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Caractérisation des inhibiteurs potentiels de DCIR, une lectine de type C participant à la transmission du VIH-1
Mémoire
Thy-René NSIMBA BATOMENE
Maîtrise en Microbiologie - Immunologie
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Thy-René NSIMBA BATOMENE, 2016
Caractérisation des inhibiteurs potentiels de DCIR, une lectine de type C participant à la transmission du VIH-1
Mémoire
Thy-René NSIMBA BATOMENE
Sous la direction de :
Caroline GILBERT, directrice de recherche
iii
Résumé
Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 provoque une infection définitive de
l’organisme. Il entraine une déroute du système immunitaire depuis la primo-infection
occasionnant ainsi, une déplétion massive des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Le DCIR
(Dendritic Cell Immuno Receptor) qui constitue le socle de notre travail, est une lectine de type
C. Il est exprimé sur les cellules myéloïdes comme les cellules dendritiques mais aussi sur les
cellules B, les LTCD4 infectés par le VIH-1 et apoptotiques ainsi que sur les LTCD4 polarisés
en Th17. Il constitue un facteur d’attachement et d’internalisation du virus dans la cellule
dendritique. Il permet son transfert aux LTCD4 dans les organes lymphoïdes secondaires,
jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée au VIH-1. En plus, le DCIR assure la
régulation négative de la réponse cellulaire, favorisant ainsi la propagation et la réplication du
virus au détriment de la réponse immunitaire contre le VIH-1. Le rôle que joue le DCIR est
dépendant du sentier de signalisation induit à la suite de la phosphorylation des résidus
tyrosine de son motif ITIM. Le blocage de DCIR par des inhibiteurs spécifiques pourrait
empêcher cette phosphorylation et réduire l’attachement, l’internalisation et le transfert du
virus. Nous avons montré que la stimulation des cellules dendritiques et des LTCD4 polarisés
en Th17 avec un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus
tyrosine des protéines. De plus, les inhibiteurs de la portion extracellulaire du DCIR inhibent
cette activation. Afin de développer une mesure plus directe de l’interaction de DCIR avec ces
inhibiteurs, nous avons purifié le DCIR à partir des cellules Raji-CD4-DCIR. En conclusion, ce
projet de maitrise montre que l’activation directe de DCIR peut être renversée par des
inhibiteurs montrant ainsi leurs spécificités. De plus, le profil d’activation de DCIR est
spécifique pour chaque type cellulaire. A long terme, l’inactivation de DCIR par des inhibiteurs
efficaces pourrait être une stratégie thérapeutique capable d’inhiber l’infection et de préserver
une réponse immunitaire efficace.
iv
Table des matières
Résumé ..................................................................................................................................... iii
Table des matières ................................................................................................................. iv
Liste des figures .................................................................................................................... vii
Liste des abréviations .......................................................................................................... viii
Remerciement ........................................................................................................................ xii
Chapitre I : Introduction .......................................................................................................... 1
1.1. Le virus de l’immunodéficience humaine de type I (VIH-1) ............................................. 1
1.1.1. Structure et classification du VIH-1 ......................................................................... 1
1.1.2. Organisation génomique du VIH-1 .......................................................................... 2
1.1.3. Cycle de réplication du virus de l’immunodéficience humaine ................................ 4
1.1.3.1. Attachement/Fusion ......................................................................................... 4
1.1.3.2. Entrée du VIH-1 dans la cellule par endocytose .............................................. 5
1.1.3.3. Décapsidation/Transcription inverse/Intégration nucléaire de l’ADN viral ........ 5
1.1.3.4. Transcription .................................................................................................... 6
1.1.3.5. Traduction ........................................................................................................ 7
1.1.3.6. Assemblage et bourgeonnement ..................................................................... 7
1.1.4. Thérapie antirétrovirale du VIH-1 ............................................................................ 8
1.1.5. Nouvelles approches thérapeutiques ...................................................................... 9
1.1.6. Patients capables de contrôler la charge virale ..................................................... 11
1.1.7. Immunopathogénèse de l’infection à VIH-1 .......................................................... 12
1.1.7.1. Entrée du virus dans l’organisme ................................................................... 13
1.1.7.2. Perte de l’intégrité de la muqueuse intestinale .............................................. 14
1.1.8. Immunopathogenèse du VIH-1 associée aux toll like receptors (TLRs) ................ 16
1.2. Les lectines de type C et le VIH-1 ................................................................................ 19
1.2.1. Les lectines ........................................................................................................... 19
1.2.2. Classification des lectines ..................................................................................... 19
1.2.3. Les lectines de type C ........................................................................................... 20
1.2.3.1 Structure et classification des lectines de type C ............................................ 20
1.2.3.2. Lectines de type C des cellules myéloïdes .................................................... 21
1.2.3.3. Les lectines de type C de type II capable de lier le VIH-1 .............................. 24
1.2.3.3.1. La langerin (CD207) ............................................................................... 24
v
1.2.3.3.2. Le DC-SIGN (CD209) ............................................................................. 24
1.2.4. Le DCIR humain (CLEC4A) .................................................................................. 26
1.2.4.1. Identification de DCIR .................................................................................... 26
1.2.4.2. Expression de DCIR humain.......................................................................... 27
1.2.4.3. Structure du DCIR ......................................................................................... 28
1.2.4.4. Les ligands de DCIR ...................................................................................... 29
1.2.4.5. Fonctions du DCIR dans l’élaboration de la réponse immune ....................... 30
1.2.4.6. DCIR et VIH-1 ................................................................................................ 33
1.2.4.7. DCIR et LTCD4.............................................................................................. 36
1.2.4.8. Les inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR ..................................... 38
Chapitre II : Hypothèse et objectifs ...................................................................................... 40
2.1. Hypothèse .................................................................................................................... 40
2.2. Objectifs ....................................................................................................................... 41
Chapitre III : Matériels et méthodes ..................................................................................... 42
3.1. Réactifs ........................................................................................................................ 42
3.2. Anticorps ...................................................................................................................... 42
3.3. Cellules Raji-CD4-DCIR ............................................................................................... 43
3.4. Cellules dendritiques .................................................................................................... 43
3.5. Purification des LTCD4 et leur polarisation en Th17 .................................................... 44
3.6. Évaluation de la phosphorylation des résidus tyrosine ................................................. 45
3.7. Immunobuvardage ....................................................................................................... 45
3.7.1. Migration sur gel de polyacrylamide 12% .............................................................. 45
3.7.2. Migration sur gel gradient de polyacrylamide 7,5 %- 20 % ................................... 46
3.8. Purification du DCIR et de HLA-DR par colonne d’affinité ............................................ 47
3.8.1 Purification de DCIR............................................................................................... 47
3.8.1.1. Préparation de la colonne .............................................................................. 47
3.8.1.2. Préparation de lysat cellulaire ........................................................................ 48
3.8.1.3. Purification et élution ..................................................................................... 48
3.8.2. Purification de HLA-DR ......................................................................................... 48
3.9. Dosage des protéines .................................................................................................. 49
3.9.1. Dosage avec le Biodrop ........................................................................................ 49
3.9.2. Dosage avec le BCA ............................................................................................. 49
Chapitre IV : RESULTATS ..................................................................................................... 50
4.1. Activation de DCIR sur la lignée cellulaire Raji-CD4-DCIR .......................................... 50
vi
4.1.1. La présence de DCIR sur les Raji-CD4 ................................................................. 50
4.1.2. Détermination de la concentration saturante de l’anti-DCIR ................................. 51
4.1.3. Activation des Raji-CD4-DCIR et mesure du patron de phosphorylation des
protéines sur leurs résidus tyrosine ................................................................................ 52
4.2. Activation de DCIR dans les cellules primaires ............................................................ 54
4.2.1. Activation de DCIR sur les cellules dendritiques ................................................... 54
4.2.2. Activation de DCIR sur les LTCD4 polarisés en Th17 ........................................... 56
4.3. Évaluation de la liaison du DCIR avec les ligands ........................................................ 58
4.3.1. Détection de la protéine DCIR purifiée .................................................................. 58
Chapitre V : Discussion ........................................................................................................ 59
5.1. Différence de phosphorylation dans les trois modèles cellulaires ................................ 60
5.2. Le rôle de DCIR dans la transmission de l’infection par le VIH-1 ................................. 60
5.3. Rôle du motif ITIM de DCIR dans l’infection par le VIH-1 ............................................. 61
5.4. Les antirétroviraux versus les inhibiteurs de DCIR ....................................................... 62
5.5. Le DCIR dans le macrophage ...................................................................................... 63
5.6. Perspectives ................................................................................................................. 64
Conclusions ........................................................................................................................... 66
Bibliographies ........................................................................................................................ 67
vii
Liste des figures
Figure 1 : Structure morphologique du VIH-1………………………………………………………..3
Figure 2 : Organisation génomique du VIH-1………………………………………………………..3
Figure 3 : Cycle de réplication du VIH-1……………………………………………………………...4
Figure 4 : Transmission du VIH-1 dans les muqueuses…………………………………………..14
Figure 5 : Classification et structure des lectines de type C de type I et type II exprimées sur
les cellules de la lignée myéloïde ……………………………..................................................... 21
Figure 6 : Model d’un sentier de signalisation induite suite à l’activation des lectines de type C
dectine-1, dectine-2 et Mincle dans la cellule myéloïde …………………………………………..23
Figure 7 : Les quatre formes de l’ARNm épissé de DCIR…………………………………………28
Figure 8 : Voies de signalisation induite par le DCIR ……………………………………………..33
Figure 9 : Rôle du motif ITIM dans la capture, internalisation et signalisation médiées par
l’engagement de DCIR ……………………………………………………………………………….36
Figure 10 : Expression de l’IL-17 et de DCIR sur les LTCD4 polarisés en Th17……………….37
Figure 11 : Inhibiteurs de la portion extracellulaires de DCIR obtenus après criblage virtuel…39
Figure 12 : Expression de DCIR sur les Raji-CD4…………………………………………………51
Figure 13 : Détermination de la concentration d’anticorps anti-DCIR saturante de DCIR…….52
Figure 14 : Augmentation de la phosphorylation des protéines sur leurs résidus tyrosine à la
suite de l’activation de DCIR………………………………………………………………………….53
Figure 15 : Patron des protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine à la suite de
l’activation directe de DCIR sur les cellules dendritiques………………………………………….55
Figure 16 : Inhibition du patron de phosphorylation sur les cellules dendritiques par les
inhibiteurs de DCIR……………………………………………………………………………………56
Figure 17 : Inhibition du patron de phosphorylation sur les LTCD4 Th17 par les inhibiteurs de
DCIR…………………………………………………………………………………………………….57
Figure 18 : Détection de la protéine DCIR purifiée par l’anticorps anti-DCIR…………………...58
viii
Liste des abréviations
ADN Acide désoxyribonucléique ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire AP-1 Activator protein 1 APC Allophycocyanin APOBEC3G Apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-like-3G ARN Acide ribonucléique ARNm Acide ribonucléique messager ARNt Acide ribonucléique de transfert ARNdb Acide ribonucléique double brin ASGPR 1 et 2 Asialoglycoprotein receptor 1 et 2 BCA Acide Bicinchoninique BCL B cell lymphoma 10 BCR B cell receptor, Recepteur de cellule B BDCA-2 Blood dendritic cell antigen 2 BSA Bovine serum albumin BTK Bruton’s tyrosine kinase CA Capside CARD9 Caspase recruitment domain family, member 9 CCR C-C chemokine receptor CCL Chemokine (C-C motif) ligand CD Cluster of differenciation CLEC-1 et -2 C-type lectin domain family-1 et -2 CLEC-9A, 12B C-type lectin domain family-9A, 12B CLECSF 6 et 8 C-type lectin superfamily member 6 et 8 CMH Complexe majeur d’histocompatibilité CNBr Cyanogen bromide CRD Carbohydrate recognition domain CRF Circulating recombinant forms CRISPR/Cas9 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Caspase9 CTLA-4 Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 CTLD C-type lectin-like domain CXCR C-X-C chemokine receptor CXCL Chemokine (C-X-C motif) ligand DAMP Damage-associated molecular pattern DAP-3 Death associated protein 3 DAP12 DNAX-activating protein of 12 kDa DEC-205 Dendritic and epithelial cells, 205 kDa Dectin-1 et -2 Dendritic cell-associated C-type lectin-1 et 2 DC Dendritic cell, Cellule dendritique DCAR Dendritic cell immune-activating receptor DCIR Dendritic cell immunoreceptor DC-SIG N Dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin
ix
Env Enveloppe EPN Glutamine-proline-asparagine EPS Glutamine proline-serine ERK ½ Extracellular signal-regulated kinase 1/2 FcR Fc-receptor Gag Groupe d’antigène GALT Gut associated lymphoid tissue gp glycoprotéine GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor HAART Highly active anti-retroviral therapy HBSS Hank’s Buffered Salt Solution Hck Hematopoietic cell kinase hDCIR DCIR humain HLA-DR Human leukocyte antigen–antigen D Related HMGB High-mobility group protein ICAM -2, -3 Intercellular adhesion molecule 2 et 3 IgA Immunoglobuline A IFN Interféron IL Interleukine IN Intégrase ITAM Immunoreceptor tyrosine-based activation motif ITIM Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif IRF3 Interferon regulatory factor 3 kDa Kilo dalton KIR Killer immunoglobulin receptor LARG Leukemia-associated Rho guanine nucleotide exchange factor LPS Lipopolysaccharide LTCD4/8 Lymphocyte T-cluster of differenciation 4/8 LTNP Long term non progressors LTR Long terminal repeat LRR Leucin-rich repeat LOX-1 Lectin-like oxydized low-density lipoprotein receptor-1 MA Protéine de la matrice MADCAM-1 Mucosale addressin cell adhesion molecule 1 MALT1 Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1 MAPK Microtubule-associated protein kinase MBP Mannose binding protein mDCIR DCIR murin MGN Méganucléase MICL Myeloid inhibitory C-type lectin-like receptor MINCLE Macrophage-inducible C-type lectin MMR Macrophage mannose receptor MIP-1α et 1β Macrophage inflammatory protein 1 alpha et 1 beta MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88 NC Nucléocapside Nef Negative factor NF-Kb Nuclear factor-kappa B
x
NK Naturel killer NKC Natural killer complex NNRTI Non nucleoside reverse transcriptase inhibitors NRTI Nucleoside reverse transcriptase inhibitors PAK p21-activated kinase PBMC Peripheral blood mononuclear cells PD-1 Programmed cell death protein 1 PI3K Phosphoinositide-3-kinase PIC Pre-integration complex PKC Protein kinase C PLC γ2 Phospholipase C gamma 2 Pol Polymérase PR Protéase PRR Pattern recognition receptor RANTES Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted Rev Regulator of virion RNAi RNA interference SB Sample buffer SDF-1 Stromal cell-derived factor 1 SIDA Syndrome d’immunodéficience humaine SHP-1 et 2 Src homology-2 containing tyrosine phosphatase-1et 2 SHIP Src homology-2 (SH2)-containing tyrosine inositol phosphate shRNA Small hairpin RNAs siRNA Small interfering RNA SU Protéine de surface (gp120) Syk Spleen tyrosine kinase TALEN Transcription Activator-Like Effector Nuclease Tat Trans-Activator of Transcription TCR T-Cell receptor TECK Thymus-expressed chemokine TGF-β Tumor growth factor-beta Th17 T helper 17 TIR Toll/IL-1 receptor TIRAP TIR associated protein TLR Toll like receptor TM Protéine transmembranaire (gp41) TNF-α Tumor necrosis factor-alpha TRAM TRIF lated adaptator molecule TRIF TIR domain-containing adaptator protein induced IFN-β VIH-1 Virus de l’immunodéficience humaine de type 1 Vpr Viral protein R Vpu Viral protein U ZNF Zinc finger nuclease
xi
A mes parents, frères et soeurs
A mon épouse et mes enfants
Pour le soutien et encouragement
xii
Remerciement
Qu’il me soit permis au terme de mes études de maîtrise en microbiologie et immunologie, de
remercier ma directrice de recherche, Dre Caroline Gilbert pour m’avoir accepté dans son
laboratoire. Sa grande disponibilité en dépit de ses multiples occupations, sa passion pour la
recherche et sa rigueur scientifique m’ont été d’un grand apport pour mon épanouissement
scientifique. Le climat serein et l’esprit d’équipe qui règnent dans son laboratoire ont été
déterminants pour mes recherches.
Je profite de cette opportunité pour exprimer ma gratitude aux professionnelles de recherche
Alma Posvandzic et Myriam Vaillancourt pour leur encadrement. Mes remerciements vont
également à Caroline Subra ainsi qu’à mes compagnons de lutte Audrey Hubert, Julien Pierre
Vitry et Sofiane Berrazouane sans oublier Karianne St Gelais. Qu’ils trouvent ici, l’expression
de ma reconnaissance.
Je voudrais enfin remercier le Programme Canadien de Bourses de la Francophonie (PCBF)
et l’Agence Canadienne de Développement International (ACDI) ainsi que son agence
d’exécution, l’Association des Universités et Collèges du Canada (AUCC) pour avoir pris en
charge mes études de maîtrise et mon séjour au Canada. Je remercie enfin le gouvernement
de la R.D.Congo pour m’avoir sélectionné.
1
Chapitre I : Introduction
1.1. Le virus de l’immunodéficience humaine de type I
(VIH-1)
1.1.1. Structure et classification du VIH-1
Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un virus enveloppé à ARN
monocaténaire, membre de la famille de retroviridae, de la sous famille des orthoretrovirinae et
du genre lentivirus qui regroupe les virus cytopathogènes responsables d’infections
persistantes et à évolution lente. Les rétrovirus possèdent une transcriptase inverse, une
enzyme spécifique qui leur permet de rétrotranscrire l’ARN génomique viral en ADN double
brin capable de s’intégrer dans le génome de la cellule hôte sous le nom de provirus, et de
causer une infection définitive de l’organisme.
Tel que présenté à la figure 1, le VIH-1 a une forme sphérique et est doté d’une enveloppe
formée d’une bicouche lipidique dérivée de la cellule hôte, comportant deux glycoprotéines de
surface, la gp120 et la gp 41 ainsi que d’autres protéines issues de la membrane de la cellule
hôte lors du bourgeonnement. Ces deux protéines forment à la surface du virus des
complexes sous forme de spicules visibles au microscope électronique [1]. L’enveloppe virale
entoure le core viral constitué d’une matrice et d’une capside à l’intérieur de laquelle on trouve
deux molécules d’ARN monocaténaire, associées aux enzymes impliquées dans la réplication
virale.
Le VIH-1 se classe en trois groupes dont le M (Major), O (Outlier) et le groupe N (virus
appartenant ni au groupe M ni au groupe O). Le groupe M est le plus répandu et est
responsable de la pandémie du sida dans 90% de cas. On trouve en son sein, neuf sous types
ou clades définis de A à D, de F à H et de J à K dont les clades A, B, C et D sont en majorité
responsables des infections par le VIH-1 [2]. Ces sous types sont inégalement répartis à
travers le monde. L’infection d’un individu par plus d’un sous type viral peut engendrer des
formes recombinantes en circulation (CRFs : Circulating recombinant forms) dont les plus
répandus et impliqués dans la majorité des cas d’infections sont les recombinants CRF01-AE
et CRF02-AG [2].
