Caractérisation moléculaire des tumeurs oligodendrogliales ...ol.saulnier.free.fr/doc/LPG_Olivier_SAULNIER.pdf · réalisée à l'École Nationale de Chimie, Physique et Biologie

Olivier SAULNIER

Licence professionnelle de biotechnologies

Spécialité génomique

E.N.C.P.B – Cnam – AFi24

2012 – 2013

Caractérisation moléculaire des tumeurs

oligodendrogliales anaplasiques

Chefs d’équipe : Pr. Jean-Yves DELATTRE – Pr. Marc SANSON

Maître d’apprentissage : Dr. Ahmed IDBAIH

Encadrante : Catherine CARPENTIER

Professeur tuteur : Isabelle ÉTIENNE

Durée : 12 mois (15 septembre 2012 – 14 septembre 2013)

Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (CR-ICM)

Equipe de neuro-oncologie expérimentale

UPMC UMR_S975, Inserm UMR 975, CNRS UMR 7225

Groupe hospitalier Pitié Salpêtrière – Bâtiment ICM

47-83 boulevard de l'hôpital

75013 Paris, France

Table des abréviations

2-HG : 2-HydroxyGlutarate

ADN : Acide DésoxyriboNucléique

AII : Astrocytome

AIII : Astrocytome anaplasique

ARC : Association pour la Recherche sur le Cancer

ARN : Acide RiboNucléique

ARTC : Association pour la Recherche sur les Tumeurs Cérébrales

BWA : Burrows-Wheeler Aligner

CBTRUS : Central Brain Tumor Registry of the United States

CDKN2A : Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A

CGH array : Comparative Genomic Hybridization array

CIC : Capicua transcriptional repressor

CNRS : Centre National de la Recherche Scientifique

COSMIC : Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer

CRB : Centre de Ressources Biologiques

CR-ICM : Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière

CTBP2 : C-Terminal Binding Protein 2

dbSNP : database SNP

ddNTP : Didésoxyribonucléotides

DMSO : Diméthylsulfoxyde

EGF : Epidermal growth factor

EGFR : Epidermal growth factor receptor

ENCPB : École Nationale de Chimie, Physique et Biologie

EVS : Exome Variant Server

FAT1 : tumor suppressor homolog 1

FUBP1 : Far ipstream element binding protein 1

GBM : Glioblastome

GBMO : Glioblastome à composante oligodendrogliale

ICM : Institut du Cerveau et de la Moelle épinière

ICR : Institute of Cancer Research

IDH1 : Isocitrate dehydrogenase 1

IDH2 : Isocitrate dehydrogenase 2

IGV : Integrative Genomics Viewer

IK : Indice de Karnofsky

INCa : Institut National du Cancer

InDels : Insertions/Délétions

Inserm : Institut national de la santé et de la recherche médicale

IRM : Imagerie par Résonance Magnétique

MgCl2 : Chlorure de magnésium

MID : Multiplex IDentifiers

NGS : Next Generation Sequencing

NOTCH1 : Notch 1

NOTCH2 : Notch 2

OAII : Oligoastrocytome

OAIII : Oligoastrocytome anaplasique

OII : Oligodendrogliome

OIII : Oligodendrogliome anaplasique

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

ONT : OncoNeuroThèque

OS : Overall Survival

pb : paire de bases

PBS : Phosphate Buffered Saline

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCV : Procarbazine, CCNU, Vincristine

PFS : Progression-Free Survival

pH : potentiel Hydrogène

POLA : Prise en charge des OLigodendrogliomes Anaplasiques

PTP : PicoTiterPlate

RBPJ : Recombination signal Binding Protein for immunoglobulin kappa J region

rcf : relative centrifugal force

RIN : RNA Integrity Number

rpm : rotation par minute

SETD2 : SET Domain containing 2

SNC : Système Nerveux Central

SNP : Single Nucléotide Polymorphism

SNV : Single Nucléotide Variation

SYNE1 : Spectrin repeat containing, nuclear envelope 1

TDM : Tomodensitométrie

TERT : Telomerase reverse transcriptase

Tm : melting Temperature

TP53 : Tumor protein p53

UCSC : University of California, Santa Cruz

UMR : Unité Mixte de Recherche

UPMC : Université Pierre et Marie Curie

UTR : UnTranslated Region

WES : Whole-Exome Sequencing

p. 4

Sommaire

Présentation de l’entreprise

Introduction

Les gliomes

Les oligodendrogliomes anaplasiques

Le contexte du projet et objectifs

Matériel et méthodes

1) Extraction, quantification et qualification des acides nucléiques

2) Détermination du statut IDH1/IDH2 par séquençage direct

3) Caractérisation moléculaire des tumeurs sur puce pan-génomique

4) Recherche de variants par séquençage haut débit : Whole-Exome Sequencing

a) Principe du séquençage haut débit sur plateforme Illumina

b) Traitement bio-informatique des données générées

c) Validation des mutations par séquençage direct

5) Séquençage moyen débit du gène CIC via la technologie 454 – Roche®

a) Principe du séquençage par la technologie 454 sur GS Junior

b) Traitement bio-informatique des données


Résultats

1) Population d'étude

2) Mise en évidence d'altérations génétiques et génomiques dans les OIII

a) Validation des altérations connues

b) Validation des altérations originales

c) Mise en évidence de voies de signalisation

Discussion et perspectives

Conclusion personnelle

Références bibliographiques

Annexes

p. 5

Présentation de l'entreprise

Dans le cadre de ma formation (licence professionnelle de biotechnologies, spécialité génomique)

réalisée à l'École Nationale de Chimie, Physique et Biologie (ENCPB) à Paris; j'ai effectué mon apprentissage

en alternance au sein du Centre de Recherche de l’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (CR-ICM).

L’Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM) est une fondation internationale reconnue d'utilité

publique, fondée en 2005 et présidée par le Professeur Gérard SAILLANT. L’ICM dispose de plus de

22 000 m² de laboratoires, d'un important Centre de Ressources Biologiques (CRB) et d’un pôle de

plateformes de haute technologie permettant à l’ensemble des 600 chercheurs, ingénieurs et techniciens de se

consacrer pleinement à la recherche sur les maladies neurologiques. Ce centre, installé au cœur du groupe

hospitalier Pitié-Salpêtrière à Paris, étudie les causes ainsi que les mécanismes des grandes pathologies du

système nerveux, comme, par exemple, la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la sclérose en

plaques et les tumeurs cérébrales.

Aujourd'hui, l'un des objectifs majeurs de la recherche menée dans l’ICM est de favoriser de nouvelles

découvertes scientifiques avec des perspectives d’applications diagnostiques et/ou thérapeutiques chez les

patients souffrant de maladie neurologique. C'est dans cette perspective que le CR-ICM, créé en 2009, s'est

installé au sein du bâtiment de l'ICM début 2011, regroupant ainsi, en un même lieu, patients, médecins,

chercheurs et techniciens. Le CR-ICM est une Unité Mixte de Recherche (UMR) sous la tutelle de l'Université

Pierre et Marie Curie (UPMC), de l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) et du

Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Les financements du CR-ICM sont d’origines très

diverses. Ils proviennent de financements associatifs/institutionnels, (comme la fondation Association pour la

Recherche sur le Cancer (ARC) pour la recherche sur le cancer, l’Association pour la Recherche sur les

Tumeurs Cérébrales (ARTC) ou l’Institut National du Cancer (INCa)) des contrats et des donateurs privés

ainsi que des différentes tutelles (Inserm, CNRS, UPMC). Son budget global en 2011 était de 38,5 millions

d'euros (salaires inclus).

Les différentes missions du CR-ICM sont axées sur la recherche fondamentale et appliquée,

notamment dans le but de mieux comprendre l'organisation et le fonctionnement, normaux et pathologiques,

du système nerveux. L’ICM est constitué de 22 équipes scientifiques réparties selon 4 axes de recherche :

- Axe I : maladies neurodégénératives

- Axe II : excitabilité, synapse et pathologies associées

- Axe III : développement, pathologies gliales et réparation

- Axe IV : cognition, émotion, action

C'est au sein du troisième axe que j'ai réalisé mon apprentissage et plus particulièrement dans l'équipe

de neuro-oncologie expérimentale des Professeurs Jean-Yves DELATTRE et Marc SANSON. Les objectifs

généraux de l'équipe, concentrés sur les tumeurs cérébrales, sont :

- l'identification de biomarqueurs moléculaires

- la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l'oncogenèse des

tumeurs cérébrales

- le développement et l’évaluation de nouvelles thérapies dans des modèles précliniques de tumeurs

cérébrales

p. 6

L'équipe de neuro-oncologie expérimentale dispose de la plus grande biobanque de tumeurs cérébrales

d'Europe (OncoNeuroThèque – ONT, Groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière) avec plus de 11 000 individus

inclus dont plus de 4 000 souffrant de gliomes (document 1). ONT est une tumorothèque en cours de

certification pour la norme NF S 96-900 et est localisée sur deux étages à l'ICM. Elle regroupe des fragments

tumoraux congelés de différents types de tumeurs cérébrales : (i) des gliomes qui représentent plus de 50%

des tumeurs primitives du système nerveux central (SNC), (ii) des méningiomes, (iii) des lymphomes

cérébraux primitifs et (iv) des tumeurs cérébrales plus rares.

Afin de pouvoir mettre à disposition l’ensemble des données cliniques, pathologiques et moléculaires

des patients ; une base de données a été mise en place regroupant toutes ces informations (document 2).

p. 7

Document 1 : Répartition des ressources biologiques d’OncoNeuroThèque (ONT) Légende : A. Représentation de la base de données d’OncoNeuroThèque selon l’histologie des tumeurs gliales. GBM : glioblastome (grade IV); GBMO

: glioblastome à composante oligodendrogliale (grade IV); OIII : oligodendrogliome anaplasique (grade III); OAIII : oligoastrocytome anaplasique

(grade III); AIII : astrocytome anaplasique (grade III); OII : oligodendrogliome (grade II); OAII : oligoastrocytome (grade II); AII : astrocytome

(grade II). B. Répartition de la diversité de la biobanque selon le type d’échantillon stocké.

Document 2 : Base de données OncoNeuroThèque A. Base de données cliniques d’OncoNeuroThèque B. Base de données moléculaires d’OncoNeuroThèque

p. 8

Introduction

Les gliomes

Les gliomes sont des tumeurs cérébrales primitives dérivant des cellules macrogliales (astrocytes,

oligodendrocytes et épendymocytes) qui composent la macroglie du SNC. Par analogie aux cellules

macrogliales normales, il existe donc trois principaux types de gliomes : (i) les astrocytomes, (ii) les

oligodendrogliomes et (iii) les oligoastrocytomes ou les gliomes mixtes. Les épendymomes constituant un

groupe singulier au sein des gliomes, ils ne seront pas abordés ici.

Les gliomes touchent aussi bien les adultes que les enfants, leur incidence annuelle est de 5 cas pour

100 000 habitants. En effet, chaque année, en France, sont diagnostiqués entre 3000 et 4000 nouveaux cas. La

prolifération des cellules gliales cancéreuses dans le cerveau entraîne une augmentation de la pression dans la

boîte crânienne et une compression du parenchyme cérébral avec l’apparition de signes cliniques. Les

symptômes les plus fréquemment observés sont des céphalées, des crises d'épilepsie et/ou des handicaps

neurologiques (moteurs, sensitifs et/ou cognitifs). La tumeur peut être visualisée chez le patient par des

examens neuroradiologiques (TDM cérébral et IRM cérébrale) mais le diagnostic de certitude pour les gliomes

repose sur l’examen histologique d’un fragment tumoral sous microscope.

L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a mis en place, d'après un consensus, une classification

histologique ou neuropathologique des tumeurs cérébrales dont la dernière modification date de 2007 1. Cette

classification a pour but d'unifier la nomenclature histologique des gliomes, permettant donc à tous les

neuropathologistes de donner une même terminologie pour des tumeurs phénotypiquement semblables. Cette

classification individualise 7 principaux types de gliomes en fonction du phénotype des cellules tumorales et

du grade de malignité. Le grade de malignité des gliomes tient compte de plusieurs paramètres : (i) la

différenciation cellulaire, (ii) la densité cellulaire, (iii) la présence d’atypies nucléaires, (iv) le degré d’activité

mitotique et (v) la présence de nécrose (document 3). La tumeur primitive du SNC la plus fréquente et la plus

agressive est l'astrocytome de grade IV ou glioblastome qui représente plus de 50 % de l'ensemble des tumeurs

gliales malignes (annexe 1). Ces derniers ont une survie globale médiane de 15 mois 2.

p. 9

Document 3 : Classification des tumeurs gliales d’après l’OMS (2007) adapté de Louis et al., 2007 1

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p. 10

Aujourd’hui, avec l’arrivée des nouvelles technologies de séquençage haut débit, l’analyse

moléculaire des gliomes a permis de découvrir des altérations moléculaires pertinentes sur le plan biologique

et sur le plan clinique. Certaines de ces altérations moléculaires détectées dans les tumeurs gliales constituent

dorénavant des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques. La découverte de ces altérations moléculaires a

aussi permis de mieux comprendre la gliomagenèse ainsi que la mise en évidence de l’importante

hétérogénéité intratumorale et intertumorale 3 de ces tumeurs.

