Analyses globales et nouveaux indicateurs d’exposition dans les

cellules de l’épiderme humain

Service de Génomique FonctionnelleCEA, Evry

Accidents d’irradiation

1. Identifier les personnes exposées dans une

population ?

2. Estimer une dose reçue ?

SGF

Tests classiques : un gène, une protéine marqueur

Génomique fonctionnelle : puces à ADNensemble des gènes humains

Première application à la dosimétrie biologique :S Amundson, Rad Res, 2000

human lymphocytes

SGF

Exposition humaine après accidents ou radiothérapie

systèmegastrointestinal

peau

premièrecible

indicateur

poumon

systèmehématopoïétique

Organisation de l ’épiderme humain

Couche basalecellulessouches

couche cornée

prolifération

différenciationterminale

Irradiation externe

Dosimétrie biologique

. décollement des couches supérieures « stripping »

. peu invasif. possible à plusieurs endroits et

plusieurs temps

SGF

Modèle :keratinocytes humains primaires,différenciés

en culture

Technique :puces à ADN

pour faire un screening le plus ouvert possible

SGF

Buts :

1.Fondamental : Mécanismes de la réponseglobale du kératinocyte à l’irradiation

2. Appliqué : recherche de nouveaux marqueurs d’exposition

SGF

chirurgieplastique

trypsine

kératinocytesnormaux

calcium, confluence

keratinocytesdifférenciés

Objectifs de l’étude

Caractérisation de la réponse des kératinocytes humains primaires spécifiques à

une faible dose d’irradiation ionisante

10 mGy versus 2 Gy

Recherche des gènes et des profils temporels d ’expression spécifiques

SGF

Dispositif d’irradiation

Laboratoire LREG (CEA INRA, Jouy-en-Josas)

Dosimétrie par Dosimétrie par FliFli : SPR du CEA Saclay: SPR du CEA Saclay

10 mGy Une source de 60 Co, 550 KeV d ’énergie moyenne

Débit de dose : 3 mGy / min

Durée de l’irradiation : 4 minutes

8 sources de 60 Co

Débit de dose : 300 mGy / min

Durée de l’irradiation : 8 minutes

2 Gy

1ère analyse : déterminer des GENES MARQUEURS des deux doses

Irradiation 2 Gy et 10 mGy, témoins

6h3h 72h15h 24h 48h

RNA (t)

Hybridation irradié (t) / non irradié (t)

Analyse temps par temps

Réponses dose-spécifiques

10 mcGy2 Gy

214

370

269

2 Gy : 6 % des sondes, dont 370 spécifiques

10 mGy : 5 % des sondes, dont 214 spécifiques

Analyse temps par temps :

profils spécifiques

10 mGy

0

100

200

300

400

500

3h 6h 15h 24h 48h 72hHours Post-IR

Num

bero

f gen

es Gènes spécifiques 10 mGy :

↑ ↓ 48h

Gènes communs :

↓ 48h et ↑ 72h↑

↓

2 Gy

0

100

200

300

400

3h 6h 15h 24h 48h 72hHours Post-IR

Num

bero

f gen

esGènes spécifiques 2 Gy :

↑ 3h

Gènes communs :

↑ 24h et ↓ 48h

Qui sont ces gènes ?

des facteurs de transcription, commePHD finger

PHF10 1 cGy

00,5

11,5

22,5

33,5

4

3h 6h 48h 72H

Exp

ress

ion

ratio

MicroarrayqRT-PCR

Signature moléculaire faible dose précoce

SGF

Qui sont ces gènes ?

des gènes du stress oxydatif, comme la thioredoxine

TXNL 1 cGY

0

1

2

3

4

5

6

3h 6h 48h 72H

Exp

ress

ion

ratio

MicroarrayqRT-PCR

Signature moléculaire fd tardive

SGF

Qui sont ces gènes ?

des gènes du catabolisme cellulaire, comme l’ubiquitine 2Br

UBE2B 1cGy

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3h 6h 48h 72H

Exp

ress

ion

Ratio

MicroarrayqRT-PCR

Signature moléculaire fd tardive

SGF

Familles de gènes kératines

-0,600

-0,400

-0,200

0,000

0,200

0,400

0,600

3h 6h 15h 24h 48h 72hLog

ratio

KRT19KRT6BKRT4KRT12KRT15KRT16KRT5KRT10KRT7

2 Gy, 9 gènes induits à 24 hréprimés à 48 h

1 cGy, 2 gènesréprimés à 48 h

différents

Signature 2 Gy tardive

Voies énergétiques : ATP

-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4Induction factor

Repression factor

ATP5G3ATP5C1

ATP6ECOX7B

COX6BHCS

OXA1L PFKP

PGK1 ASNS

AHCY GUSB

IARS AARS

GARS

ATP synthases Mito respiratory chainGlycolysis

Lipid metabolism Amino acid synthesis-6

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4Induction factor

ATP5G3ATP5C1

ATP6ECOX7B

COX6BHCS

OXA1L PFKP

PGK1 ASNS

AHCY GUSB

IARS AARS

GARS

ATP synthases Mito respiratory chain Glycolysis

Lipid anabolism Amino acid synthesis

Induction de voies produisant de l’énergie

Répression de voies consommant de l’énergie

Mesures d’ATP intracellulaire

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

10 Gy

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2 Gy 10 Gy

3 h

6 h

24 h

Radiation dose (Gy)

