Correction du concours 2010 2011

Correction du concours 2010/ 2011 : !Chez les mammifères, la dégradation oxydative des acides gras à chaîne longue joue un rôle majeur dans le métabolisme énergétique. Le principal d’entre eux est l’acide palmitique : CH3-(CH2)14-COOH. Cette dégradation oxydative ayant lieu dans la mitochondrie, un système de transfert est nécessaire pour faire passer la forme activée (liée au coenzyme A et donc appelée acyl-CoA) des acides gras à chaîne longue du cytosol vers la mitochondrie. Ce système de transfert implique le couplage de l’acide gras à une molécule appelée carnitine et comprend deux enzymes membranaires appelées carnitine-palmityl transférases ou CPT : l’activité CPT1 est située sur la face cytosolique de la membrane externe de la mitochondrie et l’activité CPT2 sur la face interne de la membrane interne de la mitochondrie

selon le schéma suivant :

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Il existe trois isoformes de CPT1 (CPT1A, CPT1B, CPT1C) qui sont exprimées à des niveaux différents selon les tissus.

STRUCTURES L’analyse de la séquence de la protéine CPT1A (un peu plus de 770 résidus) par le programme TopPred (Topology prediction of membrane proteins) permet de déterminer le diagramme d’hydrophobicité présenté dans la figure B1A. !!!

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On retient que :

La dégradation de l’acide palmitique a lieu dans la mitochondrie.

La CTP1 est une enzyme située au niveau de la face externe de la membrane externe mitochondriale, donc au niveau cytosolique.

La CTP2 est une enzyme située au niveau de la face interne de la membrane interne mitochondriale, donc au niveau de la matrice mitochondriale.

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!!Figure B1A : En abscisse est indiquée la position des acides aminés et en ordonnée est indiqué le degré d’hydrophobicité

Question 32 : Indiquez le nombre de segments transmembranaires que peut comporter la protéine membranaire CPT1A, prédit par le diagramme d’hydrophobicité : a. Un b. Deux c. Sept d. Onze e. Douze

La structure tridimensionnelle de la partie cytoplasmique de la protéine CPT1A a été résolue par diffraction des rayons X. Si la détermination de son appartenance à une classe est difficile à établir, il est par contre possible d’observer certaines caractéristiques structurales présentées dans la figure B1B.

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On retient que : Il existe 3 isoformes de la CTP1 (CTP1A, CTP1B et CTP1C), la CTP1A comprend deux

segments hydrophobes.

Question 33 : Identifiez la ou les caractéristique(s) correspondant aux structures proposées : a. La protéine comporte un seul domaine b. La protéine comporte deux domaines c. La protéine comporte trois domaines d. Le coude est un coude bêta classique e. Le coude est un coude de structure atypique !!Les prédictions de structures secondaires pour la protéine CPT1A indiquent l’existence d’une hélice alpha entre les acides aminés 103 et 122. La projection des chaînes latérales des résidus d’acides aminés selon l’axe de l’hélice présentée dans la figure B2 répond aux caractéristiques de celle-ci et permet d’en reconstituer la structure primaire. Pour ne pas surcharger la représentation du modèle de la roue hélicoïdale, les acides aminés 121 et 122 ne figurent pas sur le schéma. Le code des acides aminés est fourni dans le tableau ci-dessous !!!!!!!!!

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On retient que :

La protéine CPT1A comprend 2 domaines, avec un coude béta (comprend 4 résidus)

particulier car ce dernier contient bien une proline au résidu n+1 mais pas de glycine.

Notion de cours et de vocabulaire :

Les coudes γ comprennent 3 résidus, et la liaison hydrogène à l’origine de la stabilisation du coude se fait entre les résidus n et n+2. Les coudes β comprennent 4 résidus et la liaison hydrogène à l’origine de la stabilisation du coude se fait entre les résidus n et n+3. Il existe différents types de coudes β et les coudes β de type I et II qui comprennent une proline au résidu n+1 et une glycine au résidu n+3. Les coudes β de type VI qui comprend une glycine au résidu n+1 et une proline au résidu n+2.

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Une hélice α est une hélice droite, elle comprend 3,6 acides aminés par tour de spire : = 100°

Ainsi sur un modèle de la roue hélicoïdale, lorsque l’on représente une hélice α on déterminera la séquence en lisant l’enchainement des acides aminés séparés d’un angle de 100°.

Lorsque la roue hélicoïdale est une représentation de 18 acides aminés (comme c’est le cas ici : AA1 à AA18), on peut considérer qu’un angle de 100° équivaut à un décalage de 5 acides aminés dans le sens des aiguilles d’une montre sur la roue.

!!!!!!Question 34 : Déterminez la séquence de la région en hélice alpha :

103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 a. N L G L G V W V I T V V L V G S A F T M b. N F A S G V L V V T I V W V G L G L T M c. N W L L V V G I G L T S G V A V V F T M d. N V I L A V W L G T G F L V G S V V T M e. N V V S G V L F G T G L W V A L I V T M !Question 35 : Indiquez la caractéristique de la région en hélice alpha : a. Transmembranaire et hydrophile b. Transmembranaire et hydrophobe c. Transmembranaire et amphiphile d. Exposée au milieu aqueux (cytoplasmique ou intermembranaire mitochondriale) et amphiphile e. Hétéropolaire (hydrophile sur 1,5 tour et hydrophobe sur 4,0 tours) Deux oligopeptides de 15 acides aminés appartenant à la séquence de la protéine CPT1A (partie C terminale) ont été choisis en vue de produire des anticorps polyclonaux de lapins afin de pouvoir réaliser des western blots.

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On rappelle qu’il existe trois isoformes (CPT1A, CPT1B, CPT1C) qui sont exprimées à des niveaux différents selon les tissus. La séquence d’une partie de la région C terminale de l’isoforme CPT1A (référence P50416) est alignée avec la séquence homologue de l’isoforme CPT1B (référence Q92523) et celle de l’isoforme CPT1C (référence Q8TCG5).

! L’oligopeptide 1 est à l’origine de la production de l’anticorps 1 et l’oligopeptide 2 est à l’origine de la production de l’anticorps 2. !

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On retient que :

Il existe une hélice alpha de 20 acides aminés, cette hélice alpha est composée de 12 acides aminés hydrophobes (acides aminés soulignés sur le modèle de la roue hélicoïdale), 3 acides aminés hydrophiles, de 3 glycine (qui n’est ni un acide aminé polaire ni un acide aminé apolaire) et de 2 acides aminés dont on ignore la nature (les acides aminés 121 et 122).