De nombreuses altérations moléculaires impliquées dans gliomagenèse ont été découvertes, telles que

des mutations, des amplifications, des réarrangements ou des délétions chromosomiques dérégulant des

oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs.

Les principales altérations génomiques et génétiques mises en évidence dans les gliomes sont :

- la perte des bras chromosomiques : co-délétion 1p et 19q 4,5

- la mutation ponctuelle de gènes : IDH1 6,7

, CIC 8–11

, FUBP1 8–10

, promoteur TERT 12,13

- la délétion de gènes suppresseurs de tumeurs : TP53 14

, CDKN2A 15

- l'amplification d'oncogène : EGFR 16,17

p. 11

Les oligodendrogliomes anaplasiques

Épidémiologie

Les oligodendrogliomes anaplasiques (OIII) représentent 6,2 % des gliomes d'après le rapport établi

par le Central Brain Tumor Registry of the United States (CBTRUS) 18

. En France, entre 300 et 600 nouveaux

cas d'OIII sont diagnostiqués chaque année.

Anatomopathologie

Les OIII sont des gliomes diffus malins de haut grade de malignité (grade III selon la classification de

l'OMS de 2007). Sur le plan anatomopathologique, ils sont caractérisés par des cellules de phénotype

oligodendrocytaire en "œuf sur le plat" et organisés en "nid d’abeille" 19

(document 4).

Aspects radiologiques

Sur le plan radiologique, les OIII sont le plus souvent caractérisés par une localisation frontale et une

prise de contraste (document 5), traduisant la rupture de la barrière hémato-encéphalique 20

.

Traitements

Le traitement des patients souffrant d’un OIII repose sur un trépied thérapeutique : (i) la chirurgie, (ii)

la radiothérapie et (iii) la chimiothérapie. La chirurgie, permettant la résection tumorale, doit être aussi large

que possible tout en préservant le patient de toute séquelle neurologique. La chirurgie est suivie d’une

radiothérapie encéphalique. La chimiothérapie est prescrite selon le statut des bras chromosomiques 1p/19q

(présence de la co-délétion 1p/19q ou non). Si la tumeur présente une co-délétion des bras chromosomiques

1p/19q, une chimiothérapie (Procarbazine, CCNU, Vincristine -PCV-) précoce adjuvante à la radiothérapie est

délivrée. En effet, ce biomarqueur génomique est associé à une meilleure réponse à la chimiothérapie précoce.

En l’absence de co-délétion 1p/19q, la place de la chimiothérapie est discutée et évaluée dans le cadre d’essais

cliniques.

Pronostic

Le pronostic des patients souffrant d’OIII est très hétérogène, en fonction des caractéristiques

cliniques et moléculaires de la tumeur, et varie de 2 à 20 ans 21

.

p. 12

Document 4 : Aspects neuropathologiques d’un oligodendrogliome anaplasique tiré de Mokhtari et al., 2013 19

Légende : Coupe histologique d’un oligodendrogliome anaplasique organisé en "nid d’abeille" et présentant une prolifération vasculaire.

Document 5 : Aspects neuroradiologiques d’un oligodendrogliome anaplasique tiré Reyes et al., 2013 20

Légende : IRM d’un oligodendrogliome anaplasique localisé au niveau frontal gauche et présentant une prise de contraste.

p. 13

Caractéristiques moléculaires

Plusieurs altérations génétiques et génomiques ont été identifiées dans les OIII (document 6) comme

(i) la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q, (ii) les mutations des gènes IDH1 ou IDH2, (iii) les

mutations du gène CIC, (iv) les mutations du gène FUBP1 et (v) les mutations du promoteur du gène TERT.

La co-délétion des bras chromosomiques 1p/19q est observée dans environ 75% des OIII et est

associée à un meilleur pronostic et à une meilleure réponse à la chimiothérapie 5.

Les mutations des gènes IDH1 et IDH2 sont observés dans plus de 80% des OIII 6,7

. Les gènes IDH1

et IDH2 codent respectivement pour les isocitrates déshydrogénases NADP+ dépendantes 1 (cytosolique) et

2 (mitochondriale). Ces deux protéines jouent un rôle essentiel dans le métabolisme cellulaire, elles permettent

la conversion de l'isocitrate en α-cétoglutarate. Les mutations retrouvées dans les gènes IDH1 et IDH2 sont

des "points-chauds" (ou hotspots). Elles touchent respectivement les codons R132 et R1727 (annexe 2) et ont

été décrites pour la première fois en 2009 6. Ces mutations situées au sein du site actif des enzymes IDH1 et

IDH2 provoquent une modification de leur spécificité et conduisent à une production et une accumulation de

2-hydroxyglutarate (2-HG) qui contribuerait à la formation et à la progression de gliomes 22

.

Ces deux altérations (co-délétion 1p/19q et la mutation IDH1/2) sont des caractéristiques moléculaires

majeures avec une grande valeur pronostique. En effet, il a été montré que la co-délétion des bras

chromosomiques 1p et 19q était un facteur pronostique favorable dans les oligodendrogliomes. Il a également

été montré que les mutations des gènes IDH1 et IDH2 étaient aussi associées à un pronostic favorable

indépendamment de la perte des bras chromosomiques 1p/19q 23

(document 7).

Le gène CIC, localisé sur le chromosome 19q, est un répresseur transcriptionnel impliqué notamment

dans la voie du récepteur de l’EGF. Il est retrouvé muté dans 50 à 60% des OIII 8–11

.

Le gène FUBP1, situé sur le chromosome 1p, code pour une protéine régulatrice de l’expression de

l’oncogène c-myc qui est lui-même impliqué dans de nombreux cancers. Il est retrouvé muté dans 15 à 20%

des OIII 8–10

.

Le gène TERT est impliqué dans le maintien de la longueur des télomères. Son promoteur a

récemment été découvert muté dans 85% des OIII 12,13

. Cette mutation participerait à l’immortalisation des

cellules gliales normales et à leur engagement dans le développement tumoral.

p. 14

Document 6 : Principales altérations génétiques et génomiques retrouvées dans les oligodendrogliomes

anaplasiques de grades III (OMS)

Altération Région impliquée % variants Littérature

co-délétion 1p19q 75 Reifenberger J. et al. (1994)

Cairncross G. J. et al. (1998)

mutation IDH1 80 Yan H. et al. (2009)

Hartmann C. et al. (2009)

mutation CIC 50 à 60

Bettegowda C. et al. (2011)

Jiao Y. et al. (2012)

Sahm F. et al. (2012)

Yip S. et al. (2012)

mutation FUBP1 15 à 20

Bettegowda C. et al. (2011)

Jiao Y. et al. (2012)

Sahm F. et al. (2012)

mutation promoteur TERT 85 Killela P. J. et al. (2013)

Arita H. et al. (2013)

Document 7 : Courbe de survie des gliomes de grade III en fonction des statuts des bras chromosomiques

1p/19q (co-délétés ou non) et des gènes IDH1/IDH2 (muté ou non) tiré de Labussière et al., 2010 23

Légende : A : IDH1/IDH2 muté et co-délétion 1p/19q; B : IDH1/IDH2 muté sans co-délétion 1p/19q; C : IDH1/IDH2 non muté

p. 15

Le contexte du projet et objectifs

Dans le cadre de mon apprentissage, j'ai travaillé sur la caractérisation moléculaire des tumeurs

oligodendrogliales anaplasiques des patients pris en charge dans le cadre du réseau national multicentrique

"Prise en charge des OLigodendrogliomes Anaplasiques" (POLA). Le réseau POLA a été labélisé en 2009 par

l’INCa. L'objectif de l'ensemble du réseau POLA est d'améliorer et d'harmoniser, au niveau national, la prise

en charge médicale et la recherche effectuée sur les OIII et plus largement sur les tumeurs oligodendrogliales

malignes (oligoastrocytomes anaplasiques, oligoastrocytomes anaplasiques avec nécrose et glioblastomes à

composante oligodendrogliale). Le réseau POLA encourage également la recherche biologique et clinique sur

ces tumeurs rares via notamment la constitution de la plus grande biobanque internationale d’échantillons

biologiques (sang et tumeur). Les échantillons proviennent, après leur consentement écrit et signé, de patients

souffrant d'OIII. Le réseau POLA regroupe 35 groupes hospitaliers français qui sont sous la coordination de

deux centres de références :

- le centre de référence clinique (Pr. DELATTRE) du groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière à Paris

- le centre de référence d'anatomopathologie (Pr. FIGARELLA-BRANGER) de l'hôpital la Timone à

Marseille

Le réseau POLA est notamment constitué d'un groupe de recherche translationnelle dont l'objectif est

la recherche de biomarqueurs moléculaires diagnostiques et pronostiques. Cette recherche translationnelle est

primordiale pour les médecins car elle permet d’affiner la prise en charge médicale du patient d’après le profil

moléculaire de sa tumeur. C'est dans cette optique qu'est réalisé, pour chaque patient inclus dans le réseau

POLA, 2 à 3 semaines après la chirurgie, une analyse moléculaire afin de connaître les caractéristiques

génomiques de sa tumeur.

En plus du groupe translationnel, le réseau POLA comprend d’autres groupes de recherche :

(i) épidémiologie, (ii) radiologie, (iii) anatomopathologie et (iv) neurotoxicité des traitements anti-tumoraux.

Pour qu’un patient soit inclus dans le réseau POLA, une double relecture histologique est réalisée dans le but

de conforter et de valider le diagnostic. En février 2013, après une double relecture histologique, le réseau

POLA comptait 573 patients.

Mon objectif au sein de l’équipe de neuro-oncologie expérimentale fût la caractérisation moléculaire

des tumeurs oligodendrogliales anaplasiques. Pour cela, j’ai travaillé sur l’exploitation et la validation de

données de séquençage exonique haut débit (Whole-Exome Sequencing – WES) mettant en œuvre des notions

de bio-informatique ainsi que du séquençage Sanger. J’ai également été amené à réaliser du séquençage

moyen débit (technologie 454 – Roche®) sur le gène CIC afin de valider les données de la littérature.

De plus, j’ai effectué des manipulations dites "de routine" lors de chaque réception de nouveaux

prélèvements POLA. Il s’agissait d’extraire l’Acide DésoxyriboNucléique (ADN), de réaliser un séquençage

systématique des gènes IDH1 et IDH2, par séquençage Sanger, ainsi que l'analyse du profil génomique sur

puce d’hybridation génomique comparative (Comparative Genomic Hybridization array -CGH array-).

J’ai également réalisé des extractions d’Acide RiboNucléique (ARN) ainsi que leur qualification sur

Bioanalyzer2100 (Agilent®) dans l’objectif de faire du séquençage haut débit d’ARN. Ces travaux sont menés

en collaboration avec le Pr. Mark LATHROP de l’Université McGill (Montréal, Canada) et sont en cours

d’analyse, ils ne seront donc pas détaillés dans ce mémoire.

p. 16

Matériel et méthodes

1) Extraction, quantification et qualification des acides nucléiques

Matériel biologique

Chaque semaine, les échantillons tumoraux POLA sont envoyés (depuis les laboratoires de

neuropathologie nationaux participant au réseau POLA) à l’ICM. Ils sont traités puis stockés dans un but de

recherche moléculaire, sous forme de tissus congelés ou de bloc inclus en paraffine. L'échantillon doit

contenir au moins 60% de cellules tumorales pour être jugé représentatif de la tumeur.

57 gliomes de grade III (OMS), confirmés par une double relecture histologique centralisée, ont été

inclus dans le réseau POLA et constituent notre population d'étude du WES. 51 d'entre eux sont des OIII

(89,5%) et 6 sont des oligoastrocytomes anaplasiques ou gliomes mixtes (10,5%).

Extraction d’ADN à partir de tissu congelé

Dans le cas de tissus congelés, un morceau de tissu tumoral est coupé afin d’en extraire l’ADN

génomique, le reste de tissu est congelé dans de l’azote liquide à -196°C. Le morceau de tissu tumoral est

incubé pendant une nuit à 56°C sous agitation (450 rotations par minute -rpm-) avec 1mL de tampon de lyse

(Lysis Buffer L13, Invitrogen®) et 20µL de protéinase K à 20 mg/mL (Roche

®). Le tampon de lyse va

permettre la dégradation des membranes tandis que la protéinase K va hydrolyser les protéines cellulaires.

