Contribution a l’étude du microdosage du calcium dans le serum sanguin

C O N T R I B U T I O N A L'I~TUDE DU M I C R O D O S A G E DU

CALCIUM DANS LE SERUM SANGUIN.

Par

P. WENGER, CH. CIMERMAN et P. BORGEAUD.

Laboratoiro do Chimie Analytique de l'Universit6 do Gen~ve.

(Eingelangt am 21. Juli 1933.)

INTRODUCTION.

Lorsqu'on fail l'~tude bibliographique complete 1 des m6thodes de dosage du calcium dans le s~rum sanguin, on constate que celles-ci existent en tr~s grand nombre et qu'on peut les cl~sser, d'apr~s le principe sur lesquelles elles reposent en:

A. M6thodes colorim@triques. B. M~thodes n6ph61om6triques. C. M6thodes volum6triques. D. M6thodes gravim6triques.

Parmi ces proc6d6s, c'est le dosage volum6trique, avee pr@cipita- lion pr6alable du calcium eomme oxalate, qui est le plus important et le plus 6tudi6.

La plupart des auteurs, apr~s avoir pr~cipit@ le calcium comme oxalate, lavent le pr6cipit6, le dissolvent duns l'acide sulfurique et t i trent l'acide oxalique ainsi lib~r6, par le permanganate de potassium. Sur certains points cependant, les auteurs ne sont pas d'accord, leurs opinions sont mSme parfois coatradictoires. C'est pourquoi, il nous a sembl6 int6ressant do reprendre, au point de rue exp6rimental, les diff6rents facteurs qui peuvent influncer l'exaetitude du dosage.

Nous proc~derons donc ~ une 6rude critique de cette m6thode el,

Cette @rude fer~ l'ob~e~ d'un m6moire s6par6.

142 P. Wenger, Ch. Cimermaa et P. Borgeaud:

d'autre part, nous ~tudierons les m~thodes gravim~triques dent nous monfrerons l'application au dosage du calcium dans le s~rum sanguin.

[. Etude critique des m~thodes volumdtriques manganimSt'~*ique~ h l'oxalate.

Les diff~rents facteurs que nous allons successivement ~tudier sent:

1. lu temperature et les conditions du virage, 2. la centrifugation et la filtration, 3. reau de lavage, 4. le pit de la solution lors de la precipitation, 5. l'influence du rouge de m4thyle, 6. la min~ralisation ~ la flamme nue et au four ~lectrique, 7. la precipitation directe.

Principe de la m~thode ~ l'oxalate: Le calcium est pr~cipit6 comme oxalate, celui-ci est dissous darts l'acide sulfurique et l 'acide oxalique ainsi lib~r~ est titr~ par le permanganate de potassium.

Toute ~tude critique devant commencer par un dosage sur une solution de titre connu, nous avons tout d'abord prSpard une solution titr~e de chlorure de calcium: 10 gr. de chlorure de calcium puriss ont 6t6 dissous dans 1 litre d'eau distill~e. Le calcium corn tenu dans la solution ainsi obtenue a 4t~ dos6 par une prise de 20 cc. soit volum~triquement, soit gravim~triquement. Par dilution de cette solution, nous avons obtenu une concentration en calcium voisine de celle du s~rum sanguin humain, soit environ 100 mgr./lit.

Nous savons que, pour le titrage, on emploie une solution de permanganate centi~me normale, nous l'avons pr~par~e par dilution de la solution dixi~me normale, celle-ci ayant ~t~ titr~e par l 'oxalate de sodium.

Etude des faeteurs.

Pour cette ~tude, nous avons proc~t~ comme suit: ~ 2 cc. de lmtre solution titr~e de calcium, contenant 0,2 mgr., nous averts ajout~ ~ l'~bullition 0,5 cc. d'oxalate d'ammonium en solution sa- furze. Apr~s tree heure nous avons filtr~ avec un micro-filtre d'amiante, puis lav~ avec 4 cc. d'eau distill~e, dissous dans de l'acide

Contribution ~. l'dtude du microdosag~ du calcium dam~ le serum sanguin. 143

sulfurique au cinqui~me et titr6 ~ chaud par une solution centidme normale de permanganate de potassium.

1. Temperature de virage. Les diffdrents auteurs ne donnent pas teujours des indications prdcises concernant la tempdrature choisie pour le t i trage et le temps pendant lequel la coloration rose doit persister pour que le virage soit considdrd comme exact. Nous avons fait une sdrie d'essais sur la solution titrde de chlorure de calcium dont 1 cc. contient 0,1 mgr. de calcium. Le t i t rage an moyen de la solution de permanganate centibme normale a dtd effectud '~ 60 °, 700 et 80 °, la solution dtant portde 1 minute au bain-marie aprbs la premibre coloration rose.

I1 n'y a pas grande diff6rence entre ]es rdsultats des essais titrds ~. 600 et h 70 °, tandis qu'~ 80 °, la premibre coloration ne persiste pas 1 minute au bain-marie; si l'on ajoute alors ]e permanganate jusqu'h rose persistant, on obtient des r~sultats qui se rapprochent de ceux trouvds ~ 60 °, 70°; cette constatation nous a amend h examiner s'il n'y aurait pas 1~ une destruction du permanganate par la chaleur, la solution dtant trbs dilude (N, 100).

