Anaïs BrassierInterne de pédiatrie ParisMaster 2 de génétique

Hôpital Necker Enfants MaladesInserm Unité 781Y. De Keyzer; P.de Lonlay; A.Munnich

Maladie rare d’intoxication endogène Maladie du catabolisme des acides aminés

ramifiés de transmission autosomique récessive

Liée à un déficit enzymatique en propionyl CoA carboxylase (PCC)

Bloc enzymatique sur la voie de dégradation de 4 acides aminés essentiels (valine, isoleucine, méthionine, thréonine)

La PCC convertit le propionyl CoA en méthylmalonyl CoA puis transformation en succinyl CoA qui rejoint le cycle de Krebs (CK)

Principal but du CK: synthèse de NADH utilisé par la chaîne respiratoire mitochondriale (CR)

Cycle de Krebs

Forme typique (déficit enzymatique complet): révélation néonatale par un coma progressif avec acido- cétose et hyperammoniémie

Décès rapide en l’absence de traitement

Formes plus tardives (déficit enzymatique partiel): présentations neurodigestives très variables

Formes rares d’AP sensibles à la biotine (B8: cofacteur de la PCC)

Non spécifiques:

Acidose métabolique à TA augmenté Cétose Hyperlactacidémie Hyperammoniémie

Spécifiques:

CAO urinaire: accumulation de métabolites toxiques en amont du déficit (3 OH propionate, tiglyglycine, méthylcitrate, et propionylglycine)

Diagnostic de certitude = diagnostic moléculaire: recherche du déficit enzymatique par séquençage de l’ADN (sur sang ou fibroblastes)

Complications viscérales à long terme fréquentes et graves: Myocardiopathies Insuffisance rénale Pancréatite Complications neurologiques: nécrose aigüe des

noyaux gris centraux (Sd de Leigh); syndrome cérebelleux; régression psychomotrice, mouvements anormaux et convulsions

Pronostic à long terme difficile et incertain: morbidité et mortalité élevées

Rôle toxique connu du propionyl CoA sur certaines enzymes mitochondriales

Complications neurologiques tardives survenant même en cas de contrôle des précurseurs du propionate (régime hypoprotidique suivi limitant l’apport des précurseurs de l’acide propionique)

autre mécanisme physiopathologique…

mécanismes mal élucidés, mais probablement liés à un dysfonctionnement énergétique mitochondrial:

Une accumulation de métabolites toxiques en amont du bloc enzymatique

Un déficit en succinyl CoA en aval du bloc enzymatique

Cycle de Krebs

Le succinyl CoA est un substrat anaplérotique important du CK, impliqué directement dans la synthèse de NADH

Donc: en cas de déficit en succinyl CoA Dysfonctionnement du CK Et déficit secondaire de la CR mitochondriale

Hypothèse: augmenter les réserves de substrats anaplérotiques pour restaurer en partie l’acitivité du CK et le fonctionnement de la CR afin de prévenir les complications tardives de l’AP

Étudier l’efficacité de traitements anaplérotiques in vitro en contournant la voie du propionate pour restaurer l’activité de la CR

Création d’un modèle de cellules hépatocytaires humaines (HepG2) rendues déficientes en PCCA (pas de lignées d’hépatocytes de patients atteints d’AP et le plus souvent les fibroblastes

n’expriment pas le déficit enzymatique) par l’expression de RNAi spécifiques du gène

• synthèse de 4 RNAi ciblant plusieurs régions spécifiques des ARN m de la PCCA (logiciel internet) replacés dans oligonudléotide de 97nt (comportant les motifs de la structure miRNA ) :

miPCCA-F (22) miPCCA-R (22)Hairpin micro RNAPied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA

97 nt

miPCCA-F (22) miPCCA-R (22)Hairpin micro RNAPied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA

miPCCA-F (22) miPCCA-R (22)Hairpin micro RNAPied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA

EcoRI XhoI

130 nt• Sous clonage des oligonucléotides contenant le RNAi dans un plasmide d’expression

EcoR I

Xho I+ E. coliTMP TMP-miPCCA

Ligation Transformation

• amplification par PCR de ces oligonucléotides

Promotor = CMV TRE = Tetracycline Responsive Element (Tet-On) Puromycine resistance (promotor pgk) Expression GFP (IRES)

Carte du vecteur• Transfection des plasmides recombinants dans les cellules

hepG2

• Sélection des clones HepG2 contenant le plasmide ( par puromycine) avec la plus forte diminution d’expression de PCCA

TRE pCMV

Palindrome du microRNA

pPGK puromycine IRES GFP

miPCCA-F (22) miPCCA-R (22)Hairpin micro RNAPied 5’ micro RNA Pied 3’ micro RNA

Micro RNA repliéRNAi

Hybridation ARNm=> “inactivation”

Traitement des clones par doxycycline (0,1 à & µg/ml pendant 15 jours): induction de l’expression des miRNA spécifiques de la PCCA ( système TETon)

Inhibition de la PCCA:

Caractérisation des clones au niveau protéique: analyse de la PPCA par Western Blot et par dosage de l’activité enzymatique (carboxylation du propionyl CoA avec du C14

et mesure du méthylmalonyl CoA C14 produit)

Mesure de l’activité de la CR mitochondriale par des techniques de spectrophotométrie

Traitements des clones avec la plus forte diminution d’expression de la PCCA, par des substrats anaplérotiques (citrate, aspartate…) pendant 48 à 96h

Comparaison de l’activité de la CR avant et après les traitements anaplérotiques

Sélection de clones stables contenant le plasmide par puromycine

Validation du modèle hépatocytaire par 2 clones indépendants montrant une forte inhibition de la PPCA sous traitement par doxycycline associés à une activité enzymatique très faible ( activité résiduelle de 4 %)

PuromycineSelection

Leonard J 1995, J Inherit Metab Dis 18:430-434 Mardach R, et al. 2005, Mol Genet Metab 85:286-90 Ostergaard E, et al. 2007, Brain 130:853-61 Schwab M, et al. 2006, Biochem J 398:107-12 Yano S, et al. 2003, J Inherit Metab Dis 26:481-8 Brusque M, et al. 2002, Neurochem Int 40:593-601 Alberio S, et al. 2007, Mitochondrion 7:6-12 Spinazzola A, et al. 2006, Nat Genet 38:570-5 Elpeleg O, et al. 2005, Am J Hum Genet 76:1081-6 Mochel F, et al. 2005, Mol Genet Metab 84:305-12 Roe C, et al. 2002, J Clin Invest 110:259-69

citrate

cis-aconitate

isocitrate

-ketoglutarate

succincylCoA

succinate

fumarate

malate

oxaloacétate

acétyl CoA H2O

H2O

CO2

+

CO2 +

Coenzyme A

+ CoA ADP

FADH2

NADH

NADHH2O

NADH

ATP

SDHComplexe II

pyruvate

glucose