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Anomalies des gènes et leur exploration
Alain Hovnanian
Service de Génétique Médicale
Hôpital Purpan
Tél: 05 61 77 90 79 05 62 74 45 00
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
MUTATIONS
Définition: Modification du matériel génétique (maladie/polymorphisme). Variation de séquence héréditaire ou acquise
Origines:- Spontanées (endogènes) (1):
- Anomalies de la réplication de l ’ADN- les plus fréquentes (10-6 paires de bases par
génération)- erreurs de l’ADN polymérase (erreur de lecture conduisant à des mésappariements ou mismatch)- favorisées par les séquences répétées
- Accidents de recombinaison méiotique- surviennent lors de la méiose- favorisés par des séquences d ’homologie entre chromosomes- délétions, duplications, recombinaisons illégitimes
Origines des mutations (suite):
- Spontanées (2):- Déamination, en particulier de cytosine méthylée
- très fréquent en pathologie humaine- non reconnu par les systèmes de réparation de l ’ADN- ex: Arg CGA -> Stop TGA
- Dépurination- Espèces oxygène réactives (ion O2
- superoxide, radicaux libres)
- Provoquées (extérieurs):- agents génotoxiques - 3 types: . chimiques (hydrocarbones, chimiothérapie), . physiques (radioactivité naturelle et autres rayons ionisants, UV) . biologiques (virus)- normalement corrigés au cours de la réplication par les systèmes de réparation de l ’ADN- déficients dans certaines maladies génétiques (ex: xéroderma pigmentosum…)(cancers)
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Types de mutations
A - Mutations ponctuelles
B - Insertions ou délétions de plusieurs bases
C - Expansions de triplets (mutations instables)
D - Macrolésions
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
A - Mutations ponctuelles
Les plus fréquentes, extra ou intra-géniques, polymorphismes (RFLP, SNPs) ou mutations responsables de maladies génétiques
1 - Substitutions de baseDéfinition: remplacement d ’un nucléotide par un autre Leur effet dépend de leur nature et position dans le gène:
- régions codantes:- mutation silencieuse- mutation faux-sens
- changement d ’un acide aminé par un autre - conservatrice (acide aminé de même classe)
ou non conservatrice- mutation non-sens
- changement d ’un acide aminé en un codon stop prématuré (TAA, TGA, TAG)
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
1 - Substitutions de base (suite)
- régions codantes:
cas particuliers:
- codon d ’initiation de la traduction
- codon de terminaison de la traduction
- séquences « Exonic splicing enhancer »
(-> anomalie d ’épissage)
- mutation non-sens entraînant le saut de
l ’exon correspondant
(-> rétablissement de la phase)
1 - Substitutions de base (suite)
- régions non codantes:- introns:
- sites consensus d ’épissage (site donneur gt, site accepteur ag)- sites non consensus d ’épissage- site de branchement- conséquences:
-> saut d ’exon-> rétention d ’intron-> activation d ’un site cryptique d ’épissage, exonique ou intronique
- séquences régulatrices en amont du gène -> anomalies de régulation de la transcription
- séquences 3 ’UTR -> instabilité de l ’ARNm
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Exemples anomalies d ’épissage
gtgt gtag ag
c
gtgt gtag ag
a
gtgt gtag ag
stop
gt
Saut d ’exon
Activation d ’un site cryptique d ’épissage
Saut d ’exon
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Conséquences possibles des mutations de la région 3’UTR
2 - Délétion ou insertion d ’une base
- régions codantes:
entraînent un décalage du cadre de lecture
(« mutations décalantes ») conduisant le plus
souvent à un codon stop prématuré
- régions non codantes:selon leur localisation:- région promotrice; anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage- région 3 ’ UTR: instabilité ARNm
B - Insertion ou délétions de plusieurs bases (micro-délétions ou micro-insertions)
Perte ou ajout de plusieurs bases
