COURS CHM 2971 Hiver 2005 Chimie bio-analytiqueesilbac1.esi.umontreal.ca/.../CHM2971H06_cours1.pdf · Familiarisation avec les principes et méthodes d’analyse instrumentale modernes

CHM 2971 H2006 1

COURS1

10 janvier 2006

CHM 2971 H2006 2

CHM 2971Hiver 2006

Chimie Bioanalytique

Chargé de cours: Obayda DebsCourriel: [email protected]é: lundi 11h00-14h00Bureau: U-335

Responsable:Prof. Pierre ThibaultCourriel: [email protected], Pavillon Marcelle Coutu, bureau: 2306-17

CHM 2971 H2006 3

Références• Harris, D.C., Quantitative Chemical Analysis, 6e édition, W.H. Freeman

and Co, New York (NY), 2003.• Skoog, D.A., West, D.M. et Holler, J.F., Chimie Analytique, 7e édition,

DeBoeck Université, Paris, 1997.• Cunico, R.L., Gooding, K.M. et Wehr, T., Basic HPLC and CE of

Biomolecules, Bay Bioanalytical Laboratory, Richmond (CA), 1998.• Waldron, K.C., Notes de cours (divers), Université de Montréal.• D’amboise, M., Notes de cours CHM3171 et 6170, Université de

Montréal, 1995.• Bertrand, M.J., Notes de cours CHM2971, Université de Montréal.• Migneault, I, Notes de cours CHM2971Hiver 2004 , Université de

Montréal.• Thibault, P., Notes de cours CHM3102, Université de Montréal.

CHM 2971 H2006 4

Objectifs du coursFamiliarisation avec les principes et méthodes d’analyse instrumentalemodernes utilisés en laboratoire:

• Partage et électromigration- Extraction- Chromatographie gazeuse- Chromatographie liquide- Électrophorèse capillaire

• Méthodes spectroscopiques- UV/ Vis- Fluorescence- IR

• Spectrométrie de masse- Instrumentation- Protéomique

janvier

février

21 février intra

mars

avril

Dernier cours: 11 avril

CHM 2971 H2006 5

Barème du cours

Laboratoire: 35 %

Examen intra: 30 % - 21 février (2 h.)

Extraction, chromatographie, électrophorèse capillaire

Examen final: 35 % - à déterminer (3 h.)

(Electrophorèse capillaire), spectroscopie, spectrométrie de

masse

CHM 2971 H2006 6

1.0 Introduction

CHM 2971 H2006 7

Analyse simple: colorant alimentaire

EauO

H H • Système à 2composantes

• Séparation simple,mais inutile

• Caractérisationdirect du composé

CHM 2971 H2006 8http://members.pgonline.com/~bryand/StainsFile/dyes/45380.htm

Analyse complexe: mélange de colorants

• Système à 12composantes

• Séparationnécessaire et possible

• Caractérisationpost-séparation descomposés

CHM 2971 H2006 9

Analyses biochimiques complexes

• Systèmes biologiquesà haute complexité

• Isolation et séparationnécessaire avec travailmultiétapes

• Caractérisation post-séparation descomposés

CHM 2971 H2006 10

Analyses biochimiques complexes• Complexité provenant de :

- la localisation des biomoléculesd’intérêt : organite, cytoplasme, RE,membrane, noyau …- niveau d’expression et nombre decopies par cellule- diversité génétique- polymorphisme- modification post-traductionnelles

•Minimiser les étapes de purification- affinité- extraction- …

• Définir la pureté nécessaire :99%

99-95%

95%

utilisation thérapeutiqueétudes in-vivocristallographie,caractérisations physico-chimiquesantigène pour productiond’anticorps, séquençaged’Edman

CHM 2971 H2006 11

2.0 PRINCIPES DESÉPARATION

CHM 2971 H2006 12

2.1 Extraction liquide-liquidePrincipe: séparation de solutés par partition différentielle entre deux phases non miscibles

Phaseorganique

VorgPhase

aqueuseVaq

Constante de distribution(coefficient de partage)

A(aq) ↔ A(org)B(aq) ↔ B(org)

[ ][ ]aq

orgD A

AK =

1) Initialement (temps 0):

[ ]aq

aq VaA 00 =

2) Extraction 1:- ajout de Vorg (1)- A se distribue entre les deux phases

[ ]aq

aq VaA 11 = [ ]

orgorg V

aaA 101 −=

01 aVVK

Va

aqorgD

aq

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

+=

Sachant que:

( )aq

orgD Va

VaaK

//

1

10 −=

On trouve:

Extraction de l’espèce A

CHM 2971 H2006 13

2.1 Extraction liquide-liquideExtraction de l’espèce A (suite)

2) Extraction 2:- récupération de Vorg (1)- ajout de Vorg (2)- A se distribue entre les deux phases

[ ]aq

aq VaA 22 = [ ]

orgorg V

aaA 212 −=

0

2

2 aVVK

Va

aqorgD

aq

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

+=

De même manière:

0aVVK

Va

n

aqorgD

aqn ⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

+=

3) Par induction mathématique,l’équation générale suite à nextractions est:

Sachant que:

( )aq

orgD Va

VaaK

//

2

21 −=

0 2 4 6 8 100,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,0

a n/a

0

Nombre d'extractions (n)

KD=0,1

KD =0,3

KD =0,5

KD =0,7

KD =1

KD =3

Vaq = 10 mLVorg = 10 mL

CHM 2971 H2006 14

2.1 Extraction liquide-liquideVérification de la validité de l’équation

[ ][ ] ( )

n

aqorgDaq

naq

VVKAA

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

+=

1/1

0

1) Diviser par Vaq :

aq

n

aqaqaqorgD

aqaq

aq

n

Va

VVVVKVV

Va 0

///

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

+=

2) Simplifier :

3) Définir: rapport de force (R)

aq

org

VV

R =[ ][ ]

n

Daq

naq

RKAA

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+

=1

10

4) Tester la validité :

[ ][ ]

[ ][ ]

01 00

0

==∞→→

aq

naq

aq

naq

AA

AA

Pas d’extraction

Tout le produitextrait

0 2 4 6 8 100,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

[A] aq

, n/[A

] aq, 0

Nombre d'extractions (n)

R=1

R=3R=5R=7R=9

R=11

KD = 0,1

CHM 2971 H2006 15

2.1 Extraction liquide-iquideConditions d’utilisation de l’extraction simple

• Deux phases immiscibles• Deux phases chimiquement inertes entre elles• Deux phases chimiquement inertes avec les produits• KD unique pour chaque produit• Nombre d’extractions (n) réalisable

Applications:

• Extraction de lipides des aliments pour des tests decontrôle de la qualité et détermination du % de gras:

- lait et produits laitiers- croustilles et craquelins- bacon, saucisses et viandes traitées

• Détermination de métaux- terre de fertilisation- échantillons biologiques

CHM 2971 H2006 16

2.2 La chromatographieHistorique

• Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919), botaniste,biochimiste et physiologiste russe né en Italie. En 1903, ilréussi à séparer des pigments sur une colonne d’inuline etbaptise cette nouvelle technique de ‘chromatographie’.

Observations de Tswett

• Séparation de chlorophylles colorées par partitiondifférentielle entre deux phases dont une eststationnaire et l’autre est mobile.• Deux phases immiscibles: solide / stationnaire etliquide / mobile• Processus dynamique: bandes de couleurs qui sedéplacent et se séparent avec le temps• Partage des analytes entre les deux phases

t= 0 min t= 30 min

colonne

pigmentsvégétaux

phasestationnaire

clorophyllesséparées

phasemobile

CHM 2971 H2006 17

2.2 La chromatographiePrincipe de la chromatographie

http://falcon.sbuniv.edu/~ggray/CHE3345/index.html

1) Chargement d’unmélange A+B auhaut de la colonneet application d’unepression de solvant

2) Les produitsprogressent dansla colonne àdifférentesvitesses menant àleur séparation

3) Le produit A,moins retenu parla phasestationnaire, éluele premier de lacolonne

5) Le produit B,mieux retenupar la phasestationnaire,élue second dela colonne

1 1 1 1 12 3 4 5 6 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6 2 3 4 5 6

4) Le produit Aest entièrementisolé du produit Bet la séparationse poursuit pourrécupérer B

A + B

CHM 2971 H2006 18

2.2 La chromatographie

• Phase mobile : flux de liquide ou de gazentraînant les solutés à travers la colonne.- rôle de transport- immiscibles avec la phase stationnaire- chimiquement inerte- physiquement actif (interaction avec soluté)

