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nnales de pathologie (2013) 33, 80—83

Disponible en ligne sur

www.sciencedirect.com

RTICLE ORIGINAL

pport de la méthode TUNEL dans l’estimation duélai post-mortem : une étude expérimentale

ontribution of the TUNEL method for post-mortem interval estimation: Anxperimental study

Anne Dorandeua, Geoffroy Lorin de la Grandmaisonb,∗

a Service de médecine légale, hôpital Lapeyronie, 371, avenue du Doyen-Gaston-Giraud,34295 Montpellier cedex 5, Franceb Service d’anatomie pathologique et de médecine légale, hôpital Raymond-Poincaré, 104,boulevard Raymond-Poincaré, 92380 Garches, France

Accepté pour publication le 16 novembre 2012

Disponible sur Internet le 19 mars 2013

MOTS CLÉSApoptose ;Méthode TUNEL ;Peau ;Délai post-mortem

Résumé L’estimation du délaiDe nombreuses méthodes ont édemeurent approximatives. Afinavec l’accroissement du délai poanimal (rat) pour étudier la relatde peau de rats et le délai post-étaient associés à l’apoptose au

statistiquement au délai post-moaprès le décès). L’application dmédecine légale est discutée.© 2012 Elsevier Masson SAS. Tou

KEYWORDSApoptosis;TUNEL method;Skin;Post-mortem interval

Summary The assessment of plogy. Many methods have been uthe hypothesis of an increased rmethod was applied in rats to stskin samples and the post-mortewere associated with apoptosis inpost-mortem interval in the earlyof the TUNEL method for estimat© 2012 Elsevier Masson SAS. All

∗ Auteur correspondant.Adresse e-mail : g.lorin@rpc.aphp.fr (G. Lorin de la Grandmaison).

242-6498/$ — see front matter © 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droitsttp://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.2012.11.002

post-mortem est d’importance majeure en médecine légale.té utilisées dans la période post-mortem précoce, mais elles

de tester l’hypothèse d’une majoration du taux d’apoptosest-mortem, nous avons appliqué la méthode TUNEL sur modèleion entre le nombre de cellules apoptotiques de prélèvements

mortem. Notre étude a montré que les processus cadavériquesniveau des cellules cutanées. Le taux d’apoptose était corrélértem dans la période post-mortem précoce (moins de 48 heurese la méthode TUNEL pour estimer le délai post-mortem en

s droits réservés.

ost-mortem interval is of major importance in forensic patho-sed in the early post-mortem period but remain rough. To testate of apoptosis increasing with post-mortem interval, TUNELudy the relationship between the number of apoptotic cells inm interval. Our study showed that the post-mortem processes

skin cells. The apoptosis rate was statistically correlated with post-mortem (less than 48 hours after death). The application

ing the post-mortem interval in forensic pathology is discussed.rights reserved.

réservés.

t-mo

Apport de la méthode TUNEL dans l’estimation du délai pos

Introduction

L’estimation du délai post-mortem est d’importancemajeure en médecine légale. De nombreuses méthodesont été utilisées dans la période post-mortem précoce,mais elles demeurent approximatives. Plus le décès estancien et plus l’estimation est entachée d’incertitude. Dansla période post-mortem précoce, l’estimation est princi-palement basée en pratique sur l’évaluation des signescadavériques, en particulier le refroidissement cadavé-rique dans des pays à climat tempéré [1]. La méthoded’Henssge permet d’estimer au mieux l’heure de la mortdans une fourchette d’environ 5 h 30 (± environ 3 heures)avec une probabilité de 95 % [1,2]. Parmi les nombreusesautres méthodes testées, notamment biophysiques et bio-chimiques, aucune n’apparaît fiable en pratique [3].

L’apoptose est une forme spécifique de mort cellulaireassociée à des aspects très caractéristiques sur le planmorphologique et biochimique : condensation de la chro-matine et du cytoplasme, fragmentation nucléaire en corpsapoptotiques, suivies de cassures de l’ADN par activa-tion de certaines endonucléases [4]. Pendant les processuscadavériques sont couramment observées des modificationscellulaires à type d’autolyse et de putréfaction [5]. Uneaugmentation du taux d’apoptose a été observée dans destissus traumatisés, sur des prélèvements post-mortem depeau et de cerveau [6,7]. Il n’est donc pas impossible queles processus cadavériques induisent une apoptose, les cel-lules étant brutalement soumises à un stress du fait d’unmilieu anoxique. Afin de tester l’hypothèse d’une majo-ration du taux d’apoptose avec l’accroissement du délaipost-mortem, nous avons appliqué la méthode TerminalTransferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) sur modèle ani-mal pour étudier la relation entre le nombre de cellulesapoptotiques de prélèvements de peau de rats et le délaipost-mortem. La peau a été choisie comme site de prélève-ment du fait de sa résistance dans la période post-mortemprécoce et de modifications apoptotiques déjà décrites mor-phologiquement sur des prélèvements post-mortem [6].