Nous avons constatd que ce n'dtait pas le cas.

La tempdrature adoptde pour les essais subsdquents a 6t6 celle de 70 °, ]a premiere coleration rose persistant 1 minute au bain- marie ~ 70°; ceci pour une raison d'ordre pratique, l 'exactitude dtant ~ peu de chose prbs la re@me ~t 60 °, 700 et ~ 80 °, ~ savoir qu'h 60 °, la solution se refroidit trop vite pendant le titrage, et; qu'~ 80 °, la premibre coloration rose ne persiste pas.

Dans le cas du dosage du calcium par prdcipitation directe dans le s6rum, neus avons rdduit la persistance de la coloration ~t 30 se- cendes, ceci en raison des matibres organiques qui adherent g6nd- ralement au pr6cipit6 et qui rdduisent le permanganate.

2. Centrifugation et filtratiou. Plusieurs auteurs signalent le fair que le prdcipitd d'oxalate de calcium grimpe le long des pa- rois du tube ~ centrifuger au cours des diffdrents lavages 2.

C'est pourquoi nous avons essayd de substituer la filtration fi la centrifugation, pensant dviter ainsi une cause d'erreur. A cet

BLIJI~DORN-GENcK, Biochem. Ztschr., 135, 581 (1923); ffOI~KERs-REvERS Ztschr. physiol. Chem., 144, 181 (1925); BIGWOOD-RoosT, Bull. soc. chim. biol., 13, 1214 (1931).

144 P. Wenger, Ch. Cimerman et P. Borgeaud:

offer, nous avons utilis~ des << baguettes >> microfiltrantes (Fil ter- stiibchen): l'une en porcelaine d ~ employee par VID~A~X et VAHLQUIST ~ pour le dosage du calcium dans le sang et los t issus; l'autre en verre garnie d'amiante non encore utilis~e jusqu'ici pour le dosage du calcium dans le s6rum.

Emploi du microfiltre de porcelaine. 4

Ce microfiltre est compos6 d'une tige de porcelaine de 5 cm. environ; ~ une extremitY, il s'6vase et forme une surface filtrante circulaire en porcelaine poreuse (fournisseur: Staatliche Por- zellan-Manufaktur, Berlin). L'appareil ~ filtrer se compose d'un tube en U ~troit reli~ d'un c5t6 au microfiltre, au moyen d'un pet i t tuyau en caoutchouc, et de l 'autre h une ~prouvette munie d'une

Fig. 1. Appareil "~ filtrer.

tubulure lat6rale par laquelle on fait le vide avec une trompe eau; dans cette ~prouvette, on peut placer un r~cipient plus petit , soit pour le contrSle des eaux de lavage, soit pour recueillir le filtrat en vue du dosage du magnesium.

La precipitation, la filtration et le t i t rage se font dans le m6me ¢ microbecher >> (dim.: hauteur 4 cm., diam~tre 1,5 cm.)

I1 a 'y a done aucun transvasage.

s VID~RK-VAn~QUIST, Bioch. Ztschr., 230, 245 (1931). E. $¢HWARz-BER(;KAMPF, Ztschr. anal~. Chem., 69, 327 (1926).

Contr ibut ion a l '4tude du microdosage du calcium dana 1o serum sanguin .

Voici les rdsult.ats obt.enus:

Pr ise

2cc. sol. dilude en CaC1._,

145

Valeur th~oriquc Valeur t rouv~e cal-

en calcium cul~e en calcium

100 mgr. / l i t . 102 mgr./ l i t .

102 ~,

Pris(, Valeur th~orique Valeur t rouv~e calcul~e

en calcium ea calcium

~aCO.~ s6eh6 k poids cons tan t

0.58 mgr. 0 232 mgr. 0.2305 mgr.

0.48 ), 0.192 , 0.195 ,

0.49 )~ 0 1 9 6 • 0 2 0 0

0.49 ~. 0 1 9 6 ~, 0 2 0 0 0,49 ~, 0,196 ,~ 0,200

L'erreur absolue est comprise ent.re 0 et. 2!g.

Le ti trage est un peu ddlicat, par le fait. que le pr~cipit6 d'oxalate de calcium ne se dissout pas ent.i~rement dans l'acide sulfurique si l'on ne souffle pas darts la tige du filtre ver.s la fin du titrage. Des cssais ont 6t.6 fait.s sans souffler dans le tilt.re et. les rdsul~afs trouv6s.ont 6t6 t.rop faibles. Cet.te mani~re de proc~der est done n6cessaire, et l'on est. parfois oblig~ de souffler k plusieurs re- prises dans la tige du filtre ]usqu'h ce qu'il ne se produise plus de d6coloration dans la solut.ion. Le flit.re serf comme agit.at.eur. Pour le dosage du calcium par pr6cipit.ation direcfe dans le sSrum. ce tilt.re esf tr~s appropri6, ear la tilt.ration se fa i r assez rapidement.

Voici les r6sultats obtenus sur deux s6rums diff6rents:

s~rum A. P r i se I c c . 98,30 mgr . lit.

96,10 ~ ,, s~rum B. Pr i se 2cc . 104 ~ ,,

103 •

La concordance est. done saUsfaisante (1 ~ 27o).

