Acta Bot. Gallica, 1999, 146 (1), 5-24.

Biosynthese des isoprenoides

par Rachida Kribii, Isabelle Soustre et Francis Karst

Laboratoire de genetique physiologique et moleculaire, IBMIG, 40 avenue du Recteur Pineau, F-

86022 Poitiers-Cedex

Resume.- Les isopreno'ides sont des metabolites importants rencontres chez tous les etres vivants. lis interviennent dans le metabolisme primaire, dans les fonctions vitales comme Ia photosynthese, Ia respiration, les hormones de crois­sance et dans le contr61e du cycle cellulaire. Dans le metabolkisme secondaire, ils permettent a Ia plante de s'adapter a son milieu et d'assurer sa protection contre les predateurs et parasites. On trouve egalement des ar6mes, des huiles essentielles. La voie de biosynthese est maintenant bien connue, autant chez les Procaryotes que chez les Eucaryotes et les organites des cellules euca­ryotes.

Mots-ctes : biosynthese des isopreno'ides - cellules procaryotes - cellules eucaryotes.

Abstract.- lsopenoids are important metabolites in all living cells. In primary metabolisl, they are found in photosynthesis, respiration, growth factors and in cell cycle control. In secondary metabolism, they interfere in plant defense against diseases and its adaptation to environmental conditions. Numerous bio­technological products come from this metabolic pathway such as aroms and essential oil components. Now this biosynthetic pathway is well known as in pro­caryotic, eucaryotic cells and organels.

Key-words :isoprenoid biosynthesis pathway- procaryotic and eucaryotic cell - main steps.

I. STRUCTURE ET FONCTIONS DES ISOPRENOIDES

Les isopn!noldes sont des metabolites ubiquistes rencontres chez tous les organismes vivants. lis incluent des composes essentiels tels les sterols (stabilite de Ia membrane des Eucaryotes, precurseurs d'hormones steroldes), les polyprenols des chaines prenylquinones dans les chlorophylles et bien d'autres composes dont Ia fonction de certains n'est pas enco­re bien elucidee.

Chappell ( 1995) a etabli une classification des isoprenoldes vegetaux et les a classes en deux categories principales :

1- Les metabolites primaires sont impliques dans des fonctions vitales telles Ia photo­synthese ( carotenoldes, chlorophylle, phylloquinone, plastoquinone), Ia respiration (ubi-

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quinone, cytochrome a), !'architecture de Ia membrane (ste­rols, triterpenoi'des), Ia regulation de Ia croissance et du deve­loppement (acide gibberellique, acide abscissique, brassinosteroides, certaines cytokinines) et Ia regulation du cycle cellulaire (proteines prenylees). 2- Les metabolites secondaires regroupent des composes per­mettant a Ia plante de s'adapter a son milieu. Ce sont, par exemple, des substances attractives des insectes qui facilitent Ia pollinisation et des substances de defense contre des infec­tions fongiques et bacteriennes (phytoalexines). On trouve aussi, parmi les metabolites secondaires, des composes qui presentent un interet biotechnologique comme le caoutchouc nature!, des aromes, des huiles essentielles ou qui possedent un

IPP

Fig. 1.- Structure de !'unite iso-prenique, l'isopentenyl diphosphate.

Fig. 1.- Structure of the isopre­nic unit, isopentenyl diphos­phate.

interet pharmacologique comme le taxol (agent a propriete antitumorale). Le point commun entre ces composes tn!s divers, et dont Ia structure est plus ou moins complexe, est leur origine biosynthetique. En effet, les isoprenoi'des derivent tous d'une meme unite a cinq atomes de carbone qui forment une chaine carbonee lineaire relative­ment simple, l'isopentenyl diphosphate : IPP (Fig. I).

La formation de l'IPP a ete largement etudiee chez Ia Levure et le tissu hepatique des Mammiferes. Ces etudes ont permis l'etablissement d'une voie de biosynthese de l'IPP a partir de l'acetyl-CoA via !'acetoacetyl CoA, le 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Co A, le mevalonate, pour aboutir a l'IPP. Cette voie de biosynthese, dite voie du mevalonate, a ete consideree comme Ia voie de biosynthese unique des isoprenoides chez tous les orga­nismes vivants. Toutefois on a montre recemment chez les bacteries et les plantes !'exis­tence d'une voie alternative independante du mevalonate et qui est abordee a Ia fin de !'article.

II. BIOSYNTHESE DES ISOPRENOIDES, VOlE DU MEVALONATE

La biosynthese des composes terpeniques est tres complexe et multibranchee (Fig. 2). On peut cependant Ia diviser en cinq processus majeurs.

L'acetyl coenzyme A est d'abord converti en isopentenyl diphosphate (IPP). L'action de diverses isoprenyl diphosphate synthases genere ensuite, a partir de l'IPP, des interme­diaires isopreniques d'ordre superieur, qui contiennent 10, 15 ou 20 atomes de carbone et qui sont le geranyl diphosphate (GPP), le farnesyl diphosphate (FPP) et le geranylgeranyl diphosphate (GGPP), respectivement. A partir de ces intermediaires, il y a formation de composes en C30 et C40, qui representent les precurseurs des sterols et des caroteno"ides. Ces precurseurs peuvent aussi subir une cyclisation et constituer le squelette de base de diverses families terpeniques, ou etre utilises dans des reactions d'alkylation pour fournir Ia chaine prenyl de composes non terpeniques.