Ainsi on a une hélice alpha de 20 acides aminés majoritairement hydrophobes, ceci nous permet fortement de supposer que c’est une hélice alpha transmembranaire (car il faut 20 résidus pour traverser la membrane) et hydrophobe.

A partir de broyats de tissus, on prépare des extraits totaux et des fractions purifiées mitochondriales. Pour chaque tissu (foie, muscle, cerveau), ces deux types d’échantillons sont dénaturés par la chaleur en présence de SDS et de bêta-mercaptoéthanol et soumis à une électrophorèse de type SDS-PAGE (une même quantité de protéine est déposée dans chaque puits). On procède ensuite à un électrotransfert sur une membrane qui est finalement soumise à une immunodétection avec les anticorps 1 ou 2 (à une même concentration en

immunoglobulines), marqués à l’aide d’un isotope radioactif. La révélation est faite par autoradiographie et les résultats sont portés en figure B3.

! Figure B3. Foie : pistes 1 et 2 ; Muscle : pistes 3 et 4 ; Cerveau : pistes 5 et 6

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On retient que :

On cherche à obtenir des anticorps spécifiques de CPT1A. En observant les séquences des trois isoformes de CPT1 (CPT1A, CPT1B et CPT1C) et la séquence des oligopeptides 1 et 2. On voit que la séquence de l’oligopeptide 1 est retrouvée chez les trois isoformes, alors que la séquence de l’oligopeptide 2 est retrouvée seulement chez CPT1A.

On peut donc s’attendre à ce que l’anticorps issu de l’oligopeptide 1 ne soit pas spécifique de CPT1A, contrairement à l’anticorps de 2.

!Question 36 : Interprétation qualitative du western blot. Analysez les documents et choisissez la ou les réponse(s) appropriée(s) : a. L’anticorps 1 et l’anticorps 2 sont spécifiques de CPT1A FAUX : L’anticorps 1 semble révéler toutes les isoformes de l’enzyme CPT1. b. L’anticorps 1 est spécifique de CPT1A et l’anticorps 2 n’est pas spécifique de CPT1A FAUX c. L’anticorps 1 n’est pas spécifique de CPT1A et l’anticorps 2 est spécifique de CPT1A VRAI : L’anticorps 2 ne révèle que la forme hépatique de CPT1 qui est surement CP1A. d. Vis-à-vis des 3 isoformes, la différence de spécificité des anticorps 1 et 2, n’est pas surprenante VRAI : Au vu des séquences données précédemment on pouvait s’attendre à ce que l’anticorps 2 contrairement à l’anticorps 1 soit spécifique de CPT1A. e. Vis-à-vis des 3 isoformes, les résultats obtenus à l’aide de l’anticorps 1 en termes de spécificité, ne sont pas surprenants VRAI : La séquence de l’oligopeptide 1 est retrouvée sur chaque isoforme de CPT1, on peut donc s’attendre à ce que la séquence ne soit pas spécifique. !!Question 37: Interprétation quantitative du western blot. Analysez les documents et choisissez la ou les réponse(s) appropriée(s) : a. La masse moléculaire estimée de CPT1A est proche de 68 kDa b. La masse moléculaire estimée de CPT1A est proche de 88 kDa VRAI

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On retient que :

Comme attendu, l’anticorps 1 n’est pas spécifique, il révèle CPT1A, CPT1B et CPT1C.

En revanche l’anticorps 2 ne révèle l’enzyme CPT1 que dans un tissu, on peut donc fortement supposer que c’est l’enzyme CPT1A (puisque la séquence de l’oligopeptide 2 est retrouvée uniquement sur CPT1A). De plus la révélation ne se fait que dans le foie, on peut donc supposer que CPT1A est la forme hépatique de l’enzyme CPT1.

Ensuite on a une électrophorèse complètement dénaturante (SDS + bêtamercaptoéthanol), seule la masse de l’enzyme CPT1 A influe sur sa migration. Dès lors on peut déterminer la masse de CPT1A à partir de cette électrophorèse, qui est d’environ 90 KDa.

Enfin pour l’anticorps 2 on observe deux pistes issues du même tissu et pourtant avec des quantités d’enzymes CPT1A différentes (la bande de la piste 2 est plus épaisse que la bande de la piste 1). Ceci peut s’expliquer par le fait que la fraction 1 serait mitochondriale et que la fraction 2 serait totale (cytosolique + mitochondriale). En effet, on sait que la majorité des enzymes mitochondriales sont fabriquées dans le cytosol avant d’être exportées vers la mitochondrie. Ainsi la fraction 1 ne comprendrait que les enzymes CPT1A natives et exportées dans la mitochondrie, alors que la fraction 2 comprendrait les enzymes CPT1A natives et exportées vers la mitochondrie, mais aussi les CPT1A en cours de fabrication (celles subissant dans le cytosol des modifications post-traductionnelles…). D’où les différences de quantité observées (on rappelle que le Western Blot est une méthode semi-quantitative). Encore une fois n’hésitez pas à couplez vos connaissances de cours, pour ce raisonnement une bonne connaissance de son cours sur les mitochondries est nécessaire.

c. Pour l’anticorps 2, la piste 1 correspond à la fraction purifiée mitochondriale et la piste 2 à l’extrait total ??? La grille officielle met cette réponse Fausse, personnellement je l’aurai mise vraie, je n’ai pas pu déterminer la justification invalidant cette réponse. En effet il me semble que lorsque l’on a la fraction totale on a une quantité plus importante d’enzyme CPT1A car la fraction totale comprendrait la fraction cytosolique et la fraction mitochondriale d’enzyme CPT1. d. Pour l’anticorps 2, la piste 2 correspond à la fraction purifiée mitochondriale et la piste 1 à l’extrait total. De même la grille officielle met cette réponse vraie, cependant je l’aurait invalidée au profit de la proposition C. e. L’anticorps 1 a plus d’affinité pour CPT1A que l’anticorps 2 FAUX : Nous n’avons aucune information sur l’affinité dans les expériences précédentes, seules la spécificité de l’anticorps 2 est mise en évidence.

