheng
et al., 1997] et RORγt [Ivanov et al., 2006], respectivement spécifiques des lignées lymphocytaires
Th1, Th2 et Th17, fut évalué par RT-PCR quantitative sur des lymphocytes T amplifiés dans
des conditions « neutres » (non pro-Th1, non pro-Th2, et non pro-Th17). Par ailleurs, les
cytokines produites et sécrétées furent analysées par plusieurs approches.
Résultats
130
I.2. Résultats
I.2.1. TYK2 est associé à la suceptibilité à la SEP dans la population française.
Dans un effort de répliquer l’association de TYK2 avec la SEP, nous avons génotypé
une cohorte française de cas-témoins SEP pour le polymorphisme rs34536443. L’association
de l’allèle G du polymorphisme rs34536443 de TYK2 fut évaluée par une approche classique
pour une étude en cas-témoins. Il fut confirmé un enrichissement significatif de l’allèle G
chez les patients SEP comparé aux témoins (97% chez les patients SEP contre 95% chez les
témoins ; P = 0,003 ; Tableau II). Dans notre étude, le risque relatif obtenu pour l’allèle G est
un peu plus élevé que celui des études précédentes : RR = 1,92 (1,24-2,97). La faible taille de
la cohorte disponible pour cette étude pourrait certainement en être la cause. Par ailleurs, une
analyse en TDT fut pratiquée sur 640 familles trio SEP françaises. Cette analyse démontra
une sur-transmission de l’allèle G aux enfants souffrant de SEP (P = 0,013 ; Tableau III ).
L’ensemble de ces résultats confirment les conclusions de l’étude de Ban et al., associant le
gène TYK2 avec la susceptibilité à la SEP. L’allèle majoritaire G du polymorphisme
rs34536443 de TYK2 est donc un allèle de susceptibilité à la SEP alors que l’allèle
minoritaire C est associé à une protection contre cette maladie.
Tableau II : Analyse d’association du polymorphisme rs34536443 de TYK2 dans la SEP par une approche
en cas-témoins.
N No d’
allèles G Freq de
l’allèle G No d’
allèles C Freq de
l’allèle C RR (95% c.i.) χ2 P
Cas 703 1370 0,97 36 0,03 1,92 (1,24-2,97) 8,7 0,003
Témoins 511 973 0,95 49 0,05
N, nombre d’individus. « No d’allèles » fait référence au nombre d’allèles du polymorphisme rs34536443. RR,
risque relatif. c.i., intervalle de confiance.
Tableau III : Analyse TDT du polymorphisme rs34536443 de TYK2 dans la SEP sur 640 familles trio
françaises.
Marqueur Allèle Fréquencea Tb Ub T/Ub P
rs34536443 G 0,967 54 34 1,59 0,013
aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission (T/U).
Résultats
131
I.2.2. Le polymorphisme rs34536443 conduisant au changement TYK2P1104A ne modifie par
l’expression de la protéine TYK2.
Le polymorphisme rs34536443 se localise dans l’exon 21 du gène codant pour TYK2.
Ce polymorphisme entraîne un changement d’acide aminé en position 1104 de la protéine.
Alors que l’allèle majoritaire G code pour une proline, l’allèle minoritaire C code pour une
alanine. Une des conséquences de la modification de la structure primaire de TYK2 pourrait
être d’affecter la stabilité de la protéine dans la cellule. Pour appréhender cela, nous avons
étudié l’expression de la protéine TYK2 dans deux groupes d’individus établis en fonction de
leur génotype pour le polymorphisme rs34536443. Ces deux groupes apparaîtront dans la
suite du travail sous la nomenclature suivante : TYK2GG et TYK2GC. Il fut pratiqué une
extraction protéique sur des lymphocytes amplifiés à partir de cellules mononucléées du sang
périphérique. Un western-blot permit de détecter la protéine TYK2 totale ainsi que l’actine β
(servant à la normalisation). Cette approche ne révéla pas de différence d’expression de la
protéine TYK2 entre les individus homozygotes pour l’allèle G et les individus hétérozygotes
(P = 0,91 ; Figure 37). Nous pouvons conclure des données obtenues que le changement
TYKP1104A ne modifie pas le niveau basal de la protéine TYK2 totale dans les lymphocytes, ce
qui suggère que ce polymorphisme n’affecte pas la stabilité de la protéine.
Figure 37 : Le polymorphisme rs34536443 ne modifie pas l’expression protéique de TYK2. (a) Les
protéines extraites de lymphocytes isolés d’individus TYK2GG et TYK2GC sont analysées en western-blot à l’aide
d’anticorps spécifiques de TYK2 et de l’actine β. (b) Quantification de la protéine TYK2 par western-blot.
Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 10 individus pour chacun des génotypes. L’expression relative
de TYK2 est calculée en normalisant sur l’expression de l’actine β. Le graphique est représentatif de deux
expériences indépendantes.
Résultats
132
I.2.3. Le polymorphisme TYK2P1104A influence le niveau d’activation de TYK2.
Le polymorphisme TYK2P1104A localise dans le domaine kinase de la protéine. Ce
domaine est à la fois important pour l’activation de la protéine via une auto- ou une trans-
phosphorylation de certains résidus (les tyrosines en position 1054 et 1055 de la protéine :
T1054 et T1055), mais aussi pour son activité kinase. Ainsi le polymorphisme rs34536443
pourrait avoir des conséquences sur l’état d’activation de TYK2 en présence d’une
stimulation par l’IFNβ. L’activation de TYK2 fut évaluée par western-blot en utilisant un
anticorps dirigé spécifiquement contre les T1054 et T1055 phosphorylées. Le niveau
d’activation de TYK2 fut exprimé par un ratio de l’expression relative de la forme
phosphorylée de TYK2 par rapport à l’expression relative de la protéine TYK2 totale. En
l’absence de stimulation par l’IFNβ, la protéine TYK2 n’était pas phosphorylée ce qui
confirma l’absence d’activation détectable de TYK2 dans des conditions basales. Après 15
minutes de stimulation par de l’IFNβ à 1 000 U/ml, une activation de TYK2 fut détectée dans
les deux groupes, quel que soit le génotype (Figure 38a). La quantification de la
phosphorylation de TYK2 démontra une activation plus importante de l’enzyme dans le
groupe TYK2GG par rapport au groupe TYK2GC (différence d’environ 2 fois ; P = 0,035 ;
Figure 38b). Ces résultats suggèrent que le polymorphisme rs34536443, en changeant la
séquence du domaine kinase de la protéine TYK2, modifierait l’état d’activation de la
protéine en présence d’une stimulation par l’IFNβ. L’allèle majoritaire G, codant pour une
proline en position 1104 et conférant une augmentation de la susceptibilité à la SEP, conduit à
une protéine TYK2 plus active que la forme codée par l’allèle minoritaire C possèdant une
alanine en position 1104.
Résultats
133
Figure 38 : Le polymorphisme rs34536443 modifie le niveau d’activation de TYK2. (a) Détection spécifique
de phospho-TYK2 (P-TYK2) et de TYK2, par western-blot réalisé sur un extrait protéique de lymphocytes
amplifiés. Les cellules ont été stimulées par de l’IFNβ à 1 000 U/ml. L’absence de détection de P-TYK2 dans les
cellules avant stimulation suggère que TYK2 n’est pas activé en conditions basales. (b) Quantification du ratio
P-TYK2 / TYK2 total obtenu par western-blot. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 10 individus
pour le groupe TYK2GG et N = 9 pour le groupe TYK2GC. Les expressions relatives de TYK2 total et de P-TYK2
sont calculées en normalisant sur l’expression de l’actine β.
I.2.4. Le polymorphisme TYK2P1104A influence l’état d’activation de la voie de signalisation
de l’IFNβ.
La protéine kinase TYK2, associée au récepteur à l’IFNβ, intervient dans la
phosphorylation des protéines STAT1 et STAT2. Cette phosphorylation est indispensable à
l’hétérodimérisation de STAT1-STAT2, un complexe important dans la transmission du
signal de la voie de l’IFNβ. Ainsi, pour étudier l’effet du polymorphisme rs34536443 sur
l’activité kinase de TYK2, il fut évalué le niveau de phosphorylation de STAT1 (sur la
tyrosine en position 701) et STAT2 (sur la tyrosine en position 690), deux cibles directes de
TYK2. Le niveau de phosphorylation des STATs est exprimé en ratio de l’expression relative
de la forme phosphorylée de STAT par rapport à l’expression relative de la protéine STAT
totale. En l’absence de stimulation des cellules par l’IFNβ, ni STAT1 (Figure 39a), ni STAT2
(Figure 39c) ne furent retrouvés phosphorylés, indiquant l’absence d’activation de la voie de
signalisation de l’IFNβ en conditions basales. Par contre, après 15 minutes de stimulation par
de l’IFNβ à 1 000 U/ml, une phosphorylation de STAT1 et de STAT2 fut détectée dans les
deux groupes TYK2GG et TYK2GC (Figure 39a et 39c). Bien que cette différence ne soit pas
significative, il fut trouvé une tendance à une plus importante phosphorylation de STAT1
(différence d’environ 1,3 ; P = 0,60 ; Figure 39b) et de STAT2 (différence d’environ 2,2 ; P =
0,06 ; Figure 39d) dans le groupe TYK2GG. Ce résultat tend à confirmer que l’allèle C
Résultats
134
coderait pour une forme hypo-active de la protéine TYK2 par rapport à l’allèle G. L’absence
de significativité dans la comparaison des deux groupes pour la phosphorylation des STATs
peut s’expliquer par l’état transitoire de la forme phosphorylée de ces protéines. Une cinétique
après stimulation par l’IFNβ permettrait de capter la période où la différence entre les deux
groupes est la plus importante.
Figure 39 : Le polymorphisme rs34536443 modifie le niveau d’activation de la voie de signalisation de
l’IFN ββββ. (a, c) Détection par western-blot de phospho-STAT1 (P-STAT1) et de STAT1 (a) ou de phospho-
STAT2 (P-STAT2) et de STAT2 (b) réalisé sur un extrait protéique de lymphocytes amplifiés. Les cellules ont
été stimulées par de l’IFNβ à 1 000 U/ml. L’absence de détection de P-STAT1 et de P-STAT2 dans les cellules
avant stimulation suggère que la voie de l’IFNβ n’est pas activée en conditions basales. (b, d) Quantification des
ratios P-STAT1 / STAT1 (b) et P-STAT2 / STAT2 (d) obtenus par western-blot. Chaque barre représente la
moyenne ± s.e.m. N = 10 individus pour le groupe TYK2GG et N = 9 pour le groupe TYK2GC. Les expressions
relatives de STAT1, STAT2, P-STAT1 et P-STAT2 sont calculées en normalisant sur l’expression de l’actine β.
Pour confirmer l’effet du polymorphisme rs34536443 sur l’activité kinase de TYK2,
l’expression de plusieurs gènes induits par l’IFNβ (MxA, MxB, OAS1, IRF1 et SOCS3) fut
évaluée par RT-PCR quantitative. Chacun de ces gènes posséde dans son promoteur une
séquence IRSE intervenant dans l’activation de leur expression par l’IFNβ. Les sondes
oligomériques utilisées sont spécifiques de la séquence de l’ARN messager du gène. Comme
il existe une expression basale faible de chacun de ces gènes, les résultats sont présentés sous
Résultats
135
la forme d’un ratio de l’expression du gène après stimulation par l’IFNβ (2 heures à une
concentration de 1 000 U/ml) sur son expression avant stimulation. En accord avec
l’observation d’une signalisation augmentée dans le groupe TYK2GG par rapport au groupe
TYK2GC, tous les gènes régulés par l’IFNβ, testés par RT-PCR quantitative, démontrèrent une
expression plus importante dans le groupe TYK2GG (d’un facteur allant de 1,6 à 2,2 ; Figure
40).