Actuellement, plusieurs etapes de Ia voie de Ia synthese des isopreno"ides ne sont pas encore elucidees chez les plantes. Nous exposons ici un resume du processus de Ia bio­synthese en se basant, en particulier, sur les travaux effectues chez les Mammiferes et Ia Levure.

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mevalonate ,...!... HMG-CoA -4----·---· acetyi-CoA

~ Classes Exemples Fonctlons

IPP -. groupement prenyl cytokinine regulateur de croissance

b~ ar6me, parfum,

GPP ~ monoterpenes menthol interactions plante-insectes

b~ sesquiterpenes capsidiol interactions plante-pathogene

df/

FPP ~ sterols stigmasterol structure et fonction de Ia membrane

b~ ,.~ proteines prenylees proteines de type ras croissance cellulaire ,

liantle GTP

GGPP~ diterpenes acide gibberelllque regulateur de croissance, cas bene interactions plante-pathogene

~ dollchols, glycosylation, polyprenols ubiquinone, transport d'electrons.

chlorophylles, photosynthese, carotenoides photoprotectlon

Fig. 2.· Schema simplifie des differentes branches de Ia voie de biosynthese des isopreno'ides (d'apres Chappell, 1995). (a) HMG·CoA reductase, (b) prenyltransferases, (c) monoterpene syntheses, (d) sesquiterpene syntheses, (e) squalene synthase, (f) prenyl:proteine transferases, (g) diterpene syntheses et (h) phytoene synthase.

Fig. 2.· Simplified diagram of different pathways in isoprenoids biosynthesis. (a) HMG-CoA reductase, (b) prenyl­transferases, (c) monoterpene syntheses, (d) sesquiterpene syntheses, (e) squalene synthase, (f) prenyl:protein transferases, (g) diterpene syntheses et (h) phytoene synthase.

A. De l'acetyi-CoA a I'IPP Le point de depart de Ia synthese isoprenique correspond a Ia condensation de trois

molecules d'acetyl-CoA pour former le 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA). Chez les Mammiferes et Ia Levure, cette reaction requiert l'activite de deux enzymes dis­tinctes : l'acetoacetyl-CoA thiolase et Ia 3-hydroxy-methylglutaryl-CoA synthase (HMG­CoA synthase).

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l'acetoacetyl-CoA thiolase Cette enzyme catalyse Ia condensation de deux molecules d'acetyl-CoA pour former

l'acetoacetyl-CoA. Servouse eta/. (1984) ont caracterise des mutants de Levure affectes au niveau de l'activite de cette enzyme. Le gene codant l'acetoacetyl-CoA thiolase de Saccharomyces uvarum a ete isole par complementation fonctionnelle en utilisant l'un d'entre eux (Dequin eta/., 1988). Le gene correspondant chez Saccharomyces cerevisiae a ete clone par Hiser et a/. (1994) par complementation d'un mutant thermosensible, le mutant ergl0-21.

l'HMG-CoA synthase Cette enzyme permet Ia formation de l'HMG-CoA a partir de l'acetoacetyl-CoA et l'ace­

tyl-CoA. Les mutants de Levure, affectes au niveau du gene correspondant, ont ete aussi caracterises par Servouse eta/. (1984). Greenspan eta/. (1987) ont decrit un inhibiteur spe­cifique de cette enzyme, le L-659, 699. Cet inhibiteur nous a permis d'isoler, au laboratoi­re, le gene codant l'HMG-CoA synthase de Ia Levure Saccharomyces cerevisiae.

Des analyses biochimiques ont montre que, chez les plantes, ces deux reactions sont apparemment catalysees par une enzyme unique. Des etudes effectuees chez Catharanthus roseus ont montre qu'apres plusieurs etapes de purification, les deux activites n'ont pas pu etre dissociees (Van der Heijden et a/., 1994 ). Par ailleurs Weber et Bach ( 1994) ont puri­fie, a homogeneite, a partir du Radis, une proteine de 55 kDa capable d'effectuer successi­vement les deux etapes. Cette proteine aurait alors a Ia fois Ia fonction de l'acetoacetyl-CoA thiolase et celle de l'HMG-CoA synthase.

Montamat eta/. (1995) ont isole un ADNc d'Arabidopsis thaliana codant l'HMG-CoA synthase. Cet ADNc complemente les mutants de Levure affectes dans l'activite de cette enzyme (erg!! et ergl3). Cependant ces auteurs ont montre que l'ADNc ne complemente pas le mutant erglO deficient dans l'activite de l'acetoacetyl-CoA thiolase. De plus, le dosage des activites enzymatiques, dans un extrait proteique de Ia Levure transformee, montre que cet ADNc coderait une proteine possedant l'activite HMG-CoA synthase, mais depourvue de l'activite acetoacetyl-CoA thiolase. Ce resultat contredit !'hypothese selon laquelle les deux activites seraient presentes sur un meme polypeptide. Recemment, Vollack et Bach (1996) ont clone un ADNc codant une acetoacetyl-coenzyme A thiolase de Radis par complementation fonctionnelle du mutant erg I 0 de Saccharomyces cerevi­siae.

l'HMG-CoA reductase L'HMG-CoA reductase catalyse Ia synthese de l'acide mevalonique a partir d'HMG­

CoA. La reaction se fait par deux reductions successives en utilisant deux molecules de NADPH. C'est une enzyme qui a ete tres etudiee chez les Mammiferes, chez qui elle est consideree comme Ia premiere etape limitante dans Ia synthese du cholesterol (Goldstein & Brown, 1990).

