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CONCOURS EXTERNES IT 2014

EPREUVE TECHNIQUE D’ADMISSION Durée : 2 heures Coefficient : 2 CONCOURS N° 43 Corps : Assistant ingénieur BAP : A : Sciences du vivant Emploi-type : Assistant en techniques biologiques Délégation organisatrice : Ile de France Ouest et Nord, Meudon

REMARQUES IMPORTANTES

La calculatrice non programmable est autorisée. Merci de répondre directement sur le sujet et de le joindre à votre copie d’examen.

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Exercice 1 : Etude de protocole en anglais (14 points)

C. elegans embryos staining

Gravid hermaphrodites worms were washed off plates with M9 buffer and collected in 1.5ml

micro-tubes. The worm were then gently pelleted (1200g) and resuspended in 100ul M9

buffer, and treated with 400ul of hypochlorite to obtain the embryos. After several washes in

distilled water (1200g), embryos were incubated with fixative (4% paraformaldehyde,18%

methanol, 3mM EGTA, 64mM KCI, 16mM NaCI, 12mM PIPES pH 7.4) on ice for 20 min

and quickly frozen in liquid nitrogen. After thawing under tap water. The tubes were shaken

at 100rpm at room temperature for 20 min. The embryos were then gently pelleted (1000g) to

remove most of fixative and washed once in Tris-Triton buffer (100mM Tris-HCI pH 7.4, 1%

Triton X-l00, lmM EDTA). After three additional washes (15-30 min each) in PBS-TB (1x

PBS, 1% BSA, 0.5% Tween 20, 1mM EDTA), the embryos were resuspended in PBS-TB and

then incubated at room temperature for 15 min. For staining, embryos were incubated with

primary antibodies (rabbit anti-Actin-Sigma-R506) at 1:l00 dilution in PBS-TB at 4°C

overnight. The next day they were washed three times (15-30 min each) in PBS-TB then

incubated, in the dark, with goat, anti-rabbit secondary antibodies (Jackson Labs-JL302)

coupled with fluorescein isothiocyanate (FITC) at 1:1000 dilution in PBS-TB at room

temperature for 2 hr. After three washes, as previously done (15-30 min each) in PBS-TB,

embryos were gently resuspended in 15ul of NPG mounting solution (2% n-propyl galate,

30mM Tris-HCI pH 9.5, 70% glycerol) containing also 10ng/ml of diamidinophenylindole

(DAPI) for epifluorescence microscopy. A 5ul drop of the stained embryos was then spotted

on a poly-lysine coated slide and overlayed with a 43mmX32mm coverslip. The coversplip

was then sealed with transparent nail polish and stored at 4°C until observation.

A. A partir du protocole ci-dessus, listez (en français) 2 appareils (équipements) et 6

consommables dont vous aurez besoin pour réaliser l’expérience.

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B. Donnez un exemple de réactif utilisé pour chacune des catégories suivantes.

Tampon :………………………………………………………………………………………...

Chélateur d’ions :………………………………………………………………………………..

Fixateur : ………………………………………………………………………………………..

Détergent : ………………………..……………………………………………………………..

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C. Décrivez brièvement (en français) le but de cette expérience.

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D. Traduisez en français cet extrait du protocole.

“The tubes were shaken at 100rpm at room temperature for 20 min. The embryos were

then gently pelleted (1000g) to remove most of fixative and washed once in Tris-Triton

buffer (100mM Tris-HCI pH 7.4, 1% Triton X-l00, lmM EDTA). After three additional

washes (15-30 min each) in PBS-TB (1x PBS, 1% BSA, 0.5% Tween 20, 1mM EDTA),

the embryos were resuspended in PBS-TB and then incubated at room temperature for 15

min.”

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D.E. A quoi servent :

- le DAPI :…….……………………………………………………………………………..

- la BSA :……………………………………..……………………….. ……………………

- la fluorescein isothiocyanate (FITC) :……………………………………………………..

- la poly-lysine:.……………………………………………………………………………..

E.F. A quoi sert un anticorps secondaire ?

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F.G. Donnez deux exemples de techniques courantes de laboratoire faisant appel à

des anticorps secondaires?

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Exercice 2 (3 points)

Pour chaque question, entourez la bonne réponse.

A. Une mutation dans le génome mitochondrial peut-elle être transmise :

• de la mère à son fils ?

a) OUI

b) NON

• de la mère à sa fille ?

a) OUI

b) NON

• du père à son fils ?

a) OUI

b) NON

• du père à sa fille?

a) OUI

b) NON

B. Quel est l’ordre de grandeur de longueur du nématode C. elegans adulte ?

a) le µm

b) le mm

c) le cm

d) le m

C. Quel est le nombre approximatif de cellules somatiques constituant un nématode C.

elegans adulte ?