Radiation dose (Gy)

Ratio ATP irradiatedvs control cells

Ratio ATP irradiatedvs control cells

kératinocytesdifférenciés

kératinocytesproliférants

signature précoce et tardive forte dose

Confirmation dans la peau humaine ?Normal epidermis Irradiated epidermis (2 Gy 6h)

K14

ATP1a1

Cyt c

Analyse temps par temps Conclusions et Perspectives

Liste de gènes spécifiques à chaque dose

Applications dosimétriques

Puce de pronostic

Recherche fondamentale

élucider les différences entre les mécanismes de

régulation des faibles doses et des doses

modérées10 mGy

2 Gy

Analyse temps par temps Conclusions et Perspectives

Liste de gènes spécifiques à chaque dose

Applications dosimétriques

kits de PCR spécifiques kératines

test fonctionnel ATP

SGF

2ème analyse : déterminer des PROFILS temporels d’expression spécifiques

Nécessite d’avoir un témoin commun à tous les temps pour effectuer une étude cinétique

Etude basée sur les gènes modulés par l’irradiation : 850 gènes de l’étude « temps par temps »

SGF

Profils d’expression à 2 Gy

3 6 15 24 48 72

Time post-irradiation (hours)

Ratio

Vagues de réponse géniques !

2ème stratégie d’hybridation

Irradiés 2 Gy et 10 mGy

6h3h 72h15h 24h 48h6h3h 72h15h 24h 48h

ARN irradiés

Pool ARN

non irradiésHybridation

ARN irradiés (temps) / pool NI

étude en cinétique et en clustering

Analyse Cinétique

Clusters 1 & 2 Cluster 3

T3h 10 mGyT24h 10 mGyT24h 2 GyT6h 10 mGyT6h 2GyT3h 2 GyT15h 10 mGyT15h 2 GyT48h 10 mGyT48h 2 GyT72h 2 GyT72h 10 mGy

Construction d’un arbre de regroupement

Analyse en clustering

Groupes de gènes (clusters) ayant la même cinétique de réponse sur 3 jours

Analyse de clusters

3 6 15 24 48 72 3 6 15 24 48 72Temps

10 mGy 2 GyDose

profil spécifique de régulation de 38 gènes dans le temps

Co-régulation de ces 38 gènes par des séquences promotrices communes ?

Etude des promoteurs avec le logiciel APEX

Recherche sur ordinateur (in silico) de séquences régulatrices

Identification de sites de liaison de facteurs de transcription

Identification de 8 sites de liaison

de facteurs de transcription

Régulateurs potentiels des réponses

10 mGy/2 Gy

En test par des expériences d’immuno précipitation de chromatine , GATA-3

SGF

Résumé

La faible dose induit une reprogrammationgénétique des kératinocytes 6 % des sondes

Etude « temps par temps » : gènes spécifiques de chaque dose

Etude « clustering » : profils temporels spécifiques de chaque dose

Lamartine, J Cell Biochem, 2004

Franco et al., Radiation Research, in press

Génomique fonctionnelle et radioprotection

• W Park, Oncogene, 2002, lignée Jurkat et PBMCpuces à 2400 gènes

• 384 régulés par rayons γ

• relation doses et temps-dépendantes

• concept de « Radchip », puces dédiées portant des gènes

biomarqueurs de l’exposition

Génomique fonctionnelle et radioprotection

• S Amundson, NIH, biomarqueursdes lymphocytes humains périphériques

• 2000, Rad Res, 6 500 sondes20 cGy à 20 Gy, 3 gènes (DDB2, Waf1)

induction linéaire à 24 et 48 h

• 2004, Cancer Res, 6 500 sondessang de patients TBI, fractions 1,5 et 3 Gy

DDB2, Waf1,GADD45 6 h, biomarqueurs confirmés in vivo

Génomique fonctionnelle et radioprotection

• 2003, Grace M, Clin Chem (AFFRI)dosimétrie lymphocytes humains

• kit de multi PCR de terrainpour quantifier les ARNs de 4 gènes

GADD45, DDB2, BAX, MnSODinductions dose-dépendantes

Génomique fonctionnelle et dosimétrie

• points forts :. faible quantité de matériel nécessaire

ARN de 5000 cellules. reproductibilité des résultats

. technique très robuste. bientôt génome humain complet

• l’analyse globale est une technique d’avenirpour le screening et le diagnostic

SGF

Mais ….• l’analyse globale est une technique d’avenir

qui dérange…

• nouvelle manière de faire de la biologie

• demande de nouveaux outils très spécifiques, collaboration avec les bio-informaticiens

• développement (génome complet) et validation nécessaires

Comparaisons inter-plate-formesSGF