Chez Saccharomyces cerevisiae, deux genes codant l'HMG-CoA reductases ont ete iso­les par Sasson eta/. (1986) en criblant une banque d'ADN avec une sonde issue de l'ADNc codant l'HMG-CoA reductase de !'Hamster (Chin eta/., 1982).

Chez les plantes, l'HMG-CoA reductase est codee par une famille de genes dont le nombre depend des especes. L'analyse des transcrits de ces genes montre que, suivant les especes, ces genes presentent une expression differentielle, en fonction des tissus ou des conditions physiologiques de Ia plante. Ces isoenzymes seraient par consequent impli-

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quees dans des syntheses specifiques d'isoprenoi:des (Dean et a/., 1991 ; Narita et a/., 1991 ; Chye eta/., 1992 ; Enjuto et a/., 1994, 1995 ; Lumbreras eta/., 1995).

phosphorylation du mevalonate La synthese de l'IPP, a partir du mevalonate, consiste en une phosphorylation sequen-

tielle du mevalonate en trois etapes : - Ia formation du mevalonate 5-phosphate : cette reaction est catalysee par Ia mevalona­te kinase et necessite de l'ATP. Le gene ERG 12, codant Ia mevalonate kinase de Ia Levure, a ete isole par Oulmouden et Karst (1990), par complementation de Ia souche mutante erg12-l (Karst & Lacroute, 1977). Un ADNc codant Ia mevalonate kinase a ete isole du foie de Rat par Tanaka et a/. ( 1990) et celui codant !'enzyme chez !'Homme par Schafer et a/. (1992). Enfin, l'ADNc codant Ia mevalonate kinase de Ia plante Arabidopsis thaliana a ete isole au laboratoire (Riou eta/., 1994) par complementation du mutant de Levure ergl2-l. - Ia formation du mevalonate diphosphate : cette reaction, consommant de l'ATP, est catalysee par Ia mevalonate phosphate kinase. Le gene codant cette enzyme chez Ia Levure a ete clone par Tsay et Robinson ( 1991 ), par complementation d'un mutant isole par Karst et Lacroute (1977). - le mevalonate diphosphate subit une deshydratation-decarboxylation pour donner l'IPP. La reaction est catalysee par Ia mevalonate diphosphate decarboxylase. Recemment, le gene de Ia Levure a ete isole par purification de Ia proteine et sequen9age de peptides issus de Ia digestion trypsique de Ia proteine (Toth & Huwyler, 1996)et par complemen­tation fonctionnelle d'un mutant de Levure (Berges et a/., 1997).

l'isomerisation de l'JPP L'IPP n'est pas suffisamment reactif pour initier Ia condensation en terpenoi:des supe­

rieurs. Pour cette raison, il est d'abord isomerise en son ester allylique : le dimethylallyldi­phosphate (DMAPP) sous !'action de l'isopentenyl diphosphate isomerase. Le gene codant l'isopentenyl diphosphate isomerase de Saccharomyces cerevisiae a ete isole par Anderson et a/. ( 1989a), apres purification de Ia proteine et sequen9age de Ia partie N-terminale. L'enzyme de plante a ete purifiee et caracterisee chez le Poivron (Dogbo & Camara, 1987) et chez Ia Jacinthe (Liitzow & Beyer, 1988).

B. Action des isoprenyl diphosphate synthases Les isoprenyl diphosphate synthases, aussi appelees 1 '-4 prenyltransferases ou prenyl­

transferases monofonctionnelles, permettent Ia formation des composes en C 10, C 15 et C20. La reaction se fait par condensation d'une unite isoprenique homoallylique, l'IPP, sur un substrat allylique (Poulter & Rilling, 1981 ), ce substrat pouvant etre le DMAPP, le GPP ou le FPP.

Ia geranyl diphosphate synthase La geranyl diphosphate synthase catalyse la formation du geranyl diphosphate (GPP)

par condensation d'une molecule d'IPP sur une molecule de DMAPP (Heide & Berger, 1989) (Fig. 3 ). Cette enzyme a pu etre caracterisee chez certains micro-organismes comme Micrococcus lysodeikticus (Sagami eta/., 1978).

Chez les plantes superieures, le GPP est le precurseur de nombreux monoterpenes (Banthorpe et a/., 1972 ; Croteau, 1987). II est aussi implique dans Ia biosynthese de quelques alcaloi:des qui presentent un interet pharmaceutique (l'ajmalicine et Ia serpenti-

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~·~~T~~e PPi

Fig. 3.- Reaction catalysee par Ia geranyl diphosphate synthase (d'apres Heide & Berger, 1989).

