ADN fœtal dans le sang maternel > J.M. COSTA Laboratoire Cerba Colloque ATC Aix-en-Provence 20 Septembre 2010

ADN fœtal ADN fœtal

dans le sang materneldans le sang maternel

> J.M. COSTA Laboratoire Cerba

Colloque ATC Aix-en-Provence

20 Septembre 2010

Diagnostic prénatal Diagnostic prénatal in utero in utero en France : rappelsen France : rappels

Principales indications

• Anomalies chromosomiques 94.375

• Maladies et caractéristiques génétiques 2.881

– Mucoviscidose

– Hémoglobinopathies

– Amyotrophie spinale

– Achondroplasie…

• Foetopathies infectieuses 6.443

– Toxoplasmose

– Cytomégalovirus, parvovirus B19, varicelle…

Données Agence de la Biomédecine année 2007

Diagnostic des anomalies chromosomiques : 94.375

Indication

• Age maternel ( 38 ans) 30.677

• Marqueurs sériques 38.377

Soit de 345 à 690 pertes fœtales pour 895 trisomies 21

détectées

Diagnostic prénatal Diagnostic prénatal in utero in utero en France : rappelsen France : rappels

Données Agence de la Biomédecine année 2007

Les acides nucléiques circulants ou cellules fœtales ?

Diagnostic prénatal à partir du sang maternelDiagnostic prénatal à partir du sang maternel

ADN fœtal plasmatiqueADN fœtal plasmatique

Physiopathologie

• Origine cellulaire: les cellules

trophoblastiques

• Apparition précoce dans la circulation

maternelle ≈ 5-6SA

• Augmentation de la concentration

tout au long de la grossesse

• Disparition rapide (< 48 h) après

accouchement (1/2 vie 16 min)

• Pas de persistance après grossesse


Méthode d’étude de concept simple

• Recueil du plasma/sérum

• Extraction des acides nucléiques

• Analyse par biologie moléculaire


Difficultés et limites

Analyse moléculaire

• Séquençage…

• MLPA, QF-PCR…

• Caryotype moléculaire (CGH-array, SNP-

array)


Difficultés et limites d’analyse

• Ne représente que 3 à 6% de l’ADN

plasmatique

• Quantité faible au 1er trimestre : 20-30

Geq/ml

• Analyse restreinte à la détection de

séquences

absentes du génome maternel

Analyse de l’ADN fœtal plasmatiqueAnalyse de l’ADN fœtal plasmatique

Recherche de séquences absentes du génome maternel

XY

Détermination du sexe fœtal :Recherche de séquences dérivées du chromosome Y (gèneSRY)

Sérum positif (x4)

Sérum négatif (x4)

Diagnostic de sexe fœtal par analyse de l’ADN fœtal Diagnostic de sexe fœtal par analyse de l’ADN fœtal circulantcirculant

Détermination du sexe foetalDétermination du sexe foetal

Intérêts

– Maladies génétiques liées à l’X

– Eviter un geste invasif (CVS) chez les patientes conductrices qui portent un fœtus de sexe féminin (ne présentant aucun risque)

– Hyperplasie congénitales des surrénales (déficit en 21-hydroxylase)

– Eviter le recours à un traitement corticoïde chez les patientes qui portent un foetus de sexe masculin (traitement inutile)

– Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie

– Aide à la prise en charge.


Recherche de séquences absentes du génome maternel

RHD+

Génotypage RHD fœtal :séquences dérivées du gène RHD

RHD-

Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage génotypage RHDRHD

Les bases moléculaires du système rhésus

Gène RHD

Gène RHCE

98 % d’homologie au niveau nucléotidique

92 % d’homologie au niveau protéique

3’UTR

Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au Analyse de l’ADN fœtal circulant: application au génotypage génotypage RHDRHD

Les bases moléculaires du phénotype RhD-négatif

Phénotype RhD-positif 85 %

Phénotype RhD-négatif 15 %

+

+

del

+

del

del 43 %

42 %

Génotypage Génotypage RHD RHD fœtal à partir du sang maternel: fœtal à partir du sang maternel: principeprincipe

Génome paternel RhD-positif

Sang maternel

Fœtus RhD-négatif

Génome maternel+

Génome foetal Fœtus RhD-positif

Détection par amplification génique (PCR en temps réel) de séquences nucléotidiques (d’origine paternelle) dérivées du gène RHD

Génome maternel+

Génome foetal

Ex5 Ex7 Ex10

Génotypage Génotypage RHDRHD fœtal non invasif fœtal non invasif

Indications

– Les patientes RhD-négatives allo-immunisées

• Eviter un geste invasif qui risque de réactiver l’immunisation

– Les patientes RhD-négatives devant subir un geste invasif

• Eviter une prophylaxie anti-D inutile

• Mise en place d’une prophylaxie immédiate

Intérêt: environ 30% des fœtus sont RhD-négatifs

o Limiter l’exposition à des produits dérivés du sang

o Limiter l’utilisation des immunoglobulines (stocks limités)

o Augmente la pertinence de la prophylaxie (Jones et al, BJOG 2004;111:8982-902). Pour éviter 1 cas d’allo-immunisation, il faut traiter:

– 278 femmes en l’absence de génotypage

– 166 femmes si le génotype fœtal RHD est connu positif

Diagnostic prénatal non invasif des maladies Diagnostic prénatal non invasif des maladies monogéniques monogéniques (ou caractéristique génétique)(ou caractéristique génétique)??