Une fois la lyse complète de l’échantillon, on ajoute 10µL de RNAse A à 20 mg/mL (Invitrogen®) et on laisse

incuber 5 minutes à température ambiante, ceci dans le but d’hydrolyser l’ARN de l’échantillon.

L’ADN génomique est ensuite purifié à l’aide de l’automate iPrep™

Purification Instrument

(Invitrogen®) et du kit iPrep

™ ChargeSwitch

® gDNA Tissue Kit (Invitrogen

®). La purification de l’ADN

génomique se base sur la technologie ChargeSwitch®, développée par Invitrogen

®, reposant sur l’utilisation de

billes magnétiques sur lesquelles sont greffés des groupements ionisables. À potentiel Hydrogène (pH)

inférieur à 6, les groupements sont chargés positivement ce qui va permettre la fixation de l’ADN, qui lui, est

chargé négativement par ses phosphates. Les billes (et donc l’ADN) sont retenues par un aimant, tandis que

les contaminants sont éliminés par lavage. La charge des billes est ensuite neutralisée en augmentant le pH

(par une solution peu saline) ce qui va permettre d’éluer l’ADN en se détachant des billes magnétiques.

Extraction d’ADN à partir de tissu fixé au formaldéhyde et inclus en paraffine

Dans le cas de bloc inclus en paraffine, 10 coupes de 20 µm sont coupées au microtome afin d’en

extraire l’ADN. 500 µL de Phosphate Buffered Saline (PBS) sont ajoutés aux copeaux de paraffine et incubés

pendant 10 minutes à 90°C dans le but de rendre la paraffine liquide. Ensuite, le tube est immédiatement

centrifugé pendant 15 minutes à 10 000 relative centrifugal force (rcf) puis placé dans la glace afin de

solidifier le disque de paraffine. En effet, la paraffine étant moins dense que la solution aqueuse, il va se

former un disque de paraffine sur le haut du tube qu’on élimine ensuite à l’aide d’une pince. La suite du

protocole est identique à celui décrit pour le tissu congelé. Le principe de la purification via le kit iPrep™

ChargeSwitch® gDNA Tissue Kit (Invitrogen

®) est présenté en annexe 3.

p. 17

Quantification et qualification d’ADN

L’ADN génomique est quantifié à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop (ND-8000, Thermo

Scientific®) en déposant 1,5 µl d’échantillon. Les deux principaux avantages du dosage au Nanodrop est le

faible volume de matériel nécessaire et le fait qu’il n’y ait pas de dilution préalable nécessaire. Les protéines

absorbent majoritairement à 280 nm ; les composés chimiques et phénoliques majoritairement à 230 nm, et

l’ADN majoritairement à 260 nm. Les rapports A260

/A280

et A260

/A230

permettent d’évaluer la pureté des acides

nucléiques présents dans chaque échantillon. Pour considérer un échantillon pur en ADN, le rapport A260

/A280

doit être compris entre 1,8 et 2,0. Si ce rapport est inférieur à 1,8, la contamination en protéines est considérée

comme importante. Le rapport A260

/A230

, lui, doit être proche de 2,0 afin de pouvoir considérer l’échantillon

exempt de contaminants.

Extraction d’ARN à partir de tissu congelé

Un morceau de tissu tumoral est placé dans un tube contenant des billes de céramique (FastPrep™

Lysing Matrix, MP Biomedicals) et du trizol (responsable de la lyse des cellules). Le tissu est broyé deux fois

pendant 40 secondes à 6 000 rcf à l’aide de l’appareil FastPrep (FastPrep ® FP120, Savant Bio 101). La phase

liquide est transférée dans un tube Eppendorf® et est homogénéisée grâce à un agitateur rotatif pour finaliser la

lyse cellulaire. Du chloroforme est ensuite ajouté au lysat cellulaire pour créer une phase aqueuse et une phase

organique. Le chloroforme va permettre de dissocier les acides nucléiques, qui s'accumuleront au niveau de la

phase aqueuse, des autres constituants cellulaires. La phase aqueuse est récupérée après centrifugation dans un

autre tube qui sera placé dans l’automate de purification iPrep™. La purification se fait à l’aide de billes

magnétiques ionisables qui vont fixer les acides nucléiques et permettre l’élimination des contaminants via des

étapes de lavages. Les ARN sont ensuite précipités par de l’isopropanol, lavés par différents tampons et enfin

élués dans 100 µL d’eau RNase free.

Quantification et qualification d’ARN

Les ARN sont quantifiés à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop (Nanodrop 8000

Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific) en déposant 1,5 µl d’échantillon. Pour considérer un échantillon

pur en ARN, le rapport A260

/A280

doit être proche ou supérieur à 2,0. Si ce rapport est inférieur à 1,8, la

contamination en protéines est considérée comme importante. Le rapport A260

/A230

doit être proche de 2,0 afin

de pouvoir considérer l’échantillon exempt de contaminants.

La qualité des ARN totaux extraits est vérifiée sur puce RNA 6000 Nano Kit (Agilent®) à l’aide d’un

Bioanalyzer2100 (Agilent®). L’instrument met en œuvre un système d’électrophorèse sur puce microfluidique

permettant l’analyse des échantillons à partir de faible quantité (25 ng à 500 ng). Les avantages du

Bioanalyzer sont : la faible consommation en matériel biologique, la reproductibilité des résultats et

l’automatisation du procédé. À l’aide d’un intercalant, l’appareil mesure en temps réel l’intensité de

fluorescence en fonction du temps de migration dans les microréseaux. Pour chaque échantillon, un chiffre,

compris entre 1 et 10, est donné résultant de la qualité globale de l’ARN : c’est le RIN (RNA Integrity

Number). Ce chiffre permet d’attribuer un score à la qualité de l’ARN, plus il est élevé plus la préparation

d’ARN est considérée comme "intacte" ou de "bonne qualité". Le RIN est calculé via un algorithme prenant

en compte l’aire sous les différents pics obtenus, la ligne de base, le ratio ARNr 28S/ARNr18S et l’éventuelle

présence de dégradation. Selon les applications, on considère une préparation d’ARN correcte à partir d’un

RIN ≥ 7. L’étude sur le séquençage des ARN étant en cours d’analyse à Montréal, aucun résultat ne sera

présenté ici. Un exemple d’électrophorégramme et les résultats obtenus au Bioanalyzer sont présentés dans le

document 8 et en annexe 4.

p. 18

Document 8 : Profil électrophorétique d’ARN sur Bioanalyzer 2100 (Agilent®)

p. 19

2) Détermination du statut IDH1/IDH2 par séquençage direct

Dans le but de déterminer le statut mutationnel IDH1 et IDH2 d’une tumeur, l’ADN tumoral est

séquencé par la méthode Sanger 24. Cette méthode de séquençage par synthèse enzymatique, s’appuie sur

l’utilisation de Didésoxyribonucléotides (ddNTP) aussi appelés "terminateurs de chaines". Ces ddNTP ont

pour caractéristique de porter un atome d’hydrogène à leur extrémité 3’ à la place du groupement OH habituel

ce qui empêche l’incorporation d’un autre nucléotide. Chaque ddNTP porte un fluorochrome différent de

manière à pouvoir distinguer quelle base a été incorporée. Suite à la réaction enzymatique, on obtient donc

statistiquement un ensemble de brins d’ADN de longueurs différentes correspondants aux brins

complémentaires de la séquence du brin matrice. Un schéma de principe du séquençage par la méthode Sanger

est présenté en annexe 5.

On réalise donc dans un premier temps une PCR (Polymerase Chain Reaction) classique afin

d’amplifier notre région cible dans le but d’obtenir un signal détectable. Pour cela, on utilise le kit FastStart

PCR Master (Roche®) qui contient à la fois une ADN polymérase recombinante mais aussi le tampon (qui

contient notamment le chlorure de magnésium (MgCl2), co-facteur essentiel aux ADN polymérases) et les

dNTP. La Taq recombinante a pour caractéristique d’être inactive à des températures inférieures à 75°C car

elle a été chimiquement bloquée afin d’éviter l’amplification de séquences non spécifiques. Elle est "libérée"

dans le milieu réactionnel par un chauffage de 5 minutes à 95°C. Elle est qualifiée de Hot Start. Le milieu

réactionnel de la PCR classique ainsi que le cyclage utilisé sont indiqués en annexe 6 et 7.

La taille des amplicons attendus est de 290 paires de bases (pb) pour IDH1 et 170 pb pour IDH2. 2µL

de produit PCR sont déposés au Caliper LabChip® GX (PerkinElmer

®) (annexe 8). Le Caliper est un appareil

mettant en œuvre un système de microfluidique permettant la séparation des acides nucléiques. Les avantages

du Caliper sont la faible consommation en échantillon (2 µL de produit PCR), la rapidité (30 secondes de

migration par échantillon), la sensibilité et la reproductibilité. Les amplicons sont ensuite purifiés à l’aide du

kit Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter ©) (annexe 9). Ce kit de purification permet, à l’aide de billes

magnétiques ionisables, de purifier les amplicons d'une taille supérieur à 100 paires de bases (pb) en éliminant

donc les amorces en excès, les dimères d’amorces, les dNTP non incorporés et les sels.

Une fois les produits de PCR purifiés, on réalise la réaction de séquençage. Pour cela, l’ADN est

mélangé avec l’amorce sens ou anti-sens ainsi que le mix du kit Big Dye Terminator v3.1 (Applied

Biosystems®) qui contient l’ADN polymérase, les 4 dNTP, les 4ddNTP marqués et le tampon. Le milieu

réactionnel de la réaction de séquençage ainsi que le cyclage utilisé sont indiqués en annexe 10 et 11. Les

produits de séquençage sont ensuite purifiés à l'aide du kit Agencourt CleanSEQ (Beckman Coulter ©

) afin

d’éliminer les ddNTP non incorporés ainsi que les autres réactifs non utilisés. Puis les échantillons sont

séquencés sur un séquenceur 48 capillaires 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems®).

Les 916 électrophorégrammes réalisés au cours du projet sont ensuite lus par le logiciel Chromas Lite

et comparés par rapport aux séquences de références des gènes IDH1 et IDH2.

Pour le gène IDH1, la séquence de référence est : ATA-GGT-CGT-CAT-GCT

Pour le gène IDH2, la séquence de référence est : ATT-GGC-AGG-CAC-GCC

p. 20

3) Caractérisation moléculaire des tumeurs sur puce pan-génomique

La technique de CGH array a été inventée en 1998 25

et connaît un essor considérable depuis les

années 2005. Elle permet, à l’aide de puces à ADN, la détection à haute résolution des anomalies

chromosomiques sur l’ensemble du génome.

Le principe de la CGH array repose sur une hybridation compétitive entre un ADN cible et un ADN

de référence, tous deux marqués par un fluorochrome différent. Les puces pan-génomiques d’Agilent® se

présentent sous forme de lame de verre, sur lesquelles plusieurs dizaines de milliers à plus d’un million de

sondes de 60 bases sont fixées via un système de jet d’encre. Ces fragments d’ADN de séquence et de position

génomique connue couvrent l’ensemble du génome et sont représentatifs d’une seule séquence génomique

chacun.

Le marquage est réalisé à l’aide de deux fluorochromes : les cyanines 3 et 5. Pour chaque échantillon,

l’ADN de référence (ADN sanguin) est marqué par la cyanine 3 et l’ADN cible (ADN tumoral) est marqué

par la cyanine 5. Les puces utilisées sont des lames de 4 spots sur lesquels sont fixés 180 000 sondes couvrant

l’ensemble du génome humain, soit une sonde tous les 17kb. L’ensemble des kits et leurs coûts sont

référencés en annexe 12.

Préparation et marquage des ADN par amorçage aléatoire

Les couples d’ADN tumoral-sanguin sont dégradés par la chaleur pendant 30 minutes à 95°C dans le

but d’obtenir de petits fragments d’ADN afin de permettre l’hybridation avec les sondes. La dégradation de

l’ADN est vérifiée sur gel d’agarose, la présence d’un smear est synonyme d’une bonne dégradation.

1 µg d’ADN tumoral et sanguin sont placés dans des tubes. On y ajoute 5 µL de random primers, qui

sont des amorces aléatoires qui vont se fixer aléatoirement sur l’ensemble du génome. On chauffe à 95°C

pendant 10 minutes afin de dénaturer l’ADN puis on place immédiatement les tubes dans la glace pendant

5 minutes dans le but de figer l’ADN dans un état dénaturé.

