Utilisation de la protéomique comme biomarqueur d ...contribue probablement à la cornification terminale associée à l'activation ,la prolifération et la kératinisation des kératinocytes

11

Gembloux

Facultéuniversitaire des Sciences agronomiques

Développement de biomarqueursd’exposition et d’effet par la protéomique

chez des invertébrés aquatiques pour déterminer les zones à risque et évaluer

la qualité des eaux de surface.

PromoteursPromoteursE. Haubruge, M. Paquot, J-P. Thomé, B. Wathelet

CollaborateursCollaborateursE. DePauw, L. Fagot, F. Francis, D. Leroy, L. Michel, N. Milants

22

IntroductionIntroduction

Contamination gContamination géénnééralisraliséée de la biosphe de la biosphèère par re par des polluants gdes polluants géénnéérréés par ls par l’’action de laction de l’’hommehomme

Directive Cadre 2000/60 Directive Cadre 2000/60 surveillance de la surveillance de la qualitqualitéé des eauxdes eaux

EcotoxicologieEcotoxicologie modernemoderne : 2 approches: 2 approches

Approche "Approche "classiqueclassique""

Approche basApproche baséée sur le sur l’’utilisation de utilisation de biomarqueursbiomarqueurs

33

Les Les biomarqueursbiomarqueurs

•• BiomarqueurBiomarqueur : Changement d’une réponse biologique, pouvant être mis en relation avec l’exposition à des substances chimiques ou avec les effets toxiques de celles-ci.

•• BiomarqueurBiomarqueur dd’’expositionexposition : : renseigne sur la présence dans un organisme d’une substance exogène, de ses métabolites, ou d’un produit formé par l’action du xénobiotique.

A distinguer des biomarqueursbiomarqueurs dd’’effeteffet

44

ObjectifsObjectifs

DDééveloppement de veloppement de biomarqueursbiomarqueurs chez des chez des invertinvertéébrbréés aquatiques s aquatiques

Mettre en Mettre en éévidence les effets de diffvidence les effets de difféérents rents xxéénobiotiquesnobiotiques chez ces invertchez ces invertéébrbréés s

Utilisation de mUtilisation de mééthodes molthodes molééculairesculaires ::•• ProtProtééomiqueomique•• Mesure dMesure d’’activitactivitéés enzymatiquess enzymatiques•• ……

55

GammarusGammarus pulexpulex

• Crustacé Amphipode dulçaquicole

• Petite taille (8-18 mm)

• Détritiphage vivant dans des eaux calmes et bien oxygénées

AvantagesAvantages ::Largement distribué et souvent abondant

Sensible aux polluants

Cycle de vie entièrement aquatique

Élevage en laboratoire possible

Nombreuses études

66

Le gammare comme espLe gammare comme espèèce ce sentinellesentinelle

RRééponses biochimiquesponses biochimiquesRRééponses morphologiquesponses morphologiquesFeedingFeeding rate et croissancerate et croissanceRRééponses comportementalesponses comportementalesReproductionReproduction

77

Maintien dMaintien d’’une population de une population de GammarusGammarus pulexpulex en laboratoireen laboratoire

Gammares prGammares préélevlevéés dans le Blanc Gravier s dans le Blanc Gravier àà ColonsterColonster et maintenus en et maintenus en éélevage en levage en laboratoirelaboratoire conditions de vie connues et conditions de vie connues et mamaîîtristrisééeses

ContaminationContamination de de G. G. pulexpulex àà ll’’aide de aide de diffdifféérents rents xxéénobiotiquesnobiotiques

88

Plan de travailPlan de travail

Récolte des organismes

Contamination

Elevage

99

Les Les PCBsPCBs

1 à 10 atomes de chlore

209 congénères

mono à décachlorés

• Stabilité thermique, résistance à l’oxydation et capacités diélectriques Utilisation à grande échelle

• Dispersion généralisée dans la biosphère et bioaccumulation importante

• Toxicité hépatique, diminution de fécondité, altérations du développement, …

1010

Les Les PCBsPCBs

Contamination gContamination géénnééralisralisééee de de ll’’environnementenvironnement