Pour mieux comprendre la structure 3D de la protéine CPT1A, des mitochondries isolées sont, dans un premier type d’expérience, traitées par du DSS (disuccinimidyl suberate), un agent de pontage hydrophobe. Ce genre de réactif chimique est capable de créer des liaisons covalentes entre les sous-unités d’un complexe (dans l’expérience on voit qu’il est utilisé à différentes concentrations). Après action, les réactifs sont éliminés et les mitochondries sont récupérées par centrifugation. Celles-ci sont alors remises en suspension puis on procède à une extraction des protéines pour finir par leur analyse par western blot (figure B4). La masse moléculaire du complexe déterminée par SDS-PAGE et correspondant à CPT1A est d’environ 270 kDa)

!Dans un deuxième type d’expérience, les mitochondries isolées sont traitées par un tampon contenant une faible concentration d’un détergent non ionique (triton X-100, digitonine), de façon à extraire et solubiliser sans les dénaturer les protéines de la membrane externe mitochondriale. Après centrifugation, les surnageants sont soumis à une chromatographie par filtration sur gel (superose 6) et sur chaque fraction recueillie (éluats de 200 microlitres), il est procédé à un western blot afin de mettre en évidence de façon semi-quantitative la protéine CPT1A (exprimée en unités arbitraires, a.u., figure B5). Le chromatogramme représente pour chaque point : en abscisse le volume d’élution et en ordonnée la quantité de CPT1A éluée. La masse moléculaire du complexe déterminée par filtration sur gel et correspondant à CPT1A est d’environ 270 kDa.

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On retient que

L’objectif des chercheurs est de déterminer la structure quaternaire de CPT1A et que pour cela ils utilisent un agent capable de créer des liaisons covalentes entre les différentes sous unités d’une même protéine.

Ici la masse de la CPT1A est de 270 KDa 3 x 88 KDa. Ceci nous amène donc à supposer que la CPT1A est un homotrimère. On utilise cet agent créant des liaisons covalentes entre sous unités parce que pour déterminer la masse d’un polymère en électrophorèse il faut utiliser des agents dénaturants pour que le seul critère influençant la migration de la protéine soit la masse. Mais dès lors on perd la structure quaternaire de la protéine. Ainsi on utilise cet agent créant des liaisons covalentes entre sous unités protéiques pour conserver la structure quaternaire de la protéine et en même temps déterminer sa masse. Une solution surement plus simple aurait-été de faire migrer la protéine à travers une chromatographie sur gel filtration pour déterminer sa masse, préalablement à sa migration électrophorétique.

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Figure B4

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Figure B5

Question 38 : Interprétation des expériences de pontage et de filtration sur gel. Analysez les documents et choisissez la ou les réponse(s) appropriée(s) : a. La concordance des masses moléculaires observée en SDS-PAGE et en filtration sur gel est une coïncidence FAUX : Ces expériences sont tout à fait concordantes, elles convergent vers une seule hypothèse : L’enzyme CPT1A est un homotrimère (composé de trois sous unités d’environ 88 KDa) de masse environ égale à 270 KDa. b. La concordance des masses moléculaires observée en SDS-PAGE et en filtration sur gel reflète l’organisation en sous-unités VRAI : cela reflète une organisation homotrimérique de la CPT1A. c. Les résultats expérimentaux sont incompatibles avec une organisation oligomérique de la protéine CPT1A FAUX : Les résultats sont compatibles avec une organisation homotrimérique.

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d. Les résultats expérimentaux sont compatibles avec une organisation homodimérique de la protéine CPT1A FAUX : Les résultats sont compatibles avec une organisation homotrimérique. e. Les résultats expérimentaux sont compatibles avec une organisation homotrimérique de la protéine CPT1A VRAI

Après hydrolyse trypsique de la protéine CPT1A, on isole par chromatographie sur phase inversée 2 tétrapeptides parmi les différents peptides produits. On analyse ces peptides par spectrométrie de masse. Les spectres obtenus après électronébulisation (ESI, pas de fragmentation) fournissent un ion moléculaire (M+H)+ de rapport m/z déterminé pour chaque peptide. La fragmentation (ESI-MS-MS) de chaque ion fournit les fragments de type « y » de rapport m/z suivants :

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Il convient de noter que le prétraitement de la protéine CPT1A par une phosphatase suivi de l’hydrolyse trypsique ne permet d’isoler qu’un seul tétrapeptide (tétrapeptide 1). Rappel : La fragmentation des chaînes peptidiques se fait principalement au niveau des liaisons peptidiques selon le schéma suivant :

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La charge positive retenue côté COOH fournit les fragments de type « y ». L’acide aminé C terminal verra sa masse augmenter de 19 (à cause du OH du groupement carboxylique et de la fonction amine). En vous aidant du tableau ci-dessous, déterminez la séquence de chaque tétrapeptide :

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En spectrométrie de masse, on retire 19 au dernier rapport m/z pour avoir la masse correspondant à l’acide aminé de l’extrémité C-terminale du peptide étudié.

La phosphorylation d’un résidu d’acide aminé, induit une augmentation de 80 du rapport m/z de cet acide aminé.

Question 39 : Déterminez la séquence des peptides trypsiques (PTyr correspond à de la phospho tyrosine) : a. Tétrapeptide 1 : Arg - Asp - Tyr - Cys Tétrapeptide 2 : Arg - Asp - PTyr - Cys b. Tétrapeptide 1 : Cys - Tyr - Asp - Arg Tétrapeptide 2 : Cys - PTyr - Asp - Arg c. Tétrapeptide 1 : Arg - Asp - PTyr - Cys Tétrapeptide 2 : Arg - Asp - Tyr - Cys d. Tétrapeptide 1 : Cys - PTyr - Asp - Arg Tétrapeptide 2 : Cys - Tyr - Asp - Arg e. Tétrapeptide 1 : aucune séquence proposée Tétrapeptide 2 : aucune séquence proposée

!!!ENZYMOLOGIE !On s’intéressera ici principalement à la CPT1, qui catalyse la réaction : palmityl-CoA + carnitine palmityl-carnitine + CoA La CPT1 a été purifiée à partir de mitochondries de foie de rat, afin de comparer son activité sur des acyl-CoA de différentes longueurs, pour une concentration constante et saturante de carnitine (2 mM). Les résultats sont les suivants : !

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On retient que :

Le peptide 1 est composé des acides aminés :

175 – 19 = 156 Arg

290 – 175 = 115 Asp-Arg

453 – 290 = 163 Tyr-Asp-Arg

556 – 453 = 103 Cys-Tyr -Asp-Arg

Le peptide 2 est composé des acides aminés :

175 – 19 = 156 Arg

290 – 175 = 115 Asp-Arg

533 – 290 = 243 = 163 + 80 PTyr-Asp-Arg On a un résidu Tyrosine phosphorylé, son

rapport m/z estaugmenté de 80, par le poids supplémentaire apporté par le groupement phosphoryle.