L’ensemble des résultats obtenus indique que l’allèle C est associé à une hypo-
activation de la kinase TYK2, ce qui conduit à une hypo-activation de la voie de signalisation
de l’IFNβ (phosphorylation des STATs moins importante et diminution de l’expression des
gènes induits par l’IFNβ).
Figure 40 : Le polymorphisme rs34536443 contrôle le niveau d’expression des gènes induits par l’IFNββββ.
Quantification par RT-PCR quantitative de l’expression de MxA (a), de MxB (b), d’OAS1 (c), d’IRF1 (d) et de
SOCS3 (e) réalisée sur des lymphocytes amplifiés. L’expression relative correspond au ratio de l’expression du
gène après stimulation à l’IFNβ (2 heures à une concentration de 1 000 U/ml) sur son expression avant
stimulation. L’expression relative est calculée sur la moyenne de duplicats normalisés sur le gène de ménage
GAPDH. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 pour
le groupe TYK2GC.
Résultats
136
I.2.5. Le polymorphisme TYK2P1104A influence la polarisation des lymphocytes T
Des travaux ont démontré, chez l’animal et chez l’Homme, l’importance de la kinase
TYK2 dans la polarisation des lymphocytes T. Il a été aussi prouvé que l’absence de cette
protéine conduit à une différenciation pro-Th2 des cellules immunitaires (lymphocytes T et
cellules dendritiques). Afin de comprendre comment l’allèle C codant pour une kinase hypo-
active pouvait protéger de la SEP, nous nous sommes intéressés à l’influence que le
polymorphisme TYKP1104A pouvait avoir sur la composante lymphocytaire du système
immunitaire. Pour cela, les lymphocytes furent isolés à partir d’individus dont le génotype
pour le polymorphisme étudié était connu puis amplifiés dans des conditions neutres, c'est-à-
dire sans pousser les cellules dans une voie pro-Th1, pro-Th2 ou pro-Th17.
Puis nous avons évalué par RT-PCR quantitative, en fonction du génotype pour le
polymorphisme rs34536443, l’expression de trois facteurs de transcription nucléaires : T-bet,
GATA3 et RORγt respectivement impliqués dans l’engagement vers des lignages Th1, Th2 et
Th17 (Figure 41). Il fut démontré une différence significative de l’expression de GATA3 (P
= 0,01), avec une plus forte expression dans le groupe TYK2GC par rapport au groupe
TYK2GG (facteur d’augmentation proche de 1,6). Par contre, aucune différence pour
l’expression de T-bet et RORγt ne fut démontrée entre les deux génotypes. L’augmentation de
l’expression du facteur de transcription nucléaire GATA3 dans le groupe TYK2GC par rapport
au groupe TYK2GG suggère une polarisation des lymphocytes en faveur d’une réponse Th2.
Figure 41 : Le polymorphisme rs34536443 influence l’expression des facteurs nucléaires impliqués dans
la polarisation lymphocytaire. Quantification par RT-PCR quantitative de l’expression de T-bet (a), de
GATA3 (b) et de RORγt (c) réalisée sur des lymphocytes amplifiés à l’aide de billes anti-CD3/CD28 et d’IL-2
(50 U/ml). L’expression relative est calculée sur la moyenne de duplicats normalisés sur le gène de ménage
GAPDH. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12
individus pour le groupe TYK2GC.
Résultats
137
NNous avons alors voulu savoir si le génotype pour le polymorphisme rs34536443 de
TYK2 avait une influence suffisante sur l’expression de T-bet, GATA3 et RORγt pour
permettre la classification des individus en deux groupes cohérents (Figure 42). Une
représentation graphique 3D, prenant en compte simultanément l’expression des trois facteurs
de transcription, fut donc réalisée. Elle suggèra qu’il était possible de séparer les deux
génotypes du polymorphisme rs34536443 suivant ces critères (Figure 42a). Il fut alors
entrepris une classification des données d’expression, centrées et réduites, dont les résultats
sont représentés sous la forme d’une carte « heatmap » (Figure 42b). Cette classification nous
permit de dégager deux groupes principaux, composés chacun de 10 individus. Cette
séparation des deux groupes reposait principalement sur une différence d’expression pour
GATA3 et RORγt. En effet, alors qu’un des groupes présentait une forte expression de
GATA3 et une faible expression de RORγt, l’autre démontrait à l’inverse une faible
expression de GATA3 et une forte expression de RORγt. Par ailleurs, les groupes obtenus
présentaient une bonne cohérence dans le génotype des individus les constituant, à savoir :
80% d’individus TYK2GC et 20% de TYK2GG dans le premier groupe, et inversement dans le
deuxième groupe.
Résultats
138
Figure 42 : L’expression des facteurs nucléaires impliqués dans polarisation lymphocytaire permet de
classer les individus en fonction de leur génotype pour le polymorphisme rs34536443. (a) Représentation en
3D de l’expression de T-bet, GATA3 et RORγt, quantifiée par RT-PCR sur des lymphocytes amplifiés à l’aide
de billes anti-CD3/CD28 et d’IL-2 (50 U/ml). Les individus du génotype TYK2GG sont représentés par des carrés
rouges alors que les individus du génotype TYK2GC sont représentés par des carrés noirs. (b) Classification des
échantillons en fonction de leur ressemblance dans l’expression ARN de T-bet, GATA3 et RORγt. La
classification est pratiquée sur des valeurs centrées réduites. Un code couleur arbitraire est donné pour
représenter l’expression des gènes (allant du vert pour une faible expression vers le rouge pour une expression
élevée). N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 pour le groupe TYK2GC.
Afin de confirmer l’influence du polymorphisme rs34536443 sur la polarisation
lymphocytaire, leur sécrétion de cytokines fut évaluée par une approche en Luminex® (Figure
43b-j). Cette approche nous permit de quantifier simultanément la sécrétion de 11 cytokines
dans le milieu de culture. Pour cela, une culture lymphocytaire de 3 jours fut réalisée en
présence d’IL-2 (50 U/ml) et de billes anti CD3/CD28. En parallèle, la prolifération
lymphocytaire fut testée par mesure de l’incorporation de thymidine tritiée (Figure 43a). Les
cellules démontrèrent une capacité à proliférer comparable, indépendamment de leur génotype
(P = 0,83). Ceci nous permit d’affirmer que les différences de sécrétions cytokiniques
observées n’étaient pas la conséquence d’une différence de prolifération. La présence d’IL-7
et d’IL-15 dans le milieu ne fut pas quantifiable car ces cytokines étaient présentes à des
concentrations situées hors de la gamme étalon (données non représentées). Par ailleurs, les
concentrations en IL-17 furent détectées à la limite de la sensibilité de la technique ce qui
Résultats
139
rendit les résultats peu interprétables. Les lymphocytes isolés à partir d’individus de génotype
TYK2GC démontrèrent une augmentation de la sécrétion de cytokines de type Th2, telles que
l’IL-4 (différence de 2,1 ; P = 0,006 ; Figure 43b) et l’IL-5 (différence 2,3 ; P = 0,04 ;
Figure 43c) mais pas l’IL-13 (P = 0,09 ; Figure 43f). Par contre, il ne fut pas observé de
différence dans la sécrétion d’IFNγ, molécule de type Th1 (P = 0,48 ; Figure 43i). Il fut par
ailleurs retrouvé une augmentation de la sécrétion de deux autres cytokines, l’IL-6 (différence
de 3 ; P = 0,002 ; Figure 43d) et l’IP-10 (différence de 3,1 ; P = 0,01 ; Figure 43h), dans le
groupe TYK2GC par rapport au groupe TYK2GG.
Figure 43 : Le polymorphisme rs34536443 influence la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T. (a)
Quantification de la prolifération lymphocytaire par incorporation de thymidine tritiée après 72h de culture en
présence de billes anti CD3/CD28 et d’IL-2 (50 U/ml). (b-j ) Quantification des cytokines présentes dans le
milieu après 72h de culture des lymphocytes en présence de billes anti CD3/CD28 et d’IL-2 (50 U/ml). La
concentation des cytokines est calculée sur une moyenne de duplicats. Chaque barre représente la moyenne ±
s.e.m. N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 pour le groupe TYK2GC.
Résultats
140
En parallèle de l’analyse de la sécrétion cytokinique en Luminex®, une étude
préliminaire par cytométrie en flux fut réalisée (Figure 44). Les lymphocytes amplifiés furent
stimulés à la PMA/ionomycine puis marqués pour le marqueur de surface CD8 et pour l’IL-4
intracellulaire. Bien que ces données ne soient que préliminaires, il fut observé un plus fort
pourcentage de cellules CD8+ productrices d’IL-4 dans le groupe TYK2GC que dans le groupe
TYK2GG. Ces résultats restent à confirmer par une analyse plus robuste et plus poussée des
cytokines produites par les différentes populations lymphocytaires.
Figure 44 : Etude par cytométrie de l’effet du polymorphisme rs34536443 sur la production de cytokines
par les lymphocytes. Le marquage a été réalisé sur des lymphocytes amplifiés, isolés de personnes dont le
génotype pour le polymorphisme rs34536443 était connu. Les cellules ont été stimulées pendant 4h à la
PMA/ionomycine en présence de GolgiSTOP (a) Représentation des données de cytométrie pour le marquage
intracellulaire de l’IL-4 au sein de la population lymphocytaire CD8+. Toutes les cellules contenues dans les
cadrans Q1 et Q2 sont considérées comme positives pour l’IL-4. (b) Quantification des cellules positives pour
l’IL-4 au sein de la population lymphocytaire CD8+. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. N = 11
individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 pour le groupe TYK2GC.
L’ensemble de ces données suggère que l’allèle C du polymorphisme rs34536443 de
TYK2 modifie la balance Th1/Th2 en faveur d’une réponse pro-Th2, ce qui pourrait expliquer
la protection conférée par cet allèle dans la susceptibilité à la SEP. Par contre, aucune
différence dans la polarisation des lymphocytes T vers un profil Th1 ou Th17 n’a été observée
en séparant les patients suivant leur génotype pour le polymorphisme rs34536443.
Résultats
141
II. Le locus IFIH1-GCA-KCNH7 n’est pas associé à la
susceptibilité génétique à la SEP dans la population française.
II.1. Objectifs
En 2008, Martinez et al. publièrent un travail associant le locus IFIH1-GCA-KCNH7,
et plus précisément les polymorphismes rs1990760 et rs2068330, à la susceptibilité à la SEP
[Martínez et al., 2008]. Ces deux polymorphismes localisent dans deux gènes diffèrents, IFIH1 et
KCNH7 respectivement. Précédemment, le polymorphisme contenu dans le locus IFIH1 avait
été associé au diabète de type 1, une autre maladie auto-immune [Smyth et al., 2006]. Le gène
IFIH1, aussi connu sous le nom de MDA-5, fait partie des gènes dont l’expression est activée
par les IFNs. Il code pour une hélicase qui, grâce à son domaine de recrutement des caspases
en N-terminal, induit la mort des cellules infectées par des virus [Andrejeva et al., 2004]. Afin de
confirmer cette association du locus IFIH1-GCA-KCNH7 avec la SEP, une cohorte composée
de familles trio françaises fut génotypée pour ces deux polymorphismes par une approche en
PCR TaqMan.
II.2. Résultats
Ce travail de réplication de l’association du locus IFIH1-GCA-KCNH7 avec la
susceptibilité à la SEP a fait l’objet d’une publication en 2009 dans la revue European Journal
of Human Genetics. Les résultats sont présentés ci-dessous.
Résultats
142
Résultats
143
Résultats
144
Résultats
145
Résultats
146
Résultats
147
III. Les gènes de la famille des OAS et susceptibilité à la SEP
III.1. Objectifs
Ce travail avait pour objectif d’identifier de nouveaux gènes associés à une
augmentation de la susceptibilité à la SEP parmi les gènes codant pour des protéines de la
voie de signalisation des IFNs de type 1. En effet, cette voie est impliquée dans la pathogénie
de plusieurs maladies auto-immunes dont la SEP [Theofilopoulos et al., 2005].