Fig. 3.- Geranyl diphosphate synthase reaction (according to Heide & Berger, 1989)

ne), ce qui explique les nombreuses etudes realisees sur Ia synthese du GPP chez les plantes. La GPP synthase a ete caracterisee chez Lithospermum erythrorhizon (Heide & Berger, 1989), Salvia officina/is (Croteau & Purkett, 1989), Pelargonium roseum (Suga & Endo, 1991 ). L'enzyme a ete purifiee, a homogeneite, a partir de cellules de Vilis vinifera par Clastre eta/. ( 1993). Aucun gene ou ADNc codant cette enzyme n'a encore ete isole.

Ia farnesyl diphosphate synthase La FPP synthase catalyse une reaction de condensation sequentielle d'une molecule

d'IPP avec le DMAPP et le GPP pour aboutir a Ia formation du FPP (Poulter & Rilling, 1976). Les deux etapes de Ia reaction sont schematisees sur Ia figure 4.

~· ~OPPT~OPP;- ~OFP DMAPP IPP PPi GPP PPi FPP

Fig. 4.- Reactions catalysees par Ia FPP synthase (d'apres Sheares et a/.,-1989). Fig. 4.- FPP synthase reaction (according to Sheares eta/., 1989).

Cette enzyme a ete caracterisee biochimiquement chez Saccharomyces cerevtszae (Eberhardt & Rilling, 1975), ainsi que dans le foie de Poulet (Reed & Rilling, 1975), le foie de Pore (Barnard & Popjak, 1980) et le foie humain (Barnard & Popjak, 1981 ).

Chez les vegetaux, les FPP synthases ont ete caracterisees chez le Poivron (Hugueney & Camara, 1990), le Potiron (Ogura eta/., 1968) et le Po is (Allen & Banthorpe, 1981 ).

De meme, plusieurs genes et ADNc, codant cette enzyme, ont ete isoles chez plusieurs organismes, tels que Saccharomyces cerevisiae (Anderson et a/., 1989b ; Chambon eta/., 1990), le Rat (Clarke et a/., 1987 ; Ashby & Edwards, 1989), !'Homme (Sheares et a/., 1989 ; Wilkin eta/., 1990) et Escherichia coli (Fujisaki et a/., 1990). Chez les plantes, un ADNc codant Ia FPP synthase a ete isole chez Arabidopsis tha/iana par complementation du mutant erg20 de Saccharomyces cerevisiae (Delourme eta/., 1994) et deux ADNc chez le Lupin (Attuci eta/., 1995). Cunillera eta/. ( 1996) ont isole deux genes qui codent Ia FPP synthase d'Arabidopsis thaliana et montre que leur expression est differente au niveau tis­sulaire. Recemment, un ADNc codant Ia FPP synthase a ete isole chez le Mai"s (Li & Larkins, 1996)

Ia geranylgeranyl diphosphate synthase La geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPP synthase) catalyse Ia formation du

GGPP par condensation d'une molecule de FPP sur une molecule d'IPP (Fig. 5). II a ete demontre que Ia GGPP synthase est impliquee dans Ia formation des diterpenes

et des carotenoi"des (Kuntz et a/., 1992) et intervient dans Ia prenylation des proteines

OPP

FPP +

~ PPi

GGPP

Fig. 5.- Reaction catalysee par Ia GGPP synthase (d'apres Kuntz et at., 1992). Fig. 5.- GPP synthase reaction (according to Kuntz eta/., 1992).

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~OPP IPP

OPP

(Rilling et a/., 1990). La decouverte de ce role important a motive de nombreuses etudes concernant cette enzyme.

La GGPP synthase a ete purifiee et caracterisee chez Capsicum annuum (Dobgo & Camara, 1987), Sinapis alba (Laferriere & Beyer, 1991 ), Methanobacterium thermoformi­cium (Tachibana et a/., 1993) et Methanobacterium thermoautotrophicum (Chen & Poulter, 1993 ).

Les genes et les ADNc codant Ia geranylgeranyl diphosphate synthase ont ete isoles chez de nombreux organismes : Erwinia herbicola (Math eta/., 1992), Sulfobolus acido­caldarius (Ohnuma et a/., 1994) et Methanobacterium thermoautotrophicum (Chen & Poulter, 1994). Chez les Eucaryotes, le gene Albino3 de Ia levure Neurospora crassa a ete iso1e par Carattoli et a/. ( 1991 ). Ce gene code une GG PP synthase dont Ia regulation trans­criptionnelle est dependante de Ia lumiere. Kuntz eta/. ( 1992) ont isole un ADNc codant Ia GGPP synthase de Capsicum annuum. Le gene codant cette enzyme a ete isole par Badillo et a/. (1995).

Jiang eta/. (1995) ont isole le gene BTSJ qui supprime Ia mutation bet2-l, affectant Ia geranylgeranyl transferase de type II chez Ia Levure Saccharomyces cerevisiae. Le gene BTSJ code Ia geranylgeranyl diphosphate synthase. Les auteurs montrent que le gene BTSJ n'est pas essentiel pour Ia croissance des Levures en phase vegetative, mais sa disruption empeche Ia geranylgeranylation de plusieurs proteines et rend les cellules sensibles au froid.

C. Les prenyl transferases bifonctionnelles Ces enzymes catalysent une condensation tete-tete de deux substrats allyliques diphos­

phates suivi d'un rearrangement 1'-1 de l'intermediaire forme (Fig. 6).