Matériel et méthodes

Trente rats albinos (Rattus norvegicus) de souche Wis-tar masculins adultes ont été sacrifiés en respectant lalégislation internationale d’euthanasie des animaux de labo-ratoire.

Le protocole suivant a été suivi : ces animaux ont tous étémaintenus à température ambiante constante (20 ◦C) aprèsleur sacrifice jusqu’à la fin des séries de prélèvements. Deséchantillons cutanés de 2 cm ont été prélevés au niveau dela partie interne de la cuisse juste après le décès, ensuitetoutes les trois heures jusqu’à la 24e heure puis toutes lessix heures jusqu’à la 48e heure. Les prélèvements cutanésont tous été effectués en peau saine, à distance de toutetache verte si cette dernière était éventuellement consta-tée. Chaque prélèvement a été immédiatement fixé dans duformaldéhyde à 10 % pendant 24 heures, puis, après déshy-dratation inclus en paraffine et coupés au microtome selondes sections de 4 �m.

Afin de détecter les cellules apoptotiques, la méthodeTUNEL a été réalisée en utilisant le kit ApopTag ONCOR©

(Q-Biogène, Illkirch, France). Cette méthode consiste en unedétection des clivages de l’ADN induit par les caspases acti-vées. Lors du clivage de l’ADN, les radicaux 3′OH sont libéréset reconnus par une transférase qui leur associe un dUTP

rtem 81

0

5

10

15

20

25

30

48363024211815129630

NBCEL

INTEN

BASAL

INTER

SUPERF

heures

Nombre de cellules

Figure 1. Nombre et intensité de marquage des cellules épider-miques en fonction de leur localisation et du délai post-mortem.Number and intensity of epidermis apoptotic cells according totheir localization and post- mortem interval.

marqué par un fluorochrome ou biotinylé. Cette techniquemanquant de spécificité, une étude immunohistochimique aété réalisée en parallèle avec l’anticorps anti-caspase 9.

Concernant la technique TUNEL, l’enzyme de détectiondes cassures de l’ADN, la TDT a été placée sur chaque lame(54 �l) pendant une heure à 37 ◦C et en atmosphère humide.L’amplification s’est faite grâce à la peroxydase. La révéla-tion a été effectuée grâce à la di-amino-benzidine (DAB).Pour obtenir un meilleur contraste, une contre-coloration àl’hématéine-éosine a été faite pendant 15 secondes. Danschaque expérience ainsi standardisée, des témoins positifset négatifs ont été utilisés. Les témoins négatifs ont étéobtenus par l’omission de l’enzymes TdT. Des prélèvementsde foie de rat, traités avec anti-FAS, ont été utilisés commetémoins positifs de la fragmentation de l’ADN.

Les cellules marquées par la technique TUNEL et parl’anticorps anti-caspase 9 ont été comptées sur toutes leslames sur trois champs contigus à fort grossissement (× 400)en distinguant les cellules des différentes couches cutanées(basale, intermédiaire et superficielle).

L’intensité du marquage a été appréciée de facon semi-

quantitative, en étant gradée de 0 à 3 :• 0 = pas de marquage ;• 1 = discret marquage du noyau ;• 2 = marquage modéré du noyau ;• 3 = intense marquage du noyau.

L’analyse a été faite en double insu par deux observateursindépendants.

Pour chaque lame examinée (une par cas et par délaipost-mortem), le nombre moyen de cellules marquées(quelle que soit l’intensité du marquage) par champ et pourchacune des trois couches épidermiques a été étudié.

L’étude statistique a été basée sur la base d’une régres-sion linéaire multiple avec tests standard de Fisher et deStudent. Le seuil de significativité était fixé à 5 %. Le logicielstatistique utilisé était le SAS.

