Bio 1010-Rap.lab.No.3.Centrigugation Differentielle

5/13/2018 Bio 1010-Rap.lab.No.3.Centrigugation Differentielle - slidepdf.com

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1. Résumé

Le but de l¶expérience était d¶apprendre à faire les deux manières de fractionnement

cellulaire : soit le différentielle ou en gradient de densité.

Nous avons utilisé un morceau de foie de rat que nous avons centrifugé en premier

lieu à plusieurs reprises, nous avons obtenu après chaque centrifugation des culots de plus

en plus petits. Et en deuxième lieu, nous avons créé un gradient de densité entre la

solution A et B et nous avons ajouté la fraction C1, par après nous avons centrifugé pour

obtenir 5 couches ou chacune contient les organites de même densité que le liquide.

Notre principale conclusion pour la centrifugation différentielle est que le culot qui

est plus lourd se sédimente au fond de l¶éprouvette et le lysat reste en haut. Dans le cas de

la centrifugation en fonction du gradient de densité est que chaque phase contient des

particules qui ont la même densité que la phase liquide.

2. Introduction:

Dans ce laboratoire, nous avons abordé le fractionnement cellulaire par centrifugation

différentielle. Cela consiste à séparer des constituants de leur cellule grâce à

l¶homogénéisation ou en déchiquetant la membrane cellulaire avec des produits

chimiques ou en utilisant une force physique. L¶homogénéisation, quant à elle, c¶est une

méthode qui se fait à des vitesses de plus en plus fortes pour que les fractions soient de

plus en plus petites, de moins en moins denses et soient sédimentées. C¶est pour cela que

nous avons un culot au fond de l¶éprouvette remplie de surnageant. On peut aussi appeler

le culot, un surnageant.

Le fractionnement cellulaire se fait de deux manières, la première est la centrifugation

différentielle ou en milieu homogène, la deuxième est la centrifugation en gradient de

densité. Pour la première méthode, cela consiste à effectuer une série de centrifugation

successive à vitesse de plus en plus élevées. Par après, on récupère le culot et le

surnageant, et comme dit précédemment les particules seront de plus en plus petites et

moins denses et elles seront sédimentées au fond de l¶éprouvette. Pour la deuxième



méthode, cela consiste à séparer les organelles en fonction de l¶encombrement seulement

si c¶est à faible gradient, et en fonction de la densité si c¶est à fort gradient.

Dans cette expérience, nous aurons à manipuler un fragment du foie de rat qui sera le

tissu duquel nous allons séparer l¶homogénat du lysat. Pour la centrifugation dans unmilieu homogène, nous utiliserons le saccharose isotonique qui servira à «le bleu de

méthylène 0,05% dans du saccharose isotonique servira à colorier les constituants de

chaque phase du résultat de la première et deuxième partie. Pour la centrifugation basée

sur le gradient de densité, nous utiliserons la solution A qui consiste en un mélange de la

solution ±mère de Percoll 50%(V/V) avec du saccharose 0,25M, la solution mère a une

densité de 1,15g/mL. Nous utiliserons aussi une solution B qui consiste en un mélange de

la solution-mère de Percoll 70%(V/V) et avec du saccharose 0,25M. La seringue, quant à

elle, servira à faire passer la solution B et dans la solution A sans mélanger les solutions,

ainsi nous pourrons effectuer la centrifugation à différents gradient de densité.

Le but expérimental de ce laboratoire est de nous familiariser avec la centrifugation

différentielle et à gradient de densité, de pouvoir différencier l¶homogénat et le lysat et

d¶examiner les différentes phases que cela soir pour la centrifugation différentielle ou sur

gradient de sucrose.

4. Résultats

Figure#1. Fraction H (microscopie photonique, grossissement 100X, coloration bleu

de méthylène)

Grosses morceaux de tissus, bleu foncé Débris cellulaires, bleu foncé Vaisseaux sanguines

Fond bleu-gri



Figure#2. Fraction C1 (microscopie photonique, grossissement 40X, coloration bleu

de méthylène)

Débris des cellules, bleu foncé Noyaux

Figure#3. Fraction S1 (microscopie photonique, grossissement 40X, coloration bleu

de méthylènes)

Fond bleu claire Petits granulations bleus et blanc

Figure#4. Fraction C2 (microscopie photonique, grossissement 100X, coloration bleu de méthylènes)

Organelles de petite dimension

Figure #5. Fraction S2 (microscope photonique, grossissement 100X, coloration bleu

de méthylène)

Particules de très petite dimension

Figure #6. Dessin de tube conique après la centrif ugation en gradient de densité