2
1.1.2. Organisation génomique du VIH-1
Le génome du VIH-1 comporte trois gènes de structure (gag, env et pol) impliqués dans la
synthèse des protéines de structure, de l’enveloppe ainsi que des enzymes virales et six
gènes accessoires et régulateurs de la réplication virale (tat, rev, nef, vif, vpr et vpu). Le gène
gag (groupe d’antigènes) code pour la protéine Gag (Pr55) dont le clivage par la protéase
virale amène à la synthèse des protéines de la matrice p17, des protéines de la capside p24 et
des protéines de la nucléocapside p7 et p6 [3]. Le gène env (enveloppe) code pour la
polyprotéine gp160 qui sera clivée par la protéase cellulaire pour générer les protéines
membranaires gp120 et les protéines transmembranaires gp41 [4, 5], qui sont par la suite
transportées vers la membrane plasmique de la cellule hôte pour y être incorporées lors du
bourgeonnement. Le gène pol (polymérase) code pour les enzymes virales. Le génome du
VIH-1 possède à ses extrémités 5’ et 3’ une séquence LTR (Long Terminal Repeat). Le 5’LTR
est impliqué dans l’initiation de la transcription de l’ARN rétroviral et le 3’LTR sert de signal de
coupure des gènes afin de donner naissance aux précurseur Gag, précurseur Gag-Pol et
précurseur Env dont les deux premiers sont clivés par les protéases virales [6] et le troisième
par les protéases cellulaires pour générer les protéines virales fonctionnelles. Les protéines
codées par les gènes accessoires tat (Trans-Activator of Transcription), rev (Regulator of virion
expression), vpu (Viral protein U), vif (Viral infectivity factor), vpr (Viral protein R) et nef
(Negative factor), sont produites par la traduction des ARNm poly ou multi épissés et jouent un
rôle dans le contrôle de l’expression des autres protéines virales ainsi que dans le cycle
réplicatif du virus et la pathogenèse.
3
Figure 1 : Structure morphologique du VIH-1 (Adapté du Laboratoire Caroline Gilbert)
Figure 2 : Organisation génomique du VIH-1 (Adapté de [7])
4
1.1.3. Cycle de réplication du virus de l’immunodéficience
humaine
Le cycle de la réplication du VIH-1 comprend de nombreuses étapes qui sont brièvement
illustrées à la figure 3 et décrites ci-dessous.
Figure 3 : cycle de réplication du VIH-1 (Adaptée de [8])
1.1.3.1. Attachement/Fusion
Tout commence par la fixation de la glycoprotéine gp120 du VIH-1 au récepteur cellulaire CD4
présent sur les LTCD4, mais aussi présent à la surface membranaire des monocytes, des
cellules dendritiques et des microglies dans le cerveau [1]. Ces cellules constituent les
principales cibles du VIH-1. La gp120 à travers son site de liaison (CD4 Binding Site) interagit
avec le domaine D1 du récepteur CD4. Il s’en suit un changement conformationnel de la
gp120 permettant l’exposition de son domaine V3 qui contient le site de liaison pour les
récepteurs de chimiokines (CCR5 ou CXCR4) [1, 9], appelés aussi corécepteurs. La liaison de
la gp120 avec le CD4 et l’un de ces corécepteurs permet la fusion de la membrane virale avec
celle de la cellule hôte. En effet, l’interaction entre la boucle V3 de la gp120 et le CCR5
(CD195) ou le CXCR4 (CD184) démasque la gp41 et rapproche la membrane du virus et celle
5
de la cellule hôte, permettant ainsi à la gp41 ancrée dans la bicouche lipidique virale
d’engendrer la fusion des deux membranes grâce à son peptide de fusion. La capside virale
est ainsi relâchée dans le cytoplasme.
Les récepteurs de chimiokines (CCR5 et CXCR4) découverts en 1996 [10] sont des protéines
cellulaires avec sept domaines transmembranaires, associées aux protéines G. Elles sont
exprimées sur les lymphocytes T, les macrophages/monocytes et les cellules dendritiques,
mais à de différents niveaux. Les CCR5 est plus grandement exprimé sur les LTCD4 mémoire
que sur les autres sous-types des lymphocytes T et le CXCR4 par contre, a une plus grande
expression sur les LTCD4 naïfs [11]. Les ligands naturels de CCR5 sont le RANTES, le MIP-
1α (CCL3) et le MIP-1β (CCL4) et celui de CXCR4 par contre, est le SDF-1 (CXCL12) [12, 13].
La spécificité de l’interaction de la région variable V3 de la gp120 avec le corécepteur indique
le tropisme du virus [14-16].
1.1.3.2. Entrée du VIH-1 dans la cellule par endocytose
En dehors de la fusion qui se fait entre l’enveloppe virale à travers la gp120 et la membrane
cytoplasmique à travers le CD4 et l’un des corécepteurs CCR5 ou CXCR4, le VIH-1 peut
pénétrer dans la cellule hôte par endocytose. En effet, le VIH-1 peut se lier à d’autres
récepteurs membranaires notamment les lectines de type C, et être internalisé dans les
endosomes des cellules cibles comme la cellule dendritique, le monocyte et le macrophage.
La voie d’endocytose permet aux cellules de séquestrer le virus dans les endosomes et
d’assurer son transfert aux cellules avoisinantes [17, 18].
1.1.3.3. Décapsidation/Transcription inverse/Intégration nucléaire de l’ADN
viral
Une fois dans le cytoplasme, la déstabilisation de la capside à la suite de la phosphorylation
des protéines de la matrice par les kinases associées au virus [19], favorise la libération de
tout son contenu incluant les deux brins d’ARN et les enzymes virales. L’ARN viral simple brin
est rétrotranscrit en ADN simple brin par la transcriptase inverse, en utilisant une amorce
d’origine cellulaire liée au génome viral (ARNt Lys3 ). En même temps, la RNAse H de la
transcriptase inverse procède à la dégradation totale de l’ARN matriciel et laisse indemnes les
courtes séquences riches en purines qui serviront d’amorces pour la synthèse du second brin
6
en utilisant comme matrice, l’ADN proviral simple brin. La transcriptase inverse est dépourvue
d’une activité exonucléase 3’ vers 5' et elle peut fréquemment changer des matrices
nécessaires pour la rétrotranscription du génome virale. Ceci fait que cette enzyme introduit
des erreurs qui sont responsables de la grande variabilité génétique du VIH-1 et
conséquemment de la résistance aux antirétroviraux et à l’échappement au système
immunitaire [20].
L’ADN proviral double brin ainsi synthétisé, reste lié aux protéines virales et cellulaires formant
ainsi, un complexe de pré-intégration (PIC : pre-integration complex) composé essentiellement
de l'ADN proviral double brin, de l’intégrase, de la transcriptase inverse, des protéines de la
matrice, de l’amorce ARNt Lys3, de la Vpr, et des protéines d’origine cellulaire comme HMG-I/Y
(High mobility group protein). Le mécanisme par lequel l’ADNc viral est transporté dans le
noyau est encore mal connu et diffère en fonction du type cellulaire. Il est proposé que le PIC
pénètre dans le noyau par les pores nucléaires soit grâce à la machinerie cellulaire d’import
nucléaire associée aux protéines virales (Intégrase, protéines matricielles et Vpr) ayant des
propriétés caryophiles, soit grâce à une structure inhabituelle (central DNA flap) contenue
dans l’ADN viral [21, 22].
Dans le noyau, l’intégrase virale coupe quelques nucléotides dans chacune des extrémités de
l’ADN viral et clive en même temps l’ADN chromosomique de la cellule infectée de manière à
permettre la jonction de ces deux molécules. L’ADN viral est ainsi intégré dans le génome de
la cellule sous la forme de provirus grâce à l’action de l’intégrase virale [23], et la réplication du
virus commence ou sa latence s’installe.
1.1.3.4. Transcription
Une fois dans le noyau, l’ADN proviral est transcrit en ARNm viral par une enzyme cellulaire,
l’ARN polymérase II. Cependant, cette transcription nécessite que la cellule soit dans un état
d’activation. En effet, les facteurs de transcriptions présents dans la cellule activée notamment
le NF-KB (Nuclear factor-kappa B), interagissent avec le promoteur viral situé sur le 5’LTR et
permettent la transcription des gènes viraux en ARN viral génomique, ARNm partiellement
épissé ou non épissé et en ARNm poly ou complètement épissé. À cette étape du cycle, la
protéine Tat favorise la transcription virale efficiente en permettant à l’ARN polymérase II de
7
synthétiser des longs transcrits [24] et la protéine Rev assure l’exportation des ARNm viraux
du noyau vers le cytoplasme [25].
1.1.3.5. Traduction
Dans le cytoplasme, les ARNm poly ou multi-épissés sont traduits en protéines régulatrices
(Tat, Rev, Nef, Vif, Vpu, Vpr) et les ARNm peu ou non épissés sont traduits en polyprotéines
Gag, Gag-Pol et Env. La polyprotéine Env est clivée par une protéase cellulaire pour donner
naissance à deux protéines de l’enveloppe virale (gp120 et gp41) et les polyprotéines Gag et
Gag-Pol par contre, vont subir un clivage protéolytique par la protéase virale, au moment du
bourgeonnement pour aboutir aux protéines internes du virus (Matrice, Capside,
Nucléocapside et les trois enzymes virales : Transcriptase inverse, Intégrase et Protéase).
1.1.3.6. Assemblage et bourgeonnement
Ils constituent les deux dernières étapes du cycle viral et interviennent au moment où la quasi-
totalité des protéines virales est synthétisée et est présente dans le cytoplasme de la cellule
infectée. Toutes les protéines virales y compris l’ARN génomique du virus s’assemblent au
niveau de la face interne de la membrane plasmique sous le contrôle de la polyprotéine Gag
myristoylée [26]. Le bourgeonnement se passe dans les corps vésiculaires pour les
macrophages [27], et les virus sont ensuite libérés de la cellule après fusion de ces corps
vésiculaire avec la membrane cytoplasmique.
La maturation des particules virales a lieu lorsque les virions sont relâchés dans
l’environnement extracellulaire via la protéine Vpu. Par la suite, intervient le clivage des
précurseurs de Gag et Gag-Pol par la protéase virale qui va générer les protéines constitutives
internes (P6MA, P7MA, P17CA et P24NC) et les trois enzymes virales (transcriptase inverse,
intégrase et protéase). La capside se condense et prend la forme en cône. La particule virale
devient ainsi mature et infectieuse.
Les traitements antirétroviraux disponibles ciblent plusieurs de ces étapes du cycle réplicatif
du virus.
8
1.1.4. Thérapie antirétrovirale du VIH-1
Les médicaments antirétroviraux actuellement sur le marché ne guérissent pas le sida, mais
jouent un rôle important dans la prévention de la transmission du VIH-1 et dans l’augmentation
de l’espérance de vie des patients. Généralement, une combinaison de trois molécules
antirétrovirales est requise pour supprimer la réplication virale [28] afin de retarder la survenue
du sida. Cependant, ce traitement ne restaure pas l’état de santé de patient et doit être
maintenu à vie pour prolonger l’espérance de vie.
Les agents antirétroviraux sont répartis en six différentes classes en fonction de leur
mécanisme et de leur cible. Ces classes sont : les inhibiteurs de la transcriptase inverse :
NRTIs et NtRTIs (nucleoside and nucleotide analog reverse transcriptase inhibitors) et NNRTIs
(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors), les inhibiteurs d’intégrase, les inhibiteurs des
protéases, les inhibiteurs de fusion et les inhibiteurs d’entrée (antagoniste de corécepteur
CCR5) [29]. Chacun de ces agents pharmacologiques agit sur une cible spécifique dans les
différents stades du cycle réplicatif du VIH-1. [30]. La réussite du traitement est mise en
évidence par une élévation du nombre de LTCD4 et une diminution de la charge virale à un
niveau indétectable (inférieur à 40 copies/ml) dans le sang et dans les sécrétions génitales
[31, 32].
Bien qu’ayant un potentiel de supprimer la réplication virale, de réduire la transmission du virus
et de retarder la survenue du sida, les antirétroviraux ne peuvent pas éliminer le virus latent
dans les cellules. Il est donc important de chercher à comprendre davantage la
physiopathologie du VIH-1, afin de découvrir des nouvelles cibles thérapeutiques et de
développer des nouvelles approches thérapeutiques pour mieux lutter contre ce fléau. Il serait
en outre intéressant que les nouvelles approches thérapeutiques puissent résoudre le
problème d’échappement thérapeutique dû à la mutation virale et aux variants viraux, mais
aussi le problème d’effets secondaires dus à la toxicité des médicaments. Une autre
alternative serait d’aborder une approche qui puisse sortir le virus de sa latence. Ceci
permettrait de guérir les patients de l’infection à VIH-1. Une autre approche serait de fournir
une cure fonctionnelle, c’est-à-dire de contrôler le virus par immunothérapie.
9
1.1.5. Nouvelles approches thérapeutiques
Parmi les nouvelles approches thérapeutiques en cours de développement, la thérapie
génique peut faire recours au RNAi (RNA interference) comme les shRNA (small hairpin
RNAs) et les siRNA (small interferingRNA) [33, 34], aux nucléases au doigt de zinc (ZFNs :
Zinc Finger Nucleases) [35, 36], aux nucléases effectrices de type activateurs de transcription
(TALENs : Transcription Activator-Like Effector Nuclease) [37], au CRISPR/Cas9 (Clustered
Regularly interspaced Short Palindromic Repeats/Caspase9) [38, 39] ainsi qu’aux
méganucléases (MGNs) et aux peptides d’acides nucléiques [40], pour modifier le gène cible.
Ceci peut conduire vers une cure fonctionnelle. Par exemple, l’édition de gène peut réprimer
de manière permanente le gène qui code la protéine CCR5 ou CXCR4 conférant ainsi à la
cellule cible une résistance permanente à l’infection par le VIH-1 [37, 40-43]. La thérapie
génique dirigée contre le VIH-1 peut constituer une approche personnalisée encore assez
risquée et dispendieuse pour éradiquer le VIH-1. En effet, les scientifiques envisagent cette
approche pour réduire au silence les gènes codant les protéines virales et ceux de la
machinerie cellulaire impliqués dans la réplication virale, ainsi que ceux qui codent les
protéines impliquées dans la liaison et la fusion du VIH-1. Ceci peut permettre de contrôler la
réplication du VIH-1 et de bloquer l’infection dès les premières étapes du cycle viral,
notamment la fusion et l’entrée du virus, la rétrotranscription et l’intégration de l’ADN viral dans
la cellule hôte [28, 44]. Ainsi, le siRNA et le shRNA synthétiques et spécifiques au VIH-1 sont
capables de réprimer l’expression post-transcriptionnelle des gènes viraux en ciblant des
transcrits viraux tels que tat, rev, gag, pol, nef, env, vpr et LTR au niveau du cytoplasme [45].
Ces RNAi peuvent aussi cibler le génome viral intégré dans le génome de la cellule hôte [46-
48] et le réduire au silence en dégradant l’ARNm viral. A l’instar des antirétroviraux, le virus
peut s’échapper à cette approche thérapeutique suite aux multiples mutations occasionnées
notamment par la transcriptase inverse. Ces mutations peuvent changer la structure des
ARNm viraux et empêcher les RNAi de s’apparier à leurs séquences cibles et
complémentaires [49-51]. Ainsi, il est important que le RNAi dirigé contre le VIH-1 puisse cibler
les régions hautement conservées du génome viral de manière à éviter ou à réduire
l’échappement thérapeutique [45]. La combinaison des RNAi (siRNA ou shRNA) ou la
combinaison des siRNAs avec les antirétroviraux permet de cibler plusieurs sites de réplication
virale et peut ainsi, contourner la résistance due aux mutations [49, 52, 53].
10
Les siRNA ou shRNA spécifiques au CCR5 semblent être intéressants, dans la mesure où ce
récepteur n’est pas requis comme un facteur jouant une fonction immune essentielle de
lymphocyte T [54]. En outre, il a été montré que les personnes déficientes du récepteur CCR5
à la surface des cellules progénitrices hématopoïétiques étaient résistantes à l’infection par le
VIH-1, sans que le fonctionnement normal de ces cellules ne soit perturbé. Cependant, le
CXCR4 est requis comme un facteur de maturation des lymphocytes T [55]. Sa suppression
peut avoir des répercussions sur la maturation de ces cellules. Une autre limite de la thérapie
génique est liée au potentiel immunoactivateur des vecteurs viraux et de RNAi, qui peuvent
être reconnus par les TLRs endosomaux et induire une réponse inflammatoire suivie de la
production des INF-α [45, 56]. Ces éléments doivent être pris en compte avant de tenter
l’application des RNAi comme thérapie génique en clinique. Cependant, la plus grande
difficulté reste le mode de livraison de RNAi dans la cellule ou le tissu cible [45], ceci implique
l’utilisation d’un vecteur spécifique qui ne soit pas immunogène. La thérapie génique dirigée
contre le VIH-1 est donc prometteuse, mais il faut encore beaucoup des recherches avant que
son utilisation en clinique ne soit effective.
La latence virale constitue un grand obstacle qui empêche l’éradication définitive de l’infection
à VIH-1. Ainsi, obtenir plutôt une cure fonctionnelle, une stratégie immunologique incluant le
vaccin thérapeutique, les anticorps monoclonaux neutralisants et les inhibiteurs des
immunomodulateurs serait plus réaliste. Par exemple, le vaccin thérapeutique jouerait le rôle
d’augmenter la réponse immunitaire cytotoxique spécifique au VIH-1. Ceci permettrait le
contrôle de l’infection par le système immunitaire. Les anticorps monoclonaux neutralisants
dirigés contre le VIH-1 pourraient cibler et activer les cellules en latence virale de manière à
stimuler la réplication du VIH-1 et la déplétion de ces cellules. Les immunorégulateurs, tel que
la protéine PD-1 (Programmed cell death protein 1), jouent un rôle dans l’homéostasie
immunitaire et leurs inhibitions contribueraient à augmenter le potentiel du système
immunitaire pour faire efficacement face à l’infection [57, 58]. Pour parvenir à une cure
fonctionnelle basée sur l’immunothérapie, une bonne compréhension du mécanisme par
lequel les cellules maintiennent la latence virale et échappent au contrôle du système
immunitaire [58] ainsi que des mécanismes immunitaires qui sont impliqués dans le contrôle
du virus s’avère nécessaire. Dans ce sens, les observations et les études réalisées chez les
11
patients appelés contrôleurs élites du VIH-1 ont montré que ces derniers sont capables de
contrôler leurs charges virales en dehors de tout traitement antiviral.
1.1.6. Patients capables de contrôler la charge virale
Les contrôleurs du VIH-1 ou Elite controllers en anglais, constituent un groupe de personnes
infectées par le VIH-1 dont l’organisme est capable de contrôler de manière spontanée et
durable la réplication du virus en l’absence de traitement antirétroviral [59]. Ces individus ne
développent pas le sida. Ils maintiennent la charge virale plasmatique à des taux non
détectables en clinique (inférieur à 50-75 copies /ml) pour une longue période. Le taux des
LTCD4 reste par conséquent élevé, réduisant ainsi, le risque de progression vers la phase
sida [59, 60]. Les contrôleurs élites représentent moins de 1% de l’ensemble de personnes
infectées par le VIH-1 [60-62]. Ils constituent un modèle naturel du contrôle virologique par
l’organisme.
Les contrôleurs élites sont différents des progresseurs lents du VIH-1 (LTNP : Long term non
progressors). En effet, ces derniers sont définis comme étant un groupe d’individus infectés
par le VIH-1, mais maintenant le taux de CD4 à un niveau élevé pendant plusieurs années en
l’absence des traitements antirétroviraux [60, 63]. Ce sont donc des personnes ayant un
phénotype avec une grande stabilité immunologique et dont la charge virale peut être basse
ou modérée [60, 64]. Les deux groupes d'individus, bien que différents par leur définition,
constituent deux phénotypes capables de gérer le VIH-1 sans développer le SIDA pendant
plusieurs années. Une bonne compréhension du mécanisme biologique de ces deux modèles
naturels peut permettre une mise en place d’un vaccin thérapeutique ou une thérapie antivirale
les mimant et capable de contrôler la réplication virale [59].
Les contrôleurs élites et les progresseurs lents arrivent à contrôler la réplication virale grâce à
leurs lymphocytes T cytotoxiques spécifiques aux antigènes viraux [65]. Chez certains
contrôleurs élites, ces lymphocytes sont associés aux allèles du complexe majeur
d’histocompatibilité du type I (CMH I) tels que le HLA B*27, le HLA B*57 et le HLA C. Ces
facteurs immunogénétiques particuliers leur confèrent un potentiel de résistance contre la
réplication du VIH-1. Les LTCD8 cytotoxiques associés à ces facteurs génétiques protecteurs,
12
possèdent une grande avidité aux épitopes du VIH-1 [66, 67], et sont capables de détruire les
LTCD4 infectés par le virus. Une fois activés, les LTCD8 peuvent induire la production des
enzymes cytolytiques comme les granzymes B et les perforines [68, 69], mais aussi la
production des cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-2 nécessaire à la prolifération
cellulaire et l’IFN-γ ayant une activité antivirale. Tous ces éléments contribuent de manière
naturelle au contrôle de la charge virale.
