Bases moléculaires des

LAM et classification

Aline Renneville

DES d’Hématologie Clinique

Paris, 18 Novembre 2016

1973 : t(8;21) → AML1-ETO

1983 : inv(16) → CBFB-MYH11

1991 : implication du gène MLL dans

les réarrangements 11q23

Séquençage Sanger, 1977 Séquençage Sanger

fluorescent capillaire, 1998

Avant le « haut débit »…

Translocations chromosomiques

1995-1999 : TP53, N/K-RAS,

MLL-PTD, FLT3, WT1, KIT

1999 : AML1/RUNX1

2001 : CEBPA

2005 : NPM1

Mutations géniques

Les anomalies moléculaires dans les LAM

Avec le développement des CGH et SNP-arrays

2009 : TET2 (4q24), ASXL1 (20q11), CBL (11q23)

2010 : EZH2 (7q36)

Anomalies génomiques

→ Anomalies du nombre de copies

(gains, pertes de matériel génétique)

→ Disomie uniparentale (UPD)

Découverte de nouvelles mutations récurrentes

dans la région minimale délétée et/ou cible d’UPD :

Les anomalies moléculaires dans les LAM

Delhommeau,

NEJM 2009

Depuis l’émergence du Next-Generation Sequencing (NGS)

2010 : IDH1, IDH2, DNMT3A, UTX

2011 : GATA2, PFH6, BCOR….

Découverte de nouvelles

mutations récurrentes :

Ley TJ, Nature 2008

1er génome de cancer à être

séquencé intégralement :

Les anomalies moléculaires dans les LAM

Progrès dans la caractérisation moléculaire des LAM

Grimwade et al., Blood 2015

Fréquence des principales mutations dans les LAM

TCGA study (n=200 pts)

Patel et al., NEJM 2012

n =398 pts

Top 3 (dans LAM de l’adulte) :

FLT3 (30%), NPM1 (30%), DNMT3A (20-25%),

Puis NRAS, IDH2, IDH1, TET2, WT1, CEBPA et

RUNX1 (environ 8-10 % chaque)

Classification des LAM en (sous)-groupes génétiques

Grimwade et al., Blood 2015

Classification OMS 2016

Classification OMS 2016

1) LAM avec anomalies génétiques récurrentes

NEW

NEW

NEW

NEW

NEW

Classification OMS 2016

2) LAM avec « myelodysplasia-related changes »

- Exclusion des LAM avec mutations

de NPM1 ou CEBPAdm

- Critères d’inclusion : 1 des 3

> 50% de cellules dysplasiques

dans au moins 2 lignées

ATCD de SMD

Présence d’une anomalie CG

associée aux SMD cf Table 18

NEW : La del(9q) n’est

plus considérée ici

Classification OMS 2016

4) LAM not otherwise specified (NOS) classification FAB

3) LAM « therapy-related »

5) Sarcomes myéloïdes

6) Proliférations myéloïdes associées au syndrome de Down

NEW : % de blastes désormais

toujours établi par rapport à

l’ensemble des cellules médullaires

Prolifération myéloïde transitoire (TAM), et LAM

Caractéristique commune : mutations de GATA1 et gènes de la voie JAK-STAT

Classification OMS 2016

NOUVELLE ENTITE apparue en 2016

Valeur pronostique des

anomalies moléculaires

Le caryotype reste indispensable !

n = 5876 pts

A l’origine : le génotype à 3 gènes dans les LAM-CN

Recommandations ELN 2009 : en pratique courante, évaluer le

statut mutationnel de NPM1, FLT3, et CEBPA dans les LAM-CN

Pts NPM1+/ FLT3-ITD-

NPM1+/FLT3-ITD-

CEBPA+

Autres génotypes

Döhner, Blood 2009

Vers une classification mixte cytogénétique et moléculaire

Patel et al., NEJM 2012

- 398 pts avec LAM < 60 ans

- Panel de 18 gènes

FLT3-ITD négatif FLT3-ITD positif

Vers une classification mixte cytogénétique et moléculaire

Patel et al., NEJM 2012

Classification “génomique” et pronostique des LAM

- 1540 patients

- 111 gènes étudiés dont 76 mutés

- 5234 mutations « drivers » identifiées

- ≥ 2 mutations chez 86% des patients

Classification “génomique” et pronostique des LAM

Classification “génomique” et pronostique des LAM

Favorable

CEBPA dm

NPM1

(IDH2R140 ?)