Figure #7. Fraction a la surface (microscope photonique, grossissement 40X,

coloration bleu de méthylène)

Figure#8. Fraction dans la solution A de densité 1.09 g/ml (microscope photonique,

grossissement 40X, coloration bleu de méthylène)

Figure# 9. Fraction a l¶interface entre les solutions A et B (microscopie photonique,

grossissement 10X, coloration bleu de méthylène



Figure #10. Fraction dans la solution B de densité 1.11 g/ml (microscope photonique,

grossissement 40X, coloration bleu de méthylène)

Bande transparente

Figure#11. Fraction du culot (microscope photonique, grossissement 100X,

coloration bleu de méthylène)

5. Discussion

5.1. Centrif ugation en milieu homogène

Le broyat de foi de rat obtenu dans un milieu de saccharose isotonique glacé

(0.25M), contenait des organes cellulaires, des particules et des gros morceaux de tissu.

Avec une apparence d¶une soupe, il avait une couleur rose - orange. La séparation des

particules a été effectue sur la basse de vitesse de sédimentation, en fonction de leurs

taille.

Après le premier lavage de 5 secondes à la vitesse maximale, ont été éliminées les

grosses particules qui n¶ont pas été broyées et on obtient une fraction solide, le culot et

une partie liquide, le surnageant qui constitue l¶homogénat H. Le culot est de couleur

orange - pèche, tandis que le surnageant a la même couleur, mais plus claire. À

l¶observation au microscope photonique de cette fraction, à 100X, avec une coloration de

bleu de méthylène 0.05 %, celle-ci présente des grosses fragmentations colorées en bleu

foncées, ce qui représente selon la littérature, des débris cellulaires, des morceaux de

tissu et de vaisseaux sanguines, même des noyaux [1] (Figure # 1)

Après une centrifugation de l`homogénat de 10 min à la vitesse maximale, a été

obtenu le culot C1 et le surnageant S1. Les deux fractions ont gardées la même couleur

de pèche comme l¶homogénat H, mais plus claire. Le culot C1 a présenté des points

rouges. Les fractions ont été observées au microscope photonique à un grossissement

40X, avec coloration bleu de méthylène. Dans le culot C1 ont été visualisé des



granulations bleu foncé qui représentent des débris de cellule, des morceaux de tissus,

mais aussi des noyaux, d¶érythrocytes (globules rouges) et d¶autres organelles. Selon la

littérature, cette fraction est enrichie en mitochondries, mais contiennent aussi des

lysosomes et de peroxysomes. [1] (Figure #2). Le surnageant S1 a présenté des

granulations plus petits et moins fonce, bleus et blancs, sur un fond bleu claire,

probablement des organelles qui ne se sont pas encore sédimentées (Figure #3).

Après la dernière centrifugation de la fraction S1 pendant 30 min à une vitesse

de 10 000 g, ont été obtenues les fractions C2 et S2. A l¶observation à un grossissement

de 100X, le culot C2 a présenté une région des petits points bleus. Selon la littérature,

après une centrifugation des dizaines des minutes à une grande vitesse, est obtenue une

fraction solide qui renferme des fragmentes des RE rugueux et lisse, d¶appareil Golgi,

des microsomes [2] (Figure#4). Le surnageant S2 a présenté aussi des petits points

bleus, chose qui a démontré que même après cette dernière étape de centrifugation il

existe encore des organelles non-sédimentée et donc qu¶on n¶a pas obtenu un "cytosol"

claire (Figure#5). Il faut probablement une autre récupération de surnageant et une autre

centrifugation à une grande vitesse pendant des heures, pour obtenir un surnageant qui

contient la fraction soluble en cytosol [1].

Pour isoler des particules de densité infime ou des macromolécules hydrosolubles,la force centrifuge doit être comprise entre 100 000 g et 500 000g [2].

A été observe que les fractions obtenues par centrifugation zonale ne sont

parfaitement pures, parce que différentes particules peuvent avoir la même vitesse de

sédimentation. Cette vitesse est définie par le coefficient de sédimentation qui dépende de

la taille, de la forme et de la masse de particule. C¶est pour cela que par exemple, la zone

enrichie en mitochondrie contient aussi des lysosomes et des peroxysomes.

