A Monsieur le Docteur Axel CLOECKAERT, et Monsieur le

1

2

3

A Monsieur le Docteur Axel CLOECKAERT, et Monsieur le Docteur Pascal SANDERS,

Qui ont accepté d’être rapporteurs de cette thèse.

Qu’ils trouvent ici le témoignage de notre respectueuse gratitude.

A Monsieur le Professeur Antoine ANDREMONT, et Madame le Professeur Christine

ROQUES,

Qui nous ont fait l’honneur d’accepter de faire partie de notre jury de thèse.

Qu’ils soient remerciés pour le temps consacré à lire et à juger ce travail.

A Monsieur le Docteur Alain BOUSQUET-MELOU, et Monsieur le Professeur Pierre-Louis

TOUTAIN,

Qui m’ont accueillie comme doctorant, m’ont aidée et sans cesse guidée tout au long de ces

années de thèse avec rigueur et optimisme.

Qu’ils soient assurés de ma sincère reconnaissance.

A Monsieur le Docteur Hubert BRUGERE,

Qui m’a guidée et patiemment conseillée.

Qu’il soit assuré de tout mon respect et de toute ma reconnaissance.

A tous les membres de l’équipe « Antibiothérapie et Antibiorésistance » de l’UMR181 qui ont

contribué à la réalisation de ce travail : Madame Nathalie ARPAILLANGE, Madame le

Docteur Véronique DUPOUY, Monsieur le Docteur Jean-Pierre FERRE, et Madame Sylvie

PUEL.

Sincères remerciements.

A Madame le Docteur Marie-Françoise PRERE,

Qui nous a apporté une aide indispensable dans nos travaux.

Sincères remerciements.

A toute l’équipe zootechnique de l’UMR181 : Monsieur Sylvain BRUYAS, Monsieur Jean

DENJEAN, Monsieur Jean-Pierre GAU, Monsieur Joseph MALIGOY, Monsieur Patrice

ROUBY, Monsieur René SCHAN,

Un grand merci pour leur soutien sans faille lors des phases animales.

4

5

A toute l’équipe des thésards, Julie ANTIC, Séverine COLLET (la relève est assurée !), Aude

FERRAN (un grand merci pour toutes tes corrections éclairées...), Elizabeth JEUNESSE,

Anne-Sylvie KESTEMAN, Julien LEGHAIT (compagnon de la première et de la dernière

heure...)

A tous les membres de l’UMR181, pour leur aide, leur soutien, leur bonne humeur et leurs

encouragements, sans oublier Minet et Minette....

Un grand merci.

A tous ceux qui me sont proches et chers,

Alexis,

mes parents,

mon frère et ma sœur,

mes tantes et mon oncle,

ma grand-mère,

pour leur amour et leur soutien toujours renouvelé.

6

7

AVANT-PROPOS Ces travaux de thèse ont fait l’objet, à l’heure actuelle, des publications et des

communications suivantes :

Articles

Bibbal, D., Dupouy, V., Ferre, J.P., Toutain, P.L., Fayet, O., Prere, M.F., Bousquet-Melou, A.

Impact of three ampicillin dosage regimens on selection of ampicillin resistance in

Enterobacteriaceae and excretion of blaTEM genes in swine feces

Appl Environ Microbiol, Aug 2007, 73 (15) : 4785-4790

Bibbal, D., Dupouy, V., Prere, M.F., Toutain, P.L., Bousquet-Melou, A.

Relatedness of Escherichia coli strains with different susceptibility phenotypes

isolated from swine feces during ampicillin treatment

Appl Environ Microbiol, May 2009, 75 (10) : 2999-3006

Communications orales

Bibbal, D., Fajadet, D., Dupouy, V., Bousquet-Melou, A., Toutain, P.L., Fayet, O., Prere, M.F.

Evolution de la résistance aux antibiotiques des E. coli de la flore fécale au cours d'un

traitement à l'ampicilline chez des porcelets

In: Réunion Interdisciplinaire de Chimiothérapie Anti-Infectieuse, Paris, 2005

Bibbal, D., Bousquet-Melou, A., Dupouy, V., Prere, M.F., Fayet, O., Ferre, J.P., Toutain, P.L.

Impact of ampicillin administration on excretion of blaTEM genes in swine feces

In: 10th International Congress of the European Association for Veterinary Pharmacology and

Toxicology, Turin, 2006

Bibbal, D., Dupouy, V., Prere, M.F., Toutain, P.L., Bousquet-Melou, A.,

Relatedness of ampicillin resistant Escherichia coli strains isolated from pigs during

ampicillin treatment

In: Fourth International Conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine, Prague,

2008

8

Posters

Bibbal, D., Bousquet-Melou, A., Dupouy, V., Ferre, J.P., Laroute, V., Toutain, P.L.

Impact of ampicillin administration on blaTEM genes excretion in swine stool

In: Third International Conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine, Orlando,

2006

Dupouy, V., Bibbal, D., Bousquet-Melou, A., Prere, M.F., Fayet, O., Toutain, P.L.

Quantification of blaTEM genes in swine stool by real-time PCR

In: Third International Conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine, Orlando,

2006

9

TABLE DES MATIERES

AVANT-PROPOS ................................................................................................................................. 7

TABLE DES ILLUSTRATIONS....................................................................................................... 11

LISTE DES ABREVIATIONS........................................................................................................... 13

INTRODUCTION............................................................................................................................... 17

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................................... 23

CHAPITRE 1 : PRESENTATION DES BETA-LACTAMINES ET UTILISATION CHEZ LE PORC.................................................................................................................................................... 23

11- LES DIFFERENTES FAMILLES DE BETA-LACTAMINES ET LES MECANISMES DE RESISTANCE

MOLECULAIRE ................................................................................................................................... 23 111- Présentation générale des bêta-lactamines.......................................................................... 23 112- Les différentes familles de bêta-lactamines.......................................................................... 25 113- Résistance aux bêta-lactamines par production de bêta-lactamases ................................... 27

12-UTILISATION DES BETA-LACTAMINES CHEZ LE PORC .................................................................. 32 121- Utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire ......................................................... 32 122- Utilisation des bêta-lactamines en élevage porcin............................................................... 34

CHAPITRE 2 - IMPACT DE L’ADMINISTRATION DES BETA-LACTAMINES SUR LA FLORE DIGESTIVE ET STRATEGIES DE PREVENTION ....................................................... 41

21- ECOSYSTEME INTESTINAL ET ANTIBIOTHERAPIE........................................................................ 41 211- Description de la flore commensale digestive...................................................................... 41 212- Impact de l’antibiothérapie sur la flore digestive ................................................................ 42 213- Mesure du niveau de résistance de la flore digestive........................................................... 45

22- ANTIBIOTHERAPIE ET RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES DANS L’ESPECE PORCINE............... 48 221- Etudes descriptives de la résistance des entérobactéries de la flore digestive .................... 48 222- Analyse de l’impact de l’usage des antibiotiques sur le niveau de résistance de la flore digestive ........................................................................................................................................ 50 223- Facteurs autres que l’antibiothérapie gouvernant le niveau de résistance des bactéries de la flore digestive ............................................................................................................................... 51 224- Dynamique populationnelle des souches d’E. coli résistantes de la flore commensale...... 52

23- IMPACT DES BETA-LACTAMINES SUR L’ECOSYSTEME INTESTINAL ET ACTIVITE BETA-LACTAMASE FECALE ......................................................................................................................... 53

231- Etude chez le porc ................................................................................................................ 53 232- Etude chez l’homme ............................................................................................................. 53

24- STRATEGIES THERAPEUTIQUES DE PREVENTION DE L’EMERGENCE DE RESISTANCE DANS LA

FLORE DIGESTIVE LORS D’ADMINISTRATION DE BETA-LACTAMINES................................................ 54 241- Optimisation de schémas thérapeutiques visant à limiter l’exposition de la flore digestive à l’antibiotique ................................................................................................................................ 54 242- Destruction enzymatique des résidus d’antibiotiques dans le tube digestif ......................... 55

ETUDE EXPERIMENTALE............................................................................................................. 61

OBJECTIFS......................................................................................................................................... 61

CHAPITRE 3 : EVALUATION DE L’IMPACT DE TROIS MODALITES D’ADMINISTRATION DE L’AMPICILLINE SUR LE NIVEAU DE RESISTANCE DE LA FLORE DIGESTIVE DU PORC ET ETUDE DE LA DYNAMIQUE DE L’EMERGENCE DE LA RESISTANCE............................................................................................................................... 65

31- INTRODUCTION ........................................................................................................................... 65 32- ETUDE DE LA BIODISPONIBILITE DE L’AMPICILLINE PAR VOIE ORALE CHEZ LE PORC ................ 67

321- Problématique ...................................................................................................................... 67 322- Objectif ................................................................................................................................. 67

10

323- Matériels et méthodes........................................................................................................... 67 324- Résultats ............................................................................................................................... 69 325- Discussion ............................................................................................................................ 70

33- IMPACT DE TROIS MODALITES D’ADMINISTRATION DE L’AMPICILLINE SUR LE NIVEAU DE

RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES DIGESTIVES DU PORC.............................................................. 73 331- Problématique ...................................................................................................................... 73 332- Objectif ................................................................................................................................. 73 333- Etude de l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur l’excrétion d’entérobactéries résistantes et de gènes blaTEM dans les fèces de porc ...................................... 74 334- Etude pharmacocinétique des trois modalités d’administration de l’ampicilline................ 79 335- Discussion générale ............................................................................................................. 81

ARTICLE 1 ........................................................................................................................................ 85 34- ETUDE DE LA PARENTE PAR ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE DES SOUCHES D’E. COLI

ISOLEES DE FECES DE PORC DURANT L’ADMINISTRATION D’AMPICILLINE ....................................... 93 341- Problématique ...................................................................................................................... 93 342- Objectif ................................................................................................................................. 93 343- Matériels et méthodes........................................................................................................... 93 344- Résultats présentés dans l’article 2...................................................................................... 94 345- Résultats complémentaires : profils de résistance et pulsotypes des souches provenant des animaux témoins ......................................................................................................................... 100 346- Discussion générale ........................................................................................................... 102

ARTICLE 2 ...................................................................................................................................... 107

CHAPITRE 4 : STRATEGIE THERAPEUTIQUE DESTINEE A PREVENIR L’EMERGENCE DE BACTERIES DIGESTIVES RESISTANTES LORS D’ADMINISTRATION DE BETA-LACTAMINES : ETUDES PRELIMINAIRES................. 119

41- INTRODUCTION ......................................................................................................................... 119 42- ETUDE COMPAREE DES BIODISPONIBILITES ABSOLUES DE LA PIVAMPICILLINE ET DE

L’AMPICILLINE PAR VOIE ORALE CHEZ LE PORC ............................................................................. 121 421- Problématique .................................................................................................................... 121 422- Objectif ............................................................................................................................... 121 423- Matériels et méthodes......................................................................................................... 121 424- Résultats ............................................................................................................................. 123 425- Résultat complémentaire: biodisponibilité absolue de l’amoxicilline par voie orale chez le porc à jeun .................................................................................................................................. 124 426- Discussion .......................................................................................................................... 125

43- ETUDE DE L’ABSORPTION DE CAFEINE ENROBEE AVEC L’EUDRAGIT® FS30D CHEZ LE PORC 127 431- Problématique .................................................................................................................... 127 432- Objectif ............................................................................................................................... 127 433- Matériels et méthodes......................................................................................................... 128 434- Résultats ............................................................................................................................. 129 435- Discussion .......................................................................................................................... 131

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .......................................................................................... 135

REFERENCES .................................................................................................................................. 143

TITRE ET RESUME EN ANGLAIS .............................................................................................. 151

11

TABLE DES ILLUSTRATIONS

Tableaux

Tableau 1 : Mécanismes de résistance pour chaque famille de bêta-lactamine ....................... 24 Tableau 2 : Antibiotiques représentatifs de chaque famille de bêta-lactamine........................ 25 Tableau 3 : Classification des bêta-lactamases selon Ambler et Bush-Jacoby-Meideros........ 30 Tableau 4 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (1) ............................................ 36 Tableau 5 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (1) .......................................... 37 Tableau 6 : Pourcentage de résistance des souches d’E. coli isolées de porcs à l’abattoir ...... 49 Tableau 7 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (2) ............................................ 70 Tableau 8 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (3) ............................................ 80 Tableau 9 : Pourcentage de souches d’E. coli résistantes ........................................................ 95 Tableau 10 : Pourcentages des phénotypes résistants à l’ampicilline...................................... 96 Tableau 11 : Principaux phénotypes résistants à l’ampicilline et pulsotypes associés ............ 99 Tableau 12 : Pourcentage de pulsotypes associés à chaque profil de résistance...................... 99 Tableau 13 : Distribution des gènes de résistance.................................................................. 100 Tableau 14 : Principaux profils de résistance et pulsotypes associés .................................... 101 Tableau 15 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (4) ........................................ 124 Tableau 16 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (2) ...................................... 125 Tableau 17 : Paramètres pharmacocinétiques de la caféine................................................... 130

Figures

Figure 1 : Relations entre l’administration d’antibiotique par voie orale et l’exposition des flores bactériennes chez l’animal. .................................................................................... 17

Figure 2 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (1) ....................................................... 69 Figure 3 : Pourcentages d’entérobactéries et de souches d’E. coli résistantes......................... 76 Figure 4 : Nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces......................................................... 77 Figure 5 : Comparaison entre le log du nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces et le log

des dénombrements d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline/g de fèces .................. 77 Figure 6 : Distribution des CMI des souches d’E. coli aux jours 0, 1, 4 et 7........................... 78 Figure 7 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (2) ....................................................... 80 Figure 8 : Pourcentage des groupes phylogénétiques .............................................................. 96 Figure 9 : Dendrogramme et profil des pulsotypes .................................................................. 97 Figure 10 : Distribution des pulsotypes (1).............................................................................. 98 Figure 11 : Distribution des pulsotypes (2)............................................................................ 102 Figure 12 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (3) ................................................... 123 Figure 13 : pH des contenus digestifs de porc ....................................................................... 129 Figure 14 : Concentrations plasmatiques de caféine.............................................................. 130

12

13

LISTE DES ABREVIATIONS AFSSA Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments

AUC Aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps

AUMC Aire sous la courbe du premier moment statistique

BLSE Bêta-lactamase à Spectre Elargi

Cmax Concentration plasmatique maximale

CcrA Bêta-lactamase, « cefotaxin and carbapenem resistant »

Cl Clairance plasmatique

CLSI « Clinical and Laboratory Standards Institute »

CMI Concentration Minimale Inhibitrice

CMY Bêta-lactamase, « active on cephamycins »

CTX-M Bêta-lactamase, « active on cefotaxime, first isolated at Munich »

DGAL Direction Générale de l’ALimentation

E. coli Escherichia coli

ENVT Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse

EDTA Acide éthylène-diamine-tétraacétique

EFSA « European Food Safety Authority »

EUCAST « EUropean Comitee on Antimicrobial Susceptibility Testing »

F Biodisponibilité absolue

Frelative Biodisponibilité relative

FEC Bêta-lactamase, « fecal Escherichia coli »

HPLC Chromatographie en phase liquide à haute performance

INRA Institut National de la Recherche Agronomique

IRT Bêta-lactamase, « inhibitor resistant TEM beta-lactamase »

KPC Bêta-lactamase, « Klebsiella pneumoniae carbapenemase »

L1 Bêta-lactamase, « labile enzyme from Stenotrophomonas maltophilia »

λz Pente de la phase terminale

MIR Bêta-lactamase, « discovered at Miriam Hospital »

OXA Bêta-lactamase, « active on oxacillin »

PC1 Bêta-lactamase, « from Staphylococcus aureus strain PC1 »

PCR « Polymerase Chain Reaction »

PLP Protéines de Liaison à la Pénicilline

PSE Bêta-lactamase, « Pseudomonas-specific enzyme »

SME Bêta-lactamase, « Serratia marcescens enzyme »

SHV Bêta-lactamase, « sulfhydryl reagent variable »

t1/2 Temps de demi-vie TEM Bêta-lactamase, d’après le nom du patient Temoneira chez qui elle a été

identifiée pour la première fois Tmax Temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale

UMR Unité Mixte de Recherche

UV Ultraviolet

Vss Volume de distribution à l’équilibre

14

15

INTRODUCTION

16

Introduction

17

INTRODUCTION

Les travaux de recherche présentés dans ce document ont été réalisés dans

l’UMR181 de Physiopathologie et Toxicologie Expérimentales INRA, ENVT, située à l’Ecole

Nationale Vétérinaire de Toulouse. Au sein de l’UMR181, l’équipe «Antibiothérapie et

Antibiorésistance », animée par le Docteur A. Bousquet-Mélou étudie la problématique de

l’antibiorésistance chez les animaux à deux niveaux :

- l’émergence de résistance chez les pathogènes cibles d’une antibiothérapie, dont les

enjeux concernent la santé animale, et

- l’émergence de résistance dans la flore commensale digestive, avec ses conséquences

potentielles en santé humaine via la contamination de la chaîne alimentaire et/ou

l’environnement. Les enjeux touchent ici à la santé publique et à la sécurité sanitaire des

aliments.

La figure 1 illustre les enjeux liés au contrôle simultané de la résistance au niveau

d’un foyer infectieux et de la flore commensale digestive. Mon travail de thèse s’est intégré

dans la thématique de recherche relative à la résistance des bactéries de la flore

commensale digestive, sous la direction du Docteur A. Bousquet-Mélou et du Professeur P.-

L. Toutain.

Tube digestif

Proximal DistalBiodisponibilité incomplète

RésistanceEchecs

thérapeutiques

BiophasePathogène d'intérêt vétérinaire

Sang

AB: Voie orale

• Pathogènes zoonotiques resistants(salmonelles, campylobacters spp)

• Flore commensale (gènes de résistance)

SANTE ANIMALE SANTE PUBLIQUE

HOMME

Chaîne alimentaireContact

Environnement

Pathogènes zoonotiquesFlux de gènes

Tube digestif

Proximal DistalBiodisponibilité incomplète

RésistanceEchecs

thérapeutiques

BiophasePathogène d'intérêt vétérinaire

Sang

AB: Voie orale

• Pathogènes zoonotiques resistants(salmonelles, campylobacters spp)

• Flore commensale (gènes de résistance)

SANTE ANIMALE SANTE PUBLIQUE

HOMME

Chaîne alimentaireContact

Environnement

Pathogènes zoonotiquesFlux de gènes

Figure 1 : Relations entre l’administration d’antibiotique par voie orale et l’exposition des flores bactériennes chez l’animal.

Le développement de la résistance aux antibiotiques au niveau des flores cibles (foyers infectieux) et non cibles (flore commensale digestive) aura un impact sur la santé animale et

la santé publique. L’antibiotique administré par voie orale est partiellement absorbé au niveau du tube digestif proximal, et la fraction non absorbée exerce une pression de

sélection importante sur les bactéries de l’écosystème du tube digestif distal.

Introduction

18

Il est actuellement reconnu que l’usage des antibiotiques en production animale

exerce une pression de sélection qui favorise l’émergence et la diffusion de bactéries

résistantes. Cette pression de sélection peut s’exercer au niveau de la flore bactérienne

commensale des animaux, en particulier celle du tube digestif (127). Au niveau du tube

digestif des animaux, cette pression de sélection peut contribuer à la sélection de bactéries

zoonotiques résistantes (Salmonella, Campylobacter, E. coli), pathogènes chez l’homme, et

à la sélection de bactéries commensales résistantes. L’ensemble de ces bactéries

commensales résistantes constitue alors un réservoir de gènes de résistance pouvant être

transférés à des bactéries zoonotiques. De plus, lorsque ces bactéries digestives résistantes

d’origine animale sont transmises à l’homme, elles peuvent également transférer leurs gènes

de résistance à des bactéries de la flore commensale du tube digestif de l’homme (107,

115). La flore digestive commensale de l’homme constitue alors elle-même un réservoir de

gènes de résistance, potentiellement transférables à des bactéries pathogènes.

Compte-tenu des conséquences réelles et potentielles pour la santé publique, il nous

a paru pertinent de s’intéresser à la caractérisation de la résistance aux antibiotiques

des bactéries du tube digestif des animaux domestiques, et à la compréhension des

mécanismes de l’émergence de résistance lors d’administration d’antibiotiques chez

les animaux. Parallèlement, le développement de stratégies thérapeutiques visant à

diminuer l’excrétion par les animaux de bactéries porteuses de gènes de résistance au

cours d’un traitement antibiotique constitue un véritable enjeu pour la médecine vétérinaire.

Les bêta-lactamines représentent la classe thérapeutique la plus utilisée en

médecine humaine. Cette classe thérapeutique regroupe de nombreuses molécules qui

possèdent toutes un noyau bêta-lactame, associé à des cycles et des chaînes latérales

variables, qui expliquent les propriétés pharmacocinétiques et le spectre d’activité des

différentes molécules. Le noyau bêta-lactame est la cible des bêta-lactamases qui

l’hydrolysent, et qui rendent l’antibiotique inactif. Les bêta-lactamases représentent le

principal mécanisme de résistance aux bêta-lactamines chez les entérobactéries (84).

Les bêta-lactamines sont également largement utilisées en médecine vétérinaire, et

les bêta-lactamases identifiées chez les entérobactéries d’origine animale sont identiques à

celles identifiées chez les entérobactéries d’origine humaine (81). L’usage des antibiotiques

a été particulièrement critiqué dans la filière porcine car cette filière consomme une grande

quantité d’antibiotiques, et principalement par voie orale. En 2006, 51% des antibiotiques

vendus en médecine vétérinaire ont été vendus dans la filière porcine (3).

Introduction

19

C’est dans ce contexte que nous avons choisi de travailler sur un modèle porcin.

Dans une première partie du travail de thèse (chapitre 3), nous avons étudié l’impact sur la

flore intestinale de l’administration d’ampicilline chez le porc, en nous intéressant plus

particulièrement à l’émergence de souches d’entérobactéries résistantes, et à leur

caractérisation phénotypique et génotypique. Dans une deuxième partie (chapitre 4), nous

avons utilisé le modèle porcin pour évaluer les bases d’une stratégie thérapeutique destinée

à diminuer l’impact de l’antibiothérapie sur la flore commensale.

20

21

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre 1 : Présentation des bêta-lactamines et utilisation chez le porc

22

Etude bibliographique - chapitre 1

23


Chapitre 1 : Présentation des bêta-lactamines et utilisation chez le porc

11- Les différentes familles de bêta-lactamines et les mécanismes de résistance moléculaire

111- Présentation générale des bêta-lactamines

L’ensemble des bêta-lactamines forme une large classe d’antibiotiques qui comprend

les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes et

les inhibiteurs de bêta-lactamase. Ces molécules contiennent toutes un noyau bêta-lactame

dans leur structure moléculaire, et ce noyau bêta-lactame confère à la molécule son activité

antibiotique.

(a) Mode d’action des bêta-lactamines

Les bêta-lactamines inhibent la synthèse de la paroi bactérienne. Les cibles des bêta-

lactamines sont les PLP (protéines de liaison à la pénicilline). Les PLP interviennent dans la

synthèse et le remodelage du peptidoglycane, constituant principal de la paroi bactérienne

(129). Les bêta-lactamines possèdent un effet bactéricide (76).

Les bêta-lactamines sont des antibiotiques temps-dépendant avec un effet post antibiotique

court (bactéries à Gram positif) voire inexistant (bactéries à Gram négatif). Le but d’un

schéma thérapeutique est de maximiser le temps d’exposition des bactéries pathogènes à

l’antibiotique (87).