Valeur pronostique des mutations « isolées »

Dans LAM à caryo défavorable

Neutre ?

N-RAS

K-RAS

FLT3-TKD

IDH2R172

IDH2R140

IDH1R132

Controversé Défavorable

FLT3-ITD

MLL-PTD

RUNX1

ASXL1

TP53

KIT

DNMT3A ?

WT1 ?

TET2 ?

PHF6 ?

SRSF2 ?

Ddada n Dans les LAM CBF

Influence du nombre de mutations “drivers”

La survie globale est corrélée au nombre de mutations « drivers »,

indépendamment de l’âge et de la leucocytose initiale

Influence des interactions entre les mutations ?

La valeur pronostique d’une mutation est dépendante du contexte :

influence des mutations concomitantes

Rationnel biologique ??

Influence des interactions entre les mutations ?

Dans la future classification ELN 2017 (en révision à BLOOD) :

Pronostic favorable des mutations CEBPA dm et NPM1+ quel que soit le

caryotype. Les mutations CEPBA sm sont considérées comme

intermédiaires.

Prise en compte du ratio allélique FLT3-ITD (muté/WT) :

- favorable si NPM1+ et ratio < 0,5

- intermédiaire si NPM1 WT et ratio < 0,5

- défavorable si NPM1 WT et ratio ≥ 0,5.

Prise en compte des mutations ASXL1, RUNX1 et TP53 comme critère de

classification dans le groupe défavorable (quel que soit le caryotype)

Evolution de la classification ELN

Conclusion

Valeur pronostique des mutations : restreinte à une catégorie

cytogénétique… ou pas ??

Ex. Caryotype normal vs intermédiaire tel que tri 8, del(9q)…

Faut-il intégrer, outre le gène muté :

- Le type de mutation (ex. IDH2 R140 vs IDH2 R172) ?

- Le nombre total de mutations ?

- Les combinaisons de mutations (interactions gène-gène) ?

- Le ratio muté/WT (ex. FLT3-ITD) ou VAF ?

Difficulté de hiérarchiser les anomalies moléculaires entre elles et par

rapport à d’autres facteurs, notamment le caryotype

Recours à des scores pronostiques ? Modélisation bioinformatique ?

Hétérogénéité et complexité génétique

Exemple des LAM avec mutations de NPM1

Grimwade et al., Blood 2015

14 gènes étudiés

> 75 sous-groupes !!

La maladie résiduelle peut-elle nous sauver ??

Principes

Outils techniques

- approches moléculaires

- approches cellulaires

Avantages et inconvénients des différents marqueurs

Intérêts et applications cliniques

La maladie résiduelle dans les LAM

Principes

La maladie résiduelle (MRD)

Définition

Persistance d’un petit nombre de cellules leucémiques résiduelles :

- Indétectables par les techniques morphologiques (NFS, myélogramme)

- Résistantes à la chimiothérapie

- Responsables de la rechute

Cinétique de réduction de la MRD au cours du traitement

= reflet de la chimiosensibilité des cellules tumorales

Notion de cinétique

La MRD intègre :

- les facteurs pronostiques pré-thérapeutiques

- le métabolisme des drogues

- la réponse immunitaire anti-tumorale

Facteur pronostique puissant et indépendant des facteurs pré-thérapeutiques

Que mesure la MRD ?

INDUCTION CONSOLIDATION ( ALLOGREFFE)

RC hématologique

RC moléculaire

1012

1010

No

mb

re d

e c

ell

ule

s le

ucé

miq

ues

Temps

108

106

104

102

MAINTENANCE

…

Rechute

hématologique

MRD1 MRD2 MRD3 MRD4 MRD5 MRD6…..

