Bi 231: Ingénierie des Protéines

cours 2

Plan Général

• I. Introduction et rappels.• II. Purification des protéines.• III. Surexpression d'une protéine.• IV. Mutagenèse: techniques et applications. • V. L'insuline : exemple d'une stratégie.• VI. Analyse d'articles.

31 –Cahier des charges. 32 –Expression chez E. coli

- Avantages. - Organisation générale d'un vecteur - Exemples de systèmes d'expression. - Les différentes souches de E. coli existantes - Les paramètres ajustables lors d'une surexpression

33 –Autres hôtes bactériens : avantages et inconvénients. 34 –Expression chez la levure : Hôtes et vecteurs

disponibles. 35 –Expression dans des cellules Eucaryotes supérieures

animales et végétales.

III. Surexpression d'une protéine.

31 Cahier des charges (1)

définir le(s) but(s) de cette surexpression : • tests enzymatiques => purifier la protéine tout en

conservant sa fonction• production d’anticorps spécifiques => très

grande pureté mais fonctionnalité et structure non nécessaire

• injection chez homme, animal => Absence d’impureté immunogène et/ou toxique, stérilité, absence de particules en suspension, pH, ... (normes européennes)

31 Cahier des charges (2)

définir l’origine et caractéristiques de la protéine surexprimée :

• Procaryotes, Archée, Eucaryotes primitifs, supérieurs (animal, végétal), ... => modif° post traduct°les, code génétique (fréquence des codons).

• Localisation cellulaire.• Cofacteurs.• Coexpression

En fonction de ce cahier des charges, détermination du couple vecteur-hôte

Hôtes :• Bactéries :

- E. coli- autres (L. lactis)

• Levure (S. cerevisiae, S. pombe, ...)

• Cellules animales (insectes, mammifères).

• Cellules végétales et végétaux (Arabidopsis, OGM).

Vecteurs :• plasmides : ADNdb circulaire • bactériophages (=virus des

bactéries) • Bacculovirus • Sindbis Virus

• Virus de la vaccine• EBV• TMV

32 –Expression chez E. coli

Avantages :• Culture rapide et facile

(x2 /20-30 minutes).• Génétique bien connue :

- nombreux vecteurset souches disponibles.

• milieu de culture défini

Inconvénients :• modifications post

traductionnelles

=> Méthode « par défaut » : la plus simple et la mieux définie

32 –Expression chez E. coli

+ - Système de régulation inductible

- Séquence protéique supplémentaire (purification, identification, ...)

- Origine de réplication autre

- gène rapporteur

- ...

Composition d’un vecteur• Promoteur• Origine de réplication• Site de clivage multiple (insertion du gène• gène de résistance (sélection)

32 –Expression chez E. coli

pET100/D/lacZ• 8836 nucleotides• T7 promoter: bases 209-225• T7 promoter priming site: bases 209-228• lac operator (lacO): bases 228-252• Ribosome binding site (RBS): bases 282-288• Initiation ATG: bases 297-299• Polyhistidine (6xHis) region: bases 309-326• Xpress™ epitope: bases 366-389• EK recognition site: bases 375-389• lacZ ORF: bases 405-3476• T7 reverse priming site: bases 3538-3557• T7 transcription termination region: bases 3499-3627• bla promoter: bases 3928-4026• Ampicillin (bla) resistance gene: bases 4027-4887• pBR322 origin: bases 5032-5705• ROP ORF: bases 6073-6264 (complementary strand)• lacI ORF: bases 7576-8667 (complementary strand)

Exemples de vecteurs :pET

32 –Expression chez E. coli

Exemples de vecteurs :pBAD• Topoisomerized vector for 5-minute TOPO® Cloning of Taq-generated PCR products• Enterokinase cleavage site to remove thioredoxin after protein purification (if desired)• C-terminal V5 epitope for detection and analysis with the Anti-V5 antibodies• C-terminal 6xHis tag for rapid purification with ProBond™ resin and detection with the Anti-His(Cterm) antibodies

32 –Expression chez E. coli

Exemples de vecteurs :pBAD

32 –Expression chez E. coliSystéme Gateway®

Permet d'utiliser un gène placé dans un vecteur pour des utilisations et expressions très différentes.

Basé la capacité de recombinaison spécifique du bactériophage .

32 –Expression chez E. coli

Exemples de vecteurs :pBAD

32 –Expression chez E. coli

Souches de Escherichia coli

But recherché

BL21 DH5 DH10 TOP10

Amplification/Stabilité des plasmides

souche -Esouche B-T1R souche F'

Expression de protéines souche

DE3DH5αF´IQ™

Souches

Exemple : souche BL21 DE3 : F- ompT hsdSB (rB-, mB-) gal dcm rne131 (DE3)

F- : pas de gène pour pillus; ompT: déficit en une protéase ; hsdSB (rB-, mB-) déficit en une endonucléase ; ...

32 –Expression chez E. coli

Paramètres ajustables :

• Température si basse certaines protéines sont stabilisées mais tps de culture augmente beaucoup ...

• Agitation, rapport contenant/contenu oxygénation.

• Nature du milieu.

•Types de souches (présence/absence de protéases), co expression avec autres protéines (chaperons) stabilise

• ...

33 –Autres hôtes bactériens.

Rare : Bactérie exprimant des protéines ne pouvant être produites chez E. coli

Car - cofacteur non disponible (chaîne resp.).

- surexpression homologue

- analyse génomique prot memb de Lactococcus lactis (Kunji BBA 2003, 1610 97).