La réaction de marquage se fait en ajoutant dans chaque tube des dNTP, des cy3-dUTP ou cy5-dUTP

et le fragment Exo-Klenow de l’ADN polymérase I d’Escherichia Coli. Conventionnellement l’ADN sanguin

est marqué par la cyanine 3 et l’ADN tumoral par la cyanine 5. Le fragment Exo-Klenow est utilisé pour le

marquage des ADN car il n’a conservé que son activité polymérase. Les deux activités exonucléasiques 5’-3’

et 3’-5’ ont été perdues. L’élongation se fait à 37°C pendant deux heures puis l’ADN polymérase est inactivée

en chauffant 10 minutes à 65°C.

p. 21

Purification des ADN marqués et calcul des rendements de marquages

Une fois marqué, chaque ADN est purifié à l’aide des filtres Microcon®-

30kDa Centrifugal Filter

(Merck Millipore®). Ce filtre permet de retenir l’ADN sur sa membrane de cellulose et donc d’éliminer les

cyanines non incorporées ainsi que les autres contaminants. Après purification, les ADN marqués sont dosés

au Nanodrop selon les longueurs d’ondes d’excitation des cyanines 3 et 5 (à 550 nm et 649 nm,

respectivement). Cela nous permet de connaître le nombre de molécules de cyanines présent dans la

préparation (en pmol/µL) et la concentration en ADN (ng/µL). On évalue ensuite le volume récupéré après

purification afin d’en déduire la quantité totale d’ADN dans la préparation. Puis, en divisant cette quantité par

le nombre de molécules de cyanines présent dans la préparation, on obtient un rendement d’incorporation qui

correspond au nombre de molécules de cyanines incorporées par nanogramme d’ADN (pmol/ng). Le

rendement des cyanines est toujours supérieur pour l’ADN sanguin. Cela est dû au fait que la cyanine 5 est

plus grande que la cyanine 3 et s’incorpore donc plus difficilement. De plus la cyanine 5 est sensible à la

dégradation par l’ozone contrairement à la cyanine 3 qui ne l’est pas. Les couples d’ADN tumoral-sanguin

sont ensuite mélangés de façon équimolaire.

Hybridation, lavages et lecture de la lame de CGH array au scanner

On ajoute au pool d’ADN marqués un agent bloquant, de l’ADN humain Cot-1 et du tampon

d’hybridation qu’on incube pendant 3 minutes à 95°C puis 30 minutes à 37°C. L’agent bloquant est utilisé

afin de réduire les hybridations non spécifiques sur la lame, tandis que les séquences de 50-300 pb enrichies

en séquences répétées (comme Alu, Kpn) présentes dans l’ADN humain Cot-1 servent à bloquer, par

hybridation, les séquences répétées contenues dans nos échantillons.

10 µg d’ADN marqués sont ensuite hybridés sur chaque spot de la lame et incubés à 65°C pendant 48

heures à 20 rpm. Une fois le temps d’hybridation terminé, on désassemble et on rince la lame pendant

5 minutes dans un tampon de lavage puis 1 minute dans un second tampon de lavage préchauffé à 37°C. Ce

dernier contient notamment de l’acétonitrile qui permet d’éliminer toute trace liquide sur la lame avant le

passage au scanner. Les lavages permettent d’éliminer les hybridations aspécifiques qui se sont

éventuellement formées lors de l’hybridation.

La lame est ensuite placée dans un scanner MS 200 Microarray Scanner (NimbleGen, Roche®). Un

premier scan est réalisé avec une résolution de 40 µm permettant d’obtenir une image rapide de la lame et

d’observer d’éventuelles traces de lavage. Un second scan est réalisé avec une résolution de 2 µm. Le scanner

génère alors deux images, l’une avec la longueur d’onde d’émission de la cyanine 3, 570 nm et l’autre avec

celle de la cyanine 5, 670 nm. Les deux images sont ensuite analysées, calibrées et corrigées en fonction du

bruit de fond, puis superposées à l’aide du logiciel CytoGenomics (Agilent®). A la suite de cette analyse, un

score de qualité est attribué pour chaque spot reflétant la reproductibilité des réplicats, le nombre de sondes

hors de la calibration et l’écart médian de signal entre l’échantillon tumoral et sanguin. Le fichier généré est

ensuite analysé à l’aide du logiciel Nexus Copy Number (BioDiscovery®) qui nous permet ensuite de

visualiser les différentes altérations génomiques de façon quantitative.

p. 22

4) Recherche de variants par séquençage haut débit : Whole-Exome Sequencing

L’objectif du WES est d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’oncogenèse des gliomes de

grade III (OMS) et d’étudier leur sens clinico-biologique.

Les manipulations de WES ont été réalisées par l’équipe du Pr. Mark LATHROP, au Centre National

de Génotypage (CNG, Évry), sur une cohorte de 57 patients du réseau POLA pour lesquels nous disposions de

l’ADN tumoral, de l’ADN sanguin et des données cliniques. Les données générées ont ensuite été analysées

par l’équipe du Pr. Richard HOULSTON, à l’Institute of Cancer Research (ICR, Londres).

Depuis 2007, avec l’avènement des séquenceurs de nouvelle génération, il est désormais possible de

séquencer massivement, rapidement et à relativement faible coût. Cette nouvelle ère a considérablement

bouleversé le monde de la recherche et marque un pas vers une meilleure compréhension de certaines

pathologies. Le WES a été réalisé sur un séquenceur haut débit HiSeq2000 (Illumina®)

a) Principe du séquençage haut débit sur plateforme Illumina

Les différentes étapes de l’analyse WES sont les suivantes :

- préparation de la librairie d'ADN

- capture des exons

- amplification clonale : bridge PCR

- réaction de séquençage

Préparation de la librairie d'ADN

5 µg d’ADN tumoral et sanguin sont fragmentés de manière aléatoire par nébulisation de manière à

obtenir des fragments de 300-800 pb qu'on sélectionne par électrophorèse. Les extrémités sont réparées dans

le but d'obtenir des bouts francs afin de lier des adaptateurs aux extrémités (document 9).

Capture des exons

Une fois la librairie d'ADN préparée, une étape de capture des exons est réalisée. L'ADN génomique

est capturé à l'aide du kit SureSelect Human All Exon Kits (Agilent®). Ce kit se base sur la technologie

SureSelect qui permet la capture des exons selon la méthode d'enrichissement en solution (document 10). Une

librairie de sondes longues d'ARN biotinylées (120 pb) représentant l'ensemble des exons du génome humain

ainsi que les régions 3' UnTranslated Region (UTR) et 5' UTR sont mélangées à notre librairie d'ADN.

Agilent® a choisi des sondes ARN plutôt qu'ADN car l'hybridation ARN/ADN est plus forte qu'une

hybridation ADN/ADN et permet une meilleure sensibilité pour la suite du séquençage. Après 24 heures

d'hybridation, des billes magnétiques recouvertes de streptavidine sont ajoutées afin de capturer à l'aide d'un

aimant magnétique toutes les séquences qui se seront hybridées aux ARN biotinylées. Les billes sont ensuite

éliminées par lavage et l'ARN est hydrolysé par une ribonucléase.

p. 23

Document 9 : Préparation de la librairie d'ADN tiré de http://www.illumina.com

Légende : Fragmentation aléatoire de l’ADN, réparation des extrémités en "bouts francs" et ligation d’adaptateurs

Document 10 : Capture des régions exoniques à l’aide du kit SureSelect Human All Exon Kits (Agilent®)

tiré de http://www.genomics.agilent.com/ Légende : Capture des exons à l’aide de sondes ARN biotinylées représentant chacune une région exonique spécifique du génome humain.

p. 24

Amplification clonale : bridge PCR

Une PCR en pont en phase solide (bridge PCR) est réalisée afin d'amplifier de façon clonale une

molécule d'ADN en plusieurs millions de copies. La librairie d'ADN est déposée sur une puce de séquençage

haut débit (flow-cell) sur laquelle sont fixées des millions de séquences simples brins complémentaires des

adaptateurs de la librairie. Une des extrémités de l'ADN va s’hybrider avec les oligonucléotides fixés sur la

flow-cell et avec des conditions de stringence particulières, un pont va se former avec la seconde extrémité

libre qui va s'hybrider à un oligonucléotide complémentaire voisin. Après plusieurs cycles de dénaturation,

d’hybridation et d’élongation, des millions de séquences issues de séquences uniques vont former ce qu'on

appelle des clusters (document 11).

Réaction de séquençage

Après l'amplification, la réaction de séquençage est faite à l'aide de terminateurs de chaînes

réversibles. Ces dNTP chimiquement modifiés portent à leurs extrémités 3' un fluorochrome caractéristique du

dNTP et un groupement "bloqueur" qui ne permet pas l'incorporation d'un nucléotide à sa suite. La réaction de

séquençage se fait de façon cyclique : (i) les dNTP sont ajoutés, (ii) les dNTP non incorporés sont éliminés par

lavage, (iii) lecture du dNTP incorporé par excitation du fluorochrome via un laser, (iv) libération du

groupement "bloqueur" et (v) élimination du fluorochrome.

b) Traitement bio-informatique des données générées

Les données générées par le WES sont considérables et l'analyse bio-informatique qui en découle est

lourde et primordiale (annexe 13). Une première analyse appelée base calling consiste en l'analyse des images

générées par le séquenceur et la détermination d'un score de qualité reflétant la qualité du séquençage : le

phred quality score. Le phred score reflète la probabilité que le nucléotide lu soit une erreur de séquençage.

Par exemple un phred de 10 signifie qu'il y a 1/10 chance que la base lue ne corresponde pas à la base réelle.

Un phred de 30 signifie qu'il y a 1/1000 chance que la base lue ne corresponde pas à la base réelle, soit une

fiabilité équivalente à 99,999 %.

À l’aide du logiciel Burrows-Wheeler Aligner (BWA- http://bio-bwa.sourceforge.net), un alignement

des reads (lectures) est réalisé sur le génome de référence humain public le plus récent, datant de février

2009 : hg19 (University of California, Santa Cruz – UCSC). Cette étape permet, outre son alignement sur le

génome humain, d'attribuer, à chaque base, une couverture qui reflète le nombre de fois que la base a été lue

par le séquenceur.

Une étape de variant calling est ensuite appliquée via le logiciel GATK UnifiedGenotyper

(http://www.broadinstitute.org/gatk/gatkdocs/org_broadinstitute_sting_gatk_walkers_genotyper_UnifiedGeno

typer.html) dans le but de détecter les Single Nucléotide Variation (SNV) et des insertions/délétions (InDels).

Les variations détectées ainsi que les régions codantes et non codantes sont ensuite annotées via le

logiciel GATK SnpEff (http://gatkforums.broadinstitute.org/discussion/50/adding-genomic-annotations-using-

snpeff-and-variantannotator). Pour chaque variation détectée, un impact fonctionnel théorique est donné : high

(élevé), moderate (moyen), low (faible) et modifier (modificateur). L’impact fonctionnel prend en compte à la

fois la nature de la mutation (e.g. mutation ponctuelle de type SNV, mutation entrainant un changement du

cadre de lecture de type InDels) mais aussi sa position génomique (e.g. régions codantes : exons, régions non

codantes : introns, 3’ UTR et 5’ UTR).

p. 25

Document 11 : Schéma de principe de l'amplification clonale par bridge PCR tiré de http://www.illumina.com

Légende : Amplification clonale en pont en phase solide et formation de clusters à la surface de la flow-cell.

p. 26

Les Single Nucléotide Polymorphism (SNP) sont des variations d'un nucléotide par un autre et

représentent à eux seuls environ 90 % des variations génétiques entre individus. Les SNP sont généralement

localisés dans les régions fermées (non traduites) de l'ADN ou dans les régions introniques. Ils peuvent aussi

être dans les régions codantes de l'ADN mais la fonction principale de la protéine codée est très rarement

modifiée. C'est pour cette raison qu'un filtre est appliqué. Seules les variations non constitutionnelles

(somatiques), non référencées dans database SNP (dbSNP) et ayant un impact fonctionnel high ou moderate.

Les mutations ayant un impact fonctionnel low (n’entrainant pas de changement d’acide aminé) et modifier

(située dans les régions non codantes) ne sont donc pas conservées.

Les critères de sélection des variants sont :

- phred score (qualité) > 30

- couverture (quantité) > 30X

- SNV tumeur-spécifique

- non référencé dans dbSNP

- impact fonctionnel élevé ou modéré


Malgré les progrès technologiques de ces dernières années, le séquençage haut débit reste une analyse

à grande échelle pour laquelle des erreurs sont encore commises. C'est pourquoi on se doit de valider les

variations sélectionnées par séquençage direct. La méthode de Sanger est une méthode rapide, faible et peu

coûteuse permettant donc de facilement valider les variations sélectionnées.