Ia squalene synthase Le squalene est le precurseur des sterols. La synthese du squalene est catalysee par Ia

squalene synthase a partir de deux molecules de FPP. La reaction se deroule en deux etapes : les deux molecules de FPP sont condensees en pre-squalene diphosphate, un intermediaire qui est ensuite rearrange en squalene (Fig. 6A). Cette reaction necessite Ia presence du NADH ou du NADPH.

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Le squalene represente le premier produit specifique de Ia synthese des sterols. Cette branche issue de Ia voie des isoprenoldes a ete tres etudiee en particulier chez Ies Mammiferes avec l'objectif d'elucider le processus de regulation de Ia synthese du choles­terol.

Des mutants de Saccharomyces cerevisiae, defectifs dans l'a:ctivite de Ia squalene syn­thase, ont ete identifies parmi une collection de mutants bloques dans Ia voie de biosyn­these d'ergosterol (Karst & Lacroute, 1977). Ces souches ont ete designees erg9. Ces mutants sont incapab1es de convertir 1e mevalonate en squalene et 1es cellu1es accumulent le farnesol, produit de degradation du FPP. Ces mutants sont a l'origine des premieres etudes moleculaires de Ia squalene synthase. Ainsi, le gene ERG9 codant Ia squalene syn­thase de Ia Levure Saccharomyces cerevisiae a ete clone par complementation du mutant erg9 (Fegueur et al., 1991 ; Jenning et al., 1991 ).

McKenzie et al. ( 1992) ont determine Ia sequence de Ia region N-terminale et Ia sequen­ce d'un peptide endogene issu de Ia digestion trypsique de Ia proteine tronquee de Rat Ceci a permis a ces auteurs de choisir des oligonucleotides et de cloner, par PCR, un ADNc codant Ia squalene synthase du foie de Rat.

Le clonage d'autres ADNc codant des squalene synthases de Souris (Inoue eta!., 1995), de !'Homme (Summers et al., 1993 ; Robinson et a!., 1993 ), de Schizosaccharomyces pombe (Robinson et al., 1993) et de Ia plante Arabidopsis thaliana a ete realise (Nakashima et al., 1995 ; Kribii eta!, 1997).

Ia phytoene synthase La phytoene synthase a ete purifiee a partir de chromoplastes de Capsicum annuum

(Dogbo et al., 1988). Le gene codant Ia phytoene synthase du champignon Neurospora crassa a ete isole par Schmidhauser eta!. (1994 ).

Chez Ia Tomate, un ADNc correspondant a un ARNm accumule lors de Ia maturation des fruits a ete isole et identifie comme une polygalacturonase. Bartley et a!. ( 1992) ont montre qu'il s'agissait de l'ADNc de PSYJ codant Ia phytoene synthase. Un deuxieme ADNc codant une phytoene synthase PSY2 a ete clone par Bartley et Scolnik (1993). Les genes PSYJ et PSY2 ont une expression ditferente : le gene PSYJ est preferentiellement exprime dans les jeunes plants et les fruits murs, tandis que les transcrits de PSY2 sont abondants dans les feuilles matures. Le gene de Ia phytoene synthase a aussi ete isole du Mals (Buckner et al., 1990), du Poivron (Romer et al., 1993), d'Arabidopsis thaliana (Scolnik & Bartley, 1994) et du Melon (Karvouni eta!., 1995).

Les carotenoldes sont tres repandus dans Ia nature et essentiellement synthetises par les plantes, mais ils le sont aussi par plusieurs micro-organismes. La synthese des carotenoldes a ete etudiee chez ditferentes bacteries dont certaines sont photosynthetiques telles Rhodobacter capsulatus (Armstrong et a/., 1989 ; Armstrong et al., 1990a), Erwinia ure­dovora et Erwinia herbicola (Misawa et a!., 1990). Chez ces trois especes bacteriennes, une famille de genes impliques dans Ia biosynthese des carotenoldes et appeles crt ont ete isoles. Ces genes se retrouvent groupes dans une meme region du genome. Les genes crtB codant Ia phytoene synthase ont ete clones chez deux Cyanobacteries : Cyanobacterium synechococcus (Chamovitz et al., 1992) et Cyanobacterium synechocystis (Martinez-Ferez et al., 1994).

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A:

+ PPO~ FPP FPP

+ J condensation 1'- 2- 3 PPi, H ~ f

pn!squalene

NADPH 1 . op+ rearrangement1'- 1

PP1,NA

squalene

8:

PPO + PPO

GGPP GGPP

~ condensation 1'- 2 - 3

prephytoene

~ rearrangement 1'- 1

phytoene

Fig. 6.- Mecanisme de reaction des deux prenyl transferases bifonctionnelles. A, squalene synthase ; B, phytoene synthase.

Fig. 6.- Two prenyl transferase reactions. A, squalene synthase; B, phytoene synthase.

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D. Les prenyl transferases de transfert Ces enzymes sont responsables du transfert d'unites allyliques sur des accepteurs non

terpeniques. les parahydroxybenzoate transjerases

- La parahydroxybenzoate-geranyl transferase : cette enzyme catalyse Ia prenylation du parahydroxybenzoate, le groupe prenyl etant fourni par le geranyl diphosphate. Cette reac­tion a ete mise en evidence chez Lithospermum erythrorhizon (Heide & Tabata, 1987).

