Biosynth&se des glycoprot6ines. XIV. Role des sites cytoplasmiques dans les cellules embryonnaires et rCoplasiques en culture en suspension

PIERRE EOUISBT, DANI&LE LEBRE, MARIE-BI?N~DICTE PWADAE, JEANINE G W ~ L E , ET R E N ~ GOT Labomtoire de Chioaie Bioiogique et Equige de Recherches no 66 dl4 CNRS, Facuitt de Mkdecine, Eyor?, France

Received January 26, 1970

lour so^, P., LEBME, B., PRADAL, Me-B., GRESLE, J., AND GOT, R. Biosynth6se des glycsprotkines. XIV. Role des sites cytoplasmiques dms les cellules embryonnaires et nCoplasiques en culture en suspensisn. Can. J. Bioehem. 48, 1082-1086 (1970).

Bans les cellules embryonnaires et n&plasiques en culture en suspension, la biosynthtise des chai'nes glucidiques des glycoprotkines s9eRectue en trois sites subcytoplasrniques distincts: ribosomes, membranes endoplasmiques, et phase cytoplasrnique won particulaire. Bien que les membranes endoplasmiques reprksentent le site Ie plus important sur le plan quantitatif, le fractisnnement des polysornes eonfirme la pr6sence de D-g8ucssamine A leur niveau. Ces rCsw%tats dCmontrent que la mise en place des chaines glusidiques des glycoprotCines dam les cellules en culture en suspension dCbute alors que la fraction pdypeptidique est encore fixCe aux polyssmes.

In embryonic and neoplastic cells suspended in culture mmedium, incorporation of labelled glucosamine into glycoprotein occurred in three distinct subcellular sites: endoplasmic membranes, ribosomes, and cell sap, of which the first was quantitatively the most important. The presence sf labelled glucosamine on pslysomes indicates that the carbohydrate moiety starts to become attached to the polypeptide while the glycoprotein is still linked to the poiysome.

Intrsdoction d'ineorporation d9un prksurseur radioactif, et se

La localisation des sites cytsplasmiques res- ponsables de la biosyntk&se des gIycoprotkines a fait l'objet d'un grand nombre de travaux. Ceux-ci concernent essentiellernent les cellules ascitiques d9EhrHich (9, le foie (12, 13, 15, 16, 20, 24,25,29,30), Ie corps tkyroide (1-4,30-321, et la muqueuse intestinale (17). Cependant, il s'agit dans la plupart des eas de eellules haantement sptcialis&s,-dont la vocation essentielle est la syntk2se de glycoprotkines destinkes Stre excrktkes ou secrktkes hofs des celHules. Les premiers travaux consacr6s B I'itude des sites cytoplasmiques respsnsables de cette biosynth2se dans des cellules non sp6ciaIiskes on$ kt6 rCalisCs sur des cultures de cellules embryonnaires ou de cellules nkoplasiques en csuehe monocellulaire (9, 18, 18, 19, 21). Les rksultats obtenus ont rnontrk que, si la ckaPne polypeptidique est syaltkktiske au niveau des ribosomes, il existe en revanche plusieurs sites cytoplasmiques d'incor- poration des ehaines glueidiques; la part la plus importante sur le plan quantitatif revient B ce point de vue B la fraction soluble dam le dCsoxyckolate reprksentai~t pour I'essentiel 1es membranes du rkticulum endoplasrnique et de l'ergastoplasme.

Les cellules embryonnaires ou nkoplasiques en culture en suspension one, pendant un temps relativernent long, une activitk mktabolique in- tense perrnettant aiskrnent I'Ctude des conditions

prztent B un fractionnement eellulaire prkcis. Dans ces conditions, supkrieures A celles offertes par les cellules en couche monocellulaire, il est possible d'utiliser un tel syst6rne non sp6cialisC poanr Ia rnise en kvidence du r6le des divers sites cytoplasmiques dans la biosynth6se des glycs- protkines. Les rksultats obtenus font I'objet du prksent memoire.

Materiel et Methodes Souches Celdahires et Conditions de fillstre On a utilisk deux systemes cellulaires diR6rents: un

systeme de cellules embryonnaires normales et un syst6me de cellules nkoplasiques.