Les couples d’ADN tumoral-sanguin sont amplifiés puis séquencés en utilisant le même protocole que

dans la partie 2. Seules les variations somatiques sont conservées.

p. 27

5) Séquençage moyen débit du gène CIC via la technologie 454 – Roche®

Dans le but d'enrichir les données obtenues par WES et de valider la fréquence de mutation du gène

CIC de la littérature, un séquençage moyen débit sur GS Junior System (Technologie 454, Roche®) sur une

série de 52 OIII présentant tous une co-délétion des bras 1p et 19q, a été réalisé. Cette série comporte

32 tumeurs déjà passées en WES et 20 tumeurs supplémentaires, ceci dans le but de vérifier le pourcentage de

variants sur le gène CIC par rapport aux données de la littérature (Cf. résultats de WES).

Le GS Junior System (Roche®) est le "modèle de paillasse" de la société Roche

® utilisant la

technologie 454. Cette technologie se base sur une amplification clonale via une PCR en émulsion puis par un

pyroséquençage. 100 000 à 150 000 lectures de 300-400 pb sont générées en 10 heures, soit un total d’environ

50 mégabases. Ce séquençage a été réalisé sur le GS Junior de la plateforme Génotypage et Séquençage située

au 2ème

étage de l’ICM.

a) Principe du séquençage par la technologie 454 sur GS Junior

Les différentes étapes du séquençage sur GS Junior sont les suivantes :

- amplification des régions exoniques d’intérêt

- préparation de la librairie d'ADN

- amplification clonale : émulsion PCR

- enrichissement des billes positives

- réaction de séquençage : le pyroséquençage

Amplification des régions exoniques d’intérêt

Les 20 exons composants le gène CIC ont donc été découpés par amplicons de 200 à 300 pb chacun,

pour un total de 28 amplicons finaux (annexe 14). L’ensemble des régions exoniques de l’ADN tumoral ont

été amplifiées par PCR pour les 52 patients d’après le protocole en annexe 15. Une séquence universelle de

20 pb est ajoutée à l’extrémité 5’ de chaque amorce dans le but de pouvoir ajouter les adaptateurs par la suite.

Du diméthylsulfoxyde (DMSO) est ajouté dans le milieu réactionnel de la PCR afin d’augmenter le rendement

d’amplification en réduisant la formation de structure secondaire. Après purification, la taille des amplicons

est vérifiée en déposant 2µL de produits PCR au Caliper (document 12).

Préparation de la librairie d’ADN

Tous les amplicons d’un même échantillon (28 amplicons par échantillon) sont mélangés dans un

même puits de façon équimolaire. Les pools d’amplicons sont purifiés à l’aide du kit Agencourt AMPure XP

(Beckman Coulter ©

). Une touchdown PCR est ensuite réalisée (annexe 16) dans le but d’ajouter les

adaptateurs MIDs (Multiplex IDentifiers) grâce aux séquences universelles de nos amplicons. Les MIDs sont

de courtes séquences de dix paires de bases qui permettent d’identifier chaque échantillon selon son étiquette

MID lors du séquençage. Les adaptateurs contiennent, en partant de 5’, l’amorce A ou B pour le séquençage,

la clé et la séquence MID (document 13). La clé est une séquence de quatre bases permettant au séquenceur de

ne pas commencer le séquençage des fragments qui n’ont pas d’adaptateurs à leurs extrémités.

p. 28

Document 12 : Migration des amplicons du gène CIC au Caliper

Document 13 : Ajout des adaptateurs A et B par PCR tiré de la fiche technique Roche®

Légende : Les adaptateurs A et B sont ajoutés, par PCR, aux amplicons grâce à leur séquence universelle présente à chaque extrémité (vert foncé).

Adaptateur A : Amorce A – Clé – MID

Adaptateur B : Amorce B – Clé – MID

p. 29

Une Taq polymérase recombinante de haute-fidélité est utilisée afin d’éviter au maximum les erreurs

lors de l’élongation. Une touchdown PCR est réalisée dans le but de réduire au maximum les hybridations non

spécifiques et donc la formation d’amplicons non souhaités. Pour cela, la température d’hybridation est placée

10°C au-dessus de la Tm (melting Temperature) des amorces puis est diminuée de 1°C par cycle pendant

10 cycles jusqu’à atteindre la Tm des amorces. Les 10 premiers cycles permettent d’augmenter la stringence et

donc de n’amplifier que nos séquences cibles. Puis les 30 cycles suivants permettent d’augmenter le

rendement d’amplification en abaissant la température d‘hybridation à la Tm des amorces.

Les amplicons de PCR MID sont ensuite déposés au Caliper puis purifiés à l’AMPure XP. Une fois

purifié, les échantillons (contenant chacun les 28 amplicons) sont dosés au Nanodrop puis mélangés dans un

seul puits de façon équimolaire. Le tube contient donc les 52 échantillons pour lesquels il y a 28 amplicons

chacun. Ce maxi pool est purifié, dosé puis déposé au Caliper (document 14). Notre librairie d’ADN est

désormais prête.

Amplification clonale : émulsion PCR

L’émulsion PCR est réalisée dans un mélange huile/eau afin de former des microgouttelettes (ou

microréacteurs) contenant les "acteurs de la PCR" ainsi que des billes de captures, sur lesquelles sont fixées

des millions de sondes complémentaires des séquences MIDS (document 15). Afin d’amplifier de façon

clonale un seul fragment d’ADN, on va travailler en condition limitante, c'est-à-dire que dans chaque

microréacteur, on souhaite qu’il y ait soit 1, soit 0 molécule d’ADN. Pour que cela soit effectif, il faut déposer

2 molécules d’ADN/bille. Les conditions de l’émulsion PCR sont standardisées : on dispose de 5 millions de

billes que l’on mélange avec 5 µL de notre échantillon. Par conséquent, il faut déposer 10 millions de

molécules dans un volume de 5µL, on dilue donc notre échantillon à 2*106 molécules d’ADN/µL. Pour cela, à

partir de la concentration de notre maxi pool et de la taille moyenne de la totalité des amplicons, on arrive au

nombre de molécules d’ADN par µL avec la formule suivante :

Nombre de molécules/µL de maxi ADN Nombre d'Avogadro

Masse molaire moyenne d'une paire de base Taille moyenne amplicons

[ADN] : concentration en ADN en ng/µL ; Nombre d’Avogadro 6,022 1023 mol-1 ; Masse molaire moyenne d’une paire de base 656,6 g/mol ;

Taille moyenne des amplicons = 379 pb.

Enrichissement des billes positives

Une fois l’amplification faite, on réalise une étape d’enrichissement qui consiste à conserver

uniquement les billes sur lesquelles il y a eu une amplification. Pour cela, des amorces biotinylées,

complémentaires des amorces A et B, sont ajoutées et vont s’hybrider aux fragments d’ADN. Cette

particularité permet, par l’ajout de billes magnétiques recouvertes de streptavidine, de fixer, via la biotine, les

billes sur lesquelles il y a eu une amplification. Cela permet donc, par des étapes de lavage, d’éliminer toutes

les billes qui n’ont pas eu d’amplification lors de l’émulsion PCR.

p. 30

Document 14 : Migration du maxi pool au Caliper Légende : Le maxi pool contient les 52 échantillons, identifiés par des MIDs différents, pour lesquels on dispose, pour chacun, les 28 amplicons du

gène CIC.

Document 15 : Schéma de principe de l’émulsion PCR tiré de la fiche technique Roche® Légende : A. L’ADN est ajouté aux billes de captures de façon limitante afin d’obtenir statistiquement une ou zéro molécule d’ADN par bille. B. Tous

les "acteurs" de la PCR sont présents dans les microréacteurs. C. L’amplification clonale de la molécule d’ADN se fait au sein du microréacteur. D. Le

mélange huile/eau est ensuite brisé afin de récupérer les billes de captures sur lesquelles se trouvent des millions de copies du fragment initial.

p. 31

Réaction de séquençage : le pyroséquençage

La technologie 454 de chez Roche® se base sur le pyroséquençage (document 16). Les 4 bases de

l'ADN sont ajoutées de façon cyclique : une base après l'autre avec des étapes de lavage entre chaque base.

Lorsque la base ajoutée est complémentaire du brin matrice, il y a ajout de la base et libération d'un

pyrophosphate qui sera transformé en ATP par une enzyme présente dans le milieu réactionnel (la

sulfurylase). Une seconde enzyme (la luciférase) va se servir de cet ATP afin d’émettre un signal luminescent

qui sera ensuite détecté par une caméra CCD (charge coupled device).

500 000 billes sont ensuite déposées sur un support de 5cm x 2cm, appelé PicoTiterPlate (PTP), qui

contient 350 000 puits (document 17) dans le but d’obtenir statistiquement une bille par puits. Un "sandwich"

est déposé au sein de chaque puits de la PTP (document 18). Une première couche d’enzyme est déposée,

ensuite sont déposées nos billes d’ADN, puis une seconde couche d’enzyme et enfin une dernière couche est

déposée. Les deux premières couches d'enzymes contiennent la sulfurylase et la luciférase nécessaire au

séquençage. Alors que la dernière couche contient notamment de l’apyrase servant à dégrader les dNTPs en

excès ainsi que l’ATP.

Un des inconvénients de cette technologie (qu'on retrouve également dans la plupart des autres

technologies) est que dans les régions homopolymériques, le signal capté par la caméra CCD n'est pas

systématiquement proportionnel au nombre de bases ajoutées. C’est pourquoi il faut en tenir compte lors de

l’analyse bio-informatique qui en découle.

b) Traitement bio-informatique des données

En sortie du séquençage, les fichiers sont démultiplexés puis analysés à l’aide du logiciel CLC

Genomics Workbench (CLC bio®). Les séquences brutes sont alignées avec la séquence de référence du gène

CIC d’après l’algorithme de Smith-Waterman. Les variants sont détectés puis annotés via le programme

Probabilistic Variant Caller du logiciel. Une requête est ensuite réalisée via Access (Microsoft Office®) afin de

croiser les variations obtenues avec les bases de données publiques de 1 000 Genomes Project, Catalogue Of

Somatic Mutations In Cancer (COSMIC) et Exome Variant Server (EVS). Cela permet d’identifier les

variations détectées lors du séquençage qui ont déjà été décrites dans les bases de données et donc notamment

d’identifier les SNP.

Les critères de sélection des variants sont :

- couverture > 10X

- région non homopolymérique

- Au moins 5 % de reads mutés dans les 2 sens (F et R)

- SNV tumeur-spécifique

- non référencé dans 1 000 Genomes Project

- impact fonctionnel élevé ou modéré


Tout comme le séquençage haut débit, l’étape de validation des variations détectées reste encore à ce

jour nécessaire.

Les couples d’ADN tumoral-sanguin sont amplifiés puis séquencés en utilisant le même protocole que

dans la partie 2. Seules les variations somatiques sont conservées.

p. 32

Document 16 : Schéma de principe du pyroséquençage – technologie 454 (Roche®).

tiré de la fiche technique Roche® Légende : Lors de l’incorporation d’une base, un pyrophosphate (PPi) est libéré, il va être utilisé par une sulfurylase afin de former de l’ATP qui lui-

même va servir à une luciférase pour émettre un signal luminescent qui sera capté par une caméra CCD.

Document 17 : PicoTiterPlate (PTP)

Document 18 : Mise en place du "sandwich" au sein de la PicoTiterPlate (PTP) tiré de la fiche technique Roche®

Résultats

1) Population d'étude

Les données cliniques, biologiques, pathologiques de la population d'étude sont présentées dans le

document 19.

57 patients du réseau POLA ont été inclus dans notre étude : 38 hommes et 19 femmes (sexe ratio H/F

2,0). L’âge médian était de 48 ans (extrêmes 27-81 ans). Toutes les tumeurs étaient des gliomes de grade III

confirmés par une double relecture neuropathologique centralisée (51 OIII et 6 OAIII).

L’indice de Karnofsky (IK) est un score de performance servant à mesurer la capacité d’une personne

à exécuter les actes de la vie quotidienne (e.g. habillage, toilette). Il permet donc de mesurer une éventuelle

amélioration ou aggravation du handicap lié à la maladie. Plus l’indice est faible, plus le patient est handicapé

par la maladie et plus il a besoin d’aide pour les actes de la vie quotidienne. L'IK médian de la population

d'étude est de 90 (un IK >70 indique que le patient est autonome à domicile).

La notion de survie sans progression (Progression-Free Survival – PFS), traduit le temps écoulé

jusqu'à une éventuelle progression (aggravation ou décès) de la maladie. Alors que la survie globale (Overall

Survival – OS), traduit le temps écoulé jusqu'à l'éventuel décès du patient. Ces deux notions permettent de

réaliser des courbes de survies qui sont très couramment utilisées afin d'étudier l’efficacité d’un traitement ou

la présence/absence d'un biomarqueur sur l’évolution de la pathologie.

Les manifestations cliniques au diagnostic étaient des crises d'épilepsie, des céphalées, des troubles

cognitifs et un déficit sensitivo-moteur chez respectivement 53,7%, 35,2%, 16,7% et 9,3% des patients. La

localisation de la tumeur était frontale chez 73,7% des patients et une prise de contraste sur les examens

radiologiques a été observée dans 70,0% des tumeurs.