On peut calculer la vitesse de rotation (en rpm) pour atteindre une accélération

donnée (une force centrifuge donnée), en connaissant la valeur du rayon du rotor de la

centrifugeuse, soit en utilisant une équation mathématique (1), soit en utilisant des

nomographes



, ou

y RCF- la force centrifuge relative

y r - le rayon du rotor (cm)

y N- la vitesse de rotation (révolutions per min)

Pour obtenir une force centrifuge de 8500 g, en sachant que le rayon du rotor de la

centrifugeuse est de 10 cm, il faut une vitesse de rotation N de 8500 rev/min

Le même résultat on obtient ci on utilise un nomographe pour la détermination de la

force centrifuge relative qui comprenne trois échelles pour le rayon du rotor, la force

centrifuge relative et la vitesse de rotation. Il suffit de tracer une droite qui unit les

valeurs connues et on obtient la troisième (méthode d¶abaque).

5.2. Centrif ugation en gradient de densité

La fraction C1 a été déposée sur un gradient de densité formé dans un tube à

centrifuger, des couches superposée de solutions de saccharose de moins en moins

concentrées. Donc avant de la centrifugation on avait au dessus des couches de

saccharose, une couche qui représente un mélange d¶organites. Pendant la centrifugation

chaque organite va migrer et va s¶immobiliser dans la couche de densité égale a la sienne

[3] (Figure #6).

La foi est un organe très vascularisé, donc il contient aussi des cellules sanguines.

Après la centrifugation ont été obtenues plusieurs fractions. Chaque fraction a été

observée au microscope photonique. A la surface a été obtenue une bande de couleur

rouge-brun pale (Figure #7). Il s¶agit des lymphocytes, des cellules blanches du sang, qui

sont des cellules ovoïdes, nucléées, dont le noyau de grande taille d¶environ 7 µm, qui



occupe quasiment tout le corps cellulaire. Selon la littérature la bande de lymphocytes a

une densité d¶environ 1.063 g/ml (1.057 g/ml-1.067 g/ml). La bande suivante (solution A

de densité 1.090 g/ml) a une couleur rose ± pale et visualisé au microscope au

grossissement 40X, ne montre aucune particule, donc il s¶agit d¶une bande de saccharose

(Figure #8). A l`interface entre les solutions A et B des densités différentes, a été formée

une bande de couleur jaune-transparente. Selon la littérature il s¶agit d¶une zone qui

contient des érythrocytes ou hépatocytes. Les hépatocytes sont des cellules rouges,

anucléé, de taille plus petite que les globules blanches, mais qui se séparent à un niveau

de densité de 1.098 g/ml (1.089 g/ml- 1.105 g/ml) (Figure #9). Les globules blancs sont

beaucoup moins nombreux dans le sang que les globules rouges; les globules rouges sont

4 à 5 millions/mm3, tandis que les globules blancs sont 4 à 8000/mm3. C¶est le raison

pour laquelle ne présente la même densité de séparation. La bande suivante, dans lasolution B, de densité de 1.11 g/ml a été transparente ; on suppose qu¶il s¶agit d`une

bande de saccharose (Figure#10). Au fond de l¶éprouvette on a obtenu le culot de

couleur rouge foncé. On suppose que sont des morceaux des vaisseaux sanguins qui

donnent cette couleur. A l¶observation au microscope à un grossissement de 40X on a

observé des noyaux et d¶autres organelles (Figure #11). Les mitochondries, les

lysosomes et les peroxysomes se séparent aux densités plus grandes que 1.11 g/ml, donc

est possible qu¶on retrouve ce type d¶organites dans le culot.

6. Conclusion

La centrifugation différentielle nous a permis des séparer différentes types

des composes cellulaires (différentes organelles, leucocytes, érythrocytes). Les

fractionnés cellulaires obtenues par centrifugation en gradient de saccharose sont plus

nettes que celles obtenues par centrifugation a la vitesse de sédimentation.

La centrifugation est une méthode couramment utilisée en laboratoire

( biochimie, bactériologie, hématologie, sérologie) pour séparer ou analyser des fractions

ou des structures sub-cellulaires, des composantes cellulaires, des macromolécules (des

protéines), ou encore de purifier des virus. Un exemple d'application est l'étude du trafic


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intracellulaire ou la purification des mitochondries qui sont séparées des noyaux. Les

vitesses et les durées de centrifugation peuvent varier en fonction du type de tissus, du

tampon ou d'autres facteurs.

7. Réf érences

[1]. Science expérimentale et connaissance du vivante : la méthode et les concepts par Pierre Vignais et Paulette Vignais, pg 223

[2]. Biologie cellulaire par Marc Maillet, pg 47

[3]. Biologie moleculaire de la cellule Par David Baltimore,Harvey Lodish,ArnoldBerk,Collectif,,S. Laurence Zipursky,Laurence-S Zipursky,Paul Matsudaira,James

Darnell, pg.1664. Protocoles de laboratoire d¶enseignement BIOLOGIE CELLULAIRE sessionautomne 2011, pg.4

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