- régions codantes:
- Si multiple de 3:
perte ou ajout d ’un ou plusieurs acides aminés
- Si non multiple de 3
entraînent un décalage du cadre de lecture
conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré
- régions non codantes:selon leur localisation:- région promotrice: anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage- région 3 ’ UTR: instabilité ARNm
6081del28
6847del27
Délétions génomiques de COL7A1 dans l’EBD dominante
Conséquences des mutationsMutation respectant le cadre de lecture:
- ex: . mutation faux-sens, insertion ou délétion multiple de
3, . anomalie d ’épissage respectant ou rétablissant la
phase
- conduisent à la synthèse d ’une protéine anormale présentant:
- le remplacement d ’un acide aminé par un autre
- la perte ou le gain d ’un ou plusieurs acides aminés
-> protéine produite, mais stabilité et/ou fonction compromises
Conséquences des mutations (suite)Mutation interrompant le cadre de lecture:
- ex: mutations non-sens, insertion ou délétion non multiples de 3
- conduisent à un codon stop prématuré pouvant entraîner:
- instabilité de l ’ARNm muté (NMRD)
- synthèse d ’une protéine tronquée ayant une extrémité
COOH anormale
- synthèse d ’une protéine amputée d ’une séquence
peptidique (saut d ’exon portant un PTC)
-> protéine non produite, ou instable et/ou non fonctionnelle
C - Expansions de triplets (mutations instables)
- Répétitions instables de triplets nucléotidiques
- Nature, nombre, localisation (région codante/non codante) variables
- Souvent maladies neuro-dégénératives
- Le plus souvent transmission autosomique dominante
- Exemples
Syndrome de l ’X fragile CGG 5 ’UTR XR Xq27
Dystrophie myotonique de Steinert CTG 3 ’UTR AD 19q13
Chorée de Huntington CAG codante AD 4p16
Ataxie de Friedreich GAA intron 1 AR 9q13
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Mutations dynamiques (expansion de triplets)
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
D - Macrolésions
- Conséquences délétères en pathologie et au cours de
l ’évolution
- Délétions de quelques centaines à plusieurs milliers de pb
- Duplications
- Fusion de gènes suite à une double cassure de l ’ADN
(ex. translocation)
- Inversions de gènes (orientation tête-bêche d ’un fragment
d ’ADN)
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Stratégies de recherche d ’anomalie des gènes(Maladie et gène connus +++)
Analyse directe
Mutation connue
de petite taille de grande taille
PCR
- Enzyme de restriction- Hybridation spécifique d ’allèles- Séquençage +++
- Longue PCR ou- Southern-blot
Identification d ’une mutation non sens de COL7A1 par séquençage
Arg->StopCGA -> TGA
EB
Mère
Père
Tropho
Arg->StopCGA -> TGA
Analyse directe (1)
Mutation inconnue
PCR
Détection:- SSCP Single strand conformational polymorphism- DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis- CSGE Conformation sensitive gel electrophoresis- DHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography
Identification:- Séquençage +++
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Technique du SSCP
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Principe des techniques du DGGE, CSGE et DHPLC
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Technique du DGGE
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Technique du DGGE
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Détection de mutation de COL7A1 par DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)
Pic d ’élution anormal
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
PCR multiplex
Analyse directe (2)
Macrolésions
Cytogénétique Biologie moléculaire
- Hybridation sur chromosome
(FISH, Fluorescent in situ hybridization)
- Southern-blot
- PCR:
Perte d ’hétérozygotie
Défaut d ’amplification de l ’ADN
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Technique du Southern blot
Analyse indirecte
Etude de marqueurs génétiques polymorphes:
- intra-géniques ou flanquant le gène