Des figures mitotiques, des atypies cytonucléaires, de la nécrose, de la vascularisation endocrinoïde et

des calcifications étaient respectivement observées dans 100%, 59%, 27%, 95%, 86% des tumeurs.

2) Mise en évidence d'altérations génétiques et génomiques dans les OIII

a) Validation des altérations connues

Par CGH array

La co-délétion 1p/19q :

Le statut des bras chromosomiques des tumeurs a été déterminé par analyse du profil sur puce pan-

génomique de CGH array et la co-délétion 1p/19q a été observée dans 82,5% des tumeurs.

L’image présentée dans le document 20 est un profil obtenu en CGH array d’un OIII après analyse par

le logiciel Nexus Copy Number (BioDiscovery). Le nuage de points bleus représente l'ensemble des sondes

couvrant la totalité du génome humain. Les lignes situées aux extrémités en vert et rouge correspondent

respectivement aux amplifications géniques et aux délétions homozygotes. Les lignes intermédiaires verte et

rouge correspondent aux gains et aux délétions hétérozygotes. La ligne jaune correspond à la ligne de base

caractéristique du profil de la tumeur. Dans le cas où la ligne de base franchit les bornes délimitées par les

lignes verte et rouge, il y a alors une aberration chromosomique, comme ici, par exemple, avec la co-délétion

1p/19q.

Document 19 : Représentation des données cliniques, biologiques et pathologiques de la cohorte en fonction

de la co-délétion 1p/19q Légende : 1p/19q : tumeurs présentant la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q ; Non 1p/19q : tumeurs ne présentant pas la co-délétion des

bras chromosomiques 1p et 19q ; OIII : oligodendrogliome anaplasique ; OAIII : oligoastrocytome anaplasique ; IK : Indice de Karnofsky ; PFS : survie

sans progression (Progression-Free Survival) ; Nb : Nombre ; OS : survie globale (Overall Survival) ; Déficit SM : déficit sensitivo-moteur ; cyto. :

cytonucléaires ; Vasc. endo. : vascularisation endocrinoïde.

1p/19q Non 1p/19q Total

Nombre | Pourcentage 47 | 82,5% 10 | 17,5% 57

Histologie OIII 45 | 95,7 6 | 60,0 51 | 89,5

OAIII 2 | 4,3 4 | 40,0 6 | 11,5

Clinique

Âge médian [min-max] 49 [31-81] 46 [27-81] 48 [27-81]

Sexe ratio (H/F) 1,9 2,3 2,0

IK médian [min-max] 90 [60-100] 85 [80-100] 90 [60-100]

PFS (semaines) 113 99 109

Nb d'évènements 15 5 20

OS (semaines) 123 99 118


Signes cliniques

Épilepsie 23 | 52,3 6 | 60,0 29 | 53,7

Céphalées 16 | 36,4 3 | 30,0 19 | 35,2

Troubles cognitifs 9 | 15,8 0 | 0 9 | 16,7

Déficit SM 3 | 6,8 2 | 20,0 5 | 9,3

Localisation tumorale Frontale 36 | 76,6 6 | 60,0 42 | 73,7

Non Frontale 11 | 23,4 4 | 40,0 15 | 26,3

Prise de contraste Présence 29 | 70,7 6 | 66,7 35 | 70,0

Absence 12 | 21,3 3 | 33,3 15 | 30,0

Neuropathologie

Mitose 46 | 100 10 | 100 56 | 100

Atypies cyto. 23 | 50,0 10 | 100 33 | 58,9

Nécrose 11 | 23,9 4 | 40,0 15 | 26,8

Vasc. endo. 44 | 95,7 8 | 80,0 52 | 92,9

Calcification 39 | 84,8 9 | 100 48 | 85,7

Document 20 : Profil de CGH array d’un oligodendrogliome anaplasique Légende : Profil d’un oligodendrogliome anaplasique en CGH array présentant la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q.

Par Whole-Exome Sequencing (WES)

L’analyse bio-informatique des résultats du WES a mis en évidence que 1 316 gènes sont retrouvés

mutés au moins une fois, 262 gènes sont retrouvés mutés au moins deux fois et enfin 66 gènes sont retrouvés

mutés trois fois et plus au sein de la population d’étude.

Les gènes IDH1 et IDH2 :

La présence (ou non) de mutations sur le gène IDH1 et IDH2 a été définie par séquençage direct par la

méthode Sanger et 94,7% des tumeurs présentant une mutation sur les gènes IDH1 ou IDH2.

Le gène IDH1 est retrouvé muté chez 47/57 patients. Après validation, toutes les mutations ont été

validées (82,5%). L'ensemble des mutations retrouvées sur le gène IDH1 se situent au niveau du résidu

arginine situé en position 132 (annexe 17)

Le gène IDH2 est retrouvé muté chez 6/57 patients (document 21). Après validation, toutes les

mutations ont été validées (10,5%). L'ensemble des mutations retrouvées sur le gène IDH2 se situent au niveau

du résidu arginine situé en position 172 (annexe 18)

Le gène CIC :

Le gène CIC est retrouvé muté chez 12/57 patients (document 22). Après validation, 11/57 patients

(19,3%) ont été confirmés en séquençage Sanger.

Le gène FUBP1 :

Le gène FUBP1 est retrouvé muté chez 10/57 patients (document 23). Après validation, 9/57 patients

(15,8%) ont été confirmés en séquençage Sanger.

Document 21 : Validation des mutations retrouvées sur le gène IDH2 Légende : Chr : chromosome ; Statut 1p/19q : statut de la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q ; Séq. Réf : séquence de référence ;

Altération : séquence retrouvée lors du séquençage whole-exome ; Subst. : mutation ponctuelle de type SNV ; fs : mutation entrainant un changement du

cadre de lecture (frameshift) ; InDel : insertion ou délétion n’entrainant pas de changement du cadre de lecture ; Stop : mutation entrainant l’apparition

d’un codon stop ; V : mutation validée par séquençage Sanger I : mutation invalidée par séquençage Sanger.

Tumeur Statut 1p/19q Chr Position Séq réf. Altération Nature Validation

2694 co-délété 15 90631838 C T Subst. V




3016 co-délété 15 90631838 C A Subst. V


Document 22 : Validation des mutations retrouvées sur le gène CIC Légende : Chr : chromosome ; Statut 1p/19q : statut de la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q ; Séq. Réf : séquence de référence ;





2472 co-délété 19 42791371 AG - fs I

42796553 TG - fs V

2671 co-délété 19 42795715 CAGT - fs V

2688 co-délété 19 42794104 G A Subst. V

2691 co-délété 19 42793217 TCAG - fs V



2842 co-délété 19 42794521 CT - fs V



3122 co-délété 19 42797749 C A Subst. I

3320 co-délété 19 42791176 - TGTT fs V

3463 co-délété 19 42791736 A G Subst. V

Document 23 : Validation des mutations retrouvées sur le gène FUBP1 Légende : Chr : chromosome ; Statut 1p/19q : statut de la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q ; Séq. Réf : séquence de référence ;





2402 co-délété 1 78422271 - T fs V

2472 co-délété 1 78425914 C A Stop I

2485 co-délété 1 78430858 CCATCATGGCGAT - fs V

2551 co-délété 1 78422357 AGCTTGGGCT - fs V

2716 co-délété 1 78432429 G C Subst. V

78432436 G A Subst. V

2755 co-délété 1 78430423 G - fs V

2807 co-délété 1 78430381 G T Stop V

2911 co-délété 1 78426115 ACCTCCTGGGCC - InDel V

78426115 - GAGG fs V

3126 co-délété 1 78430342 G T Subst. V

3237 co-délété 1 78430405 AT - fs V

b) Validation des altérations originales

D’après la fonction cellulaire et l'hypothétique rôle dans la gliomagenèse des gènes altérés, nous avons

décidé, de façon arbitraire, de valider une série de gènes qui nous semblait pertinent du point de vue de la

pathologie. C’est pourquoi, les mutations retrouvées sur les gènes SYNE1, FAT1 et SETD2 ont été validées par

séquençage Sanger.

Le gène SYNE1 :

Le gène SYNE1, spectrin repeat containing, nuclear envelope 1, localisé sur le chromosome 6q24 est

retrouvé muté chez 4/57 patients (document 24). Après validation, 3/57 patients (5,3%) ont été confirmés en

séquençage Sanger.

Le gène FAT1 :

Le gène FAT1, tumor suppressor homolog 1, localisé sur le chromosome 4q35 est retrouvé muté chez

3/57 patients (document 25). Après validation, toutes les mutations ont été validées (5,3%).

Le gène SETD2 :

Le gène SETD2, SET Domain containing 2, localisé sur le chromosome 3p21 est retrouvé muté chez

3/57 patients (document 26). Après validation, 2/57 patients (3,5%) ont été confirmés en séquençage Sanger.

Document 24 : Validation des mutations retrouvées sur le gène SYNE1 Légende : Chr : chromosome ; Statut 1p/19q : statut de la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q ; Séq. Réf : séquence de référence ;





2497 co-délété 6 152728256 A T Stop V


2747 co-délété 6 152615124 G A Stop I

3063 co-délété 6 152734612 AT - fs V

Document 25 : Validation des mutations retrouvées sur le gène FAT1 Légende : Chr : chromosome ; Statut 1p/19q : statut de la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q ; Séq. Réf : séquence de référence ;







2842 co-délété 4 187629096 C G Subst. V

Document 26 : Validation des mutations retrouvées sur le gène SETD2 Légende : Chr : chromosome ; Statut 1p/19q : statut de la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q ; Séq. Réf : séquence de référence ;





2747 co-délété 3 47162672 C T Stop V

2832 co-délété 3 47098936 C T Subst. I

2877 non co-délété 3 47163248 C T Stop V

c) Mise en évidence de voies de signalisation

Afin de mieux comprendre l’oncogenèse des OIII, nous nous sommes intéressés aux éventuelles voies

de signalisation et métabolique qui seraient altérées. Pour cela, la liste des 66 gènes retrouvés mutés dans au

moins 3 tumeurs a été analysée via l’outil d’annotation fonctionnel de DAVID Pathway.

(http://david.abcc.ncifcrf.gov). Cet outil regroupe les données de plusieurs banques de données métaboliques

comme Kegg, Biocarta, Panther, Reactome. Après analyse de la liste de gènes retrouvés altérés dans les OIII,

une liste de voies de signalisation et métabolique est générée (document 27). Avec une p-value égale à 0,0017,

la voie de signalisation Notch est celle qui sort en première avec 4 gènes impliqués.

Les 4 gènes impliqués dans la voie Notch sont : (i) Notch 1 (NOTCH1), (ii) Notch 2 (NOTCH2), (iii)

Recombination signal Binding Protein for immunoglobulin kappa J region (RBPJ) et (iv) C-Terminal Binding

Protein 2 (CTBP2). 14 mutations sur ces gènes ont été retrouvées sur un total de 11 patients (document 28).

Après validation, 8/57 patients (14,0%) ont été confirmés comme étant altérés sur la voie de signalisation

Notch (i.e. présentant au moins une mutation génique sur la voie Notch).

Document 27 : Mise en évidence de voies de signalisation/métabolique impliquées dans l’oncogenèse des

OIII. tiré de http://david.abcc.ncifcrf.gov

Légende : Term : termes relatifs aux gènes impliqués dans la voie. Count : nombre de gènes impliqués dans la voie. % : pourcentage de gènes impliqués

dans la voie par rapport au nombre de gènes totaux.

Document 28 : Validation des mutations retrouvées sur la voie de signalisation Notch Légende : Chr : chromosome ; Statut 1p/19q : statut de la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q ; Séq. Réf : séquence de référence ;




Tumeur Statut 1p/19q Gène Chr Position Séq réf. Altération Nature Validation

2472 co-délété RBPJ 4 26426018 AGTT - fs I

2532 co-délété NOTCH1 9 139412245 G T Subst. V

2691 co-délété RBPJ 4 26426018 AGTT - fs V

2702 co-délété

RBPJ 4 26426316 AACA - fs V

RBPJ 4 26426318 A T Subst. V

RBPJ 4 26426321 G A Subst. V

2819 co-délété NOTCH1 9 139412278 G A Subst. V

2842 co-délété CTPB2 10 126678125 T - fs I

2877 non co-délété NOTCH1 9 139412254 ACG - InDel V

2915 co-délété NOTCH1 9 139412204 G A Subst. V

NOTCH1 9 139413137 - AGAA fs V

3000 co-délété NOTCH2 1 120469171 G - fs V

3063 co-délété CTPB2 10 126678125 T - fs I

3463 co-délété NOTCH2 1 120491683 AA - fs V

Discussion et perspectives

Discussion du matériel et méthodes

Les OIII sont des tumeurs cérébrales primitives malignes très hétérogènes d’un patient à l’autre. Le

traitement des patients présentant un OIII repose sur la neurochirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie.