Emploi du microfiltre de verre ~ (amiante).

Celui-ci comprend une tige de verre de 8 cm. de long qui se r~trgcit puis s'~vase ~ une extremitY; cet espace ~largi est rempli

"~ H'~USLER, Ztschr . ana ly t . Chem., 64, 362 (1924).

lO

146 P. Wenger, Ch. Cimermaa et P. Borgeaud:

d'amiante. Celle-ci dolt 5tre purifi6e: dans ce but, on la f a r dig6rer au bain-marie avec de ]'acide nitrique concentr6; au bout de quelques heures, on filtre sur un entonnoir en poreelaine et lave ~ l 'eau bouillante jusqu'~t 61imination de l'ion nitrique. L'amiante est s6ch6e ~ l'~tuve ~ 100 ° et eonserv6e dans un flacon boucM. L'appareil £ filtrer est identique ~ celui que nous avons d~erit h propos du filtre de porcelainc.

Fig. 2. Microfiltre de verre.

Voici quelques r6sultats obtenus avec le filtre de. verre:

Prise Valeur tMorique Valeur trouv~e calcul~e

en calcium en calcium

2cc. sol. dilute CaCl.- 100mgr./ l i t . 100 mgr./l i t . 100,9 ~ ,

99,1 ~ ,,

100,9 . ,-"

98,2 ,,. .

101,8 ,, -

On voit que l'erreur est sensiblement la m~me qu'avec le filtre de porcelaine.

Pour la pr6eipitation directe du calcium, dans le s~rum, ce filtre est moins pratique que le precedent; m~me si l'on a soin de diluer le s~rum, la filtration est parfois extr~mement lente. Par contre, la fin du titrage est plus nette, route l'amiante doit 6tre souffl4e dans le becher et la premiere coloration rose est facile ~ saisir; en faisant des essais ~ blanc (qui consistent ~ mettre dans le microbecher 5 cc. d'eau distill~e, 0,5 cc. d'acide sulfurique con- eentr6 et un peu d'amiante, et ~ t i trer ~ chaud par le permanga-

C o n t r i b u t i o n ~ l ' d t ude d u microdo,~age d u c a l c i u m d a n s le s e r u m s a n g u i n . 147

nate), nous avons constat~ qu'il faut d~duire 0,01cc. au volume de permanganate trouv~; ceci est probablement d~t ~t une absorp- i,ion de la coloration par l 'amiante plutSt qu'~ une action r@ductrice de celle-ci sur le permanganate. Voici quelques dosages op~r6s h, double sur des s6rums en utilisant ce filtre:

S@rum A 9 9 , 3 m g r . / l i t . S@rum B 1 0 4 m g r . / l i t .

98 )~ ~ 1 0 2 . .

S@rum C 97 ,, ~ S@rum D 9 6 2 ~

1 0 0 ,) . 96 ,2 . .

L'erreur varie de 0 k 3% quand la prise est de 2 ce. Sur 1 cc., le dosage est forc6ment moins exact. Autant que possible, nous avons tou~ours fair dosages k double et sur 2 cc. de s6rum.

Pour compl6ter cette 6rude, nous avons proc6d6 ~ un dosage comparatiT sur le m~me s~rum, par precipitation directe e~, e~- ployant des filtres diffdrents:

filtre d'amiante: 95 mgr./lit. filtre de porcelaine: 94 >> >>

La concordance est donc satisfaisante. Enfin, nous avons effectu6 des dosages comparati]s .~ur le mdme

sdrum, par mindralisation, en centri~ugeant une ]ois et en filtrant l'autre ~ois:

par centrifugation 100,6 mgr./lit. par filtration 102,0 >) >>

(filtre d'amiante)

Ici aussi, la concordance est bonne.

Conclusion: Nous pr6f6rons la filtration ~ la centrifugation, d'abord parce qu'elle 61imine la possibilit6 d'une perte en calcium lors du siphonage, puis parce que nous pensons qu'avec la m@me quantit6 d'eau de lavage, t'@limination de l 'oxalate d'ammonium en exc~s se fair mieux; enfin, et cette raison est d'ordre purement pratique, parce que la filtration et le lavage ne demandent aucune surveillance, avantage qui n'est pas ~ n6gliger. La filtration et le lavage prennent environ un quart d'heure. I1 est 6vident que, pour des dosages en s6rie, la centrifugation est un peu plus .rapide, I,uisqu'on peut centrifuger g6n6ralement plusieurs tubes ~ la lois.

1o*

]48 P. Wenger, Ch. Cimerman et P. Borgeuud:

3. Eau de lavage. Nous rappelons que les eaux de lav~ge em- ployees sont: l'eau distill~e, l 'ammoniaque 5, 2To, l'alcool-4ther, une solution satur~e d'oxalate de calcium.