Dans ce but, une cohorte cas-témoins, homogène en âge et en sexe, fut réunie. Bien
que modeste en taille (20 individus dans chaque groupe), cette cohorte présentait l’avantage
d’inclure des individus SEP recrutés au tout début de la maladie. Le sang des patients SEP fut
prélevé au moment du diagnostic, c’est-à-dire après la première ou la seconde poussée, et
avant la mise en place du moindre traitement (immuno-modulateur ou immuno-suppresseur).
III.2. Résultats
III.2.1. Modification de l’expression des gènes de la voie des IFNs de type 1 chez les patients
SEP
Afin d’identifier de nouveaux gènes associés à la susceptibilité à la SEP, nous avons
tout d’abord étudié l’expression de 92 gènes appartenant à la voie des IFNs de type 1 par une
approche en PCRarray (la liste des gènes étudiés est disponible dans le chapitre « Annexes »,
Figure S1). Cette analyse fut réalisée sur la cohorte cas-témoins comprenant les patients pris
précocement dans l’évolution de la SEP. Parmi l’ensemble des gènes présentant une
différence d’expression chez les patients SEP par rapport aux témoins, seuls MxB, OAS2 et
OASL démontrèrent une significativité statistique inférieure à P = 0,005 (Figure 45a). Ces 3
gènes avaient une expression augmentée chez les patients SEP par rapport aux témoins : MxB
démontra une différence d’expression de 1,7 (P = 0,0005 ; Figure 45c), OAS2 de 1,9 (P
= 0,002 ; Figure 45d) et OASL de 1,5 (P = 0,004 ; Figure 45e). Cependant, l’approche par
PCRarray pose le problème de la localisation inconnue des sondes et de la possible
amplification de l’ADN. Il était donc important de reproduire ces résultats par une approche
plus traditionnelle en RT-PCR quantitative. Les différences d’expression furent confirmées
Résultats
148
sur la même cohorte, par RT-PCR quantitative en utilisant des sondes spécifiques des ARNm
et de l’ensemble des isoformes (pour les gènes en codant plusieurs ; Figure 45b).
De ce travail, il ressortit que deux gènes de la famille des OAS présentaient une
différence significative d’expression entre les patients SEP et les témoins. Nous avons alors
choisi d’étudier si des polymorphismes présents dans OAS2 ou OASL pouvaient être associés
à la susceptibilité à la SEP.
Figure 45 : Comparaison de l’expression des gènes de la voie des IFNs de type 1 chez des patients SEP par
rapport à des témoins. (a) Résumé des résultats de quantification d’expression par PCRarray pour les gènes
présentant une différence statistique de P < 0,005. N = 17 pour les témoins et N = 17 pour les patients SEP. (b)
Validation de la quantification de l’expression de MxB, OAS2 et OASL par RT-PCR quantitative. N = 19 pour
les témoins et N = 19 pour les patients SEP. (c-e) Représentation graphique des résultats de quantification
obtenus en PCRarray pour (c) MxB, (d) OAS2 et (e) OASL. Chaque barre représente la moyenne ± s.e.m. CTR :
témoins. SEP : patients SEP.
II I.2.2. Association du gène OASL avec la susceptibilité à la SEP dans la population française
Dans un effort d’identifier une possible association du gène OASL avec la
susceptibilité à la SEP, une cohorte composée de familles trio fut utilisée. Cinq
polymorphismes, répartis sur l’ensemble du gène codant pour la protéine OASL, ont été
génotypés par une approche en PCR TaqMan (Figure 46a). Puis, une analyse en TDT fut
pratiquée sur les 591 familles trio SEP françaises disponibles. Par cette analyse, aucun des
polymorphismes étudiés ne démontra une sur-transmission significative d’un des allèles aux
Résultats
149
enfants souffrant de SEP (Figure 46b). Ainsi, dans la population française, le gène OASL ne
semble pas être un gène de susceptibilité à la SEP.
Figure 46 : Le gène OASL n’est pas associé avec la susceptibilité à la SEP dans les familles trio françaises.
(a) Les polymorphismes étudiés sont représentés sur la carte génétique par des boules bleues numérotées. 1 :
rs4556628, 2 : rs10849832, 3 : rs3213545, 4 : rs3213546, 5 : rs12819210. Les triangles noirs représentent les
blocs de polymorphismes en déséquilibre de liaison. (b) Résultats du génotypage, par une approche en PCR
TaqMan, de 591 familles trio françaises pour 5 polymorphismes répartis sur l’ensemble du gène codant pour
OASL. aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission
(T/U).
III.2.3. Association du gène OAS2 avec la susceptibilité à la SEP dans la population française
La même approche que celle menée pour le gène OASL fut pratiquée pour le gène
OAS2. L’utilisation du procédé en PCR TaqMan permit de génotyper neuf polymorphismes
Résultats
150
répartis sur l’ensemble du gène OAS2 (Figure 47a). Les résultats du génotypage de 591
familles trio SEP françaises furent analysés en TDT. Cette analyse révéla une association
entre deux polymorphismes d’OAS2, rs12815666 et rs1298301, et la susceptibilité à la SEP
(Figure 47b). Le polymorphisme rs12815666 démontra une sur-transmission de l’allèle T aux
enfants souffrant de SEP (P = 0,016). Pour le polymorphisme rs1298301, c’était l’allèle G qui
était sur-transmis (P = 0,007). Pour augmenter la puissance statistique, 49 familles trio
supplémentaires furent génotypées pour ces deux polymorphismes, portant ainsi la cohorte
disponible pour cette étude à une taille de 640 familles. De cette extension, l’association du
polymorphisme rs12915666 ressortit renforcée (P = 0,008), alors que celle du polymorphisme
rs1298301 atteignit la limite de la significativité (P = 0,059).
Afin de valider ces résultats d’association d’OAS2 avec la susceptibilité à la SEP dans
la population française, les polymorphismes rs12815666 et rs1298301 furent génotypés dans
une cohorte cas-témoins (Tableau IV et Tableau V). Les résultats obtenus ne sont que
préliminaires à cause du faible nombre d’individus disponibles (environ 600 cas et 350
témoins). L’approche cas-témoins ne révéla pas d’association significative ni pour le
polymorphisme rs12815666 (P = 0,803 ; Tableau IV), ni pour le polymorphisme rs1298301
(P = 0,450 ; Tableau V).
Résultats
151
Figure 47 : Le gène OAS2 est associé avec la susceptibilité à la SEP dans les familles trio françaises. (a) Les
polymorphismes étudiés sont représentés sur la carte génétique par des boules bleues numérotées. 1 :
rs12815666, 2 : rs1298301, 3 : rs2072138, 4 : rs1293764, 5 : rs1293755, 6 : rs2239193, 7 : rs1293749, 8 :
rs1293747, 9 : rs15895. Les triangles noirs représentent les blocs de polymorphismes en déséquilibre de liaison.
(b) Résultat du génotypage, par une approche en PCR TaqMan, des familles trio françaises pour 9
polymorphismes répartis sur l’ensemble du gène codant pour OAS2. aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission (T/U). cRésultats du génotypage effectué sur 591
familles trio françaises. dRésultats du génotypage effectué sur 640 familles trio françaises.
Résultats
152
Tableau IV : Analyse d’association du polymorphisme rs12815666 d’OAS2 dans la SEP par une approche
en cas-témoins.
rs12815666 N No d’
allèles T
Freq de
l’allèle T
No d’
allèles C
Freq de
l’allèle C RR (95% c.i.) χ2 P
Cas 600 194 0,16 1006 0,84 1,03 (0,83-1,27) 0,059 0,803
Témoins 362 114 0,16 610 0,84
N, nombre d’individus. « No d’allèles » fait référence au nombre d’allèles du polymorphisme rs34536443. RR,
risque relatif. c.i., intervalle de confiance
Tableau V : Analyse d’association du polymorphisme rs1298301 d’OAS2 dans la SEP par une approche
en cas-témoins.
rs1298301 N No d’
allèles G
Freq de
l’allèle G
No d’
allèles A
Freq de
l’allèle A RR (95% c.i.) χ2 P
Cas 588 990 0,84 186 0,16 0,98 (0,95-1,02) 0,572 0,450
Témoins 358 612 0,85 104 0,15
N, nombre d’individus. ‘No d’allèles’ fait référence au nombre d’allèles du polymorphisme rs34536443. RR,
risque relatif. c.i., intervalle de confiance.
L’ensemble de ces résultats ne permet pas de conclure de manière certaine que le gène
OAS2 constitue un gène de susceptibilité à la SEP dans la population française. Le
génotypage d’autres cohortes, de taille plus importantes, permettrait de confirmer ou non les
données que nous avons obtenues.
Résultats
153
FFAACCTTEEUURRSS EEPPII GGEENNEETTII QQUUEESS EETT
SSUUSSCCEEPPTTII BBII LL II TTEE AA LL AA SSEEPP
Résultats
154
Résultats
155
I. Inactivation du chromosome X et susceptibilité à la SEP
I.1. Objectifs
Une des caractéristiques communes aux maladies auto-immunes est que les femmes
sont plus affectées que les hommes. Bien que cette différence de susceptibilité demeure
encore inexpliquée, plusieurs hypothèses furent proposées comme l’importance du système
hormonal. Une autre différence majeure entre les hommes et les femmes est le nombre de
chromosomes X présents dans chaque cellule et le mécanisme du XCI que cela implique.
Ainsi, les femmes sont composées de deux populations cellulaires en fonction de l’origine du
chromosome X exprimé, alors que les hommes n’en sont composés que d’une seule. Plusieurs
maladies auto-immunes, comme la sclérodermie et la thyroïdite auto-immune, présentent une
modification du profil du XCI. En effet, il fut démontré que dans les cohortes de patients
souffrant d’une de ces maladies, une plus grande proportion d’individus présentait un fort
biais du XCI (c'est-à-dire que l’expression du chromosome X paternel comparée à celle du
chromosome X maternel s’éloignait d’un ratio 50:50 dans les cellules sanguines) comparé à
une cohorte de témoins. L’objectif de notre travail était de déterminer si un tel phénomène
existait dans la SEP, et s’il pouvait expliquer la discordance de statut clinique pour la maladie
observée chez des jumelles MZ. Entre le début de cette étude et l’écriture de cette thèse une
autre équipe publia des résultats concernant l’importance du XCI dans la SEP [Knudsen et al.,
2007].
Le profil du XCI est mesuré par à une succession d’étapes de digestion et
d’amplification par PCR (Figure 48). L’ADN génomique est soumis ou non à une étape de
digestion par l’enzyme HhaI, qui est sensible aux méthylations. Le chromosome X inactif est
fortement méthylé ce qui empêche la digestion des sites reconnus par l’enzyme. Puis est
réalisé une amplification par PCR d’un gène localisé sur le chromosome X : le gène codant
pour le récepteur aux androgènes. Les oligomères nucléotidiques spécifiques de ce gène
encadrent un microsatellite ainsi qu’une séquence reconnue par l’enzyme de digestion HhaI.
Seul le gène présent sur le chromosome X inactif peut être amplifié par PCR après digestion
avec HhaI. Le profil d’inactivation du chromosome X est alors calculé en mesurant l’intensité
des fragments amplifiés après migration en microcapillaires.
Résultats
156
Figure 48 : Protocole expérimental permettant de mesurer le profil d’inactivation du chromosome X chez
une femme.
Ce profil du XCI est exprimé en pourcentage. 50% représente une inactivation
aléatoire du chromosome X, c’est à dire un nombre égal de cellules exprimant le chromosome
X d’origine parternelle et de cellules exprimant le chromosome X d’origine maternelle. Ce
profil peut s’échelonner de 50% à 100% s’il ne prend pas en compte l’origine du chromosome
X inactivé (ce qui est en général le cas pour les études menées sur des cohortes cas-témoins)
ou de 0% à 100% s’il en tient compte. 0% et 100% réprésentent alors des biais complets où
toutes les cellules expriment un chromosome X de même origine.