EffetsEffets sur les organismes sur les organismes connusconnus

XENOBIOTIQUES MODELESXENOBIOTIQUES MODELES

UtilisUtiliséés pour valider ls pour valider l’’approche approche protprotééomiqueomique

1111

Le Le ChlordChlordééconecone

Pesticide organochlorPesticide organochloréé

Largement utilisLargement utiliséé en en Guadeloupe et en Martinique Guadeloupe et en Martinique (insecticide)(insecticide)

Difficilement dDifficilement déégradablegradable

CaractCaractèère lipophile re lipophile bioaccumulationbioaccumulation

DDéérréégulateurgulateur endocrinien puissantendocrinien puissant

1212

ToxicitToxicitéé aiguaiguëë du du ChlordChlordééconecone

Espèce Valeur de la LC50 à 96h SourceCrustacés: Palaemonetes pugio 121 µg/l Schimmel & Wilson (1977)

Gammarus pseudolimnaeus 180 µg/l Sanders et al (1981)Callinectes sapidus 210 µg/l EPA (2000)

Poissons: Leisostomus xanthurus 6,6 µg/l Schimmel & Wilson (1977)Pimephales promelas 69,5 µg/l Epa (2000), Mallatt & Barron (1988)Lamproie de mer 414 µg/l Epa (2000), Mallatt & Barron (1988)Ictalarus punctatus 514 µg/l Van Veld et al (1984)

Espèce Valeur de la LC50 à 48h SourceCrustacés: Paeneus aztecus 85 µg/l EPA, 2000 in Bocquené et Franco (2005)

GammarusGammarus pulexpulexLC50 96hLC50 96h 316,2 316,2 µµgg/l/l

1313

Le Le FFéénitrothionnitrothionInsecticide organophosphoré

Substance préoccupante (Directive Européenne 76/464/CEE)

Serait inducteur de l’ERODchez l’écrevisse Procamburus clarkii(Porte et Escartin, 1998)

1414

LC50 LC50 FFéénitrothionnitrothion

LC50 96h : 4,95 4,95 µµgg/l/l

LC1 LC10 LC25 LC50 LC75 LC90 LC99

1515

Contamination Contamination in vitroin vitro des des gammaresgammares

Utilisation de boîtes de Petri en verre (100 mm x 20 mm)

Un filtre circulaire (Ø : 8,5 cm) tapisse le fond

Dans chaque boîte : 40 ml de solution aqueuse + 10 gammares

Les solutions sont renouvelées toutes les 24 heures

Durée totale d’exposition aux toxiques : 144 heures

6 solutions de toxiques :

• PCBs

-) congénère n°169 (1 µg/L)

-) congénère n°77 (10 µg/L)-) 7 congénères "traceurs" en mélange (PCBs n° 28, 52, 101, 118,

138, 153 et 180) (1 µg/L)• Chlordécone (10 µg/l)

• Fénitrothion (1µg/l)

• 3-méthylcholanthrène (10 µg/l)

Conditions de l’expérience : 15°C, alternance 16 h jour/8h nuit

1616



Contamination

Elevage

LC50 96h

Chlordecone316,2 µg/l

Fénitrothion4,95 µg/l

Analyse de l’activitéenzymatique EROD

1717

LL’’ééthoxyrthoxyréésorufinesorufine--OO--ddééééthylasethylase (EROD)(EROD)

Appartient Appartient àà la famille CYPIA1 des la famille CYPIA1 des monooxygmonooxygéénasesnases àà cytochrome P450.cytochrome P450.

Catalyse la premiCatalyse la premièère phase de dre phase de déétoxication toxication de composde composéés apolaires tels que les s apolaires tels que les PCBsPCBs..

ActivitActivitéé induite par plusieurs familles de induite par plusieurs familles de xxéénobiotiquesnobiotiques: : PCBsPCBs, dioxines, furannes, , dioxines, furannes, HAPsHAPs..