En operant sur la solution titr~e de chlorure de calcium, les r4sultats ont ~t~ sensiblement les m~mes en lavant, soit avec 6 cc. d'eau distill4e, soit avee 6 cc. d'ammoniaque 5, 2TO (erreur de 0 5, ~ ) . L'eau de lavage est ajout4e par portions de 2 cc. et l'4coule- ment doit se faire goutte 5, goutte, une filtration trop rapide en- trainant un lavage incomplet. Le lavage du pr~cipit~ d 'oxalate de calcium est des plus importants; comme le dit MESTREZAT ~, il vaut mieux laver 5, fond le pr4cipit6 et faire une correction de solubHit4 si cela est n4cessaire. L'ion oxalique a 4t4 recherch4 dans les eaux de lavage au moyen du nitrate d'aregnt, ceci pour le lavage 5, l 'eau distill4e; aprbs 6 cc. il n'y a plus de pr4cipit6 d'oxalate d'argent. et-les r4sultats sent satisfaisan,ts. Ceux-ci variant en g4n4ral de 0 5, 2To en trop, nous n'avons pas ~ug4 n4cessaire d'apporter une correction de solubilitY.

Cependant, lors de la precipitation directe du calcium dans le s4rum, l'ammoniaque 5, 2 To est pr4f4rable 5, l'eau, car e l lea l 'avan- rage de dissoudre, partiellement du moins, les impuret~s organiques qui adhbrent au pr4ciplt4 d'oxalate de calcium.

Nous avons essay4 d'employer l'eau de lavage pr4conis4e par VELnuz-DESCHASEAUX T, c'est-5,-dire un m41ange d'eau-alcool-~ther, puis d'alcool-4ther et enfin le dernier lavage se fair 5. l'~ther seul.

Soit avec le filtre de porcelaine, soit avec ]e filtre d'am.iante, les r6sultats obtenus ont 4t6 beaucoup trop forts. Bien que le microbecher et le filtre aient 4t4 mis au bain-marie bouillant pendant un quart d'heure, il a dfi rester de l'4ther non 4vapor~ qui r4duit fortement le permanganate; nous avons constat4 que 2 cc. d'~ther, en solution sulfurique, r4duisent 5,3 cc. de permanganate N.100. Ce mode de lavage 5, l'alcool-4ther n'est donc pas applicable au cas qui nous int~resse.

Une autre tentative a 4t4 faite avec une solution satur4e d'oxmlate

6 MESTREZAT, Bull. soc. biol., 5, 263 (1923). 7 VELLuz-DEscHAsEAuX, Bull. soc. chin. biol., 1~, 797 (1931); C. R. soc.

biol., 104, 976 (1930).

Contribution a l'~tude du mierodosag~ du calcium dans le serum sanguin. 149

de calcium s. TMoriquement, c'est l'eau de lavage id~ale par le fai~ que, d'une part, il n'y a aucune perte £ craindre par solubilit~ du pr~cipit~ dans sa solution satur~e et, d'autre part, le volume de solution restant apr~s le dernier ]avage n'4tant qu'une fraction de ec., son action sur le permanganate est ndgligeable. Pratiquement, nous avons obtenu des r~sultats environ 10% trop forts, en tra-- vaillant sur la solution titr6e de calcium. Dans nos essais subsdquents, nous avons adopt~ eomme eau de lavage l'ammoniaque b, 2% pour les raisons d~jk indiqu~es.

4. PH de la solution ldrs de la precipitation de l'oxalate de calcium 9. Cette ~tude a ~t~ faite sur une solution di[e << s~rum artificiel >> pr~par~e par GUILLAUMIN l° et contenant dans un litre d'eau distill~e:

NaC1 8,6 gr. MgS0, 0,25 gr. K..,SO~ 0,46 >> (NK0.,HPO, 0,15 >> CaCQ 0,25 >>

1 cc. de cette solution contient 0,1 mgr. de calcium. Nous avons effectu~ une s~rie de dosages avec une prise de 2 co.

de s~rum artificiel en op6rant £ des pH diffdrents, con tr616s par l'indicateur universeI de MERCK.

Entre les pi t 4 et 8,5, les diff6rences sont minimes; l'influence du pI-[ est done faible; dans nos essais subs6quents, nous avons adopt~ le pH 5 pour la precipitation de l 'oxalate de calcium; c'est la zone de virage du rouge de m6thyle.

5. Influence du rouge de m~thyle. Afin de savoir si o u i o u nvn le rouge de m~thyle avait une influence perturbatrice sur le dosage du calcium, nous avons fait plusieurs essais sur la so]ution titr~e de chlorure de calcium; dans les uns, le calcium a ~t~ directement pr6cipit6 par l 'oxalate d'ammonium., dans les autres, nous avons pr6alablement a.]out~ une goutte d'une solution alcoolique de rouge de m~thyle. Les rgsultats ont 6t6 identiques (~ l ~ p r b s ) , si bien que nous en avons conclu que le rouge de m~thyle n'influen~ait

8 PANToN-MARRACK, Clinical Pathology, p. 123. ~ TWF.]~DY-Kocl~, C., 1@29, II, 1189. - - S T A N F O l l D - W t t F ~ A T L E Y , Biochem. Journ., 19, 710 (1925). - - K~RK- SCIt~IDT, Journ. Biol• Chem•, 83, 311 (1929).

SI~OHL, Journ. Biol. Chem., 50, 527 (1922). ~ GUILLAUMIN, Journal reed., 14, 402 (1925).


pas le dosage et pouvait ~tre employ6 sans risquer d'introduire une cause d'erreur.