I.2. Résultats
I.2.1. L’immortalisation par l’EBV modifie le profil du XCI
Nous disposons au laboratoire d’une importante collection d’ADNs extraits à partir de
cellules issues de patients SEP et de témoins, immortalisées par l’EBV. Afin de savoir si ces
échantillons pouvaient être utilisés pour étudier l’importance du XCI dans la SEP, il fallu
déterminer si l’immortalisation des cellules par l’EBV modifiait le profil du XCI. Dans ce but,
Résultats
157
il fut extrait de l’ADN partir de sang frais de 10 individus puis à partir de cellules issues de
ces mêmes individus et immortalisées par l’EBV. Le profil de XCI fut mesuré sur les deux
types d’ADN pour chacun des individus (Figure 49). Le profil du XCI fut mesuré par
amplification du gène codant pour le récepteur aux androgènes. L’analyse de la corrélation
démontra que l’immortalisation des cellules avait pour conséquence de modifier leur profil de
XCI. En effet, sur les 10 individus testés, l’immortalisation modifia légèrement le profil de
XCI chez 2 individus et fortement chez 4 autres individus. L’immortalisation modifiant le
profil de XCI chez certains individus, nous avons décidé d’utiliser pour la suite de l’étude
uniquement de l’ADN extrait sur du sang frais.
Figure 49 : L’immortalisation des cellules immunitaires par l’EBV modifie leur profil de XCI. Corrélation
comparant le profil du XCI avant et après immortalisation des cellules immunitaires, pour chaque individu. Le
profil du XCI est calculé après amplification par PCR du gène codant pour le récepteur aux androgènes,
précédée ou non d’une digestion par l’enzyme HhaI. La ligne noire, de fonction Y=X, représente une corrélation
parfaite qui serait obtenue si l’immortalisation ne modifiait pas le profil du XCI. N = 10 individus, et chaque
rond correspond à un individu.
I.2.2. Les patientes SEP présentent un profil du XCI moins biaisé que les témoins
Afin de déterminer si une modification du profil du XCI pouvait expliquer la plus
grande susceptibilité des femmes à la SEP, une cohorte composée de 68 femmes témoins et de
74 patientes souffrant de SEP fut réunie. Le profil du XCI fut mesuré par une approche
standard utilisée pour ce genre d’étude (amplification du gène codant pour le récepteur aux
androgènes). Le profil du XCI évoluant lentement au cours de l’avancée dans la vie, il était
important que nos groupes de patientes SEP et de témoins soient homogènes concernant leur
âge. Ainsi, l’âge moyen calculé était de 33,2 ans pour les témoins et de 33,5 ans pour les
patientes SEP, ce qui ne représente pas une différence significative (P = 0,82).
Résultats
158
La mesure du profil du XCI permit de mettre en évidence une différence significative
entre les témoins et les patientes SEP (Figures 50b). En effet, les témoins présentaient en
moyenne un biais du XCI plus important (61%) que les patientes SEP (58,4% ; P = 0,02). De
plus, l’observation de la répartition des individus en fonction des classes du profil du XCI
démontra un plus fort pourcentage d’individus dans la classe de biais 50%-59% chez les
patientes SEP que chez les témoins, avec respectivement 73% des individus contre 57%
(Figure 50a). Cependant, pour les forts biais du profil du XCI (plus de 80% des cellules ayant
le même chromosome X actif), aucune différence significative ne fut démontrée en comparant
les deux groupes (P = 0,72 ; Figure 50b). Contrairement à d’autres maladies auto-immunes,
comme la thyroïdite auto-immune et la sclérodermie, dans lesquels les patientes présentaient
un biais augmenté du profil du XCI par rapport aux témoins, dans la SEP cela semble être
l’inverse. Le biais du XCI était plus faible chez les patientes que chez les témoins.
Figure 50 : Le profil du XCI diffère entre la population de patientes SEP et la population de témoins. Le
profil du XCI est calculé après amplification par PCR du gène codant pour le récepteur aux androgènes,
précédée ou non d’une digestion par l’enzyme HhaI. (a) Représentation graphique de la répartition des individus
en fonction du profil du XCI mesuré. Les barres blanches correspondent aux individus témoins et les barres
noires aux patientes SEP. (b) Tableau résumant l’ensemble des données comparant le profil du XCI mesuré chez
les témoins et chez les patientes SEP. N = 68 témoins (CTR) et N = 74 patientes SEP. c.i. intervalle de
confiance.
Résultats
159
I.2.3. Corrélation du profil du XCI au sein de cohortes de jumelles MZ, établie en fonction du
statut clinique pour la SEP
Afin de confirmer les données obtenues en cas-témoins et, plus largement, de valider
l’hypothèse qu’une modification du profil du XCI pouvait être associée à la susceptibilité à la
SEP, nous avons essayé de reproduire ces résultats sur des cohortes composées de jumelles
MZ. En effet, l’utilisation de telles cohortes présente des avantages non négligeables : la sœur
de l’individu malade sert de témoin idéal car il est possible de faire abstraction de
l’information génétique (partagée à 100% entre les deux individus MZ) et en grande partie de
l’environnement. Pour cela, nous avons réuni 29 paires de jumelles MZ saines toutes les deux,
servant de population témoin (CTR/CTR), 21 paires de jumelles MZ discordantes pour la SEP
(CTR/SEP) et 8 paires de jumelles concordantes pour la SEP (SEP/SEP) (Figure 51). La
monozygotie des individus fut confirmée génétiquement par l’analyse d’un panel de plusieurs
microsatellites répartis sur différents chromosomes. Les deux cohortes les plus importantes en
taille ne démontrèrent pas de différences significatives dans l’âge moyen des individus (35,3
ans pour la population CTR/CTR et 40,8 ans pour la population CTR/SEP, P = 0,24). Pour la
cohorte SEP/SEP, seul l’âge de 3 couples d’individus était connu, portant l’âge moyen à 51,7
ans. Cependant, il ne différait pas des 2 autres cohortes (P = 0,14 en comparant avec la
cohorte CTR/CTR et P = 0,18 en comparant avec la cohorte CTR/SEP).
Le profil du XCI fut mesuré par amplification du récepteur aux androgènes par PCR,
ce qui permit de connaître la corrélation qu’il existait pour ce profil entre les individus
composant chaque paire de jumelles (Figures 51a-c). Le coefficient de corrélation calculé
pour la cohorte CTR/SEP donna un r égal à 0,68 (P = 0,0002 ; Figure 51d). Afin de
déterminer si les différences observées du profil du XCI au sein des paires de la cohorte
CTR/SEP étaient associées à une discordance du statut clinique pour la SEP ou alors étaient
seulement le reflet d’événements stochastiques, le coefficient de corrélation fut calculé pour
les cohortes CTR/CTR et SEP/SEP dont les individus sont cliniquement concordants. Les
valeurs sont respectivement égales à r = 0,76 (P < 0,0001 ; Figure 51d) et r = 0,43 (valeur
exacte ; Figure 51d). Bien que la corrélation soit moins bonne dans la cohorte CTR/SEP par
rapport à la cohorte CTR/CTR, une analyse statistique ne permit pas de mettre en évidence
une différence significative entre les deux groupes (P = 0,59 ; Figure 51d). Ainsi, l’utilisation
de paires jumelles ne permit pas de confirmer l’association d’une modification du profil du
XCI avec le statut clinique pour la SEP. Cependant, la tendance à obtenir une corrélation plus
mauvaise au sein de la cohorte CTR/SEP comparé à la cohorte CTR/CTR laisse croire que
Résultats
160
l’absence de significativité pourrait être dûe à des tailles de cohortes trop restreintes. Cette
faible taille des échantillons ne nous permettrait pas d’obtenir une puissance statistique
suffisante pour détecter le faible effet de la modification du profil du XCI sur la susceptibilité
à la SEP.
Figure 51 : Comparaison du coefficient de corrélation pour le profil du XCI au sein de cohortes de
jumelles MZ, en fonction du statut clinique pour la SEP. Le profil du XCI est calculé après amplification par
PCR du gène codant pour le récepteur aux androgènes, précédée ou non d’une digestion par l’enzyme HhaI.
CTR : témoins, SEP : patientes SEP. (a-c) Représentation graphique de la corrélation intra-paire pour le profil du
XCI. La ligne noire représente la corrélation linéaire au sein de la cohorte. (a) Corrélation pour la cohorte
CTR/SEP. Jumelle a : CTR, jumelle b : SEP. N = 21 paires de jumelles. (b) Corrélation pour la cohorte
CTR/CTR. N = 29 paires de jumelles. (c) Corrélation pour la cohorte SEP/SEP. N = 8 paires de jumelles. (d)
Tableau résumant l’ensemble des données obtenues concernant les coefficients de corrélation du profil du XCI. aTest de rang de Spearman, bComparaison des coefficients de corrélation avec le groupe CTR/SEP par
transformation en Z de Fisher, cValeur exacte.
I.2.4. La monosomie du chromosome X dans la SEP
Des études réalisées chez les femmes ont montré que plusieurs maladies auto-
immunes, en plus d’être associées à une modification du profil du XCI, étaient associées à une
augmentation du pourcentage de cellules sanguines ayant perdu un de leur chromosome X.
Afin de déterminer si les patientes SEP présentaient une augmentation du pourcentage
de cellules sanguines ayant une monosomie pour le chromosome X, une cohorte de 10
jumelles MZ discordantes pour la SEP fut réunie. Les cellules du sang périphérique furent
Résultats
161
marquées par hybridation in situ à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques pour les
chromosomes X et Y (Figure 52a). Pour chaque individu, il fut compté dans chaque noyau
(pour une moyenne de 750 noyaux) le nombre de chromosomes X et éventuellement de
chromosome Y. La monosomie pour le chromosome X fut systématiquement confirmée par
l’absence de chromosome Y dans le noyau. Le pourcentage de cellules présentant une
monosomie du chromosome X était de à 4,1% chez les jumelles témoins contre 4,3% chez les
jumelles souffrant de SEP. La comparaison intra-paire ne permit pas de mettre en évidence de
différence dans la monosomie du chromosome X chez la jumelle souffrant de SEP par rapport
à sa sœur saine servant de témoin (P = 0,8 ; Figure 52b). Ainsi, une plus forte monosomie du
chromosome X ne semble pas être un phénomène associé à la SEP.
Figure 52 : Monosomie du chromosome X au sein de paires de jumelles MZ discordantes pour la SEP. (a)
Image obtenue en microscopie à champ large après marquage des chromosomes X et Y par hybridation in situ.
L’image de gauche provient du marquage de cellules du sang périphérique d’une femme. Une cellule présentant
une monosomie du chromosome X y est visible (flèche blanche). L’image de droite provient du marquage de
cellules du sang périphérique d’un homme. Le noyau des cellules, marqué au DAPI, apparaît en bleu. Les sondes
spécifiques des chromosomes X et Y apparaissent respectivement en vert et en rose. (b) Comparaison de la
monosomie du chromosome X au sein de chaque paire de jumelles MZ discordantes pour la SEP. Les lignes
noires relient chacune des sœurs d’une paire. N = 10 paires de jumelles MZ.