• Phase stationnaire : support solide ou pseudo-liquide servant à retenir les solutés selon différentsmécanismes les faisant progresser à des vitessesvariables dans la colonne.- rôle d’affinité- immiscibles avec la phase mobile- chimiquement inerte- physiquement actif (interaction avec soluté)

Système chromatographique idéal

SOLUTÉ

Vs

Vm

CHM 2971 H2006 19

SOLUTÉ

Constante de distribution :

A(mobile) ↔ A(stationnaire)

2.2 La chromatographieSystème chromatographique idéal

[ ][ ]m

sD A

AK =

Conditions de séparation :

• KD ≠ 0 sinon [A]s = 0 : aucune affinité avec laphase stationnaire et aucune séparation• KD ≠ grand sinon [A]s >> [A]m : élution faible,le soluté est fortement retenu par la phasestationnaire, mauvaise séparation• KD ≠ petit sinon [A]s << [A]m : élution rapide,le soluté est faiblement retenu par la phasestationnaire, mauvaise séparation•Nécessairement, KD,A > KD,B > KD,C

A AAAA

A

AAA A

AA

A A

A AA

A

A

A A

A

A

AA

A

A

A

AA

AAA

AA

AA

AKD

AAA

AA

AA

A

A

A

CHM 2971 H2006 20

2.2 La chromatographieConstante de distribution

• Par définition :

• KD existe si :- Enthalpie ∆H < 0- Échanges énergétiques dans le système- Pas de transformations chimiques- Interactions intermoléculaires selondifférentes composantes de forces

- Van der Waals- Keesom- Debye- Pont hydrogènes- Coulomb et autres

KRTG ln−=∆

RS

RTH

RTGK ∆

+∆−

=∆−

=ln Gain ou perte de degré deliberté dans le système

Chaleur dégagé: contributionprincipale à l’équation

B

A

CHM 2971 H2006 21

r-6Dipôle instantané –

dipôle induit(Van der Waals)

r-6Dipôle – dipôle induit(Debye)

r-4Ion – dipôle induit

r-3Pont hydrogène

r-3Dipôle – dipôle(Keesom)

r-2Ion – dipôle

r-1Ion – ion(Coulomb)

Force del’interaction

Énergiepotentielle

Types d’interaction

2.2 La chromatographieComposantes de force

O

O

O

O

+K+K

OHH

HHδ+

δ-µr

OHH

HH

OHH

HH

H

O

HNH

HH

H

H

OHH

HHδ+

δ-µr

∝

∝

∝

∝

∝

∝

∝

Na+

H HOδ−

δ+

O=C=OCa2+δ−

δ+

2 kJ/moll

1 kJ/mol

5 kJ/moll

20 kJ/mol

12 à 30 kJ/mol

CHM 2971 H2006 22

2.3 Principes physiques de séparationChromatographie d’adsorption

• Phase stationnaire:Solide

• Phase mobile:Liquide ou gaz

• Mode de séparation:Un soluté adsorbé fortement passe plus detemps dans la colonne qu’un soluté adsorbéfaiblement

CHM 2971 H2006 23

Chromatographie de partage

t

• Phase stationnaire:Liquide, pseudo-liquide ou greffée appliquée surune surface solide (silice SiO2)


• Mode de séparation:Les solutés se solubilisent dans la phasestationnaire liquide et sont en constanteéquilibre avec cette dernière et la phase mobileen mouvement

2.3 Principes physiques de séparation

CHM 2971 H2006 24

Chromatographie ionique

• Phase stationnaire:Échangeurs anioniques (-SO3

-) ou cationiques(-N(CH3)3

+) attachés de manière covalente à unsupport solide (résine)

• Phase mobile:Liquide

• Mode de séparation:Les solutés ioniques s’attachent à la phasestationnaire par interactions électrostatiques etse séparent selon leur charge et leur grosseur


CHM 2971 H2006 25

Chromatographie d’exclusion,filtration sur gel ou perméation

• Phase stationnaire:Gel poreux


• Mode de séparation:Les solutés sont séparés par grosseur. Le gelporeux exclus les grosses molécules qui nepeuvent y pénétrer éluant en premier. Parcontraste, les petites molécules doivent traverserles pores du gel et éluent par la suite.