6. Mindralisatiou it la flamme nue et au ]our dlectrique. Ben hombre d'auteurs font pr~c~ler le dosage du calcium dans le sdrum ,t'une mindralisation, c'est-~-dire qu'avant de pr6cipiter le calcium, i]s 6vaporent le s6rum £ sec, le calcinent ~ haute temp6rature pour d~truire compl~tement les mati~res organiques et n'obtenir qu'un r6sidu de cendres blanches; selon eux, c'est m~me le seul procdd6 tout ~ fair rigoureux pour avoir un ben dosage de calcium t o t a l

Nous allons maintenant examiner deux modes de min~ralisation:

a) Mindralisation au ~our dlectrique.

2 co. de s~rum sent 6vapor6s k see au bain-marie dans une capsule de ptatine, puis chauff~s graduellement au four 61ectrique. Vers "~00 ̀~, le r6sidu noir se boursoufie, au bout d ' l heure la temp6ra- lure monte k 450 °, la structure du r~sidu est alors tr~s fine; mais ce n'est qu'k 700 e, au bout d'une heure vingt, que la destruction est complete et que les cendres sent blanches. Nous avons essay~ de laisser le s6rum plusieurs heures k 5000 (temp6rature indiqu6e par BIGWOOD-:ROOST 11, mais sans parvenir ~ une min6ralisation complete.

Technique de dosage employee: les cendres blanches sent humec- f6es de deux gouttes d'acide chlorhydrique concentr6, puis de 2 3 cc. d'eau distill6e; on transvase dans un microbecher en ayant soin de bien rincer la capsule de platine. Apr~s addition d'une goutte de rouge de m6thyle, on a]oute de l'ammoniaque concentr6 .~usqu'au virage, puis de l'acide ac~tique ]usqu'~ coloration rose p~le; on met lo C microbecher>> quelques minutes au bain-marie bouillant et on laisse tomber goutte ~ goutte 0,5 cc. d'une solution satur6e d'oxalate d'ammonium (ceei pour une prise de s6rum de 2 cc.). Apr~s avoir laiss6 reposer une heure, on filtre (ces essais- 1~ ont 6t6 fairs avec le filtre d'amiante), on lave avec 6 ec. d'ammoniaque k 2To, on dissout darts l'acide sulfurique et on t i t re par le permanganate N/100.

" BIOWOOD-RoosT, Bull. see. chim. biol., 18, 1214 (1931).

Contribution a l'~tude du microdos~go du calcium d~ns le serum sunguin. 151

b) Min~ralisation ~t la flamme nue.

On ~vapore ~ sec 2 cc. de s~rum au bain-marie, puis on calcine au d6but sur une toute petite fiamme; peu ~ peu le r~sidu se car- bonise, prend feu parfois, ce qu'il faut ~viter autant que possible en chauffant tr~s graduellement. Au bout de 5 minutes, on peut calciner plus fortement et ]a minSralisation ne s'effectue compl~tement que sur la grande flamme d'un bec T~clu. Le tout dure 10 minutes ~ un quart d'heure. L~ suite de la. m~thode est identique l~ pr~c~dente.

Des essais de dosage de calcium, dans le s~rum, avec mindra- lisatioa pr~alable au four ~lectrique, nous ont montr6 que pour obtenir des r~sultats corrects, il faut porter la temperature ~ 900 °. A 500 °, la temperature n'est pas suffisamment 51ev6e pour une min~ralisation complete. Entre 7000 et 900 °, bien que la min~ralisation soit complete, on trouve des r~sultats faibles et discordants.

Par min~ralisation ~ la flamme hUe, par contre, les essais de dosage de calcium ont donn~ de bons r6sultats.

L~ calcination £ la flamme nue, de beaucoup la plus simple, est celle que nous avons adoptde pour la suite de nos essais. Ce mode de calcination est tout aussi rapide que la destruction nitro-per- chlorique de GUILLAUMIN 12 e t a l 'avantage de ne pas introduire de calcium dans l'analyse. Nous n'avons pas constat~, comme le font certains auteurs, qu'il ffit difficile d'obtenir des cendres exemptes de charbon. Cependant, dans eertains cas, la destruction des mati~res organiques est plus lente, par exemple pour les s~rums riches en pigments biliaires (ict~res, etc.).

7. Precipitation directe. R~sum~ de la m~thode: La prise est de 2 cc. de s6rum frais que l'on dilue ~ 4 cc. avec de l'eau distill~e: on pr~cipite le calcium comme oxalate, on laisse reposer 1/2 ~ 12 sulfurique ~ 20~o et on t i t re avec du permanganate de potassium N[100 ~ 700 (coloration persistant 30 mirutes au bain-marie ~ 70°).

Bien que moins precise, la precipitation directe du calcium

1: GUILL.~.UMIN, Bull. soc. chim. biol., 12, 1269 (1930).

152 P. W e n g e r , Ch. C i m e r m a a e t P. B o r g e a u d :

comme oxalate dans le s6rum sanguin est g6n6ralement adol)t~e pour les dosages courants ~3.

La duroc de contact entre le pr6cipit6 l'oxalate de calcium et la solution n'est pas bien d4termin~e. Certains auteurs centrifugent au bout d'une demi-heure, d'autres seulement apr~s douze heures. Quelques essais sur divers s~rums nous ont donn6 les r6sultats suivants"

Sgrum D fil tr~ au bou t d ' I h e u r e 109 mgr . / l i t .