(b) Développement de bêta-lactamines en réponse à l’émergence de

résistance

Avant l’utilisation des bêta-lactamines en médecine, certaines bactéries produisaient

déjà des bêta-lactamases. Ces bêta-lactamases avaient peut être un rôle mineur dans le

métabolisme de la paroi de la cellule, ou devaient protéger les bactéries contre les bêta-

lactamines produites par les champignons dans l’environnement. Quelque soit leur fonction,

c’est l’utilisation humaine des antibiotiques qui a favorisé l’émergence des bactéries

porteuses de bêta-lactamases (83). Au fur et à mesure que la résistance s’est étendue, les


24

chimistes des laboratoires pharmaceutiques ont répondu en développant des composés

avec une stabilité accrue aux bêta-lactamases, et des agents protecteurs pour inhiber ces

bêta-lactamases (111). Ces nouvelles bêta-lactamines ont à leur tour sélectionné des

nouvelles formes de résistance. Le tableau 1 illustre le développement de nouvelles classes

de bêta-lactamines en réponse à l’émergence de nouveaux mécanismes de résistance.

La course engagée entre apparition de résistance et mise au point de nouvelles

molécules est inégale. La découverte de nouveaux antibiotiques ne suit pas le rythme

d’émergence et de diffusion des résistances bactériennes (94). Dans ce contexte, il apparaît

crucial de ralentir l’émergence et la dissémination de ces résistances afin de conserver le

plus longtemps possible l’utilité thérapeutique des bêta-lactamines existantes.

Tableau 1 : Mécanismes de résistance pour chaque famille de bêta-lactamine

qui ont poussé à développer de nouvelle familles (adapté à partir de (51)).

Famille de bêta-lactamines

Mécanismes responsables de résistance

benzylpénicillines pénicillinases staphylococciques

isoxazolyl-pénicillines modification des PLP

amino-pénicillines TEM-1 et SHV-1 chez les entérobactéries PSE-1 chez Pseudomonas aeruginosa

uréido-pénicillines Idem amino-pénicillines

céphalosporines de première génération

TEM-1 hyperproduction de céphalosporinases de classe C

céphalosporines de deuxième génération

hyperproduction de bêta-lactamase de classe A par Klebsiella oxytoca hyperproduction de bêta-lactamases TEM et SHV par les entérobactéries hyperproduction de bêta-lactamases de classe C

céphalosporines de troisième génération

BLSE (bêta-lactamase à spectre élargi) hyperproduction de bêta-lactamase de classe A par Klebsiella oxytoca hyperproduction de bêta-lactamases de classe C

céphalosporines de quatrième génération

BLSE hyperproduction spécifique de SHV-5 hyperproduction de bêta-lactamases de classe C

monobactames BLSE bêta-lactamases de classe A de Klebsiella oxytoca bêta-lactamases de classe C

carbapénèmes métallo-bêta-lactamases


25

112- Les différentes familles de bêta-lactamines

Les bêta-lactamines sont classées dans quatre familles : pénicillines,

céphalosporines, monobactames et carbapénèmes (20). Le tableau 2 indique les

antibiotiques représentatifs pour chaque famille.

Tableau 2 : Antibiotiques représentatifs de chaque famille de bêta-lactamine

Famille de bêta-lactamines

Antibiotiques représentatifs

Pénicillines

benzyl-pénicillines benzylpénicilline

isoxazolyl-pénicillines méticilline, oxacilline, cloxacilline

amino-pénicillines ampicilline, pivampicilline, amoxicilline, épicilline

uréido-pénicillines azlocilline, mézlocilline, pipéracilline

carboxy-pénicillines carbenicilline, ticarcilline

amidino-pénicillines mécillinam, pivmécillinam

Céphalosporines

première génération céfalexine, céfatrizine, céfalotine, céfazoline

deuxième génération céfoxitine, céfamandole, céfotétan, céfuroxime

troisième génération céfotaxime, céfopérazone, ceftazidime, ceftriaxone, céfixime

quatrième génération céfépime, cefpirome

Monobactames aztreonam

Carbapénèmes ertapénem, imipénem, méropénem

Inhibiteurs de bêta-lactamases

acide clavulanique, sulbactam, tazobactam

(a) Pénicillines

La benzylpénicilline a été la première pénicilline utilisée. Cette bêta-lactamine et ses

dérivés (pénicilline du groupe G) possèdent un spectre antibactérien qui couvre les cocci à

Gram positif et négatif et les bacilles à Gram positif. L’apparition de souches de

Staphylococcus aureus productrices de pénicillinases a nécessité la synthèse de molécules

stables à l’hydrolyse par cette enzyme.

Les isoxazolyl-pénicillines (pénicilline du groupe M) possèdent des modifications

structurales qui permettent une augmentation de la stabilité à l’hydrolyse par les

pénicillinases mais qui entraînent souvent une diminution de l’activité antibactérienne.


26

Les amino-pénicillines (pénicilline du groupe A) possèdent une activité sur les

bacilles à Gram négatif. L’ampicilline et l’amoxicilline appartiennent à ce groupe.

L’amoxicilline ne diffère de l’ampicilline que par un groupement hydroxyle qui lui confère une

meilleure biodisponibilité par voie orale que l’ampicilline. La pivampicilline fait partie d’un

groupe d’ester de l’ampicilline qui libère l’ampicilline suite à l’action des estérases digestives

extra- et intracellulaires. Ces prodrogues ont été développées pour améliorer la

biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale (53).

Les uréido-pénicillines et les carboxy-pénicillines possèdent un spectre élargi à

certains bacilles à Gram-négatif. Elles sont actives sur Pseudomonas aeruginosa et sur

certaines souches productrices de céphalosporinases. Elles sont réservées à la médecine

humaine.

Les amidino-pénicillines présentent un spectre limité aux bacilles à Gram négatif.

(b) Céphalosporines

Ces bêta-lactamines sont toutes à large spectre et leur intérêt réside surtout dans

leur activité sur les bacilles à Gram négatif. Les céphalosporines sont traditionnellement

divisées en quatre générations sur la base de leur spectre antibactérien, et surtout de leur

comportement vis-à-vis des céphalosporinases.

Les céphalosporines de première génération possèdent un spectre qui couvre les

cocci à Gram positif ainsi que quelques bactéries à Gram négatif. Ce sont les moins stables

vis-à-vis de l’hydrolyse par les bêta-lactamases.

Les céphalosporines de deuxième génération possèdent une activité accrue

contre les bactéries à Gram négatif. Elles sont stables à l’hydrolyse par les bêta-lactamases

d’origine plasmidique (non BLSE), mais pas à l’hydrolyse par les céphalosporinases d’origine

chromosomique AmpC.

Les céphalosporines de troisième génération possèdent une couverture plus large

contre les bactéries à Gram négatif mais parfois au dépend d’une bonne couverture contre

les cocci à Gram positif. De plus, leur stabilité en présence de bêta-lactamase d’origine

chromosomique AmpC est nettement supérieure à celles des céphalosporines de première

et deuxième générations. La découverte des BLSE (Bêta-lactamase à Spectre Elargi) en

1983 marquera le début d’une nouvelle ère dans l’histoire de la résistance de la résistance

aux bêta-lactamines (75). Ces enzymes sont capables d’hydrolyser les céphalosporines de

troisième génération et les monobactames (24).

Les céphalosporines de quatrième génération possèdent une stabilité accrue

contre certains types de bêta-lactamases produites par Pseudomonas aeruginosa et d’autres

bactéries entériques.


27

(c) Monobactames

Cette classe de bêta-lactamine ne contient qu’un seul agent antibiotique :

l’aztréonam. Son spectre couvre uniquement les bacilles à Gram négatif, y compris

Pseudomonas aeruginosa. Il n’est pas utilisé en médecine vétérinaire.

(d) Carbapénèmes

Ces bêta-lactamines ont le spectre antibactérien le plus large et sont stables à la

plupart des bêta-lactamases. Elles sont réservées à la médecine humaine.

(e) Inhibiteurs de bêta-lactamases

Ce sont des inhibiteurs suicides de bêta-lactamases qui associés avec une bêta-

lactamine lui permettent de conserver son activité vis à vis des souches productrices de

bêta-lactamases. Ils inhibent la majorité des bêta-lactamases excepté les céphalosporinases

et les métallo-bêta-lactamases. Ces molécules inhibitrices possèdent par ailleurs une activité

antibactérienne, mais à des concentrations trop élevées, et non compatibles avec un usage

thérapeutique.

113- Résistance aux bêta-lactamines par production de bêta-lactamases

(a) Mécanismes moléculaires de résistance aux bêta-lactamines

Les bactéries ont développé différents mécanismes pour contrecarrer l’action des

bêta-lactamines (109) :

* Production de bêta-lactamases :

Les bêta-lactamases sont des enzymes bactériennes qui hydrolysent le noyau bêta-

lactame et qui rendent l’antibiotique inactif avant qu’il n’atteigne sa cible : les « protéines de

liaison à la pénicilline » (PLP). La parenté structurale que les bêta-lactamases partagent

avec les PLP leur permet de lier, acétyler et hydrolyser donc inactiver les bêta-lactamines

(89). Les bêta-lactamases sont exportées dans le milieu extracellulaire (bactéries à Gram

positif telles que Staphylococcus aureus) ou périplasmiques (bactéries à Gram négatif). Plus

de 500 bêta-lactamases ont été répertoriées (11). La destruction des bêta-lactamines par les

bêta-lactamases est le mécanisme de résistance majeur des bactéries à Gram négatif.


28

* Modification des « protéines de liaison à la pénicilline » (PLP) :

Ces PLP modifiées présentent une affinité plus faible pour les bêta-lactamines. Elles

sont relativement résistantes à l’inactivation par les pénicillines et sont capables de remplir

les fonctions des PLP lorsque ces dernières sont inactivées. Ce mécanisme de résistance

est majeur pour les bactéries pathogènes telles que Staphylococcus aureus, Streptococcus

pneumoniae et les entérocoques (140).

* Diminution de la perméabilité de la membrane externe :

Chez les bactéries à Gram négatif, la perte ou la diminution de l’expression des

porines limite l’entrée de certaines bêta-lactamines dans l’espace périplasmique et donc

l’accès à la membrane interne où sont situées les PLP. Cette diminution de la perméabilité

contribue au développement de résistance aux bêta-lactamines, d’autant plus si elle est

associée à d’autres mécanismes de résistance (88).

* Protéines d’efflux :

L’acquisition ou la surproduction de pompes à efflux peuvent expulser les bêta-

lactamines hors de la bactérie même contre le gradient de concentration (108).

(b) Support génétique des gènes codant pour les bêta-lactamases

Les gènes qui codent pour les bêta-lactamases sont situés soit sur des plasmides,

soit sur le chromosome. Ils peuvent être intégrés dans des éléments génétiques mobiles

(de type transposon, intégron, îlot génomique). Les déterminants génétiques de la résistance

peuvent être transmis par transfert horizontal y compris entre espèces phylogénétiquement

éloignées (84).

La résistance à certaines bêta-lactamines par production de bêta-lactamase peut être

naturelle. Ceci sous-entend qu’une forte proportion des bactéries d’une espèce bactérienne

donnée ont manifesté d’emblée un phénomène de résistance, avant toute pression de

sélection.

Par opposition à la résistance naturelle, la résistance acquise se manifeste sous

l’effet d’une pression de sélection. L’exemple de la propagation de TEM-1, la première bêta-

lactamase portée par un plasmide identifiée chez une bactérie à Gram négatif est illustratif.

Cette enzyme a été isolée pour la première fois dans une culture de sang d’un patient

nommé Temoneira en Grèce (34). Le transfert de TEM-1 a été facilité vers d’autres espèces

de bactéries car le gène qui code pour l’enzyme TEM-1 : blaTEM-1 est présent sur des


29

plasmides et des transposons. Quelques années après sa première identification, l’enzyme

TEM-1 a été propagée dans le monde entier, et est maintenant présente dans diverses

espèces de membres de la famille Enterobacteriaceae, et dans Pseudomonas aeruginosa,

Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae (18).

(c) Classification des bêta-lactamases

Une classification moléculaire des bêta-lactamases, impliquant la connaissance de la

structure primaire des bêta-lactamines a été proposée par Ambler (7). Une classification

fonctionnelle a été proposée par Bush et al. (25), dans laquelle les auteurs tiennent compte

de la fonctionnalité des bêta-lactamases (substrat, profil d’inhibition) et divisent ces enzymes

en quatre groupes (1 à 4) avec plusieurs sous-groupes.

La classification moléculaire proposée par Ambler divise aussi les bêta-lactamases

en quatre groupes (A à D), qui présentent des différences sur le plan phylogénétique. Les

bêta-lactamases des classes A, C et D font partie des enzymes à sérine active, c'est-à-dire

qui possèdent dans leur site actif une sérine qui intervient dans le mécanisme d’acétylation

au cours de l’hydrolyse des bêta-lactamines. Par contre la classe B inclut les métallo-bêta-

lactamases dont l’activité nécessite la présence d’ions métalliques.

La classification comparée des bêta-lactamases selon Ambler et Bush-Jacoby-

Meideros est présentée dans le tableau 3. La nomenclature des bêta-lactamases est

détaillée dans la liste des abréviations (page 13).


30

Tableau 3 : Classification des bêta-lactamases selon Ambler et Bush-Jacoby-Meideros

(25)

Inhibition

par : Bush Ambler Substrats préférentiels

ACa EDTA

Enzymes représentatives

1 C céphalosporines - - AmpC, CMY-2, MIR-1

2a A pénicillines + - PC1

2b A pénicillines, céphalosporines

+ - TEM-1, TEM-2, SHV-1

2be A pénicillines, céphalosporines à large spectre, monobacatames

+ - BLSE TEMs, SHVs, CTX-Ms

2br A pénicillines +/- - IRT TEMs

2c A pénicillines, carbenicilline

+ - PSE-1

2d D pénicilline, cloxacilline +/- - OXAs

2e A céphalosporines + - FEC-1

2f A pénicillines, céphalosporines, carbapénèmes

+ - KPC-1, SME-1

3 B la plupart des bêta-lactamines

- + L1, CcrA

4b

a acide clavulanique b La classe 4 regroupe les bêta-lactamases qui ne peuvent être classées dans les autres classes.

* Classe A

La classe A est la plus diversifiée. Historiquement, elle était principalement

représentée par les pénicillinases. Comme leur nom l’indique, ces enzymes sont

principalement actives sur les pénicillines (bêta-lactamase PC1 de Staphylococcus aureus),

mais aussi, à un moindre degré sur les céphalosporines de première génération. La majorité

de ces enzymes est sensible aux inhibiteurs suicides utilisés en médecine (acide

clavulanique, sulbactam et tazobactam). Les principaux représentants de ce groupe sont les

bêta-lactamases du type PC1, TEM, SHV et récemment le type CTX-M. Les séquences

aminées des enzymes de type TEM, SHV et OXA sont répertoriées sur le site internet

suivant : www.lahey.org/studies/inc_webt.html.

** Bêta-lactamases de type TEM

TEM-1 est l’enzyme la plus fréquemment rencontrée chez E. coli, mais elle est aussi

présente chez de nombreuses espèces telles que Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp.,

http://www.lahey.org/studies/inc_webt.html�


31

Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae. Jusqu’à 90% de la résistance à

l’ampicilline chez E. coli est due à la production de TEM-1 (84). TEM-1 est capable

d’hydrolyser l’ampicilline, et à un degré moindre l’oxacilline ou la céfalotine, et a une activité

négligeable vis-à-vis des céphalosporines à spectre étendu. L’enzyme TEM-2 diffère de

TEM-1 par un seul acide aminé. Les gènes qui codent pour ces enzymes sont situés sur des

plasmides, souvent transférable in vitro à des souches réceptrices de laboratoire. Le

dissémination de ces gènes est aussi facilité par le fait qu’ils fassent partie des transposons

Tn1, Tn2 ou Tn3 (104).

La première BLSE de type TEM (TEM-3) a été découverte en 1989 (121). Depuis

lors, plus de 100 dérivés de TEM ont émergé par substitution d’un ou plusieurs acides

aminés à partir de TEM-1 (105). Certains dérivés sont des IRT (Inhibitor-Resistant TEM

bêta-lactamase) principalement mis en évidence dans des isolats cliniques et résistants à

l’action de l’acide clavulanique (27), mais la majorité de ces nouveaux dérivés sont des

BLSE. Bien que les BLSE de type TEM soient le plus souvent produites par E. coli et

Klebsiella pneumoniae, ces enzymes ont été aussi mises en évidence chez les autres

espèces d’entérobactéries, et chez d’autres bactéries à Gram négatif (18).

** Bêta-lactamases de type SHV

Ces enzymes se retrouvent plus fréquemment mais pas exclusivement, dans

l’espèce Klebsiella. L’enzyme SHV-1 est la plus fréquemment rencontrée. Le gène codant

pour SHV-1 se situe sur le chromosome pour la majorité des souches de Klebsiella

pneumoniae, mais est habituellement porté par un plasmide chez E. coli. Une centaine de

BLSE dérivent des pénicillinases de SHV-1 par substitution d’un ou de plusieurs acides

aminés (18).

** Bêta-lactamases de type CTX-M

Ces dernières années, une nouvelle famille de BLSE est apparue, qui hydrolyse

préférentiellement le céfotaxime : les bêta-lactamases de type CTX-M. Ces enzymes se sont

rapidement propagées au niveau mondial et elles sont les BLSE majoritaires chez les

entérobactéries dans certaines zones géographiques (112).

* Classe B : métallo-bêta-lactamases

L’importance clinique des métallo-bêta-lactamases est liée au fait qu’elles hydrolysent

les carbapenèmes, composés qui échappent à l’activité des bêta-lactamases à sérine active.

La plupart des métallo-bêta-lactamases hydrolysent une variété de pénicillines et de

céphalosporines, et sont insensibles aux inhibiteurs suicides classiques (15).


32

* Class C : Céphalosporinases

Dans la classe C, on retrouve les céphalosporinases AmpC qui sont codées par des

gènes qui étaient primitivement situés sur le chromosome de nombreuses bactéries à Gram

négatif telles que Citrobacter freundii, Serratia marcescens et Enterobacter spp.. Chez ces

bactéries, l’expression de AmpC est inductible. Les gènes codant pour ces enzymes sont

aussi présents chez E. coli, où ils ne sont pas inductibles. Ces enzymes sont résistantes à

l’acide clavulanique (106).

* Class D : Oxacillinases

La classe D regroupe les bêta-lactamases qui hydrolysent l’oxacilline et ses dérivés

et qui sont faiblement inhibées par l’acide clavulanique. Ces enzymes sont le plus souvent

retrouvées chez Pseudomonas aeruginosa, mais elles ont aussi été retrouvées chez

d’autres bactéries à Gram négatif (105).

12-Utilisation des bêta-lactamines chez le porc

121- Utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire

(a) Usage des antibiotiques en médecine vétérinaire

Les antibiotiques peuvent être utilisés en médecine vétérinaire de quatre façons avec des

objectifs différents (118) :

* usage thérapeutique : l’objectif majeur est d’obtenir la guérison des animaux

cliniquement malades et d’éviter la mortalité.

* usage métaphylactique : lorsqu’une infection collective et contagieuse se déclare

chez quelques animaux dans des élevages avec de grands effectifs, l’ensemble du groupe

des animaux est traité. Cet usage permet de traiter les animaux soumis à la pression

infectieuse alors qu’ils sont encore en incubation ou lorsque les manifestations cliniques sont

très discrètes, ce qui permet un traitement collectif par voie orale. La méthaphylaxie est

généralement mise en œuvre à partir d’un seuil d’atteinte des animaux au sein du lot de 10-

15% de l’effectif.


33

* usage prophylactique : les antibiotiques peuvent parfois être administrés à des

périodes critiques de la vie des animaux soumis à une pression de contamination régulière

et bien connue. Dans la filière porcine, des antibiotiques peuvent être donné à titre préventif

au moment du sevrage qui constitue un stress important pour les animaux.

L’antibioprophylaxie est aussi utilisée lors d’opérations chirurgicales pour prévenir les

infections bactériennes.

* facteurs de croissance : les antibiotiques peuvent être utilisés dans l’aliment à titre

d’additifs en vue d’améliorer la croissance et les performances des animaux, sans que les

mécanismes à l’origine de l’amélioration de ces performances aient été clairement élucidés

(39). Cet usage a fait l’objet de nombreuses critiques et il est interdit au sein de l’Union

Européenne depuis 2006 (122).

(b) Modalités d’usage des antibiotiques chez les animaux de rente

Des traitements individuels sont généralement mis en œuvre pour les animaux de

grande taille selon des modalités comparables à celle de la médecine humaine. Ces

traitements individuels sont inadaptés pour des larges effectifs d’animaux, comme c’est le

cas en filière porcine ou aviaire. En effet, d’un point de vue pratique, il est impossible de

traiter individuellement un lot de 20 000 poulets de chair ou une bande de 150 porcs. Dans

ce cas, le traitement ne peut être que collectif.

La voie d’administration est choisie en fonction des aspects pharmacologiques, des

aspects microbiologiques, du statut monogastrique-polygastrique de l’animal ainsi que du

nombre d’animaux à traiter (13). La voie parentérale est réservée à des traitements

individuels. La voie orale sera privilégiée pour les traitements collectifs. Elle peut se faire par

administration dans l’eau de boisson ou dans l’aliment. Une enquête épidémiologique

réalisée auprès de vétérinaires réalisant des prescriptions d’antibiotiques en élevage porcin

en France en 2000 a révélé que la voie orale était la voie d’administration prescrite dans

93% des cas, soit dans la nourriture (63%), soit dans l’eau (37%) (29).

(c) Antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire

Les antibiotiques utilisés en médecine humaine et vétérinaire appartiennent aux

mêmes familles, à l’exception d’une sous famille propre à la médecine vétérinaire

(pleuromutilines) et de quelques sous-familles utilisées exclusivement en médecine

humaine. Les carboxy-pénicillines, les uréido-pénicillines, les carbapénèmes et les

monobactames sont notamment réservés à la médecine humaine.


34

Entre 1999 et 2005, en France, les antibiotiques les plus utilisés en médecine

humaine ont été les bêta-lactamines qui représentaient plus de la moitié du tonnage total

vendu. Au cours de la même période, en médecine vétérinaire, les tétracyclines

représentaient presque la moitié du tonnage total vendu. Près de la moitié des ventes

d’antibiotique vétérinaires a été réalisée dans la filière porcine (4).

Le suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des antibiotiques en

France en 2006 a montré que dans la filière porcine la vente de tétracycline a représenté

58% des ventes. Les bêta-lactamines arrivent en cinquième position avec 5% du tonnage

derrière les tétracyclines, les sulfonamides, les macrolides et les polypeptides. Les

céphalosporines ne représentent que 0.02% des ventes (3).

122- Utilisation des bêta-lactamines en élevage porcin

(a) Bêta-lactamines possédant une Autorisation de Mise sur le

Marché dans l’espèce porcine

Les bêta-lactamines utilisables dans l’espèce porcine en France sont les suivantes :

la pénicilline G, l’ampicilline, l’amoxicilline, une céphalosporine de troisième génération : le

ceftiofur, et une de quatrième génération : la cefquinome. Toutes ces molécules peuvent être

utilisées par voie injectable. Seules l’ampicilline et l’amoxicilline peuvent être administrées

par voie orale. L’utilisation de l’association amoxicilline-acide clavulanique n’est pas

autorisée en France dans l’espèce porcine. Les bêta-lactamines sont utilisées seules ou

dans des formulations où elles sont associés avec d’autres antibiotiques.

(source : Dictionnaire des Médicaments Vétérinaires, 2007)

(b) Indications des bêta-lactamines dans l’espèce porcine

- Truies : l’indication principale est le traitement des cystites. Les truies sont traitées de

manière individuelle par voie orale avec de l’amoxicilline ou par voie injectable avec le

ceftiofur ou la cefquinome.

- Porcelets en maternité : les traitements sont toujours individuels. La prévention des

arthrites est réalisée par injection de pénicilline G, d’amoxicilline ou de céphalosporines. Les

colibacilloses peuvent être traitées par voie orale avec les associations amoxicilline-colistine

ou ampicilline-colistine.

- Porcelets au sevrage : l’amoxicilline permet de contrôler les infections à Streptococcus suis

par voie orale et les infections respiratoires par voie injectable.