Malgré ce traitement lourd, les OIII ont tendance à récidiver à plus ou moins long terme. De nouveaux

traitements plus efficaces et mieux tolérés sont donc nécessaires.

Le développement de nouveaux traitements passe par une meilleure connaissance de l’oncogenèse

moléculaire des OIII qui, elle-même nécessite l'analyse d’un nombre important de tumeurs sur un ensemble de

biomarqueurs moléculaires.

Les OIII sont des tumeurs rares. En effet, environ 300 à 600 cas sont diagnostiqués chaque année en

France. Outre son objectif d’harmoniser la prise en charge médicale des patients souffrant d’OIII sur tout le

territoire français, le réseau POLA encourage la recherche biologique, notamment par la constitution d'une

importante biobanque d'échantillons provenant de patients souffrant d'OIII. À notre connaissance, la

tumorothèque POLA constitue la plus grande tumorothèque dédiée aux OIII dans le monde. Elle permet donc

des études moléculaires sur un grand nombre d'échantillons. Néanmoins, cette tumorothèque, constituée de

manière prospective à partir de 2008, ne permet pas encore de faire des études pronostiques compte tenu du

recul encore limité.

La convergence des grandes biobanques de tumeurs et l'arrivée des techniques de biologie moléculaire

à haut débit ont permis de faire des avancées considérables dans la caractérisation moléculaire des OIII. En

effet, les puces pan-génomiques et le séquençage à haut débit ont permis de mettre en évidence et/ou de

préciser des altérations génétiques dans les OIII : (i) la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q dans

75%, (ii) les mutations des gènes IDH1 et IDH2 dans 80%, (iii) les mutations des gènes CIC dans 50 à 60% et

(iv) les mutations des gènes FUBP1 dans 15 à 20%. Ces techniques de biologie moléculaire ont néanmoins des

limites et nécessitent encore des validations par des approches conventionnelles. Au cours de notre étude,

94/102 (92,2%) des mutations détectées par Next Generation Sequencing (NGS) ont été validées par

séquençage à la méthode Sanger. Dans le futur, de nouveaux séquenceurs plus sensibles, utilisant des faibles

quantités de matériel voire de l’ADN issue d'une cellule unique permettront encore d’accélérer les découvertes

sur la biologie des OIII.

Discussion des résultats

Nos résultats confirment des résultats clinico-biologiques connus dans la littérature concernant les OIII

mais ils apportent également de nouvelles données originales. Les résultats moléculaires (document 29)

confirmatoires et originaux seront discutés successivement.

Résultats confirmatoires :

Les gènes IDH1 et IDH2 sont mutés respectivement dans 82,5% et 10,5% des échantillons de notre

série. Toutes les tumeurs 1p/19q co-délétées sont IDH mutées. En revanche, seulement 3 tumeurs non 1p/19q

co-délétées sont IDH-mutées.

Par WES, le gène CIC est retrouvé muté dans 19,3% de notre population et dans respectivement 34,0%

et 0% des OIII 1p/19q co-délétés et des OIII non 1p/19q co-délétés. On a observé un manque de sensibilité

pour la détection de mutations sur le gène CIC en NGS car le pourcentage de variants est significativement

plus faible que celui déjà décrit dans la littérature des OIII 8–11

.

Il nous a donc semblé nécessaire de vérifier le pourcentage de variants détectés lors du WES sur le

gène CIC. C’est pourquoi, nous avons procédé au séquençage moyen débit du gène CIC par une technologie

complémentaire (454 – Roche®). 52 tumeurs oligodendrogliales anaplasiques 1p/19q co-délétées ont donc été

séquencées puis validés par séquençage Sanger sur l'ADN tumoral et constitutionnel. Il s’avère que 48,1% des

tumeurs sont retrouvées mutées (document 30) ce qui corrèle bien avec les données déjà connues sur ce gène.

Par ces résultats, on a pu mettre en évidence la présence de 8 faux-négatifs qui n'avaient pas été détectés en

WES.

Dans le but de connaître la raison du nombre de faux-négatifs sur ce gène, à partir des fichiers bruts

d’alignement (.bam) provenant du séquençage whole-exome, j’ai visualisé, pour chaque faux-négatif, les

séquences du gène à l’aide du logiciel Integrative Genomics Viewer (IGV – Broad Institute®). Ce logiciel

permet d’aligner des fichiers .bam avec un génome de référence. Le génome humain hg 19 (UCSC) est

téléchargé puis chargé sur IGV.

Après visualisation de l’ensemble des faux-négatifs, on observe que pour tous, la couverture de

l’ensemble du gène CIC est faible voire nulle pour certains exons. En effet, on voit bien, à partir de

l'annexe 19, que la région où une mutation a été détectée par séquençage au GS Junior est très faiblement

couverte (3 reads) par séquençage whole-exome. On observe bien que sur les 3 reads, deux d’entre eux

présentent la mutation attendue (tumeur 2551 : C => T). Cependant la couverture étant trop faible, la mutation

ne passe pas le filtre et est donc éliminée. A contrario, l'annexe 20 présente une tumeur mutée sur le gène

IDH1 (R132H : CGT => CAT). On observe bien que la région génomique 2q33.3 est beaucoup mieux

couverte (> 50 reads) et permet donc une meilleure détection de la mutation.

Ce phénomène étant étendu à l’ensemble des faux-négatifs, on peut s’expliquer du fait de la perte des

bras chromosomiques 1p et 19q qui est très répandue dans les OIII (tous les faux-négatifs présentent la co-

délétion 1p/19q). En effet, les tumeurs 1p/19q co-délétées ont une quantité de matériel génétique de ces

régions inférieure aux non co-délétés. Il se pourrait donc que lors de la capture des exons, les gènes se trouvant

sur les positions génomiques 1p et 19q (e.g. le gène CIC) soient moins bien capturés et donc moins bien

couverts lors du séquençage. Cela expliquerait donc le fait que 8 tumeurs ne sont pas retrouvées mutées sur le

gène CIC par WES mais le sont par séquençage au GS Junior.

Le gène FUBP1 est retrouvé muté dans respectivement 19,1% et 0% des OIII 1p/19q co-délétés et des

OIII non 1p/19q co-délétés. Le pourcentage de variants corrèle avec celui retrouvé dans la littérature qui est de

15 à 20% dans les OIII selon les études.

Document 29 : Représentation schématique des altérations moléculaires retrouvées dans la population d’étude

Document 30 : Validation des mutations retrouvées sur le gène CIC par séquençage moyen débit Légende : Chr : chromosome ; Statut 1p/19q : statut de la co-délétion des bras chromosomiques 1p et 19q ; Séq. Réf : séquence de référence ;



d’un codon stop ; V : mutation validée par séquençage Sanger I : mutation invalidée par séquençage Sanger ; NA : non applicable.

Tumeur Chr Position Séq réf. Altération Nature Validation Somatique

2472 19 42791371 AG - fs I NA

19 42796553 TG - fs V oui

2497 19 42795829 C T Stop V oui

2543 19 42796244 C T Stop V NA

2551 19 42791757 C T Subst. V oui

2618 19 42796240 C - fs V NA

2661 19 42797282 AG - fs V NA

2668 19 42791716 G A Subst. V oui

2671 19 42795715 CAGT - fs V oui

2702 19 42793076 T - fs V oui

2716 19 42791863 AC - fs V oui

2754 19 42791782 - GGGCCCTGGTCCA

CCAGCGTCATC fs V NA

2755 19 42791715 C T Subst. V oui

2830 19 42794737 T - fs V oui

2832 19 42795048 G T Stop V oui

2878 19 42799059 C T Subst. V oui

2921 19 42791757 C T Subst. V oui

3016 19 42795521 - T fs V oui

3032 19 42799067 GA - fs V oui

3063 19 42796558 G - fs V oui

3125 19 42791757 C T Subst. V oui

3149 19 42795270 G T Subst. I NA

3327 19 42797278 C T Stop V oui

3464 19 42799039 A G Subst. V NA

3472 19 42791239 C T Subst. V non

19 42791724 A - fs V oui

3551 19 42791758 G A Subst. V NA

3557 19 42791859 T C Subst. V oui

Résultats originaux :

Trois gènes intéressants, sur les bases de nos connaissances de leurs fonctions biologiques, ont été

retrouvés mutés de manière récurrente dans les OIII : SYNE1, FAT1 et SETD2

SYNE1 (Spectrin repeat containing, nuclear envelope 1) est muté dans 5,3% des tumeurs de notre

étude. Il s’agit d'un gène de 146 exons localisé dans la région chromosomique 6q24 codant pour une protéine

des membranes nucléaires. Cette dernière interagit avec des filaments d’actine et la lamina du cytoplasme et

participe au positionnement et à la forme du noyau dans la cellule. Elle jouerait notamment un rôle dans la

migration neuronale chez la souris 26,27

.

FAT1 (tumor suppressor homolog 1) est muté également dans 5,3% des tumeurs de notre série. Il

s’agit d’un gène de 27 exons localisé sur la région chromosomique 4q35 codant pour une protéine appartenant

à la famille des cadhérines. Elle est impliquée dans les liaisons cellules/cellules et joue un rôle dans la polarité

et la migration cellulaire 28,29

.

SETD2 (SET domain containing 2) est muté dans 3,5% des tumeurs de notre cohorte et dans 6,4% des

tumeurs 1p/19q co-délétées. Il s’agit d’un gène de 21 exons localisé sur la région chromosomique 3p21 codant

pour une protéine responsable de la méthylation de l’histone H3 et serait donc impliqué dans la modulation de

la structure chromatinienne 30

. De plus, il a été décrit que la mutation du gène SETD2 conduirait à une

diminution de la méthylation des histones et engendrait une transcription accrue du gène TERT ce qui

expliquerait le rôle suppresseur de tumeur du gène SETD2 31

.

Implication de la voie Notch :

Compte tenu de l’absence de nouvelle mutation génique ponctuelle très fréquente (≥25%), nous nous

sommes intéressés aux voies de signalisation intracellulaires dérégulées par des mutations génétiques rares. De

manière intéressante, la voie Notch via des mutations génétiques portant sur des gènes différents est touchée

dans ~15% des OIII (document 31).

La voie Notch apparait intéressante dans l’oncogenèse des OIII pour plusieurs raisons :

(i) La voie Notch joue un rôle clé dans le développement du système nerveux. En effet, l’activation

de la voie Notch induit une répression de la différenciation vers un sous-type neuronal et

oligodendrocytaire tout en induisant une différenciation astrocytaire 32,33

.

(ii) Plusieurs études ont montré l’importance de la voie Notch dans la formation et au développement

tumoral. Le rôle suppresseur de tumeur ou oncogène des gènes de la voie de signalisation n’est

pas encore clairement défini.

(iii) De plus, il agirait notamment sur l’oncogène c-myc 34

et il a été montré, en 2011, que la

surexpression de la protéine NOTCH1 serait associée à un facteur de mauvais pronostic dans les

gliomes 35

(document 32).

Cette voie de signalisation, altérée dans près de 15% de notre population d'étude, constitue donc une cible

privilégiée afin de comprendre les mécanismes conduisant à la gliomagenèse des OIII. Dans l’idéal, afin de

valider ces hypothèses il faudrait étudier, sur le plan fonctionnel, le rôle de la voie Notch dans les OIII.

Document 31 : Représentation des données cliniques, biologiques, pathologiques et moléculaire de la cohorte

en fonction de l'altération de la voie Notch Légende : Notch mutée : voie de signalisation Notch altérée ; Notch non mutée : voie de signalisation Notch non altérée ; OIII : oligodendrogliome

anaplasique ; OAIII : oligoastrocytome anaplasique ; IK : Indice de Karnofsky ; PFS : survie sans progression (Progression-Free Survival) ; Nb :

Nombre ; OS : survie globale (Overall Survival) ; Déficit SM : déficit sensitivo-moteur ; cyto. : cytonucléaires ; Vasc. endo. : vascularisation

endocrinoïde.