Un défi technologique majeur-1

Délétion/insertion, réarrangement complexe and expansion de triplets : IMPOSSIBLE (?)

Détection de mutation ponctuelle: ENVISAGEABLE …

si développement de techniques sensible de détection de séquences minoritaires• Real-time PCR (PNA, allele-specific…)

• PCR-dHPLC

• PCR-High Resolution Melting

• PCR et primer extension (MALDI-TOF)….

1% 0%2.5%

5%

Détection d’une population minoritaire d’allèle muté: Détection d’une population minoritaire d’allèle muté: exemple de la PCR-HRMexemple de la PCR-HRM

Proportion de l’allèle muté au sein d’un background « sauvage »


Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus

Mutation de novo : achondroplasie Recherche de la mutation G380R du gène FGFR3

Ce qui va changer ? (validation clinique en cours)

• Complément à l’analyse échographique

Ce qui pourrait se faire ?

• Hypochondroplasie• Nanisme thanatophore• Syndrome d’Apert


Recherche de mutations ponctuelles chez le foetus

SNP paternel : génotypage KEL (K1) Recherche du variant Thr193Met du gène KEL

Ce qui va changer ? (validation clinique en cours)

• Plus de recours à l’amniocentèse chez les patientes allo-immunisées pour évaluation fœtale

Ce qui pourrait se faire ?

• Génotypage plaquettaire (HPA1…)• Diagnostic des maladies autosomiques dominantes

(paternelle)• Test de paternité

K1 K2

Diagnostic prénatal non invasif des anomalies Diagnostic prénatal non invasif des anomalies chromosomiques chromosomiques (trisomie 21)(trisomie 21)??

Un défi technologique majeur-2

Remaniements chromosomiques complexes: IMPOSSIBLE (?)

Aneuploïdies (trisomie 13, 18 et/ou 21) : POSSIBLE … par quantification du nombre de chromosomes du fœtus :

• Marqueurs non spécifiques

• Marqueurs spécifiques du foetus: ARN (fœtaux) placentaires ou marqueurs épigénétiques

Quantification de marqueurs NON-SPECIFIQUES

Chr21 mère

Foetus Euploïde Foetus T21

Chr21 foetus

ADN fœtal plasmatique et trisomieADN fœtal plasmatique et trisomie

Dosage chromosomique relatif (RCD) par Digital PCR

ADN fœtal plasmatique et trisomie 21ADN fœtal plasmatique et trisomie 21

Quantification par « massively parallel sequencing »

“bridge amplification”

“by synthesis”

Massive parallel sequencing

“PCR emulsion” “by ligation”

Single molecule amplification


chromosomesreads

15 patientes (terme médian: 14 semaines)

Tous les cas (9) correctement identifiés


18 patientes (terme médian: 18 semaines)




• Avantages• Démonstration pour la détection des trisomies 13, 18 et 21• Approche indépendante de polymorphismes

• Inconvénients• Coût et quantité de données générées (stockage)• En l’état actuel, formats inadaptés à un haut débit


Chr21

ADN/ARN fœtal plasmatique et trisomieADN/ARN fœtal plasmatique et trisomie

Foetus euploïde Foetus T21

Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ARNs placentaires

ARN fœtal circulant et trisomieARN fœtal circulant et trisomie

CGGGATAAATATCGACTC 5866.8 Da


A

CT



C

MassARRAY® (Maldi-Tof)

Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs

ARN fœtal circulant et trisomieARN fœtal circulant et trisomie

Sensibilité: 90 % (valeur prédictive négative 96,5 %)

57 patientes fœtus à caryotype normal(mean gestation 13.0 weeks)

10 patientes fœtus trisomie 21(mean gestation 14.7 weeks)

Rati

o

Dosage chromosomique relatif (RCD) par ratios de SNPs

ChrRef


Foetus euploïde Foetus T21

Quantification marqueurs fœtaux SPÉCIFIQUES: ADN hyperméthylé

Chr21

Ratio de HLCS /ZFY ADNs hyperméthylés

29 patientes (1er, 2nd and 3ème trimestre)


Quantification par dosage chromosomique relatif


Aspects règlementairesAspects règlementaires

L’analyse de l’ADN fœtal circulant est un acte de diagnostic prénatal

Laboratoires : Autorisation de diagnostic prénatal par l’ARH

Praticiens : Agrément par l’Agence de la Biomédecine

Déclaration annuelle des activités diagnostiques

Documents

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