- microsatellites ou bi-alléliques
RFLP: Restriction fragment length polymorphism
SNPs: single nucleotide polymorphism
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
A
3p21
COL7A 48,948-48,980PvuIID3S1581D3S1568
D3S1588 54,62
45
50
Mb
D3S3582 43,88
D3S3629 46,47-48,91
48,985
49,48
Distance physiqueMarqueurs génétiques
Centromère
TélomèreEtude de liaison génétiqueutilisant les marqueurs de COL7A1
Chromosome 3
219 221
227 237
219 237
Père
Mère
Enfant atteintd ’EB récessive
Génotypage de marqueurs de COL7A1
219 221
227 237
219 237
Père atteint
Mère
Enfant atteintd’ EB dominante familiale
Génotypage de marqueurs de COL7A1
Père Mère
Enfant EBDR Enfant sain Trophoblaste Porteur sain
Diagnostic prénatal d ’EBDR par étude indirecte (marqueurs de COL7A1)
ADN
Génotypage (marqueurs de COL7A1)et Recherche de mutations de COL7A1
COL7A1amplifié
Sang
Diagnostic moléculaire des EB dystrophiques
Vérification des mutations
Exemples de conséquences des mutations
Codons stop prématurés
Instabilité ARNm
Protéine non produite
Allèle nul(perte de fonction)
Maladies récessivesMaladies dominantes (par haploinsuffisance)
Mutations faux-sens
Protéine qualitativement anormale
Stabilité variable
Fonction anormale(diminution, perte
ou nouvelle fonction)
Maladies récessivesMaladies dominantes (par effet dominant négatif)
Mutations d’épissage
Quelques définitions (1)
Allèle: forme alternative au locus d’un gène
Allèle nul: allèle qui ne produit pas de protéine
Allèle hypomorphe: allèle qui produit une quantité réduite de la protéine ou une protéine
moins active
Allèle néomorphe: allèle dont le produit a une nouvelle activité
Allèle antimorphe: allèle dont le produit antagonise l’activité du produit normal
Disomie uniparentale: les deux copies d’un même chromosome viennent d’un seul
parent
Empreinte: expression différentielle et réversible d’un gène selon l’origine parentale
Epigénétique: modifications de l’ADN sans altération de sa séquence (ex. méthylation
de l’ADN, acétylation des histones)
Epistasie: intéraction de plusieurs gènes pour produire un phénotype
Quelques définitions (2)
Haploinsuffisance: le produit d’un seul allèle est actif, mais en
quantité insuffisante pour une fonction normale
Haplotype: groupes d’allèles transmis ensemble
Hémizygote: présence d’un gène en une seule copie
Hétérozygote: deux allèles différents d’un même gène
Homozygote: deux allèles identiques d’un même gène
Méthylation: addition d’un groupement méthyle (-CH3) à certains
nucléotides (surtout la cytosine) interférant avec la transcription
Microsatellites: séquence de un à 10 nucléotides répétés en tandem,
souvent polymorphes
Multifactoriel: résultant de l’interaction de facteurs
environnementaux et génétiques multiples
Transition: remplacement d’une purine (A, G) en l’autre, ou une
pyrimidine (C, T) en l’autre
Transversion: remplacement d’une purine (A, G) en une pyrimidine
(C, T), ou d’une purine en une pyrimidine
Nomenclature des mutations
Mutations faux-sens: ex: c.1784G>A ou p.Gly551Glu
Mutations non-sens: ex: c.1626C>T ou p.Arg542X
Mutations d ’épissage: ex SD: c.621+1G>A
ex SA: c.622-2A>C
Délétion : ex. en phase: c.1522_1524del ou p.Phe508del
(« del » après 1er et dernier éléments délétés)
Insertion: ex. décalante: c.409_410insC ou p.Glu137ProfsX17
(« ins » après les éléments encadrants l’insertion, suivi des nucléotides
insérés)
Insertion/délétion: ex: c.112_117delinsTG (ou c.112_117delAGGTCAinsTG)
Génotypes: ex: [p.Phe508del] + [p.Gly551Glu] hétérozygote composite
ex: [p.Phe508del] + [=] hétérozygote
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Mosaïcism
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Anomalies de l’empreinte parentale
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Maladies mitochondriales
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005
Un gène = une maladie
Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005