Diagnostic

Le suivi de la MRD dans les LAM

La MRD est pronostique à tous les stades du suivi

Au cours du suivi de MRD Au diagnostic d’une LAM

Notion d’évènement rare

Pour évaluer la MRD, il faut recourir à des techniques

ayant une limite de détection basse

Limite de détection des différentes techniques

Cytologie Caryotype

FISH

CMF

RQ-PCR

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

NGS

PCR digitale

Quel(s) marqueur(s) choisir pour suivre la MRD ?

Considérer l’hétérogénéité et l’évolution clonale à la rechute

Jan et al, Oncogene 2012

Quel(s) marqueur(s) choisir pour suivre la MRD ?

Considérer l’existence d’anomalies pré-leucémiques

Shlush LI et al, Nature 2014

Genovese G et al, NEJM 2014

Jaiswal S et al, NEJM 2014

Pertinence des marqueurs potentiels de MRD

Pré-leucémiques Leucémiques Leucémiques

sous-clonales

Transcrits de fusion

NPM1

CEBPA*

RUNX1*

DNMT3A +++

TET2

IDH1

IDH2

FLT3-ITD

FLT3-TKD

RAS

PTPN11

KIT

- Sensibles

- Potentiellement

non spécifiques

- Sensibles

- Spécifiques

- Spécifiques

- Perdus dans 10-90%

des cas

Steensma et al, Blood 2015

* Si non germinales

Clonal Hematopoiesis of

Indeterminate Potential

(CHIP)

Outils techniques

Approches moléculaires :

- RQ-PCR +++

- NGS

- PCR digitale

Approches cellulaires :

Cytométrie en flux

PCR quantitative en temps réel = technique de référence

Techniques moléculaires utilisées pour le suivi de MRD

Techniques « innovantes », en développement

Séquençage de nouvelle génération (NGS)

PCR digitale

Intérêt particulier pour la quantification des mutations géniques

ponctuelles (FLT3, IDH1/2…) sur ADN génomique

Applications en recherche clinique, pas en pratique courante

En pratique, surtout utilisée dans les LAM pour

la quantification des transcrits (ARN) :

- transcrits de fusion chimérique

- expression de WT1

- mutations de NPM1

INTRODUCTION

Transcrits de fusion chimériques récurrents

- t(15;17)(q22;q12-21) / PML-RARA

- t(8;21)(q22;q22) / AML1-ETO (RUNX1-RUNX1T1)

- inv(16)ou t(16;16)(p13q22) / CBF-MYH11

- t(9;11)(p22;q23) / MLL-AF9 (KMT2A-MLLT3)

Expression aberrante de gènes

ex. surexpression de WT1 +++

Mutations géniques

ex. NPM1 +++ (A / B / D)

(FLT3-ITD et autres : en recherche)

Cibles moléculaires utilisées pour la MRD en routine

Applicables aux LAM à

caryotype normal

(= 50% des LAM)

Sonde Amorce AS Amorce S

CBFB MYH11

Système de RQ-PCR

Next-Generation MRD

VAF médian

= 3,61%

Limite de détection : 1% (jusque 0,03% pour certaines indel)

Next-Generation MRD

Avantages : permet de mesurer simultanément le site d’insertion, la

séquence, le ratio allélique, et la polyclonalité (mutations multiples)

Diagnostic Fin de

traitement

Rechute 1 Rechute 2

Bibault et al., Oncotarget 2015

Next-Generation MRD

- WGS, WES ou re-séquençage ciblé

- 50 couples diagnostic/rémission

- Seuil considéré : > 5% des cellules médullaires

(VAF 2,5%) à J30 mutations « persistantes »

Pts avec EFS > 12 mo (n=9, 111 mutations)

Pts avec EFS ≤ 12 mo (n=16, 184 mutations)

Approches cellulaires de la MRD dans les LAM

3 méthodologies analytiques différentes :

San Miguel,1997

Venditti,2000

Kern,2003

LAIP : absents dans les moelles normales

ou présents mais à taux très faible (< 0,1%)

identification « directe » au diagnostic

1) Leukemia-associated aberrant immunophenotype (LAIP)

Profil LAIP Majeur :

- exprimé significativement par au moins une partie des blastes

(hétérogénéité des blastes leucémiques !)