Un autre mécanisme permettant aux contrôleurs élites et aux progresseurs lents de contrôler
la charge virale est l’immunité innée due par l’activation de cellule NK (Naturel killer). En effet,
il a été montré in vitro que l’allèle HLA-Bw4 du HLA-B*57 était fortement associé aux
récepteurs de la cellule NK, le KIR (killer immunoglobulin receptor) tels que KIR3DS1 et
KIR3DSL1 [70-72]. Ces résultats ont montré que l’association entre le KIR et ses ligands, HLA-
B Bw4 permettait le contrôle de la réplication virale et par conséquent empêchait la
progression de l’infection vers la phase SIDA. Il a été également montré que l’inhibition de la
réplication virale était plus efficace dans la cellule NK exprimant l’allèle KIR3DS1 que dans
celle ne l’exprimant pas [72].
En plus des facteurs immunogénétiques décrits ci-dessus, il en existe d’autres notamment les
facteurs intrinsèques de restriction ou les facteurs participant à l’immunité intrinsèque. C’est le
cas de la protéine APOBEC3G qui est présente en plus grande quantité dans les LTCD4 des
contrôleurs élites. Ceci permet une limitation de la réplication du VIH-1 sur les cellules cibles,
contribuant ainsi, avec les autres facteurs cités ci-haut au contrôle de la charge virale [73].
Ces observations recueillies chez les contrôleurs élites et les progresseurs lents montrent
qu’une réponse immunitaire efficace peut contrôler ce virus. Il est donc important de bien
connaitre l’immunopathogénèse de l’infection à VIH-1.
1.1.7. Immunopathogénèse de l’infection à VIH-1
L’infection par le VIH-1 est caractérisée dès la primo-infection, par une déplétion massive et
progressive des LTCD4 et par une dérégulation irréversible du système immunitaire.
.
13
1.1.7.1. Entrée du virus dans l’organisme
La barrière des muqueuses génitales ou digestives est la principale voie d’entrée du virus
dans l’organisme. Dans la lamina propria, le virus va entrer en contact avec les cellules
susceptibles à l’infection [74], notamment les cellules dendritiques myéloïdes, les LTCD4 à
mémoire effectrice et les macrophages [75].
Les cellules dendritiques présentes dans la muqueuse constituent les premières cellules à
reconnaitre les pathogènes et à provoquer l’induction de la réponse immunitaire adaptative par
les lymphocytes T. Les cellules dendritiques qui reconnaissent les pathogènes à travers leurs
PRR (pattern recognition receptors), migrent vers les organes lymphoïdes secondaires, grâce
à leurs récepteurs de chimiokines CCR7 qui interagissent avec leurs ligands, CCL19 ou
CCL21 produits par les cellules de stroma [76]. L’interaction entre l’antigène lié au CMHII et le
complexe TCR/CD3, accompagnée de l’interaction des molécules de costimulation,
provoquent l’activation des LTCD4 naïfs qui seront par la suite polarisés en LTCD4 mémoires
et effecteurs (de type Th1, Th2, Th17) et en LTCD4 régulateurs (Treg).
Dans les tissus lymphoïdes de la muqueuse gastro-intestinale, les cellules dendritiques
CD103+/- secrètent l’acide rétinoïque conférant aux lymphocytes T effecteurs un tropisme
digestif en leur induisant l’expression de récepteurs de chimiokines CCR9 et des molécules
d’adhésion α4β7 [77-79]. Ces molécules interagissent respectivement avec leurs ligands
CCL25/TECK (Thymus-Expressed chemokines) et MADCAM-1 (Mucosal vascular addressin
cell adhesion molecule) et permettent la migration aussi bien des lymphocytes T effecteurs
que des lymphocytes B effecteurs ou plasmocytes sécréteurs d’IgA vers la muqueuse [77, 80,
81].
La cellule dendritique ayant capturé le VIH-1 grâce à ses PRR, notamment les lectines de
types C comme le DC-SIGN, le DC205, le MMR, ou le DCIR, l’internalise dans les endosomes
et migre dans les organes lymphoïdes secondaires, comme le ganglion lymphatique ou la
cellule dendritique va transférer le virus aux LTCD4 lors des interactions cellulaires. Dans les
organes lymphoïdes, la réplication du virus est très intense provoquant ainsi, la déplétion
massive des LTCD4 et occasionnant la propagation du virus dans d’autres organes [82]. La
plus grande déplétion de LTCD4 se passe dans le tractus gastro-intestinal, car cette
muqueuse héberge un grand nombre de lymphocytes T mémoires activés ayant un phénotype
14
CD4+CCR5+, susceptibles à l’infection par le VIH-1 [83, 84]. Cette déplétion massive entraine
la détérioration du système immunitaire et de l’architecture de la muqueuse.
Figure 4 : Transmission du VIH-1 dans les muqueuses (Adapté de [85])
1.1.7.2. Perte de l’intégrité de la muqueuse intestinale
Les muqueuses constituent une barrière de protection contre les microorganismes présents
dans l’environnement extérieur. Les tissus lymphoïdes qui s’y trouvent jouent un rôle crucial
pour le contrôle de l’inflammation et de l’activation immunitaire, participant ainsi, à l’intégrité de
la barrière mucosale [86]. Dans la muqueuse gastro-intestinale, les LTCD4 polarisés en Th17
15
contribuent à l’homéostasie de la muqueuse digestive. En effet, grâce à la sécrétion de l’IL-17
et l’IL-22, ils assurent le maintien de l’intégrité de la barrière mucosale. La cellule dendritique
CD103+, en secrétant l’acide rétinoïque, permet à d’autres cellules comme les cellules
lymphoïdes innées de sécréter l’IL-17 et l’IL-22, deux cytokines associées au maintien de
l’intégrité structurale de la barrière épithéliale [87], protégeant ainsi les jonctions serrées entre
les cellules épithéliales. Les LTCD4 Th17 sont des cellules très permissives à l’infection par le
VIH-1 [88]. Ainsi, lors des premières étapes de l’infection par le VIH-1, on observe une
déplétion massive de ces cellules au niveau des organes lymphoïdes secondaires du tractus
gastro-intestinal [89], menant subséquemment à une diminution importante de production de
l’IL-17 et l’IL-22. Ceci occasionne un dysfonctionnement et une perte de l’intégrité de la
muqueuse, résultant par une translocation microbienne et des produits microbiens.
La perte de l’intégrité de la barrière mucosale est aussi observée suite au dysfonctionnement
des cellules B durant l’infection par le VIH-1. Il mène à une diminution de production des
immunoglobulines A (IgA). Il est cependant connu que l’IgA joue un rôle dans la protection de
la muqueuse contre la translocation microbienne. Cet anticorps est capable de former des
complexes avec les bactéries, leur empêchant ainsi d’être en contact avec l’épithélium. Il peut
en outre assurer la neutralisation des produits microbiens [90]. Le dysfonctionnement des
cellules B induit à la suite de l’infection par le VIH-1 incluant la diminution du nombre d’IgA
contribue à la perte de l’intégrité de la barrière épithéliale [91, 92].
Après la perte de l’intégrité mucosale, on observe chez les personnes infectées, une
augmentation des taux plasmatiques des produits microbiens notamment le lipopolysaccharide
qui constitue un indice clé de la translocation microbienne et prédicteur de la progression de la
maladie [93]. On observe en outre l’augmentation d’autres marqueurs associés à la
translocation microbienne, mais aussi à la sévérité de la maladie, comme l’ADN ribosomique
16s bactérien [94] et le CD14 soluble [95]. Tous ces marqueurs peuvent persister et rester
élevés dans le plasma après plusieurs années de traitement aux antirétroviraux [96, 97].
Les bactéries et les produits microbiens ayant subi la translocation peuvent être reconnus par
les PRR comme les TLRs exprimés sur les cellules présentatrices d’antigènes. Ceci
occasionne l’activation des certaines voies de signalisation cellulaires notamment le NF-kB
résultant par la production des cytokines pro-inflammatoires [98]. Les LTCD4 sont activés par
16
la présentation antigénique, mais aussi par les cytokines pro-inflammatoires et cette activation
du système immunitaire favorise la réplication du VIH-1.
1.1.8. Immunopathogenèse du VIH-1 associée aux toll like
receptors (TLRs)
Les TLRs (Toll Like Receptor) sont des PRRs qui reconnaissent les motifs conservés des
pathogènes PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns) et DAMP (Damage-Associated
Molecular Patterns) provoquant l’activation cellulaire et la production des cytokines
inflammatoires et de plusieurs molécules antivirales [99]. Les TLRs sont exprimés par la
majorité des cellules de l’immunité innée y compris les cellules endothéliales. Certains parmi
eux sont membranaires tels que le TLR1, le TLR2, le TLR4, le TLR5, le TLR6, le TLR10 et le
TLR11. D’autres par contre sont localisés dans les compartiments endosomaux, il s’agit de
TLR3, TLR7, TLR8 et de TLR9 [99-101] et sont impliqués dans la défense contre les virus
[102, 103]. Ils contiennent dans leurs parties extracellulaires un domaine LRR (Leucin-Rich
Repeat) et dans la partie cytoplasmique une région hautement conservée, un domaine TIR
(Toll/IL-1 receptor). L’activation des TLRs par leurs ligands spécifiques induit une cascade des
voies de signalisation dépendante ou indépendante de MyD88 (Myeloid differentiation primary
response gene 88) aboutissant à l’activation des facteurs de transcription tels que NF-Kb
(Nuclear factor-kappa B), AP-1 (Activator protein 1) et IRF3 (Interferon regulatory factor 3). La
voie dépendant de MyD88 conduit à l’activation de facteur de transcription NF-kB qui favorise
la production des cytokines pro-inflammatoires et au facteur IRF3 spécifique à la production
d’IFN-β après activation de TLR7, TLR8 et TLR9. Cette voie est commune à tous les TLRs
sauf le TLR3 dont la voie de signalisation est dépendante d’une protéine adaptatrice, le TRIF
(TIR domain-containing adaptator protein induced IFN-β). L’activation de TLR4 par contre peut
engager les deux voies et implique comme protéines adaptatrices, les TRAM (TRIF lated
adaptator molecule)/TRIF et les TIRAP (TIR associated protein)/MyD88 [103].
Les TLRs exprimés sur les cellules de l’immunité innée notamment les cellules myéloïdes tels
que les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques contribuent de manière
directe dans la stimulation du système immunitaire des personnes infectées par le VIH-1.
Cette activation chronique du système immunitaire est en faveur de la réplication virale
17
intense, à la déplétion massive des LTCD4 [87, 104] et provoque la dérégulation de la réponse
immunitaire [105], préparant ainsi la route vers l’étape sida.
La présence de LPS dans le sang de personnes infectées par le VIH-1 constitue un indice
remarquable de la translocation microbienne. Ainsi, le TLR4 est capable de le reconnaitre et
d’induire l’activation du système immunitaire inné ou adaptatif. L’activation des TLRs par les
pathogènes ou les produits microbiens favorise la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires
notamment le TNF-α, l’IFN-α, l’IL-1, l’IL-6 et l’IL-18 qui, en dehors de leur rôle activateur du
système immunitaire innée [106, 107] participent aussi à l’apoptose des cellules de l’immunité
des personnes infectées par le VIH-1. La modulation de ces cytokines par l’immunothérapie
peut constituer une approche thérapeutique [107].
En dehors de LPS, d’autres produits microbiens notamment l’ARN, l’ADN, la flagelline et le
peptidoglycane sont susceptibles d’être reconnus par les TLRs et participent à l’activation
chronique du système immunitaire des personnes infectées par le VIH-1. En effet, les TLRs
7/8 reconnaissent l‘ARN génomique du VIH-1, mais aussi les ARNs simples brins des autres
pathogènes permettant ainsi l’activation directe du système immunitaire. Leur expression
particulière sur les cellules dendritiques plasmacytoïdes permet la sécrétion d’INF-α, l’une des
cytokines jouant un rôle non seulement dans l’immunité innée et adaptative [108, 109], mais
aussi dans l’apoptose des LTCD4 [110]. Il en est de même pour le TLR9 localisé
particulièrement dans le réticulum endoplasmique et le TLR3 qui se lient respectivement à
leurs ligands, CpG-DNA et ARNdb et par conséquent participent à l’activation immunitaire. Le
TLR2 constitue un bon détecteur de mycobactérium tuberculosis lors de la co-infection sida-
tuberculose [111]. L’infection chronique à VIH-1 est associée à l’augmentation de l’expression
des TLRs sur les cellules de l’immunité innée [112] notamment le TLR2 sur le monocyte,
contribuant ainsi à l’inflammation et à la réplication virale.
Il a été montré que la pré-stimulation de TLR8 par l’ARN génomique du VIH-1 ou par un autre
ligand qui lui est spécifique, entrainait l’augmentation de la production des cytokines pro-
inflammatoires par le biais de TLR4 exprimé sur le monocyte, après sa stimulation par le LPS
issu de la translocation microbienne [113]. La stimulation croisée des certains TLRs pendant
18
l’infection chronique par le VIH-1, peut donc amplifier l’activation immunitaire et accélérer la
réplication virale.
La voie de TLRs impliquée dans l’activation chronique du système immunitaire peut être
considérée comme une cible thérapeutique potentielle capable de réduire l’immunopathologie
de l’infection par le VIH-1 [114]. Comme dit ci-haut, la stimulation des TLRs endosomaux induit
une cascade des voies de signalisation aboutissant à une réponse immunitaire antivirale par la
production des molécules antivirales notamment l’IFN-β, l’IFN-α et IFN-γ [99]. L’utilisation des
agonistes de ces TLRs ou autres molécules qui miment l’ARN génomique du VIH-1 peut
générer une réponse immunitaire anti-VIH-1 capable d’inhiber la réplication virale dans les
premières étapes de l’infection [115]. Il a ainsi été montré que les agonistes de TLR7, comme
le gardiquimod étaient capables de stimuler le TLR7 par une voie dépendante de la protéine
adaptatrice MyD88 et d’induire la production d’une grande quantité d’IFN-α nécessaire pour
inhiber la réplication du VIH-1 dans les PBMCs (Peripheral blood mononuclear cell) en culture.
Le rôle des agonistes de TLRs comme adjuvant ont été montré dans le vaccin thérapeutique
dirigé contre le VIH-1 chez la souris [116, 117] et chez les primates non humains [118, 119].
Ces expériences ont montré que les agonistes de TLRs étaient capables d’augmenter la
réponse immunitaire anti-VIH-1 tant humorale que cellulaire induite suite à l’inoculation du
vaccin.
Les agonistes des TLRs ou autres molécules mimant l’ARN génomique du VIH-1, constituent
des outils thérapeutiques contre cette pandémie. Leur combinaison avec le vaccin
thérapeutique peut s’avérer une approche intéressante capable d’inhiber la réplication virale,
tout comme notre compréhension des mécanismes impliqués dans leurs régulations. Cette
introduction au chapitre 2 est une excellente initiative. À ce sens, la lectine de type C, DCIR a
été décrite comme un inhibiteur de l’activation des TLRs endosomaux TLR7/8 et TLR9 [120,
121]. Quels rôles jouent les lectines de type C dans la réponse immunitaire et l’infection au
VIH-1 ? Ce sujet sera abordé dans le chapitre 2 de ce mémoire.
19
1.2. Les lectines de type C et le VIH-1
1.2.1. Les lectines
Les lectines sont des protéines ou glycoprotéines capables de reconnaitre et de se lier de
manière spécifique et réversible aux saccharides, oligosaccharides et aux glycoprotéines. Les
lectines sont présentes chez les animaux et sur les microorganismes notamment les bactéries
et les virus. La plupart des lectines possèdent un domaine commun de reconnaissance de
sucre (CRD : Carbohydrate Recognition Domain). La première lectine, extraite des graines de
ricin (Ricinus communis), découverte en 1888 par Herman Silltmark était de nature végétale.
Cette lectine avait la capacité de reconnaitre les sucres présents à la surface des érythrocytes
et de provoquer leur agglutination [122].
1.2.2. Classification des lectines
Plusieurs critères existent pour classifier les lectines. Cette classification peut se faire en
fonction de leurs origines (animale, virale, bactérienne ou végétale), de la séquence en acides
aminés du domaine CRD de reconnaissance des glucides [123], de la spécificité vis-à-vis des
saccharides ou en fonction de leurs structures moléculaires. Il existe plusieurs structures
tridimensionnelles des lectines, regroupées en familles dont certaines sont d’origine animale.
Parmi les lectines animales, on trouve les calnexines, les lectines de type M, type C, type F,
type I (Siglecs), type L, type P, type R, Lectines box F, galectines, lectines chitinase like,
ficolines et intelectines. Certaines sont cytosoliques et jouent un rôle dans le repliement, le tri,
la maturation et le trafic des protéines. Dans ce groupe, on retrouve notamment les
calnexines, les galectines, les lectines de types M, P et L. D’autres par contre, sont
extracellulaires telles que les lectines de type C et de type R, les siglecs et les galectines et
sont impliquées dans la reconnaissance des motifs conservés des pathogènes et dans la
signalisation et l’adhésion cellulaire [124, 125].
Dans ce projet de maitrise, les lectines de type C et particulièrement le DCIR a retenu notre
attention et constitue l’objet de notre étude.
20
1.2.3. Les lectines de type C
1.2.3.1 Structure et classification des lectines de type C
Les lectines de type C constituent un groupe hétérogène de protéines transmembranaires
caractérisées par un ou plusieurs domaines de reconnaissance des hydrates de carbone,
CRD [126, 127]. Ce terme, lectine de type C a été désigné pour les différencier des autres
lectines animales ne possédant pas le domaine CRD et dont la liaison avec le sucre ne
dépendait pas du calcium [128]. Il est à noter par ailleurs que toute lectine de type C ne lie pas
exclusivement le sucre. Ainsi, il existe des lectines de type C, possédant le domaine CRD,
mais qui sont capables de lier d’autres ligands que le sucre, notamment les protéines, les
lipides ou des substances non organiques tel que le venin du serpent [129]. D’autres encore
peuvent lier le sucre, mais indépendamment du calcium. Ces lectines sont désignées lectine
de type C like [126, 129].
Le domaine CRD des lectines de type C est doté d’une structure en forme de double boucle et
possède 4 sites de liaison du calcium, dont deux sont requis pour la reconnaissance et la
liaison des hydrates de carbone. Ces deux sites de liaison en l’occurrence le motif EPN (Gln-
Pro-Asn), spécifique au mannose et au fucose et le motif QPD (Gln-Pro-Asp), spécifique au
galactose et au glycane contenant le N-acetylgalactosamine [128, 130, 131], sont composés
chacun d’un triplé d’acides aminés dont l’un est un résidu cystéine-proline qui sépare les
chaines carbonyles latérales. Chez le DCIR, le résidu aspargine est remplacé par la sérine, ce
qui résulte au motif EPS (Glutamate-Proline-Sérine) [132]. La liaison du domaine CRD/Ca2+ et
le monosaccharide forment un complexe dont les deux chaines carbonyles assurent la
coordination de la liaison du CRD au calcium et la formation des ponts d’hydrogène en liaison
avec le monosaccharide. Ces deux liaisons permettent de stabiliser le complexe et de
déterminer la spécificité de la liaison du domaine de lectine de type C au sucre [133]. Les
lectines de type C sont codées par un complexe de gènes des cellules NK (NKC : Natural
Killer Complex) localisé sur le chromosome 6F3 chez la souris et sur le chromosome 12p13
chez l’humain [134].
Les lectines de type C sont exprimées dans plusieurs types cellulaires, mais dans le cadre de
ces travaux, nous allons plus nous concentrer sur les lectines membranaires de type C,
particulièrement celles qui sont exprimées sur les cellules de la lignée myéloïde.