- La parahydroxybenzoate-polyprenyl transferase : cette enzyme est responsable de Ia deuxieme etape de la synthese du coenzyme Q. Elle catalyse Ia prenylation du parahy­droxybenzoate avec un groupe all-trans polyprenyl (Winrow & Rudney, 1969).

l'ARNt-isopentenyl transferase L'ARNt-isopentenyl transferase fixe une molecule d'IPP sur un ARN de transfert. Le

gene codant cette enzyme chez Saccharomyces cerevisiae a ete isole par Dihanich et a/. (1987) par complementation d'un mutant affecte dans les modifications des ARNt cyto­plasmiques et mitochondriaux.

Prenylation des proteines La prenylation des proteines est une modification post-traductionnelle impliquant une

liaison covalente d'un groupe isoprenyl a Ia cysteine en position C-terrninale d'une protei­ne. Cette modification existe chez de nombreux Eucaryotes (Farnsworth et a/., 1990 ; Maltese & Robisshaw, 1990). Plusieurs proteines telles la )amine B, les proteines liant le GTP et les proteines ras requierent cette prenylation qui leur perrnet )'association a Ia membrane, necessaire a leur activite. Le groupe isoprenyl transfere a ces proteines peut etre soit le farnesyl, soit le geranylgeranyl (Farnsworth et a/., 1991 ; Rilling et a/., 1990). A ce jour, trois enzymes catalysant ces reactions de prenylation sont identifiees :

- Ia farnesyl transferase : modifie specifiquement les proteines ayant une sequence pep­tidique carboxy terminale CAAX ou A est un acide amine aliphatique et X un acide amine quelconque (Reiss eta/., 1990, 1991) ; - Ia geranylgeranyltransferase I : agit sur des proteines comportant Ia sequence carboxy terminale CAAL (Moores et a/., 1991) ; - Ia geranylgeranyltransferase II : prenyle les proteines dont Ia sequence carboxy termi­nale est XCXC, XXCC ou CCXX ; cette prenyl transferase a ete mise en evidence dans les cellules du cerveau de Rat (Seabra eta/., 1992 ; Marshall, 1993).

E. Les cyclases terpeniques II existe differentes classes de terpenoldes cycliques. Ces composes sont formes a par­

tir des intermediaires C I 0, C 15 et C20 de Ia voie de biosynthese des isoprenoldes. Les enzymes responsables de Ia cyclisation du GPP, du FPP et du GGPP sont appelees respec­tivement monoterpene, sesquiterpene et diterpene cyclases. De nombreuses terpene cylases ont ete partiellement ou totalement purifiees a partir de plantes ou de micro-orga­nismes (Moesta & West, 1985 ; Hohn & Vanmmiddlesworth, 1986 ; Cane & Pargellis, 1987 ; Hohn & Plattner, 1989 ; Munk & Croteau, 1990 ; Savage et a/., 1994 ; Croteau et a/., 1994).

/es monoterpene cyclases La formation des monoterpenes se fait a partir du GPP par l'action des monoterpene

cyclases. Les monoterpenes sont essentiellement des composes aromatiques dont les plus

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connus sont le menthol, le citronellol, le linalol et Ie geraniol. Chez Ies plantes, ces mole­cules interviennent dans !'attraction des insectes· pollinisateurs. La monoterpene cyclase qui catalyse Ia formation du limonene a partir du GPP est appelee limonene cyclase (ou synthase). Un ADNc, codant Ia limonene synthase de Ia menthe, a ete isole par Colby et al. (1993).

les sesquiterpene cyclases Les sesquiterpenes derivent du FPP. Certaines de ces molecules possedent des proprie­

tes aromatiques. Ce sont aussi des molecules de defense chez les vegetaux, lors d'une infection par un agent pathogene. Chez les plantes, Ia premiere etape de conversion du FPP en phytoalexines est catalysee par Ia 5 epi-aristolochene synthase (EAS). Facchini et Chappell ( 1992) ont demontre que, chez le Tabac, cette enzyme est absente dans les condi­tions physiologiques normales et induite lors de son infection par un agent pathogene. Ces auteurs ont isole, a partir d'une banque d'ADNc de Tabac elicite, deux ADNc independants ( cEAS 1 et cEAS2) codant Ia EAS et montre que Ia regulation de !'enzyme se fait au niveau transcriptionnel.

les diterpene cyclases Les diterpenes sont synthetises a partir du GGPP. Parmi ces molecules, on trouve les

gibberellines qui sont des hormones de developpement chez les plantes, mais aussi le taxol qui est un diterpene d'interet pharmaceutique grace a ses proprietes antitumorales. Le taxol bloque Ia mitose en se fixant aux microtubules (Nicolaou et al., 1994). La premiere etape de Ia formation du taxol consiste en Ia cyclisation du GGPP en taxa 4, 11-diene. L'enzyme taxadiene synthase catalyse cette etape. Un ADNc, codant Ia taxadiene synthase a ete isole a partir d'une banque d'ADNc de l'If du Pacifique, Taxus brevifolia (Wildung & Croteau, 1996).