1818

LL’’ééthoxyrthoxyréésorufinesorufine--OO--ddééééthylasethylase(EROD)(EROD)

BiomarqueurBiomarqueur dd’’exposition aux exposition aux PCBsPCBs, dioxines, , dioxines, HAPsHAPs,,……

1919

Dosage de lDosage de l’’activitactivitéé ERODEROD

Protocoles classiquement utilisés AUCUNE ACTIVITE MESUREE AUCUNE ACTIVITE MESUREE

MAIS

plusieurs paramètres peuvent être modifiés

Les xénobiotiques utilisés n’induiraient pas cette activité chez G. pulex

Utilisation d’autres xénobiotiques : fénitrothion (Porte et Escartin, 1998), 3-méthylcholanthrène

2020

Le 3Le 3--mmééthylcholanthrthylcholanthrèènene

Molécule couramment utilisée dans lesétudes biochimiques

Dérégulateur endocrinien

Inducteur connu de l’activité EROD

2121


Protocoles classiquement utilisés AUCUNE ACTIVITE MESUREE AUCUNE ACTIVITE MESUREE

MAIS

plusieurs paramètres peuvent être modifiés

Les xénobiotiques utilisés n’induiraient pas cette activité chez G. pulex

Le temps d’incubation serait insuffisant

Le catalyseur utilisé ne serait pas assez efficace

La concentration en substrat serait insuffisante

Utilisation d’autres xénobiotiques : fénitrothion (Porte et Escartin, 1998), 3-méthylcholanthrène

Allongement jusqu’à 2h

Utilisation du NADH au lieu du NADPH (Snyder, 2000)

Augmentation de la concentration en substrat

2222


Les inhibiteurs de protéase classiquement utilisés pour préparer les échantillons ne seraient pas suffisants

La mesure à température ambiante ne conviendrait pas

La quantité d’enzyme dans un seul individu serait insuffisante

Ajout d’autres inhibiteurs de protéases

Essai de mesure à la température de l’élevage

Pools d’organismes

Activités toujours inférieures aux limites de détection

HYPOTHESES :

• Activité non induite par ces composés chez G. pulex

• Pas d’activité EROD chez le gammare, une autre enzyme pourrait être induite à la place

2323



Contamination

Analyse de l’activitéenzymatique ERODElevage

LC50 96h

Analyse de l’activitéenzymatique GSTs



2424

La biotransformation des polluants La biotransformation des polluants hydrophobeshydrophobes

• Phase I : Activation du xénobiotique par addition ou modification d’un groupement fonctionnel

X

X-0H

02

H20Monooxygénases à cytochrome P450

• Phase II : Conjugaison du xénobiotique activé avec un composéendogène polaire

Glutathion-S-transférases (GSTs)

2525

Les Les GSTsGSTsDosages individuels par colorimétrieConditions optimales : • pH = 6,5• T° = 25°C• Dosages sur animaux entiers

Activité GST décelée chez les gammares contaminés par différents congénères de PCBs et par le chlordecone

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

TA TNC Tacét CPCB169 CPCB77 CMix3 CChl10 CChl20

GST

(nm

ole/

min

*µg

de p

roté

ines

2626



Contamination


Protéomique

Elevage

LC50 96h




2727

La La protprotééomiqueomique

Ensemble de mEnsemble de mééthodes permettant de thodes permettant de ssééparer, identifier et caractparer, identifier et caractéériserriserll’’ensemble des ensemble des protprotééinesines relatives relatives àà un un ggéénome dans des conditions particulinome dans des conditions particulièères.res.

Modifications du Modifications du protprotééomeome apraprèès s exposition exposition àà un un xxéénobiotiquenobiotique..

2828

La protéomique

Electrophorèse-2D

ImagerieAnalyse des gels et excision des spots de protéines

Coloration des gels

X 3

Extraits de protéinestotales

2929

Gammares contaminGammares contaminéés aux s aux PCBsPCBs

G. pulex contaminés avec les PCBs coplanaires (77 et 169)

pI

pM

CB169: surexpression de 10 spots, sous expression de 3 spots

CB77: surexpression de 4 spots, sous expression de 13 spots 7 traceurs : surexpression de

8 spots, sous expression de 12 spots

G. pulex contaminés avec les 7 PCBs traceurs

pI

pM

Variation de 5 spots commune aux deux types de PCBs

3030

Gammares contaminGammares contaminéés au s au ChlordChlordééconecone

Chlordécone :