Résultats
162
Résultats
163
FFAACCTTEEUURRSS GGEENNEETTII QQUUEESS EETT
RREEPPOONNSSEE AAUU TTRRAAII TTEEMM EENNTT
Résultats
164
Résultats
165
I. Recherche de marqueurs génétiques prédictifs de la réponse au
traitement de la SEP par l’IFNββββ
I.1. Objectifs
Bien que la molécule d’IFNβ soit utilisée depuis de nombreuses années dans le
traitement de la SEP, il n’existe à l’heure actuelle encore aucun marqueur (clinique,
radiologique, génétique…) prédictif de la réponse du patient au traitement. Sachant que
seulement 1/3 des patients traités répondent favorablement au traitement, il est urgent de
trouver rapidement de tels marqueurs. Cela permettrait d’une part d’améliorer la prise en
charge du malade et d’autre part d’éviter des dépenses de santé inutiles. Des travaux
antérieurs avaient déjà associés des polymorphismes contenus dans des gènes de la voie des
IFNs de type 1 avec la réponse au traitement de l’hépatite C par l’IFNα. C’est en s’appuyant
sur ces résultats que nous avons recherché des polymorphismes qui pouvaient présenter un
intérêt clinique dans la prédiction de l’efficacité de la thérapie par IFNβ dans la SEP
I.2. Résultats
I.2.1. Recherche de polymorphismes associés à la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ
Pour mener cette étude, une cohorte franco-espagnole de patients SEP traités par
l’IFN β fut réunie. Les critères cliniques disponibles pendant les deux premières années de
traitement permirent de classer les patients en deux groupes extrêmes de réponse : les patients
répondeurs et les patients non-répondeurs (critères de classification décrits dans le chapître
« Matériels et Méthodes »). Cette recherche préliminaire de polymorphismes permettant de
prédire la réponse au traitement par l’IFNβ dans la SEP s’appuya sur des données déjà
publiées. Ainsi, 13 polymorphismes localisés dans 8 gènes (CTLA-4, IL-10, IRF1, IRF4,
MAP3K3, MxA, OAS1 et TRAIL), connus pour influencer l’efficacité du traitement de
l’hépatite C par l’IFNα, furent génotypés par PCR TaqMan sur la cohorte. Sur l’ensemble des
polymorphismes génotypés, des associations significatives ou en étant proches furent trouvées
pour les gènes TRAIL (Figure 53) et OAS1 (Figure 53). Si l’étude par génotype du
polymorphisme rs1131532 localisé dans le gène TRAIL n’apporta pas de résultats
Résultats
166
significatifs (Figure 53a), l’analyse de la fréquence de portage de l’allèle A démontra un
enrichissement, proche de la significativité (P = 0,06), de l’allèle A chez les patients
répondeurs par rapport aux non-répondeurs (Figure 54b). Les porteurs de l’allèle A
présentaient un risque relatif de réponse au traitement augmenté de 1,5 fois par rapport aux
non-porteurs. De plus, l’analyse du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 démontra un
enrichissement significatif (P = 0,02) de l’allèle G chez les patients répondeurs par rapport
aux non-répondeurs (Figure 54c). Les porteurs de l’allèle G présentaient un risque relatif de
réponse au traitement augmenté de 1,42 fois. A l’opposé, il fut observé un enrichissement
proche de la significativité (P = 0,08) de l’allèle A chez les patients non-répondeurs par
rapport aux répondeurs (Figure 54b), conférant aux porteurs de l’allèle A un risque de non-
réponse augmenté de 1,12 fois. Ces travaux préliminaires suggèrent que les gènes TRAIL et
OAS1 pourraient être d’un intérêt clinique dans la prédiction de l’efficacité de la thérapie par
l’IFN β dans la SEP.
Figure 53 : Association du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL avec la réponse au traitement de la
SEP par l’IFN ββββ. (a) Comparaison de la fréquence des génotypes en fonction du statut de réponse au traitement
par l’IFNβ (b-c) Comparaison des fréquences de portage de l’allèle A (b) ou de l’allèle G (c) en fonction du
statut de réponse au traitement par l’IFNβ. R, patients répondeurs au traitement. NR, patients non-répondeurs au
traitement. N, nombre d’individus. « Freq » fait référence à la fréquence des individus porteurs du génotype (a)
ou de l’allèle indiqué (b-c). RR, risque relatif de réponse au traitement. c.i., intervalle de confiance.
Résultats
167
Figure 54 : Association du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec la réponse au traitement de la SEP
par l’IFN ββββ. (a) Comparaison de la fréquence des génotypes en fonction du statut de réponse au traitement par
l’IFNβ (b-c) Comparaison des fréquences de portage de l’allèle A (b) ou de l’allèle G (c) en fonction du statut de
réponse au traitement par l’IFNβ. R, patients répondeurs au traitement. NR, patients non-répondeurs au
traitement. N, nombre d’individus. « Freq » fait référence à la fréquence des individus porteurs du génotype (a)
ou de l’allèle indiqué (b-c). RR, risque relatif de réponse au traitement. c.i., intervalle de confiance.
II.2.2. Confirmation des données d’association entre OAS1 et TRAIL dans la réponse au
traitement de la SEP
Afin de confirmer les résultats associant le polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL
et le polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec l’efficacité du traitement de la SEP par
l’IFN β, ces deux polymorphismes furent génotypés dans une nouvelle cohorte de taille plus
importante. Dans ce but, une cohorte regroupant des patients SEP français, espagnols et
allemands sous traitement par IFNβ fut réunie. Ces patients furent classés en fonction de leur
réponse au traitement en appliquant les mêmes critères que ceux utilisés dans l’étude
préliminaire. L’analyse du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL, par génotype (P =
0,49) ou par portage d’allèle (P = 1,00 et P = 0,32), ne permit pas de confirmer l’association
avec la réponse au traitement obtenue précédemment (Figure 55). De manière similaire,
l’analyse du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 s’accompagna d’une absence
d’association avec la réponse au traitement dans la SEP, quelle que soit l’approche analytique
utilisée (Figure 56). En s’appuyant sur cette seconde étape de confirmation des données
préliminaires, il nous a été impossible de confirmer que les 2 polymorphismes localisés dans
Résultats
168
les gènes TRAIL et OAS1 pouvaient être utilisés comme des marqueurs génétiques prédictifs
de la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.
Figure 55 : Invalidation de l’association du polymorphisme rs1131532 du gène TRAIL avec la réponse au
traitement de la SEP par l’IFNββββ. (a) Comparaison de la fréquence des génotypes en fonction du statut de
réponse au traitement par l’IFNβ (b-c) Comparaison des fréquences de portage de l’allèle A (b) ou de l’allèle G
(c) en fonction du statut de réponse au traitement par l’IFNβ. R, patients répondeurs au traitement. NR, patients
non-répondeurs au traitement. N, nombre d’individus. « Freq » fait référence à la fréquence des individus
porteurs du génotype (a) ou de l’allèle indiqué (b-c). RR, risque relatif de réponse au traitement. c.i., intervalle
de confiance.
Résultats
169
Figure 56 : Invalidation de l’association du polymorphisme rs2660 du gène OAS1 avec la réponse au
traitement de la SEP par l’IFNββββ. (a) Comparaison de la fréquence des génotypes en fonction au statut de
réponse au traitement par IFNβ (b-c) Comparaison des fréquences de portage de l’allèle A (b) ou de l’allèle G
(c) en fonction du statut de réponse au traitement par IFNβ. R, patients répondeurs au traitement. NR, patients
non-répondeurs au traitement. N, nombre d’individus. « Freq » fait référence à la fréquence des individus
porteurs du génotype (a) ou de l’allèle indiqué (b-c). RR, risque relatif de réponse au traitement. c.i. intervalle de
confiance.
Résultats
170
Résultats
171
II. Etude de l’effet d’un polymorphisme de TYK2 sur la réponse
au traitement de la SEP par l’IFNββββ.
I.1. Objectifs
Le gène TYK2 code pour une kinase indispensable à la transmission du signal dans la
voie des IFNs de type 1. Précédemment, nous avons démontré que le polymorphisme
rs34536443 du gène TYK2 avait pour conséquence d’influencer l’activité de l’enzyme en
fonction de l’allèle codé. Il était donc intéressant d’évaluer l’effet de ce polymorphisme dans
la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.
L’étude de l’effet du polymorphisme rs34536443 dans la réponse au traitement fut
réalisée par une approche fonctionnelle, en analysant les modifications de l’expression des
marqueurs nucléaires pro-Th1, pro-Th2 et pro-Th17, mais aussi en réunissant une cohorte
européenne de patients SEP traités par l’IFNβ et dont les données cliniques disponibles
permettaient de définir leur statut de réponse au traitement.
I.2. Résultats
I.2.1. Le polymorphisme rs34536443 modifie la polarisation lymphocytaire
Malgré l’obtention par différentes équipes de données contradictoires concernant les
mécanismes d’action de l’IFNβ, il semble que la molécule modifie la polarisation des
lymphocytes T. C’est pourquoi nous avons choisi d’étudier l’expression de T-bet, de GATA3
et de RORγt (trois facteurs nucléaires associés respectivement à une polarisation
lymphocytaire pro-Th1, pro-Th2 et pro-Th17) avant et après la mise en contact des
lymphocytes avec l’IFNβ. Indépendamment du génotype pour le polymorphisme rs34536443
de TYK2, l’ajout d’IFNβ dans la culture a pour effet d’augmenter significativement
l’expression de T-bet (Figure 57a) et de diminuer significativement l’expression de GATA3
et de RORγt (Figures 57b-c). Cependant, malgré cette tendance générale partagée par les
deux génotypes, il fut démontré que le génotype TYK2GG présentait une plus forte
augmentation d’expression de T-bet (4,2 fois) comparé au génotype TYK2GC (2,8 fois ; P =
0,01 ; Figure 57b). A l’inverse, la diminution d’expression de GATA3 et de RORγt était
Résultats
172
moins marquée pour le génotype TYK2GG (0,4 fois pour GATA3 et RORγt) que pour le
génotype TYK2GC (0,2 fois ; P = 0,0006 pour GATA3 ; Figure 57d ; 0,3 fois ; P= 0,02 pour
RORγt ; Figure 57f).
Figure 57 : Le polymorphisme rs34536443 contrôle le niveau d’expression des facteurs nucléaires de
polarisation lymphocytaire en présence d’IFNββββ. Quantification par RT-PCR quantitative de l’expression de
T-bet (a-b), de GATA3 (c-d) et de RORγt (e-f) réalisée sur des lymphocytes amplifiés. L’expression relative
correspond à l’évaluation de l’expression du gène avant (-IFNβ) et après stimulation (+IFNβ) par l’IFNβ. La
stimulation est réalisée pendant 2 heures (ou 4 heures pour GATA3) à 1 000 U/ml. L’expression relative est
calculée sur la moyenne des duplicats normalisés sur le gène de ménage GAPDH. Chaque barre représente la
moyenne ± s.e.m. N = 11 individus pour le groupe TYK2GG et N = 12 individus pour le groupe TYK2GC.
I.2.2. Association du polymorphisme rs34536443 avec la réponse au traitement de la SEP par
l’IFN β
Bien que le polymorphisme rs34536443 semblait contrôler la polarisation
lymphocytaire en présence d’IFNβ, il était indispensable de contrôler si ce polymorphisme
permettait de prédire la réponse des patients SEP au traitement par IFNβ. Dans ce but, il fut
Résultats
173
réuni une cohorte européenne (française, espagnole et allemande) de patients SEP dont le
statut de réponse au traitement était bien défini. Cette cohorte composée de 365 individus
(142 répondeurs et 223 non-répondeurs) ne comportait que des patients souffrant de la forme
RR-MS. Le génotypage des individus par la méthode de PCR TaqMan ne permit pas de
mettre en évidence une différence significative de la fréquence des allèles dans les deux
classes de réponse (P = 0,71 ; Tableau VI). Cependant, ce résultat négatif est à pondérer. En
effet, l’allèle C est un allèle rare (MAF égale à 3%) ce qui rend difficile l’étude d’une
association entre le polymorphisme rs34536443 et la réponse au traitement de la SEP par
l’IFN β dans des cohortes de taille réduite.
Tableau VI : Analyse d’association du polymorphisme rs34536443 de TYK2 avec la réponse au traitement
de la SEP par l’IFNββββ.
