Chromatographie sur phase inverse - Université de Montréalesilbac1.esi.umontreal.ca/~thibaupi/CHM3102/DOC/ch6-chromato3.pdf · Chromatographie sur phase inverse CHM 3102 267 Principe

Chromatographie sur phase inverse

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Principe de séparation

Phase stationnaire greffée avec ligand C4, C8 ou C18

Peptide injecté dans la phase mobile et entrainevers la colonne

Peptide adsorbé sur la phase stationnaire

Peptide désorbé de la phase stationnaire avec le gradient d’acetonitrile

• Le peptide est d’abord adsorbé sur la phase stationnaire en présence d’une phase mobile aqueuse.

• La désoption du peptide est effectuée en augmentant le % solvant organique(e.g. acetonitrile) en utilisant un gradiant d’élution.

• La colonne est par la suite ré-équilibrée avec le solvant aqueux.

• Phénomène d’adsorption ou la séparation survient par un mécanisme de partition entrela phase mobile et la phase stationnaire.

• La distribution du peptide entre les deux phases depend des affinités hydrophobiqueset de la composition de la phase mobile


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Facteurs affectant la chromatographie surphase inverse

Phase stationnaireType de ligandComposition de la phase mobile Diametre des poresTaille des particulesDimension de la colonneTempératureAdditifs


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ColonneAcier inoxydable (pression)Diamètre des particules : 3 à 10 µmTaille des pores : 70 à 300 ÅAire : 50 à 250 m2/g


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Phase stationnaire

[W.R.Melander, C.Horvath, Reversed-Phase Chromatography, in HPLC Advances and Perspectives, V2, Academic Press, 1980]

[K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979]


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Phase stationnaire

Comprend des groupessilanol libres pouvantdonner lieu a d’autrestypes d’interactions


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Phase stationnaire

Solubilité de la silice en fonction du pH

Limitations de la silicepH

<2 (hydrolyse Si-O-Si-R)>8 (dissolution)

Tamponphosphate (inorganique) vsTris (organique)Molarité

Température

Supports polymériques (PS-DVB) également utilisé


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Phase stationnaire

Modification des groupes silanols


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Type de ligand et diamètres des pores

300 Å50-100 Å

Transfert de masserestreint

Transfert de masseplus efficace

Diamètres des pores

Phase greffée

Silanol libre résiduel

Ether; source de silanol

n: 17, C187, C83, C4

Greffon

Groupe terminal (Capping group)


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Composition de la phase mobile (solvants)Acetonitrile (ACN)• Volatile • Faible viscosité• Peu d’absorption UV adsorption à basse longueur d’onde• Couramment utilisé pour la séparation des peptides

Isopropanol• Utilisé pour les protéines de masse élevée ou tres hydrophobe• Viscosité élevée• Peut etre dilué avec ACN 1:1• 1-3% IPA dans ACN peut améliorer le rendement dans certain cas (Synthetic

Peptide Purification by Application of Linear Solvent Strength Gradient Theory, J.C. Ford and J.A. Smith, J. Chrom. 483, 131–143 (1989))

Ethanol• Utilisé pour purification a grande échelle• Bon solvant pour la chromato. phase inverse• Utilisé pour l’élution de protéines hydrophobes

Methanol et autres solvantsOffre tres peu davantage comparativement aux solvants plus couramment utilisés


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Propriétés physiques des solvants


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Viscosité des mélanges de solvants

La viscosité des mélanges eau-alcoolaugmente de façonsignificative jusqu’àune proportion 1:1.double

50%


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Composition de la phase mobileGradient d’élution

Elution trop rapide

Elution trop lente

Elution trop rapide

Elution trop lente


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Gradient d’élution et solvant organique

N. C. Robinson, M.D. Dale, L.H. Talbert, “Subunit Analysis of Bovine Cytochrome c Oxidase by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography”, Arch. of Biochem. and Biophys. 281(2), 239–244 (1990)