Total de 22 spots variables

pM

pI G. pulex contaminés au chlordecone

Variation spots : PCBs ≠ chlordecone

3131

Gel d’électrophorèse coloréau nitrate d’argent

Digestion à la trypsine

Protéines excisées

EFGDLVKSéquences protéiques Tag

+ Spectrométrie de masse (MS)

M/Z

Intensité

Liquid ChromatographyElectrospray Ionization

Recherche dans les bases de données

(Génomique/EST/Protéine)

M/Z

AA1

AA2AA3

AA4

Intensité

+ Spectrométrie de masse (MS)

3232

Identification des protIdentification des protééines : gammares ines : gammares contamincontaminéés aux s aux PCBsPCBs coplanairescoplanaires

Spot number Protein Fonction MW (kDA) pI (pH unit) Mowse score

52Bloom syndrome protein homolog (EC 3.6.1.-

) (xBLM) (Xenopus laevis )Participe à la réplication et à la réparation du

DNA 154,281 8,41 31

55

Enolase (EC 4.2.1.11) (2-phosphoglycerate dehydratase) (2-phospho-D-glycerate hydro-

lyase) (Homarus gammarus )

Intervient dans la glycolyse en catalysant la conversion du 2-phosphoglycerate en 2-

phosphoenolpyruvate (PEP) 47,525 5,85 28

56

Actin, cytoskeletal 1 (LPC1) (Lytechinus pictus )

Protéine bi-globulaire importante pour l'architecture et les mouvements cellulaires 42,157 5,38 130

58

Filensin (Beaded filament structural protein 1) (Lens fiber cell beaded-filament structura)

(Homo sapiens ) protéine membranaire du crystallin 74,784 5,09 35

59

Actin, aortic smooth muscle (Alpha-actin-2) (Bos taurus )

Protéine bi-globulaire importante pour l'architecture et les mouvements cellulaires 42,381 5,23 55

60

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 (EC 1.2.1.12) (GAPDH-1) (Caenorhabditis

elegans )

Intervient dans la glycolyse en catalysant la conversion du glycéraldéhyde-3-phosphate en

1,3-bisphosphoglycérate36,531 7.68 121

61

Probable arginine kinase F46H5.3 (EC 2.7.3.3) (AK) (Caenorhabditis elegans )

Catalyse la phosphorylation de l'azote des résidus guanidine de l'arginine en présence

d'ATP et d'un cation divalent avec formation de phosphorylarginine et d'ADP

44,653 6,84 26

65

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 (EC 1.2.1.12) (GAPDH-1) (Caenorhabditis

elegans )


1,3-bisphosphoglycérate36,531 7,68 121

66Catalase (EC 1.11.1.6) (Danio rerio )

Rôle dans la protection cellulaire : décompose le peroxyde d'hydrogène en eau et

en oxygène59,902 8,12 28

67Catalase (EC 1.11.1.6) (Danio rerio )

Rrôle dans la protection cellulaire : décompose le peroxyde d'hydrogène en eau et

en oxygène59,902 8,12 40

70

Arginine kinase (EC 2.7.3.3) (AK) (Drosophila melanogaster )



40,126 6,04 62

3333

Identification des protIdentification des protééines : gammares ines : gammares contamincontaminéés au s au chlordchlordééconecone

Spot number Proteine Fonction MW (kDA) pI (pH unit) Mowse score

6 Vacuolar ATP synthase subunit B (Gallus gallus )

hydrolyse d'ATP en absence de gradient de protons, rôle d'acidification de la lumière des

compartiments50,536 5,31 23

7 Tubulin beta chain (Beta tubulin) (Fragment) (Haliotis discus) formation des microtubules protofilamentaires 38,554 5,85 24

10Chaperonin homolog Hsp-60, mitochondrial

precursor (Heat shock protein 60) (Caenorhabditis elegans )

impliquée dans l'import de protéines mitochondriales et dans l'assemblage de

macromolécules, peut faciliter le repliement correct de protéines importées, peut aussi

prévenir le mauvais repliement et promouvoir le repliement et l'assemblage correct de

polypeptides dépliés générés sous des conditions de stress dans la matrice mitochondriale