35

- Porcs en engraissement : l’amoxicilline et l’association pénicilline-dihydrostreptomycine

peuvent être utilisés par voie injectable pour contrôler les infections respiratoires. En cas

d’infection aiguë, l’ensemble des porcs peut être traité avec de l’amoxicilline par voie orale.

(source : (23))

(c) Propriétés pharmacocinétiques des bêta-lactamines chez l’animal

Les propriétés pharmacocinétiques des bêta-lactamines chez le porc sont présentées

dans cette section car lors de notre étude expérimentale, nous avons testé l’impact de trois

modalités d’administration de l’ampicilline sur la flore digestive. Les profils des

concentrations plasmatiques de l’ampicilline ont alors été étudiés afin d’estimer de manière

indirecte l’exposition du tube digestif à l’ampicilline (chapitre 3).

* Propriétés pharmacocinétiques de l’ampicilline par voie parentérale

chez le porc

Le tableau 4 présente la synthèse des résultats des paramètres pharmacocinétiques

de l’ampicilline, administrée par voie intraveineuse et intramusculaire, mesurés au cours de

trois études.


36

Tableau 4 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (1)

(moyennes ± écart-type) après administration par voie intraveineuse et intramusculaire chez le porc.

Référence Galtier et al.,

1979 (55) Yuan et al., 1997 (139)

Apley et al., 2007 (9)

Dose mg/kg 20 10 17.6

Voie intraveineuse

Poids des porcs kg 36-49 28-36 6-15

AUCa µg.h/mL 36.3 19 ± 2.7 28.87 ± 2.01

Vssb L/kg 0.51 ± 0.02 0.86 ± 0.33

Clc L/h/kg 0.55 0.52 ± 0.07 0.62 ± 0.04

t1/2d

h 0.59 0.69 ± 0.08 0.92 ± 0.05

Voie intramusculaire

Poids des porcs kg 36-49 30-48 6-15

AUCa µg.h/mL 32 17 ± 5 25.07 ± 3.09

Cmaxe µg/mL 12 ± 5 7.39 ± 0.9

Tmaxf h 0.34 ± 0.18 1 (étendue : 0.5-1.5)

Fg % 88 86± 23 83 ± 29 a AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss : volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d t1/2 : temps de demi-vie, e Cmax : concentration plasmatique maximale, f Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, g F : biodisponibilité absolue

* Propriétés pharmacocinétiques de l’amoxicilline par voie orale chez le

porc et impact du statut digestif

Il n’existe pas à notre connaissance de données dans la littérature concernant les

paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline chez le porc par voie orale. Par contre, de

nombreuses études ont été publiées pour l’amoxicilline. L’amoxicilline ne diffère de

l’ampicilline que par un groupement hydroxyle qui lui confère une meilleure biodisponibilité

par voie orale que l’ampicilline. Les résultats de deux études étudiant la biodisponibilité

absolue de l’amoxicilline, et l’impact du statut digestif sur l’absorption chez le porc sont

résumés dans le tableau 5. L’absorption de l’amoxicilline par voie orale chez le porc est lente

et incomplète. De plus, il apparaît que la présence d’aliment dans le tractus digestif serait

responsable d’une diminution de la biodisponibilité par voie orale de l’amoxicilline.


37

Tableau 5 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (1)

(moyennes ± écart-type) après administration chez le porc à jeun et le porc nourri.

Référence Agerso et al., 1998 (5) Del Castillo et al., 1998 (36)

Poids kg 30-50 24 jours (environ 8 kg)

Dose mg/kg 10 15

Statut digestif A jeun Nourri A jeun Nourri

Cmaxa µg/mL 1.6 ± 0.9 0.8 ± 0.3 4.7 ± 1.5 2.1 ± 1.3

Tmaxb h 1.9 ± 0.9 3.6 ± 1.5 0.9 ± 0.1 0.8 ± 0.3

Fc % 33 ± 14 28 ± 8 36 ± 6 23 ± 15 a Cmax : concentration plasmatique maximale, b Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, c F : biodisponibilité absolue

* Propriétés pharmacocinétiques de la pivampicilline

Les propriétés pharmacocinétiques de la pivampicilline sont présentées dans cette

section. Elles ont motivé le choix de cette bêta-lactamine dans le cadre d’une stratégie

thérapeutique que nous proposons. Cette stratégie est destinée à prévenir l’émergence de

résistance au sein de la flore digestive commensale lors d’administration de bêta-lactamines.

Nous présentons cette stratégie dans le chapitre 4.

La pivampicilline (C-3 pivaloyloxyméthyl ampicilline) est un ester de l’ampicilline.

Cette prodrogue de l’ampicilline a été développée afin d’améliorer la biodisponibilité de

l’ampicilline par voie orale chez l’homme (133). La pivampicilline est hydrolysée par des

estérases, présentes au niveau de la lumière intestinale et à l’intérieur des entérocytes. La

pivampicilline est plus liposoluble que l’ampicilline et elle pénètre plus facilement dans les

cellules intestinales. Lorsque la pivampicilline est à l’intérieur des entérocytes, l’ampicilline

formée suite à son hydrolyse intracellulaire est majoritairement prise en charge par des

transporteurs situés sur le pôle basal, et se retrouve dans la circulation sanguine. Ces

mécanismes expliquent la plus grande biodisponibilité observée (53). De plus, les esters

sont inactifs sur le plan bactériologique car le groupement carboxylique en C-3 est

indispensable pour l’expression de l’activité antibactérienne (21).

Chez l’animal, les paramètres pharmacocinétiques de la pivampicilline ont été étudiés

chez le veau et le cheval (48, 141). Dans ces deux espèces, la biodisponibilité de la

pivampicilline est de l’ordre de 30% alors que celle de l’ampicilline est de l’ordre de 10%. De

plus, le statut digestif ne semble pas avoir d’effet sur l’absorption à la différence de

l’ampicilline ou de l’amoxicilline.

38

39


Chapitre 2 : Impact de l’administration des bêta-lactamines sur la flore digestive et stratégies de

prévention

40


41

Chapitre 2 - Impact de l’administration des bêta-lactamines sur la flore digestive et stratégies de prévention

Ce chapitre présente les conséquences de l’antibiothérapie sur l’écosystème

intestinal des animaux, et les conséquences qui en découlent en terme de santé publique. Il

est centré sur l’étude de la résistance des bactéries de la flore digestive du porc, sur l’impact

écologique des bêta-lactamines, et sur les stratégies thérapeutiques de prévention des

modifications de cet écosystème au cours d’une antibiothérapie.

21- Ecosystème intestinal et antibiothérapie

211- Description de la flore commensale digestive

(a) Composition de la flore commensale du tube digestif

L’anatomie du tube digestif et les flores intestinales qui y résident, sont variables

d’une espèce animale à l’autre (73). Chez le porc, comme dans les autres espèces, la flore

varie en fonction des stades physiologiques (74) et de l’alimentation (62). La flore intestinale

forme un écosystème complexe dont la composition varie en fonction de la localisation dans

le tube digestif et en fonction de l’individu. Chez le porc, il a été montré qu’il existait des

différences dans la composition de la flore entre des animaux de même origine génétique, et

qui étaient hébergés dans des conditions identiques (65).

L’estomac, le duodénum et l’intestin grêle proximal contiennent peu de bactéries pour

la plupart des lactobacilles et des streptocoques (73). Le côlon abrite la densité microbienne

la plus forte avec 109-1011 bactéries/mL et une majorité de bactéries anaérobies strictes,

composées de nombreuses espèces. Les principaux genres bactériens sont les suivants :

Streptococcus, Lactobacillus, Eubacterium, Fusobacterium et Bacteroides. L’ensemble de

ces bactéries compose la flore dominante. La flore sous-dominante regroupent des

espèces bactériennes anaérobies strictes mais aussi des espèces aérobie-anaérobie

facultatives : les entérobactéries et les entérocoques. Chez le porc, les souches d’E. coli

représentent environ 2% des bactéries fécales (98). A côté de cette flore résidente, il peut

exister une flore transitoire, qui ne s’implante pas dans le tube digestif, sauf dans des

circonstances pathologiques ou lors d’une antibiothérapie.


42

(b) Résistance à la colonisation

La flore du tube digestif établit des relations multiples avec l’hôte, créant un équilibre

dynamique dont la stabilité est maintenue par des interactions partiellement connues. La

composition de la flore du tube digestif est relativement stable pour un individu au cours du

temps. La flore digestive agit comme une barrière en s’opposant à l’implantation et à la

multiplication des micro-organismes d’origine exogène (135). Cet effet de barrière prévient

aussi la colonisation du tube digestif par des micro-organismes déjà présent tels que les

levures ou Clostridium difficile. Cette résistance à la colonisation est principalement assurée

par la flore anaérobie, mais aussi par des facteurs anatomiques et physiologiques

(péristaltisme, sécrétion de salive, acidité gastrique...) et par le système immunitaire.

212- Impact de l’antibiothérapie sur la flore digestive

Dans le cas d’une antibiothérapie, une fraction de la dose administrée peut être

excrétée sous forme active par voie biliaire ou sécrétée par la muqueuse intestinale, à

laquelle s’ajoute en cas d’administration orale la fraction non absorbée. Les quantités

d’antibiotiques qui sont alors présentes dans le tube digestif peuvent altérer l’équilibre

microbien de la flore intestinale. Les effets observés chez l’hôte peuvent être alors (43):

- l’élimination des bactéries sensibles aux concentrations actives de l’antibiotique,

- la sélection et la prolifération de bactéries résistantes au sein de la flore endogène.

L’antibiothérapie modifie donc la stabilité de l’écosystème bactérien et altère la composition

de la flore responsable de la résistance à la colonisation.

Plusieurs facteurs interviennent sur l’intensité des modifications de l’écosystème

intestinal au cours d’un traitement antibiotique, notamment la concentration active qui atteint

la lumière intestinale, l’activité intrinsèque de la molécule sur les bactéries qui composent

l’écosystème, de sa fixation à des composants du bol alimentaire (protéines, cellulose) et

son inactivation éventuelle dans le contenu intestinal (125).

(a) Emergence de micro-organismes pathogènes dans la flore

digestive

La disparition de l’effet de barrière peut entraîner l’émergence de bactéries

pathogènes. Chez l’homme, les colites pseudomembraneuses, liées au développement de

Clostridium difficile producteur de toxines, et la pullulation de levures saprophytes telles que

Candida albicans sont l’illustration de l’effet des antibiotiques sur la flore intestinale (125). La


43

prise d’antibiotique est également un facteur de risque de survenue d’une infection à

salmonelles (41).

En médecine vétérinaire, l’ampicilline ne doit pas être administrée ni aux rongeurs, ni

au lapins car elle perturbe leur écosystème digestif et être l’origine de colites (Clostridium

difficile chez les rongeurs et Clostridium spirofome chez le lapin) (110). Les amino-

pénicillines ne doivent pas non plus être administrées par voie orale chez le cheval car elles

sont très peu absorbées dans cette espèce, et induisent des entérocolites à Clostridium

difficile (116).

(b) Emergence de bactéries résistantes dans la flore digestive chez

l’animal et conséquences en terme de santé publique

* Emergence de bactéries zoonotiques résistantes

Chez l’animal, le traitement antibiotique peut permettre l’émergence ou la sélection

de bactéries zoonotiques résistantes dans le tube digestif des animaux. Ces bactéries

peuvent être transmises à l’homme par les aliments qu’il consomme et être responsable de

toxi-infections alimentaires. Ces bactéries peuvent être également transmises par contact

avec les animaux ou indirectement par d’autres voies. Les bactéries du genre

Campylobacter et Salmonella sont les principales bactéries responsables de gastro-

entérites d’origine infectieuse et la viande de porc fait partie des sources de contamination

de l’homme. Le fait que ces bactéries zoonotiques soient résistantes aux antibiotiques peut

avoir plusieurs conséquences (96):

- En général, les diarrhées bactériennes zoonotiques de gravité faible ou modérée ne

sont habituellement pas traitées avec des antibiotiques. Les patients âgés, les patients

bactériémiques ou les malades à risque de complication peuvent cependant être traités avec

des antibiotiques. Si les bactéries zoonotiques sont résistantes, on peut assister à un échec

thérapeutique.

- Les bactéries zoonotiques résistantes seraient à l’origine d’infections plus invasives

et d’une augmentation de la mortalité des patients.

- Si des bactéries zoonotiques résistantes contaminent un individu soumis

préalablement à une antibiothérapie, elles auront un avantage sélectif pour coloniser le tube

digestif de cet individu.

En terme de santé publique, le premier enjeu de l’utilisation des antibiotiques chez les

animaux est donc de limiter leur impact sur l’émergence et la sélection de bactéries


44

zoonotiques résistantes dans le tube digestif des animaux car la diffusion de bactéries

zoonotiques résistantes de l’animal à l’homme est possible, et de nombreux arguments

attestent de sa réalité (45).

* Emergence de bactéries commensales résistantes

Le traitement antibiotique peut aussi permettre l’émergence ou la sélection de

bactéries commensales résistantes dans le tube digestif. La dissémination des

déterminants génétiques de la résistance portés par une bactérie commensale peut être

considérable puisque ces gènes peuvent être transférés verticalement (à la descendance)

ou horizontalement (aux autres lignées bactériennes) s’ils sont situés sur des éléments

génétiques mobiles. Ces échanges peuvent survenir entre souches résidentes de la flore

intestinale provenant d’espèces identiques, différentes voire éloignées (132). Le tube digestif

des animaux devient un réservoir de gènes de résistance à l’antibiotique administré. Les

bactéries commensales sont transmises à l’homme par les mêmes voies que les bactéries

zoonotiques. Les bactéries commensales d’origine animale peuvent donc potentiellement se

retrouver dans le tube digestif de l’homme et même si elles n’y sont que de façon transitoire,

elles peuvent alors éventuellement transférer des gènes aux bactéries commensales

humaines. L’écosystème intestinal humain se trouverait donc enrichi de déterminants

génétiques de résistance d’origine animale, potentiellement transmissibles à des bactéries

pathogènes (115). L’étude de ces flux de gènes potentiels entre le monde animal et humain

est encouragée par l’AFSSA (Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments) et

l’EFSA (European Food Safety Authority) afin de mieux cerner son importance (4).

Les bactéries isolées chez les animaux et chez l’homme partagent les mêmes

mécanismes de résistance, ceci est un argument en faveur de l’absence d’étanchéité entre

les populations bactériennes d’origine humaine et animale. Les flux de gènes de résistance

peuvent a priori s’effectuer dans les deux sens, et l’évaluation des flux de gènes entre les

populations bactériennes humaines et animales nécessite de développer des marqueurs qui

permettent de reconnaître l’écosystème d’origine de la bactérie ou du mécanisme de

résistance. Ces marqueurs sont particulièrement difficiles à définir car les populations

bactériennes d’origine humaine et animale peuvent être relativement proches. En effet, une

étude récente vient de montrer qu’en Ouganda les populations humaines rurales et le

cheptel partageaient des souches de E. coli identiques sur le plan génétique (113).

Un deuxième enjeu de l’utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire est donc

de limiter l’excrétion de bactéries digestives résistantes car ces bactéries peuvent


45

potentiellement transmettre leurs gènes de résistance à des bactéries qui font partie de

l’écosystème intestinal de l’homme. Le travail expérimental que nous avons mené s’inscrit

dans cette problématique. Nous avons voulu décrire les mécanismes qui concourent à

l’émergence de résistance lors d’administration d’ampicilline chez le porc, et proposer une

stratégie thérapeutique destinée à limiter l’impact de l’administration d’ampicilline sur la

sélection de bactéries résistantes d’origine digestive.

213- Mesure du niveau de résistance de la flore digestive

Dans l’optique de comparer le niveau d’excrétion fécale de bactéries résistantes suite

à l’administration d’antibiotique selon différents schémas thérapeutiques, il est indispensable

de quantifier le niveau de résistance de la flore commensale. Cette section présente les

méthodologies utilisées pour quantifier ce niveau de résistance. Quant à l’étude des

mécanismes populationnels qui concourent à l’émergence de cette résistance, elle nécessite

le recours à des techniques d’épidémiologie moléculaire

(a) Détection de la résistance bactérienne

*Définition de la résistance

La méthode de référence pour déterminer l’efficacité d’un antibiotique sur une souche

bactérienne est la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) par les

méthodes de dilution in vitro.

La valeur de la CMI permet de définir si une souche bactérienne est résistante. La

notion de résistance peut être définie selon différents points de vue (35):

- pour le microbiologiste, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si

elle dispose d’un mécanisme de résistance augmentant la valeur de la CMI,

- pour l’épidémiologiste, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si

elle a une CMI significativement différente de celle de la population sauvage,

- pour le pharmacologue, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si

les concentrations atteintes au site d’action, sont inférieures à la CMI,

- pour le clinicien, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si le

traitement n’est pas efficace.

Afin de prédire la sensibilité d’une souche en terme d’activité clinique afin de réaliser

le meilleur choix thérapeutique, des valeurs critiques ont été définies par des comités

d’experts. Elles permettent de déterminer la catégorie clinique d’une souche (sensible,


46

intermédiaire, résistante). La détermination de ces valeurs critiques a pris en compte la

distribution de CMI dans la population bactérienne considérée, les propriétés

pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de l’antibiotique et les résultats des études

cliniques (130). Pour que l’interprétation d’une valeur de CMI soit correcte, la détermination

de la CMI doit suivre les recommandations techniques des différents comités d’experts. Au

niveau européen, le comité d’experts est l’EUCAST (European Comitee on Antimicrobial

Susceptibility Testing) et aux Etats-Unis le CLSI (Clinical and Laboratory Standards

Institute). Ces comités ont déterminé des valeurs critiques pour les pathogènes d’intérêt

vétérinaire dans certaines espèces.

*Méthodologie de détection de la résistance

Lorsque l’on veut définir la catégorie clinique d’une souche, la méthode de référence

est la détermination de la CMI. Des valeurs critiques sont aussi disponibles pour interpréter

les résultats de l’antibiogramme.

Il est cependant possible d’identifier l’existence d’un mécanisme de résistance par

d’autres méthodes phénotypiques : détection directe d’enzymes de dégradation (test de

recherche de bêta-lactamases), recherche sélective sur des géloses contenant l’antibiotique

à des concentrations supérieures aux valeurs critiques, modification du milieu ou des

conditions d’incubation pour augmenter l’expression de la résistance, confirmation de la

présence de bêta-lactamase par l’utilisation d’inhibiteurs tels que l’acide clavulanique ou

l’EDTA....

Les méthodes génotypiques permettent de détecter les déterminants génétiques de

la résistance. La PCR (Polymerase Chain Reaction) est classiquement utilisée. Le

développement des techniques de biologie moléculaire a permis de développer des puces à

ADN qui peuvent détecter un large panel de gènes de résistance (102).

(b) Quantification du niveau de résistance au sein de la flore

commensale

La quantification de la résistance au sein de la flore commensale est nécessaire pour

le suivi des niveaux de résistance dans les enquêtes épidémiologiques, pour étudier l’impact

d’administration d’antibiotiques sur la sélection ou l’émergence de résistance dans la flore

digestive. Il n’existe pas de recommandations sur les méthodes pour mesurer

quantitativement la résistance dans ces populations. Evaluer la résistance de manière


47

quantitative représente un véritable challenge en terme de méthodologie et

d’échantillonnage (35).

La mesure de la résistance à un antibiotique au sein de la flore commensale peut se

faire grâce à bactéries indicatrices. E. coli et Enterococcus faecium sont classiquement

utilisées parce que leur mise en culture est facile et qu’elles ont une importance en

pathologie animale et humaine. Le pourcentage de souches d’E. coli résistantes est

couramment utilisé chez le porc pour mesurer le niveau de résistance de la flore

commensale (120).

Une autre façon d’estimer quantitativement la résistance est de calculer le rapport

entre le dénombrement de bactéries poussant sur milieu supplémenté en antibiotique (à une

concentration qui inhibe les bactéries sensibles), et le dénombrement total. Les

entérobactéries, coliformes ou E. coli ont été utilisés à cet escient chez le porc (16, 38).

Dans ces études, l’estimation de la résistance dépend d’une mesure sur des isolats

provenant de populations contenant des millions de bactéries. Dans l’optique de quantifier

le réservoir digestif de gènes de résistance au niveau de la biomasse bactérienne totale,

les gènes peuvent être quantifiés par PCR en temps réel. Cette approche a déjà été utilisée

chez l’animal afin d’évaluer l’impact sur la flore commensale de différents schémas

d’administration de bêta-lactamines. Chez le chien, la quantification des gènes blaTEM dans

les fèces par PCR en temps réel a permis d’évaluer l’impact d’une nouvelle stratégie

thérapeutique destinée à limiter les effets de l’ampicilline sur l’écosystème digestif (63). Chez

les bovins, les gènes blaCMY2 ont été quantifiés afin d’évaluer l’impact de différents schémas

posologiques du ceftiofur (6).

Au cours de notre travail expérimental, nous avons développé et validé une technique

de quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc. Nous avons comparé cet outil

aux indicateurs phénotypiques classiquement utilisés : le pourcentage d’entérobactéries

résistantes (calculé à l’aide des dénombrements réalisés sur gélose supplémentée ou non

en ampicilline) et le pourcentage de souches d’E. coli résistantes (calculé après la

détermination de la CMI de 20 isolées par animal) (cf. Article 1).

(c) Epidémiologie moléculaire au sein de la flore commensale

Les méthodes moléculaires se sont beaucoup développées ces dernières années

notamment pour l’investigation épidémiologique et la comparaison de souches bactériennes.

Ces méthodes permettent d’apprécier la diffusion d’un clone résistant au sein d’une

population donnée ou bien de mettre en évidence des transferts horizontaux de gènes (1).


48

Le pouvoir de discrimination des souches est variable selon les méthodes et l’espèce

bactérienne analysée. Ces méthodes reposent sur deux grands principes : soit l’amplification

par PCR de séquences données, soit la restriction de l’ADN bactérien (123).

L’électrophorèse en champ pulsé repose sur la restriction de l’ADN bactérien. Nous

avons utilisé cette technique au cours de notre travail expérimental pour typer des souches

fécales d’E. coli, sélectionnées par l’administration d’ampicilline, et évaluer leur parenté

génétique (cf. Article 2). L’électrophorèse en champ pulsé est une technique de référence

pour différencier les souches pathogènes et pour suivre leur dissémination (54, 59). Elle peut

également permettre d’évaluer la dissémination d’un clone résistant au sein de l’écosystème

digestif (93).

22- Antibiothérapie et résistance des entérobactéries dans l’espèce porcine

221- Etudes descriptives de la résistance des entérobactéries de la flore digestive

(a) Programme national de surveillance de la résistance des bactéries

de la flore commensale en filière porcine

En France, la surveillance de la résistance des bactéries de la flore commensale pour

la filière porcine a été initiée en 2002. Cette surveillance est réalisée dans le cadre d’un plan

de surveillance mis en place par la DGAL (Direction Générale de l’ALimentation), en

collaboration avec l’AFFSA. Le programme actuel a pour objectif de fournir une évaluation

annuelle du taux de résistance pour les bactéries indicatrices E. coli et Enterococcus

faecium. Le tableau 6 donne les pourcentages de résistance des souches de E. coli isolées

de porcs à l’abattoir en 2003 et 2004.


49

Tableau 6 : Pourcentage de résistance des souches d’E. coli isolées de porcs à l’abattoir

moyennes (intervalle de confiance) en 2003 et 2004 (à partir de (2)).

Pourcentages de souches d’E. coli résistantes Antibiotique

2003 2004

Acide nalidixique 7.1 (2.0-12.1) 3 (0-6.3)

Ampicilline 26.5 (17.8-35.3) 22 (13.9-30.1)

Apramycine 9.1 (3.4-14.8) 4 (0.2-7.8)

Chloramphénicol 21.4 (13.3-29.6) 14 (7.2-20.8)

Ciprofloxacine 0 (0-2.9) 1 (0-3.0)

Florfénicol 2 (0-4.7) 1 (0-3.0)

Gentamicine 3.1 (0-6.5) 0 (0-3.0)

Néomycine 5.9 (1.3-10.6) 5 (0.7-9.3)

Streptomycine 67 (57.8-76.2) 62 (52.5-71.5)

Tétracycline 81.2 (73.6-88.8) 86 (79.2-92.8) Triméthoprime + Sulfonamides

48 (38.2-57.8) 44 (34.3-53.7)

Les souches d’E. coli étaient majoritairement résistantes à la tétracycline et à la

streptomycine. Environ la moitié des souches était résistante à l’association triméthoprime-

sulfonamides, et environ 25 % des souches étaient résistantes à l’ampicilline.