636 – 453 = 103 Cys-PTyr -Asp-Arg

!Question 40 : Pour une enzyme dont la cinétique est michaelienne, et qui satisfait aux conditions du quasi-équilibre, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? a. La Km est approximativement égale à la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat (ES), c’est-à-dire de l’équilibre E + S donne ES VRAI : VRAI la Km est l’inverse d’une constante d’affinité, elle est approximativement égale à une constante de dissociation. b. La Km est approximativement égale à l’inverse de la constante d’affinité du substrat pour l’enzyme (Kaff) VRAI : la Km est une constante mesurant l’inverse de l’affinité. c. La Vmax est proportionnelle à la Km FAUX : La Km est une constante propre à l’enzyme alors que la Vmax est dépendante de la concentration en enzyme. d. La Km est la concentration de substrat pour laquelle la vitesse initiale est égale à Vmax/2 VRAI : Km = [S] pour laquelle on a Vinitiale = Vmax/2. e. La Km est proportionnelle à la concentration totale de l’enzyme ([E]t) FAUX : C’est la Vmax qui est proportionnelle à la concentration totale de l’enzyme [E]t. !!Question 41 : On admet que la cinétique de la CPT1 correspond aux conditions de quasi-équilibre. Au vu des résultats présentés dans le tableau ci-dessus, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? a. Le substrat qui a la plus grande affinité pour la CPT1 est le composé de longueur C2 FAUX : Plus Km est grande, moins le substrat n’a d’affinité pour l’enzyme. b. Le substrat pour lequel la Vmax est la plus élevée est le composé de longueur C16 VRAI : C’est dans le tableau. c. Les différences de Km et de Vmax prouvent que l’enzyme purifiée est en réalité le mélange de différentes iso-enzymes FAUX : Cela ne le prouve pas, en revanche cela peut en effet expliquer les différences entre Vmax et Km observées. d. Les données présentées ne permettent pas de calculer le rapport kcat/Km VRAI : On ne peut pas calculer ce rapport en ayant simplement la Km et la Vmax comme donnée. e. Les données présentées ne sont pas interprétables car, dans les conditions du quasiéquilibre, on ne peut pas déterminer la Vmax FAUX : On peut tout à fait déterminer la Vmax dans les conditions de quasi-équilibre. !La CPT1 a été purifiée à partir de mitochondries de rat, préparées soit à partir de muscle (CPT1B), soit à partir de foie (CPT1A). Dans les deux cas, on a utilisé soit des animaux nourris, soit des animaux laissés à jeun pendant 24 heures. Sur les CPT1B et CPT1A purifiées à partir d‘animaux nourris ou à jeun, on a étudié l’effet du malonyl-CoA, qui est un composé intermédiaire de la synthèse des acides gras. Les résultats sont présentés dans la figure B6.

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On retient que :

La Km de la CPT1A est minimale et donc l’affinité est maximale pour des acyls-CoA de taille C14 et C16.

La Vmax de la CPT1A est maximale et donc l’efficacité catalytique est maximale pour des acyls-CoA de taille C16.

On retient que :

Le Malonyl-CoA diminue l’activité enzymatique de la CPT1A mais pas celle de la CPT1B, et ceux de manière moins importante quand l’animal est à jeun.

! Figure B6 : Effet du malonyl-CoA sur l’activité CPT1, mesurée avec comme substrats le palmityl-CoA et la carnitine. !!Question 42 : Au vu des résultats présentés dans la figure B6, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? a. Ces résultats démontrent que le malonyl-CoA est un inhibiteur compétitif vis-à-vis du palmityl-CoA FAUX : On a aucune information sur la nature de l’inhibition (on ne sait pas si il y a une influence sur la Km ou la Vmax). b. Seule la forme hépatique de la CPT1 (CPT1A) est significativement inhibée par le malonyl-CoA VRAI : On a supposé précédemment que la CPT1 A est la forme hépatique de la CPT1, et seule cette forme semble être inhibée par le malonyl-CoA. c. Le jeûne induit la protéolyse de la CPT1A FAUX : Nous avons aucune information sur une quelconque protéolyse de la CPT1 A. d. Le malonyl-CoA est un substrat de la CPT1A, mais pas de la CPT1B FAUX : Le malonyl-CoA est un inhibiteur de la CPT1A, et non un substrat. e. Le jeûne entraîne une augmentation de la sensibilité de la forme hépatique (CPT1A) à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA FAUX : Le jeune entraine au contraire une « protection » vis-à-vis de l’inhibition par le Malonyl-CoA. !Sachant que le jeûne induit la libération de glucagon, une hormone qui agit par l’intermédiaire de protéines-kinases, certains chercheurs ont supposé que l’effet du jeûne sur la forme hépatique de la CPT1 (CPT1A) était dû à une phosphorylation de la protéine. Ils ont purifié la CPT1A à partir de foies de rats laissés à jeun, et ont étudié l’effet du traitement de l’enzyme purifiée par un mélange de protéines-phosphatases. L’activité de l’enzyme non traitée, était de 115 nmol.min-1.mg-1 de protéines, contre 65 nmol.min-1.mg-1 de protéines pour l’enzyme traitée. Ils ont aussi comparé l’effet inhibiteur du malonyl-CoA sur l’enzyme traitée ou non par les protéines-phosphatases. Les résultats sont présentés dans la figure B7.

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Question 43 : Compte-tenu des données de l’énoncé, et des résultats présentés dans la figure B7, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? a. La déphosphorylation de la CPT1A entraîne une augmentation de son activité enzymatique FAUX : C’est la phosphorylation de la CPT1 A qui entraine une augmentation de son activité enzymatique, par le biais d’une « protection » vis-à-vis de l’effet inhibiteur par le Malonyl-CoA. b. La déphosphorylation de la CPT1A entraîne une augmentation de la sensibilité de l’enzyme à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA VRAI : La phosphorylation entraine une protection vis-à-vis de l’inhibition par le Malonyl-CoA. c. Les données expérimentales sont incompatibles avec une régulation de la CPT1A par modification covalente de l’enzyme FAUX ; Les données expérimentales supposent que la régulation de l’activité de la CPT1 A passe par des mécanismes de phosphorylation qui sont des modifications covalentes. d. La déphosphorylation de la CPT1A fait disparaître le site de fixation du malonyl-CoA FAUX : Les résultats sont plus en faveure de l’idée que la phosphorylation ferait apparaître le site de fixation du Malonyl-CoA. e. La protéolyse partielle de la CPT1A par les protéines-phosphatases entraîne une baisse de l’activité enzymatique FAUX : Les phosphatases sont des enzymes de déphosphorylations, elles ne coupent que le groupement phosphoryle. !Question 44 : Concernant la régulation d’une activité enzymatique par modification