60,235 5,31 63

12 Heat shock 70 kDa protein A (Caenorhabditis elegans )

chaperonnes moléculaires, fonctions cytoprotectrices (repliement des protéines, conservation des structures, transfert des

protéines à travers les membranes)

69,965 5,44 37

20 Keratin, type II cytoskeletal 2 epidermal (Cytokeratin-2e) (K2e) (CK 2e) (Homo sapiens )

contribue probablement à la cornification terminale associée à l'activation ,la prolifération et

la kératinisation des kératinocytes66,11 8,07 23

38 Probable citrate synthase, mitochondrial precursor (EC 2.3.3.1) (Caenorhabditis elegans)

enzyme mitochondriale impliquée dans le cycle de Krebs 51,793 7,68 47

39 Arginine kinase (EC 2.7.3.3) (AK) (Drosophila melanogaster )



40,126 6,04 20

42 Malate dehydrogenase, mitochondrial precursor (EC 1.1.1.37) (Homo sapiens )

enzyme qui participe à la gluconéogénèse en oxydant le malate issu de la mitochondrie 35,965 8,92 84

47Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1

(EC 1.2.1.12) (GAPDH-1) (Caenorhabditis elegans )



48Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1

(EC 1.2.1.12) (GAPDH-1) (Caenorhabditis elegans )



Tubulin alpha-1 chain (Aplysia californica )8 484,9350,686formation des microtubules protofilamentaires

3434



Contamination


Protéomique

Elevage

LC50 96h


Analyse des HSPs



3535

Les Les HSPsHSPs

«« HeatHeat ShockShock ProteinsProteins »» ((HSPsHSPs) ) PROTEINES DE PROTEINES DE STRESSSTRESS

• Gènes hautement conservés

• 5 familles :

HSP110HSP110 (110 kDa)

HSP90HSP90 (83-90 kDa)

HSP70HSP70 (68-75 kDa)

HSP60HSP60

Et la famille des ««petitespetites»» HSPHSP (15-40 kDa)

3636

Les Les HSPsHSPs•• Formes inductiblesFormes inductiblesProtectionProtection et rrééparationparation des cellules en

réponse aux stress

Chaperonnes molChaperonnes molééculairesculairesMinimisent agrégation

Facilitent le folding correct des protéines

et l’élimination des protéines dénaturées

dénaturation de protéines

•• Formes constitutives Formes constitutives Rôles dans la physiologie cellulaire basaleRôles dans la physiologie cellulaire basale

3737

Les Les HSPsHSPs

•• HSP70HSP70Famille Famille ubiquiste ubiquiste

SSééquencesquences les plus les plus conservconservéées es et les pluset les plusrréépanduespandues

Les plus Les plus sensibles sensibles àà la templa tempéératurerature

Fonction de Fonction de chaperonnes molchaperonnes molééculairesculaires

3838

Dosage des Dosage des HSPsHSPs

Contrôle de charge

(b-actine)

HSP70

3939



Contamination


Protéomique

Elevage

LC50 96h


Analyse de l’activitéenzymatique MROD

Analyse des HSPs



4040

La La mmééthoxyrthoxyréésorufinesorufine--OO--ddéémmééthylasethylase (MROD)(MROD)

CYP6G1 activité MROD

Famille largement exprimée chez les insectes

Résistance aux xénobiotiques chez la drosophileDosage de l'activité MROD chez Gammarus pulex.

0

2

4

6

8

10

12

Témoins PCB169 Fénitrothion Chlordécone

4141

ConclusionConclusion

Mise en Mise en éévidence de vidence de variations du variations du protprotééomeome suite suite àà la contamination de la contamination de G. G. pulexpulex par des par des xxéénobiotiquesnobiotiquesIdentification des protIdentification des protééinesines dont dont ll’’expression varie et des voies expression varie et des voies mméétaboliques impliqutaboliques impliquééesesUtilisation de ces protUtilisation de ces protééines pour le ines pour le ddééveloppement de veloppement de biomarqueursbiomarqueurs

Documents

Utilisation de la protéomique comme biomarqueur d ...contribue probablement à la cornification terminale associée à l'activation ,la prolifération et la kératinisation des kératinocytes