Au niveau européen, une enquête épidémiologique sur le niveau de résistance chez

l’animal a été réalisée par le CEESA (Centre Européen d’Etudes pour la Santé Animale)

(26). Les prélèvements ont été réalisés à l’abattoir entre 1999 et 2000 pour la filière porcine.

Les résultats montrent que le pourcentage de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline

était différent entre les pays. Il était relativement bas au Danemark, aux Pays-Bas, en Suède

avec respectivement 10.5%, 17% et 3.4% des souches résistantes à l’ampicilline. Par contre,

en Espagne, 52.1% des souches étaient résistantes à l’ampicilline.

(b) Déterminants génétiques de la résistance aux bêta-lactamines chez

les animaux

Une étude a été réalisée en Espagne par Brinas et al. afin d’identifier les

déterminants génétiques de la résistance dans des souches d’E. coli isolées à partir

d’aliments d’origine animale, et de fèces d’humains et d’animaux sains (19). Les résultats ont

montré que le mécanisme de résistance à l’ampicilline dans les souches d’E. coli était la

production de bêta-lactamase TEM à 83%. Parmi les gènes blaTEM, le gène blaTEM-1b a été

identifié dans 69% des cas. Le même type d’étude réalisée au Danemark sur des souches


50

d’E. coli isolées à partir de fèces d’animaux sains et malades a montré les mêmes résultats

(103). Cette prédominance des gènes blaTEM a été retrouvée dans des souches d’E. coli

pathogènes isolées chez le porc (92) au Canada, et dans des souches d’E. coli

commensales isolées de bovins, porcins et poulets en Allemagne (61).

Les gènes blaTEM sont responsables de la résistance à l’ampicilline des souches

d’E. coli isolées du tube digestif des animaux. Le tube digestif des animaux représente

un réservoir de gènes blaTEM que nous avons quantifié par PCR en temps réel lors de notre

étude expérimentale afin d’évaluer les quantités de gènes excrétés au cours d’une

antibiothérapie.

En ce qui concerne la résistance aux céphalosporines de troisième génération, des

BLSE de type CTX-M-1 ont été mises en évidence dans des souches d’E. coli isolées dans

la filière porcine en France (95).

222- Analyse de l’impact de l’usage des antibiotiques sur le niveau de résistance de la flore digestive

Plusieurs études ont montré que chez le porc, comme chez les autres espèces

animales, l’administration d’antibiotique augmente la prévalence de la résistance au sein des

bactéries de la flore commensale. Lorsque les antibiotiques sont administrés, en majorité par

la voie orale chez le porc, les bactéries digestives qui sont résistantes à l’antibiotique sont

sélectionnées, et ces bactéries résistantes peuvent alors coloniser le tube digestif (120).

Sunde et al. ont recherché la prévalence de la résistance au sein de souches fécales

d’E. coli isolées de porcs provenant de 10 fermes avec un historique d’utilisation antibiotique

à but thérapeutique différent (127). Ils ont montré que pourcentage le plus important de

bactéries résistantes a été retrouvé dans les fermes où l’utilisation d’antibiotiques était

considérée comme élevée. Il ont de plus mis en évidence que le tube digestif des porcs était

un véritable réservoir de gènes de résistance, situés dans des éléments génétiques mobiles

facilement transmissibles à d’autres bactéries par transfert horizontal (128).

Belloc et al. ont montré que l’administration de fluméquine chez la truie entraînait une

augmentation du pourcentage de bactéries résistantes aux fluoroquinolones (16). Ils ont

aussi constaté que les dénombrements des souches d’E. coli totaux et résistants

présentaient une grande variabilité entre les individus au cours du traitement.


51

D’autres auteurs ont aussi mis en évidence une relation entre une utilisation élevée

d’antibiotique et une plus forte prévalence d’entérobactéries résistantes dans la flore

digestive du porc (37, 58, 91).

223- Facteurs autres que l’antibiothérapie gouvernant le niveau de résistance des bactéries de la flore digestive

(a) Persistance de souches antibiorésistantes dans le tube digestif des

animaux

En l’absence de pression de sélection exercée par l’antibiotique, des entérobactéries

résistantes ont été retrouvées dans le tube digestif des hommes et dans l’environnement

(114).

Chez le porc, il a été mis en évidence que l’arrêt de l’utilisation d’antibiotiques

n’entraînait pas la disparition des souches résistantes du tube digestif (22, 78).

Chez des animaux sauvages, qui n’ont jamais été exposés a priori aux antibiotiques,

les gènes codant pour des BLSE variées de type CTX-M, TEM et SHV ont été détectés dans

les fèces (32).

Ces exemples montrent que dans l’environnement, des facteurs autres que les

antibiotiques, doivent donc contribuer à la distribution et au maintien des déterminants

génétiques de la résistance dans la flore digestive normale des animaux (8, 126).

(b) Facteurs autres que l’antibiothérapie ayant un impact sur le

niveau de résistance des bactéries de la flore commensale

L’antibiothérapie n’est pas le seul facteur qui contribue à l’augmentation du nombre

de bactéries résistantes dans la flore fécale. L’impact de plusieurs facteurs sur le niveau de

résistance a été étudié dans l’espèce porcine.

Moro et al. ont montré que des stress thermiques, qu’ils soient froids au chauds,

conduisaient à une excrétion plus importante de bactéries résistantes dans la flore fécale

(99, 100). Le stress provoqué par un transport long et un temps d’attente important avant

l’abattage a aussi conduit à une augmentation de bactéries résistantes dans les fèces (97).

Les conditions d’hébergement, d’hygiène et l’âge des animaux pourraient aussi influencer le

développement et la maintenance de bactéries résistantes dans la flore commensale du porc

(38, 79).


52

En conclusion, le niveau de résistance des bactéries du tube digestif dépend non

seulement de la pression de sélection exercée par l’antibiotique; mais il est aussi gouverné

par d’autres facteurs. L’excrétion de bactéries résistantes est d’ailleurs très variable chez un

même animal au cours du temps. L’étude de la dynamique populationnelle des souches d’E.

coli résistantes dans la flore commensale permettrait de mieux cerner les mécanismes qui

gouvernent l’excrétion des souches résistantes.

224- Dynamique populationnelle des souches d’E. coli résistantes de la flore commensale

Une équipe anglaise a montré que le tube digestif des veaux, en l’absence de

pression de sélection exercée par des antibiotiques, était colonisé par des souches d’E. coli

résistantes à l’ampicilline très rapidement après leur naissance. Ces souches appartenaient

à des pulsotypes variés. L’analyse temporelle des résultats a montré que le tube digestif

était colonisé par des « vagues » successives de pulsotypes résistants à l’ampicilline

différents, qui avaient probablement une origine environnementale (67).

L’impact de l’administration d’ampicilline sur la diversité des souches commensales

d’E. coli a été étudié chez le chien au cours d’une étude expérimentale. Les auteurs ont

montré que l’ampicilline a sélectionné des souches résistantes à l’ampicilline qui étaient

éloignées génétiquement, et que les souches qui étaient sensibles avant l’administration

d’ampicilline ne sont pas devenues résistantes (93).

Peu d’études ont donc été menées pour appréhender les mécanismes

populationnels qui concourent à l’émergence de résistance. La compréhension de ces

mécanismes pourrait pourtant permettre de mieux cerner l’émergence de résistance et

d’envisager des stratégies pour la prévenir. Dans le cadre de notre étude expérimentale,

nous avons donc voulu caractériser la dynamique de l’émergence de la résistance au sein

des populations digestives d’E. coli. Par rapport à l’étude qui a été réalisée chez le chien,

nous avons sélectionné des souches résistantes à l’ampicilline avant traitement, afin

d’évaluer si les souches sélectionnées par le traitement existaient déjà dans le tube

digestif avant le traitement (Article 2).


53

23- Impact des bêta-lactamines sur l’écosystème intestinal et activité bêta-lactamase fécale

231- Etude chez le porc

Après administration d’ampicilline par voie orale à des porcs, Esoula et al. ont étudié

les concentrations et l’efficacité in situ de l’ampicilline au niveau du caecum (50). Après la

première administration, les concentrations en ampicilline, mesurées par dosage

microbiologique, ont atteint un pic dans le caecum au bout d’environ 5 heures. Entre 5 et 8

heures après l’administration, le nombre de colibacilles a diminué. A 24 heures, ils avaient

retrouvé leur niveau initial et chez la majorité des porcs, et ils étaient devenus résistants à

l’ampicilline. Chez ces porcs, lors de la deuxième et troisième administrations, le dosage

microbiologique de l’ampicilline a montré que l’ampicilline avait été inactivée au niveau du

caecum. Les auteurs suggèrent que l’ampicilline a été inactivée par des bactéries porteuses

de plasmide conférant une résistance à l’ampicilline.

Cette hypothèse a été confirmée par les mêmes auteurs (33). Ils ont administré de

l’ampicilline à des agneaux axéniques, à des agneaux gnotoxéniques hébergeant une flore

contenant des E. coli soit sensibles soit résistants, et à des agneaux conventionnels. Chez

les agneaux axéniques ou hébergeant une flore sensible, une grande quantité d’ampicilline a

été mesurée au niveau du côlon. Par contre, chez les agneaux conventionnels ou

hébergeant une flore résistante, l’ampicilline a été inactivée.

232- Etude chez l’homme

Sullivan et al. ont réalisé la synthèse de diverses études étudiant l’impact de

l’administration des bêta-lactamines sur la microflore du tube digestif de l’homme (125).

(a) Administration d’ampicilline ou d’amoxicilline

L’administration d’ampicilline ou d’amoxicilline chez l’homme entraîne une importante

croissance d’entérobactéries résistantes. Les effets sur la flore aérobie à Gram positif (cocci)

et sur les bactéries anaérobies sont modérés. Il n’y a pas d’émergence de résistance chez

les entérocoques et chez les Bacteroides. Chez certains sujets, une colonisation par

Clostridium difficile ou Candida a pu être mise en évidence.


54

(b) Administration de céphalopsorines

L’administration de céphalosporines par voie orale ou parentérale entraîne une chute

importante du nombre d’entérobactéries, une augmentation du nombre des bactéries

aérobies à Gram positif (cocci) et un effet modéré sur les bactéries anaérobies. L’émergence

de résistance est absente parmi les entérocoques, les entérobactéries et les Bacteroides.

Par contre, le tube digestif des sujets est plus fréquemment colonisé par Clostridium difficile.

Lorsque des céphalosporines ont été administrées par voie orale ou parentérale, il a

été mis en évidence une relation inverse entre la production de bêta-lactamase (pouvant

hydrolyser les céphalosporines) et les concentrations en antibiotique dans les fèces (44, 80).

Une hypothèse était que les bêta-lactamases lorsqu’elles sont produites par des bactéries du

tube digestif doivent détruire les résidus de céphalosporines. Les effets de l’administration de

céphalosporines chez les sujets dont la flore produisait des bêta-lactamases ont ainsi été

réduits au minimum (28).

24- Stratégies thérapeutiques de prévention de l’émergence de résistance dans la flore digestive lors d’administration de bêta-lactamines

241- Optimisation de schémas thérapeutiques visant à limiter l’exposition de la flore digestive à l’antibiotique

Le développement de la résistance à un antibiotique est fonction des concentrations

auxquelles les bactéries sont exposées et de la durée de cette exposition. Des schémas

thérapeutiques différents conduisent à des expositions différentes du tube digestif, qui

peuvent avoir des impacts différents sur l’émergence de résistance au sein de la flore

commensale (138). Des exemples d’études chez le porc de l’impact d’administration

d’antibiotiques, selon divers schémas thérapeutiques, sur le niveau de résistance des

bactéries digestives, sont donnés dans cette section.

(a) Etudes descriptives et étiologiques

L’impact des modalités d’usage des antibiotiques a été approfondi dans le cadre

d’une étude de cohorte (42). Une des conclusions de cette étude est la mise en évidence

d’un risque plus important de sélection de souches résistantes d’E.coli lorsque les


55

antibiotiques sont dispensés à dose subthérapeutique dans l’aliment par rapport à des

traitements individuels.

Dans le cadre d’une étude visant à évaluer les relations entre les niveaux de

résistance de souches d’E. coli commensales et pathogènes et la consommation

d’antibiotique, Jensen et al. ont montré qu’au niveau national la résistance à l’apramycine

des souches d’E. coli pathogènes était significativement corrélée à la quantité et la durée de

l’administration d’apramycine (71).

(b) Eudes expérimentales

Mathew et al. ont démontré qu’entre différentes conditions d’administrations

d’apramycine, celle qui correspondait à une exposition orale, répétée, ponctuelle, à dose

maximale, conduisait aux taux de résistance les moins importants (90).

Wiuff et al. ont étudié l’effet de différents schémas posologiques d’administration

d’enrofloxacine sur le développement de résistance au niveau de souches de Salmonella et

d’E. coli du tube digestif. Ils ont montré que la résistance aux fluroquinolones au niveau de la

flore coliforme se développe très rapidement quelle que soit la voie d’administration et la

dose. A contrario, la sélection des salmonelles résistantes introduites au niveau du tube

digestif était diminuée lors de l’utilisation de la voie intramusculaire et en fractionnant la dose

(137).

Les études réalisées chez le porc indiquent que des schémas thérapeutiques

différents peuvent conduire à des impacts différents sur la sélection de souches

résistantes dans le tube digestif des animaux. C’est pourquoi, dans le cadre de notre

étude expérimentale, nous avons voulu évaluer si l’administration d’ampicilline selon des

modalités différentes pouvait avoir un impact différent sur la sélection

d’entérobactéries résistantes (Article 1).

242- Destruction enzymatique des résidus d’antibiotiques dans le tube digestif

Afin de prévenir la colonisation du tube digestif par des micro-organismes

opportunistes et des bactéries résistantes au cours d’une antibiothérapie, il faudrait obtenir

une diminution de la pression de sélection exercée sur l’écosystème digestif qui permette le

maintien de la flore barrière. Pour ce faire, une stratégie thérapeutique envisageable serait

d’inactiver les résidus d’antibiotique qui exercent une pression de sélection sur les bactéries

tout au long du tube digestif, et particulièrement au niveau du côlon, qui contient la

population bactérienne la plus importante. Deux options peuvent être envisagées pour


56

inactiver l’antibiotique: l’adsorption par un agent chimique, ou la destruction par un

mécanisme enzymatique (131).

(a) Administration de bêta-lactamase dans le but d’inactiver les

résidus digestifs de bêta-lactamines

Nous avons vu dans la section 232 que l’inactivation des résidus de céphalosporines

par des bêta-lactamases produites par des bactéries du tube digestif était associée avec des

altérations moindres de l’écosystème intestinal. L’utilisation de bêta-lactamases pour détruire

les résidus de bêta-lactamines dans le tube digestif apparaît ainsi naturellement comme une

stratégie permettant de diminuer la pression de sélection sur les bactéries commensales.

Pour tester cette hypothèse, Léonard et al. ont isolé des bactéries productrices de

bêta-lactamases du genre Bacteroides et Clostridium dans des fèces d’individus traités avec

de la ceftriaxone par voie intraveineuse et qui présentaient une activité bêta-lactamase (vis-

à-vis de la ceftriaxone) dans leur fèces (80). Ils ont administré ces bactéries à des souris à

flore humanisée qui ne contenait pas de bactéries anaérobies productrices de bêta-

lactamases. Ils ont mis en évidence que l’administration des souches sélectionnées

prévenait des effets délétères de la ceftriaxone, c’est à dire la colonisation du tube digestif

par une souche de Candida albicans et une souche d’Enterobacter cloacae résistante à la

ceftriaxone.

Une stratégie thérapeutique combinant l’utilisation concomitante de bêta-lactamine et

de bêta-lactamase est donc envisageable. Cependant, il faut s’assurer que l’exposition

systémique de l’individu à la bêta-lactamine ne soit pas modifiée.

(b) Administration de bêta-lactamine par voie parentérale et de bêta-

lactamase par voie orale

Lorsque les bêta-lactamines sont administrées par voie parentérale, l’objectif est

d’inactiver les résidus de bêta-lactamines excrétés dans le tube digestif par la bile.

Harmoinen et al. ont validé cette approche chez le chien (64). Ils ont administré à des chiens

de l’ampicilline par voie intraveineuse. Trois minutes avant, ils avaient administré à ces

chiens des billes à enrobage gastro-résistant contenant une bêta-lactamase recombinante

de classe A, qui a été libérée très précocement dans le tractus digestif car toute l’ampicilline

présente dans le tube digestif devait être inactivée. Les résultats ont montré que

l’augmentation de l’activité bêta-lactamase dans le jéjunum était corrélée à la diminution des

concentrations en ampicilline dans le tube digestif. Par ailleurs, il n’y a aucune modification

des paramètres pharmacocinétiques au niveau sanguin. De plus, chez les chiens traités à


57

l’ampicilline + bêta-lactamase, les auteurs n’ont pas observé d’impact sur la diversité

bactérienne du tube digestif, ou de sélection d’entérobactéries résistantes.

La même équipe a montré qu’une bêta-lactamase de classe B administrée en même

temps que l’association piperacilline-tazobactam par voie sous-cutanée prévenait de la

colonisation du tube digestif de souris par des entérocoques résistants à la vancomycine

(124).

(c) Administration de bêta-lactamine et de bêta-lactamase par voie

orale

Lorsque l’on administre la bêta-lactamine par voie orale, la stratégie est plus

complexe. Si on veut administrer de façon concomitante la bêta-lactamine et la bêta-

lactamase, il faut que les bêta-lactamases soient vectorisées en dehors de la fenêtre

d’absorption de la bêta-lactamine afin de ne pas diminuer l’exposition systémique de

l’individu à l’antibiotique. Les antibiotiques sont majoritairement absorbés au niveau du tube

digestif proximal. En ce qui concerne l’amoxicilline, il a été montré chez l’homme, que

l’absorption était maximale dans le duodénum et le jéjunum. Elle est beaucoup moins

importante et saturable au niveau de l’iléon, et elle n’est pas du tout absorbée au niveau du

côlon (14). D’après ces données, les bêta-lactamases devraient être libérées au niveau de la

région iléo-colique, afin de ne pas interférer avec l’absorption des bêta-lactamines.

Cependant, il faut que les bêta-lactamases soient libérées avant que la bêta-

lactamine, administrée par voie orale, n’atteigne le caecum car la partie distale du tube

digestif contient les populations bactériennes les plus denses, et serait le véritable

amplificateur de bactéries résistantes. Récemment, une équipe a validé cette stratégie en

administrant à des rats de l’amoxicilline par voie orale, et des bêta-lactamases (de classe B)

in situ au niveau de l’iléon (66). L’inactivation de l’amoxicilline à ce niveau du tractus digestif

a permis d’éviter la multiplication d’entérobactéries résistantes. Dans l’optique de développer

une stratégie de co-administration de bêta-lactamines et de bêta-lactamases par voie orale,

le développement d’un enrobage à délivrance optimale sera donc le point crucial.

La délivrance colique a fait l’objet de nombreuses recherches afin de délivrer des

médicaments in situ, par exemple pour le traiter la maladie de Crohn, les colites ulcéreuses,

le cancer colorectal ou l’amibiase. Pour réussir la délivrance colique d’un médicament, il doit

être protégé de l’absorption et de l’environnement du tube digestif proximal, et il doit être

libéré uniquement au niveau du côlon proximal. Plusieurs stratégies peuvent être utilisées:

des prodrogues, des systèmes pH-dépendant, des systèmes temps-dépendant, des


58

systèmes pression-dépendant et des systèmes contrôlés par l’activité microbienne du côlon

(31).

La vectorisation utilisant l’activité microbienne du côlon a été récemment utilisée pour

développer des billes de bêta-lactamases à délivrance colique. Les billes de bêta-

lactamases ont été enrobées par de la pectine et protégées de la dégradation dans le tube

digestif proximal (17). L’enrobage à base de pectine permet une vectorisation colique car la

pectine est complètement dégradée par des pectinases qui ne sont présentes qu’au niveau

du côlon. La co-administration de ces billes à des rats en même temps que l’amoxicilline n’a

pas eu d’impact sur les paramètres pharmacocinétiques de l’antibiotique.

Dans le cadre de notre étude expérimentale, nous avons évalué chez le porc, la

libération d’un enrobage à dissolution pH-dépendante qui a été développé chez l’homme

pour obtenir une vectorisation iléo-colique: l’Eudragit® FS 30 D. L’utilisation de cet enrobage

s’inscrit dans une stratégie thérapeutique qui consiste à associer une prodrogue

d’ampicilline avec des billes contenant des bêta-lactamases. Cette stratégie est

développée dans le chapitre 4.

59

ETUDE EXPERIMENTALE

Objectifs

60

Etude expérimentale - objectifs

61

ETUDE EXPERIMENTALE

OBJECTIFS

La synthèse bibliographique a mis en évidence que la sélection de bactéries

résistantes dans la flore commensale digestive des animaux pouvait avoir un impact en

terme de santé publique lorsque ces bactéries sont transmises à l’homme. L’objectif de ce

travail de thèse a donc été d’évaluer des stratégies visant à diminuer l’excrétion de bactéries

résistantes d’origine digestive, lors d’antibiothérapie en médecine vétérinaire. Nous avons

choisi de travailler avec le modèle porc car la filière porcine consomme la plus grande part

des antibiotiques utilisés chez les animaux. De plus, l’utilisation majoritaire de la voie orale

conduit à une exposition massive des bactéries du tube digestif.

Nous nous sommes intéressés dans ce travail à l’impact des bêta-lactamines car

ces molécules constituent la classe d’antibiotique la plus utilisée en médecine humaine, et

elles sont également utilisées en médecine porcine. De plus, nous avons vu que le

développement de nouvelles bêta-lactamines pour contrecarrer les mécanismes de

résistance a toujours été suivi de l’émergence de nouveaux mécanismes de résistance (cf.

tableau 1). Dans ce contexte, il serait judicieux de développer une stratégie qui permette de

limiter l’excrétion et la dissémination de bactéries résistantes d’origine digestive lors

d’administration de bêta-lactamines, afin de préserver l’efficacité des molécules existantes.

En outre, une stratégie originale de destruction des résidus de bêta-lactamines dans le tube

digestif par des bêta-lactamases a été décrite dans la littérature par plusieurs auteurs (17,

63, 66).

Les objectifs de cette thèse ont été :

- de caractériser la résistance bactérienne dans la flore digestive lors de

l’administration d’ampicilline chez le porc et,

- d’évaluer une stratégie thérapeutique visant à diminuer l’excrétion de bactéries

résistantes digestives lors d’administration d’ampicilline.

Nous avons vu précédemment que deux options étaient envisageables afin de

diminuer la pression de sélection sur les bactéries digestives lors d’une antibiothérapie :

- optimiser le schéma thérapeutique de façon à limiter l’exposition de la flore digestive à

l’antibiothérapie et,

Etude expérimentale - objectifs

62

- inactiver les résidus d’antibiotique qui n’ont pas été absorbés ou qui ont été sécrétés dans

le tube digestif.

Dans la première partie de ce travail de thèse (chapitre 3), nous avons tout d’abord

évalué si trois modalités d’administration de l’ampicilline (voie intramusculaire, voie orale à

jeun et voie orale avec l’aliment) réalisables sur le terrain conduisaient à des résultats

différents en terme d’émergence de résistance. Nous avons également cherché à

comprendre l’origine de la résistance afin de mieux cerner la dynamique de son émergence

au sein de la population des souches d’E. coli digestives.