21
1.2.3.2. Lectines de type C des cellules myéloïdes
Selon le groupe de Figdor, on peut classer les récepteurs lectines de type C exprimées sur les
cellules myéloïdes, particulièrement sur les cellules dendritiques et sur les cellules de
langherans en deux grands groupes en fonction du nombre de domaines CRD présent dans la
portion extracellulaire. Le premier groupe est celui des lectines de type C de type I comportant
plusieurs domaines CRD. On retrouve dans ce groupe, les lectines comme le MMR
(Macrophage mannose receptor) et le DEC 205 (Dendritic and epithelial cell 205 kDa). Le
deuxième groupe par contre est composé des lectines de type C de type II possédant un seul
domaine CRD [135].
Figure 5 : classification et structure des lectines de type C de type I et type II exprimées
sur les cellules de la lignée myéloïde ( Adapté de [135]).
En nous référant à certains travaux, notamment ceux de Huysamen [136, 137], ceux de
Susanne Sattler [138] et ceux de Bernhard Kerscher [139], on peut classer les lectines de type
C de type II en deux grands blocs en fonction de l’organisation du domaine CRD et du motif de
signalisation cytoplasmique: le groupe de dectine-1 et de dectine-2. Les 2 groupes possèdent
dans leur portion extracellulaire, un seul domaine CRD, un domaine neck et une région
transmembranaire. Dans leur portion cytoplasmique, on trouve un motif impliqué dans la
transduction du signal qui peut être soit un ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation
22
motif), soit un ITIM (Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) ou un domaine riche en
proline ou encore un motif di-leucine [140]. Le groupe de dectine-1 comprend le MICL (Myeloid
Inhibitory C-type lectin-like receptor) ou CLEC12A, CLEC12B, CLEC9A (C-type lectin domain
family-12A,12B, 9A), CLEC-1, CLEC-2 (C-type lectin family-1, 2), Dectin-1(Dendritic cell-
associated C-type lectin-1) ou CLEC7A et LOX-1 (Lectin-like oxydized low-density lipoprotein
receptor-1). Le groupe de dectin-2 est composé de BDCA (Blood dendritic cell antigen-2),
DCAR (Dendritic cell immuno-activating receptor), DCIR (Dendritic cell immunoreceptor),
Dectin-2 (Dendritic cell-associated type lectin-2), CLECSF8 (C-type lectin superfamily 8) et
Mincle (Macrophage-inducible C-type lectin) [136]. Les deux groupes présentent des grandes
ressemblances dans leurs portions extracellulaires, ils se différencient cependant par la taille
de leur queue cytoplasmique. En effet, le dectin-1 possède un domaine cytoplasmique long et
suffisant pour induire directement une signalisation intracytoplasmique. Le groupe de dectin-2
par contre, contient une queue cytoplasmique courte et ne possède donc pas un domaine de
signalisation dans leur portion cytoplasmique à l’exception de DCIR dont le motif
cytoplasmique est long comme celui du groupe de dectin-1 [139]. Pour les autres membres,
l’induction du signal intracytoplasmique nécessite au préalable l’association du récepteur avec
une molécule adaptatrice comme le récepteur FcRγ [139] ou avec un partenaire de
signalisation comme DAP12 (DNAX-activating protein of 12 kDa) [134]. Cette association se
fait au niveau de la région transmembranaire grâce à une interaction entre un résidu chargé
positivement dans la dectin-2 et un autre résidu chargé négativement dans la chaine gamma
du FcR [139, 141].
Les lectines de type C jouent un rôle majeur dans le système immunitaire. En effet, à l’instar
des TLRs, elles se comportent comme des PRR et sont capables de reconnaitre et de lier
leurs ligands endogènes et exogènes, incluant les pathogènes comme les champignons, les
bactéries et les virus et de participer à l’induction de l’immunité innée et adaptative, mais aussi
à l’homéostasie du système immunitaire [142, 143]. Après activation, les lectines contenant le
motif ITIM recrutent les tyrosines phosphatases SHP-1 et SHP-2 et sont capables d’inhiber
certaines fonctions cellulaires [120, 121]. La phosphorylation des tyrosines du motif ITAM
conduit généralement à une activation de la cellule. Elle peut cependant dans d’autres cas
induire un signal négatif et inhiber l’activation de la cellule, tout comme un motif ITIM peut
induire un signal positif [144, 145].
23
Dans les cellules myéloïdes, certaines lectines comme dectin-1, dectin-2 et MINCLE avec un
motif ITAM sont phosphorylées par la tyrosine Src kinase à travers les tyrosines présentes
dans leur motif de signalisation. Les lectines activées procèdent au recrutement et à
l’activation de la kinase Syk qui à son tour active la PLCγ2 (Phospholipase C gamma 2). Il s’en
suit une cascade d’activation des protéines impliquant le CARD9 (Caspase Recruitment
Domain family, member 9), le BCL10 (B Cell Lymphoma10) et le MALT1 (Mucosa-Associated
lymphoid tissue lymphoma Translocation gene1) [146, 147] qui sont requis pour l’activation
des facteurs de transcription NF-kB et de la voie de MAPKinase [147]. Ceci se solde par
l’activation des fonctions cellulaires. D’autres lectines, comme le BDCA-2 exprimé sur la cellule
dendritique plasmacytoïde, bien que possédant un motif ITAM, sa phosphorylation par la Src
kinase entraine l’inhibition de l’activation de la cellule et de la production des cytokines pro-
inflammatoires notamment l’IFN-α en réponse au TLR9 [148, 149]. Cette lectine a été
identifiée comme un récepteur reconnaissant et liant le mannose présent sur la gp120 du VIH-
1 [150] et peut donc moduler les sentiers de signalisation induite par le TLR9 et jouer un rôle
dans la pathogenèse du VIH-1.
Figure 6 : Model d’un sentier de signalisation induite suite à l’activation des lectines de
type C dectine-1, dectine-2 et Mincle dans la cellule myéloïde (Adaptée de [147])
24
1.2.3.3. Les lectines de type C de type II capable de lier le VIH-1
Dans ce sous-titre, nous parlerons des lectines de type C type II, dectine 1 ou dectine 2
pouvant jouer un rôle dans l’endocytose, la phagocytose, la présentation antigénique, ainsi
que celles ayant le potentiel de reconnaitre et lier le VIH-1. Il s’agit notamment de DC-SIGN, la
langerin, le BDCA-2 et le DCIR. Le DCIR constitue le point focal de notre projet et sera par
conséquent traité dans un sous-titre particulier.
1.2.3.3.1. La langerin (CD207)
Ce récepteur est exprimé à la surface des cellules de langerhans. Il possède dans sa partie
extracellulaire un seul domaine CRD et dans sa partie intracellulaire, un domaine riche en
proline. La langerin peut lier le mannose ou le galactose de manière dépendante du Ca+2,
cependant sa liaison avec le glycosaminoglycan serait indépendante de l’ion calcium [151].
La cellule de langerhans est caractérisée par les granules de birbeck qui sont constitutivement
associées à la langerin dans le cytoplasme [152]. Le VIH-1 est lié à travers le mannose ou le
galactose présent sur la gp120 par la langerin, qui internalise et dégrade directement dans les
granules de birbeck le virus sans présentation antigénique. L’endocytose du VIH-1 provoquée
par la langerin est dépendante de la cavéolin-1 et prévient non seulement l’infection à VIH-1
mais, aussi le transfert du virus aux LTCD4. La langerin constitue donc une sorte de barrière
naturelle au niveau de la muqueuse contre la transmission et la propagation du VIH-1 [153].
1.2.3.3.2. Le DC-SIGN (CD209)
Le DC-SIGN (Dendritic Cell Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin)
est une lectine de type C avec une région extracellulaire composée d’un domaine CRD en C-
terminal avec un motif EPN de reconnaissance des résidus de mannose ou des résidus
fucosylés incluant les antigènes Lewis [154, 155], un domaine neck avec 7 motifs complets et
un motif incomplet répétés en tandem de 23 résidus amino-acides et un domaine
transmembranaire. Il contient dans sa région intracellulaire une queue cytoplasmique en N-
terminal contenant un motif di-leucine (LL), un motif à base de résidu tyrosine (YSKL) et un
groupe tri-acidique (EEE), nécessaire pour la transduction du signal intracellulaire. Le domaine
neck est nécessaire pour l’oligomérisation permettant ainsi au récepteur d’augmenter son
25
avidité vis-à-vis de ses ligands [156, 157]. Le DC-SIGN est exprimé sur les cellules
dendritiques immatures et sur les sous-populations des macrophages [158, 159].
Le DC-SIGN joue un rôle dans la migration cellulaire, dans la phagocytose suivie de la
présentation antigénique via le CMH II et I [160] ainsi que dans l’adhésion cellulaire grâce à sa
liaison avec l’ICAM-3 (Intercellular adhesion molecule 3). Le DC-SIGN se lie à ICAM-2 exprimé
sur les cellules endothéliales avec une très haute affinité et permet aux cellules dendritiques
de rouler sur l’endothélium et de s’y adhérer [161]. Le DC-SIGN est une lectine qui reconnait le
mannose ou le fucose présent sur plusieurs types de pathogènes incluant les bactéries, les
champignons, les parasites et les virus [162] notamment le VIH-1 [163]. Ainsi, il est capable de
capturer ces pathogènes et de les dégrader après leur internalisation dans les compartiments
protéolytiques, précisément dans les endosomes tardifs. Les peptides générés sont ensuite
présentés liés au CMH de classe II ou de classe I respectivement aux LTCD4 et aux LTCD8,
dans le but de développer une réponse immunitaire spécifique contre les pathogènes. Dans
les organes lymphoïdes secondaires, le DC-SIGN permet l’adhésion intercellulaire en se liant
à son ligand endogène naturel, l’ICAM-3 à la surface de lymphocyte T. Cette liaison contribue
à la formation de la synapse immunologique entre la cellule dendritique et le LTCD4 et permet
de stabiliser l’interaction peptide-CMH et TCR/CD3. Ceci constitue une étape clé lors de la
présentation antigénique.
En ce qui concerne l’infection à VIH-1, la protéine virale gp 120 est fortement glycosylée et le
DC-SIGN présentant une forte affinité pour cette protéine a été décrit comme un facteur
d’attachement du VIH-1 [164, 165]. Il reconnait donc le mannose présent sur la gp120 sans
distinction du tropisme viral et permet le transfert du virus des cellules dendritiques aux LTCD4
naïfs [166]. Après contact, le virus et le DC-SIGN sont internalisés sous forme d’un complexe
par endocytose dans des puits de clathrines, puis acheminés dans les endosomes précoces et
lysosomaux ou le DC-SIGN sera dissocié de son ligand suite à l’acidité des compartiments
endosomaux, et recyclé à la surface de la cellule dendritique après libération de son ligand
[167]. Après dégradation du VIH-1 par le protéasome, des peptides viraux sont présentés via
CMH II aux LTCD4 dans les organes lymphoides secondaires. Ils peuvent aussi être présentés
de façon croisée au CMH I pour générer une réponse TCD8 spécifique [168, 169]. Par des
mécanismes non encore bien élucidés, une partie de VIH-1 échappe à la dégradation et se
retrouve dans des corps multivésiculaires de la cellule ou ces virions sont protégés. Ils
26
seraient par la suite recyclés à la surface cellulaire et transférés aux lymphocytes T sous leur
forme infectieuse [170]. Tout comme après la liaison entre DC-SIGN et le VIH-1, certaines
particules virales ne sont pas internalisées et resteraient concentrées à la surface de la cellule
dendritique [171]. Ceci augmenterait l’affinité du complexe DC-SIGN et gp 120 avec le CD4,
favorisant ainsi facilement la transmission du VIH-1 au LTCD4 [172]. La protéine accessoire
Nef jouerait en partie un rôle dans ce mécanisme dans la mesure où elle est capable
d’interagir avec le DC-SIGN et affecter son internalisation, favorisant ainsi la transmission du
VIH-1 des cellules dendritiques aux LTCD4 [173, 174].
L’activation de DC-SIGN entraine sa relocalisation dans les endosomes et induit plusieurs
voies de signalisation susceptible d’être influencée par la nature du sucre (mannose ou
fucose) contenu dans le ligand. L’activation de DC-SIGN par un anticorps entraine la
phosphorylation de ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinase), Akt (PKB : Protein kinase
B) et PI3K (Phosphatidylinositol-3-kinase) et compromet la maturation de la cellule dendritique.
La stimulation de DC-SIGN par un ligand portant le mannose notamment la gp120 du VIH-1,
passe par l’activation du résidu tyrosine et serine respectivement par les kinases Src et PAKs
(Focal adhesion kinase) et le recrutement de LARG (Leukemia-Associated Rho Guanine
nucleotide-exchange factor) et des protéines Rho-GTPase RhoA qui vont à leur tour activer
Raf1 [175]. Il découle de cette signalisation une augmentation de la production des cytokines
pro-inflammatoires comme l’IL-6 et l’IL-12, mais aussi des cytokines suppressives comme l’IL-
10 induite par l’activation du TLR4. L’activation de voie de signalisation dépendante de Raf1
peut activer le facteur de transcription NF-kB en phosphorylant la serine 276 de la protéine
p65. Ceci mène à la production d’IL-10 capable de diminuer la capacité de présentation
antigénique et de moduler la réponse immunitaire médiée par le lymphocyte Th1 [176]. La
signalisation de DC-SIGN médiée par le VIH-1 empêche la maturation de la cellule dendritique
et diminue la prolifération des LTCD4 [177, 178]. Elle permet aussi de moduler la réponse pro-
inflammatoire induite par les TLRs [176].
1.2.4. Le DCIR humain (CLEC4A)
1.2.4.1. Identification de DCIR
Comme nous l’avions mentionné précédemment, le DCIR fait partie du groupe des lectines de
type C de type II de la famille dectine 2, incluant le DCAR, le BDCA-2, le CLECS-F8 et le
27
MINCLE. Trois groupes ont cloné le DCIR dans différents types cellulaires. Bates a été le
premier en trouvant une séquence d’acides aminés homologue aux séquences d’acides
aminés conservés du récepteur hépatique ASGPRS-1 et 2 (Hepatic asialoglycoprotein
receptor) et du récepteur mannose [132]. Le gène qui code pour le DCIR a été également
identifié chez la souris par Bates [132]. En 2001, Huang et collaborateurs isolent le cDNA de
DCIR [179]. En 2002, le groupe de Beaulieu découvrit un gène appelé CLECSF6 (C-type lectin
superfamily 6) sur le neutrophile humain [180]. Il constata ensuite que son expression pouvait
être modulée sur le neutrophile [180, 181].
1.2.4.2. Expression de DCIR humain
Bates a montré que l’ARN messager du DCIR humain est fortement exprimé dans les
leucocytes du sang périphérique. Il est modérément exprimé dans la rate, les ganglions
lymphatiques ainsi que dans la moelle osseuse et faiblement exprimé dans le thymus, la
moelle épinière et dans la trachée. [132, 179]. Le DCIR n’est cependant pas exprimé dans le
foie, le cœur, les poumons, la prostate, l’intestin grêle, le colon, le testicule et dans les glandes
thyroïdiennes [132]. Chez la souris, l’ARN messager de DCIR est observé particulièrement
dans le ganglion lymphatique et dans la rate [132, 182]. Le DCIR murin de la souris est
exprimé sur les cellules myéloïdes spléniques telles que le macrophage, le monocyte et la
cellule dendritique ainsi que sur le lymphocyte B, mais son expression n’est pas observée sur
le lymphocyte T et sur la cellule NK [182].
Le DCIR humain est exprimé sur les cellules de la lignée myéloïde incluant les cellules
dendritiques myéloïdes et plasmacytoïdes, le macrophage, le monocyte et le neutrophile, mais
aussi sur le lymphocyte B [132]. Un environnement inflammatoire peut favoriser l’induction de
l’expression du DCIR sur certains types cellulaires ne l’exprimant pas normalement. Ainsi
donc, on trouve le DCIR humain sur les LTCD4, les LTCD8 ainsi que sur les cellules NK
présentes dans les articulations des personnes souffrantes de l’arthrite rhumatoïde [183]. Son
expression est cependant diminuée sur le neutrophile activé par le LPS, l’IL-1 ou le TNF-α
[180] ainsi que sur les cellules dendritiques matures en présence de CD40 ligand, LPS et de
TNF-α [132]. Ceci montre que l’expression du DCIR peut être modulée à la surface de certains
types cellulaires par les cytokines pro-inflammatoires présentes dans l’environnement
28
cellulaire. L’expression de DCIR a également été détectée sur les LTCD4 des individus
infectés par le VIH-1 et sur les LTCD4 apoptotiques [184].
1.2.4.3. Structure du DCIR
Le DCIR comprend une région extracellulaire qui comporte un seul domaine CRD avec un
motif EPS (glutamate-proline-serine) spécifique pour la liaison du galactose ainsi qu’un
domaine neck composé d’une répétition de 23 acides aminés. Dans sa portion cytoplasmique,
il comporte un motif ITIM dont la séquence consensus S/I/V/LxYxxI/V/L (Y : résidu tyrosine, L:
leucine, I : isoleucine et x : un acide aminé quelconque) est impliqué dans la transduction du
signal.
Il existe 4 formes d’ARNm épissé de DCIR (v1-v4). Elles portent le même domaine CRD, mais
se différencient par la présence ou non du domaine neck et de la région transmembranaire. La
première (v1) possède les 3 domaines et se trouve dans plusieurs tissus et types cellulaires
[132, 180, 182]. Les trois autres par contre sont des formes courtes dont l’une (v2), détectée
dans le neutrophile est dépourvu du domaine neck [132, 140, 180]. Les deux dernières formes
sont trouvées dans la cellule dendritique dont v3 est dépourvue du domaine transmembranaire
et v4 est à la fois dépourvue des domaines neck et transmembranaire [179].
Figure 7 : Les quatre formes de l’ARNm épissé de DCIR (Adapté de [140])
29
1.2.4.4. Les ligands de DCIR
Le DCIR est une lectine de type C capable de reconnaitre et de lier le mannose ou le fucose
présent sur les ligands endogènes et sur les pathogènes. Cette liaison est fortement
influencée par la N-glycosylation située à la 185ème position de la chaine peptidique du
domaine CRD de DCIR [185]. En effet, pour identifier les ligands de DCIR et connaitre
l’importance de la N-glycosylation de son domaine CRD, des constructions chimériques ont
été réalisées notamment le DCIR-FC dans la cellule CHO (Chinese hamster ovary) avec un
CRD pleinement glycosylé (CHO-DCIR-Fc) et dans la cellule CHO lec8 avec un CRD non
glycosylé (CHO Lec8 DCIR-Fc) ainsi qu’une construction chimérique dont la N-glycosylation a
été mutée (CHO-DCIRN185Q-FC) [185, 186]. Ces chimères ont permis à Bloem et al de
comprendre le rôle potentiel de la glycosylation de DCIR dans la liaison de ses ligands et
d’identifier les ligands endogènes et exogènes de DCIR. Ainsi, il a montré que la construction
chimérique CHO-FC-DCIR était incapable de lier le sucre présent sur ses ligands. Cependant
la construction chimérique CHO-Lec DCIR-FC présentait une parfaite liaison avec le sucre
présent sur les ligands. Ceci a amené à considérer que la glycosylation du domaine CRD
inhibe la liaison du DCIR avec ses ligands [186]. Grâce aux expériences réalisées sur les
constructions chimériques avec un CRD non glycosylé, il a été montré que le domaine CRD de
DCIR peut lier le sucre présent sur ses ligands endogènes comme les antigènes des groupes
sanguins sulfo-lewisa, lewisb et lewisa ainsi que le mannose, le fucose et le mannotriose [185,
186]. Le DCIR partage ces ligands avec le DC-SIGN [154, 155, 185, 187], mais à des degrés
de spécificité différente [186].