Ceih6es En~brysnnaires Normales On utilise ies cellules fibrqblastiques de I'embryow de

poulet. Une suspension cellulaire servant d'inscuium initial est grkparke, B partir de 10 ernbryons de poulet au 9" jsur d9incubation, dans les conditions prickdem- ment dkcrites (10). Les cellules sgsnt introduites dam un flacon de culture de 2 litres en presence de 1 litre de milieu de culture constituC par la solution saline de Hanks et Wallace (14) we contenant ni calcium ni magnCsium, additionnk de 1 % d'hydrolysat de lactalbu- mine (Lactaibumiw Hydrolysate, enzymatic, N.B.C.), de 0.2 % d'extrait de levure (Institut Pasteur, Paris), de 8.1 "/, de glucose, de 0.881 % de glycocolle, et de 10 "/, de sCrum de veau, et cowtenant, par milliiitre, 200 unit6s de peniciiline et 58 pg de streptomycine. Ees celBuIes se multiplient a 37", l'agitatigsn continue Ctant rCalisCe par deux barreaux de Teflon horizontaux et perpendiculaires 19un it I'autre, tournant B ia vitesse de 1 tour par seconde. Dans ces conditions, on obtient en 72 h environ 2 x A 3 x 108 cellules dont la vitalit6 est vCrifide par coloration au bleu Trypan.

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Cellules Nkoplc~siqe~es On utilise des celluIes nCoplasiques de souche KB,

d'origine ectodermique humaine (6). Un inoculum initial correspondant a environ 12 x 10" cellules, obtenues aprks une prCcuIture de 3 jours en couche rnonocellulaire, est mis en suspension dans le flacon dkcrit ci-dessus, en presence de 1 Bitre du meme milieu de culture, et sournis auw rnCmes conditions d'agitatisn. On obtient en 72 h environ 5 x a 6 x lo7 cellules en suspension, dont la viabilitC est vCrifiCe comme prkcedemment.

I~ncc~rporafion d'etn Prtcurseur Radioactif Apr6s 24 h de culture en agitation continue, on

introduit dans le flacon 20 pCi de 6-3H-~-glucosamine (6-3K-~-glucosarnine, New England Nuclear, USA, activitC spkifique 1 1 50 mCi/namole). On realise dans Ies rnCmes conditions ran double marquage isotopique des glycoproteines en intrsduisant dans le milieu de culture: (a) soit 100 yCi de 6-3H-~-glu~osamine et 20 pCi d'hydrolysat de proteines-"'C de Chlorella uulgaris (CEA, France, activiti spkcifique 520.8 pCi/mg), et (b) soit 20 yCi de 1-P4C-~-glucosarnine (Montecatini. Ztalie, activitC spkcifique 905 yCi/mmsle) et 100pCi d'hy- drolysat d'amino a~ ides -~W (New England Nuclear, USA, melange de 15 amino acides). Les cellules embryonnaires normales, comme les celIules neoplasiques, incorporent le marqueur, en milieu agitC et won renouvelk, pendant une pkriode de 4-8 k.

Techniques de Fracdisn~emen& Cellulaire Fractionnement Celbuhire Total

Les cellules sont r6coltees par skdianentation a 4 "C (30 min, 2000 g), puis remises en suspension dam 10 ml de tampon Tris--HCI, pH 7.4 ('0.05 M ) - KCB (0.25 M ) - MgCla (0.805 M ) - saccharose (0.25 M ) - polyvinylsulfate de potassium (50 yg/ml), enfin brsykes a I'aide d'un homogCnCiserar Ultra-Turrax TP % 812, fonctionnant sous 1 10 V pendant 2 min. On Clirnine les cellules non broyees, les noyauw, et les mitochondries par sedimentation h 10 086 g pendant 10 min. Les ~nierosomes sont sCparCs de la phase cytoplasrnique non particulaire par ddimen- tation du "siarnageant post-mitschsndrial" pendant 1 h it I05 000 g. Les microsomes, rernis en suspension dans Be tampon prCcCdent, sont trait& par le dCsoxycholate de sodium (concentration finale 1 %). Les ribosomes sont alors sCdimentCs a 105 000 g pendant 2 h, alors que les membranes endoplasmiques demeurent dans la fraction soluble dam Be dCsoxycholate. Toutes Ies fractions sont dialyskes pendant 24 h sous eau eourante, ce qui permet d'eliminer, coanme nous l'avons vCrifiC (10) la totalite de Ba radioactivite non intCgrCe dans des structures macro- rnolCculaires.