F. La biosynthese des sterols La voie de biosynthese des sterols derive de la voie generate des isoprenoldes. Cette

voie de biosynthese est tres etudiee chez les Mammiferes et Ia Levure. Chez Saccharomyces cerevisiae, dix genes parmi les onze impliques specifiquement dans cette voie ont ete clones (Lees et al., 1995 ; Bard et al., 1996). Les differentes etapes de Ia for­mation de !'ergosterol a partir du squalene sont presentees dans Ia figure 7.

La premiere enzyme specifique de Ia synthese des sterols est Ia squalene synthase. Le squalene issu de cette reaction est engage uniquement dans Ia synthese des sterols (Faust et al., 1979).

La squalene epoxydase : cette enzyme permet !'incorporation d'un atome d'oxygene dans Ia molecule de squalene pour donner le 2,3 squalene epoxyde. Des mutants de Ievu­re appartenant a trois groupes de complementation non lies erg], ergl8, ergl4 ont ete iso­les (Karst, 1978). Le gene ERG 1 a ete isole par Jandrositz et al. ( 1991) a !'aide de Ia terbinafine qui est une allylamine, inhibiteur specifique de !'enzyme. Le meme inhibiteur a ete utilise pour cribler des Ievures transformees avec une banque d'ADNc de Rat. Cette approche a ainsi permis a Sakakibara et al. (1995) d'isoler I'ADNc codant la squalene epoxydase de Rat. L'analyse de Ia sequence proteique revele Ia presence d'un domaine transmembranaire au niveau N-terminal et presente un consensus de liaison avec le FAD suggerant qu'il s'agit d'une flavoenzyme (Sakakibara et al., 1995). L'ADNc du Rat a servi de sonde pour isoler un ADNc codant Ia squalene epoxydase de Ia Souris (Kosuga et al., 1995). Nakamura et al. (1996) ont montre, chez Ia lignee cellulaire Hela, une regulation

16

~ ... n~V .. ERG9 Q3 ·~ -ERGJ

.riV~ .. Q.j'~ -ERG7

squalene

4-methyl-8,24-cholestadienol

~ ~G25

ERG25 H

.~ .. H~ ~RG6 H

zymosterol

ERG4

ergosterol

0

squalene epoxy de

4, 4-dimethyl-8,24-cholestadienol

... ERG2

fecosterol

5, 7,22,24(28 )­ergostatetraenol

ERG5

lanosterol

FJIGll!

4 '4-di methyl­cholesta-8, 14,24-trienol

episterol

ERG3~

5, 7,24(28)-ergostatrienol

Fig. 7.- Etapes specifiques de Ia voie de biosynthilse de !'ergosterol chez Ia levure Saccharomyces cerevisiae (adap­te de Lees eta/., 1995).

Fig. 7.- Specific steps of ergosterol biosynthesis pathway in Saccharomyces cerevisiae (according to Lees et a/., 1995).

17

1995). Nakamura et a/. ( 1996) ont montre, chez la lignee cellulaire He/a, une regulation au niveau transcriptionnel de Ia squalene epoxydase par les sterols.

- L'oxydosqualene cyclase : cette enzyme est la lanosterol synthase chez les organismes non photosyntetiques. L'enzyme correspondante chez les organismes photosynthetiques est appelee cycloartenol synthase. Karst et Lacroute ( 1977) ont isole des mutants de Saccharomyces cerevisiae erg7 et erg17 affectes au niveau de cette enzyme.

Le gene codant Ia lanosterol synthase a ete clone chez Candida albicans (Kelly et al., 1990), chez Saccharomyces cerevisiae (Corey et a/.,1994), chez !'Homme (Baker et al., 1995), chez le Rat (Abe & Prestwich, 1995) et chez Schizosaccharomyces pombe (Corey et al., 1996). Corey eta/. (1993) ont transforme le mutant erg7 par une banque d'expres­sion d'ADNc d'Arabidopsis thaliana et recherche un clone qui produit le cycloartenol. Ils ont ainsi clone l'ADNc codant une oxydosqualene synthase vegetale.

Le lanosterol forme subit une succession de transformations catalysees par des deme­thylases, des isomerases, des desaturases, des deshydrogenases ....

La plupart des etapes tardives de Ia voie de biosynthese des sterols ne sont pas encore definies chez les plantes. Un mutant d'Arabidopsis thaliana deficient dans l'activite de !'en­zyme ~ 7 -sterol-C-5 desaturase a ete isole par Gachotte eta!. ( 1995). Ces auteurs ont mon­tre que le gene ERG3 codant !'enzyme correspondante chez IaLievure complemente Ia mutation de Ia plante. Par ailleurs un ADNc codant Ia ~7 reductase chez Arabidopsis tha­liana, a ete isole par Lecain et al. ( 1996), apres transformation de la levure par une banque d'ADNc et selection de clones transformes resistants a Ia nystatine.

Lavoie de biosynthese des sterols aboutit, chez les Mammiferes, a Ia formation du cho­lesterol. Chez Ies plantes superieures, les sterols principaux sont le stigmasterol et Ie sito­sterol et chez Ies champignons, le sterol majoritaire est !'ergosterol (figure 8).