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On retient que :

L’effet de l’inhibition de la CPT1 A par le Malonyl-CoA est moins important en absence de phosphatases, on peut donc supposer que la phosphorylation est un mécanisme rendant moins sensible la CPT1 A à l’inhibition par le Malonyl-CoA. On peut supposer que lors d’un jeune le glucagon induit des cascades de phosphorylation, parmi lesquelles on a phosphorylation de la CPT1 A qui est dès lors moins sensible à l’inhibition induite par le Malonyl-CoA et donc l’on a une dégradation plus importante de l’acide palmitique pour servir de substrat énergétique à la cellule.

covalente de la protéine (phosphorylation/déphosphorylation), quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? !Attention c’est une question générale sur les mécanismes de régulation par phosphorylation, déphosphorylation, il ne faut donc pas s’appuyer sur les résultats expérimentaux présentés précédemment pour répondre à cette question. !a. La déphosphorylation entraîne toujours une diminution de l’activité catalytique FAUX : La déphosphorylation peut dans certains cas entrainer une augmentation de l’activité catalytique. b. La phosphorylation entraîne toujours une augmentation de l’affinité de l’enzyme pour le substrat FAUX : Ce n’est pas toujours le cas, on peut avoir diminution de l’activité catalytique suite à une phosphorylation. La phosphorylation peut aussi dans certains cas ne pas affecter l’activité catalytique. c. Le pourcentage d’enzyme sous la forme phosphorylée dépend uniquement de la concentration intra-cellulaire de l’ion phosphate FAUX : Il dépend aussi de la concentration en kinase et en phosphatase, de l’activité enzymatiques de ces kinases et de ces phosphatases… d. La phosphorylation est nécessairement catalysée par des protéines-kinases et la déphosphorylation est nécessairement catalysée par des protéines phosphatases VRAI e. La régulation par modification covalente ne concerne jamais des enzymes allostériques FAUX : Les enzymes allostériques peuvent subir le même type de modification que les enzymes Michaélienne. !Afin de déterminer la localisation du site actif et du site de liaison du malonyl-CoA, la CPT1A, purifiée à partir de foies de rats nourris, a été soumise à des protéolyses ménagées. Ces expériences et des expériences complémentaires de mutagénèse dirigée in vitro, ont montré que le site de fixation du malonyl-CoA était situé sur l’extrémité N-terminale de l’enzyme, et que le site actif était situé sur l’extrémité C-terminale. Pour préciser le mode d’action du malonyl-CoA, des chercheurs ont fait exprimer différentes protéines recombinantes dans la levure S. cerevisiae (qui possède des mitochondries, mais n’a pas d’activité CPT) : la CPT1A en totalité, la CPT2 (voir schéma de l’Introduction) en totalité, et un hybride CPT1A/CPT2, formé de la fusion de l’extrémité N-terminale de CPT1A avec la totalité de CPT2. Les sites actifs de la CPT1A et de la CPT2 sont strictement identiques. Les propriétés de chacune de ces enzymes ont été étudiées. Les constructions et les résultats sont présentés ci-dessous :

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On retient que :

Le site de fixation du Malonyl-CoA est situé à l’extrémité N-terminale de la CPT1 A et le site actif est situé à l’extrémité C-terminale de la CPT1A (le site actif est identique à celui de la CPT12).

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! !Question 45 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) compatible(s) avec les données de l’énoncé et avec les résultats présentés ci-dessus ? a. La CPT2 est insensible à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA VRAI b. La présence du site actif de l’enzyme suffit pour que le malonyl-CoA puisse exercer son effet inhibiteur FAUX : Le site de fixation du Malonyl-CoA est nécessaire (mais non suffisant). c. L’effet inhibiteur du malonyl-CoA nécessite la présence simultanée de l’extrémité Nterminale et de la partie C-terminale de la CPT1A VRAI : En effet si l’on a l’extrémité N-terminale de la CPT1 A et l’extrémité C-terminale de la CPT2 on n’a pas d’inhibition par le Malonyl-CoA. d. L’extrémité N-terminale de la CPT1A régule négativement l’activité de la CPT2 FAUX : Que l’on a la CPT1A, la CPT2 ou la CPT1/2 on a la même activité enzymatique, seule l’inhibition par le Malonyl-CoA change. e. L’extrémité N-terminale de la CPT1A régule négativement l’affinité du site actif de la CPT2 pour le palmityl-CoA FAUX : Que l’on a la CPT1A, la CPT2 ou la CPT1/2 on a la même affinité pour le palmityl-CoA. !Des travaux ont montré que le jeûne provoque une augmentation de la fluidité de la membrane externe de la mitochondrie, et qu’il existe une relation inverse entre cette fluidité et le degré d’inhibition de la CPT1A par le malonyl-CoA. L’insertion de la CPT1A dans la membrane externe de la mitochondrie est telle que l’extrémité N-terminale et l’extrémité Cterminale se trouvent toutes deux dans le cytosol. !!

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On retient que :

Même en présence du site actif et du site de fixation du Malonyl-CoA, la CPT2 n’est pas inhibée par le Malonyl-CoA.

!

!

! Tableau B1 : Des mitochondries de foies de rats nourris ont été traitées à l’alcool benzylique aux concentrations indiquées, puis avec l’agent permettant le couplage stable de l’extrémité N-terminale et de l’extrémité C-terminale de la CPT1A (« Couplage N/C »), ce qui permet d’évaluer la probabilité de contact entre ces deux extrémités. Les résultats sont exprimés en % !de la CPT1A sous forme couplée.

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On retient que :

L’alcool benzylique diminue la probabilité d’interaction entre l’extrémité N-terminale et l’extrémité C-terminale, de plus la présence d’alcool benzylique diminue l’inhibition par le Malonyl-CoA sur l’activité de la CPT1 A. On en déduit que plus la probabilité d’interaction entre l’extrémité N-terminale et C-terminale de la CPT1 A est forte, plus l’inhibition par le Malonyl-CoA est forte. Ceci explique que plus la fluidité de la membrane est importante plus on a inhibition par le Malonyl-CoA (car une membrane fluide favorise les interactions entre l’extrémité N-terminale et C-terminale.