Skparafion des Polysomes par Ia Mkthode de Penman et a!. (28)

Les cellules sont ~CcoltCes par skdimentation a froid comme pr6cedemment. ke culot est repris dans 10 rnl de solution saline de Earle (7) et lave trois fois dans cette m i k e solution. 11 est repris aprks lavage dans 5 ml de tampon Tris-HCI, pH 7.4 (0.01 M ) - KC1 (0.01 M ) - MgCla (0.0015 M), puis les celleiles sont broyCes par passage dans un homogCnCiseur de Potter avec un jeu de 0.15 mm. Les noyaux sont CliminCs par une centrifuga- tion de 10 min h 800g. Le surnageant postnuclCaire est amen6 B la concentration finale de 0.5 % en dksoxycho-

late de sodium, puis dCposC sur un gradient de 24 ml de saccharose, 5-20 %, prepare dans le tampon precedent et contenant de plus 50 pg/mB de polyvinylsulfate de potassium. On centrifuge pendant 55 min a 4 "C, dam %e rotor SW 25-1 d'uwe ultracentrifugeuse Spinco L, a la vitesse de 24 000 tours par t~~inute . On rkcolte des fractions aliquotes dont on mesure la densite optique A 260 mp et la radioactivitk.

Sipamtiore des Bolysomes par la Mkthode dc We&fstebt et nl. (33)

Les cellules, rkcoltees par sedimentation comme prd- cedemment, sont remises en suspension dans 10 ml de tampon Tris-HCl, pH 7.4 (0.05 M ) - KC1 (0.025 M ) - MgCl, (0.005 M ) - saccharose (0.2% M ) - polyvinylsulfate de potassium (50 pg/ml). On les broye a l'aide d'un homogenkiseur Ultra-Turrax TP 1812 fot~ctionnant sous 110 V pendant 2 nain. Les cellules non broykes, les noyaux, et les rnitochondries sont sedimentes a 10 000 g pendant 10 min. Le surnageant postmitochondrial est amen6 a la concentration de 1.3 O/, en dkssxyeholate de sodium, puis dCposC au sommet d'un tube de centrifuga- tion contenant 3 m1 de saccharose 1.8 A4 au fond, puis 4 ml de saccharose, 8.5 M. On centrifuge pendant 4 h h 165 000g. Le culot de polysomes obtenus est remis en suspension dans la solution tampon initiale. Aprks contrdle de la teneur en proteines par Ba rCaction de Lowry et al. (22) et dosage du RNA par spectrophotomi- trie ultraviolette (1 unite de densite optique a 260 rnp = 50 yg de WNA), Ies polysornes sont fractionnks par sedimentation en gradient linhire de saccharose, 0.3 M-1 M.

On rCcolte des fractions aliquotes dont on mesure la densite optique B 260 1a1p et la radioactivite.

Mesure de Radiunctit?itk La radioactivitC des fractions aliquotes est mesuree

apres prdcipitation par l'acide trichloracCtique h 10 %. Les prCcipitCs sont recueillis siar filtres Whatn-aan GB/5, sCches puis comptds dans un cornpteur h scintillation liquide Tri-Carb Packard, en presence de 5 ml du naCBange seintillateur suivant: 5 g/B de 2,5-diphCnyloxa- zole, 0.3 gll de 1,4-bis-2-(rnCthyl-5=ph6nyl-oxazo1yl)-ben- zene, dans le tolukne. On determine 19activitC spkcificgue par dosage des proteines a l'aide de la rnCthode de Lowry e? 01. (22).

Cekkules Ne'oplasiques CSoucFae KB) L9incorporation de la 6-3M-~-glucosamine

dans Bes diffkrentes fractions subcytoplasmiques des celluIes nCopIasiques KB en culture en suspension est rksurnke dans le Tableau I. EBle met en Cvideiace trois sites d'incorporation, dont Be plus actif est reprCsentC par les membranes endoplasmiques. Cependant, une quantitk non nkgligeable de marqueur radioactif se trouve incorporke au niveau des ribosomes.