- non exprimé habituellement par les cellules physiologiques

- stable au cours du traitement

Un LAIP majeur peut donc être utilisé pour la détection de la MRD

CMF mulitparamétrique : suivi d’une combinaison d’aberrations

44

La « qualité » des LAIP

Les différents types de LAIP

1) Infidélité de lignées : expression aberrante d’Ag lymphoïdes

ex. CD7 ; CD56 ; CD19 dans LAM t(8;21) ; CD2 dans LAM3

2) Hyper-expression d’Ag (CD33++)

3) Sous-expression d’un Ag (DR, CD33, CD13)

4) Expression asynchrone d’Ag (CD34+ et CD65+/ CD11b+)

LAIP et MRD dans les LAM

- Le LAIP ne représente pas la totalité des blastes (2 à 70%)

- Instabilité des LAIP à la rechute (disparition totale dans 20-25% des cas)

Difficultés et limites

FS

SS SS

CD45

SS

CD34

CD14

CD65

Quel est le phénotype des CSL ??

CD34+CD38-/low CD123+ CD90-

CLL-1+ CD47+ CD44+ TIM3+ CD25+….

Mais aussi CD34- ou CD38+…

CD34+ CD38- CD123+, mais seulement 85% des pts sont CD34+

CLL-1 : présent chez environ 90% des pts

Marqueurs utilisables pour la MRD

Larsen HO, Cytometry, 2012

2) Quantification des « cellules souches leucémiques » (CSL)

3 méthodologies analytiques différentes :

Approches cellulaires de la MRD dans les LAM

Approches cellulaires de la MRD dans les LAM

3 méthodologies analytiques différentes :

3) Quantification du « différent du normal » (fenêtres vides)

Nécessite une bonne connaissance du phénotype des moelles

« normales » et des moelles de régénération

Envisageable grâce aux cytomètres de dernière génération (> 6 C)

Analyse des cellules au profil différent de la physiologie (sans connaître

le profil initial du diagnostic) : identification «indirecte »

Fenêtres immunophénotypiques sans aucune population identifiée dans

une moelle normale (ex : pop CD13-CD33+CD7+CD34+CD38-)

MRD et LAIP dans les LAM

• La sensibilité d’un résultat négatif

et

• la spécificité d’un résultat positif dépendent de:

• La « qualité des LAIP »

• Le nombre de cellules analysées

• un cluster d’évènements est requis pour la MRD

Calcul d’intervalles de confiance pour éviter FN et FP

Recommandation I-BFM Flow MRD : cluster homogène de cellules de

10-30 évènements

Performances analytiques de la MRD en CMF

Applicabilité

AML1-ETO

CBFB-MYH11

NPM1

FLT3-ITD

WT1

7-8%

7-8%

30%

(CN : 50%)

20-25%

80%

CMF (LAIP) 80%

Spécificité/LAM

Oui

Oui

Oui

Oui

Non

Relative

Stabilité

à la rechute

100%

100%

100% ?

80-90% ?

> 95%

> 75%

Technique

standardisée

Oui

Oui

Non

Non

Oui

Non

Limite de

détection

10-5

10-5

10-4 à 10-6

10-4

10-3

10-3 à 10-4

Caractéristiques des principaux marqueurs de MRD dans les LAM

MLL-AF9 5% 10-5 Oui 100% Non

PML-RARA 8-10% Oui 100% Oui 10-5

Diagnostic de LAM

Cytogénétique & Bio mol

t(8;21), inv(16),

t(15;17), t(9;11)

MRD par RQ-PCR

sur les transcrits

de fusion correspondants

NPM1 +

MRD par RQ-PCR

mutation-spécifique

(mutation NPM1 A /B /D)

NPM1 -

MRD par CMF : LAIP ?

Et / ou RQ-PCR WT1 ?