Dans la deuxième partie de ce travail (chapitre 4), nous avons entrepris l’évaluation

d’une stratégie consistant en la co-administration par voie orale d’un ester d’ampicilline (la

pivampicilline) et de bêta-lactamase à vectorisation colique. Le chapitre 4 décrit les études

préliminaires qui ont permis de déterminer les propriétés d’absorption de l’ester d’ampicilline,

et de caractériser les propriétés de délivrance de l’enrobage sélectionné dans le tube digestif

du porc.

63

ETUDE EXPERIMENTALE

Chapitre 3 : Evaluation de l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur le

niveau de résistance de la flore digestive du porc et étude de la dynamique de l’émergence de la

résistance

64

Etude expérimentale - chapitre 3

65

Chapitre 3 : Evaluation de l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur le niveau de résistance de la flore digestive du porc et étude de la dynamique de l’émergence de la résistance

31- Introduction

Dans ce chapitre, nous avons évalué si des modalités d’administration différentes de

l’ampicilline conduisaient à un impact différent au niveau de l’émergence d’entérobactéries

résistantes dans la flore digestive. Nous avons également décrit la dynamique de

l’émergence de la résistance au sein des populations digestives d’E. coli.

Au cours d’une première étude, nous avons déterminé les profils pharmacocinétiques

de l’ampicilline par voie parentérale et par voie orale chez le porc, et nous en avons déduit

de manière indirecte l’exposition digestive pour ces deux voies d’administration.

Au cours d’une deuxième étude, nous avons mesuré le niveau de résistance de la

flore digestive après administration d’ampicilline selon trois modalités (voie intramusculaire,

voie orale à jeun et voie orale avec l’aliment). Dans l’optique de quantifier ce niveau de

résistance de façon pertinente, nous l’avons mesuré à l’aide de trois indicateurs : deux

indicateurs phénotypiques et un indicateur génotypique : la quantification des gènes blaTEM

dans les fèces par PCR en temps réel. Nous avons en effet développé ce nouvel outil dans

l’optique de quantifier les gènes blaTEM excrétés par les porcs lors d’administration

d’ampicilline. Les résultats sont présentés dans l’article 1.

Au cours d’une troisième étude, dont les résultats sont présentés dans l’article 2,

nous avons caractérisé l’impact de l’administration d’ampicilline sur les populations

digestives de souches d’E. coli. Pour ce faire, nous avons étudié par électrophorèse en

champ pulsé, la parenté entre des souches d’E. coli, qui ont été sélectionnées par

l’administration d’ampicilline, et qui présentaient des profils de résistance différents.


66


67

32- Etude de la biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale chez le porc

321- Problématique

Des expositions différentes des bactéries digestives à un antibiotique peuvent être à

l’origine d’impact différent en terme d’émergence de résistance au sein de la flore

commensale (cf. synthèse bibliographique). La voie orale conduit à une exposition digestive

massive et aurait donc l’impact le plus négatif en terme d’émergence de résistance. Nous

avons évalué la biodisponibilité absolue de l’ampicilline chez le porc afin d’estimer les

quantités résiduelles dans le tube digestif après administration orale d’ampicilline. Cette

étude a été conduite car il n’existe pas de données dans la littérature concernant la

biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale chez le porc.

322- Objectif

Evaluer la biodisponibilité absolue de l’ampicilline par voie orale chez le porc.

323- Matériels et méthodes

(a) Plan expérimental

Quatre porcs ont été utilisés (13.3 kg à 17.9 kg). Des cathéters jugulaires ont été mis

en place sous anesthésie générale dans la veine jugulaire droite. L’entretien des cathéters a

été réalisé matin et soir. Le plan expérimental a été un cross-over à deux périodes avec un

temps de washout de 3 jours. Une dose de 20 mg/kg a été administrée par voie

intraveineuse et par voie orale. De l’ampicilline sodium (Ampicilline Cadril® 5G, Laboratoire

Coophavet) a été administrée par voie intraveineuse grâce à un cathéter placé dans la veine

auriculaire. Les prélèvements de sang ont été réalisés via le cathéter jugulaire et transvasés

dans des tubes héparinés à 0, 1, 2, 4, 8, 15, 30, 45 minutes et 1,1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24

heures après l’administration d’ampicilline. Pour les administrations orales, des boulettes ont

été préparées avec de l’aliment, de l’eau, et le prémélange médicamenteux (Ampicilline 80

Porc Franvet®, Laboratoire Franvet). Les porcelets avaient été mis au préalable à jeun et ils

ont rapidement consommé les boulettes proposées. Ils ont eu ensuite accès à leur repas


68

quotidien. Les échantillons de sang ont été prélevés de la même manière à 0, 15, 30, 45

minutes et 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24 heures après l’administration d’ampicilline.

Les échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -80°C.

(b) Dosage plasmatique de l’ampicilline

Les concentrations d’ampicilline dans le plasma ont été déterminées par HPLC

(chromatographie en phase liquide à haute performance) couplée à un détecteur UV

(ultraviolet) après extraction sur phase solide. Cinq cents microlitres de plasma et 50 µL de

standard interne (3-acetamidophenol, 1µg/mL) ont été déposés sur une cartouche SPE

(Bond Elut C8 Varian® 100mg) conditionnée avec 1 mL de méthanol et 1 mL d’eau

ultrapure, et passés lentement sous vide. La cartouche a été lavée avec 500 µL d’eau

ultrapure et les analytes ont été élués avec 1 mL de methanol / acide acétique (95:5, v/v).

L’extrait a été alors évaporé à 40°C sous azote et reconstitué dans 100 µL d’eau ultrapure.

Les tubes ont été vortexés et centrifugés à 20 000 g pendant 10 min. Cinquante microlitres

de surnageant ont été injectés dans le système HPLC. Les analyses ont été effectuées par

un système Agilent comprenant une pompe isocratique 1100, un passeur d’échantillon 1100

et un détecteur UV 1050. Les données ont été acquises et traitées par le logiciel

ChenStation. La phase mobile était constituée d’un mélange de tampon acétate 5 mM pH 4

et d’acétonitrile (8:92, v/v), pompée à 0.7mL/min au travers d’une colonne (Inertsil ODS3®

C18, 3µm, 150 x 4mm) équipée d’une précolonne (Inertsil ODS3 10x4mm) à 40°C. Les pics

étaient visibles par absorbance UV à 230 nm de longueur d’onde.

Les pourcentages d’extraction calculés pour le standard interne étaient compris entre

69 et 92%. Les données (rapport aire de la molécule / aire du standard interne vs

concentration) sont obtenues avec une régression linéaire incluant une composante

quadratique pondérée 1/X². La courbe de calibration a été établie pour des concentrations

allant de 0.125 à 20 µg/mL. La validation de la méthode a été effectuée avec 4 points de

contrôle qualité aux concentrations suivantes : 0.4, 1.25, 7.5 et 15 µg/mL. L’opération a été

répétée 6 fois durant 3 jours. Les précisions intra- et inter-jour étaient inférieures à 12% et

l’exactitude était comprise entre 95 et 104%. La limite de quantification a été établie à 0.125

µg/mL avec une précision de 4% et une exactitude de 96%.

(c) Analyse des résultats

Les concentrations plasmatiques d’ampicilline en fonction du temps ont été analysées

à l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2,

Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Les paramètres pharmacocinétiques ont été


69

calculés grâce aux équations classiques (60). L’aire sous la courbe des concentrations

plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. La

clairance plasmatique (Cl) a été calculée en divisant la dose administrée par l’AUC obtenue

après administration par voie intraveineuse. Le temps de demi-vie (t1/2) a été calculé selon

l’équation suivante : t1/2=ln2/ λz, où λz est la pente de la phase terminale, calculée par

régression linéaire sur le logarithme des concentrations. Le volume de distribution à

l’équilibre (Vss) a été calculé selon l’équation suivante : Vss=(Dose*AUMC)/AUC2, où l’AUMC

est l’aire sous la courbe du premier moment statistique. Pour la voie orale, le pic des

concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir des

données. La biodisponibilité absolue (F) a été calculée en divisant l’AUC individuelle obtenue

après administration par voie orale par l’AUC individuelle obtenue après administration par

voie intraveineuse.

324- Résultats

Les résultats sont présentés dans la figure 2 et le tableau 7. Après administration par

voie intraveineuse, l’ampicilline a été distribuée et éliminée rapidement. Après administration

par voie orale, les concentrations plasmatiques ont atteint un pic de 0.43 µg/mL à 1.63

heures. L’ampicilline a été très peu absorbée car sa biodisponibilité absolue n’était que de

6.16%.

a)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 100 200 300 400

Temps (min)

Co

nc

en

tra

tio

n d

'am

pic

illin

e

(µg

/mL

)

Voie intraveineuse Voie orale porc nourri

b)

0.01

0.1

1

10

100

0 100 200 300 400

Temps (min)

Co

nc

en

tra

tio

n d

'am

pic

illin

e

(µg

/mL

)

Voie intraveineuse Voie orale porc nourri

Figure 2 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (1)

(moyennes ± écart-type) en fonction du temps (min) après administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie orale à la dose de 20 mg/kg, n=4. L’échelle des concentrations

est arithmétique a) et logarithmique b).


70


(moyennes ± écart-type) après administration par voie intraveineuse et par voie orale à la dose de 20 mg/kg, n=4.

Unités Voie

intraveineuse Voie orale porc

nourri AUCa mg.h/L 24.5 ± 2.3 1.46 ± 0.58

Vssb L/kg 0.46 ± 0.07

Clc L/h/kg 0.23 ± 0.02

Cmaxd µg/mL 0.43 ± 0.15

Tmaxe h 1.63 ± 0.43

t1/2f h 0.77

Fg % 6.16 ± 2.83 a AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss : volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d Cmax : concentration plasmatique maximale, e Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, f t1/2 : temps de demi-vie, g F : biodisponibilité absolue

325- Discussion

Après administration par voie intraveineuse, l’ampicilline a été rapidement distribuée

et éliminée. Les paramètres pharmacocinétiques que nous avons obtenus sont comparables

à ceux décrits dans la littérature chez le porc (9, 139). D’autre part, nous avons évalué que la

biodisponibilité absolue de l’ampicilline par voie orale chez le porc nourri était de 6.16%.

L’absorption de l’ampicilline par voie orale est donc très faible chez le porc. Elle est

comparable à celle du cheval à jeun : 2% (49) et à celle du veau respectivement nourri et à

jeun : 4.53% et 12.08% (141).

L’administration par voie intraveineuse devrait conduire à l’exposition la moins

importante du tube digestif à l’ampicilline. Après administration par voie intraveineuse chez

l’homme, l’ampicilline était présente dans la bile à des concentrations équivalentes aux

concentrations plasmatiques (72). L’ampicilline est alors secrétée au niveau du tube digestif,

ce qui explique qu’après un délai de 30 minutes, Galtier et Charpenteau ont mesuré des

concentrations d’ampicilline de l’ordre de 4 µg/g dans les contenus digestifs de porc, après

leur avoir administré 20 mg/kg d’ampicilline par voie intraveineuse (55). En ce qui concerne

la voie orale, compte tenu de la biodisponibilité absolue très faible de l’ampicilline chez le

porc, la majorité de la dose d’ampicilline administrée reste au niveau du compartiment

digestif et pourrait donc exercer une pression de sélection importante sur les bactéries

digestives.


71

L’administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie orale devrait donc

conduire à des concentrations d’ampicilline très différentes au niveau du tube digestif,

l’administration par voie orale entraînant une exposition massive des bactéries du tube

digestif. Par ailleurs, lors d’administration par voie orale, le statut digestif peut modifier

l’exposition des bactéries à l’ampicilline. En effet, le contenu digestif peut être à l’origine de

divers phénomènes de fixation qui rendent l’antibiotique inactif (69). Les concentrations

libres d’antibiotique, mesurables par dosage microbiologique, peuvent dans ce cas être

diminuées et l’exposition des bactéries digestives à l’antibiotique moins importante. Le

contenu alimentaire peut aussi être à l’origine d’une diminution de l’absorption des bêta-

lactamines. L’absorption de l’amoxicilline est diminuée chez le porc lorsqu’elle est

administrée par voie orale en même temps que l’aliment (5, 36). Dans le cas d’une

diminution de la biodisponibilité de l’ampicilline liée à la prise de nourriture, l’exposition du

tube digestif à l’antibiotique serait augmentée en terme de concentrations totales, alors que

dans le même temps la présence de fibres dans la lumière intestinale pourrait provoquer une

diminution des concentrations libres biologiquement actives.

En conclusion, les données expérimentales obtenues dans cette étude associées aux

données de la littérature concernant l’effet de l’alimentation sur la biodisponibilité des bêta-

lactamines suggèrent que la voie d’administration et le statut digestif conduisent à des

expositions différentes du tractus intestinal.


72


73

33- Impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur le niveau de résistance des entérobactéries digestives du porc

331- Problématique

Au regard des résultats de l’étude précédente et des données de la littérature

concernant l’impact du statut digestif sur la biodisponibilité des bêta-lactamines, nous avons

fait l’hypothèse que les trois modalités d’administration de l’ampicilline suivantes : la voie

intramusculaire, la voie orale chez le porc à jeun et la voie orale chez le porc nourri

pouvaient conduire à des expositions différentes du tube digestif. Nous avons voulu évaluer

si ces modalités d’administration entraînaient un développement de résistance différent au

niveau de la flore digestive.

Nous avons vu dans la synthèse bibliographique, qu’il était difficile d’obtenir une

mesure exacte du niveau de résistance de la flore commensale. C’est pourquoi nous avons

utilisé trois méthodes pour évaluer ce niveau de résistance: deux indicateurs phénotypiques

et un indicateur génotypique. Dans l’optique de quantifier le réservoir de gènes de résistance

à l’ampicilline dans le tube digestif, et d’estimer les quantités de gènes excrétés par le porc

au cours du traitement, nous avons en effet développé un nouvel outil: la quantification des

gènes blaTEM par PCR en temps réel.

332- Objectif

L’objectif de cette étude était triple :

1- Développer et valider une méthode de PCR en temps réel afin de quantifier les

gènes blaTEM dans les fèces, et comparer cet indicateur génotypique à des indicateurs

phénotypiques.

2- Evaluer l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline (voie

intramusculaire, voie orale chez le porc à jeun, voie orale chez le porc nourri) grâce à ces

trois indicateurs.

3- Déterminer les profils pharmacocinétiques de ces trois modalités d’administration.


74

333- Etude de l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur l’excrétion d’entérobactéries résistantes et de gènes blaTEM dans les fèces de porc

La majorité des résultats de cette étude sont présentés dans l’article 1.

(a) Matériels et méthodes

Dix-huit porcs, âgés de 7 semaines à leur arrivée, ont été utilisés. L’ampicilline a été

administrée pendant 7 jours à la dose de 20 mg/kg/jour* selon trois modalités (trois groupes

de quatre porcs) : voie orale au cours du repas, voie orale à jeun et voie intramusculaire. Le

quatrième groupe (6 porcs) a servi de groupe témoin. Le niveau de résistance à l’ampicilline

a été mesuré grâce à trois méthodes:

- deux méthodes phénotypiques :

- le pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline après dénombrement

sur milieu Mac Conkey en absence et en présence d’ampicilline,

- l’évaluation de la CMI de l’ampicilline sur 20 souches d’E. coli isolées.

- une méthode génotypique : la quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc par

PCR en temps réel utilisant le SYBR green.

Les prélèvements de fèces ont été réalisés avant traitement et un, quatre et sept jours après

le début du traitement pour les mesures phénotypiques, et tous les jours pour les mesures

génotypiques. Un modèle linéaire généralisé à effets mixtes a été utilisé pour l’analyse

statistique.

Le plan expérimental, la méthodologie et les analyses statistiques sont détaillés de façon

exhaustive dans l’article 1.

* Nous avons administré 20 mg/kg/jour par voie orale et par voie intramusculaire. C’est la

posologie recommandée dans le Dictionnaire des Médicaments Vétérinaires pour la voie

orale. Concernant la voie intramusculaire, la posologie recommandée est de 7 mg à 14

mg/kg/12 heures.


75

(b) Résultats présentés dans l’article 1

Indicateurs phénotypiques du niveau de résistance : figure 3 Pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline :

Avant traitement, le pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline était

compris entre 2.5% et 12% pour les quatre groupes de porcs. Aux quatrième et septième

jours de traitement, ces pourcentages étaient supérieurs à 50% pour les 3 groupes traités et

toujours inférieurs à 15% dans le groupe témoin. L’analyse statistique a indiqué une

augmentation significative (p<0.05) du pourcentage d’entérobactéries résistantes à

l’ampicilline dans les trois groupes traités par rapport au groupe témoin, mais pas de

différence significative entre les trois modalités d’administration.

Pourcentage de souches d’ E. coli résistantes :

La détermination de la fréquence des souches d’E. coli ayant une CMI

d’ampicilline≥32 µg/mL (valeur critique proposée par le CLSI) a montré qu’avant traitement,

selon les groupes de porc, 1% à 38% des souches d’E. coli étaient résistantes à l’ampicilline.

Au quatrième et septième jour de traitement, la majorité des souches d’E. coli était résistante

chez les porcs traités alors que seulement 36% étaient résistantes chez les porcs témoins.

L’analyse statistique a pu mettre en évidence une différence significative (p<0.05) dans

l’excrétion de souches d’E. coli résistantes entre la voie orale chez les porcs nourris et les

porcs témoins. Les deux autres modalités d’administration n’ont pas montré de différence

par rapport au groupe témoin probablement à cause d’une grande variabilité à l’intérieur du

groupe témoin et de la faible puissance statistique de l’essai.


76

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (jours)

% e

nté

rob

ac

téri

es

ré

sis

tan

tes

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (jours)

% E

. co

li ré

sist

ants

Figure 3 : Pourcentages d’entérobactéries et de souches d’E. coli résistantes

(moyennes ± écart-type) après administration d’ampicilline à la dose de 20 mg/kg par la voie intramusculaire (▲) (n=4), par la voie orale chez le porc à jeun (■) (n=4), et par la voie orale

chez le porc nourri (□) (n=4). Six porcs ont été utilisés comme témoins (●).

Quantification des gènes blaTEM :

La spécificité de l’amplification par PCR en temps réel des gènes blaTEM, la qualité de

la courbe standard, la qualité de l’extraction et l’absence d’inhibiteurs ont été contrôlées. La

technique de PCR quantitative a été validée pour des quantités de gènes blaTEM comprises

entre 104 et 109 copies/g de fèces (cf. résultats de validation présentés dans l’article 1).

Avant traitement, les quantités de gènes blaTEM étaient au dessous de 107 copies/g de

fèces (figure 4). Au cours du traitement, ces quantités ont fluctué entre 104-106 copies/g pour

le groupe témoin, 107-109 copies/g pour les deux voies orales et 106-108 copies/g pour la

voie intramusculaire (cf. résultats individuels présentés dans l’article 1). Les quantités de

gènes blaTEM excrétées ont été significativement plus importantes pour les animaux traités

que pour le groupe témoin (p<0.001), et plus élevées pour la voie orale au cours du repas

que pour la voie intramusculaire (p<0.05).


77

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (jours)

cop

ies

de

gèn

es b

laT

EM/

g d

e fè

ces

1 E+4

1 E+5

1 E+6

1 E+7

1 E+8

1 E+9

1 E+10

Figure 4 : Nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces

(moyennes ± écart-type) après administration d’ampicilline à la dose de 20 mg/kg par la voie intramusculaire (▲) (n=4), par la voie orale chez le porc à jeun (■) (n=4), et par la voie orale

chez le porc nourri (□) (n=4). Six porcs ont été utilisés comme témoins (●).

Enfin, la comparaison entre les quantités de gènes blaTEM et les dénombrements des

entérobactéries résistantes respectifs a montré une corrélation significative (r2=0.67) (figure

5).

R2 = 0.67

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

3 5 7 9 11 Log (bla TEM/g de fèces)L

og

(e

nté

rob

ac

téri

es

ré

sis

tan

tes

à

l'am

pic

illi

ne

/g d

e f

èc

es

)

Figure 5 : Comparaison entre le log du nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces et le log des dénombrements d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline/g de fèces


78

(c) Résultats complémentaires à ceux présentés dans l’article 1

La distribution des CMI aux jours 0, 1, 4 et 7 pour les porcs témoins et traités est

donnée dans la figure 6. Avant traitement, environ 20% de l’ensemble des souches d’E. coli

étaient résistantes à l’ampicilline (c'est-à-dire ayant une CMI ≥ 32 µg/mL). Après 7 jours de

traitement, pour les porcs traités la majorité des souches étaient résistantes avec des CMI

supérieures à 256 µg/mL.

Jour 0

0

20

40

60

80

100

0.5 1 2 4 8 16 32 64 12

825

6>25

6

CMI (µg/mL)

% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Jour 1

0

20

40

60

80

100

0.5 1 2 4 8 16 32 64 12

825

6>25

6

CMI (µg/mL)

% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Jour 4

0

20

40

60

80

100

0.5 1 2 4 8 16 32 64 12

825

6>25

6

CMI (µg/mL)

% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Jour 7

0

20

40

60

80

100

0.5 1 2 4 8 16 32 64 12

825

6>25

6

CMI (µg/mL)

% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Figure 6 : Distribution des CMI des souches d’E. coli aux jours 0, 1, 4 et 7

pour les porcs témoins ( ) et pour les porcs ayant reçu l’ampicilline par voie intramusculaire ( ), par voie orale à jeun ( ), et par voie orale en même temps que l’aliment ( ), n=320

souches à chaque jour.


79

334- Etude pharmacocinétique des trois modalités d’administration de l’ampicilline

Dans le but d’évaluer de manière indirecte l’exposition du tube digestif à l’ampicilline

pour les trois modalités d’administration, une étude pharmacocinétique a été réalisée sur les

porcs après les 7 jours de traitement pendant lesquels l’effet sur la flore de l’antibiothérapie a

été évalué.

(a) Matériels et méthodes

Les prélèvements de sang ont été réalisés par ponction directe au niveau du sinus

veineux jugulaire droit en utilisant des tubes héparinés. Les prélèvements de sang ont été

réalisés avant et 15, 30 minutes et 1, 1.5, 2, 3, 4 et 6 heurs après l’administration par voie

orale et 10, 15, 30 minutes et 1, 2, 3, 4 et 6 heures après l’administration par voie

intramusculaire. Les échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma

stocké à -80°C.

Le dosage plasmatique de l’ampicilline a été réalisé selon la méthode décrite la

section 31.





plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. Le

pic des concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir

des données. La biodisponibilité relative (Frelative) a été calculée en divisant l’AUC moyenne

obtenue après administration d’ampicilline par voie orale par l’AUC moyenne obtenue après

administration par voie intramusculaire. Pour comparer les AUC un test de Tukey a été

utilisé après une transformation logarithmique des données.

(b) Résultats

Les résultats sont présentés dans la figure 7 et le tableau 8. Suite à l’administration

par voie intramusculaire, un pic des concentrations plasmatiques de 24.7 µg/mL a été atteint

à 0.44 heures, puis les concentrations ont décliné rapidement. Pour les voies orales, le pic

des concentrations plasmatiques était moins élevé et retardé chez les porcs nourris par

rapport aux porcs à jeun : 0.49 µg/mL à 2.13 heures pour les porcs nourris contre 3.26

µg/mL à 0.75 heures pour les porcs à jeun. Les biodisponibilités relatives des voies orales


80

étaient basses et significativement différentes: 20.3% chez le porc à jeun et 7.5% chez le

porc nourri.

a)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 100 200 300 400

Temps (min)

Co

nce

ntr

atio

n

d'a

mp

icil

lin

e (µ

g/m

L)

Voie orale porc nourriVoie orale porc à jeunVoie intramusculaire

b)

0.0

0.1

1.0

10.0

100.0

0 100 200 300 400

Temps (min)

Co

nce

ntr

atio

n

d'a

mp

icil

lin

e (µ

g/m

L)

Voie orale porc nourriVoie orale porc à jeunVoie intramusculaire


(moyennes ± écart-type) en fonction du temps (min) après administration d’ampicilline par voie intramusculaire, par voie orale chez le porc nourri et le porc à jeun à la dose de 20

mg/kg, n=4. L’échelle des concentrations est arithmétique a) et logarithmique b).