Statut de réponse à
l’IFN ββββ N
No d’
allèles G
Freq de
l’allèle G
No d’
allèles C
Freq de
l’allèle C RR (95% de c.i.) χχχχ2 P
R 142 275 0,93 9 0,03 1,86 (0,77-4,49) 0,14 0,71
NR 223 434 0,93 12 0,03
R, patients répondeurs au traitement. NR, patients non-répondeurs au traitement. N, nombre d’individus. « No
d’allèles » fait référence au nombre d’allèles du polymorphisme rs34536443. RR, risque relatif. c.i., intervalle de
confiance.
Résultats
174
175
DDII SSCCUUSSSSII OONN
EETT
PPEERRSSPPEECCTTII VVEESS
Discussion et Perspectives
176
Discussion et Perspectives
177
I. Facteurs génétiques et susceptibilité à la SEP
I.1. Implication du gène TYK2 dans la susceptibilité génétique à la SEP
Les données de ce travail ont permis de confirmer les études génétiques précédentes
associant le polymorphisme rs34536443 du gène TYK2 avec la susceptibilité à la SEP [Ban et
al, 2009 ; ANZgene, 2009]. En effet, l’allèle G du polymorphisme rs34536443 augmente de 1,92
fois le risque de développer la maladie dans la population française. Ainsi, TYK2 est le 5ème
gène, n’appartenant pas à la famille du CMH, découvert comme associé à la pathogénie de la
SEP.
Ce polymorphisme localisé dans le domaine kinase de TYK2 conduit au changement
d’un acide aminé en position 1104 de la protéine [Kaminker et al., 2007]. Alors que l’allèle G
majoritaire dans la population caucasienne code pour une proline, l’allèle C minoritaire
conduit à son remplacement par une alanine. Les résultats obtenus au cours de ce travail
montrent pour la première fois que l’allèle C, associé à une moindre susceptibilité à la SEP
code pour une kinase TYK2 hypo-active. En effet, l’activation de TYK2 suite à l’engagement
du récepteur à l’IFNβ (IFNAR) conduit à une plus faible phosphorylation de TYK2 en
T1054/T1055 chez les individus TYK2GC comparés aux individus TYK2GG. Cette
phosphorylation est directement corrélable au niveau d’activation de TYK2. L’hypo-
activation de TYK2 chez les individus TYK2GC fut observée à toutes les étapes de
transduction du signal de la voie des IFNs de type 1 : une diminution de la phosphorylation de
STAT1 et STAT2 et une moins grande induction des gènes possédant une séquence ISRE
dans leur promoteur. L’ensemble de ces données permettent de conclure que l’allèle C du
polymorphisme rs34536443 associé à une diminution de la susceptibilité à la SEP serait
directement responsable d’une moindre activité de la kinase TYK2 suite au changement d’un
acide aminé dans le domaine kinase de la protéine. Ces résultats sont en accord avec les
données obtenues chez l’animal où une perte totale de l’activité kinase de TYK2 conduisait à
une résistance à l’induction de l’EAE, modèle de la SEP [Spach et al., 2009].
Bien qu’initialement découverte comme associée à la voie des IFNs de type 1, la
kinase TYK2 est en réalité impliquée dans de nombreuses voies de signalisation cytokiniques
comme la voie de l’IL-6, de l’IL-10, de l’IL-12 et de l’IL-23 [Watford et al, 2006]. Chez
l’Homme et chez l’animal, une perte totale de l’activité kinase de TYK2 conduit à une
modification de la polarisation lymphocytaire en favorisant une réponse anti-inflammatoire
Discussion et Perspectives
178
pro-Th2 [Ghoreschi et al., 2009]. Les résultats obtenus lors de cette étude montrent que l’allèle C
du polymorphisme rs34536443 modifie la polarisation des lymphocytes en favorisant une
réponse Th2. En effet, une augmentation d’expression du facteur nucléaire GATA3, marqueur
pro-Th2, a été observée chez les individus porteurs de l’allèle C comparé aux individus
homozygotes pour l’allèle G. Par ailleurs, corrélant avec l’étude d’expression, l’analyse des
cytokines produites par les lymphocytes démontra, chez les individus porteurs de l’allèle C,
une augmentation de la production d’IL-4 et d’IL-5 qui sont deux cytokines sécrétées par les
lymphocytes Th2. Cependant, pour l’IL-13, une autre cytokine de type Th2, aucune différence
n’apparut entre les deux génotypes du polymorphisme rs34536443. Bien que le
polymorphisme rs34536443 ait une influence sur la réponse Th2, il ne semble pas modifier les
réponses Th1 et Th17. En effet, aucune différence des facteurs pro-Th1 et pro-Th17 ne fut
observée. Ni l’expression des facteurs nucléaires T-bet et RORγt, ni la sécrétion d’IFNγ et
d’IL-17 ne présentèrent de différence après répartition des individus en fonction de leur
génotype pour le polymorphisme rs34536443. Cette étude préliminaire sur la sécrétion
cytokinique doit être renforcée par une analyse en cytométrie de flux. En effet, il est important
de déterminer si le polymorphisme rs34536443 influence la polarisation lymphocytaire à la
fois dans le compartiment T CD4+ et dans le compartiment T CD8+. Cette approche devrait
être prochainement menée dans notre laboratoire. De manière plus surprenante, les individus
porteurs de l’allèle C présentèrent une sécrétion augmentée d’IL-6 et d’IP-10. Bien que
l’association entre l’effet protecteur conféré par allèle C dans la SEP et une augmentation de
la sécrétion d’IL-6 et d’IP-10 puisse paraître paradoxale, plusieurs études ont démontré que
ces cytokines pouvaient avoir des effets protecteurs dans le développement de la SEP. L’IL-6
appartient à la famille des cytokines pro-inflammatoires [Kishimoto et al., 2005] et a un rôle
crucial durant la phase d’induction de l’EAE [Okuda et al., 1998]. De plus, le LCR des patients
SEP présente une concentration augmentée d’IL-6 par rapport à des individus sains
[Malmeström et al., 2006], alors que des cellules productrices d’IL-6 sont retrouvées dans les
lésions actives du SNC de ces patients [Maimone et al., 1997]. Cependant, le rôle de l’IL-6 dans
les pathologies neurologiques n’est pas encore bien cerné. En effet, l’injection d’IL-6 a un
effet bénéfique sur l’évolution de l’EAE induite par le virus de Theiler [Rodriguez et al., 1994],
alors qu’une augmentation transitoire de l’IL-6 serique chez les patients SEP ayant reçu une
injection d’IFNβ prédirait une réponse favorable au traitement [Nakatsuji et al., 2006]. L’IP-10
quant à elle, est une chimiokine qui joue un rôle majeur dans l’infiltration des monocytes dans
le SNC et dont le récepteur, CXCR3, est considéré comme une cible potentielle dans les
maladies impliquant un recrutement de cellules T inflammatoires [Fife et al., 2001].
Discussion et Perspectives
179
Paradoxalement, des souris invalidées pour le gène codant pour l’IP-10 développent une EAE
plus sévère que des animaux sauvages [Klein et al., 2004].
Au cours de cette étude, nous avons ainsi démontré que le polymorphisme rs34536443
associé à la susceptibilité à la SEP modifiait l’activité kinase de la protéine TYK2. L’allèle C,
qui est associé à une diminution de la susceptibilité à la SEP, code pour une kinase TYK2
hypo-active comparé à la forme codée par l’allèle G. Cette protection conférée par l’allèle C
du polymorphisme rs34536443 passerait par une réponse Th2 favorisée. L’ensemble de ces
résultats corroborent les données obtenues chez l’animal. Bien que la kinase TYK2 fut
initialement découverte comme impliquée dans la voie des IFNs de type 1, l’effet protecteur
du polymorphisme rs34536443 de TYK2 ne semble pas reposer exclusivement sur
l’implication de cette voie. En effet, chez l’animal, alors qu’une inhibition totale de la voie
des IFNs de type 1 induit une EAE exacerbée, l’inhibition totale de l’activité de TYK2
conduit au phénotype contraire c'est-à-dire à une résistance à la maladie. On peut donc
supposer que chez l’Homme, l’effet protecteur conféré par la diminution d’activité de TYK2,
codé par l’allèle C du polymorphisme rs34536443, implique majoritairement une voie
indépendante de la voie des IFNs de type 1. On peut espérer que, dans le futur, la découverte
de cette voie puisse permettre le développement de nouveaux traitements de la SEP.
I.2. Implication du locus IFIH1-GCA-KCNH7 dans la susceptibilité
génétique à la SEP
Les données de génétique obtenues par Martínez et al. [Martínez et al., 2008] associant
les polymorphismes rs1990760 et rs2068330, présents dans le locus IFIH1-GCA-KCNH7,
avec la susceptibilité à la SEP confirmaient la théorie du partage des loci de susceptibilité
entre les différentes maladies auto-immunes [Frazer et al., 2009]. Initialement découvert comme
associé à la susceptibilité au diabète de type 1 [Smyth et al., 2006] le polymorphisme rs1990760
du gène IFIH1 semblait aussi intervenir dans la pathogénie de la SEP. Afin de confirmer
l’association du locus IFIH1-GCA-KCNH7 avec la susceptibilité à la SEP dans la population
française, nous avons réalisé une approche similaire à celle menée par Martínez et al.
Cependant, l’absence de réplication dans notre étude ne permit pas de confirmer les travaux
précédents. Depuis la publication de notre étude, deux autres équipes se sont interessées à
l’implication du gène IFIH1 dans la susceptibilité à la SEP. Ces deux dernières études
obtinrent des résultats contradictoires. Alors qu’Enevold et al. montrèrent une association
Discussion et Perspectives
180
significative du polymorphisme rs1990760 du gène IFIH1 avec la SEP [Enevold et al., 2009], un
consortium international d’étude de la SEP s’appuyant sur de larges cohortes cas-témoins et
familles trio SEP ne parvint pas à mettre en évidence l’association d’IFIH1 avec la maladie
[IMSGC, 2009].
Ainsi à l’heure actuelle, à la vue des résultats obtenus par différentes équipes,
l’association du polymorphisme rs1990760 avec la SEP reste encore soumise à expectative.
Une analyse fonctionnelle menée sur l’effet du polymorphisme rs1990760 dans la SEP
permettrait d’affirmer ou non que le polymorphisme rs1990760 d’IFIH1 est directement
impliqué dans la pathogénie de la SEP. En effet, le polymorphisme rs1990760 d’IFIH1
conduit au remplacement d’une alanine en position 946 de la protéine par une thréonine. Un
travail réalisé sur le diabète de type 1 montra que l’allèle du polymorphisme rs1990760
d’IFIH1, associé avec une augmentation de la susceptibilité à la maladie, conduisait à une
augmentation de l’expression d’IFIH1 dans les cellules monucléées du sang périphérique [Liu
et al., 2009]. Par ailleurs, des travaux récents, visant à identifier des polymorphismes de
susceptibilité au diabète de type 1, ont identifié quatre nouveaux polymorphismes rares
associés à la maladie. Les allèles minoritaires de ces polymorphismes rares, qui présentent
une indépendance avec le polymorphisme rs1990760, confèrent une protection contre le
diabète de type 1. De plus, ils sont possiblement fonctionnels de par leur localisation dans le
gène IFIH1. En effet, deux se localisent dans des exons ce qui conduit à des changement
d’acides aminés et les deux autres se localisent dans des introns retrouvés dans des sites
impliqués dans l’épissage de l’ARNm [Nejentsev et al., 2009]. Il serait donc intéressant de
vérifier si ces nouveaux polymorphismes ne sont pas partagés avec la SEP.
I .3. Implication des gènes de la famille des OAS dans la susceptibilité à la
SEP
Afin de découvrir de nouveaux gènes impliqués dans la pathogénie de la SEP, nous
avons étudié l’expression des gènes impliqués dans la voie des IFNs de type 1. Les patients
SEP pris précocement dans le développement de la maladie démontrèrent une activation de la
voie des IFNs de type 1. Cette activation de la voie était visible par l’augmentation de
l’expression des gènes portant des éléments de réponse aux IFNs dans leur promoteur. De
cette comparaison, parmi les 3 gènes présentant la différence d’expression la plus significative
Discussion et Perspectives
181
entre les patients SEP et les témoins, 2 appartenaient à la famille des OAS : OAS2 et OASL.