Résultats

Les données quantitatives relatives au nombre de cellulespositives pour chaque couche de l’épiderme sont montréesdans le Tableau 1. Les mêmes résultats sont présentés sousforme d’un graphe sur la Fig. 1. L’intensité du marquageaugmente depuis le moment du décès jusqu’à la 12e heure

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Tableau 1 Nombre et intensité de marquage des cellules apodu délai post-mortem.Number and intensity of epidermis apoptotic cells according to their l

Délaipost-mortem (h)

Nombre totalde cellules

Intensité moyenne dumarquage cellulaire

Noce

0 15,5 ± 5,62 1,23 ± 0,5 153 18,67 ± 11,58 2,27 ± 0,45 106 21,83 ± 14,96 2,53 ± 0,51 9,9 20,9 ± 12,57 2,63 ± 0,49 7,

12 25,4 ± 14,13 2,97 ± 0,18 815 26,47 ± 18,26 1,73 ± 0,69 6,18 9,87 ± 12,41 1,43 ± 1,28 3,21 9,2 ± 8,58 0,8 ± 0,41 4,24 5,43 ± 5,57 0,6 ± 0,5 4,30 2,77 ± 4,07 0,37 ± 0,49 1,36 1,3 ± 2,79 0,23 ± 0,43 0,48 1,17 ± 1,78 0,33 ± 0,48 1

avant de décroître progressivement. Pour les cellules super-ficielles, le marquage maximum est observé à la 18e heure(Fig. 2). Pour les cellules intermédiaires, le marquage maxi-mum est observé à la sixième heure. À l’inverse de cetteévolution biphasique, les cellules basales montrent un mar-quage décroissant dès la troisième heure. Quel que soitle type de cellules, l’intensité et le nombre de cellulesmarquées diminuent de facon nette après la 21e heure.Les différences de marquage cellulaire selon l’évolutiondu délai post-mortem étaient statistiquement significativespour tous les types de cellules. Dans le modèle de régressionlinéaire multiple, le r2 était égal à 0,577. De plus, comptetenu des différents tests statistiques, le modèle était repro-ductible, issu d’une moyenne des résultats obtenus par lesdeux lecteurs (Tableau 1 avec les écarts-types). Des tests demulticolinéarité ont été effectués sur les variables significa-tives et ont tous été négatifs. Ainsi, les différentes variablessignificatives étaient non corrélées entre elles.

L’étude statistique multivariable a permis d’établirla formule suivante : délai post-mortem = 32,648—1,114 × basal − 6,886 × intensité + 0,209 × superficielle +0,434 × intermédiaire (± 3 heures).

Figure 2. Marquage intense des cellules épidermiques pourun délai post-mortem de 18 heures (méthode TUNEL), grossisse-ment × 400.Strong staining of epidermis cells for post-mortem interval of18 hours (TUNEL method), magnification 400 × .

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A. Dorandeu, G. Lorin de la Grandmaison

ptotiques épidermiques en fonction de leur localisation et

ocalization and post- mortem interval.

mbre dellules basales

Nombre de cellulesintermédiaires

Nombre de cellulessuperficielles

,5 ± 5,62 0 0,3 ± 6,18 8,37 ± 5,54 007 ± 6,05 8,57 ± 5,88 4,1 ± 3,3313 ± 5,12 6,27 ± 4,31 7,5 ± 4,62,2 ± 4,4 8,13 ± 4,69 9,07 ± 6,0267 ± 4,63 7,03 ± 4,93 12,9 ± 10,7633 ± 4,41 3,03 ± 3,94 3,5 ± 4,6123 ± 3,68 3,63 ± 4,27 1,17 ± 1,4207 ± 4,6 0,83 ± 1,15 0,53 ± 0,9463 ± 2,25 0,93 ± 1,64 0,47 ± 0,8297 ± 1,85 0,2 ± 0,76 0,07 ± 0,25,1 ± 1,65 0,07 ± 0,25 0

iscussion

otre étude a montré sur un modèle animal (rat) que les pro-essus cadavériques étaient associés à l’apoptose au niveaues cellules cutanées. La souche de rat utilisée dans notretude peut être considérée comme un bon modèle de laécomposition humaine et des processus apoptotiques. Leat de même souche a en effet déjà fait l’objet de plusieurstudes expérimentales ayant pour objet d’estimer le délaiost-mortem [8—13]. Les auteurs de ces études n’ont pasentionné de chronologie d’apparition des modificationsost-mortem qui soit particulière aux rats. Les modifica-ions semblent donc être similaires à celles observées cheze cadavre humain. De plus, en cas de délai post-mortemourt dans des conditions expérimentales chez le rat (moinse 24 heures), il n’a pas été constaté d’influence du délaiost-mortem sur la détection de l’apoptose [14].