CHM 2971 H2006 26

Chromatographie d’affinité

• Phase stationnaire:Solide greffé d’antigènes, d’anticorps ou …

• Phase mobile:Liquide

• Mode de séparation:Un soluté (une protéine) interagit sélectivementavec la phase stationnaire et les autres solutés sontpas/peu retenus. Le soluté d’intérêt est délogé enfin d’analyse.

Ex: Colonne IMAC : permet d’enrichir des protéinescontenant une chaîne peptidique de 6-His


CHM 2971 H2006 27

B

tRt’R

htm

W0,5

|0

A

0

W

Détecteur

Sign

al

AB

Colo

nne

1 2 3 4 5 6

2.4 Définitions quantitativesAllure d’un chromatogramme

t0 = temps de rétention nulle h = hauteur du pictR = temps de rétention w = largeur du pict’R = temps de rétention ajusté w0,5 = largeur du pic

à mi hauteurmRR ttt −=,

CHM 2971 H2006 28

• Volume de rétention (VR) et volume mort (V0) :Volume de phase mobile nécessaire pour éluer un soluté d’unecolonne chromatographique

•Facteur de capacité (k’) :Constante utilisée pour évaluer la vitesse de déplacement d’uneespèce donnée à travers une colonne chromatographique. Optimalentre 1 et 10.

2.4 Définitions quantitatives

[ ][ ] m

R

m

mR

m

s

mm

ss

tt

ttt

VVK

VAVAk

,, =

−=×=

××

=

vRR utV ×= uv : débit en volume, (mL/min)

vutV ×= 00 sconnectiondétecteurinjecteurtubulurem vvvvV ++++=

Vm = volume de la phase mobile

CHM 2971 H2006 29

• Résolution (R) :– Mesure de l’aptitude d’une colonnechromatographique à séparer deux composés– Évaluée entre deux pics


( )AB

RARB

wwttR

+−

=2

4σ

tRA tRB

wA wB

CHM 2971 H2006 30

σ35,2%50 =W

σ4%5.13 =W

σ2%60 =W


• Caractéristique d’un pic idéal :La forme idéale d’un pic chromatographique est gaussienne. Cettedescription mathématique permet la caractérisation du pic.

( )2

2

2

21

t

Rtt

t

eMd

c σ

πσ

−−

⎭⎬⎫

⎩⎨⎧⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=

c: concentration de l’analyte au temps td: débit de l’éluantM: masse de soluté injectéeσt: écart type et σt

2: variance tR: temps de rétention du soluté

ttR

CHM 2971 H2006 31


• Asymétrie (As) :Propriété décrivant la forme des pics chromatographiques.Généralement les pics expérimentaux sont imparfaits et leur forme estplutôt celle d’une gaussienne modifiée par une exponentielle (GME)

ABAs =

CHM 2971 H2006 32

2.4 Définitions quantitatives• Efficacité du système et nombre de plateaux théoriques (N)N est défini comme une zone fictive où la distribution d’un solutéatteint l’équilibre. L’efficacité est donc le nombre de fois où le solutéatteint l’équilibre lors de son parcours de la colonne. Plus l’efficacitéest grande, plus N est grand.

2

16 ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛×=

b

R

wtN

2

2/1

55.5 ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛×=

wtN R

ou

• Hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) ou (H)H est la hauteur d’un plateau théorique exprimé par mètre de colonne.

LHet

NLH

2σ== L : longueur de la colonne

σ2 : variance du pic

CHM 2971 H2006 33

• Sélectivité (α) :La sélectivité est une mesure de la capacité d’une colonne à donnerdes pics différents pour des solutés différents. C’est le rapport descoefficients de distribution de deux espèces, A et B (k’A, k’B),parcourant une colonne chromatographique. Par convention, on metau numérateur le coefficient de l’espèce qui est la plus retenue.

'''

'

'

'

ABA

B

RA

RB

A

B kkoùKK

tt

kk

>===α


- Pour qu’il y ait possibilité de séparation des composés Aet B, il faut que α ≠ 1 et nécessairement α >1

- Si α = 1, on peut améliorer la séparation en modifiant :? La phase stationnaire (effet sur k’)? La température (∆G = -RTlnK)

CHM 2971 H2006 34

2.4 Définitions quantitatives• Critères d’une bonne séparation

– Tous les constituants d’un mélange doivent être retenus– Les pics d’intérêt doivent être bien séparées (R>1,5)– L’analyse doit être rapide

2.