Chez l’Homme, les gènes de la famille des OAS sont retrouvés dans un locus localisé sur le
chromosome 12. Les gènes codant pour OAS1, OAS2 et OAS3 sont regroupés ensemble,
alors que le gène OASL se situe un peu plus loin sur le chromosome [Hovnanian et al., 1998].
Suite à ces résultats, nous avons voulu étudier la possible implication des gènes OAS2 et
OASL dans la pathogénie de la SEP. Alors que nos travaux démontrèrent une absence
d’association du gène OASL avec la SEP, il fut trouvé une association significative entre le
gène OAS2 et la maladie. Le polymorphisme rs12815666, qui présente le plus de
significativité (P = 0,008), se localise dans la région promotrice du gène OAS2. Le locus OAS
avait déjà été précédemment associé à une autre maladie auto-immune. En effet, Field et al.
associèrent un polymorphisme présent dans l’intron 6 du gène OAS1 avec le diabète de type
1 [Field et al., 2005]. Il avait été précédemment montré que ce polymorphisme influençait
l’activité enzymatique de la protéine OAS1 : l’allèle de susceptibilité au diabète de type 1
était celui qui codait pour une protéine OAS1 possédant une forte activité basale [Bonnevie-
Nielsen et al., 2005]. Par la suite, cette association fut confirmée par un autre travail suggérant
qu’un autre polymorphisme, en LD avec le précédent, devait être le polymorphisme
fonctionnel [Tessier et al., 2006]. Plus récemment, un travail réalisé en cohorte cas-témoins
associa un haplotype des deux polymorphismes déjà associés au diabète de type 1 avec la
susceptibilité à la SEP [Fedetz et al., 2006]. Cependant, aucune étude de confirmation ne fut
publiée par la suite. D’ailleurs, notre laboratoire ne parvint pas à confirmer cette association
au moyen d’une cohorte familles trio française (chapître « Annexes », Figures S2-S3).
I.4. Conclusion
Pendant de nombreuses années, les travaux visant à rechercher les facteurs génétiques
impliqués dans la pathogénie de la SEP ne parvinrent pas à identifier de nouveaux gènes,
autres que ceux du locus du CMH. Depuis peu, l’apparition de nouvelles techniques de
génotypage et la disponibilité de cohortes de taille très importante autorisent les études par
GWAS. Cette nouvelle approche a permis aux études d’association génétique d’acquérir une
certaine maturité et a rendu possible la découverte de nouveaux gènes ayant un faible effet (en
comparaison avec l’effet du CMH) sur la pathogénie de la SEP. Au cours de ce travail, nous
avons pu démontrer que le gène TYK2 était associé à la SEP via une modification
Discussion et Perspectives
182
fonctionnelle de son activité kinase conférée par le polymorphisme rs34536443. Les données
actuelles semblent de plus en plus supporter l’implication de la voie des IFNs de type 1 dans
la pathogénie de la SEP. En effet plusieurs travaux récents, de génétique et d’expression,
s’accordent à démontrer l’importance de cette voie [Ban et al., 2008, De Jager et al., 2009b, Van
Baarsen et al., 2006]. Si les résultats associant le gène OAS2 avec la susceptibilité à la SEP
venaient à être confirmés, alors il s’agirait du 3ème gène de la voie des IFNs de type 1 associé
à la maladie. Cependant, même si la voie des IFNs de type 1 semble fortement impliquée dans
la pathogénie de la SEP, il est important de confirmer les associations publiées, comme cela a
été le cas pour le locus IFIH1-GCA-KCNH7. En effet, les études génétiques réalisées sur
l’implication de gènes dans la maladie, en l’absence de démonstrations fonctionnelles, sont
soumises à de multiples biais pouvant conduire à une forte inflation des erreurs de type 1
(faux positifs).
Discussion et Perspectives
183
II. Facteurs épigénétiques et susceptibilité à la SEP
II.1. Inactivation du chromosome X et susceptibilité à la SEP
Bien que la SEP soit considérée comme une maladie auto-immune à forte composante
génétique dans sa pathogénie, la forte proportion de discordance clinique chez les jumeaux
MZ suggère que des facteurs environnementaux et épigénétiques sont aussi impliqués [Willer
et al., 2003]. Par ailleurs la SEP, comme d’autres maladies auto-immunes, affecte plus
fortement les femmes que les hommes. Bien que plusieurs hypothèses furent avancées pour
expliquer ce phénomène, aucune n’est entièrement satisfaisante. Récemment, des travaux ont
montré que le XCI, mécanisme épigénétique mis en place uniquement chez les femmes, était
associé à plusieurs maladies auto-immunes telles que la sclérodermie [Ozbalkan et al., 2005], la
thyroïdite auto-immune [Ozcelik et al., 2006] et tout dernièrement la polyarthrite rhumatoïde
[Chabchoub et al., 2009]. Notre travail sur le phénomène du XCI dans la SEP s’inscrit dans cette
recherche des maladies auto-immunes pour lesquelles ce phénomène épigénétique serait
impliqué. Par une étude en cas-témoins nous avons observé une modification significative du
profil du XCI chez les patientes SEP. Ces observations sont en contradiction avec celles
obtenues par une autre équipe pour qui le profil du XCI était inchangé dans la SEP [Knudsen et
al.2007]. Ces résultats discordants peuvent s’expliquer par la méthode de mesure du XCI
reposant sur des étapes de digestion et d’amplification PCR, toutes susceptibles d’induire des
biais dans les observations faites. De plus la SEP, par son hétérogénéité, peut faire que la
cohorte SEP de notre étude présente des différences cliniques comparé à celle incluse dans
l’étude de Knudsen et al. Afin d’éviter une possible hétérogénéité entre les patients et les
témoins, indépendante de la discordance clinique pour la SEP, nous avons choisi de
poursuivre notre travail en étudiant le phénomène du XCI chez des jumelles MZ discordantes
pour la maladie. Cette méthode présente l’avantage d’avoir une femme « saine » servant de
témoin apparié à sa jumelle souffrant de la maladie. Cependant, bien que les différences intra-
paire du profil du XCI soient plus marquées chez les jumelles MZ discordantes pour la SEP
(coefficient de corrélation égal à 0,68) que chez des jumelles MZ témoins (coefficient de
corrélation égal à 0,76), cette différence n’atteignit pas la significativité (P = 0,59). Le faible
poids d’un tel facteur épigénétique dans la pathogénie de la SEP, ainsi que la faible taille de la
cohorte de jumelles MZ disponible, pourrait expliquer cette absence de significativité. Si nos
données d’épigénétique se voyaient confirmées, la SEP serait la première maladie auto-
Discussion et Perspectives
184
immune pour laquelle le profil du XCI serait modifié, non pas vers un plus fort biais mais vers
un biais moyen moins important.
Bien que les travaux sur l’association du phénomène du XCI avec les maladies auto-
immunes émettent l’hypothèse qu’un fort biais du XCI est un facteur causal dans le
développement de la maladie [Stewart et al., 1998], il est important de garder à l’esprit que cette
causalité n’a jamais été formellement démontrée. En effet, même si le chromosome X héberge
de nombreux gènes de l’immunité (FOXP3, CD40L, la chaîne α de l’IL-2R) ou des gènes
codant pour des antigènes contre lesquels le système immunitaire peut se retourner (par
exemple la protéine PLP dans le cas de la SEP), le biais du XCI observé sur les cellules
sanguines pourrait être le simple reflet d’un dérèglement général du système immunitaire
favorisant l’expansion clonale d’une sous-population cellulaire. Afin de pouvoir considérer le
phénomène du XCI comme un facteur potentiellement responsable de la prédominance des
femmes dans les maladies auto-immunes, les futurs travaux devront étudier le phénomène
dans d’autres maladies auto-immunes, mais aussi mesurer le profil du XCI dans plusieurs
types de cellules, dont ceux localisés au niveau du tissu cible et non pas uniquement dans le
sang. En effet, l’observation d’un biais du XCI généralisé à l’ensemble des tissus d’un
organisme suggèrerait que ce biais est présent avant même le développement de la maladie.
Ce mécanisme épigénétique serait alors susceptible d’être responsable, par un mécanisme qui
reste à expliquer, de l’apparition de la maladie. A l’inverse si ce biais était observé
uniquement dans le sang, le phénomène pourrait être simplement une des conséquences du
développement de la maladie.
Par ailleurs, le phénomène épigénétique du XCI s’accompagne parfois d’une
élimination du chromosome X inactivé conduisant à une monosomie du chromosome X dans
la cellule. Pour deux maladies auto-immunes, la sclérodermie et la thyroïdite auto-immune,
l’augmentation du biais du XCI s’accompagne d’une augmentation de la monosomie du
chromosome X dans les cellules sanguines [Invernizzi et al., 2005]. L’étude de ce phénomène
dans la SEP au moyen de jumelles MZ discordantes pour la maladie ne permit pas de mettre
en évidence l’éventuelle implication de la monosomie du chromosome X dans la pathogénie
de la SEP.
Discussion et Perspectives
185
II.2. Conclusion
L’importante discordance des jumeaux MZ pour la SEP démontre que les facteurs
environnementaux et les facteurs épigénétiques ont un effet non négligeable dans la
pathogénie de la maladie. Certaines études réalisées sur le lupus érythémateux et la
polyarthrite rhumatoïde suggérèrent que les lymphocytes T des patients présentaient un défaut
d’activité d’une enzyme intervenant dans la méthylation de l’ADN. Dans la SEP peu d’études
se sont interessées à l’importance des facteurs épigénétiques dans le développement de la
maladie. Cela est principalement dû à la difficulté d’étudier les facteurs épigénétiques sur de
larges cohortes de patients. En effet, les facteurs épigénétiques modifient l’expression des
gènes sans pour autant modifier la séquence de l’ADN. L’étude de ces facteurs par des
approches d’association conventionnelles, reposant sur une amplification de l’ADN, est donc
impossible. Cependant, avec l’apparition de nouvelles techniques permettant d’étudier
l’épigénome d’un individu (principe comparable aux puces à polymorphismes mais pour les
modifications épigénétiques de l’ADN), on peut espérer que, dans le futur, des modifications
épigénétiques dans des gènes soient identifiées comme associées à une susceptibilité accrue à
la SEP.
Discussion et Perspectives
186
Discussion et Perspectives
187
III. Facteurs génétiques et réponse au traitement
I II.1. Recherche de marqueurs génétiques prédictifs de la réponse au
traitement de la SEP par l’IFNββββ
L’utilisation de l’IFNβ dans le traitement de la SEP apporte une amélioration de
l’évolution de la maladie en réduisant la fréquence des poussées de 30% en moyenne [IFNβ MS
Study group,1995]. Cependant, ce chiffre représente la moyenne de l’effet de la molécule sur
l’ensemble des patients traités. Au niveau de l’individu, certains patients sont dits « bons
répondeurs » au traitement car ils démontrent une réduction de la fréquence des poussées bien
supérieure à la moyenne. A l’opposé, des patients peuvent être des « mauvais répondeurs »
avec une réduction de la fréquence des poussées inférieure à cette moyenne de 30%. Cette
variabilité dans la réponse au traitement peut s’expliquer par une variabilité génétique au sein
de la population de malades. En s’appuyant sur des travaux montrant l’influence de la
génétique dans la réponse au traitement de l’hépatite C par l’IFNα, nous avons choisi
d’étudier, par une approche gène candidat, l’effet de ces polymorphismes dans le traitement
de la SEP par l’IFNβ. De l’étude préliminaire réalisée sur une cohorte franco-espagnole, les
gènes OAS1 et TRAIL démontrèrent une association (significative ou proche) avec la réponse
au traitement. En effet, les premiers résultats indiquèrent que le génotype TRAILAA du
polymorphisme rs1131532 et le génotype OAS1GG du polymorphisme rs2660 étaient associés
à une augmentation de la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ d'environ 1,5 fois. Afin
de confirmer ces premiers résultats, une cohorte européenne de taille plus importante fut par
la suite constituée. Toutefois, le génotypage de ces deux polymorphismes ne permit pas de
confirmer cette association. Ces résultats divergents ne permettent pas d’envisager les
polymorphismes des gènes TRAIL et OAS1 comme des marqueurs génétiques prédictifs de la
réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ.