(moyennes ± écart-type) après administration par voie intramusculaire et par voie orale chez le porc nourri et le porc à jeun à la dose de 20 mg/kg, n=4.

Cmax

a Tmaxb AUCc Frelative

d

Voie d’administration µg/mL h mg.h/L %

Intramusculaire 24.7 ± 8.3 0.44 ± 0.13 30.7* ± 9.2 100

Orale porc à jeun 3.26 ± 1.9 0.75 ± 0.3 6.22* ± 2.74 20.3*

Orale porc nourri 0.49 ± 0.2 2.13 ± 0.6 2.29* ± 0.9 7.5*

* Les valeurs sont significativement différentes entre les groupes (p<0.05). a Cmax : concentration plasmatique maximale, b Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, c AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, d Frelative : biodisponibilité relative


81

335- Discussion générale

L’objectif de ce travail était d’évaluer l’impact de trois modalités d’administration de

l’ampicilline sur le niveau de résistance de la flore digestive au moyen de trois indicateurs :

deux indicateurs phénotypiques et un indicateur génotypique que nous avons validé : la

quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc. Les trois modalités d’administration

testées étaient : la voie intramusculaire, la voie orale chez le porc à jeun et la voie orale chez

le porc nourri.

Les indicateurs phénotypiques ont révélé une augmentation massive

d’entérobactéries et de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline au cours du traitement,

avec des CMI supérieures à 256 µg/mL. Des modifications marquées de l’écosystème

digestif et notamment la sélection d’entérobactéries résistantes, ont été décrites lors

d’administration de bêta-lactamines dans plusieurs espèces (50, 93, 125). L’analyse

statistique a mis en évidence que les porcs traités excrétaient plus d’entérobactéries

résistantes que les porcs témoins. Concernant le deuxième indicateur phénotypique:

l’excrétion de souches d’E. coli résistantes, une différence significative a seulement pu être

mise en évidence entre les porcs qui avaient reçu l’ampicilline par voie orale au cours du

repas et les porcs témoins. L’absence de différence significative entre les deux autres

modalités d’administration et les porcs témoins pour cet indicateur a probablement pour

origine une grande variabilité dans le groupe témoin. Dans nos conditions expérimentales, la

détermination de la fréquence des entérobactéries résistantes s’est révélée plus pertinente

que l’évaluation du pourcentage de souches d’E. coli résistantes.

La fréquence d’entérobactéries résistantes a été déterminée sur l’ensemble de la

population des entérobactéries alors que le pourcentage de souches d’E. coli résistantes a

été calculé à partir de 20 souches isolées. Dans la plupart des programmes de surveillance,

la recherche de la résistance aux antibiotiques est effectuée sur une seule souche d’E. coli

par prélèvement. Récemment une étude a comparé les résultats obtenus avec cette

méthodologie aux résultats obtenus en déterminant la fréquence d’entérobactéries

résistantes par prélèvement. Les auteurs ont conclu que l’estimation de la fréquence

d’entérobactéries résistantes pouvait permettre d’obtenir des données quantitatives utiles

dans l’analyse de l’association entre la consommation d’antibiotiques et le développement de

résistance (134). Cette conclusion est à rapprocher de nos résultats qui ont montré que la

détermination de la fréquence des entérobactéries résistantes nous a permis de quantifier de


82

manière pertinente le niveau de résistance de la flore digestive des porcs lors

d’administration d’ampicilline.

Par ailleurs, dans l’optique de quantifier la résistance à l’ampicilline au niveau de la

biomasse bactérienne totale, nous avons développé un outil de quantification des gènes

blaTEM dans les fèces par PCR en temps réel. En effet, nous avons vu dans la synthèse

bibliographique que les gènes blaTEM codent pour les bêta-lactamases de type TEM qui sont

majoritairement responsables de la résistance à l’ampicilline chez les entérobactéries. Nous

avons quantifié ces gènes par PCR en temps réel car cette technique présente de nombreux

avantages : elle est sensible, elle permet de quantifier grâce à une courbe de calibration des

gènes provenant de matrices variées, et elle permet une quantification au niveau de la

biomasse bactérienne totale sans mise en culture des bactéries. Cette technique a été

utilisée pour ces avantages afin de quantifier des gènes de résistance provenant de matrices

variées et complexes (30, 85, 86).

La quantification des gènes blaTEM a permis, dans nos conditions expérimentales, de

détecter des différences parmi trois modalités d’administration de l’ampicilline, alors que

l’analyse phénotypique ne permettait pas de les distinguer. Afin de comparer cet indicateur

génotypique aux indicateurs phénotypiques, nous avons comparé les dénombrements des

entérobactéries résistantes à l’ampicilline par gramme de fèces et les quantités de gènes

blaTEM par gramme de fèces. Il existe une corrélation significative entre les résultats obtenus

avec ces deux techniques. Les divergences étant en partie dues probablement à

l’imprécision des deux techniques, au fait que les gènes blaTEM peuvent être présents dans

des bactéries autres que les entérobactéries, et qu’il existe d’autres mécanismes de

résistance à l’ampicilline chez les entérobactéries (cf. synthèse bibliographique).

Concernant l’impact des modalités de traitement, il est apparu que l’administration

d’ampicilline par voie orale chez des porcs nourris conduisait à l’excrétion la plus importante

de gènes blaTEM. Par ailleurs, les résultats pharmacocinétiques ont montré que parmi les

deux voies orales, la modalité d’administration avec l’aliment avait la plus faible

biodisponibilité. En effet, la prise de nourriture concomitante à la prise de bêta-lactamine par

voie orale diminue l’absorption de l’antibiotique chez le porc (70), le chien (77) et l’homme

(136). On peut supposer que parmi les trois modalités d’administration testées, la voie orale

chez le porc nourri est celle qui a conduit à l’exposition la plus importante des bactéries du

tube digestif. Cependant, la voie intramusculaire a conduit à une exposition suffisamment

importante au niveau du tube digestif pour sélectionner les entérobactéries résistantes et

éliminer les sensibles.


83

En conclusion, l’ensemble des résultats indique que notre technique de quantification

des gènes blaTEM par PCR en temps réel apparaît comme étant un outil prometteur pour

l’évaluation de l’impact des traitements antibiotiques chez l’animal. De plus, cet outil peut

aussi être utilisé pour quantifier les gènes de résistance dans des environnements divers et

pourrait permettre d’appréhender les flux de gènes de résistance entre les réservoirs

animaux et humains.

Grâce à cet indicateur génotypique et aux indicateurs phénotypiques, nous avons mis

en évidence que des différences d’exposition peuvent conditionner des niveaux de

résistance différents au niveau de la flore digestive. Cependant, les trois modalités

d’administration testées ont toutes été à l’origine d’un impact négatif sur l’écosystème

digestif, et de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être envisagées afin de prévenir

l’émergence de résistance lors d’administration d’ampicilline.

Etude expérimentale - article 1

84


85

Article 1

Impact of three ampicillin dosage regimens on selection of ampicillin

resistance in Enterobacteriaceae and excretion of blaTEM genes in swine

feces

D. Bibbal, V. Dupouy, J.P. Ferré, P.L. Toutain, O. Fayet, M.F. Prère, and A.

Bousquet-Mélou

Applied and Environmental Microbiology, Aug 2007; 73(15) : 4785-90


86


87


88


89


90


91


92


93

34- Etude de la parenté par électrophorèse en champ pulsé des souches d’E. coli isolées de fèces de porc durant l’administration d’ampicilline

La majorité des résultats de cette étude sont présentés dans l’article 2.

341- Problématique

Au cours de l’étude précédente, nous avons vu que l’administration d’ampicilline

conduisait à l’émergence massive de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline. Nous

avons aussi mis en évidence que la résistance à l’ampicilline des entérobactéries d’origine

digestive était significativement corrélée à la présence des gènes blaTEM.

Les mécanismes populationnels qui concourent à l’émergence de résistance au cours

d’une antibiothérapie ont été peu étudiés. Nous avons donc voulu explorer la dynamique de

l’émergence de résistance au sein de la population digestive des souches d’E. coli au cours

de ce traitement à l’ampicilline. Deux mécanismes peuvent contribuer à l’émergence de

résistance au sein de la population digestive des E. coli lors d’une pression de sélection

exercée par l’ampicilline :

- des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline préexistantes dans le tube digestif

peuvent être sélectionnées,

- les gènes blaTEM, qui sont situés sur des éléments génétiques mobiles (84, 104),

peuvent être transmis par transfert horizontal à des souches d’E. coli, qui étaient au

préalable sensibles à l’ampicilline.

342- Objectif

L’objectif de cette étude a été de déterminer si l’ampicilline avait sélectionné des

souches d'E. coli résistantes préexistantes dans le tube digestif ou si des souches

préalablement sensibles avaient acquis un mécanisme de résistance à l’ampicilline.


Nous avons réalisé cette étude à partir des prélèvements issus de la phase

expérimentale décrite dans l’article 1. Les prélèvements de fèces provenaient des 12 porcs


94

qui ont été traités à l’ampicilline pendant 7 jours et de 4 porcs témoins. Les homogénats de

fèces qui ont été recueillies avant traitement et un, quatre et sept jours après le début du

traitement ont été ensemencés sur gélose Mac Conkey. De plus, afin de sélectionner des

bactéries résistantes avant le traitement, les homogénats de fèces recueillies avant

traitement ont été ensemencés sur gélose Mac Conkey contenant de l’ampicilline (Jour 0

AmpR). Pour chaque porc, à chaque temps de prélèvement, 5 colonies ont été prélevées et

confirmées comme étant des souches d’E. coli à l’aide de galerie API 20E. Pour chaque

souche, le profil de résistance à 13 antibiotiques a été déterminé par antibiogramme. Les 13

disques utilisés dans cette étude ont été les suivants : ampicilline, amoxicilline+acide

clavulanique, céfalotine, ceftiofur, gentamicine, kanamycine, néomycine, acide nalidixique,

ciprofloxacine, tétracycline, chloramphénicol, triméthoprime, sulfonamides. Le groupe

phylogénétique de chaque souche a été défini ainsi que son pulsotype par électrophorèse en

champ pulsé après digestion de son ADN par l’enzyme Xba1. Les déterminants génétiques

de la résistance et les gènes codant pour les intégrases 1 et 2 ont été recherchés par PCR

chez des souches appartenant aux phénotypes de résistance majoritaires.

La méthodologie est détaillée de façon exhaustive dans l’article 2.

344- Résultats présentés dans l’article 2

(a) Résistances associées à l’ampicilline

Le tableau 9 présente les pourcentages de souches d’E. coli résistantes à

l’ampicilline, à la céfalotine, au chloramphénicol, à la tétracycline, au triméthoprime, à la

streptomycine et aux sulfonamides. Aucune souche d’E. coli n’a présenté de résistance vis-

à-vis du ceftiofur. Trois souches étaient résistantes à l’association amoxicilline + acide

clavulanique et deux souches étaient résistantes à la gentamicine, à la kanamycine, à la

néomycine, à la ciprofloxacine et à l’acide nalidixique. Avant traitement, seulement 23% des

souches d’E. coli étaient sensibles à tous les antibiotiques testés. La plupart des souches

étaient résistantes à la tétracycline (69%). Avant traitement, seulement 6% des souches

étaient résistantes à l’ampicilline. Aux quatrième et septième jours de traitement, ce

pourcentage était au dessus de 90%, et le pourcentage de résistance au chloramphénicol, à

la tétracycline, au triméthoprime, à la streptomycine et aux sulfonamides avait aussi

augmenté.


95

Tableau 9 : Pourcentage de souches d’E. coli résistantes

chez les porcs témoins et les porcs traités à l’ampicilline avant le traitement, et quatre et sept jours après le début du traitement.

Jour 0 Jour 4 Jour 7

Traités Témoins Traités Témoins Antibiotique

(n=78) (n=60) (n=20) (n=57) (n=20)

Ampicilline 6 93 25 96 25 Céfalotine 0 3 5 7 0

Chloramphénicol 3 32 0 56 0

Tétracycline 69 90 85 89 65

Triméthoprime 45 58 0 68 5

Streptomycine 20 82 25 86 20

Sulfonamides 46 63 0 77 10

Sensible 23 0 0 4 0

En effet, les souches résistantes à l’ampicilline qui sont apparues au cours du

traitement sont majoritairement multirésistantes, c'est-à-dire qu’elles sont résistantes à au

moins quatre antibiotiques (tableau 10). De plus, tous les profils de résistance sélectionnés

par l’administration d’ampicilline étaient déjà présents avant traitement parmi les souches

d’E. coli prélevées sur gélose supplémentée en ampicilline (Jour 0 AmpR). Le phénotype

résistant à l’ampicilline majoritaire était résistant à cinq antibiotiques additionnels :

chloramphénicol, sulfonamides, tétracycline, triméthoprime et streptomycine. Ce phénotype

représentait 53% des souches après sept jours de traitement. Par ailleurs, il était majoritaire

au sein des souches résistantes à l’ampicilline avant traitement car il représentait 48% des

souches sélectionnées sur gélose supplémentée avec de l’ampicilline avant le début du

traitement (Jour 0 AmpR).


96

Tableau 10 : Pourcentages des phénotypes résistants à l’ampicilline

parmi les souches d’E. coli prélevées sur les porcs traités aux jours 0, 4 et 7, et parmi les souches sélectionnées sur gélose supplémentée en ampicilline avant traitement (Jour 0

AmpR) a.

Jour 0 Jour 4 Jour 7 Jour 0 AmpR Profil de résistance b

(n=78) (n=60) (n=57) (n=73)

Amp Te 7 5 2

Amp Te Str 8 9 11

Amp Sul Te Str 15 9 2

Amp Chl Sul Trim Str 5 2 5 20

Amp Sul Te Trim Str 18 4 4

Amp Chl Sul Te Trim Str 5 32 53 48

a seuls les six phénotypes majoritaires sont présentés; b Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine

(b) Composition génétique des populations d’E. coli

La détermination de la fréquence des groupes phylogénétiques a mis en évidence un

changement dans la composition des populations d’E. coli : avant traitement 75% des

souches appartenaient au groupe B1, alors qu’après sept jours de traitement, 85% des

souches appartenaient au groupe A (figure 8).

0

20

40

60

80

100

Tra

ités

Con

trôl

es

Tra

ités

Con

trôl

es

Jour 0 Jour 4 Jour 7 Jour 0AmpR

A B1 B2 D

Figure 8 : Pourcentage des groupes phylogénétiques

A, B1, B2 et D des souches d’E. coli isolées chez les porcs traités à l’ampicilline et chez les porcs témoins, et des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline avant le début du

traitement (Jour 0 AmpR).


97

(c) Parenté des souches sélectionnées par le traitement

Caractéristiques et distribution des pulsotypes :

L’électrophorèse en champ pulsé des 308 souches d’E. coli a permis de définir 18

groupes contenant chacun plus de deux souches non différentiables. Ces groupes ont été

identifiés par une lettre. Le dendrogramme ainsi que les profil des pulsotypes pour une

souche de chaque groupe sont présentés dans la figure 9. Dix groupes de deux souches non

différentiables et 18 pulsotypes uniques ont aussi été identifiés. Par la suite, les pulsotypes

associés avec deux souches ont été regroupés sous le terme ‘Pr’ et les pulsotypes uniques

sous le terme ‘Uq’.

A

B

J

K

E

M

D

F

N

G

O

L

I

C

H

P

Q

100%

70%

40%

10%

A

B

J

K

E

M

D

F

N

G

O

L

I

C

H

P

Q

100%

70%

40%

10%

A

B

J

K

E

M

D

F

N

G

O

L

I

C

H

P

Q

100%

70%

40%

10%

Figure 9 : Dendrogramme et profil des pulsotypes

pour une souche d’E. coli représentative de chaque groupe de pulsotype.

Lors de l’étude de la distribution des pulsotypes dans les trois séries temporelles de

porcs utilisées au cours de l’étude, nous avons remarqué que les animaux avaient en

commun de nombreux pulsotypes même s’ils provenaient de générations différentes (voir

discussion).

La distribution des pulsotypes avant traitement et au cours du traitement est

présentée dans la figure 10. Avant administration d’ampicilline, trois groupes de pulsotypes


98

étaient associés avec le phénotype de résistance à l’ampicilline parmi les souches d’E. coli

prélevées sur les géloses ne contenant pas d’ampicilline : A, K et E (figure 10, Jour 0). Les

pulsotypes A et K sont apparus majoritaires parmi les souches résistantes à l’ampicilline

sélectionnées avant traitement sur gélose supplémentée en ampicilline (figure 10, Jour 0

AmpR). Aux quatrième et septième jours de traitement l’administration d’ampicilline a

sélectionné des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline associées à des pulsotypes qui

étaient déjà présents dans le tube digestif avant traitement (figure 10, Jour 4 et Jour 7). Au

septième jour de traitement, 53% des souches étaient associées avec le pulsotype A.

Jour 4

0

10

20

30

40

50

60

A K M B Pr G Uq F L E J D I N P Q O R C HPulsotypes

% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Jour 0 AmpR

0

10

20

30

40

50

60


% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Jour 7

0

10

20

30

40

50

60


% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Jour 0

0

10

20

30

40

50

60


% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Figure 10 : Distribution des pulsotypes (1)

pour les souches d’E. coli prélevées avant traitement sur gélose ne contenant pas d’ampicilline (Jour 0) et sur gélose supplémentée en ampicilline (Jour 0 AmpR), et aux quatrième et septième jours d’administration d’ampicilline (Jour 4 et Jour 7). Les lettres

identifient les groupes de pulsotypes, le terme ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement deux souches et le terme ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques. Les souches

sensibles à l’ampicilline sont indiquées en blanc et les résistantes en noir.

Comparaison des pulsotypes et des phénotypes résistants à l’ampicilline :

Le tableau 11 établit la comparaison entre les profils de résistance et les pulsotypes

qui leur ont été associés avant et au cours du traitement. Le tableau 12 présente les

pourcentages de pulsotypes associés à chaque phénotype de résistance. Un pulsotype

pouvait être associé avec des phénotypes de résistance variés, et inversement un même

phénotype pouvait être associé avec des pulsotypes différents. Néanmoins, le tableau 12

met en évidence qu’un phénotype de résistance a été majoritairement associé à un

pulsotype et le tableau 11 montre que cette association a été stable au cours du temps. Le


99

phénotype résistant à six antibiotiques a été associé avec 7 pulsotypes mais 76% des

souches qui présentaient ce phénotype appartenaient au pulsotype A. Enfin, aucun des

pulsotypes associé avec un statut sensible à l’ampicilline avant traitement n’a été retrouvé

associé à la résistance à l’ampicilline au cours du traitement (figure 10).

Tableau 11 : Principaux phénotypes résistants à l’ampicilline et pulsotypes associés

pour les souches d’E. coli prélevées avant traitement sur gélose ne contenant pas d’ampicilline (Jour 0) et sur gélose supplémentée en ampicilline (Jour 0 AmpR), et aux

quatrième et septième jours d’administration d’ampicilline (Jour 4 et Jour 7).

Pulsotypes associésb

Jour 0 Jour 4 Jour 7 Jour 0 AmpR Profil de résistancea

(n=78) (n=60) (n=57) (n=73)

Amp Te L, Uq L, A L, F

Amp Te Str F, Pr F, Pr F

Amp Sul Te Str B B B, Pr

Amp Chl Sul Trim Str K, Pr K K, A K, A, Uq, Pr

Amp Sul Te Trim Str E, B, A, K E H, E, A, Uq

Amp Chl Sul Te Trim Str A, K A, Uq A, J, K A, J, K, H, O

a Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine; b les lettres identifient des groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement 2 souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques

Tableau 12 : Pourcentage de pulsotypes associés à chaque profil de résistance

les résultats obtenus à Jour 0, Jour 0 AmpR, Jour 4 et Jour 7 ont été regroupés par profil de résistance.

Profil de résistancea Nbb Pulsotypes associés (pourcentage)c

Amp Te 9 L (67), A (11), F (11), Uq (11)

Amp Te Str 16 F (88), Pr (12)

Amp Sul Te Str 20 B (90), Pr (10)

Amp Chl Sul Trim Str 18 K (70), A (12), Pr (12), Uq (6)

Amp Sul Te Trim Str 18 E (56), A (12), B (10), H (10), K (6), Uq (6)

Amp Chl Sul Te Trim Str 83 A (76), J (11), K (9), Uq (2), H (1), O (1) a Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine ; b Nombre de souches de E. coli par phénotype de résistance, c les lettres identifient les groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement 2 souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques


100

(d) Recherche des déterminants génétiques de la résistance

Les déterminants génétiques de la résistance et les gènes codant pour les intégrases

1 et 2 ont été recherchés dans les souches qui présentaient le phénotype de résistance à six

antibiotiques. Les résultats sont présentés dans le tableau 13. Le gène blaTEM a été détecté

dans 98 % des souches testées. Les souches associées au pulsotype A hébergeaient une

combinaison spécifique de gènes: blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB et intI1. Cinq autres

combinaisons ont été détectées pour le même phénotype de résistance.

Tableau 13 : Distribution des gènes de résistance

détectés dans les souches associées avec le profil de résistance Amp Chl Sul Te Trim Stra

blaTEM, sulI, sulII, tet(A), strA-strB, aadA1, intI11DH

blaTEM, tet(A)1AUqb

blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(A), strA-strB, aadA1, intI11B1Uqa

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI11B1O

tet(A), strA-strB, aadA1, intI21AK

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI16B1K

blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB, intI11AJ

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI11AJ

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI17B1J

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI11B1A

blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB, intI129AA

Gènes de résistance détectésNbdGroupephylo.c

Pulsotypeb

blaTEM, sulI, sulII, tet(A), strA-strB, aadA1, intI11DH

blaTEM, tet(A)1AUqb

blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(A), strA-strB, aadA1, intI11B1Uqa

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI11B1O

tet(A), strA-strB, aadA1, intI21AK

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI16B1K

blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB, intI11AJ

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI11AJ

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI17B1J

blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI11B1A

blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB, intI129AA

Gènes de résistance détectésNbdGroupephylo.c

Pulsotypeb

a Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine; b les groupes sont identifiés par leur lettre, le pulsotype unique x par ‘Uqx’; c groupe phylogénétique; d pour chaque génotype pulsotype/groupe phylogénétique, les gènes de résistance ont été recherchés sur toutes les souches appartenant à ce génotype, sauf pour le génotype pulsotype A/groupe phylogénétique A où les gènes de résistance ont été recherchés sur 50% des souches.

345- Résultats complémentaires : profils de résistance et pulsotypes des souches provenant des animaux témoins

Le tableau 14 présente les principaux profils de résistance et les pulsotypes associés,

et la figure 11 présente la distribution des pulsotypes pour les souches d’E. coli prélevées

chez les porcs témoins. Au jour 0, 24% des souches étaient sensibles à tous les

antibiotiques testés (tableau 9) et étaient associées avec des pulsotypes variés. Deux profils

de résistance étaient majoritaires. Le premier était résistant à la tétracycline, et était associé

en majorité au pulsotype M. La recherche des déterminants génétiques de la résistance a


101

révélé que les souches appartenant au pulsotype M portaient le gène tet(A), alors que celles

qui appartenaient au pulsotype minoritaire portaient le gène tet(B). Le deuxième profil était

résistant aux sulfonamides, à la tétracycline et au triméthoprime, trois pulsotypes étant

associés avec ce profil de résistance. Les même gènes de résistance : sulI, tet(A) et le gène

codant pour l’intégrase 1 : intI1 ont été détectés chez les souches appartenant aux différents

pulsotypes. Le pulsotype M est resté majoritaire aux jours 4 (10/20) et 7 (8/20), et des

souches résistantes à l’ampicilline et à la tétracycline, associées au pulsotype M, sont

apparues.

Tableau 14 : Principaux profils de résistance et pulsotypes associés

pour les souches d’E. coli prélevées chez les porcs témoins aux jours 0, 4 et 7.