Notch mutée Notch non mutée Total

Nombre | Pourcentage 8 | 14,0% 49 | 86,0% 57

Histologie OIII 7 | 87,5 44 | 89,8 51 | 89,5

OAIII 1 | 12,5 5 | 10,2 6 | 11,5

Clinique

Âge médian [min-max] 48 [37-81] 48 [27-81] 48 [27-81]

Sexe ratio (H/F) 7 1,7 2,0

IK médian [min-max] 90 [60-100] 90 [70-100] 90 [60-100]

PFS (semaines) 106 109 109


OS (semaines) 106 123 118


Signes cliniques

Épilepsie 4 | 50,0 25 | 54,3 29 | 53,7

Céphalées 4 | 50,0 15 | 32,6 19 | 35,2

Troubles cognitifs 2 | 25,0 7 | 15,2 9 | 16,7

Déficit SM 1 | 12,5 4 | 8,7 5 | 9,3

Localisation tumorale Frontale 4 | 50,0 38 | 77,5 42 | 73,7

Non Frontale 4 | 50,0 11 | 22,5 15 | 26,3

Prise de contraste Présence 6 | 75,0 29 | 69,0 35 | 70,0

Absence 2 | 25,0 13 | 31,0 15 | 30,0

Neuropathologie

Mitose 8 | 100 48 | 100 56 | 100

Atypies cyto. 6 | 75,0 27 | 56,25 33 | 58,9

Nécrose 4 | 50,0 11 | 22,9 15 | 26,8

Vasc. endo. 7 | 87,5 45 | 93,75 52 | 92,9

Calcification 5 | 62,5 20 | 41,2 48 | 85,7

Moléculaire

Mutation IDH1/IDH2 8 | 100 46 | 93,9 54 | 94,7

Mutation CIC 3 | 37,5 16 | 32,7 19 | 33,3

Mutation FUBP1 0 | 0 9 | 18,4 9 | 15,8

Co-délétion 1p/19q 7 | 87,5 40 | 81,6 47 | 82,5

Document 32 : Courbe de survie des gliomes astrocytaires en fonction de l’expression de la protéine NOTCH1 tiré de Li J. et al., 2011 35

Légende : - : expression nulle ; + : faible expression; ++ : expression modérée ; +++ : forte expression

Conclusion personnelle

Pour conclure, cette année d’apprentissage fut pour moi une expérience professionnelle instructive et

enrichissante. J’ai été au cœur de la vie d’une équipe de recherche à la pointe de la neuro-oncologie. Cela m’a

permis de me former à de nombreuses technologies modernes et d’acquérir de nouvelles notions dans un

domaine qui m’était alors inconnu auparavant mais qui m’a subjugué.

Cette expérience a changé ma façon de travailler au sein d’un laboratoire, tant sur le professionnalisme

que se doit de tenir un laboratoire de diagnostic par rapport à ses prestataires, que sur l’organisation et la

méthodologie à adopter au quotidien.

Ce fut une année dont je garderais énormément de souvenirs et que je n’oublierais jamais. Ce fut pour

moi une excellente expérience que je recommande vivement et que je referais sans aucune hésitation.

Références bibliographiques

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813–817

Annexes

Annexe 1 : Distribution des tumeurs cérébrales primitives malignes

Annexe 2 : Répartition des mutations en fonction de leurs fréquences sur les gènes IDH1 et IDH2

Annexe 3 : Principe de la purification de l’ADN génomique via le kit iPrep™

ChargeSwitch® gDNA Tissue

Kit (Invitrogen™

)

Annexe 4 : Quantification et qualification des ARN extraits au Bioanalyzer2100 (Agilent®)

Annexe 5 : Schéma de principe du séquençage par la méthode Sanger

Annexe 6 : Programme des cycles d’amplification de la PCR classique

Annexe 7 : Milieu réactionnel de la PCR classique

Annexe 8: Migration des produits de PCR classique au Caliper

Annexe 9 : Principe de la purification des produits de PCR via le kit Agencourt AMPure XP

Annexe 10 : Milieu réactionnel de la réaction de séquençage

Annexe 11 : Programme des cycles d’amplification de la réaction de séquençage

Annexe 12 : Références et prix des kits pour CGH array

Annexe 13 : Traitement bio-informatique du Whole-Exome Sequencing

Annexe 14 : Liste des amorces du gène CIC

Annexe 15 : Protocole d’amplification du gène CIC

Annexe 16 : Ajout des MIDs par touchdown PCR

Annexe 17 : Mutation R132H sur le gène IDH1

Annexe 18 : Mutation R172K sur le gène IDH2

Annexe 19 : Visualisation sur IGV d’une tumeur présentant une mutation (C => T) sur le gène CIC

Annexe 20 : Visualisation sur IGV d’une tumeur présentant la mutation R132H (CGT => CAT) sur le gène

IDH1

Annexe 1 : Distribution des tumeurs cérébrales primitives malignes adapté de Dolecek et al., 2012 18

Annexe 2 : Répartition des mutations en fonction de leurs fréquences sur les gènes IDH1 et IDH2 adapté de Hartmann et al., 2009 7

Légende : Répartition des mutations retrouvées dans les gènes IDH1 et IDH2 dans une cohorte de 1 010 gliomes.

Gène Variation nucléotidique Changement de l'acide aminé n | %

IDH1

G395A R132H 664 | 92,7%

C394T R132C 29 | 4,2%

C394A R132S 11 | 1,5%

C394G R132G 10 | 1,4%

G395T R132L 2 | 0,2%

IDH2

G515A R172K 20 | 64,5%

G515T R172M 6 | 19,3%

A514T R172W 5 | 16,2%

Annexe 3 : Principe de la purification de l’ADN génomique via le kit iPrep™

ChargeSwitch® gDNA Tissue

Kit (Invitrogen™

) tiré de http://products.invitrogen.com

54%

3,3% 5,9%

9,5%

6,2%

7,2%

13,7% glioblastome (GBM)

oligoastrocytome anaplasique (OAIII)

astrocytome anaplasique (AIII)

astrocytome (AII)

oligodendrogliome anaplasique (OIII)

non spécifié

autres gliomes

Annexe 4 : Quantification et qualification des ARN extraits au Bioanalyzer2100 (Agilent®)

Annexe 5 : Schéma de principe du séquençage par la méthode Sanger tiré de http://www.biopsci.com

Annexe 6 : Programme des cycles d’amplification de la PCR classique

Réactif [initiale] 1 réaction (20 µL) [finale]

FastStart PCR Master 2X 10 µL 1X

Amorce sens 20 µM 1 µL 1 µM

Amorce anti-sens 20 µM 1 µL 1 µM

ADN 50 ng/µL 1 µL 50 ng

Eau

7 µL

Annexe 7 : Milieu réactionnel de la PCR classique

Nombre de cycles Température Durée

Dénaturation 94°C 5 min

Dénaturation 94°C 30 sec

Hybridation x40 60°C 45 sec

Élongation 72°C 1 min

Élongation finale 72°C 10 min

Conservation 8°C ∞

Annexe 8: Migration des produits de PCR classique au Caliper

Annexe 9 : Principe de la purification des produits de PCR via le kit Agencourt AMPure XP tiré de https://www.beckmancoulter.com

Annexe 10 : Milieu réactionnel de la réaction de séquençage


Big Dye Terminator V3.1

1 µL

Amorce sens ou anti-sens 2 µM 2 µL 0,4 µM

Sequencing Buffer 5X 1,5 µL 0,75X

Produits PCR purifiés

2 µL

Eau

3,5 µL

Annexe 11 : Programme des cycles d’amplification de la réaction de séquençage







Annexe 12 : Références et prix des kits pour CGH array tiré de http://www.genomics.agilent.com

Produit Référence Prix catalogue ($)

lames SurePrint G3 Human CGH Microarray Kit, 4x180k (Agilent) 3 363

kit de marquage SureTag Complete DNA Labeling Kit (Agilent) 2 494

kit d'hybridation Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit (Agilent) 502

kit de lavage Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1, 2 (Agilent) 495

supports de lames Hybridization Gasket Slide Kit (Agilent) 185

Annexe 13 : Traitement bio-informatique du Whole-Exome Sequencing

Annexe 14 : Liste des amorces du gène CIC

Nom d'amorce séquence (5'-3') Taille

CICex1F TGAGGAGGTGCGAGCCC

CICex1R ACCCCCACCACCGTTACTCC

CICex2F TCACCTGGCTCCTTTCCA

CICex2R AACAGCTGCCGACTCAG

CICex3F ACCTCTGTGTCCCCAGAACC

CICex3R CTCAGGGAACTCACGCATC

CICex4F CAGAGACATGGCCCTCAC

CICex4R TTCTCCCGCTGCATTAAACA

CICex5F GTCCTAACTGTCCCGCTCTG

CICex5R CCAAGAGGCAACAGCGTTA

CICex6F GCCTTCCAGGTAACGCTGT

CICex6R AGAGCCAAGGGGCTGACTA

CICex7F CTGTCATAGCGCCACTCTCT

CICex7R CTGCCCTGGACAGGTTCC

CICex8F ACCCTCTCTGCCACCTATCC

CICex8R GGTCCTGGGCAAGATTCTG

CICex9F CCTTCCTGGACAGCACTC

CICex9R AAACAGACATTCCCATGGCTT

CICex10F-1 TCGGAGTGTCCTGACCTG

CICex10R-1 CTGCCCTGACCAGACTC

CICex10F-2 TCCTCGCCTGCTTCCT

CICex10R-2 CACCAGTGTCTGCAGGAT

CICex10F-3 ACCAGGCCCCTCAGTCAT

CICex10R-3 CATTTGGAGACGCCTCAG

CICex10F-4 CATCGCCTCTAAGCCCTT

CICex10R-4 CTGGGCAATGAACTGGACA

CICex10F-5 GCCACTGTCACTAACCTACTGG

CICex10R-5 AAACGGATGCTGGTGGTG

CICex10F-6 GGAATCACCCAGGTACAGTAC

CICex10R-6 AAGGGAGCCAAACAGGAC

CICex11F TGTTTGGCTCCCTTGTAACC

CICex11R GCCAACATCCAGCAGGTAGA

CICex12F AGGTCTTGGTCTTCCCCT

CICex12R ATAGGTGATTCTGCCGCAG

CICex13F TTACCTCACTCCTCCCCATT

CICex13R GAAGCAGGAGACCAAGTTAGG

CICex14F-1 CCCTAACTTGGTCTCCTGCTT

CICex14R-1 TGGCCACAGTGTAGACCAG

CICex14F-2 ATTTTACTCTGGCAGCCCTG

CICex14R-2 AGGTCATGGAACCTGCTAGT

CICex15F-1 TGTCAGATCAACCCAGAGCA

CICex15R-1 CCCCTCAAGCTCAGACTC

297

298

295

275

295

284

235

276

288

275

295

320

240

278

285

287

288

187

279

265

273

CICex15F-2 AGTCCGAGAGCCAACTGC

CICex15R-2 GAGAGACACACAGGCATGGA

CICex16F ATCTCCCTGCCCATCTCC

CICex16R CCTAACACGCTCCACCAAG

CICex17F CTTGGTGGAGCGTGTTAGG

CICex17R CTGCCCTCCACCTAAGGA

CICex18F AGGAAGAACTCCACGGGTA

CICex18R CCTTCCAGAGACCCACTC

CICex19F TCCCCTGTGAAATAGAATGCAG

CICex19R TACAGATAAGTCCCACCCGA

CICex20F-1 GCTCCCCACCGTTTTTCTAT

CICex20R-1 AGAGTCCGAGCTGGGTGAG

CICex20F-2 TCCTCTCCCTGTACCGC

CICex20R-2 CCCCACATACTGTCCATGT

294

287

265

291

266

307

278

Annexe 15 : Protocole d’amplification du gène CIC


FastStart PCR Master 2X 5 µL 1X

Amorce sens 10 µM 1 µL 1 µM

Amorce anti-sens 10 µM 1 µL 1 µM

DMSO 100% 0,7 µL 7%

ADN 20 ng/µL 1 µL 20 ng

Eau

7 µL








Annexe 16 : Protocole d'ajout des MIDs par touchdown PCR


FastStart Hight Fidelity 5 U/µL 0,25 µL 1,25 U

dNTP 10 µM 0,5 µL 0,2 µM

Amorce MID sens 10 µM 0,5 µL 0,2 µM

Amorce MID anti-sens 10 µM 0,5 µL 0,2 µM

Tampon 10X 2,5 µL 1X

DMSO 100% 1,25 µL 5%

Pools d’amplicons purifiés

1 µL

Eau

18,5 µL




Hybridation x10 65°C * 45 sec







* : diminution de 1°C/cycle

Annexe 17 : Mutation R132H sur le gène IDH1 Légende : Électrophorégramme d’une tumeur présentant la mutation R132H (CAT > CGT) sur le gène IDH1.

Annexe 18 : Mutation R172K sur le gène IDH2 Légende : Électrophorégramme d’une tumeur présentant la mutation R172K (AGG > AAG) sur le gène IDH2.

Annexe 19 : Visualisation sur IGV d’une tumeur présentant une mutation (C => T) sur le gène CIC

Annexe 20 : Visualisation sur IGV d’une tumeur présentant la mutation R132H (CGT => CAT) sur le gène

IDH1

Documents

Caractérisation moléculaire des tumeurs oligodendrogliales ...ol.saulnier.free.fr/doc/LPG_Olivier_SAULNIER.pdf · réalisée à l'École Nationale de Chimie, Physique et Biologie