2222contrdétecteurinjecteurcolonnetotal σσσσσ +++=

ÉLARGISSEMENT DU PIC

LH total

2σ=

( ) 12t 2

2dét

2inj

∆σσ ==

où ∆t est la largueur de la bande à t0 ouplus spécifiquement, le temps passédans l’injecteur ou le détecteur

Diffusion

Dt22 =σ

CHM 2971 H2006 35

2.4 Définitions quantitatives• Distorsion des pics chromatographiquesForme idéale gaussienne :- KA indépendant de [A]- Isotherme idéalForme surchargé (overloading) :- Grande injection de soluté- [A]↑, une saturation de laphase stat. mène à KA ↑Forme traînée (tailing) :- [A]↓, une fraction du solutéest plus fortement retenuepar la phase stat. KA ↓-Souvent due aux Si-OHdénudés du supports solide- Minimisé par la silanisation

CHM 2971 H2006 36

2.4 Exercice•Quelles sont les variances et déviations standards correspondant aux phenomènes de diffusionassociés à l’injection, détection et la colonne si le débit est de 1 mL/min, la largeur de pic à mi-hauteur est de 15 s, le volume d’injection 25 mL et le volume de la cellule du détecteur est de 20 mL?

2) Déterminez la résolution chromatographique pour la séparation de l’insuline humaine et de lapin sileurs temps de retention et largeur de pic à mi-hauteur sont respectivement de 17.8, 17.2, 0.37 et0.34 min?

Quel est le nombre de plateau theorique (N) apparent et quel serait la largeur de pic a mi-hauteur siN est 20000?

Purifying proteins for proteomics, R. Simpson

CHM 2971 H2006 37

σ2obs.= σdet.

2 + σinj.2 + σcol.

2

= (W0.5/2.35)2 = (15s/2.35)2 = 40.72 s2

σinj.2 = (∆tinj.)2/12 = [(0.025ml/(1ml/min))*60s/min]2/12 = 0.19 s2

σdet.2 = (∆tdet.)2/12 = [(0.020ml/(1ml/min))*60s/min]2/12 = 0.12 s2

σ2col.= σobs.

2 - σinj.2 - σcol.

2 = 40.72 s2 - 0.19 s2 - 0.12 s2 = 40.41 s2

σcol.= 6.36 s

NB. La contribution a l’élargissement de pic associée a l’injection et la détection estconsiderée acceptable si celle-ci est moins de 5% de la variance observée.

Propriétes addititives de la variance et élargissement de pic (solution)

Quelles sont les variances et déviations standards correspondant aux phenomènes dediffusion associés à l’injection, détection et la colonne si le débit est de 1 mL/min, lalargeur de pic à mi-hauteur est de 15 s, le volume d’injection 25 µL et le volume de lacellule du détecteur est de 20 µL?

2.4 Résolutions

CHM 2971 H2006 38

2.4 Définitions quantitatives• Équation de van Deemter :Équation qui lie les effets de diffusion turbulente (chemins multiples:facteur A), de diffusion longitudinale (facteur Bµx) et de résistance autransfert de masse (facteur (CM + CS)µx) à la hauteur équivalente à unplateau théorique (HEPT ou H), et donc à l’élargissement des pics σ2.

( ) xSMx

uCCuBAH +++=

Diffusion longitudinale

Chemins multiples

Transfert de masse

CHM 2971 H2006 39

• A : Chemins multiples– S’applique seulement pour des colonnes remplies avec des

particules* Plus la taille des particules est petite (dp), plus l’efficacité de

la séparation augmente

pdA λ2= λ: facteur géométrique de remplissagedp : diamètre des particules


CHM 2971 H2006 40

AAAAA

AA

x

M

x uD

uB γ2=

γ: facteur de tortuositéDM : coefficient de diffusion (dans la phase mobile)


• B/u : Diffusion longitudinale– Toute molécule dissoute dans un liquide ou un gaz diffuse

dans toutes les directions de la concentration la plus élevé àla moins élevée

– Dgaz est en générale 10X plus grande que Dliquide

* H diminue si DM est faible

AA

Phase mobile

Documents

COURS CHM 2971 Hiver 2005 Chimie bio-analytiqueesilbac1.esi.umontreal.ca/.../CHM2971H06_cours1.pdf · Familiarisation avec les principes et méthodes d’analyse instrumentale modernes