De l’ordre de :

a) 10 cellules

b) 1000 cellules

c) 1000000 cellules

D. De quoi nourrit-on les nématodes C. elegans au laboratoire?

a) De milieu gélosé NGM

b) De levures

c) De micro-algues

d) De bactéries

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Exercice 3 (2,5 points)

Parmi les activités suivantes, lesquelles vous semblent du ressort d’un AI ? Entourez la ou les

bonne(s) réponse(s).

a) Rédiger des demandes de financement.

b) Rendre compte à son supérieur hiérarchique.

c) Initier des collaborations avec d’autres équipes.

d) Mettre au point la culture cellulaire chez C. elegans.

e) Participer aux réunions d’équipes.

f) Proposer des collaborations avec d’autres équipes.

g) Faire réaliser des devis et passer des commandes.

h) Superviser des étudiants en thèse.


Détaillez en 5 lignes maximum, le rôle du cahier de manipulation (cahier de laboratoire).

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A. Associez les pictogrammes qui suivent à leur signification.

1- Toxique

2- Nocif ou irritant

3- Corrosif

4- Matière radioactive

5- Explosif

6- Comburant

7- Inflammable

8- Dangereux pour l’environnement

9- Risque biologique

A = _____ B=_____ C=_____ D=_____

E=_____ F=______ G=_____

B. Citez trois équipements de protection individuelle à utiliser lors de la manipulation

d'azote liquide.

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C. Vous devez stériliser une solution de PBS 10X. Quels moyens pouvez-vous employer

parmi les suivants ? Entourez la ou les bonne(s) réponse(s).

a) Un filtre 0,45µm.

b) Autoclave.

c) Des ultra-sons.

d) Un filtre 0,22µm.

e) Une solution d’eau de javel à 9%.

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Expliquez les avantages et les limites de l’observation d’échantillons fluorescents vivants ou

fixés.

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Vous devez observer une protéine nucléaire fusionnée à l’EGFP dans un embryon de C.

elegans en microscopie photonique.

A. Quelle est la longueur d’onde d’excitation optimale de cette protéine selon les spectres

ci-dessous (à 25nm près) ?

_____________nm

B. A quelle longueur d’onde attendez-vous le plus fort signal émis selon les spectres ci-

dessous (à 25nm près) ?

_____________nm

Mis en forme : Police :(Par défaut)Times New Roman



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C. Sur un échantillon biologique fixé, on souhaite détecter conjointement une protéine A

et une protéine B. On dispose de deux anticorps dirigés contre A, réalisés par

immunisation soit d’une chèvre soit d'un poulet, et de deux anticorps dirigés contre la

protéine B, réalisés par immunisation soit d'une souris soit d'un lapin. Plusieurs

anticorps secondaires couplés à différents fluorophores sont disponibles: anti-poulet

couplé aux alexas 350 ou 488, anti-chèvre couplé aux alexas 650 ou 555, anti-souris

couplé au FITC ou CY2, anti-lapin couplé à l'alexa 594 ou à la CY3. Déterminez la

meilleure combinaison permettant de visualiser les deux protéines en minimisant la

superposition spectrale parmi les choix suivants. Entourez la bonne réponse.

a) anti-A (poulet)/anti-poulet Alexa 488 et anti-B (souris)/anti-souris FITC

b) anti-A (chèvre)/anti-poulet Alexa 350 et anti-B (souris)/anti-souris CY2

c) anti-A (poulet)/anti-poulet Alexa 488 et anti-B (lapin)/anti-lapin CY3

d) anti-A (chèvre)/anti-chèvre Alexa 650 et anti-B (souris)/anti-lapin Alexa 594

e) anti-A (chèvre)/anti-chèvre Alexa 555 et anti-B (lapin)/anti-lapin CY3

f) anti-A (poulet)/anti-poulet Alexa 488 et anti-B (souris)/anti-souris CY2

Tableau récapitulatif des spectres des fluorophores

Fluorophore Couleur Maximum d’absorption (nm)

Maximum d’émission (nm)

Alexa 350 Bleu 346 442

Alexa 488 Cyan-vert 495 519

Alexa 555 Jaune-vert 555 565

Alexa 594 Orange-rouge 590 617

Alexa 650 Rouge 650 665

FITC Cyan-vert 495 521

CY2 Cyan-vert 492 510

CY3 Jaune-vert 550 570

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Vous croisez deux animaux hétérozygotes A/a.