D’après les résultats de notre étude, il est possible quees processus cadavériques induisent une apoptose, les cel-ules étant brutalement soumises à un stress du fait d’un

ilieu anoxique. Les résultats de notre étude sont contraires

ceux de l’étude de Sawaguchi et al. [6] qui n’a pasis en évidence d’influence du délai post-mortem sur le

ombre de cellules apoptotiques à partir de prélèvementsutanés réalisés sur des cadavres humains. Cette discor-ance pourrait être liée au fait du caractère expérimentale notre étude sur modèle animal. La voie intrinsèque de’apoptose peut être activée par différents stimuli cellu-aires ou extracellulaires tels que l’exposition à des rayonsonisants, à des agents chimiques, à des lésions de l’ADN.es études ont montré que l’hypoxie induit l’apoptose parn processus mitochondrial impliquant la libération de cyto-hrome c, l’activation de caspase 9 et clivage et activationltérieur de caspases effectrices [15]. Il n’a toutefois pas étéontré de relation entre l’hypoxie tissulaire et le dévelop-ement de l’apoptose au niveau de la peau chez le rat danses conditions expérimentales [16]. D’autres facteurs pro-poptotiques pourraient donc être impliqués. D’après notretude, les cellules de la couche superficielle de l’épidermerésentent un marquage important durant les 18 premièreseures après le décès de l’animal. Au-delà de 18 heures, leshénomènes apoptotiques ont tendance à diminuer, quelleue soit leur localisation au sein de l’épiderme. Nos résul-ats concordent avec ceux de McCall et Cohen [17] qui ontontré que la fragmentation de l’ADN est initiée au sein

t-mo

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Apport de la méthode TUNEL dans l’estimation du délai pos

des kératinocytes de la couche granulaire. Ces constata-tions permettent d’avancer l’hypothèse d’une protectiondes couches cellulaires les plus profondes de l’épiderme.Cette résistance pourrait être liée à leur immaturité. Toute-fois, il a été montré que les kératinocytes peuvent entrer enapoptose indépendamment du processus de différenciationcellulaire [18].

D’après notre étude expérimentale chez le rat, letaux d’apoptose est corrélé statistiquement au délai post-mortem dans la période post-mortem précoce (moins de48 heures après le décès). La corrélation entre le taux decellules épidermiques en apoptose et le délai post-mortempourrait faire envisager son application en médecine légalesur des cadavres humains. Plusieurs facteurs limitentd’emblée l’application d’une telle méthode en pratique.Les prélèvements ont été effectués chez des rats conservésà température ambiante constante. Les facteurs environ-nementaux sont d’importance majeure dans la chronologied’apparition des phénomènes cadavériques, en particulierla température extérieure au cadavre. L’autolyse et laputréfaction sont ainsi accélérées en cas de températuresexternes élevées. La méthode TUNEL utilisée dans notreétude nécessite un prélèvement de peau. Même s’il s’agitd’un prélèvement facilement accessible, ce prélèvementnécessiterait d’être effectué de facon très précoce aprèsla découverte du corps, au moment de la levée de corps.La biopsie cutanée étant un acte invasif, ce type de prélè-vement ne peut se faire qu’en salle d’autopsie, retardantainsi le temps de prélèvement. Le prélèvement devraitalors se faire dans une zone de peau saine, de nombreusespathologies dermatologiques étant associées à une activitéapoptotique [19]. En dernier lieu, l’âge serait un facteur

à prendre en compte, le taux d’apoptose pouvant varierselon le vieillissement cutané [20]. En raison de tous ces fac-teurs, il semble difficile d’envisager l’application de cetteméthode morphologique en routine médicolégale à partir denos résultats. D’autres études expérimentales sont à prévoir,afin de tester l’efficacité de la méthode sur un autre échan-tillon de rats. L’influence de la température ambiante seraitde plus intéressante à évaluer, sachant qu’il s’agit d’un fac-teur essentiel qui contribue aux processus post-mortem. Endernier lieu, une étude selon le même protocole est à envi-sager sur du matériel humain, en prenant en compte lefacteur de l’âge des individus.

Déclaration d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enrelation avec cet article.

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