LAM sans translocations récurrentes

(CG normale, complexe, autres anomalies)

70-80 % des LAM

Choix de marqueur(s) de MRD en pratique courante

Applications cliniques et place

dans la stratification pronostique

Applications cliniques potentielles de la MRD dans les LAM

1) Mesure de la réponse précoce

2) Evaluation en fin de consolidation

3) Détection précoce des rechutes

4) Avant allogreffe de CSH

5) Après allogreffe de CSH

Stratification thérapeutique :

choix du traitement de consolidation

Envisager un traitement d’entretien

Suivi rapproché + initier la recherche de

donneur en vue d’une allogreffe

Adapter le conditionnement ? Prophylaxie ?

Moduler l’immunosuppression

Envisager injection Lc du donneur (DLI)

Traitement pré-emptif par Vidaza ?

Stratégie : LAIP

Seuil de positivité : MRD > 0,1%

Gerrit J. Schuurhuis

Impact pronostique de la MRD précoce

Post-induction Post- consolidation 1 Fin de traitement

Impact pronostique de la MRD-LAIP confirmé dans les 3

groupes de risque (favorable, intermédiaire ou défavorable)

LSC neg mais LAIP pos

LAIP neg mais LSC pos

Impact pronostique de la MRD précoce

Complémentarité des approches

cellulaires de MRD : LAIP et LSC

Impact pronostique de la MRD précoce dans les CBF

MRD AML1-ETO ou CBFB-MYH11 : résultats du protocole CBF-2006

Jourdan et al, Blood 2013

Reduction MRD2 < 3 log

Reduction MRD2 ≥ 3 log

CIR OS

Analyse multivariée incluant GB et mutations de RTK :

delta MRD2 : p<0.001 ; GB : p=0.051 ; mutations de RTK : p=0.11

Reduction MRD2 < 3 log

Reduction MRD2 ≥ 3 log

Impact pronostique de la MRD précoce dans les LAM NPM1+

OS selon la MRD post-conso 1 (MRD2)

Balsat M et al, J Clin Oncol (sous presse)

La MRD NPM1 sur sang en post-induction (MRD1) avec un seuil à 4 log

reduction permet d’identifier les pts qui bénéficient réellement de l’allogreffe

Impact pronostique de la MRD précoce dans les LAM NPM1+

Impact pronostique de la MRD en fin de traitement

La MRD-NPM1 en fin de consolidation est très prédictive du risque

de rechute et de la survie globale

Impact pronostique de la MRD en fin de traitement

Une MRD positive (> 0,001%) sur SANG en fin de traitement

(MRD4) est prédictive de l’évolution clinique (CIR et OS) n = 525 samples

La MRD sur moelle n’aurait pas d’impact pronostique

Sang

Moelle

Détection précoce des rechutes

Temps de doublement de la MRD :

36 jours 14 jours

12 jours 11 jours

LAM CBFB-MYH11+ :

délai moyen proche de 1

an la rechute moléculaire

et hématologique

Stentoft, Leuk Res 2006

Flow MRD : LAIP & LSC

En pré-allogreffe

Impact de la MRD en pré-allogreffe

Impact de la MRD en post-allogreffe

Conclusion sur la MRD dans les LAM

Quels marqueurs ? Intérêt de combiner plusieurs marqueurs et approches

(BM et CMF) du fait de l’hétérogénéité et de l’évolution du clone

leucémique à la rechute

Quel type de prélèvement ?

- Pour la BM : la tendance actuelle consisterait à privilégier le SANG plutôt

que la moelle.

- Pour la CMF : pas de données sur le sang (quantité de cellules limitante)

Intégration progressive des résultats de MRD pour la stratification

thérapeutique dans les essais cliniques pour « reclasser » les patients

et adapter le traitement de consolidation (allogreffe ou pas)

Apport des nouvelles technologies (NGS, PCR digitale) ?

- Oui pour élargir le spectre des marqueurs (mutations géniques +++)

- Pas vraiment en terme de limite de détection

Quel time point pour la stratification thérapeutique ?

La MRD2 (= après 2 cures) semble un bon compromis