En ce qui concerne les pathogènes, les travaux du même auteur ont montré que la gp120 et la
gp140 du VIH-1 sont des ligands du DCIR [186]. L’enveloppe du VIH-1 présente un
hétérodimère gp160 dont le clivage par la protéase cellulaire génère la gp120 (protéine
hautement glycosylée) et la gp41 (protéine faiblement glycosylée) [188]. Le DCIR présente
une forte affinité avec la gp140 qui est la partie soluble de la gp160.
A l’instar des ligands endogènes, le DCIR partage la liaison du VIH-1 avec d’autres lectines de
type C comme le DC-SIGN [164, 189, 190], mais avec des spécificités différentes. En effet,
une étude réalisée avec des lignées cellulaires exprimant le DC-SIGN ou le DCIR a montré
que les deux lectines peuvent lier la gp120 et sont capables d’assurer le transfert du virus
30
[191]. Cependant, la liaison du virus avec le DC-SIGN est plus forte [191]. Le DC-SIGN peut
lier la gp120 ou la gp140 des différentes souches du VIH-1 [192]. Sa liaison avec le glycane
riche en mannose (high mannose) présent sur les glycoprotéines du VIH-1 est plus forte que
celle avec le résidu mannose. Ainsi, le DC-SIGN se base plus sur sa liaison avec le glycane
riche en mannose pour lier la gp120 du VIH-1 [164]. Toutefois les deux lectines exploitent leur
liaison avec le mannose pour lier la gp120 et la gp140 du VIH-1.
En plus du VIH-1, le DCIR et le DC-SIGN partagent la liaison d’un certain nombre de
pathogènes comme le virus de l’hépatite C [193, 194], les parasites comme le schistosoma
mansoni et certains helminthes [186, 195]. La différence de la spécificité de liaison entre les
deux lectines peut être liée à la variété des sucres présents sur le parasite. En effet, un même
parasite peut être reconnu à la fois par les deux lectines, mais sur des sites différents. C’est le
cas des helminthes comme le schistosoma mansoni dont sa reconnaissance par le DC-SIGN
est fonction de résidu fucosyl contenu dans le sucre présent sur le parasite [187, 195, 196].
Cependant, le DCIR le reconnait à travers le résidu mannose présent sur le parasite [196]. Il a
été montré que le DCIR manque de spécificité sur d’autres ligands de DC-SIGN notamment le
mannose présent sur les champignons comme le candidat albicans [186]. Ceci pourrait
expliquer la spécificité plus large de DC-SIGN vis-à-vis des sucres contenus dans les
pathogènes par rapport au DCIR.
1.2.4.5. Fonctions du DCIR dans l’élaboration de la réponse immune
A l’instar de toutes les lectines de type C, le DCIR est impliqué dans plusieurs fonctions
cellulaires comme la reconnaissance des motifs conservés des pathogènes, la phagocytose et
la présentation antigénique [121, 197] ainsi que dans l’induction de la réponse immune et la
signalisation [198]. En outre, grâce à son motif ITIM, le DCIR joue un rôle dans la modulation
de la réponse immune et dans le contrôle des maladies auto-immunes [199, 200]. En effet, le
DCIR exprimé sur les cellules présentatrices d’antigènes est capable de lier le sucre présent
sur le pathogène, l’internaliser et favoriser la présentation antigénique dans le contexte du
CMH de classe I et II [197]. Ainsi donc, il participe à l’activation de la réponse immunitaire
innée et à l’induction de la réponse immunitaire adaptative. Le DCIR exprimé sur les
différentes sous populations de cellules dendritiques peut capturer un antigène et en assurer
31
une présentation croisée permettant ainsi l’expansion et le développement de la réponse T
CD8 spécifique [201]. L’activation de TLR7/8 combinée avec le signal de costimulation CD40
peut augmenter la présentation croisée médiée par le DCIR [201].
Les études menées par Friederike Meyer-Wentrup ont montré que le DCIR est impliqué dans
la régulation négative de la réponse cellulaire médiée par certains TLRs endosomaux [120,
121]. Dans la cellule dendritique plasmacytoïde, le DCIR internalisé dans l’endosome inhibe la
production d’IFN-α médiée par l’activation de TLR9 [121] et dans la cellule dendritique
myéloïde, il empêche l’activation de TLR8 inhibant ainsi la production de l’IL-12 et de TFN-α
[120], mais n’affecte pas la production des cytokines médiées par l’activation des autres TLRs
comme le TLR2, le TLR3 et le TLR4 [120]. Ceci suggère que le DCIR pourrait diminuer la
réponse immunitaire innée antivirale et la polarisation des lymphocytes en Th1.
Le DCIR joue un rôle dans l’homéostasie du système immunitaire [202] et est impliqué dans le
développement des maladies auto-immunes [200]. Le développement de l’arthrite rhumatoïde
lié au DCIR peut s’expliquer par le fait que le gène responsable des maladies auto-immunes
est localisé dans le même locus que le gène qui code pour les lectines de type C comme le
DCIR [200, 203]. Des grandes quantités de DCIR ont été détectées dans des biopsies
synoviales des personnes souffrantes de cette pathologie [183]. En plus, les travaux de
Noriyuki Fujikado et ceux des autres ont montré que la déficience du DCIR entraine
l’expansion excessive des cellules dendritiques et un accroissement des lymphocytes T dans
les ganglions lymphatiques, et cela serait à l’origine du développement des maladies auto-
immunes chez les souris [200]. Cette dernière a développé une arthrite aiguë associée avec
une grande quantité d’autoanticorps dans le sérum après injection de collagène II. La
survenue des autres maladies auto-immunes comme l’encéphalomyélite a été montrée chez la
souris déficiente en DCIR [204]. Ceci montre que le DCIR peut jouer un rôle dans
l’homéostasie cellulaire en régulant négativement la différenciation et la maturation des
cellules dendritiques médiées par le GM-CSF à partir de leurs précurseurs dans la moelle
osseuse [200], et contrôler les maladies auto-immunes chez les souris et peut-être aussi chez
l’humain. Les travaux de Takumi ont montré que le DCIR assure le maintien de l’homéostasie
osseuse par la régulation de l’IFN-γ. Effet, il a été montré que la déficience de DCIR chez la
souris entrainait l’augmentation d’IFN-γ dont la conséquence était une exacerbation de
32
l’ostéogenèse et de la chondrogenèse [202]. Par rapport aux autres lectines de type C, le
DCIR est la lectine qui possède le plus faible pouvoir de présentation antigénique. Cependant,
en cas de co-reconnaissance d’un ligand avec les autres lectines de type C notamment le DC-
SIGN, le DCIR affecte l’internalisation et la localisation de DC-SIGN dans l’endolysosome et
par conséquent réduit son pouvoir de présentation antigénique [205].
Le rôle immunorégulateur de DCIR dépend de la signalisation intracellulaire induite par la
phosphorylation du résidu tyrosine contenu dans son motif ITIM. Ce rôle a été montré grâce à
une étude réalisée sur la cellule B transformée avec un récepteur chimérique composé de
FcγRIIB dans la partie extracellulaire et d’un motif cytoplasmique ITIM de DCIR de la souris.
Lors de la co-activation des deux récepteurs, BCR et FcγRIIB par un anticorps, on remarqua
que la signalisation induite par le motif ITIM inhibait celle qui dépendait de l’activation du
récepteur de cellule B (BCR). Cela s’est manifesté par une absence de mobilisation de Ca2+ et
de phosphorylation des protéines provoquée par l’activation de BCR. Cependant, l’activation
du BCR seul menait à la mobilisation du Ca+2 et à la phosphorylation du résidu tyrosine des
protéines cytoplasmiques. L’activation simultanée du BCR et de FcγRIIB couplé au motif ITIM
du DCIR, dont le résidu tyrosine a été muté au profit d’un résidu phénylalanine a montré une
levée totale du rôle inhibiteur incarné par ce motif ITIM [182]. Cette expérience a donc permis
de comprendre le rôle que joue le DCIR dans la régulation négative de la réponse cellulaire.
L’activation de DCIR par un ligand spécifique entraine la phosphorylation du résidu tyrosine du
motif cytoplasmique ITIM [206] ainsi que l’absence de glycosylation de l’acide aminé 185 qui
provoque la phosphorylation de DCIR [185, 186]. Les tyrosines phosphatases SHP-1, SHP-2,
les tyrosines kinases Src et Syk et les sérine-thréonine kinases PKC et MAP seraient
impliquées dans le sentier de signalisation provoquée par l’activation de DCIR [207]. En effet,
après son activation, la tyrosine du motif ITIM phosphorylée par les kinases de la famille de
Src kinase permet le recrutement des phosphatases SHP-1 (Src homology-2 containing
tyrosine phosphatase-1) et SHP-2 [206, 208], lui permettant ainsi de jouer son rôle de
modulation de la réponse immunitaire [209] et de régulation négative de la réponse cellulaire
médiée par d’autres récepteurs comme le TLR8 et le TLR9. Toutefois, la cascade d’activation
des protéines impliquées dans ce sentier de signalisation reste à élucider.
33
Figure 8 : Voies de signalisation induite par le DCIR (Adaptée de [209])
1.2.4.6. DCIR et VIH-1
Plusieurs lectines de type C bien connues et bien caractérisées comme le DC-SIGN, le MMR
ou le syndecan-3 sont impliquées dans la liaison du VIH-1 [210-212]. Elles sont capables
d’assurer le transfert du VIH-1 en trans aux LTCD4 après une synapse virologique [213, 214].
En dehors d’elles, le DCIR a été identifié comme une autre lectine de type C impliquée dans la
capture et le transfert du VIH-1 [189, 191]. Le rôle de DCIR dans l’infection associée au VIH-1
a été montré grâce à l’utilisation des anticorps polyclonaux anti-DCIR capables de bloquer la
portion extracellulaire de DCIR et des siRNAs spécifiques capable de réduire l’expression de
DCIR sur la cellule dendritique immature dérivée des monocytes (IM-MDDC) tels que décrits
[189, 191]. En effet, une diminution de la liaison et de l’infection des cellules dendritiques
traitées avec les anticorps et des si RNA spécifiques au DCIR a été constatée. En cas de
coculture de ces cellules avec les LTCD4, une diminution de transfert du virus a été observée.
Ces expériences ont permis de comprendre l’implication du domaine CRD de DCIR et de
34
DCIR dans la liaison du VIH-1 [189] ainsi que le rôle joué par le DCIR dans le transfert du virus
[189, 191]
Le transfert du virus des cellules dendritiques aux LTCD4 peut se faire de deux façons. Primo,
le virus capturé par la cellule dendritique est internalisé dans les endosomes dans sa forme
non décapsidée (infection en trans) puis exporté à la surface cellulaire et transmis au LTCD4
pour assurer l’infection, après une synapse virologique créée par un simple contact entre les
deux cellules [189]. Secundo, après capture et internalisation, le virus se réplique dans la
cellule dendritique (infection en cis) et des nouveaux virions générés permettent l’infection des
LTCD4 [213]. En effet, l’utilisation d’un inhibiteur de transcriptase inverse non nucléoside
(l’efavirenz) capable d’entraver le transfert tardif du virus (infection en cis), mais qui n’a pas
d’effet sur le transfert précoce du virus (infection en trans), a permis de conclure que
contrairement au DC-SIGN, le DCIR participe à la propagation en trans et en cis du VIH-1
[189].
Le domaine neck du DCIR est impliqué dans l’attachement et l’infection du VIH-1. En effet, il a
été montré que la délétion du domaine neck de DCIR dans les Raji-CD4-DCIR occasionnait
une diminution de la liaison et de la réplication du virus dans les Raji-CD4-DCIR∆neck par
rapport aux Raji-CD4-DCIR sauvages [189]. Le domaine neck de DCIR ressemble à celui de
DC-SIGN dont la formation des tétramères augmente l’affinité de sa liaison avec ses ligands
[215, 216] notamment la gp120 [191]. Ainsi, par analogie au DC-SIGN, ceci suggère que le
domaine neck de DCIR serai responsable de sa multimérisation et jouerait un rôle crucial dans
l’interaction entre le DCIR et les glycoprotéines gp120 et gp140 du VIH-1.
La liaison entre le DCIR et le VIH-1 dépend de sentier de signalisation spécifiques et lié à la
phosphorylation des résidus tyrosine ou thréonine contenus dans le motif ITIM [207]. En effet,
le rôle du motif ITIM et celui des protéines intracellulaires impliquées dans cette signalisation
ont été respectivement mis en évidence grâce à la transfection des cellules dendritiques avec
des peptides intracellulaires mimant le motif ITIM phosphorylé du DCIR ainsi qu’avec des
oligonucléotides antisens. Les peptides ITIM phosphorylés sur leurs résidus tyrosine ou
thréonine créent dans le milieu intracellulaire une sorte de compétition avec le motif ITIM du
DCIR vis-à-vis des protéines effectrices, épargnant ainsi la phosphorylation du motif ITIM de
35
DCIR. Ceci empêcherait le recrutement des protéines intracellulaires impliquées dans la
signalisation par le motif ITIM. Les oligonucléotides anti-sens par contre sont capables de
cibler les protéines intracellulaires spécifiques impliquées dans la signalisation et de réduire
leur expression. En effet, la transfection des Raji-CD4-DCIR avec les oligonucléotides
spécifiques des kinases ou des phosphatases avant leur exposition au VIH-1, montrait une
diminution de la liaison du virus sur les cellules. Ces deux approches ont donc permis de
connaitre respectivement le rôle que joue le motif ITIM dans la liaison du virus et dans la
signalisation (figure 9) et de déterminer les protéines intracellulaires impliquées dans le sentier
de signalisation médiée par l’engagement de DCIR. Il s’agit notamment des tyrosines kinases
comme Src, Syk, Fyn, Hck, et des thréonines kinases comme PKC-α et MAPK (Erk1/2 et p38)
[207]. La phosphorylation du motif ITIM par ces kinases permet le recrutement des tyrosines
phosphatases SHP-1 et SHP-2 [180, 207]. La protéine Syk serait particulièrement impliquée
dans l’endocytose et la phagocytose du VIH-1. Il a été montré que les kinases Src sont
rapidement recrutées dans la membrane cellulaire grâce à leur myristoylation et seraient les
premières kinases à déclencher la cascade de signalisation. L’utilisation des inhibiteurs
pharmacologiques spécifiques aux protéines intracellulaires ont aussi permis cette
caractérisation, notamment le PP-2 et le piceatannol qui ont respectivement confirmé
l’implication des kinases de la famille Src et des kinases Syk dans la liaison du VIH-1 avec le
DCIR humain [207], mais la chronologie des évènements de signalisation reste à élucider.
36
Figure 9 : Rôle du motif ITIM dans la capture, internalisation et signalisation médiées
par l’engagement de DCIR (Adaptée de [209])
1.2.4.7. DCIR et LTCD4
En dehors des cellules myéloïdes et des lymphocytes B, l’expression de DCIR s’étend sur
d’autres types cellulaires. En effet, un environnement inflammatoire occasionne l’induction de
DCIR sur les cellules T. Ainsi, il a été montré que le DCIR est exprimé à la surface des LTCD4
du liquide synovial des personnes souffrantes de l’arthrite rhumatoïde [183, 217].
L’hyperactivation persistante du système immunitaire occasionnée par l’infection par le VIH-1
crée aussi un environnement inflammatoire qui permet la promotion de l’induction de
l’expression de DCIR sur les cellules ne l’exprimant pas naturellement. Ainsi, les travaux de
Lambert ont montré l’expression de DCIR sur les LTCD4 infectés du VIH-1 et apoptotiques. De
plus, les facteurs solubles libérés par les LTCD4 lors de l’infection entrainent l’induction de
DCIR sur les LTCD4 [184]. Outre les protéines virales comme Nef et Vpr impliquées dans
l’apoptose [218, 219], l’infection par le VIH-1 occasionne la libération des radicaux libres
comme le H2O2, capables de lyser la membrane cellulaire et de provoquer l’apoptose des
37
LTCD4 [220, 221] et l’induction de l’apoptose favorise aussi l’expression de DCIR à la surface
cellulaire [184]. Le traitement des LTCD4 avec les inhibiteurs de caspase notamment le Z-
VAD-FMK avant son exposition au VIH-1, entraine une diminution de l’expression de DCIR sur
les LTCD4 infectés. Ceci suggère qu’il existe un lien entre l’expression de DCIR sur les LTCD4
infectés du VIH-1 et l’apoptose [184].
Les LTCD4 exprimant le DCIR à la suite d’une pathologie faisant appel à une inflammation tels
que décrits ci-haut peuvent être polarisés en Th1, Th2, Th17. Afin de déterminer quels
phénotypes exprimaient préférentiellement le DCIR, une étude réalisée dans notre laboratoire
et validée dans le laboratoire de la Dre Ancuta montre que les cellules TCD4 polarisées en
Th17 expriment le DCIR à leurs surfaces (Manuscrit en préparation) (Figure 10). Ces cellules
sont générées in vitro à partir des LTCD4 naïfs en présence des cytokines nécessaires à leur
différenciation. Il s’agit de l’IL-23, l’IL-1β, le TGF-β et l’IL-6. En effet, la liaison simultanée de
TGF-β et de l’IL-6 avec leurs récepteurs respectifs sur les LTCD4 naïfs, associée à la
stimulation du TCR avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28, permet l’inhibition des facteurs
T-bet par le TGF-β et de Foxp3 par l’IL-6 et induit la transcription de facteur RORγt nécessaire
pour la différenciation des LTCD4 naïfs en Th17 [222, 223]. L’IL-23 ou sa combinaison avec
l’IL-1β est nécessaire pour la différenciation complète et assure la maturation et la stabilité de
la lignée Th17 [224, 225]. Le facteur RORγt est spécifique à la sécrétion de l’IL-17 qui
constitue la cytokine signature de LTCD4 Th17 [226].
Figure 10 : Expression de l’IL-17 et de DCIR sur les LTCD4 polarisés en Th17. Les LTCD4
Th17 sont traités avec la brefeldine 16 heures avant la perméabilisation et l’incubation des
cellules avec un anticorps couplé au FITC et dirigé contre l’IL-17 sur des cellules marquées
avec un anticorps monoclonal anti-DCIR couplé au fluorophore APC (Allophycocyanin). La
présence de l’IL-17 et de DCIR sur ces cellules a été évaluée grâce à la cytométrie en flux.
38
Les cellules positives pour l’IL-17 ont été ciblées et environ 80 % de ces cellules expriment le
DCIR.
1.2.4.8. Les inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR
Les antirétroviraux sont capables de supprimer la réplication du virus et d’augmenter
l’espérance de vie des personnes malades, mais n’éliminent pas le virus, et sont
accompagnés de plusieurs cas de résistance. Le développement des nouvelles approches
thérapeutiques dirigées contre ce virus est indispensable pour contourner l’insuffisance des
antirétroviraux. C’est dans ce cadre que notre laboratoire a ciblé comme une nouvelle cible
thérapeutique ayant un potentiel immunomodulatoire, le DCIR tel que mentionné
précédemment.
La structure tridimensionnelle de DCIR a été cristallisée récemment [227]. Celle déterminée
auparavant in silico a permis de mettre en exergue plusieurs poches hydrophobes composées
de plusieurs acides aminés, dans le domaine CRD et le motif EPS et d’identifier par criblage
virtuel plusieurs molécules pouvant s’y lier [228]. Sept composés (Figure 11) ont été analysés.
Les résultats ont montré que ces inhibiteurs occasionnaient une diminution de l’attachement
du virus sur les cellules Raji-CD4 DCIR, les cellules dendritiques et les LTCD4 apoptotiques
[228]. L’inhibition de l’attachement étant plus grande avec les inhibiteurs A1, A4, B1 et B2, ils
ont été choisis afin d’évaluer leurs impacts sur la transmission du virus par les Raji-CD4-DCIR,
les cellules dendritiques et les LTCD4 apoptotiques. Les résultats ont montré une diminution
de la réplication ou de la transmission du virus dans tous ces types de cellules. En revanche,
le test réalisé sur les Raji-DC-SIGN n’a montré aucun effet de ces inhibiteurs sur le DC-SIGN,
montrant une certaine spécificité vis-à-vis ces inhibiteurs. Enfin des tests de toxicité effectués
sur les neutrophiles et les LTCD4 n’ont révélé aucun effet indésirable de ces molécules
chimiques sur les réponses fonctionnelles des neutrophiles ainsi que sur la prolifération
cellulaire des LTCD4 [228]. Cependant, l’impact de ces inhibiteurs sur l’activation des voies de
signalisations en réponse à la stimulation de DCIR est encore inconnu.