Colonne: Vydac 218TP104Echantillon: Sous-unités cytochrome C oxidaseGradient: 25-50% acetonitrile (0.1%TFA)Détection: A214nm

Une meilleure résolution peutêtre obtenue avec un gradient plus lent

Il est recommandé d’avoir unecomposition initiale de 3-5% ACN pour réduire le temps de re-équilibration et la difficultéa rehydrater la phase stationnaire. On peut utiliserune pente d’élution de 0.5-1.0%/min


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Composition de la phase mobileL’ionisation de differents acidesaminés peut influencer l’adsorption et l’ordre d’élution

1 Bradykinin2 Oxytocin3 Angiotensine II4 Neurotensine5 Angiotensine III

Effect du pH


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Composition de la phase mobileFormation de paire d’ions

Acide trifluoroacetique (TFA)

• Courramment utilisé pour les séparations de peptides

• Volatil• Peu d’absorption UV a basse

longueur d’onde• Concentration typique: 0.1% dans

eau et ACN• Peu etre utilise pour solubiliser

protéines hydrophobiques

0.1% TFA

0.3% TFA

Digest trypsiqued’apotransferrin surcolonne Vydac218TP54

0.1% TFA

20 mM phosphate pH:2

5 mM HCl pH:2

Separation de peptides surcolonne Vydac218TP54

1. oxytocin2. bradykinin3. angiotensin II 4. neurotensin5. angiotensin I

Autres

Acide heptafluorobutyrique (HFBA)Triethylamine phosphate (TEAP)Acide formique – LC/MS

Variation de sélectivité


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Taille des particules

Avantage: N ↑

Inconvénient : P ↑

3500

pdLN ≈

L : longueur de la colonne (cm)dp : diamètre des particules (µm)


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Perte de charge (∆P) : pression qu’il faut appliquer pour faire passer la phase mobile dans la colonne chromatographique

15022cpddFLP η

≈∆L : longueur de la colonne (cm)dp : diamètre des particules (µm)dc : diamètre de la colonne (cm)F : débit (mL/min)η: viscosité (cP)∆P : perte de charge (atm)

Horvath, C., in Chromatography, partie A, Heftmann (Ed.), Chap. 3, 1983


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Separation de peptide standards surune colonne Vydac 214TP avec particules de differentes dimensions Gradient: 24–95 % ACN (0.1% TFA) en 30 min debit: 1.5 mL/min.

5 µm

10 µm

15-20 µm

The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Grace Vydac, 3rd Edition, 2002

Largeur de pic selon la variation de la taille des particules et de la quantité chargéeConditions: VYDAC® 214TP, 5 µm, 10 µm, 15–20 µm, 20–30 µm Gradient: 24–95 % ACN (0.1% TFA) en 30 min debit: 1.5 mL/min; echantillon: ribonuclease.

Les difference de performance analytique entre les tailles de particulesdeviennent moins grande avec la quantite chargee.


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Dimension de la colonne et considérationspratiquesDébit actuel peut varier d’un facteur 2 plus haut ou plus bas dependant de la méthode

Capacité de charge optimalecorrespond a la quantité de peptide pouvant être chargé sur la colonne sans compromettre la résolution

Quantité maximale de charge correspond à la quantité maximaled’échantillon pouvant être purifiésur la colonne avec un rendementet une pureté raisonable

The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Grace Vydac, 3rd Edition, 2002

Pression pour une colonne de 25 cm (1:1 eau:ACN) est typiquement de 1000-1800 PSI


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Température

La température de la colonne peutaffecter la viscosité du solvant, la pression (perte de charge), le temps de rétention et la sélectivité. Unetempérature < 60°C estrecommandée afin de limiter la dégradation de la phase stationnaireet l’élévation accrue de la pression(<5000 PSI).