L9Ctude par skdimentation en gradient de densitk des polysomes prkparks par la technique de Wettstein et al. (34) confirme la prksence de

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TABLEAP H Hncorporation de la 6-3H-~-glucosamine dans les

fractions subcytoplasmiques des cellules nCoplasiques humaines (soucke KB) en culture en suspension

- - -- ---

Radio- RadioactivitC activitk spkcicque des

Fractions totale glucoprotCines cytopIasmiques (c.p.m.) (c.p.rn./rng)

Ribosomes 919 6 808 Phase cytoplasmique

non particulaire 1965 1 6791 Membranes

endoplasrniques 1882 28 092 -- -

40 20 30 Fractions

FIG. 1. Sedimentation, en gradient IinCaire de sac- charose (0.3-1 A f ) de 24 ml, pendant 4 h a 25 CXXl tours par minute dam le rotor SW 25-1 d'une ultracentrifu- geuse Spinco, modele L, a 1-4 "C, des polysornes prepares k partir de celluies KB selon la methode de Wettstein eF a/. (33) apres incorporation de 6-3H-~- glucosarnine.

rnarqueur au niveau de ces structures ceIlulaires cornme le montre la Fig. 1. Un r6sultat tout A fait conforme est obtenu par sedimentation des polysomes selon la technique de Penman el al. (281, apr6s double rnarquage isotopique des cellulesbar amino a ~ i d e s - ~ H et de la gl&osamine- I"c (Fig. 2).

Cekkul~s Fibrobbastiques d9Embrysns de Psudet Ees taux d'incorporation de la C;-%-~-glu-

cosamine dans les fractions subcytoplasmiques des fibroblastes d'embrysns de poulet en culture en suspension, sont rassemblks dans le Tableau 11. On observe une activitk d'incorpsration ts6s importante au niveau des membranes endoplas- rniques et, B un degrk moindre, au niveau des ribosomes et de la phase cytsplasmique non particulaire.

EqCtude des poIysornes par ~Cdimentation seIon la mCthode de Penman et al. (28) colafirme la

Fro. 2. SCdimentation, en gradient Iineaire de sac- ckarose (5-28 %) de 24 mI, pendant 55 rnin B 24WU tours par minute dans le rotor SW 25-1 d'une ultra- centrifugeuse Spinco modele E, a -1-4 "G, des polysornes prepares A partir de ceblules akoplasiques KB, sellon la mCthode de Penman ef al. (28) apr6s incorporation de H-14C-~-glucosamine et d'amino acides-WH.

TABLEAU I1 Incorporation de Ia &aH-~-gHucosarnine dans les

fractions subcytoplasrniques dm fibroblastes d'embryons de poulet en culture en suspension

-- - - -- -- ----- -- --

Radio- Wadioactivit6 activite spkifique des

Fractions totale glycmprstCiaes cyeopIasrniques (c.p.m.) (c.p.m./rng)

Ribosomes 3397 9 597 Phase cytoplasmique

non particulaire 1565 1 939 Membranes

endoplasmiques 1841 22 727

presence de marqueur radioactif au niveau de ces structures, apr$s double rnarquage isotopique par amino acides-14@ et g I ~ c o s a m i n e - ~ ~ (Fig. 3).

Discussisam Les rCsultats que nous obtenons par l'ktude de

I'incorporation de glucosarnine radioactive dans les cellules embryonnaires et nCoplasiqeaes en culture en suspension mettent en evidence, dans le cadre de ces cellules non spkcialiskes, B9irn- portance des membranes endoplasmiques dans les m6canisrnes cytoplasmiques de biosyntk6se des chaines glucidiques des gIycoprotCines. Ceci est en accord avec Ies rCsultats obtenus au niveau des hCpatoeytes, de la muqueuse intestinale, et du corps thyroi'de. Cependant, ce site d9incor-

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FIG. 3. SCdimentation, en gradient linkire de sac- charose (5-20 "/,) de 24 mI, pendant 55 min B 24 000 tours par minute, des polysomes prCparCs ii partir de fi~oblastes d'embryons de poulet, selon la mCthode de Penman et al. (28) apres incorporation de 6 -3tI -~- glucosmine et d'amino a ~ i d e s - ~ ~ C .