39
Figure 11: Inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR obtenus après criblage
virtuel [228]
40
Chapitre II : Hypothèse et objectifs
2.1. Hypothèse
Notre projet de recherche s’inscrit dans le cadre de la continuité de la lutte contre le VIH-1 et
plus particulièrement dans la recherche d’une alternative thérapeutique capable d’empêcher
ou de limiter la propagation du virus dans l’organisme. En effet dès la primo-infection, une
multiplication rapide du virus dans les organes lymphoïdes secondaires mène à une déplétion
massive des LTCD4. Les traitements antirétroviraux actuels peuvent supprimer la réplication
virale, et maintenir la charge virale à un niveau non détectable dans le sang [1, 29]. Ils
augmentent l’espérance de vie des personnes infectées, mais contribuent aussi à la morbidité
associée à la maladie [229]. Ils ne corrigent pas les dommages causés aux organes
lymphoïdes secondaires ni ne rétablissent l’intégrité fonctionnelle du système immunitaire,
déjà dérégulé depuis la primo-infection [83, 230]. Il est donc important de commencer le
traitement tôt pour espérer limiter la progression du virus, les dommages tissulaires et la
déroute du système immunitaire.
La majorité des molécules antirétrovirales actuellement sur le marché combattent le virus
principalement sur les LTCD4, mais aucun de leur effet n’est à ce jour connu sur la cellule
dendritique. Cependant, la cellule dendritique est la première cellule capable de lier le virus au
niveau de la muqueuse et en assurer le transport vers les organes lymphoïdes secondaires où
le virus est transféré aux LTCD4. A ce niveau, le virus connait une multiplication rapide et
massive et occasionnant des dommages importants de ces organes [83]. La cellule
dendritique capture le VIH-1 grâce aux récepteurs lectines de type C notamment le DCIR qui
constitue le point focal de notre projet de recherche. En effet, le DCIR exprimé sur cette cellule
comme nous l’avions dit ci-haut, joue un rôle de capture du VIH-1, de présentation antigénique
pour initier la réponse immunitaire, mais aussi de transfert du virus aux LTCD4 [189] favorisant
la propagation du VIH-1 et de l’infection dans d’autres organes. Cette lectine est impliquée
dans la régulation négative des autres récepteurs de l’immunité innée de la cellule dendritique
notamment les TLR8 et TLR9 ou elle inhibe la sécrétion de certaines cytokines pro-
inflammatoires telles que l’IFN-α provoqué par l’activation de TLR9 et l’IL-12 et le TNF-α par
l’activation de TLR8 [120, 121], promouvant ainsi l’infection à VIH-1 tout en inhibant la réponse
41
immunitaire innée et acquise. Il a été montré que dans le macrophage, le DCIR est capable
d’inhiber l’activation de TLR9 par son agoniste, le CpG-ODN (Olygodéoxynucléotide) et
entrainer une régulation négative des cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-6, l’IL-1β et le
TNF-α [231]. Le DCIR peut en outre réduire la présentation antigénique assurée par d’autres
lectines comme le DC-SIGN [205] dont la conséquence ne peut être que la fragilisation de la
réponse immunitaire. Enfin, une étude menée dans notre laboratoire a montré que l’activation
de DCIR exprimé sur la cellule dendritique par un anticorps anti-DCIR ou par le VIH-1 entraine
la libération des exosomes [232]. Ces exosomes jouent des rôles de communication
intercellulaire et participent au développement de la réponse immunitaire tolérogène ou non.
Le DCIR pourrait donc participer activement à la régulation de la réponse immunitaire, donnant
avantage au virus et ainsi participer à la pathogenèse associée à l’infection par le VIH-1.
A la lumière de ce qui précède, il ressort que l’interaction du DCIR avec le VIH-1 favorise la
transmission et la propagation du VIH-1 tout en inhibant la mise en place d’une réponse
immunitaire innée et adaptative efficace dirigée contre le VIH-1. L’hypothèse de ce programme
de recherche stipule qu’il est possible de développer une thérapie ciblant exclusivement le
DCIR afin, si non de prévenir, mais au moins de réduire la propagation du VIH-1 au niveau de
la muqueuse ainsi que dans les organes lymphoïdes. Ceci permettrait de prévenir ou de
réduire les dommages tissulaires au niveau de ces organes et la dérégulation du système
immunitaire. Pour répondre à cette hypothèse, la validation des inhibiteurs ou d’antagonistes
du domaine CRD, du motif EPS ou du motif de signalisation du DCIR s’avèrerait
indispensable. Pour ce faire, la mise en place de modèle d’activation directe de DCIR ou des
mesures d’interaction du DCIR avec ses ligands est nécessaire et fait partie de mon sujet de
maîtrise.
2.2. Objectifs
Objectif 1 : Développer un modèle d’activation directe de DCIR par un anticorps anti-DCIR.
Objectif 2 : Identifier les inhibiteurs pharmacologiques capables de bloquer l’activation directe
de DCIR sur les cellules primaires (cellules dendritiques et LTCD4 Th17)
Objectif 3 : Développer un modèle pour mesurer l’interaction de DCIR avec le virus.
42
Chapitre III : Matériels et méthodes
3.1. Réactifs
Le milieu de RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute), le sérum fœtal bovin
décomplémenté (FBS : Fœtal bovine serum) non ultracentrifugé, la pénicilline G à 100 U/ml, la
streptomycine à 100 µg/ml, la L-glutamine à 2 mM, le Ficoll (lymphocyte separation medium),
le PBS (phosphate buffered saline), le HBSS (Hank’s balanced salt solution) et le dextran ont
été achetés chez Wisent Inc (Saint Bruno, QC, Canada). Le milieu X-VIVO, la primocine, la
plasmocine, et le G418 sulfate sont disponibles chez InvivoGen (San Diego, CA, USA). Le
DMSO (diméthylsulfoxide), les inhibiteurs de protéase (aprotinine et leupeptine) et
l’orthovanadate de sodium ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Les
membranes de PVDF (PolyVinyliDeneFluoride), le luminata forte et le kit de dosage des
protéines Pierce® BCA Protein assay kit ont été acheté chez Ficher Scientific (Waltham, MA,
USA). Les substrats de révélation western lightning ECL plus, et le signal Boost
immunoreaction Enhancer (diluant pour anticorps primaires et secondaires) ont été achetés
respectivement chez Perkin Elmer (Waltham, MA, USA), et chez EMD MilliporeT (Burlington,
ON, Canada). L’inhibiteur de tyrosine kinase de la famille de Src kinase (PP-2) est disponible
chez Calbiochem (San Diego, CA, USA). La colonne d’affinité contenant les protéines G pour
la purification des anticorps et la colonne CNBr-actvated Sepharose 4B pour la purification des
protéines ont été achetées chez GE Healthcare (Montréal, QC, CA). Les cytokines IL-6, IL-1β,
IL-23 et TGF-β ont été achetées chez Cedarlane® (Burlington, ON, CA) et le GM-CSF provient
de chez Genscript Biotech Corporation (Piscataway Township, NJ, USA). L’IL-4 a été acheté
chez R&D System (Minneapolis, MN, USA). Les billes protéines A/G ont été achetées chez
Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).
3.2. Anticorps
L’Anticorps monoclonal anti-DCIR humain et son isotype contrôle, l’immunoglobuline G1
(IgG1) ont été achetés chez R&D Systems Inc (Minneapolis, MN, USA). L’anticorps polyclonal
anti-actine humain et l’anticorps monoclonal anti-GFP (green fluorescent protein) ont été
achetés respectivement chez Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) et chez
SignalChem (Vancouver, BC, CA). L’anticorps reconnaissant les protéines phosphorylées sur
43
leurs résidus tyrosine (anti-TPO) a été purifié au laboratoire du Dr Caroline Gilbert à partir d’un
surnageant de culture de l’hybridome 5γ/λ. Les anticorps anti-HLA-DR (DAG 147 et le L-243)
ont été purifiés dans le même laboratoire, à partir des surnageant des hybridomes. La
purification des anticorps a été effectuée sur colonne d’affinité des protéines G.
Les anticorps secondaires, le donkey anti-mouse conjugué à la peroxydase (anti-mouse-HRP),
le donkey anti-goat conjugué à la peroxydase (anti-goat-HRP) et le fragment F(ab’)2 anti-
fragment F(ab’)2 ont été achetés chez Jackson ImmunoResearch Laboratories (Baltimore Pike,
Wes Grove, PA, USA).
Le kit du cocktail (anti-CD8, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD19, anti-CD56 et anti-glycophorin A)
pour la sélection négative des LTCD4, le kit EasySep Human naïve CD4+ cell enrichment
cocktail (l’anti-CD45RO biotinylé et billes magnétiques) pour la sélection négative des LTCD4
naïfs et le kit StemSep Human CD14+ cell selection kit (anti-CD14 et billes magnétiques) pour
la sélection positive des monocytes ont été achetés chez STEMCELL Technologies Inc
(Vancouver, BC, Canada). Le complexe anti-CD3/anti-CD28 couplé aux billes pour l’activation
et l’expansion des LTCD4 naïfs a été acheté chez Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).
3.3. Cellules Raji-CD4-DCIR
Les cellules Raji sont des cellules B transformées et transfectées avec un cDNA qui code pour
le CD4 humain. Elles sont devenues un bon modèle pour étudier l’infection au VIH-1 [233]. Les
Raji-CD4-DCIR sont des cellules Raji-CD4 chez lesquelles on a exprimé le DCIR de manière
stable par transduction en utilisant un vecteur rétroviral bicistronique MSCV-IRES-eGFP dans
lequel on a inséré le cDNA codant le DCIR humain ou non (Raji-CD4-IRES) [207, 233]. Toutes
ces cellules sont mises en culture à 37°C dans le RPMI 1640 supplémenté de 10% FBS
décomplémenté et dépourvu ou non d’exosomes bovins et auquel on a ajouté 1% de PSG (la
pénicilline à 100 U/ml, de la streptomycine à 100 µg/ml et de la L-glutamine à 2 mM) et de
10% de G418, composant ainsi un milieu complet (RPMI complet).
3.4. Cellules dendritiques
Les cellules dendritiques sont obtenues à partir des monocytes du sang de donneur en santé.
Le sang veineux est donc prélevé sous l’anticoagulant isocitrate puis centrifugé sur gradient de
44
ficoll à 450 x g pendant 30 minutes à TP (Température de la pièce). On prélève l’anneau de
cellules mononuclées (PBMCs : Peripheral blood monuclear cells) à l’interface des phases
entre le sérum et le ficoll. Après 2 lavages dans le HBSS sans Ca+2, les cellules sont
comptées. Le culot de PBMCs est resuspendu à 1x108 cellules/ml dans une solution de PBS
1x supplémenté d’EDTA à 2 mM et de BSA à 0.5%. Les cellules CD14+ sont par la suite
isolées à partir des PBMCs en utilisant le kit de sélection positive (Stemsep Human CD14
Positive selection kit) et l’autoMACS® tel que décrit [234]. Les cellules CD14+ obtenues sont
comptées et resuspendues à 1x106 cellules dans le RPMI complet supplémenté avec la
primocine à 0.2% et de la plasmocine à 0.1%. Elles sont ensuite mises en culture pendant 6
jours à 37°C avec 5% de CO2 dans une plaque de 6 puits en raison de 3x106 cellules (soit 3
ml de suspension cellulaire)/puit en présence de GM-CSF (1000 U/ml) et d’IL-4 (200 U/ml)
pour amorcer la différenciation. Le GM-CSF et l’IL-4 sont ajoutés aux jours 2 et 4 de la culture.
3.5. Purification des LTCD4 et leur polarisation en Th17
Les LTCD4 sont obtenus par une sélection négative à partir des cellules CD14+ ou en utilisant
la fraction négative (PBL) telle que décrit [234]. Les PBMCs ou les PBLs sont respectivement
resuspendus à 5x107 cellules/ml et à 8x107 cellules/ml dans le PBS / EDTA 2 mM / BSA 0.5%.
Ils sont incubés avec un cocktail d’anticorps (StemCellTM-StemSepTM Human CD4+ T Cell
Enrichment Cocktail CD8, CD14, CD16, CD19, CD56, glycophorin A) en raison de 100 µl/ml
des cellules pendant 15 minutes à TP et on y rajoute 60 µl des billes magnétiques
(StemCellTM-StemSepTM Magnetic Colloid)/ml des cellules. Après une incubation de 10
minutes à 37°C, le mélange billes anticorps et cellules est passé à travers une colonne de
filtration (Macs pre-separation filter) enfin de se débarrasser des agrégats cellulaires. A l’aide
de l’autoMACS, on réalise la sélection négative et on obtient les cellules non liées au cocktail
d’anticorps (la fraction négative), ce qui correspond aux LTCD4.
La polarisation des LTCD4 naïfs en Th17 est obtenue à partir des LTCD4 telle que décrite
[235]. Les cellules TCD4+ sont comptées et resuspendues dans une solution de PBS/ FBS 2%
à une concentration de 5x107 cellules/ml puis transférées dans un tube de 5 ml. On y ajoute
l’anticorps anti-CD45RO (Biotinylated anti-CD45RO Antibody; StemCellTM-EasySepTM; Human
naive CD4+ T Cell Enrichment Kit) en raison de 50 µl/ml. Après une incubation de 15 minutes
45
à TP, on y rajoute les billes magnétiques (Magnetic nanoparticules; StemCellTM-EasySepTM
Human naive CD4+ T Cell Enrichment Kit) et grâce à l’aimant (EasySep® Magnet), on obtient
les cellules CD4 naïves CD45RO-. Ces cellules sont comptées, lavées et reprises à 4x105
cellules/ml puis mises en culture dans le milieu complet X-VIVO 15 à 37°C et à 5% CO2. La
polarisation des LTCD4 naïfs en LTCD4 Th17 est amorcée par l’ajout d’anti-CD3/CD28 liés
aux billes (Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for cell expansion and activation) en
présence des cytokines IL-1β (10 ng/ml final), IL-6 (10 ng/ml final), IL-23 (100 ng/ml final) et
TGFβ (8 ng/ml final) ainsi que de l’anticorps anti-IFNγ pour limiter la polarisation des LTCD4
en Th1. La différenciation en Th17 est effective après 6 jours de culture.
3.6. Évaluation de la phosphorylation des résidus tyrosine
2x107 de cellules/ml (Raji-CD4-DCIR, cellules dendritiques et LTCD4 Th17) sont prétraitées
d’une part avec le DMSO dilué à 1/1000 et d’autre part avec différents inhibiteurs à 10 µM ou
25 µM, puis sont incubées à 37°C pendant 10 minutes. Avant la stimulation, une suspension
cellulaire de 25 µl est prélevée puis transférée dans un tube contenant 25 µl de tampon de
lyse (ou tampon d’échantillon) SB 2X bouillant (Sample Buffer 2X réducteur : upper buffer tris
à 0,125 mM final, SDS 20% à 8% final, β-mercaptoéthanol à 10% final, glycerol à 17,5% final,
bleu de bromophénol 0,1% à 0,0025% final, orthovanadate de sodium 200 mM à 5 mM final et
aprotinin-leupeptine 1 mg/ml à 0,025 mg/ml final) à 100°C pendant 7 minutes, tout en
vortexant. Les cellules prétraitées ou non avec les inhibiteurs sont ensuite activées avec un
anticorps anti-DCIR à (5 µg/ml pendant 2 minutes à 37°C puis avec un F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à
15 µg/ml. Une suspension cellulaire est par la suite prélevée à différents temps et transférée
dans un tube contenant le SB 2X bouillant. Les lysats cellulaires obtenus sont par la suite
gardés à -20°C
.
3.7. Immunobuvardage
3.7.1. Migration sur gel de polyacrylamide 12%
Les cellules Raji-DC4-DCIR et Raji-CD4-IRES sont lysées dans le SB 2X réducteur ou non
réducteur (le β-mercaptoéthanol est remplacé par l’eau milli Q) bouillant à 100°C pendant 7
minutes. Les lysats cellulaires obtenus sont chauffés, vortexés et centrifugés puis déposés sur
mini-gel SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel) de 12% de polyacrylamide
46
et un marqueur de poids moléculaire y est déposé au même moment. Les protéines sont
migrées pendant 1h30’ à 120 volts à TP. Après migration, les protéines sont transférées sur
les membranes de PVDF de 0,22 µm à 4°C soit à 300 mA pendant 1h30’ soit à 60 mA
pendant toute la nuit. Les membranes sont colorées avec le rouge ponceau 0,1% pour
apprécier l’efficacité du transfert et de la quantité de protéines présentes dans chaque puit.
Puis elles sont rincées avec le tampon de lavage TBST 0,15% (TBS: Tris Buffer Saline, T :
Tween-20) pour les membranes destinées à l’immunobuvardage avec les anticorps anti-GFP
et anti-actine ou le TBST 0,1% pour l’immunobuvardage avec les anticorps anti-DCIR, anti-p24
et anti-HLA-DR. Les sites non spécifiques des membranes sont bloqués avec le lait 5 %
pendant 1h00 à la TP. Après un lavage de 5 minutes, les membranes sont incubées à 4°C
pendant toute la nuit et sous agitation, avec les anticorps primaires appropriés dilués dans une
solution de lait à 5 % : l’anti-hDCIR à 1mg/ml avec une dilution de 1/1000 (1 µg/ml final), l’anti-
GFP à 1mg/ml avec une dilution de 1/3000 (0,3 µg/ml final), l’anti-actine à 200 µg/ml avec une
dilution de 1/4000 (0.05 µg/ml final), l’anti-HLA-DR à 1 mg/ml avec une dilution de 1/1000 (1
µg/ml final) et l’anti-p24 à 1 mg/ml avec une dilution de 1/2000 (0.5 µg/ml final). Après trois
lavages successifs de 5 minutes, les membranes sont mises en contact avec les anticorps
secondaires (anticorps de chèvre et anticorps de souris conjugués à la peroxydase) à une
dilution de 1/10000 pendant 1h00 à TP. L’anticorps de chèvre conjugué à la peroxydase était
utilisé pour le blot anti-actine et a été dilué dans du TBST. Ex aequo pour l’anticorps de souris
utilisé pour les immunobuvardages avec les anti-GFP, anti-p-24 et anti-HLA-DR, excepté le
blot anti-DCIR ou l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase était dilué dans le diluant
signal Boost immunoreaction Enhancer pour anticorps secondaires. Cette étape est suivie par
trois lavages consécutifs de 5 minutes, puis les membranes sont incubées avec la solution de
révélation luminata forte pendant 3 minutes pour le blot anti-DCIR et le substrat de révélation
western lightning ECL plus pendant 1 minute pour les autres blots.
3.7.2. Migration sur gel gradient de polyacrylamide 7,5 %- 20 %
Les lysats cellulaires sont chauffés, vortexés, centrifugés puis déposés sur un grand gel
gradient de polyacrylamide SDS-PAGE (7.5% à 20%) en raison de 20 µl par puit et les
protéines sont migrées à 15 mA pendant 4h00 à la TP. Les protéines sont par la suite
transférées sur les membranes de PVDF de 0,45 µm à 4°C, dans un tampon de transfert avec
Objectif 2 Perspectives Conclusion
47
20% de méthanol et avec un courant électrique de 300 mA pendant toute la nuit. Les
membranes sont ensuite colorées avec le rouge ponceau 0,1 % pour juger de la qualité du
transfert, puis lavées avec du tampon TBST 0,15 %. Cette étape sera suivie par un blocage
des sites non spécifiques de la membrane par la gélatine 2% pendant 30 minutes à 37°C, puis
les membranes sont rincées une seule fois avec la solution de TBST 0,15 % pendant 5
minutes à 37°C. Les membranes sont incubées avec l’anticorps anti-phosphotyrosine à 0.25
µg/ml pendant 1h00 à 37°C sous agitation. Trois lavages consécutifs de 5 minutes sont
nécessaires pour débarrasser la membrane de l’excès d’anticorps, puis elles sont incubées 30
minutes avec un deuxième anticorps, le second anticorps de souris couplé à la peroxydase à
une dilution de 1/10000. Après trois lavages de 5 minutes à TP, les protéines sont révélées sur
la membrane après une incubation d’une minute avec le substrat de révélation western
lightning ECL+.