Separation de digest trypsique de l’hormone de croissance humaineConditions: C18, 4.6 x 150 mm. Debit: 1 mL/min. Gradient de 0–60% ACN (0.1% TFA) en 60 min. Hancock et al.

Temperature as a variable in reversed-phase high-performance liquid chromatographic separations of peptide and protein samples. I. Optimizing the separation of a growth hormone tryptic digest, W.S. Hancock, R.C. Chloupek, J.J. Kirkland and L.R. Snyder, J. Chrom. 686, 31–43 (1994)


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Exemple de séparation

Identification de variant génétique lors de l’apparitionde globule rouge anémiquede type faucille

Conditions: VYDAC® 218TP51 (C18, 5 µm 1.0 x 250 mm) Gradient: 0–40% ACN en 50 min (0.1% TFA) debit 50 µL/min.

Automated Analytical System fo the Examination of Protein Primary Structure,Y.L.F. Hsieh, et.al., Anal. Chem. 68, 455–462 (1996)

Le phénotype est caracterisé par une substitution de l’acideglutamique par une valine en position 6 de l’hémoglobine A. Cechangement se distingue par l’apparition d’un peptide plus hydrophobe


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Exemple de séparationLa déamidation des peptides est un phénomene courant et possiblementnaturel. La déamidation non-enzymatique de l’asparagine (et a un moindre degré la glutamine) peut se produire naturellement par l’isomérisation et la racémisation de l’aspartate et l’asparagine en condition de pH neutre ou basique. Certaineséquence comprenant les acides aminésGN et SN sont plus susceptibles à la déamidation et peuvent accélérer ceprocessus.

Wright, H. T. CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991, 26, 1-52.Bischoff, R.; Kolbe, H. V. J. J. Chromatogr., A 1994, 662, 261-278.

Séparation de peptides trypsiques de la somatotropin de boeuf(BST) montrant la déamidation de Asn99. Conditions: VYDAC®218TP54 (C18, 5 µm, 4.6 x 250 mm) gradient: 0–15% ACN en 20 min, 15–21% ACN (0.1%TFA) en 12 min, 21–48% ACN en 27 min, 48-75% ACN en 4 min debit: 2.0 mL/min.

Purification and Characterization of Recombinant BovineSomatotropin Containing an Isoaspartyl Residue, M.R. Schlittler,P.C. Toren, N.R. Siegel and B.N. Violand, Ninth ISPPP, 1989, Abstract 621

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Détecteurs

Détecteurs (3 classes) :

Universel : Basé sur une propriété fondamentale des moléculesEx. : réfractométrie

Sélectif : Basé sur une propriété particulière d’une famille de composés, par exemple la présence d’un élément ou d’un group. fonctionnelEx. : UV, fluorescence, électrochimie

Spécifique : Basé sur une propriété unique à un composéEx. : spectrométrie de masse (MS)

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Détecteurs

RéfractométrieMesure continue de la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile et l’effluent de la colonne

Réfractomètre à

déviation

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Détecteurs

AvantagesUniverselFacteur de réponse semblable pour des produits de même classe

Réfractométrie

InconvénientsManque de sensibilité(général)

dépend de ∆nD entre soluté et éluant

Affecté par T, qui doit être contrôlée à 0.001, et par le débit de la phase mobileGradient d’élution possible seulement si les deux solvants ont des indices de réfraction semblables

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Détecteurs

Détecteur UVLongueur d’onde variable

Cellule de détection

Phasemobilelcε=A

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Détecteurs

Détecteur UV : Barrette de photodiodes (DAD; PDA)

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Détecteurs

Détecteur UV :

InconvénientsSubstances : chromophoreFacteur de réponse : différent pour chaque composéDAD : emploi plus difficileLimité par le « cut-off »de la phase mobile

Avantages Sélectif : choix de la longueur d’ondeDAD : mesurer àplusieurs λ (puretéd’un pic)Peu sensible à T et débitFacile à utiliser et àentretenirPeut être utilisé en mode gradientNon destructif

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