III. BIOSYNTHESE DES ISOPRENOIDES VOlE DU DESOXYXYLULOSE

La caracterisation de Ia voie de biosynthese des isoprenoides chez les plantes a beneficie, en grande partie, des etudes effectuees sur Ia synthese des sterols chez Ia Levure et les cel­lules de Mammiferes (Goldstein & Brown, 1990). Ces travaux ont permis, en particulier, Ia caracterisation de plusieurs genes codant les enzymes impliquees dans cette voie de bio­synthese. Si les sequences proteiques entre les enzymes vegetales et celles des Mammiferes ou de Levure sont relativement conservees, Ia plupart des proprietes de cette voie de biosynthese ne peuvent etre appliquees au systeme vegetal. Une des caracteris­tiques principales de cette voie de synthese chez les plantes est !'existence d'une famille de genes pour une fonction donnee et ceci Iaisse supposer un processus de regulation speci­fique. De plus Ia possibilite de !'existence d'une voie de biosynthese independante de celle du mevalonate laisse supposer une regulation differente.

Des observations datant de quelques dizaines d'annees montrent que chez des plantules de plantes superieurs (Orge, Mais ... ), le mevalonate serait responsable de Ia seule synthe­se des sterols dans le cytoplasme, tandis que Ies isoprenoides plastidiaux (carotene, phy­tol...) seraient synthetises a partir de C02 (Goodwin, 1965). De meme, des etudes realisees chez le Mais ont montre clairement que le pyruvate radioactif s'incorpore dans le ~ caro­tene et non !'acetate radiomarque (Threlfall et a/., 1967 ; Lichtenthaler et al., 1982). Ces resultats, qui, a l'epoque, s'averaient incoherents avec une biosynthese d'IPP par voie du

18

HO

HO

ERGOSTEROL CHOLESTEROL

HO HO

STIGMASTEROL SITOSTEROL

Fig. 8.- Principaux sterols presents chez les champignons (a), les animaux (b) et les plantas (c).

Fig. 8.- The main sterols present in mycophyta (a), animals (b) and plants (c).

mevalonate, ont souvent ete expliques par des modeles de compartimentation de la bio­synthese des isoprenoldes. On a ainsi formule plusieurs hypotheses tentant d'expliquer la localisation specifique des isoprenoldes plastidiaux, parallelement a une synthese de ste­rols localisee dans le compartiment cytoplasme/reticulum endoplasmique.

L'existence eventuelle d'une voie de biosynthese de l'IPP, independante de celle du mevalonate, a ete appuyee par des etudes des effets de la mevinoline sur la biosynthese de differents isoprenoldes vegetaux. En effet, la mevinoline est un inhibiteur specifique de la formation du mevalonate. II a ete observe que, chez les plantes, la mevinoline inhibe la biosynthese des sterols alors qu'elle n'affecte pas la biosynthese des chlorophylles et des carotenoldes (Fig. 9).

Des etudes, realisees par Rohmer et collaborateurs, par !'incorporation de !'acetate et du glucose 13c dans les terpenoldes des hopanes et dans la chaine prenyl de !'ubiquinone de bacteries, ont montre que la voie classique (acetate/mevalonate) n'est pas la seule voie de biosynthese des isoprenoldes dans tous les organismes et que le squelette isoprenique peut etre forme a partir de triose sans l'intermediaire du mevalonate. Cette voie est en particu­lier egalement utilisee chez les bacteries telles que Escherichia coli ou Haemophilus injluenzae (Flesch eta/., 1988 ; Rohmer eta/., 1993).

Cette voie alternative de la biosynthese d'isoprenoldes a aussi ete mise en evidence chez l'algue verte Scenedesmus obliquus (Schwender eta/., 1996). Une etude effectuee sur la Carotte, l'Orge et la Lentille d'eau (Lichtenthaler et a/., 1997) vient confirmer !'existence de la nouvelle voie de biosynthese des isoprenoldes independante du mevalonate chez les plantes superieures. Ainsi, ces auteurs ont demontre une biosynthese des isoprenoldes plas­tidiaux a partir de pyruvate et du glyceraldehyde phosphate, tandis que Ia voie du mevalo­nate serait impliquee dans la biosynthese des sterols. Des donnees plus precises concernant cette nouvelle voie de biosynthese s'eclaircissent avec, en particulier, des etudes de biolo-

COOH

I o~c

I CH 3

Pyruvate

HO~op 0

Dihydroxyacetone

phosphate

...

HO"'

HC 3

/ c=

Y::::..._ /OH '""""c

'-...H

0

> I ~

19

OPP

IPP

Fig. 9.- Biosynthese de I'IPP, proposee par Rohmer eta/. (1993). Fig. 9.- IPP biosynthesis (according to Rohmer eta/. (1993).

gie moleculaire. Ainsi l'equipe de Boronat vient apporter de nouvelles connaissances a ce sujet par le clonage et Ia caracterisation du gene codant Ia l-deoxyxylulose-5-P synthase qui catalyse Ia premiere etape de biosynthese de l'IPP par Ia voie alternative (Lois et a/.,1998).

La mise en evidence de Ia nouvelle de biosynthese des isoprenoi"des permet ainsi d'elu­cider mieux Ia compartimentation des isoprenoi"des chez les plantes, mais aussi de renfor­cer Ia theorie suivant laquelle les plastes auraient une origine endosymbiotique procaryotique.

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