,, ,, ,, ,, de 12 h e u r e s 111 ~

Sdrum E , ~, ," , 3 ,, 90

S~rum P , ,.. - ,, 2 , 98 ,, *

Les differences, peu sensibles, sont de l'ordre de grandeur des erreurs d'exp~riences.

Nous avons adopt~ douze heures comme dur6e de precipitation. Avant d'ajouter l 'oxalate d'ammonium, il est bon de diluer le s& rum avee le m~me volume d'eau distill~e, la viscosit~ diminuant ainsi, la vitesse de prdcipitation augmente.

Une autre question se pose, celle de savoir si tout le calcium est bien pr~cipit~ par l'oxalate d'ammonium au sein m~me du s6- rum; les diff~rents auteurs ne sont pas d'accord sur ce point.

Nous avons recherch6 le calcium dans le filtrat de la precipitation directe en le min~ralisant.

C a l c i u m re t rouv~ d a n a le t i l t r a t

S4rum fil tr~ apr~s 54 d ' h e u r e : 6 8 mgr . / l i t .

,~ ~ ~ ~ h e u r e : 8,16 ~

~ • 12 h e u r e s : 6 8 ~ ~,

. . . . 16 * 9,5 *

La precipitation directe dans le s~rum n'est donc pas complete, mSme apr~s 12 ou 16 heures.

Pour terminer, nous avons fair des dosages comparatifs operant sur une prise par min~ralisation, sur l 'autre par precipitation directe. En voici quelques r~sultats:

13 DE WAARD, Biochera . Z t sch r . , 97, 186 (1919 ) . - - KRA~II:R-TIs~iALL, J o u r m

Biol . Chem., 47, 475 (1921) . - - C L A ~ , J o u r n . Bio l . Chem. , 49, 487 ( 1 9 2 1 ) .

C o n t r i b u t i o n o~ l ' 6 t u d e d u m i c r o d o s a g e d u c a l c i u m d.~ns le se t 'u rn s a n g u i u .

8@rum A

, B

. C ,, D ,, E . F

G ,, H

P a r m i n 6 r a l i s a t i o n p a r p r f i c i p i t a t i o n d i r e c t o

9 8 , 0 6 m g r . / l i t . C a 1 0 8 , 0 9 m g r . l l i t . C a

9 5 , 3 ,> ,, ,, 1 0 3 , 5 ,, . .

1 1 3 , 0 ,, ~, ,, 1 1 7 , 8 ,, ,, ,>

9 2 , 6 ~ . ,~ 1 0 0 , 7 . ~> .

9 8 , 0 6 ~ . ,, 1 0 3 , 5 >, >. .

9 0 , 0 , ,, . 9 5 , 0 . . . . . .

9 3 , 0 ,~ . ,~ 9 8 , 0 . .

1 0 2 , 0 * . * 1 0 3 , 0 ,, * *

Conclusion: I. I1 est ndcessaire de en contact avec la solution pendant

153

laisser le pr~cipit~ d'oxalate au moins douze heures; bien

que, suivant les cas, la pr6cipitation soit complete au bout d'une heure, dans d'auteurs elle ne l 'est pas; cela d@end de ]a viscosit6 et de la teneur en albumines du s6rum.

II. M~me apr~s 12 h 16 heures de contact, le calcium n'est pas enti~rement pr6cipit6 du s6rum.

III. La m6thode par prdcipitation directe donne la plupart du temps des r6sultats plus 61eves que la min6ralisation. Nous arri- vons donc ~. la conclusion que la min6ralisation est n@essaire si l'on veut avoir un dosage quanti tat i f de calcium dans le s~rum sanguin.

II. Etude critique de quelques micromdthodes gravindtriques de dosage du calcium comme oxalate en rue de leur application au

dosage du calcium dans le sdrum sanguin.

Nous n'avons pas trouv6 dans la litt6rature de microm~thodes gravim6triques se rapportant au dosage du calcium dans le s6rum. Les microm6thodes actuelles nous ont sembl6 pouvoir s'appliquer

ce dosage. Mdthode d'EmichlL On dissout du carbonate de calcium darts

1 cc. d'eau distill~e, puis on ajoute 5 gouttes d'acide chlorhydrique concentr6 en ayant soin de tenir le microbecher obliquement pour 6viter les pertes dues au d~gagement du gaz carbonique; on ehauffe doucement, puis on ajoute 0,5 ce. d'acide oxalique k 3% et 1 goutte de rouge de m6thyle; puis, ~ l'6bullition, on verse de l'ammoniaque ~ 2~o ]usqu'au virage. Apr~s avoir laiss6 reposer 1 heure sous une cloche de verre, on filtre avec un filtre d'amiante, on lave 5 lois

i~ F R . E M I C H , M i k r o c h o m i s C h e s P r a k t f l c t t m , 1 9 3 1 , p . 1 3 0 .


avec 1/~ cc. d'eau distill@e, on sbche ~ 105 degr@s dans un courant d'air (on emploie ~ cot effet un <<bloc de s@chage>> (Trockenvor- richtung) 1~. On p~se comme oxalate de calcium avec 1 mol@cule d'eau.