On retient que :

Plus la fluidité de la membrane mitochondriale est importante moins on a d’inhibition par le Malonyl-CoA.

L’extrémité N-terminale et C-terminale se trouvent toutes deux dans le cytosol.

!!!Question 46 : Compte tenu des données de l’énoncé, et des résultats présentés dans la figure B8 et le tableau B1, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? a. En fluidifiant la membrane externe de la mitochondrie, l’alcool benzylique diminue la probabilité de contact entre l’extrémité N-terminale et l’extrémité C-terminale de la CPT1A VRAI b. L’alcool benzylique mime l’effet du jeûne sur la sensibilité de la CPT1A à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA VRAI : L’alcool benzylique diminue l’inhibition par la Malonyl-CoA sur la CPT1 A. c. L’alcool benzylique augmente la sensibilité de la CPT1A à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA FAUX : L’alcool benzylique diminue l’inhibition par la Malonyl-CoA sur la CPT1 A. d. L’alcool benzylique diminue l’activité catalytique de la CPT1A FAUX : L’alcool benzylique n’influe pas sur l’activité catalytique de la CPT1 A, il n’a d’effet que sur l’inhibition par le Malonyl-CoA. e. L’alcool benzylique, qui est hydrophobe, entre en compétition avec la palmityl-CoA pour le site actif de la CPT1A FAUX : Aucune des expériences nous amène vers cette hypothèse. !!Question 47 : Au total, concernant la régulation de la CPT1A, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) compatible(s) avec l’ensemble des données des énoncés et des résultats présentés dans la partie « enzymologie » de ce problème ? !a. L’inhibition de la CPT1A par le malonyl-CoA nécessite un contact entre l’extrémité N-terminale et l’extrémité C-terminale de l’enzyme VRAI : Ceci est supposé car l’inhibition par le Malonyl-CoA est favorisée quand on favorise l’interaction entre l’extrémité N-terminale et C-terminale. b. Le jeûne, en provoquant une augmentation de la fluidité de la membrane externe de la mitochondrie, diminue la probabilité de contact entre l’extrémité N-terminale et l’extrémité C-terminale de la CPT1A VRAI : Ceci est supposé car le jeune à le même effet que l’alcool benzylique. c. Le jeûne, en provoquant une diminution de la sensibilité de la CPT1A à l’effet inhibiteur du malonyl-CoA, entraîne une diminution du transfert de l’acide palmitique vers la matrice mitochondriale FAUX : Le jeune favorise l’activité de la CPT1 A en dimunant l’effet inhibiteur du Malnoyl-CoA. d. La diminution de la concentration de malonyl-CoA observée au cours du jeûne peut contribuer à l’augmentation du transfert de l’acide palmitique vers la matrice mitochondriale VRAI : Aucune information n’est donnée sur une éventuelle diminution de la concentration du Malonyl-CoA cependant rien ne contredit cette hypothèse, une diminution en Malonyl-CoA pourrait en effet diminuer son inhibition. e. Une augmentation du transfert de l’acide palmitique vers la matrice mitochondriale permet d’augmenter sa dégradation oxydative VRAI : Les enzymes sont souvent régulées par leur quantité de substrat, si elle ne fonctionnent pas physiologiquement à leur Vmax, on peut supposer que plus l’on a de substrat plus l’activité de l’enzyme est favorisée et donc plus l’on a d’acide palmitique, plus sa dégradation est activée. !!L’inhibition de la CPT1A pourrait être un moyen de traiter certaines maladies métaboliques. Plusieurs groupes ont donc cherché à synthétiser des inhibiteurs de cette enzyme. Une première série de composés, appelés C73-CoA, C76-CoA et C75-CoA ont été testés sur une CPT1A recombinante produite dans la levure S. cerevisiae. Les résultats sont présentés dans la figure B9.

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! Figure B9 : L’activité CPT1A a été mesurée en l’absence d’inhibiteurs, ou en présence de l’un d’entre eux. Chaque inhibiteur a été utilisé à la même concentration (5 µM).

! Question 48 : Concernant les composés étudiés dans l’expérience de la figure B10, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? a. Les trois composés étudiés sont des inhibiteurs allostériques de la CPT1A FAUX : Aucune courbe sigmoïde n’est observée, on a aucune preuve d’une quelconque coopérativité. b. Les trois composés étudiés sont des inhibiteurs compétitifs de la CPT1A VRAI : On a variation de la Km. c. Les trois composés étudiés sont des inhibiteurs non compétitifs de la CPT1A FAUX : On n’a pas de modification de la Vmax (les courbes coupent l’axe des ordonnés au même point sur l’axe des ordonné dans la représentation en double inverse). d. Le composé qui a le plus fort pouvoir inhibiteur est le C75-CoA VRAI e. Le composé qui a le plus fort pouvoir inhibiteur est le C73-CoA FAUX !BIOENERGETIQUE !

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On retient que :

On a une série d’inhibiteurs qui font varier la Km (les courbes coupent l’axes abscisses en différents points), ce sont donc des inhibiteurs compétitifs et le plus efficace est le C75-


Un inhibiteur compétitif fait augmenter la Km, cela se traduit par une courbe qui coupe l’axe des abscisses en des différents points sur la représentation en double inverse.

Un inhibiteur non-compétitif fait diminuer la Vmax et cela se traduit par une courbe qui coupe l’axe des ordonnés en différents points sur la représentation en double inverse.

Des souris mutantes présentant un excès d’activité CPT avec un métabolisme lipidique anormal font l’objet d’analyses biochimiques musculaires qui donnent les résultats suivants, exprimés en % par rapport aux valeurs mesurées dans des muscles de souris contrôles : 148 sur la vitesse de production mitochondriale d’ATP 151 sur la vitesse de production mitochondriale d’acétyl-CoA 62 pour la teneur en lipides totaux 144 sur la vitesse de production mitochondriale de FADH2

!!!!Question 49 : Sur la base des résultats ci-dessus, quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s)? a. Les souris mutantes ont une glycolyse hépatique anormalement élevée FAUX : C’est la lipolyse qui est augmentée, car on a une diminution de la concentration en lipide total. L’on a aucune information sur la concentration en glucide. b. L’accroissement de la production d’ATP peut résulter d’un accroissement de la fourniture de molécules de coenzymes réduits à la chaîne respiratoire VRAI : On a une augmentation de la concentration en FADH2. c. Ces souris mutantes ont une capacité anormalement élevée d’oxydation musculaire des acides gras VRAI : On a une augmentation de la lipolyse et une sur production d’ATP par le mécanisme de la respiration cellulaire. d. Un défaut du Cycle de Krebs est responsable de la totalité des observations effectuées chez les souris mutantes FAUX : Cela peut être un défaut de l’hélice de Lynen (lors de la β-oxydation des acides gras). e. Aucune des interprétations ci-dessus n’est exacte FAUX !Dans des conditions où les acides gras peuvent entrer dans les mitochondries, les capacités fibroblastiques de production mitochondriale de NAD+, NADH + H+, FAD, FADH2 et ATP sont mesurées, en réponse à l’addition d’acides gras libres, chez un malade présentant un déficit sévère de la ß-oxydation des acides gras !!!!!