A. Parmi ces propositions, quels sont les génotypes attendus des descendants et dans

quelle proportion ? Entourez la ou les bonne(s) réponse(s).

a) A/A 1/3

b) A/a 1/3

c) a/a 1/3

d) A/A 1/4

e) A/a 1/4

f) a/a 1/4

g) A/a 1/2

B. Vous obtenez les proportions suivantes :

A/a 2/ 3

A/A 1/3

Qu’en déduisez-vous ?

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Vous devez préparer 1 litre d'une solution de PBS dont la composition est :

Na2HPO4 4,3 mM

KH2PO4 1,4mM

KCl 2,7mM

NaCl 1,37mM

Vous disposez d’une solution de Na2HPO4 0,5M, une solution de KH2PO4 0,5M, de NaCl en

poudre (MM= 58,44g) et de KCl en poudre (MM= 74,55g). Décrivez la procédure et les

calculs.

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Vous devez cloner un fragment d'ADN (correspondant à un gène de 5kb) dans un vecteur

pour permettre son expression chez C. elegans en fusion avec la GFP.

A. Vous commencez par l'obtention du fragment par PCR.

Décrivez le principe de la PCR et expliquez en quelques phrases a quoi servent les différentes

étapes. Donner un exemple de programme PCR avec les températures et la durée de chacune

d’entre elles en les justifiant.

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B. Au moment de préparer votre mix de réaction PCR, vous constatez que le tube de Taq

polymérase a disparu du congélateur.

Classez les actions qui vous paraissent pertinentes par ordre de priorité.

N°…. : Je vérifie qu'elle a été recommandée

N°…. : Je la commande

N°…. : Je vérifie si elle est déjà utilisée par quelqu’un d’autre

N°…. : J'avertis mon chef

N°…. : Je laisse l'expérience de cote en attendant la commande

N°…. : Je demande aux voisins de labo de me dépanner

Mis en forme : Police :11 pt,Couleur de police : Noir, Français(France), Bordure : : (Pas debordure)


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C. Après la réaction de PCR, l'analyse de l'échantillon par électrophorèse sur gel

d'agarose montre qu'il n'y a aucune bande visible dans la piste correspondant au

produit de PCR.

Donnez 5 hypothèses pouvant expliquer ce résultat.

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D. Vous êtes parvenu à amplifier le fragment d’ADN, vous voulez maintenant le cloner

dans un vecteur en fusion avec la GFP.

Quelles sont les étapes à réaliser et dans quel ordre.

N°…. : Je purifie le fragment de PCR

N°…. : Je fais agir la ligase sur mes deux fragments

N°…. : Je déphosphoryle le fragment de PCR

N°…. : Je déphosphoryle le vecteur

N°…. : Je linéarise le vecteur par les endonucleases X et Y coupant dans le site de clonage

N°…. : Je vérifie le clonage par digestion enzymatique après purification de l'ADN

plasmidique des clones bactériens

N°…. : Je transforme des bactéries compétentes avec le produit de la ligation

N°…. : Je vérifie l’efficacité de la ligation en faisant migrer le mélange de réaction sur un gel

d'agarose

N°…. : Je digère le fragment PCR par les endonucleases X et Y coupant des séquences

introduites par chacune des deux amorces

B.E. Citez deux méthodes qui vous permettront de vérifier que votre fragment PCR

est inséré dans le vecteur.

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F. Le vecteur que vous avez construit doit permettre l’expression de la protéine d’intérêt

fusionnée à la GFP dans tous les tissus de C. elegans adulte.

Avant de commencer la transgénèse, quelle vérification supplémentaire faites-vous sur le

nouveau vecteur ?

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G. Ce vecteur est injecté dans des vers pour obtenir des animaux transgéniques exprimant

la fusion.

Après transgénèse, comment pouvez-vous vérifier l'expression de la protéine d'intérêt?

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Exercice 11 (2,5 points)

A quoi sert l’ARN dans la technique dite du RNAi? Entourez la ou les bonne(s) réponse(s).

a) C'est un ARN particulier qui permet de synthétiser des protéines

b) C'est un ARN interférent qui permet l'extinction de l'expression d'un gène

c) C'est un morceau d'un ARN entier (incomplet) qui ne fera que la moitié de la fonction.

d) C’est un ARN de séquence inversée permettant de bloquer la traduction d’un ARN

endogène.







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