Nous avons tar@ le microbecher et le filtre rempli d'amiante au moyen de la microbalanee, en faisant filtrer un peu d'eau distill@e, puis en sTchant un quart d'heure ~ 1050 et en refroidissant tou- jours dans un courant d'air sec, priv@ d'anhydride carbonique.

Los premiers essais sur la solution dilu@e de chlorure de calcium nous ont donn6 des rTsultats beaucoup trop faibles; ccpen- dant, en dissolvant l 'oxalate pes@ dans l'acide sulfurique et en le t i t rant par le permanganate, les valeurs ainsi obtenues ont 6t6 thToriques, done les r@sultats trop faibles du dosage gravim@~ri- que provenaient d'une perte d'amiante lors de ]a filtration. Pour 6viter cette perte, nous avons plac6 au fond du filtre une petite rondelle d'~toffe de tamis (~ 200 mailles'mm2) ; h l'intTrieur, nous avons plac@ une petite bille de verre, puis rempli avec de l 'amiante. Nous avons ainsi obtenu le poids constan~ du filtre et du micro-

becher. Los essais suivants ont @t6 fairs ~ partir de carbonate de calcium

p u r e t sTch@ ~ poids constant ~ 100 °.

Poids de CaC~04.H~0 trouv@ Prise de CaC~, Pnids th~oretiquo

en mgr. de CaC..,0~. H20

2,55 3,72 1,49 2,175 1,19 1,737 0,75 1,095 0,48 0,70 0,48 O,70

avec correction sans correction de solubilit~ de solubilit6

en mgr. en mgr.

3,714 3,70 2,174 2,16 1,724 1,71 1,104 1,09 0,754 0,74 0,734 0,72

Les r@sultats sent satisfaisants (moins de 1 et demi ~o d'erreur) ]usqu'~ uue prise de 0,75 mgr. de carbonate de calcium, ce qui cor- respond ~ 3 cc. de s@rum. Cette m@thode est done applicable au dosa.~e du calcium dans le sang. Nous avons pens@ qu'il @tait ]ustifi@ d'apporter aux r@sultats trouv@s une correction de solubilit@ due au lavage; nous avons pris los chiffres indiqu@s dana

15 Ibid., p. 66. - - Mikrochemie, PR~cL-FestschriR, p. 6 1929.

Contribution a l'6tude du microdosage du calcium dans le serum sanguin. 155

~MELIN-KRAUT'S xG par KOHLRAUSCH, soi t 5,6 mgr. d ' oxa l a t e de

calcium par l i t re d'eau. M~thode de Strebinger 1T. A une solut ion t i tr6e de chlorure de

calcium, on addit ionne 2 h 3 gou t t e s d 'acide ac6tique glacial, on chauffe k 700 eft on a jou te la so lu t ion satur6e d ' oxa l a t e d ' ammo-

nium dilu6e de moit i6; apr~s un repos d'une heure, on fi l tre ]a solut ion et on lave a l t e rna t ivemen t k l 'eau et k l 'a lcool; on sbche 5 105 o et on p~se.

Nous avons op6r6 selon cet te m6thode, sauf que nous avons lay6 exclusivement ~t l 'eau. Nous avons essay6 ensui te de laver avec une solut ion satur6e d ' oxa la t e de calcium, suppr iman t ain~si ]a cor rect ion de solubilit6. Th6oriquement, ]a quant i t5 de solut ion qui res te dans le tilt, re apr~s ]e dernier l avage est si faible que la charge en oxa la te qui en r6sulte est n6gligeable. Cependant , a y a n t t rouv6 des r6su l ta t s ne t t emen t t rop 61ev6s, nous avons lav6 avec 4 cc. de la solut ion satur6e d ' oxa la t e de calcium et 1 cc. d 'eau distill~e pour

enlever les t races d 'oxala te . Voici le t ab leau r6unissant les divers r6su l ta t s obtenus ave,:

cet to m6thode de pr6eipi ta t ion en milieu ac6tique e t en fai.~ant

varie!- l ' eau de lavage:

Poids de CaC.-O~.H..,O trouv6 Prise de Poids avec corree- sans correc- CaC0~ th6orique de

tion de tion de en mgr. CaC204.tf.~O solubilit6 solubilitA

0,96 1,401 1,392 1,37 0,62 0,905 0,922 0,90 0,57 0;832 0,802 0,78

0,99 1,44 1,55 0,90 1,30 1,37 0,87 1,27 1,29 0,50 0,75 0,76

1,6 2,336 2,34 0,77 1,124 1,115 0,50 0,73 0,74

Eau de lavage

4 cc. tI.~O

6 co. solution satur6e d'oxa- l~te de Ca

4 cc. solution satur6e d'oxalate de Ca Puis I cc. It20

16 GMELIN-KRAUT's , II, 2, p. 338. - - KOI-I.LRAUSCH, Ztsehr. physikaL Chem.. 50, 355 (1905).

" Mikrochemie, PnEGL-Festschrift, p. 321 (1929).