3.8. Purification du DCIR et de HLA-DR par colonne
d’affinité
3.8.1 Purification de DCIR
La purification de la molécule de DCIR a été réalisée sur colonne de sépharose activée au
CNBr (Bromure de cyanogène qui est l’un des réactifs utilisé pour coupler une cible à la
matrice de la colonne) à partir d’un lysat cellulaire de Raji-CD4 surexprimant le DCIR. Cette
colonne fonctionne sur le principe de la chromatographie d’affinité.
3.8.1.1. Préparation de la colonne
1 g de billes sont resuspendues dans 5 ml de HCl à 1mM puis transférées dans la colonne de
10 ml. Ensuite le gel est lavé en faisant passer à travers la colonne 200 ml de HCl 1mM. Les
billes sont ainsi retenues dans la colonne acidifiée. Après cette étape, 1 mg d’anticorps anti-
DCIR est centriconné et resuspendu dans 5 ml du tampon NaHCO3 à 0.1 M et à pH 8.3 puis
ajouté dans la colonne. Les deux bouts de la colonne sont ensuite bien fermés avec le
parafilm et cette dernière est agitée par rotation pendant toute la nuit à 4°C. La présence du
tampon NaHCO3 permet d’équilibrer la colonne. Le couplage étant réalisé, les anticorps anti-
DCIR sont fixés sur les billes permettant ainsi au gel de sépharose activé au CNBr de former
48
un lien covalent avec son ligand, l’anti-DCIR. L’excès d’anticorps (anticorps non fixés aux
billes) est enlevé après passage à travers la colonne du tampon Tris-HCl à 0.1 mM et à pH 8.0
pendant 2h00 à la TP. On réalise ensuite 3 cycles de lavage en alternance avec les tampons
acétate à 0.1M et à pH 4.0 et carbonate à 0.1 mM et à pH 8.3 en raison de 10 ml par cycle
pour équilibrer la colonne.
3.8.1.2. Préparation de lysat cellulaire
Les Raji-CD4-DCIR (2x108 cellules) sont centrifugés pendant 5 minutes à 300 x g et le culot
est resuspendu dans le RPMI. Les cellules sont ensuite comptées à l’aide d’un hémacytomètre
puis lavées avec le HBSS + Ca+2 froid pour éliminer le RPMI et distribuer en raison de 2x107
cellules dans les tubes eppendorf 1,5 ml déjà froid. Après le lavage, le culot cellulaire est
resuspendu dans 500 µl de tampon de CHAPS 0.6% frais et froid (CHAPS 0.6 % :, Tris-HCl à
10 mM et à pH 7.5, NaCl à 137 mM, EDTA à 1Mm et à pH 7.4, Na3VO4 à 2 mM, aprotinine et
leupeptine à 10 µg/ml, PMSF à 2 mM et l’inhibiteur de soybean trypsin à 50 µg/ml). Après
avoir bien vortexé, le lysat cellulaire est centrifugé à 13 000 x g pendant 10 minutes à 4°C. Le
lysat de chaque tube est recueilli puis transféré dans un seul tube. Ceci constitue le lysat
nécessaire pour la purification de DCIR.
3.8.1.3. Purification et élution
Le lysat est passé dans la colonne d’affinité, les molécules de DCIR sont retenues par les
anticorps anti-DCIR. Le DCIR est ensuite détaché grâce à 10 ml de tampon glycine à 0.1 M pH
2.4 et les éluats sont recueillis dans 10 tubes contenant chacun, 75 µl de la solution de Tris-
HCl à 2 M et à pH 9.0 afin de neutraliser la solution acide. Après élution, la colonne est
renaturée avec 3 cycles de lavage en alternance avec les tampons acétate et carbonate en
raison de 10 ml par tampon, puis elle est ensuite rangée à 4°C avec la solution de
conservation (0.01 M Tris-HCl pH 7.4, 0.15 M NaCl)
3.8.2. Purification de HLA-DR
La molécule de HLA-DR a été purifiée de la même manière que la molécule de DCIR, en
utilisant comme anticorps, l’anti-HLA-DR (L-243).
49
3.9. Dosage des protéines
3.9.1. Dosage avec le Biodrop
Les protéines récoltées dans les différents tubes sont d’abord dosées semi-quantitativement
avec le Biodrop, afin de pooler les fractions avec des fortes concentrations de protéines. Le
pool de protéine obtenu est ensuite centriconné avec amicon ultra 4 MWCO 10 kDa à 3000
rpm pendant 30 minutes à 4°C. Les protéines concentrées dans la partie supérieure de
l’amicon sont recueillies et resuspendues dans du PBS puis dosées avec une méthode
quantitative, le BCA. Les aliquots des protéines sont ensuite préparés et gardés à -80°C.
3.9.2. Dosage avec le BCA
Le dosage des protéines avec le kit BCA est basé sur le principe de Biuret. En effet, en milieu
alcalin, les protéines forment avec l’ion cuivre II un complexe pourpre typique dont la
concentration de la coloration est proportionnelle à la concentration des protéines. Une courbe
standard en concentrations protéiques allant de 0 µg/ml à 2000 µg/ml est préparée à partir
d’un étalon (BSA : Bovine serum albumine) à 2000 µg/ml. Les concentrations de protéines
sont déterminées par colorimétrie sur une plaque de 96 puits en duplicata en fonction de cette
courbe.
Sur une plaque de 96 puits, on dépose 25 µl de chacun des standards (0, 5, 25, 50, 125, 250,
500, 750, 1000, 1500 et 2000 µg/ml) en duplicata dans les puits de deux extrêmes. On dépose
ensuite les échantillons puis on ajoute dans chacun des puits 200 µl du réactif BCA (1 volume
de sulfate de cuivre à 4% et 50 volumes de 0.1 M de carbonate de sodium, bicarbonate de
sodium, acide bicinchonique et de tartrate de sodium dans l’hydroxyde de sodium) et on laisse
incuber pendant 30 minutes à 37°C. La plaque est ensuite lue à l’aide d’un lecteur
spectrophotométrique à 562 nm.
50
Chapitre IV : RESULTATS
4.1. Activation de DCIR sur la lignée cellulaire Raji-CD4-
DCIR
4.1.1. La présence de DCIR sur les Raji-CD4
Les Raji-CD4 sont des cellules B transformées par transfection pour qu’elles expriment le
récepteur CD4 [233]. Les Raji-CD4-DCIR par contre, sont des Raji-CD4 chez lesquelles on a
exprimé de manière stable le DCIR humain [207, 233] tel que décrit dans la section du
matériel et méthodes. L’expression du CD4 et de DCIR a rendu ce modèle susceptible à
l’infection par le VIH-1 et l’a rapproché du modèle physiologique comme les cellules
dendritiques et les LTCD4. Pour vérifier la présence de DCIR dans ce modèle cellulaire, ces
cellules ont été lysées dans le SB 2x non réducteur. A partir des lysats cellulaires obtenus,
nous avons réalisé un immunobuvardage avec un anti-DCIR, un anti-GFP et un anti-actine.
Les résultats présentés à la figure 12 montrent la présence de DCIR sur les Raji-CD4-DCIR et
aucune trace de cette protéine n’a été révélée sur les Raji-CD4-IRES. Ceci confirme l’absence
de DCIR sur cette lignée cellulaire et montre que l’anticorps anti-DCIR utilisé est réellement
spécifique vis-à-vis de la protéine DCIR. La présence de la protéine GFP à 45 kDa et de
l’actine à 25 kDa confirment respectivement la transformation des lignées par la détection de
la GFP et une quantité comparable des protéines déposées sur le gel et transférées sur la
membrane de PVDF. Ce test fût réalisé au moins à six reprises tout au long des études en
guise de contrôle.
51
Figure 12 : Expression de DCIR sur les Raji-CD4. 2x107 cellules/ml de chaque lignée
cellulaire ont été lysées dans le tampon d’échantillon. 15 µl de lysat cellulaire ont été déposés
dans le puit pour chacune des lignées cellulaires. Le DCIR, la GFP et l’actine ont été révélés
par immunobuvardage avec les anticorps correspondants.
4.1.2. Détermination de la concentration saturante de l’anti-DCIR
Pour connaitre la concentration de l’anticorps capable de lier le maximum de DCIR présent sur
les cellules, mais aussi la concentration cellulaire à laquelle nous souhaitions faire l’activation
de DCIR, nous avons incubé 2x107cellules/ml avec l’anti-DCIR à différentes concentrations (1
à 10 µg/ml) pendant 30 minutes. Après un lavage pour enlever l’excédent d’anticorps non fixé,
les anti-DCIR fixés sur les cellules ont été marqués avec un deuxième anticorps, un anti-souris
couplé à Alexa 647. La quantité d’anti-DCIR maximale pouvant être liée sur les Raji-CD4 DCIR
a été déterminée par cytométrie en flux. Le résultat présenté à la figure 13 montre que l’anti-
DCIR est capable de lier le DCIR présent à la surface des cellules, montrant des intensités
croissantes en fonction de la dose d’anticorps comprise entre 1 et 5 µg/ml. Le même protocole
a été appliqué avec les cellules n’exprimant pas le DCIR, les Raji-CD4-IRES en guise de
témoin. Les Raji-CD4-DCIR non marqués et ceux traités avec un anticorps du même isotype et
servant aussi de contrôle ont été inclus dans l’expérimentation. Cette analyse nous a permis
de considérer que l’anticorps anti-DCIR utilisé à 5 µg/ml final était suffisant pour lier tous les
DCIR présents à la surface cellulaire à une concentration de 2x107/ml.
52
No
n m
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s
1u
g/m
l a
nti
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g/m
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0
1.0106
2.0106
3.0106
4.0106
IRES
DCIR
Ind
ex d
e f
luo
rescen
ce
Figure 13 : Détermination de la concentration d’anticorps anti-DCIR saturante de DCIR.
Les cellules ont été incubées avec une dose croissante d’anti-DCIR (1 à 10 µg/ml) puis
incubées avec un anti-souris couplé au fluorophore Alexa 647. La concentration saturante de
l’anti-DCIR a été déterminée par la cytométrie en flux. Un contrôle positif avec un anti-DCIR
APC a été utilisé à 5 µg/ml. Cette figure est représentative de deux expériences réalisées.
4.1.3. Activation des Raji-CD4-DCIR et mesure du patron de
phosphorylation des protéines sur leurs résidus tyrosine
L’attachement du VIH-1 sur le DCIR est dépendant de la phosphorylation des résidus tyrosine
présents sur son motif ITIM [207]. Plusieurs protéines intracellulaires sont impliquées dans
cette phosphorylation notamment les tyrosines kinases de la famille de Src. Nous souhaitions
donc vérifier la génération d’un patron des protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine
à la suite de l’activation directe de DCIR par un anti-DCIR. Dans le but de répondre au premier
objectif assigné dans ce travail, qui est celui de développer un modèle d’activation directe de
DCIR par un anticorps anti-DCIR, nous avons dans un premier temps provoqué l’activation
directe de DCIR présent sur les Raji-CD4-DCIR avec un anticorps monoclonal anti-hDCIR et
avons renforcé cette activation avec un fragment F(ab’)2 anti-F(ab’)2. Les cellules activées ont
été lysées dans le tampon SB 2x réducteur afin de réaliser l’immunobuvardage avec un
53
anticorps anti-phosphotyrosine. Les résultats présentés à la figure 14 (panneau de gauche)
montrent un patron de protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine dont l’intensité du
signal augmente avec le temps de pontage.
Sachant qu’après l’activation de la cellule via ces récepteurs, les tyrosines kinases de la
famille Src sont rapidement recrutées dans la membrane cellulaire via leur domaine de
myristoylation [236, 237], faisant en sorte qu’elles soient souvent les premières enzymes à
être impliquées dans la cascade de signalisation. Nous avons ainsi procédé à l’activation de
DCIR sur des cellules ayant été traitées avec un inhibiteur pharmacologique bien connu et
spécifique des tyrosines kinase de la famille de Src, le PP-2. Le résultat présenté au panneau
de droite montre une inhibition de patron de phosphorylation. Ce résultat montre le rôle d’avant
plan des Src kinases dans la cascade de signalisation ainsi que dans l’augmentation du patron
de phosphorylation des protéines sur leurs résidus tyrosine après l’activation de DCIR. Ceci
nous a permis de valider le modèle d’activation de DCIR. Ces résultats nous ont amenés à
utiliser le même protocole sur les cellules primaires en l’occurrence les cellules dendritiques et
les LTCD4 polarisés en Th17.
Figure 14 : Augmentation de la phosphorylation des protéines sur leurs résidus tyrosine
à la suite de l’activation de DCIR. 2x107 cellules/ml ont été prétraitées d’une part avec le
DMSO et d’autre part avec le PP-2 à 10 µM. Les Raji-CD4-DCIR ont été ensuite incubées
54
avec ou sans l’anti-DCIR à 5 µg/ml et activées avec ou sans un second anticorps, le F(ab’)2
anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml. Les cellules ont ensuite été lysées dans le SB 2x réducteur. Les lysats
cellulaires ont été déposés dans les puits. Après l’analyse sur gel de polyacrylamide SDS-
PAGE 7.5%-20%, un immunobuvardage avec un anticorps dirigé contre les protéines
phosphorylées sur leurs résidus tyrosine a été réalisé.
4.2. Activation de DCIR dans les cellules primaires
4.2.1. Activation de DCIR sur les cellules dendritiques
Plusieurs études ont montré que les cellules dendritiques immatures expriment de grandes
quantités de DCIR à leurs surfaces et que ces cellules sont impliquées dans la pathogenèse
de l’infection par le VIH-1 telles que décrits dans l’introduction. Certaines études ont montré
que le DCIR exprimé sur les cellules dendritiques constitue un facteur d’attachement et
d’internalisation du VIH-1 et par conséquent occasionne la propagation du virus dans
l’organisme. La phosphorylation du motif ITIM de même que les tyrosines kinases Lyn, Hck,
Src et Syk semblent participer à cet attachement et à la transmission du virus par le DCIR
[207]. Par rapport à cela, nous souhaitions dans un premier temps vérifier si les cellules
dendritiques stimulées avec l’anti-DCIR pouvaient générer un patron de protéines
phosphorylées sur leurs résidus tyrosine tel que cela a été montré pour les Raji-CD4-DCIR
(Figure 14). Puis dans un deuxième temps, vérifier si les inhibiteurs de la portion extracellulaire
de DCIR pouvaient inhiber cette phosphorylation. Nous avons donc appliqué le même
protocole que celui utilisé pour stimuler les Raji-CD4-DCIR. Les cellules dendritiques ont été
activées avec ou sans anti-DCIR à 5 µg/ml puis avec ou sans F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml
ou encore avec F(ab’)2 anti-F(ab’)2 seul. Les cellules dendritiques ont été ensuite lysées dans
le SB 2x afin de réaliser l’immunobuvardage avec un anticorps dirigé contre les protéines
phosphorylées sur leurs résidus tyrosine. Le résultat présenté à la figure 15 montre que les
cellules dendritiques stimulées avec un anti-DCIR puis avec un ponteur, ont généré un patron
de phosphorylation avec un signal fort et croissant, mais qui a tendance à chuter après la
120ème minute d’activation. Cependant, au niveau des cellules non stimulées et celles
stimulées uniquement avec le F(ab’)2 anti-F(ab’)2, nous avons observé un signal faible et non
croissant en fonction de la cinétique. Ce qui explique une certaine spécificité avec l’anti-DCIR.
D’autre part, les cellules dendritiques ont été prétraitées avec un inhibiteur de la portion
55
extracellulaire de DCIR, le 1-methyl-4-[(4-methylphenyl)-NNO-azoxy]benzene (B2) à 10 µM/ml
avant d’être stimulées avec l’anti-DCIR à 5 µg/ml et le F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml. Le
résultat présenté à la figure 16 montre une légère inhibition du patron de phosphorylation à la
120ème minute d’incubation des cellules prétraitées avec l’inhibiteur. L’inhibiteur n’a cependant
montré aucun effet sur le DCIR à la 60ème minute d’incubation. Nous avons également
constaté que les cellules dendritiques non stimulées n’ont pas généré un patron des protéines
tyrosine phosphorylées.
Figure 15 : Patron des protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine à la suite de
l’activation directe de DCIR sur les cellules dendritiques. 2x107 cellules/ml ont été activées
avec ou sans anti-DCIR à 5 µg/ml puis avec ou sans le F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml ou
encore avec le ponteur seul à 37°C. Après la lyse des cellules dans le SB 2x réducteur, un
immunobuvardage avec un anti-phosphotyrosine a été réalisé.
56
Figure 16: Inhibition du patron de phosphorylation sur les cellules dendritiques par les
inhibiteurs de DCIR. 2x107 cellules/ml ont été prétraitées d’une part avec le DMSO et d’autre
part avec l’inhibiteur B2 à 10 µM pendant 10 minutes à 37°C. Les cellules ont par la suite été
activées avec 5 µg/ml de l’anti-DCIR puis avec ou sans le F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml à
37°C. Les cellules ont été lysées dans le SB 2x réducteur. 20 µl de lysats cellulaires ont été
déposé dans les puits. Après migration sur un gel SDS-PAGE, un immunobuvardage a été
réalisé sur les échantillons avec un anticorps dirigé contre les protéines phosphorylées sur les
tyrosines.
4.2.2. Activation de DCIR sur les LTCD4 polarisés en Th17
Les LTCD4 polarisés en Th17 sont très permissifs à l’infection par le VIH-1 [88]. Il a été montré
dans notre laboratoire que ces cellules expriment de grandes quantités de DCIR (Figure 10).
Cette grande expression de DCIR peut faciliter l’infection de ces cellules Th17, mais pourrait
aussi promouvoir l’infection des LTCD4 non infectés appelés bystander en attachant du virus.
Nous avons d’une part, stimulé les cellules Th17 avec un anti-DCIR puis avec un F(ab’)2 anti-
F(ab’)2 afin de réaliser un immunobuvardage avec un anti-phosphotyrosine. Nous souhaitions
57
voir si cette activation pouvait générer un patron de phosphorylation des protéines sur leurs
résidus tyrosine, tel que montré pour les cellules dendritiques. D’autre part, nous avons
procédé à un traitement des cellules par des inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR,
1-benzofuran-2-yl(phenyl)methanone (B1) et 1-methyl-4-[(4-methylphenyl)-NNO-
azoxy]benzene (B2) pour vérifier si ces derniers pouvaient inhiber la phosphorylation en
réponse à l’activation par l’anti-DCIR. Le résultat présenté à la figure 17 révèle que les LTCD4
polarisés en Th17 stimulés par un anti-DCIR sont capables de générer un patron de
phosphorylation des résidus tyrosines. Les deux inhibiteurs de la portion extracellulaires de
DCIR utilisés affectent le patron de phosphorylation généré en réponse à l’anti-DCIR.
Figure 17 : Inhibition du patron de phosphorylation sur les LTCD4 Th17 par les
inhibiteurs de DCIR. 2x107 cellules/ml ont été prétraitées ou non avec les inhibiteurs B1 et B2
à 10 µM pendant 10 minutes à 37°C. Elles ont ensuite été activées avec ou sans l’anti-DCIR à
5 µg/ml puis avec ou sans le F(ab’)2 anti-F(ab’)2 à 15 µg/ml. Les Th17 ont par la suite été
lysés dans le tampon SB 2x réducteur. Les lysats cellulaires obtenus ont été déposés dans les
puits. Après migration sur gel SDS-PAGE 7.5%-20%, un immunobuvardage avec un anticorps
dirigé contre les protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine a été réalisé.