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On retient que :

Les souris mutantes ont une production d’ATP mitochondriale plus importante que la normale, ceci illustre la présence d’une respiration cellulaire plus importante que la normale.

On a une augmentation de la production d’acétyl-CoA. L’acétyl-CoA est un carrefour métabolique, il est produit par la glycolyse, la lipolyse ou encore la protéolyse. Ainsi une augmentation de la production d’Acétyl-CoA trouve souvent son origine dans l’augmentation d’une des voies de dégradation de substrat énergétique (glycolyse, lipolyse ou protéolyse).

On a une diminution de la concentration en lipides totaux, cela suppose que la voie de dégradation de substrat énergétique à l’origine de l’augmentation de la quantité d’Acétyl-CoA est la lipolyse. Une augmentation de la lipolyse entraine en effet une diminution de la concentration en lipides.

Une augmentation de la lipolyse induit une augmentation de la concentration en coenzymes réduits tels que le FADH2.

Question 50 : Par comparaison avec des fibroblastes d’un individu sain, identifiez la ou les bonne(s) réponse(s) : a. La production d’ATP est accrue FAUX : On a une diminution de l’oxydation des acides gras et donc une diminution de la production d’Acétyl-CoA et donc une diminution de la concentration en Coenzymes réduits et donc une diminution de la production d’ATP. b. Le rapport NAD+ / NADH+H+ est diminué FAUX : La quantité de NADH,H+ est diminuée (diminution de la production de Coenzymes réduis) et donc le rapport ci-dessus est augmenté. c. Les productions de NADH + H+, FADH2 et ATP sont diminuées VRAI : On a diminution des coenzymes réduits et donc de la production d’ATP. d. Les productions de NADH + H+ et FADH2 sont diminuées VRAI : On a diminution des coenzymes réduits. e. Le rapport FAD / FADH2 est diminué FAUX : La quantité de FADH2 est diminuée (diminution de la production de Coenzymes réduits) et donc le rapport ci-dessus est augmenté. !Des mitochondries de souris normales sont isolées et placées dans un milieu permettant leur respiration en présence de substrats. La capacité de ces mitochondries à respirer, synthétiser de l’ATP et être le siège d’un transport de protons est mesurée. !!!!Question 51 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? a. La face inter-membranaire de la membrane mitochondriale interne se charge positivement par rapport à la face matricielle au cours de la respiration VRAI : Les complexes I, III et IV sont des pompes à protons et font passer des protons à travers la membrane interne mitochondriale dans l’espace intermembranaire. b. La membrane mitochondriale externe contrôle l’établissement du gradient de protons présent de part et d’autre de la membrane interne lorsque les mitochondries respirent FAUX : Le gradient de proton s’établit au niveau de la membrane interne et est contrôlé par la membrane interne. c. La synthèse mitochondriale d’ATP est accompagnée par un transport de protons depuis l’espace inter-membranaire vers la face matricielle de la membrane interne VRAI : La traversée de protons dans le sens du gradient fournit l’énergie nécessaire à la phosphorylation oxydative d’ADP en ATP. d. Au sein de la chaîne respiratoire, interviennent des systèmes transporteurs de protons et d’électrons VRAI : Les complexes I, III IV sont des transporteurs à protons et à électrons, le complexe II est uniquement un transporteur à électron. e. Le transport des électrons, le transport des protons et les phénomènes de phosphorylation correspondent à des processus étroitement couplés VRAI : L’objectif de ces trois mécanismes couplés est la production d’ATP. !BIOLOGIE MOLECULAIRE !

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On retient que

On a un déficit dans la β-oxydation des acides gras. Ceci entraine une diminution de la production de l’Acétyl-CoA, une diminution de la production de Coenzymes réduits (diminution de la concentration en NADH,H+ et FADH2). Une diminution de la concentration en Coenzymes réduits induit une diminution de la production d’ATP.

On a une augmentation de la concentration en lipides (car on n’a plus de dégradation de ces lipides par la voie de la β-oxydation des acides gras).

Pour étudier la structure du ou des gènes codant la CPT1 ainsi que le profil d’expression tissulaire, des chercheurs disposent d’une banque d’expression réalisée à partir d’un mélange de tissus (foie, muscle, muscle cardiaque) ainsi que, pour le criblage, d’un anticorps anti CPTA1 de lapins préparés à partir de l’oligopeptide 1 comme indiqué plus haut (figure B3). Cette banque d’expression utilise un système bactérien comme cellules hôte

Question 52 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? a. On réalise une banque d’expression après extraction des acides nucléiques suivie d’une transcription in-vitro puis synthèse des ADNc et clonage FAUX : La banque d’ADNc ne passe pas par une transcription in vitro, mais une rétrotranscription in vitro d’ARNm en ADNc. b. On réalise une banque d’expression après insertion de l’ensemble des ADNc obtenus à partir du mélange dans un phage comportant un gène codant la bêta galactosidase sous le contrôle du promoteur d’un « gène domestique » humain FAUX : Il ne me semble pas que l’on utilise un promoteur humain, mais plutôt un promoteur bactérien. c. On réalise une banque d’expression après insertion des ADNc obtenus à partir du mélange, chacun dans un vecteur comportant un gène codant la bêta galactosidase sous le contrôle d’un promoteur de l’opéron lactose VRAI d. La protéine produite est en général une protéine de fusion VRAI : La protéine produite contient en général une partie de la séquence peptidique de la béta-galactosidase (car l’insertion de l’ADNc se fait au sein du gène de la béta-galactosidase). e. Tous les ADNc insérés correspondant à CPTA1, exprimeront la protéine CPTA1 FAUX : Seuls ceux insérés dans le bon cadre de lecture exprimeront la protéine CPT1 A (soit 1/3 des ADNc insérés). !Le criblage à l’aide de l’anticorps 1 a permis d’identifier deux clones recombinants (X et Y). Chacun de ces clones est amplifié après culture en milieu bactérien et les inserts sont extraits et isolés du vecteur. Chacun des inserts (ADNc) des clones X et Y est marqué de manière radioactive et utilisé comme sonde pour réaliser un northern blot à partir d’extraits de différents tissus. Après hybridation avec l’ADNc du clone X et lavages, l’autoradiographie montre les résultats indiqués dans la figure B10 : !!!!!!!!!!!!