156 P. Wenger , Ch. C i m e r m a n et P. Borgertud:

On volt que les r@sultats les plus exacts ont ~t~ obtenus en lavant successivement avec 4 cc. de la solution satur~e d'oxalate de calcium et 1 cc. d'eau distill6e; l'oxalate de calcium seul dormant des r6sultats beaucoup trop ~lev~s.

L'e×actitude des r6sultats trouv~s est de 1 To environ; nous avons appliqu~ cette m6thode au dosage du calcium dans le s~rum sanguin:

Le s~rum est minGralis~, on reprend soit par l'acide chlorhydrique, soit directement par l'acide ac6tique glacial, suivant qu'on opbre d'aprbs la m6thode d'EM:CH, ou par celle de SWaF- B I N G E R .

Pour terminer cette &ude, nous averts eompar6 la m6thode gravi- m6trique de STREBINGER avec la m~thode manganim~trique. Void les r&ultafs que nous avons obtenus:

~Idthode grav imdt r ique P r i se de de S'rREBINGER. Mdthodo man- P a r pr@cipi ta t io ,

s~rum E a u de lavage: ganim@triquo p a r d i ree to -1 cc, oxal. Ca, 1 ce. H._,{} mindra l i sa t ion

3 ec. 108 mgr. / l i t . 109 mgr, / l i t .

111 >> "

'2 , 115 ,, ,' 108 ,~ ,*

116 , ~ 115 ,, ,, 2 ,, 98,;? >, ~ 99,4 ,, * 101 ,6mgr . / l i t .

La m~thode gravim~trique de dosage du calcium comme oxalate avee une molecule d'eau est done applicable au dosage du calcium dans le s~rum sanguin. La quantitG de sdrum nGcessaire (2 £ 3 ec.) n'est pas plus consid4rable que pour les m~thodes volum6triques, mais la min~ralisation est indispensable. L'inconv~nien,t de cette m~thode, au point de vue clinique, est d'Stre beaucoup trop longue et de nGcessiter une microbalance.

Cependant, nous avons pens4 qu'il @fair int@ressant d'~tudier ees microrn~thodes gravim~triques et de voir si elles pouvaient s'appliquer aux dosages biologiques. Dans certains cas d'hypo- ou d'hyper- calc@mie tr~s marqu@es, un dosage gravim~trique peut fournir un contrSle pr~cieux des m~thodes volum@triques.

Contribution a l'fitude du microdosage du calcium dans 1~ serum sauguin 157

CONCLUSION.

Le dosage du calcium dans le s6rum sanguin a donn6 lieu it urre litt~rature tr~s abondante; il est assez d61icat.

Les r6sultats que nous avons obtenus au cours de cette ~tude nous ont amen6 it la conclusion suivante:

Vu la fixit6 6tonnante de la calcdmie, le dosage du calcium sanguin dolt 6tre aussi rigoureux que possible.

Voici la mdthode que nous prdconisons et dont nous allons rap- peler les ddtails techniques:

Mdthode: Le sdrum (2 cc.) est dvapor6 it sec dans une capsule d(, platine, puis calcine, doucement d'abord, sur un bec Teclu, jusqu'it obtention de cendres blanches. On reprend par deux gouttes d'acido chlorhydrique concentrd, 2 it 3 cc. d'eau distill~e et on transvasc dans un microbecher en rin~ant soigneusement ]a capsule; apr~s avoir aiout~ une goutte de rouge de m~thyle, on rend alcalin ave(' de l'ammoniaque concentr~, puis on acidule avec de l'acide ac4tique it 4 % ]usqu'it coloration rose (pH ---- 5).

Le microbecher est port6 au bain-marie bouillant et on a~oute goutte it goutte 0,5 cc. d'une solution satur~e d'oxalate d'ammonium; on laisse reposer une heure, puis on filtre avec la baguette microfiltrante garnie d'amiante. On lave 3 lois avec 2 cc. d'ammoniaque it 2 ~ ; l 'aspiration ne doit pas ~tre trop rapide, ce qui entrainerait un lavage incomplet; la filtration e t ] e lavage durcnt de dix minutes it un quart d'heure.

On met ensuite dans le microbecher 5 cc. d'acide sulfurique it 20%, on porte au bain-marie it 700 e~ on ti tre avec du permanganate de potassium N/100 jusqu'it l~g~re coloration rose persistant une minute au bain-mario it 70 °. 0on soustrait 0,01 cc. du volume de permanganate employS; cette correction est faite it cause de l 'amiante qui absorbe l~g~rement la coloration rose. Comme le dosage est effectu~ sur 2 cc. de s~rum, si la solution de permanganate est exacte, le nombre de cc. employ~s multipli~ par 100 donne directement la teneur en calcium exprim~e en mil]igrammes par litre de s~rum.

158 P. "Wenger, Ch. C.imerm~n et P. Borgeaud: Contl~_bution a l'~tude otc.

Ex,: Volume de permanganat~ employ~ ~ 0,98 cc.

Teneur en calcium du s~rum ~- 98 mgr./lit.

Quant aux m~thodes gl'avim~triques, comme nous l'avons du reste d~j£ dit, elles sont peut-Stre plus pr~cises que les mSthodes votum~triques, mais d'une application difficile pour un laboratoire qui n'est pas sp~cialis~ daas les microdosages de precision.

Documents

Contribution a l’étude du microdosage du calcium dans le serum sanguin