III.2. Effet du polymorphisme de TYK2 sur la réponse au traitement de la
SEP par l’IFNββββ
Nous avons précédemment démontré que le polymorphisme rs34536443 du gène
TYK2 modifiait l’activité kinase de l’enzyme. La kinase TYK2 est impliquée dans plusieurs
Discussion et Perspectives
188
voies cytokiniques dont celle de l’IFNβ, qui est une molécule largement utilisée dans le
traitement de la SEP. Ainsi, nous avons choisi de tester si ce polymorphisme pouvait servir de
marqueur prédictif de la réponse au traitement de la SEP par l’IFNβ. L’ajout d’IFNβ dans le
milieu avait pour effet de modifier transitoirement l’expression des facteurs nucléaires pro-
Th1, pro-Th2 et pro-Th17. Ces résultats, en accord avec la littérature [Ramos et al., 2007 ; Guo et
al., 2008 ; Shinohara et al., 2008], démontrèrent une diminution de l’expression du facteur RORγt,
marqueur spécifique des lymphocytes Th17 qui sont, depuis peu, reconnus comme des
cellules importantes dans la pathogénie de la SEP [Langrish et al., 2005]. Par ailleurs,
l’amplitude du changement d’expression dépendait du génotype pour le polymorphisme de
TYK2.
Etant donné que le polymorphisme rs34536443 du gène TYK2 influence l’amplitude
de l’effet de l’IFNβ sur l’expression des facteurs nucléaires pro-Th1, pro-Th2 et pro-Th2,
nous avons testé ce polymorphisme comme facteur prédictif de la réponse au traitement de la
SEP par l’IFNβ. L’analyse du polymorphisme sur une cohorte européenne de patients SEP
traités à l’IFNβ ne permit pas de mettre en évidence une association entre TYK2 et la réponse
au traitement de la SEP par l’IFNβ. Même si le polymorphisme rs34536443 était un marqueur
de réponse au traitement, la faible puissance statistique conférée par le polymorphisme de
TYK2 dont la MAF est proche de 3%, rendrait difficile la détection d’une telle association.
III.3. Conclusion
L’information génétique, en plus d’influencer la susceptibilité de chacun d’entre nous
aux maladies, a un impact sur notre réponse au traitement de la maladie. Cette généralité est
maintenant acceptée avec l’apparition de la pharmacogénétique qui étudie l’influence du
profil génétique sur la réponse à un traitement. Par exemple, des données récemment obtenues
dans le domaine de la cardiologie ont montrée qu’un polymorphisme localisé dans le gène
CYP2C19 influençait la réponse au clopidogrel, médicament administré aux patients après un
infarctus du myocarde [Collet et al., 2009 ; Simon et al., 2009]. Dans le traitement de la SEP par
l’IFNβ, indépendamment de l’apparition de Nabs, il est possible d’observer des patients
répondant bien à la molécule, d’autres n’y répondant pas et enfin toute une palette de patient
présentant des réponses intermédiaires. Profitant des avancées techniques des études
génétiques sur la susceptibilité, une étude de pharmacogénétique en GWAS a récemment été
publiée [Byun et al., 2008]. Mais à l’heure actuelle les études de pharmacogénétique dans la SEP
Discussion et Perspectives
189
ne sont qu’à leurs balbutiements. En effet, la cohorte disponible pour l’étude GWAS ne
comptait que 206 individus (soit la moitié de la cohorte disponible au sein de notre
laboratoire) rendant difficile l’obtention de résultats fiables. De plus, la classification des
patients SEP en fonction de leur réponse au traitement est compliquée de par le choix des
marqueurs à utiliser. Contrairement à certaines maladies comme le diabète où la glycémie sert
de marqueur, il existe dans la SEP une multitude de marqueurs radiologiques et cliniques
possiblement utilisables pour cette classification. Or, les experts dans le domaine ne sont pas
d’accord sur les meilleurs critères de classification à utiliser. Cependant, grâce aux résultats
obtenus dans une étude de confirmation, le gène codant pour le glypicane 5 pourrait être le
premier gène identifié comme marqueur génétique de la réponse du traitement IFNβ dans la
SEP [Cénit et al, 2009].
190
191
AANNNNEEXXEESS
Annexes
192
Annexes
193
Tableau S1 : Liste et localisation sur la plaque de PCRarray des gènes amplifiés. Position sur la plaque Nom du gène Abréviation du nom
A1 Adenosine deaminase, RNA-specific ADAR
A2 ADP-ribosylation factor-like 5A ARL5A
A3 Activating transcription factor 5 ATF5
A4 Beta-2-microglobulin B2M
A5 BCL2-associated athanogene 3 BAG3
A6 Bone marrow stromal cell antigen 2 BST2
A7 Interferon-induced protein 44-like IFI44L
A8 Caspase 1, apoptosis-related cysteine peptidase (interleukin 1,
beta, convertase) CASP1
A9 Caveolin 1, caveolae protein, 22kDa CAV1
A10 Core-binding factor, beta subunit CBFB
A11 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B (p27, Kip1) CDKN1B
A12 2',3'-cyclic nucleotide 3' phosphodiesterase CNP
B1 Chemokine (C-X-C motif) ligand 10 CXCL10
B2 Defender against cell death 1 DAD1
B3 Diablo homolog (Drosophila) DIABLO
B4 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 2 DNAJB2
B5 Interferon, alpha-inducible protein (clone IFI-15K) G1P2
B6 Interferon, alpha-inducible protein (clone IFI-6-16) G1P3
B7 Guanylate binding protein 1, interferon-inducible, 67kDa GBP1
B8 Guanylate binding protein 2, interferon-inducible GBP2
B9 GTP cyclohydrolase 1 (dopa-responsive dystonia) GCH1
B10 H19, imprinted maternally expressed untranslated mRNA H19
B11 Major histocompatibility complex, class I, A HLA-A
B12 Major histocompatibility complex, class I, B HLA-B
C1 Homeobox B2 HOXB2
C2 Heat shock 70kDa protein 6 (HSP70B') HSPA6
C3 Interferon, gamma-inducible protein 16 IFI16
C4 Interferon, alpha-inducible protein 27 IFI27
C5 Interferon, gamma-inducible protein 30 IFI30
C6 Interferon-induced protein 35 IFI35
C7 Interferon-induced protein 44 IFI44
C8 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 IFIT1
C9 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 IFIT2
C10 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3 IFIT3
C11 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 5 IFIT5
Annexes
194
C12 Interferon induced transmembrane protein 1 (9-27) IFITM1
D1 Interferon induced transmembrane protein 2 (1-8D) IFITM2
D2 Interferon, alpha 1 IFNA1
D3 Interferon (alpha, beta and omega) receptor 1 IFNAR1
D4 Interferon (alpha, beta and omega) receptor 2 IFNAR2
D5 Interferon, beta 1, fibroblast IFNB1
D6 Interferon, gamma IFNG
D7 Interferon, omega 1 IFNW1
D8 Interferon-related developmental regulator 1 IFRD1
D9 Interferon-related developmental regulator 2 IFRD2
D10 Interleukin 2 receptor, beta IL2RB
D11 Interferon regulatory factor 1 IRF1
D12 Interferon regulatory factor 2 IRF2
E1 Interferon regulatory factor 3 IRF3
E2 Interferon regulatory factor 5 IRF5
E3 Interferon regulatory factor 7 IRF7
E4 Interferon stimulated exonuclease gene 20kDa ISG20
E5 Interferon-stimulated transcription factor 3, gamma 48kDa ISGF3G
E6 Inter-alpha (globulin) inhibitor H2 ITIH2
E7 Janus kinase 1 (a protein tyrosine kinase) JAK1
E8 Poly (ADP-ribose) polymerase family, member 14 PARP14
E9 Lysosomal-associated membrane protein 1 LAMP1
E10 Mal, T-cell differentiation protein MAL
E11 Mitogen-activated protein kinase kinase 1 MAP2K1
E12 Met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor) MET
F1 MAX binding protein MNT
F2 Myxovirus (influenza virus) resistance 1, interferon-inducible
protein p78 (mouse) MX1
F3 Myxovirus (influenza virus) resistance 2 (mouse) MX2
F4 V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) MYC
F5 Myeloid differentiation primary response gene (88) MYD88
F6 N-myc (and STAT) interactor NMI
F7 Neuregulin 1 NRG1
F8 2',5'-oligoadenylate synthetase 1, 40/46kDa OAS1
F9 2'-5'-oligoadenylate synthetase 2, 69/71kDa OAS2
F10 2'-5'-oligoadenylate synthetase-like OASL
F11 Phospholipase A2, group IB (pancreas) PLA2G1B
F12 Promyelocytic leukemia PML
Annexes
195
G1 Protein kinase C, zeta PRKCZ
G2 Protein kinase, interferon-inducible double stranded RNA
dependent activator PRKRA
G3 PRKR interacting protein 1 (IL11 inducible) PRKRIP1
G4 Proteasome (prosome, macropain) activator subunit 2 (PA28
beta) PSME2
G5 Pituitary tumor-transforming 1 PTTG1
G6 Regulator of chromosome condensation (RCC1) and BTB
(POZ) domain containing protein 1 RCBTB1
G7 SAM domain, SH3 domain and nuclear localisation signals, 1 SAMSN1
G8 SH2 domain protein 1A, Duncan's disease
(lymphoproliferative syndrome) SH2D1A
G9 Solute carrier family 1 (glial high affinity glutamate
transporter), member 2 SLC1A2
G10 Suppressor of cytokine signaling 1 SOCS1
G11 Suppressor of cytokine signaling 3 SOCS3
G12 Signal transducer and activator of transcription 1, 91kDa STAT1
H1 Signal transducer and activator of transcription 2, 113kDa STAT2
H2 Transporter 1, ATP-binding cassette, sub-family B
(MDR/TAP) TAP1
H3 Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 TNFSF10
H4 Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 7 TNFSF7
H5 Tripartite motif-containing 22 TRIM22
H6 Tripartite motif-containing 34 TRIM34
H7 Tyrosine kinase 2 TYK2
H8 Vascular endothelial growth factor VEGF
H9 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH
H10 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH
H11 Hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 HPRT1
H12 Ribosomal protein L13a RPL13A
Annexes
196
Les tableaux S2 et S3 présentent les résultats de génétique obtenus pour l’association
des polymorphismes rs3741981 et rs10774671 d’OAS1 avec la susceptibilité à la SEP. Pour
ces travaux les deux polymorphismes ont été génotypés sur une cohorte SEP composée de
familles trio françaises.
Tableau S2 : Analyse TDT des polymorphismes rs3741981 et rs10774671 d’OAS1 dans la SEP sur 591
familles trio françaises.
Marqueur Allèle Fréquencea Tb Ub T/Ub P
rs3741981 A 0,54 292 283 1,03 0,68
rs10774671 G 0,37 277 271 1,02 0,80 aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission (T/U).
Tableau S3 : Analyse TDT des haplotypes formés par des polymorphismes rs3741981 et rs10774671
d’OAS1 dans la SEP sur 591 familles trio françaises.
Haplotype
(rs3741981-rs10774671) Fréquencea Tb Ub T/Ub P
AA 0,54 291 281 1,04 0,68
GG 0,37 279 270 1,03 0,69
GA 0,09 84 103 0,81 0,16
aFréquence des chromosomes parentaux. bChromosomes transmis, non-transmis, et ratio de transmission (T/U).
197
BBII BBLL II OOGGRRAAPPHHII EE
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