58
4.3. Évaluation de la liaison du DCIR avec les ligands
4.3.1. Détection de la protéine DCIR purifiée
Pour arriver à développer un modèle de liaison physiologiquement pertinent entre le VIH-1 et
le DCIR, nous devons avoir une molécule de DCIR fortement glycosylée que nous pourrons
déglycosyler in vitro, car la liaison avec ses ligands ainsi que sa phosphorylation sur les
résidus tyrosine sont influencées par cette glycosylation [185, 186]. Le DCIR est une protéine
glycosylée au niveau de son domaine CRD. C’est une N- glycosylation située à la position
185ème de la chaine peptidique de son domaine de reconnaissance des sucres [185]. Cette
glycosylation est impérative pour étudier la liaison entre le DCIR et ses ligands puisque in vivo
le DCIR sera préférentiellement glycosylé. Ainsi donc, pour purifier le DCIR, il a fallu utiliser les
cellules où la glycosylation est conservée et non d’avoir recours aux cellules bactériennes qui
peuvent produire des grandes quantités de DCIR non glycosylé. Nous avons donc décidé de
purifier la molécule de DCIR à partir de culture des cellules Raji-CD4-DCIR. Cette purification
a été effectuée sur la colonne de sépharose activé au CNBr et la protéine purifiée a été
quantifiée par la méthode de BCA à l’aide d’un spectrophotomètre tel que décrit au point 4.9
du présent travail. Après purification, la molécule de DCIR a été resuspendue dans le SB 2x
non réducteur et nous avons réalisé un immunobuvardage avec un anticorps anti-DCIR pour
évaluer sa pureté. La protéine HLA-DR que nous avons aussi purifiée de la même manière
était incluse comme contrôle. Le résultat présenté à la figure 18 révèle une protéine à la
hauteur de 31 kDa en comparaison avec la protéine HLA-DR purifiée dont aucune trace n’a
été révélée. La protéine révélée correspond bien au DCIR.
Figure 18 : Détection de la protéine DCIR purifiée par l’anticorps anti-DCIR. La protéine
DCIR et de la protéine HLA-DR purifiées ont été resuspendues dans le tampon SB 2x non
réducteur. 15 µg de chacune des protéines ont été déposées dans les puits et elles ont été
migrées sur gel de polyacrylamide 12%. Un immunobuvardage avec l’anticorps dirigé contre le
DCIR a permis de révéler le DCIR uniquement dans le puit correspondant au DCIR purifié
59
Chapitre V : Discussion
Le DCIR facilite la liaison et l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et son activation
augmente la production et la propagation du virus. Sachant que le rôle joué par le DCIR,
notamment la liaison entre le DCIR et le VIH-1, son internalisation ainsi que son trafic dans les
endosomes est dépendant de la transduction du signal due à la phosphorylation du résidu
tyrosine contenu dans son motif ITIM, nous avons cherché à savoir si l’activation de DCIR
avec un anti-DCIR pouvait générer un patron de phosphorylation des résidus tyrosine. Ensuite,
nous avons vérifié si les inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR pouvaient bloquer le
DCIR et inhiber cette phosphorylation, témoin des évènements précoces d’activation cellulaire.
Pour ce faire, nous avons, dans un premier temps, évalué la présence de DCIR dans les
cellules Raji-CD4-DCIR. Dans un deuxième temps, nous avons montré que la stimulation de
DCIR par un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus tyrosine
dans les Raji-CD4-DCIR ainsi que dans les cellules primaires notamment les cellules
dendritiques et les LTCD4 polarisés en Th17. Sachant que les Src kinases jouent un rôle de
premier plan dans la cascade de signalisation, nous avons voulu vérifier si l’utilisation des
inhibiteurs spécifiques à ces protéines pouvait inhiber cette phosphorylation. Ainsi, nous avons
montré dans cette étude que le prétraitement des Raji-CD4-DCIR avec l’inhibiteur
pharmacologique des tyrosines kinases de la famille de Src, le PP2 était capable d’inhiber
cette phosphorylation, validant ainsi notre modèle d’activation. Cela étant, nous avons testé
quelques inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR dans les cellules primaires. Et nous
avons montré que ces inhibiteurs ont affecté la phosphorylation des protéines sur leurs résidus
tyrosine. Cette inhibition parait très légère avec le 1-methyl-4-[(4-methylphenyl)-NNO-
azoxy]benzene (B2) sur les cellules dendritiques. Elle s’est avéré cependant, très forte avec
l’utilisation des inhibiteurs 1-benzofuran-2-yl(phenyl)methanone (B1) et 1-methyl-4-[(4-
methylphenyl)-NNO-azoxy]benzene (B2) spécifiques au motif EPS dans les LTCD4 Th17. Ces
résultats révèlent une différence dans la réponse des cellules dendritiques versus celle des
LTCD4 Th17 lors d’une stimulation de DCIR. Cette observation renforce ainsi notre idée de
valider les effets de son activation et l’impact des inhibiteurs de DCIR dans les différents
modèles cellulaires l’exprimant.
Le niveau de glycosylation de DCIR affecte la liaison de son domaine CRD avec ses ligands.
Ceci nous a amené à purifier le DCIR à partir des Raji-CD4 le surexprimant et avons évalué sa
60
pureté par immunobuvardage. Une analyse protéomique déterminera avec précision son
niveau de glycosylation pour développer éventuellement des mesures de liaison in vitro avec
le VIH-1 en présence ou non des inhibiteurs de DCIR.
5.1. Différence de phosphorylation dans les trois modèles
cellulaires
Nous avons constaté que la phosphorylation générée à la suite de l’activation de DCIR par un
anticorps anti-DCIR était différente selon qu’il s’agissait des cellules Raji-CD4-DCIR, des
cellules dendritiques ou des LTCD4 polarisés en Th17. Dans les Raji-CD4-DCIR, le profil de la
phosphorylation augmente avec le temps de pontage et aucune protéine ne semble plus
phosphorylée qu’une autre. La phosphorylation de base est importante et ne semble pas être
influencée par l’ajout de l’anti-DCIR. Dans les cellules dendritiques, la phosphorylation est
fortement influencée par l’ajout de F(ab’)2 anti-F(ab’)2 qui ponte les anti-DCIR déjà fixés. Le
signal croit jusqu’à 2 minutes, suivi d’une diminution contrairement au Raji-CD4-DCIR. Dans
les LTCD4 Th17, nous avons constaté que l’ajout du ponteur n’a eu aucune influence sur
l’induction de la phosphorylation déjà augmentée simplement par l’ajout de l’anti-DCIR. Les
observations faites sur la mesure de phosphorylation dans les trois types cellulaires montrent
que ces cellules se comportent différemment et par conséquent doivent être traitées
indépendamment les unes des autres.
5.2. Le rôle de DCIR dans la transmission de l’infection par
le VIH-1
Comme nous l’avions dit précédemment, le DCIR est capable de lier le VIH-1 à travers son
domaine extracellulaire, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée à ce virus. Les
résultats obtenus dans notre étude (figures 16 et 17) montrent qu’il est possible de bloquer le
DCIR par des inhibiteurs extracellulaires spécifiques afin de l’empêcher de reconnaitre et de
lier la gp120 du VIH-1. Ceci réduirait la liaison et le transfert du virus. Ces résultats se
rapprochent de ceux obtenus par Claude M. Mfunyi et al, qui a observé que les cellules
dendritiques prétraitées avec les inhibiteurs pharmacologiques de la portion extracellulaire de
DCIR avant leur activation avec le VIH-1 ou avec un anticorps anti-DCIR, libéraient
61
significativement moins d’exosomes [232]. Les travaux de Lambert ont montré que les
inhibiteurs extracellulaires de DCIR étaient capables de diminuer l’attachement du virus sur les
cellules cibles ainsi que son transfert vers les LTCD4 [228]. Ces résultats mis en ensemble
montrent que le DCIR peut constituer une cible thérapeutique intéressante capable de moduler
l’infection par le VIH-1 dans les cellules cibles.
5.3. Rôle du motif ITIM de DCIR dans l’infection par le VIH-
1
L’activation du DCIR et par conséquent, la phosphorylation du résidu tyrosine contenu dans le
motif de signalisation intracellulaire ITIM pourraient affecter la production des cytokines
médiées par le TLR8 et le TLR9, notamment l’IL-12, le TNF-α et l’IFN-α [120, 121]. L’IL-12 est
requise pour la différenciation des LTCD4 naïfs en LTCD4 Th1, mais aussi à la stimulation
d’IFN-γ afin d’assurer la réponse immunitaire cellulaire. Son inhibition dans le contexte de
l’activation de DCIR pourrait être avantageuse pour le virus. En effet l’IFN-α joue un rôle
crucial dans l’immunité innée pour combattre la réplication virale. La diminution de ces
cytokines peut ainsi contribuer au dysfonctionnement du système immunitaire dirigé contre le
virus et participer à l’aggravation de l’infection. Plusieurs stratégies peuvent être utilisées pour
empêcher la phosphorylation des résidus tyrosine du motif ITIM. Ainsi, l’utilisation des peptides
phosphorylés tels que décrits dans les travaux de Lambert [207] constitue une approche
favorable. De plus, des inhibiteurs de la portion extracellulaire de DCIR, tels que montrés dans
le présent travail et qui sont capables de bloquer l’activation de DCIR et d’inhiber le patron de
phosphorylation générée à la suite de l’activation de DCIR par un anticorps anti-DCIR,
pourraient être intéressants comme stratégies immunomodulatrices. Ces stratégies pourraient
empêcher la liaison entre le DCIR et le VIH-1. Cela éviterait l’internalisation de DCIR dans les
endosomes et pourrait empêcher l’inhibition de l’activation de TLR8 et de TLR9 et augmenter
le pouvoir de présentation antigénique médiée par d’autres lectines de type C comme le DC-
SIGN. Ceci rejoint la publication de Kanazawa qui a montré que la mutation du résidu tyrosine
du motif ITIM du DCIR par un résidu phénylalanine faisait perdre au DCIR sa fonction de
régulation négative [182]
62
Plusieurs protéines intracellulaires sont impliquées dans la cascade des voies de signalisation
médiées par le DCIR notamment les kinases Src, Syk, Lyn, Hck, PKCα, Erk1/2, p38 et les
phosphatases SHP-1 et SHP-2 comme décrites aux points 1.2.4.5. et 1.2.4.6. Ces protéines
participent à l’infection dépendante du DCIR. Elles peuvent être inhibées et ainsi diminuer la
signalisation par le DCIR et de surcroit empêcher son attachement avec le virus. Le résultat
obtenu avec l’utilisation de l’inhibiteur pharmacologique des tyrosines kinases de la famille Src,
le PP2, a validé l’implication de ces protéines dans la signalisation intracellulaire médiée par le
DCIR (Figure 14, panneau de droite). La transfection des Raji-CD4-DCIR avec des
oligonucléotides anti-sens spécifiques telle que décrite par Lambert [207] a montré une
diminution du transfert du virus aux LTCD4. Ces deux résultats mis ensemble montrent qu’une
approche ciblée contre certaines kinases ou phosphatases impliquées dans la signalisation
médiée par le DCIR pourrait être intéressante. Mais malheureusement, ces protéines sont
aussi impliquées dans beaucoup d’autres voies de signalisations intracellulaires médiées par
l’engagement de plusieurs autres récepteurs. Elles jouent un rôle crucial dans la réponse
cellulaire comme la phagocytose, l’endocytose, la présentation antigénique, l’induction de la
réponse immunitaire et tant d’autres. Il serait donc pertinent de faire une étude approfondie sur
le fonctionnement et le rôle que joue chaque protéine, pour s’assurer si l’inhibition de telle ou
telle protéine n’entraverait pas les réponses fonctionnelles des cellules dendritiques ainsi que
celles d’autres cellules impliquées dans la réponse immunitaire.
5.4. Les antirétroviraux versus les inhibiteurs de DCIR
Il existe actuellement plusieurs antirétroviraux regroupés en 6 classes comme décrits au point
1.4. La majorité de ces molécules ciblent les protéines virales et agissent sur les différents
stades du cycle du VIH-1 dans le LTCD4 afin d’empêcher la réplication et la prolifération du
virus. Les inhibiteurs ayant un effet sur les molécules de la cellule hôte constituent une
minorité parmi les antirétroviraux. Il s’agit notamment de maraviroc, un antagoniste de
récepteur de chimiokine CCR5 et tant d’autres en développement comme l’AMD3100
(antagoniste du CXCR4) [238] et autres antagonistes de CCR5, le vicriviroc [239] et le
cenicriviroc [240]. Avec une combinaison classique de trois à quatre molécules différentes
(HAART : Highly active anti-retroviral therapy), les antirétroviraux permettent de réduire
l’hyperactivation du système immunitaire et contribuent à l’augmentation de l’espérance de vie
63
des personnes infectées par le VIH-1. Mais malheureusement, ce traitement ne permet pas
d’éliminer les réservoirs viraux [241]. Pour espérer éradiquer les réservoirs viraux et restaurer
l’intégrité du système immunitaire, il faudrait sortir le virus de sa latence ou détruire toutes les
cellules en latence virale. Ce qui n’est pas actuellement possible avec les antirétroviraux. En
plus ces médicaments sont principalement virostatiques et n’agissent que sur la réplication
virale dans les LTCD4. Aucun de leurs effets n’est à ce jour connu sur les cellules autres que
les LTCD4. Aussi, outre les antagonistes des récepteurs des chimiokines, ces médicaments
ne présentent aucun effet sur les protéines présentes sur certaines cellules de l’hôte, capables
de lier le VIH-1 comme le DCIR. Ce récepteur facilite la dissémination du virus dans
l’organisme dès les premières étapes de l’infection. Il serait donc important de développer des
nouvelles approches thérapeutiques dirigées contre le VIH-1 en ciblant le DCIR exprimé sur la
cellule dendritique et sur les LTCD4. Ceci pourrait résoudre notamment les problèmes de
résistance due à la survenue des mutations ou de toxicité telle qu’observée chez les
personnes sous antirétroviraux. Cette thérapie agirait au niveau des muqueuses dès la primo-
infection et pourrait limiter sensiblement la propagation du virus via les cellules dendritiques ou
les LTCD4 infectés et apoptotiques. Elle pourrait ainsi prévenir ou limiter la dérégulation du
système immunitaire.
5.5. Le DCIR dans le macrophage
Le macrophage est une cellule myéloïde qui exprime aussi le DCIR presqu’au même titre que
la cellule dendritique. Et il constitue un réservoir du VIH-1 [242]. En présence d’IFN-γ et d’IL-
12, les macrophages adoptent un phénotype qui favorise l’élimination du virus [243]. Donc la
diminution de l’IL-12 pourrait favoriser l’établissement des réservoirs viraux dans les
macrophages; puisque la différenciation des macrophages en M2 (macrophage exprimant
beaucoup de lectines de type C et capable d’assurer le transfert du VIH-1 au LTCD4) [244] en
défaveur de M1 (macrophage non permissif à l’infection par le VIH-1) permettrait la production
du virus et sa propagation dans l’organisme [245, 246]. L’activation de DCIR sur les cellules
dendritiques et les macrophages entrainerait une régulation négative de l’IL-12 médiée par le
TLR8 [120], cependant cette interleukine est requise pour la différenciation des LTCD4 en Th1
et des macrophages en M1. Ceci suggère que le DCIR peut jouer son rôle de régulation
négative aussi bien dans la cellule dendritique qu’indirectement ou directement dans le
64
macrophage. Il serait intéressant d’étudier l’infection par le VIH-1 médiée par le DCIR dans le
macrophage pour voir si l’utilisation des inhibiteurs extracellulaires de DCIR et autres
approches thérapeutiques dirigées contre le DCIR telles que les siRNA, les peptides
phosphorylés ou les oligonucléotides spécifiques aux protéines intracellulaires, pourraient
empêcher l’inhibition de TLR8. Ce qui favoriserait la polarisation des macrophages M1 et
diminuerait la susceptibilité des macrophages à l’infection par le VIH-1.
5.6. Perspectives
Les études réalisées sur ce projet de recherche ont montré que les inhibiteurs testés ont un
effet sur l’activation de DCIR. Cependant, beaucoup restent à faire pour finaliser ce projet.
Ainsi donc, notre étude pourrait être complétée par un certain nombre d’expériences dont voici
quelques-unes. Il serait utile de
poursuivre la caractérisation avec les inhibiteurs extracellulaires non encore testés de
manière à identifier davantage les plus efficaces.
réaliser le test de liaison entre la protéine DCIR et le VIH-1 (Test d’immunocapture).
Ici, il faudrait voir si le DCIR purifié est suffisamment glycosylé pour lier ou non la
gp120 du VIH-1 et ensuite faire le prétraitement de DCIR avec des inhibiteurs avant
son activation avec le VIH-1 puis mesurer l’inhibition de la liaison.
réaliser l’analyse protéomique du DCIR purifié pour vérifier son niveau de
glycosylation, qui est une caractéristique importante pour la liaison des sucres des
pathogènes.
évaluer les réponses fonctionnelles des cellules en présence des inhibiteurs de DCIR
en comparaison avec les inhibiteurs des autres lectines de type C. En effet, notre
étude n’a porté que sur les inhibiteurs de DCIR. Cependant, en dehors de celui-ci, il
existe d’autres lectines de type C capables de lier le VIH-1 et d’assurer son transfert
aux LTCD4 notamment le DC-SIGN et le MMR. Il serait donc nécessaire d’évaluer les
réponses fonctionnelles de la cellule dendritique en inhibant l’une ou l’autre des
lectines de type C ou en inhibant simultanément deux ou plusieurs lectines. Cette
étude permettrait non seulement d’évaluer les réponses fonctionnelles de la cellule
65
dont plusieurs récepteurs sont bloqués, mais aussi de voir l’impact du multi-blocage
des récepteurs sur l’infection par le VIH-1.
évaluer l’impact de l’internalisation de DCIR dans les endosomes, sachant que le
DCIR inhibe la production d’IFN-α induite à la suite de l’activation de TLR9 ainsi que
celle d’IL-12 et de TNF-α médiée par l’activation de TLR8. Il serait donc pertinent de
mettre en place un protocole capable de mesurer la capacité des inhibiteurs
extracellulaires de DCIR à empêcher l’inhibition de l’activation de TLR8 et TLR9. On
peut aussi mesurer cette capacité en utilisant les peptides phosphorylés sur leurs
résidus tyrosine ou thréonine, le siRNA spécifique de DCIR ainsi que des
oligonucléotides spécifiques des protéines intracellulaires impliquées dans la
signalisation médiée par le DCIR.
Enfin, la caractérisation des voies d’activation de DCIR dans les cellules dendritiques
et les LTCD4 Th17 ainsi que les effets des inhibiteurs de DCIR pourront être
poursuivis grâce à ce travail de maitrise.
66
Conclusions
En conclusion, la présente étude a permis de mettre en place un protocole de phosphorylation
de résidu tyrosine générée à la suite de l’activation directe de DCIR par un anti-DCIR dans les
Raji-CD4-DCIR, les cellules dendritiques et dans les LTCD4 Th17. Ces travaux ont également
montré que les inhibiteurs extracellulaires de DCIR étaient capables d’empêcher cette
phosphorylation. En utilisant l’inhibiteur de tyrosine kinase de la famille de Src, nous avons
confirmé l’implication de cette kinase dans la cascade de signalisation médiée par
l’engagement de DCIR. A travers cette étude, nous avons réussi à purifier le DCIR sur colonne
de sépharose activé au CNBr à partir des Raji-DC4-DCIR et nous avons évalué sa pureté par
immunobuvardage. Après l’analyse protéomique évaluant son niveau de glycosylation, elle
pourra être utilisée dans le test d’immunocapture.
Les résultats observés dans cette étude montrent qu’il est possible d’empêcher la liaison entre
le DCIR et le VIH-1 en utilisant des inhibiteurs spécifiques de DCIR. Cependant, d’autres
études telles décrites au point 5.6 sont nécessaires, pour avoir globalement une vision éclairée
sur les effets de ces inhibiteurs sur les réponses fonctionnelles des différents leucocytes
exprimant le DCIR.
67
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