Jour 0 (n=78)

Jour 4 (n =20)

Jour 7 (n =20)

Profil de résistance a Nbb Pulsotypesc Nbb Pulsotypesc Nbb Pulsotypesc

Sensible 19 Uq, N, Q, Pr, D

1 D

Te 17 M, Pr 10 M 8 M

Str 3 Q, N 3 P, Uq 4 P, Pr

Te Str 6 2

Sul Te Trim 23 G, I, K 1 G

Sul Trim Str 1

Amp Te 3 L 5 L

Amp Chl Sul Trim Str 3 K, Pr

Amp Chl Sul Te Trim Str 3 A, K

a Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine ; b Nombre de souches par profils de résistance ; c les lettres identifient les groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement 2 souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques


102

Jour 4

0

10

20

30

40

50

60

A K M B Pr G Uq F L E J D I N P Q O R C H

Pulsotypes

% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Jour 7

0

10

20

30

40

50

60


Pulsotypes

% d

e so

uch

es d

e E

. co

li

Jour 0

0

10

20

30

40

50

60


Pulsotypes%

de

sou

ches

de

E.

coli

Figure 11 : Distribution des pulsotypes (2)

pour les souches d’E. coli prélevées chez les porcs témoins aux jours 0, 4 et 7. Les lettres identifient les groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement deux souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques. Les souches sensibles à l’ampicilline

sont indiquées en blanc et les résistantes en noir.

346- Discussion générale

L’objectif de ce travail était d’étudier la dynamique de la résistance à l’ampicilline

dans la population digestive des E. coli lors d’administration d’ampicilline chez le porc. Les

souches d’E. coli ont été caractérisées par leur profil de résistance, leur groupe

phylogénétique et leur pulsotype obtenu après électrophorèse en champ pulsé.

L’étude des souches d’E. coli prélevées sur les porcs témoins a révélé que peu de

souches étaient sensibles à tous les antibiotiques testés, et que ces souches étaient

associées avec des pulsotypes variés. En l’absence de pression de sélection, le tube digestif

des porcs était principalement colonisé par des souches résistantes à la tétracycline (cf.

tableau 9, le pourcentage de souches d’E. coli chez les porcs témoins était toujours

supérieur à 65 %), associées à un nombre restreint de pulsotypes, et cette résistance était

associée majoritairement à la présence du gène tet(A). Avant traitement, seulement 6% des

souches étaient résistantes à l’ampicilline. C’est à cause de cette faible fréquence que nous

avons sélectionné des souches résistantes à l’ampicilline sur gélose supplémentée en

ampicilline avant de traiter les animaux, afin de décrire les phénotypes et les pulsotypes qui


103

étaient associés avec la résistance à l’ampicilline. Les profils des souches résistantes à

l’ampicilline étaient majoritairement multirésistants et le profil principal était résistant à

l’ampicilline, au chloramphénicol, aux sulfonamides, à la tétracycline, au triméthoprime et à

la streptomycine.

Le plan expérimental de l’étude a utilisé 3 séries de porcs, échelonnées sur 6 mois,

les porcs provenant du même élevage avec un fonctionnement classique de conduite en

bandes. Nous avons remarqué que les souches d’E. coli prélevées sur des porcs provenant

de bandes espacées dans le temps partageaient de nombreux profils de résistance et de

nombreux pulsotypes. Cette observation suggère qu’il existe un réservoir de souches d’E.

coli résistantes dans l’environnement des porcs. Chez les bovins, il a été montré au cours

d’une étude évaluant le niveau de résistance de la flore commensale dans plusieurs fermes,

que chaque ferme possédait un réservoir de souches d’E. coli résistantes à la tétracycline et

que ces souches circulaient entre les animaux d’une même ferme (117). Chez les poulets, le

typage de souches résistantes a montré que les mêmes génotypes persistaient dans

l’environnement de la ferme et contaminaient les nouvelles bandes (119). L’ensemble de ces

résultats indique que des animaux élevés dans le même environnement partagent un

écosystème bactérien, composé de souches porteuses de gènes de résistance, qui se

transmet entre animaux contemporains et entre générations successives.

Nos résultats suggèrent que l’ampicilline a éliminé les souches d’E. coli sensibles et a

sélectionné des souches résistantes qui étaient déjà présentes à un faible niveau dans le

tube digestif avant traitement. La composition de la population des E. coli a ainsi été

profondément modifiée. La fréquence des groupes phylogénétiques a mis en évidence ce

profond changement : l’ampicilline a sélectionné des souches qui appartenaient en majorité

au groupe phylogénétique A alors qu’avant traitement, les souches du tube digestif

appartenaient en majorité au groupe B1. Grâce aux résultats de l’électrophorèse en champ

pulsé, nous avons mis en évidence que les pulsotypes majoritaires observés avant

traitement ont disparu au cours du traitement, et ont été remplacés par des pulsotypes

minoritaires associés avec la résistance à l’ampicilline, qui existaient avant le traitement mais

à faible niveau. Sous la pression de sélection exercée par l’ampicilline ces pulsotypes sont

devenus majoritaires. Au final, la distribution des profils de résistance et des pulsotypes

observée dans la population des E. coli au cours du traitement se révèle relativement proche

de celle que nous avons observée avant le traitement dans la population des souches d’E.

coli prélevées sur gélose supplémentée en ampicilline.


104

La comparaison entre les phénotypes de résistance et les pulsotypes a révélé qu’un

pulsotype pouvait être associé avec différents phénotypes de résistance et qu’inversement,

un phénotype de résistance pouvait être associé avec différents pulsotypes. Ces résultats

sont compatibles avec un transfert horizontal de gènes de résistance dans les populations

digestives d’E. coli. Le transfert de gènes de résistance permet la dissémination de la

résistance au sein des bactéries de l’écosystème intestinal.

Lors de l’administration d’ampicilline, c’est par contre une multiplication clonale des

souches, qui possédaient déjà des mécanismes de résistance, qui a permis l’amplification de

ces gènes de résistance. Mentula et al. ont aussi montré que lors d’administration

d’ampicilline chez le chien, l’émergence de résistance était liée à la multiplication de souches

d’E. coli résistantes à l’ampicilline, plutôt qu’au transfert d’éléments de résistance à des

souches qui étaient au préalable sensibles (93). Nous pouvons supposer en outre, qu’au

moment où la pression de sélection par l’antibiotique s’exerce, le transfert de gènes de

résistance est défavorisé par la disparition des souches sensibles, potentiellement

receveuses.

Les souches résistantes à l’ampicilline, sélectionnées par le traitement, étaient

associées avec plusieurs pulsotypes; mais elles appartenaient en grande majorité au

pulsotype A (cf. figure 10 Jour 4 et Jour 7). Ce pulsotype était aussi prépondérant parmi les

souches résistantes à l’ampicilline avant le traitement (cf. figure 10 Jour 0 AmpR). Il était

majoritairement associé avec le profil de résistance à six antibiotiques car 76% des souches

qui présentaient le phénotype de résistance à six antibiotiques étaient associées avec le

pulsotype A. De manière intéressante, il est à noter que, parmi les sept pulsotypes associés

avec le profil de résistance à six antibiotiques, les souches appartenant au pulsotype A

présentaient une combinaison spécifique de gènes de résistance.

Compte-tenu du rôle du pulsotype A dans l’émergence de la résistance à l’ampicilline

chez les animaux étudiés, il serait intéressant d’identifier les mécanismes qui permettent aux

souches appartenant à ce pulsotype de persister dans le tube digestif en l’absence de

pression de sélection et de devenir majoritaires dès que l’ampicilline exerce une pression de

sélection. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la persistance des

gènes de résistance dans le tube digestif : lien avec des gènes conférant un avantage pour

coloniser le tube digestif, système d’addiction permettant le maintien du plasmide, faible coût

biologique des déterminants génétiques de la résistance, voire même apport d’un avantage

par la présence de ces gènes de résistance (46, 47, 126). Le fait que cette souche soit

prépondérante parmi les souches résistantes à l’ampicilline et qu’elle ait accumulé la

résistance à six antibiotiques suggère que cette souche doit être particulièrement bien


105

adaptée à son environnement qu’est le tube digestif et que les déterminants génétiques de la

résistance lui imposent un faible coût biologique (82).

En conclusion, lors d’administration d’ampicilline, l’émergence de résistance dans la

population des souches d’E. coli digestives était due à la sélection clonale de souches

résistantes à l’ampicilline qui étaient déjà présentes dans le tube digestif avant traitement à

faible niveau. Parmi les souches sélectionnées par le traitement, les souches appartenant à

un pulsotype particulier ont largement contribué à l’émergence de la résistance. Ces

souches étaient multirésistantes, et hébergeaient une combinaison spécifique de

déterminants génétiques de la résistance. Dans l’optique de prévenir l’émergence et la

diffusion de la résistance, il serait pertinent d’identifier par quels mécanismes ces souches

peuvent persister à faible niveau dans le tube digestif, et coloniser majoritairement le tube

digestif lors de pression de sélection exercée par l’ampicilline.


106


107

Article 2

Relatedness of Escherichia coli strains with different susceptibility

phenotypes isolated from swine feces during ampicillin treatment

D. Bibbal, V. Dupouy, M.F. Prère, P.L. Toutain, and A. Bousquet-Mélou

Applied and Environmental Microbiology, May 2009; 75(10) : 2999-3006


108


109


110


111


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114


115


116

117

ETUDE EXPERIMENTALE

Chapitre 4 : Stratégie thérapeutique destinée à prévenir l’émergence de bactéries digestives

résistantes lors d’administration de bêta-lactamines : études préliminaires


118


119

Chapitre 4 : Stratégie thérapeutique destinée à prévenir l’émergence de bactéries digestives résistantes lors d’administration de bêta-lactamines : études préliminaires

41- Introduction

Les résultats des études précédentes ont mis en évidence qu’aussi bien les quantités

d’ampicilline sécrétées dans le tube digestif après administration par voie parentérale que

celles qui ne sont pas absorbées au cours d’une administration par voie orale exercent une

pression de sélection sur la flore digestive qui favorise l’émergence rapide et massive

d’entérobactéries résistantes. Ainsi, il apparaît que la prévention de l’émergence de

résistances bactériennes dans le tube digestif lors d’administration d’ampicilline ne peut être

obtenue que par l’inactivation des résidus de bêta-lactamines dans la lumière intestinale.

Dans ce contexte, nous avons entrepris l’étude d’une stratégie de prévention de l’émergence

de bactéries digestives résistantes consistant en la co-administration par voie orale d’un

ester de bêta-lactamine, la pivampicilline, avec des billes contenant des bêta-lactamases à

vectorisation iléo-colique.

Nous avons vu dans la synthèse bibliographique que la stratégie d’utilisation de bêta-

lactamase pour inactiver l’ampicilline dans les segments distaux du tube digestif, lors

d’administration de bêta-lactamines par voie orale, impose une vectorisation qui libère la

bêta-lactamase en aval de la fenêtre d’absorption de l’antibiotique. Une libération trop

précoce au niveau du jéjunum provoquerait une destruction de l’antibiotique dans la lumière

intestinale, une diminution de sa biodisponibilité et par conséquent de son action

thérapeutique. Une libération trop tardive, c'est-à-dire en aval de la zone iléo-colique, ne

préviendrait pas de l’émergence de bactéries résistantes.

Pour enrober les billes de bêta-lactamase, une stratégie pH-dépendante a été choisie

car ce type enrobage a déjà fait l’objet de nombreux développements chez l’homme. Nous

avons choisi l’Eudragit® FS 30 D car cet enrobage a récemment été développé pour obtenir

une vectorisation iléo-colique optimale chez l’homme (68). L’utilisation de l’Eudragit® FS 30

D afin de cibler une délivrance iléo-colique chez le porc doit être au préalable validée, car il

n’existe pas de données dans la littérature à ce sujet.


120

Nous avons aussi vu dans la synthèse bibliographique que la biodisponibilité de la

pivampicilline par voie orale était plus importante que celle de l’ampicilline chez les espèces

testées. Nous avons alors formulé l’hypothèse qu’une absorption plus massive et plus

précoce de l’ampicilline administrée sous forme d’un ester permettrait d’éviter les effets de la

libération éventuelle de la bêta-lactamase (par fuite ou délivrance précoce) dans la fenêtre

d’absorption de l’antibiotique, l’objectif étant de compenser, par un décalage temporel

(absorption rapide), un éventuel déficit de décalage anatomique (vectorisation distale de la

bêta-lactamase).

Pour valider la stratégie associant pivampicilline+ bêta-lactamase, il faudra montrer

qu’elle est supérieure à l’ampicilline selon les indicateurs suivants :

- une dose de pivampicilline + bêta-lactamase conduit à une biodisponibilité

systémique de l’ampicilline supérieure ou égale à une dose équimolaire d’ampicilline

seule,

- l’action de la bêta-lactamase sur l’ampicilline ou la pivampicilline non absorbée

conduit à une destruction totale de l’antibiotique au niveau de l’iléon ou du caecum et à

une absence d’impact sur la flore bactérienne digestive.

Le chapitre 4 présente les résultats des études préliminaires visant à valider la

stratégie pivampicilline + bêta-lactamase chez le porc. Il s’articule autour de deux sections.

La première section présente les résultats de l’étude comparée des biodisponibilités

absolues par voie orale de la pivampicilline et de l’ampicilline chez le porc. La deuxième

section présente les résultats de l’étude de la libération de l’Eudragit® FS 30 D chez le porc.


121

42- Etude comparée des biodisponibilités absolues de la pivampicilline et de l’ampicilline par voie orale chez le porc

421- Problématique

Dans l’optique d’associer une bêta-lactamine à une bêta-lactamase par voie orale, la

pivampicilline présenterait un intérêt car il a été montré que son absorption était rapide et

importante chez toutes les espèces testées. Cet avantage permettrait de limiter l’impact

d’une fuite ou d’une libération précoce de bêta-lactamase sur la biodisponibilité.

Une étude préliminaire in vitro a été réalisée en collaboration avec l’Equipe Cinétique

des Xénobiotiques (Arellano C, Gandia P, Houin G et Woodley J ; Faculté des Sciences

Pharmaceutiques, Toulouse) grâce à un modèle de sacs intestinaux éversés de rat adapté

au porc. Cette étude a mis en évidence que :

- la pivampicilline était rapidement hydrolysée en présence de tissu intestinal de porc,

- les quantités d’ampicilline mesurées dans le tissu intestinal et l’intérieur du sac (c'est-à-dire

la quantité absorbée) étaient plus importantes après incubation dans un milieu contenant de

la pivampicilline qu’après incubation dans un milieu contenant de l’ampicilline.

422- Objectif

L’objectif de cette étude a été de caractériser les paramètres de l’absorption de la

pivampicilline et de les comparer à ceux de l’ampicilline, afin d’évaluer si les caractéristiques

de la pivampicilline permettraient son utilisation en association avec une bêta-lactamase.



Huit porcs, âgés de 8 semaines à leur arrivée, ont été utilisés. Le plan expérimental a

été un plan parallèle à 3 périodes avec un temps de washout d’au moins 3 jours entre les

périodes. L’ampicilline sodique a été administrée par voie intraveineuse, puis l’ampicilline

trihydrate par voie orale et enfin la pivampicilline par voie orale. Une dose équimolaire de 15


122

mg/kg d’ampicilline a été administrée à chaque période. De l’ampicilline sodium (sel de

sodium d’ampicilline, Sigma) a été administrée par voie intraveineuse au moyen d’un

cathéter placé dans la veine auriculaire. Les prélèvements de sang ont été réalisés par

ponction directe et récoltés dans des tubes héparinés à 0, 5, 15, 30 et 45 minutes et 1, 1.5,

2, 3, 4, 6, 8, 10 et 24 heures après l’administration d’ampicilline. Pour les administrations

orales, la pivampicilline (ProAmpi® 500 mg, GlaxoSmithKline Santé Grand Public) et

l’ampicilline trihydrate (Totapen® 500 mg, Bristol-Myers Squibb) ont été administrées par

gavage juste après le repas. Les échantillons de sang ont été prélevés de la même manière

à 0, 15, et 45 minutes et 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, 10 et 24 heures après l’administration. Les

échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -80°C.

(b) Dosage plasmatique de l’ampicilline

Le dosage de l’ampicilline a été réalisé selon la méthode décrite dans la section 32.

Seule l’ampicilline a été dosée car la pivampicilline est totalement hydrolysée en ampicilline

au niveau de la muqueuse digestive de porc (résultats obtenus par le Laboratoire Cinétique

des Xénobiotiques, Toulouse).

(c) Analyse des résultats





plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. La

clairance plasmatique (Cl) a été calculée en divisant la dose administrée par l’AUC obtenue

après administration par voie intraveineuse. Le temps de demi-vie (t1/2) a été calculé selon

l’équation suivante : t1/2=ln2/ λz, où λz est la pente de la phase terminale, calculée par

régression linéaire sur le logarithme des concentrations. Le volume de distribution à

l’équilibre (Vss) a été calculé selon l’équation suivante : Vss=(Dose*AUMC)/AUC2, où l’AUMC

est l’aire sous la courbe du premier moment statistique. Pour la voie orale, le pic des

concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir des

données. La biodisponibilité absolue (F) a été calculée en divisant l’AUC individuelle obtenue

après administration par voie orale par l’AUC individuelle obtenue après administration par

voie intraveineuse. Pour comparer les valeurs des AUC et des Cmax un test de Student pour


123

séries appariées a été utilisé après une transformation logarithmique des données. Pour

comparer les valeurs des Tmax, un test de Wilcoxon pour séries appariées a été utilisé.

424- Résultats

Les résultats sont présentés dans la figure 12 et le tableau 15. Suite à l’administration

intraveineuse, l’ampicilline a été rapidement distribuée et éliminée. En ce qui concerne les

administrations par voie orale d’ampicilline et de pivampicilline, le pic des concentrations

plasmatiques était significativement plus élevé pour les porcs ayant reçu la pivampicilline:

3.25 µg/mL versus 0.92 µg/mL pour les porcs ayant reçu l’ampicilline. De plus, il était plus

rapidement atteint chez les porcs ayant reçu la pivampicilline que pour l’ampicilline : 0.67

heures versus 2.13 heures pour les porcs ayant reçu l’ampicilline. La biodisponibilité absolue

de la pivampicilline par voie orale était significativement plus élevée que celle de

l’ampicilline.

a)

0

1

10

100

0 2 4 6 8 10

Temps (heures)

Co

nc

en

tra

tio

n d

'am

pic

illin

e (

µg

/mL

)

Ampicilline par voie intraveineuseAmpicilline par voie oralePivampicilline par voie orale

b)

0

1

2

3

4

5

0 2 4 6 8 10

Temps (heures)

Co

nc

en

tra

tio

n

d'a

mp

icill

ine

(µ

g/m

L)

Ampicilline par voie orale

Pivampicilline par voie orale


(moyennes ± écart-type) en fonction du temps (heures) après administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie orale, et de pivampicilline par voie orale, à la dose équimolaire

de 15 mg/kg d’ampicilline, n=8. L’échelle des concentrations est logarithmique a) et arithmétique b).


124


(moyennes ± écart-type) après administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie orale, et de pivampicilline par voie orale, à la dose équimolaire de 15 mg/kg d’ampicilline,

n=8.

Unités Ampicilline par voie

intraveineuse Ampicilline par voie

orale Pivampicilline par

voie orale AUCa mg.h/L 25.89 ± 2.5 4.56* ± 1.42 8.40* ± 2.47

Vssb L/kg 0.37 ± 0.07

Clc L/h/kg 0.59 ± 0.07

Cmaxd µg/mL 0.92* ± 0.19 3.25* ± 1.11

Tmaxe h 2.13* ± 0.70 0.67* ± 0.12

t1/2f h 0.65

Fg % 18.18* ± 8.11 32.79* ± 9.72

* Les valeurs sont significativement différentes entre les groupes (p<0.05). a AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss : volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d Cmax : concentration plasmatique maximale, e Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, f t1/2 : temps de demi-vie, g F : biodisponibilité absolue

425- Résultat complémentaire: biodisponibilité absolue de l’amoxicilline par voie orale chez le porc à jeun

Douze porcs, âgés de 8 semaines à leur arrivée ont été utilisés. Le plan expérimental

a été un cross-over à deux périodes. L’amoxicilline a été administrée à la dose de 7 mg/kg

par voie intraveineuse (Clamoxyl®) et de 20 mg/kg par voie orale (Amodex®Gé) chez le porc

à jeun. Les paramètres pharmacocinétiques sont donnés dans le tableau 16.


125

Tableau 16 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (2)

(moyennes ± écart-type) après administration par voie intraveineuse à 7 mg/kg et par voie orale à 20 mg/kg, n=12.

Unités Amoxicilline par

voie intraveineuse Amoxicilline par

voie orale AUCa mg.h/L 15 ± 5.3 10.3 ± 4.92

Vssb L/kg 0.90 ± 0.61

Clc L/h/kg 0.54 ± 0.25

Cmaxd µg/mL 4.52 ± 3.46

Tmaxe h 1.33 ± 0.39

t1/2f h 0.33

Fg % 24.19 ± 7.16

a AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss : volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d Cmax : concentration plasmatique maximale, e Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, f t1/2 : temps de demi-vie, g F : biodisponibilité absolue

426- Discussion

Les paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline après administration par voie

intraveineuse et voie orale chez le porc nourri avaient déjà été estimés au cours de l’étude

présentée dans la section 32. Pour la voie intraveineuse, les résultats sont sensiblement les

mêmes. En ce qui concerne la voie orale, dans l’étude présentée dans la section 32, nous

avions évalué cette biodisponibilité à 6.16% alors que nous l’avons estimé à 18.18% dans la

présente étude. La différence entre les deux valeurs peut en partie s’expliquer par des

conditions expérimentales différentes (gavage de Totapen® versus prise spontanée

d’Ampicilline 80 Porc Franvet® dans boulettes). De plus, comme l’ampicilline a une

absorption très faible, cette absorption présente une plus grande variabilité. Cette variabilité

importante dans l’absorption de l’ampicilline par voie orale a d’ailleurs aussi été relevée chez

le cheval (49).

Concernant la pivampicilline, nous avons montré que sa biodisponibilité absolue par

voie orale était significativement plus élevée que celle de l’ampicilline. Cette biodisponibilité

était de l’ordre de 30% comme chez le veau (141) et le cheval (48). De plus, le pic des

concentrations plasmatiques était significativement plus élevé et plus rapidement atteint

après administration de pivampicilline que d’ampicilline.

En comparant les paramètres pharmacocinétiques de la pivampicilline mesurés chez

le porc nourri à ceux de l’amoxicilline mesurés chez le porc à jeun au cours d’une autre


126

étude (tableau 16), nous avons pu mettre en évidence que la biodisponibilité absolue par

voie orale de la pivampicilline était comparable à celle de l’amoxicilline, et que le pic des

concentrations plasmatiques semblait plus rapidement atteint après administration de

pivampicilline chez le porc nourri qu’après administration d’amoxicilline chez le porc à jeun.

Dans l’optique d’associer une bêta-lactamine à une bêta-lactamase par voie orale

chez le porc, la pivampicilline présente un intérêt par rapport à l’amoxicilline et à l’ampicilline

car :

- nous avons mis en évidence que l’absorption de la pivampicilline est plus rapide que

celle de l’ampicilline ou celle de l’amoxicilline,

- nous avons montré que la pivampicilline présente une biodisponibilité absolue

supérieure à celle de l’ampicilline, et comparable à celle de l’amoxicilline,

- il a été montré chez l’homme (133) et le cheval (49) que la prise de nourriture n’avait

pas d’impact sur l’absorption de la pivampicilline, à la différence de l’ampicilline ou de

l’amoxicilline.


127

43- Etude de l’absorption de caféine enrobée avec l’Eudragit® FS30D chez le porc

Cette étude a été menée en collaboration avec la société Da Volterra (Faculté de

Médecine Xavier Bichat, Paris) qui a fourni les billes de caféine et qui a pris en charge les

dosages plasmatiques de la caféine.