poration prkpondkrant n'est pas unique; une activitk de biosynthkse se manifeste tant au niveau des ribosomes et polysomes, que de la phase cytoplasmique non particulaire. En ce qui concerne les ribosomes, les rksultats obtenus sur les cellules en culture en suspension sont en accord avec les observations faites sur les cellules nor- males ou canckreuses en couche monocellulaire (9, 10, 18, 19), sur les cellules hkpatiques (1 5, 16, 24, 25, 29), et sur les cellules de la muqueuse intestinale du rat (17). La skdimentation des polysomes, prkparks selon les mkthodes de Wettstein et al. (33) ou de Penman et 01. (28), k partir des cellules nkoplasiques humaines (souche KB) comme k partir des fibroblastes d'embryons de poulet met en Cvidence de mani2re directe la fixation de glucosamine au niveau de ces struc- tures. La prkparation des polysomes par les techniques dkcrites ci-dessus, et la prbcipitation des fractions, ainsi sCparCes par l'acide tri- chloracktique exclut la persistance de gluco- samine radioactive non intkgrke dans des macromolkcules. Un certain nombre de travaux portant essentiellement sup les cellules du corps thyroide (1-4) ont permis de supposer que les glucides constitutifs des chaines polysaccharidi- ques des glycoprotCines sont incorporks au niveau des membranes endoplasmiques apr2s que la chaine polypeptidique se soit skparke des ribosomes. Cependant, l'ensemble des rksultats acquis avec les autres systkmes cellulaires ktudiks est nettement en faveur d'une mise en place de l'osamine 'initiale' (responsable de l'uni-on de la

chaine glucidique avec la chaine polypeptidique) pendant que le polypeptide est encore fix6 aux polysomes (1 1, 23, 24, 26). 11 est certain que la majeure partie des unitks gl~rcidiques 'centrales' des chaines est mise en place par des syst2mes enzymatiques localisks au niveau des membranes endoplasmiques, alors que les unitks glucidiques 'terminales' des chaines sont incorporCes trks vraisemblablement par des systkmes enzymati- ques 1ocalisCs au niveau de la phase cytoplasmi- que non particulaire (8).

Cette dernikre observation est conciliable avec les rksultats de Neutra et Leblond (27); ces auteurs ont mis en kvidence par autoradiographie une fixation importante du fucose au niveau de l'appareil de Golgi de cellules secrktoires. Or, si cette z6ne subcellulaire est incontestablement le sikge d'une concentration par dkshydratation des produits biologiques destines a I'excrktion hors de la cellule, les rksultats obtenus par ces auteurs ne permettent pas de conclure que la n~ise en place du fucose a I'extrCmitC des chaines oligosac- charidiques ait lieu dans l'apgareil de Golgi lui-meme. En 1968, Spiro et Spiro (32) ont mis en kvidence dans les membranes endoplasmiques des cellules thyrodiennes un syst&me enzymati- que incorporant l'acide sialique ii l'extrkmitk terminale des chaines glucidiques. Cette observa- tion est parfaitement conciliable avec nos propres rksultats puisque, d'une part il s'agit de systkrnes biologiques trks diffkrents, dont l'un est A voca- tion secrktoire et que, d'autre part, ces auteurs n'ont pas cherchC si un tel systkme enzymatique existait Cgalement dans la phase cytoglasmique non particulaire.

L'ktude des cultures en suspension fournit donc des arguments en faveur de l'hypothkse prkckdemment kmise (8) d'une triple localisation, dans les cellules embryonnaires ou canckreuses, au niveau subcellulaire, des sites de biosynth2se des chainons glucidiques des glycoprotkines, la fraction des membranes endoplasmiques de- meurant la plus importante sur le plan quantitatif. Bien que la prksence d'un prkcurseur glucidique des glycoprotkines au niveau d'une fraction subcellulaire ne soit pas une preuve de l'existence d'un systkme de transglycosylation B ce niveau, elle n'en reprksente pas moins une prksomption trks grande; cette rkserve est d'ailleurs valable aussi bien pour la fraction des ribosomes, que pour celle des membranes endoplasmiques ou la phase cytoplasmique non particulaire.

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