431- Problématique

L’Eudragit® FS 30 D est un enrobage qui se dissout à un pH de 7.5 et qui a été

développé chez l’homme pour viser une délivrance iléo-colique. Chez l’homme, il existe un

gradient de pH dans le tractus digestif : 1.2 dans l’estomac, 6.6 dans l’intestin grêle proximal,

7.5 au niveau de l’iléon, 6.4 au niveau du côlon (52). La délivrance de l’Eudragit® FS 30 D a

été étudiée chez le chien (56). Dans cette étude, les chiens ont été au préalable traités avec

de la pentagastrine (afin de stimuler la libération de HCl), pour simuler les conditions du

tube digestif de l’homme. En effet, chez le chien, le pH de l’estomac peut atteindre des

valeurs de 6.8, ce qui pourrait entraîner une délivrance anticipée du contenu des billes

enrobées par l’Eudragit® FS 30 D. Chez le porc, les pH digestifs seraient aussi différents de

ceux observés chez l’homme: le pH atteint au niveau de l’iléon ne dépasserait pas la valeur

de 7 (10, 12). L’utilisation de l’Eudragit® FS 30 D pour cibler une délivrance iléo-colique chez

le porc doit donc être au préalable validée.

432- Objectif

L’objectif de cette étude était double :

1- Evaluer l’absorption de caféine enrobée d’Eudragit® FS 30 D et la comparer à celle de la

caféine non enrobée. La caféine a été utilisée car son absorption est possible tout le long du

tractus digestif (101).

2- Mesurer le pH des contenus digestifs du porc.


128



Six porcs, âgés de 7 semaines à leur arrivée, ont été utilisés. Le plan expérimental

était un cross-over à deux périodes avec un washout de 8 jours. La caféine (Merck,

Allemagne) a été administrée à la dose de 10 mg/kg dans des billes non enrobées et dans

des billes enrobées avec 20% d’Eudragit® FS 30 D (Röhm Pharma Polymers, Allemagne)

chez le porc à jeun. Les billes ont été élaborées par la société Degussa (Allemagne). Une

gélule de taille 1 a été remplie avec la dose de billes pour chaque porc et administrée par

voie orale. Les prélèvements de sang ont été réalisés par ponction directe au niveau de la

veine jugulaire et récoltés dans des tubes héparinés aux temps suivant: 0, 0.33, 0.66, 1, 1.5,

2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 et 24 heures pour les billes non enrobées et 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12,

14, 24, 34 et 48 heures pour les billes enrobées. Les échantillons ont été centrifugés (4 000

g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -20°C.

(b) Dosage plasmatique de la caféine

Les dosages de caféine ont été réalisés par ADME Bioanalyses (Vergèze) par une

méthode HPLC/UV. La méthode a été validée pour le plasma de porc pour des

concentrations allant de 0.15 µg/mL à 20 µg/mL.

(c) Mesure du pH dans les contenus digestifs

Afin d’évaluer l’impact du statut digestif sur le pH des contenus digestifs, 3 porcs ont

été sacrifiés à jeun et 3 ont été sacrifiés 4 à 5 heures après leur dernier repas. Le pH a été

mesuré au niveau de 13 sections : duodénum, jéjunum (2 sections), iléon (3 sections),

caecum, côlon centripète (3 sections), côlon centrifuge (2 sections) et rectum. Un pH-mètre

MP 230 (Mettler Toledo, Suisse) a été utilisé.

(d) Analyse des résultats

Les concentrations plasmatiques de caféine en fonction du temps ont été analysées à

l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2,


129



plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. Le

pic des concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir

des données. Pour comparer les AUC et les Cmax un test de Student pour séries appariées a

été utilisé après une transformation logarithmique des données. Pour comparer les Tmax, un

test de Wilcoxon pour séries appariées a été utilisé.

434- Résultats

(a) pH des contenus digestifs

Les résultats des mesures de pH sont présentés dans la figure 13. Le pH se situe aux

alentours de 6 pour les porcs nourris et 6.5 pour les porcs à jeun au niveau du duodénum. Il

est compris entre 6.5 (porcs nourris) et 7 (porcs à jeun) au niveau de l’iléon mais ne dépasse

pas 7. Il chute au niveau du caecum à 6 pour remonter le long du côlon distal entre 6.5

(porcs à jeun) et 7 (porcs nourris).

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

Duode

num

Jejun

um 1

Jejun

um 2

Ileum

1

Ileum

2

Ileum

3

Caecu

m

Proxim

al C

olon

1

Proxim

al C

olon

2

Proxim

al C

olon

3

Distal

Colo

n 1

Distal

Colo

n 2

Rectu

m

pH

Porcs à jeun Porcs nourris

Figure 13 : pH des contenus digestifs de porc

(moyennes ± écart-type) les porcs étant à jeun (n=3) et nourris (n=3).


130

(b) Profils cinétiques de la caféine enrobée et non enrobée avec

l’Eudragit® FS 30 D

Les résultats sont donnés dans le tableau 17 et la figure 14. Les profils des

concentrations plasmatiques de caféine présentent de grande variabilité entre les porcs

quelque soit le type d’enrobage. Après administration par voie orale de billes non enrobées

contenant de la caféine, un pic des concentrations plasmatiques de caféine de 11.6 µg/mL

est atteint au bout de 4.2 heures. En ce qui concerne les billes enrobées avec l’Eudragit® FS

30 D, le pic est significativement moins élevé et est atteint au bout de 7.7 heures. Les AUC

des deux types de billes ne présentent pas de différence significative.

a)

0

1

10

100

0 10 20 30 40 50

Temps (heures)

Co

nce

ntr

ati

on

de

c

afé

ine

(µg

/mL

)

Pas d'enrobage Eudragit FS 30 D

b)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 10 20 30 40 50

Temps (heures)

Co

nce

ntr

ati

on

de

c

afé

ine

(µg

/mL

)

Pas d'enrobage Eudragit FS 30 D

Figure 14 : Concentrations plasmatiques de caféine

(moyennes ± écart-type) en fonction du temps (heures) après administration de caféine à 10 mg/kg par voie orale dans des billes enrobées d’Eudragit® FS 30 D et non enrobées (n=6).

L’échelle des concentrations est logarithmique a) et arithmétique b).

Tableau 17 : Paramètres pharmacocinétiques de la caféine

(moyennes ± écart-type) après administration à 10 mg/kg par voie orale dans des billes enrobées d’Eudragit® FS 30 D et non enrobées (n=6).

Cmax

a Tmaxb AUCc

Enrobage µg/mL h µg.h/mL

Sans enrobage 11.6* ± 4.9 4.2 ± 2.8 207 ± 124

Eudragit® FS 30 D 6.04* ± 1.4 7. 7 ± 2.3 159 ± 49

* il existe une différence significative entre les groupes (p<0.05) ; a Cmax : concentration plasmatique maximale, b Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, c AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps


131

435- Discussion

Les pH que nous avons mesurés au niveau du tractus digestif du porc sont

semblables à ceux décrits dans la littérature (10). Ils sont aussi semblables à ceux observés

chez l’homme sauf au niveau de l’iléon. Chez l’homme, des pH de 7.5 ont été mesurés (52),

alors que dans nos conditions expérimentales chez le porc, le pH des contenus digestifs au

niveau de l’iléon ne dépassait pas la valeur de 7.

La libération de la caféine enrobée avec l’Eudragit® FS 30 D est néanmoins massive

car l’exposition systémique des animaux (AUC) représente environ 77% de celle obtenue

avec la caféine non enrobée. L’analyse statistique n’a cependant pas permis de mettre en

évidence de différence entre les AUC moyennes, du fait d’une grande variabilité inter-

individuelle observée dans le groupe avec caféine non enrobée, alors que le pic des

concentrations plasmatiques est significativement plus élevé dans ce groupe. Parallèlement,

bien que la différence ne soit pas statistiquement significative dans nos conditions

expérimentales, les résultats suggèrent l’existence d’un décalage entre les temps

d’occurrence des pics de concentration (Tmax). De manière intéressante, ce décalage

d’environ 3 heures est du même ordre de grandeur que le temps de transit oro-caecal chez

le porc (40).

La variabilité de l’absorption de la caféine (non enrobée ou enrobée) peut être

associée à plusieurs facteurs physiologiques : la vidange gastrique, le temps de transit, des

variations de pH des contenus digestifs. Chez le porc, une grande variabilité inter et intra-

individuelle a été mise en évidence lors de la mesure du temps de transit oro-caecal (40, 57).

Les résultats de cette étude suggèrent que chez le porc, l’Eudragit® FS 30 D permet

une libération massive de la caféine, et que cette libération serait retardée d’environ 3

heures par rapport aux billes non enrobées. Le pic des concentrations plasmatiques de

caféine a été atteint à 7.7 ± 2.3 heures lorsque la caféine était enrobée d’Eudragit® FS 30 D.

Par ailleurs, nous avons montré dans l’étude précédente que le pic des concentrations

plasmatiques d’ampicilline après administration de pivampicilline était atteint au bout de 0.67

± 0.12 heures. La comparaison de ces résultats suggèrent que la fenêtre d’absorption de la

pivampicilline et celle de la caféine enrobée d’Eudragit® FS 30 D pourraient être fortement

décalées dans le temps.

En conclusion, les résultats concernant les caractéristiques pharmacocinétiques de

l’ester d’ampicilline, et la libération d’un principe actif par un enrobage à base d’Eudragit® FS

30 D chez le porc nous semblent compatibles avec la stratégie envisagée.

132

133

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Conclusions et perspectives

134


135

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

La maîtrise de la qualité sanitaire des élevages nécessite le contrôle des infections

bactériennes, qui fait largement appel aux antibiotiques dont l’utilisation, à l’instar de la

médecine humaine, s’accompagne du développement de résistances bactériennes aux anti-

infectieux. Une des voies de réduction des impacts négatifs de l’antibiothérapie animale sur

la santé humaine passe par la promotion d’une antibiothérapie animale raisonnée, capable

d’assurer un objectif thérapeutique tout en minimisant les risques d’émergence et de

diffusion de l’antibiorésistance.

En terme de santé publique, un des enjeux de l’antibiothérapie en médecine

vétérinaire est de diminuer la sélection de bactéries résistantes dans le tube digestif des

animaux. Un premier objectif de ce travail de thèse a été de caractériser sur les plans

phénotypique et génotypique, la résistance bactérienne dans la flore digestive lors

d’administration d’ampicilline chez le porc, afin de mieux cerner les mécanismes de

l’émergence de cette résistance. Parallèlement, un deuxième objectif de ce travail a été

d’évaluer les bases d’une stratégie thérapeutique visant à diminuer l’excrétion de bactéries

résistantes digestives lors d’administration d’une bêta-lactamine par voie orale chez le porc.

Caractérisation phénotypique et génotypique de l’émergence

d’entérobactéries digestives résistantes lors d’administration

d’ampicilline chez le porc

Au cours de la première partie de notre travail de thèse, nous avons évalué chez le

porc l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur l’émergence

d’entérobactéries résistantes. Ces trois modalités étaient les suivantes : la voie

intramusculaire, la voie orale chez le porc nourri et la voie orale chez le porc à jeun. Nous

avons choisi de comparer ces schémas thérapeutiques car les études pharmacocinétiques

que nous avons réalisées, et les données de la littérature suggéraient qu’ils pouvaient

conduire à des expositions différentes du tube digestif. Il s’agissait ici d’évaluer si des

schémas thérapeutiques correspondant au cadre d’une autorisation de mise sur le marché

pouvaient être distingués en terme d’émergence de résistance bactérienne au niveau de la

flore commensale digestive.


136

Dans l’optique d’obtenir une mesure quantitative du niveau de résistance de la flore

digestive, nous avons utilisé trois indicateurs de résistance dont nous avons comparé les

résultats. Il s’agissait de deux indicateurs phénotypiques (le pourcentage d’entérobactéries

résistantes obtenu après dénombrement, et le pourcentage de souches isolées d’E. coli

résistantes) et d’un indicateur génotypique (la quantification des gènes blaTEM par PCR en

temps réel). Cette dernière méthode a été développée au sein du laboratoire, afin d’être en

mesure de quantifier les gènes de résistance au niveau de la biomasse bactérienne totale.

Les résultats de cette étude ont été présentés dans l’article 1.

Les résultats ont montré que dans nos conditions expérimentales, parmi les

indicateurs phénotypiques, la détermination du pourcentage d’entérobactéries résistantes

était un indicateur plus robuste que la détermination du pourcentage de souches d’E. coli

résistantes. En ce qui concerne l’indicateur génotypique, nous avons mis en évidence que la

quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc pouvait être un outil prometteur pour

apprécier l’impact d’une antibiothérapie sur la flore digestive. Nous avons en outre montré

que les quantités de gènes blaTEM étaient corrélées aux dénombrements d’entérobactéries

résistantes. Cet indicateur génotypique nous a permis de mettre en évidence que des

modalités d’administration différentes de l’ampicilline pouvaient avoir un impact différent

quant à l’excrétion de gènes de résistance. Cependant, les trois modalités d’administration

de l’ampicilline testées ont toutes eu un impact négatif quant à l’émergence de résistance

dans l’écosystème digestif du porc.

Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons approfondi la caractérisation de

l’émergence de résistance lors d’administration d’ampicilline chez le porc en étudiant la

dynamique du développement de cette résistance au sein des populations d’E. coli d’origine

digestive. Nous avons voulu évaluer dans quelle mesure le développement de la résistance

bactérienne au cours du traitement à l’ampicilline pouvait être attribué à la sélection clonale

de souches minoritaires résistantes à l’ampicilline, et/ou à l’acquisition de cette résistance

par des souches préalablement sensibles, après transfert horizontal des supports

génétiques. Nous avons caractérisé sur le plan phénotypique et génotypique les profils de

résistance qui ont émergé sous la pression de sélection de l’ampicilline, ainsi que la parenté

génétique des souches porteuses de ces résistances. Pour ce faire, nous avons typé, avant

et pendant le traitement, par électrophorèse en champ pulsé, des souches d’E. coli qui

présentaient des profils de résistance différents. Les résultats de cette étude ont été

présentés dans l’article 2.


137

Nous avons observé qu’avant l’administration d’ampicilline, les animaux hébergeaient

un réservoir de souches d’E. coli résistantes dans leur tube digestif. Ces souches étaient

majoritairement multirésistantes et l’analyse génotypique a montré que les pulsotypes

associés à ces souches étaient partagés par des porcs non contemporains mais provenant

du même élevage (issus d’une conduite en bandes classique en élevage porcin). Ces

observations renforcent des données de la littérature suggérant l’importance de

l’environnement dans la transmission et la pérennisation des réservoirs de bactéries

résistantes au sein de la flore commensale digestive. Lors de l’administration d’ampicilline,

nous avons mis en évidence que le traitement avait sélectionné majoritairement les souches

résidantes résistantes à l’ampicilline. Ainsi, nos observations suggèrent que l’émergence de

la résistance lors d’administration d’ampicilline était essentiellement due à la multiplication

clonale de souches résistantes appartenant à des pulsotypes variés.

Parmi les souches sélectionnées par l’administration d’ampicilline, celles qui étaient

associées à un pulsotype particulier (le pulsotype A) ont majoritairement colonisé le tube

digestif. Par la suite, il serait pertinent d’identifier les avantages que possèdent les souches

appartenant à ce pulsotype leur permettant de coloniser majoritairement le tube digestif sous

la pression de sélection exercée par l’ampicilline. Afin de mettre en évidence ces propriétés,

plusieurs hypothèses mériteraient d’être explorées. Entre autres, il serait intéressant

d’évaluer si la réussite des souches appartenant au pulsotype A est associée à la

combinaison spécifique des gènes de résistance qu’elles hébergent.

Nous n’avons pas mis en évidence au cours de cette étude l’existence d’un transfert

de gènes de résistance à l’ampicilline à des souches préalablement sensibles, le

développement de la résistance bactérienne observé au cours du traitement pouvant être

attribué à la seule sélection clonale de souches résistantes. Cependant le fait que des

souches appartenant à des pulsotypes variés et éloignés génétiquement soient associées

avec la résistance à l’ampicilline semble être un indicateur de l’existence du phénomène de

transfert horizontal de gènes dans le tube digestif. Le fait que nous n’ayons pas pu mettre en

évidence cet événement au cours du traitement peut être mis en relation avec le phénomène

d’élimination rapide des souches sensibles et potentiellement receveuses. Au contraire, ce

même transfert pourrait être favorisé après la fin du traitement, au moment où la pression de

sélection exercée par l’antibiotique diminue et où les souches sensibles ré-émergent. Il serait

intéressant de tester cette hypothèse par un suivi au cours du temps en phase post-

traitement de la parenté génétique et de la sensibilité à l’ampicilline des souches d’E. coli.


138

Pour finir, dans l’optique d’étudier les potentiels flux de gènes entre les souches

digestives d’origine humaine et animale, il serait pertinent d’évaluer la capacité de transfert

des gènes de résistance hébergés par les souches appartenant au pulsotype A à des

souches d’origine humaine, dans des conditions proches de celles du tube digestif de

l’homme. Par ailleurs, à l’échelle de l’environnement, la technique de quantification des

gènes blaTEM dans les fèces par PCR en temps réel semble être un outil prometteur pour

quantifier les gènes de résistance dans des environnements divers, et pourrait permettre

d’appréhender les flux de gènes de résistance entre les réservoirs animaux et humains.

Evaluation des bases d’une stratégie thérapeutique de prévention de

l’émergence de résistance dans la flore digestive lors d’administration

de bêta-lactamines par voie orale

L’ensemble des résultats obtenus au cours de la première partie de notre travail de

thèse ont montré que l’administration d’ampicilline chez le porc conduisait à l’émergence

rapide et massive d’entérobactéries résistantes, et ce quelle que soit la modalité

d’administration testée. Dans l’optique de prévenir l’émergence d’entérobactéries résistantes

lors d’administration d’ampicilline, il apparaît donc que les résidus de la bêta-lactamine

présents dans la lumière intestinale doivent être inactivés. Au cours de la deuxième partie de

notre travail de thèse, nous avons évalué les bases d’une stratégie de prévention de

l’émergence de résistance dans la flore digestive, qui consiste en la co-administration par

voie orale d’un ester d’ampicilline (la pivampicilline) et de bêta-lactamase à vectorisation

colique.

Une étude pharmacocinétique nous a permis de mettre en évidence les avantages de

la pivampicilline par rapport à l’ampicilline dans le cadre d’une association future avec des

bêta-lactamases. Chez le porc, l’ampicilline administrée sous forme de pivampicilline

présente une absorption supérieure et surtout plus précoce que l’ampicilline sous forme de

sel. Ces caractéristiques pharmacocinétiques de la forme ester de l’antibiotique

permettraient d’éviter, dans le cas de délivrance précoce ou de fuite de la bêta-lactamase

vectorisée, une hydrolyse au niveau de la fenêtre d’absorption qui conduirait à une sous-

exposition systémique du porc à l’antibiotique. Par ailleurs, nous avons montré que

l’enrobage sélectionné pour obtenir une vectorisation iléo-colique de la bêta-lactamase

(l’Eudragit® FS 30 D) permettait une libération retardée du composé enrobé (la caféine)

dans le tube digestif du porc.


139

En l’état de nos investigations, les caractéristiques combinées de la

pharmacocinétique de la pivampicilline et de libération de l’enrobage Eudragit® FS 30 D

dans le tube digestif de porcs semblent favorables à une dissociation temporelle des

processus d’absorption de l’ampicilline (plus précoce) et de libération (avec retard) de

l’enzyme capable de détruire cet antibiotique. Ces résultats nous incitent à poursuivre les

investigations des propriétés de l’association pivampicilline + billes de bêta-lactamase

enrobées d’Eudragit® FS 30 D. L’étape suivante consisterait à développer une formulation à

base de bêta-lactamases enrobées d’Eudragit® FS 30 D. Cette formulation pourrait être

testée in vitro afin de s’assurer que le processus de fabrication n’altère pas les propriétés de

la bêta-lactamase, et que la formulation libère l’enzyme au pH iléo-caecal. Par la suite,

l’étude in vivo de la formulation validée permettrait d’évaluer à la fois l’impact de la bêta-

lactamase sur la biodisponibilité de l’ampicilline administrée sous forme d’ester et sur la

prévention de l’émergence de résistance au niveau de la flore digestive.

Parmi les étapes ultérieures du développement de ce type de formulation, le choix de

la bêta-lactamase est une étape importante. Nous avons vu, dans la synthèse

bibliographique, qu’une équipe avait validé cette approche chez la souris en utilisant la

combinaison pipéracilline-tazobactam par voie sous-cutanée avec une bêta-lactamase de

classe B, qui est insensible à l’inhibiteur tazobactam (124). Le choix d’une bêta-lactamase de

classe B semble judicieux dans la perspective d’étendre cette stratégie à l’ensemble des

bêta-lactamines, notamment à celles qui sont associées à des inhibiteurs tels que le

tazobactam chez l’homme.

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TITRE ET RESUME EN ANGLAIS

Title : Impact of beta-lactam antibiotics on the emergence of resistant enterobacteria

in the digestive flora of swine : characterization and strategy of prevention

Abstract : Antibiotic administration in animals is involved in the selection of antibiotic

resistant bacteria in the digestive tract, potentially transferable to humans.

Phenotypic and genotypic characterization of the emergence of resistant digestive

enterobacteria, under selective pressure by a beta-lactam antibiotic, was performed

in pig. Multiresistant E. coli isolates were mainly selected, and the analysis of the

relatedness of these isolates suggested the selection of clones, which were already

present at low level in the digestive tract before any treatment. A therapeutic strategy

aiming at preventing the emergence of digestive resistant bacteria, during beta-

lactam antibiotic administration by the oral route in pigs, was proposed. It consists of

the association of an ester of beta-lactam antibiotic with coated beads which release

beta-lactamase at the ileocaecal junction. The characteristics of the absorption of the

ester and the characteristics of the delivery of the selected coating encourage us to

follow the exploration of this strategy.

Keywords : pig, beta-lactam antibiotics, beta-lactamase, antibiotic resistance, E. coli,

commensal digestive flora

AUTEUR : BIBBAL Delphine

TITRE : Impact des bêta-lactamines sur l’émergence d’entérobactéries

résistantes dans la flore digestive chez le porc : caractérisation et stratégie de

prévention

DIRECTEURS DE THESE : Monsieur le Docteur Alain BOUSQUET-MELOU

Monsieur le Professeur Pierre-Louis TOUTAIN

LIEU ET DATE DE SOUTENANCE :

le 10 Décembre 2008 à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse

RESUME : L’antibiothérapie chez les animaux contribue à la sélection de résistances

bactériennes au niveau du tube digestif, potentiellement transmissibles à l’homme.

La caractérisation phénotypique et génotypique de l’émergence d’entérobactéries

digestives résistantes, lors de pression de sélection par une bêta-lactamine, a été

réalisée chez le porc. Des souches d’E. coli majoritairement multirésistantes ont été

sélectionnées, et l’analyse des pulsotypes de ces souches suggère une sélection de

clones déjà présents mais minoritaires dans le tube digestif. Une stratégie

thérapeutique visant à prévenir l’émergence de bactéries digestives résistantes lors

d’administration orale de bêta-lactamines chez le porc a été proposée. Elle consiste

en l’association d’un ester de bêta-lactamine avec des billes à vectorisation iléo-

colique contenant des bêta-lactamases. Les caractéristiques d’absorption de l’ester

et de libération par l’enrobage sélectionné encouragent à poursuivre l’exploration de

cette stratégie.

MOTS-CLES : porc, bêta-lactamines, bêta-lactamase, résistance bactérienne, E.

coli, flore digestive commensale

DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Pharmacologie

INTITULE ET ADRESSE DU LABORATOIRE : UMR181 Physiopathologie et Toxicologie Expérimentales, INRA, ENVT Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse 23, chemin des Capelles BP 87614 31076 Toulouse Cedex 3

Documents

A Monsieur le Docteur Axel CLOECKAERT, et Monsieur le