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Les banques d’expressions sont des banques protéiques qui s’obtiennent par récupération d’ARNm qui est rétrotranscrit en ADNc, ADNc inséré par un vecteur au sein du génome bactérien (hôte), bactéries qui vont produire les protéines d’intérêt. On utilise de l’ADNc qui est un gène complet car les bactéries ne sont pas équipées de machineries pouvant réaliser de l’épissage, leurs transcrits ne doit donc pas contenir d’introns.

Attention les bactéries ne peuvent pas réaliser de modifications post-traductionnelles, donc on utilisera dans certains cas des levures qui sont des organismes eucaryotes, qui elles peuvent réaliser des modifications post-traductionnelle bien que ces dernières ont un moins bon rendement que les bactéries.

!Figure B10 : Northern blot obtenu après hybridation avec l’ADNc du clone X. GB = globules blancs. La ligne en pointillés fins est un simple guide d’alignement.

!!!Question 53 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? Les résultats observés sont compatibles avec : a. Une transcription spécifique de tissu VRAI : C’est une hypothèse compatible avec les résultats observés, on pourrait par exemple supposer l’existence de plusieurs gènes CPT1 qui seraient transcris de manière spécifique dans certains tissus. b. Une réplication spécifique de tissu FAUX : La réplication n’influence pas la production d’ARNm. c. Une utilisation de promoteurs alternatifs VRAI : C’est une hypothèse compatible avec les résultats observés, un emploi de promoteur alternatif aboutit à des ARNm de tailles différentes. d. Une maturation spécifique de tissu des ARNm VRAI : Un épissage alternatif par exemple est tout à fait compatible avec ces résultats. e. L’absence du signal au niveau du muscle ne peut s’expliquer que par des artéfacts liés à la qualité de l’anticorps 1 utilisé pour le criblage de la banque d’expression FAUX : Vu que l’expression du gène CPT1 semble être tissu spécifique, rien ne contredit l’idée que dans le muscle on n’aurait pas d’expression du tout du gène CPT1. !La membrane du northern-blot est débarrassée (déshybridée) de la sonde ADNc du clone X puis ré-hybridée avec l’ADNc du clone Y. Les résultats obtenus sont indiqués dans la figure B11 : !

! Figure B11 : Northern blot obtenu après hybridation à l’aide de l’ADNc du clone Y. GB = globules blancs. La ligne en pointillés fins est un simple guide d’alignement.

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On retient que :

Les chercheurs ont réalisé un Nothern Blot visant à identifier l’ARNm codant pour la protéine CPT1. On remarque que différentes formes d’ARNm de CPT1 sont identifiées en fonction du tissu dans lequel on se trouve (ces différentes formes d’ARNm pourraient trouver leur origine dans de l’épissage alternatif, l’emploi de promoteurs alternatifs, de sites de polyadénylations alternatifs…).

On retient que :

La sonde Y reconnait des formes d’ARNm de CTP1 non identifiées avec la sonde issue du clone X.

!!Question 54 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? Les résultats des deux northern blots (B10 et B11) sont compatibles avec: a. L’utilisation de sites d’initiation de la traduction différents selon les tissus FAUX : L’emploi de sites d’initiations de la traduction différents n’aboutirait pas à la production de formes différentes d’ARNm et donc n’expliquerait pas les résultats observés. Des sites d’initiations de la traduction différents aboutissent à des protéines différentes mais normalement on a des ARNm identiques. b. L’utilisation de promoteurs alternatifs selon les tissus VRAI : C’est une hypothèse compatible avec les résultats observés. c. L’utilisation de sites d’épissage différents selon les tissus VRAI : Comme dit précédemment c’est une hypothèse compatible avec les résultats observés. d. L’utilisation de sites de polyadénylations différents selon les tissus VRAI : De même c’est une hypothèse compatible avec les résultats observés, en effet des sites de polyadénylation différents aboutiraient à des ARNm des tailles différentes et expliqueraient ces fixations à différents ARNm des sondes issues des clones X et Y. e. L’ensemble de tous ces mécanismes FAUX !Question 55 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? L’ensemble des résultats permettent à ce stade d’affirmer que les ADNc des clones X et Y : a. Sont les produits de deux gènes différents FAUX : L’emploi de gènes différents est une hypothèse compatible avec les résultats mais ce n’est pas prouvé. b. Sont issus d’un seul et même gène FAUX : Ce n’est pas prouvé, car en effet l’emploi de gènes différents est une hypothèse compatible avec les résultats observés. c. Correspondent à des expressions différentes au cours du développement FAUX : C’est une hypothèse peu probable car les Nothern Blot ont été réalisés à un seul moment du développement. d. Sont les produits d’une même famille de gènes FAUX : De même, c’est une hypothèse compatible avec les résultats, mais ce n’est pas prouvé, on peut aussi très bien avoir un gène unique subissant un épissage alternatif et aboutissant aux Nothern Blot observés. e. Aucune de ces propositions n’est exacte VRAI !Les extrémités des ADNc issus des clones X et Y ont été séquencées. Les résultats de séquence du premier et dernier exon obtenus pour le brin sens, sont indiqués respectivement en figure B12A pour le clone X et en figure B12B pour le clone Y : A- 5’ CCTTCTGAGACCCCCCAGGC……………………CCTACTGAATCCCCAAAGGC 3’ Premier exon Dernier exon B- 5’CCTTCTGAGACCCCCCAGGC…………………….GCCTGGGGGGTCTCAGAAGG 3’ Premier exon Dernier exon !Figure B12A : Une partie du brin sens (premier et dernier exon) du clone X. !B12B : Une partie du brin sens (premier et dernier exon) du clone Y On souhaite réaliser une RT-PCR à l’aide d’amorces spécifiques de la séquence de l’ADNc du clone X. Pour cela, on décide de réaliser un choix d’amorces.

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Construction d’amorces :

1) Détermination de la séquence permettant une amplification spécifique de notre ADN : !

La séquence permettant d’amplifier spécifiquement notre ADN est déjà donnée, il n’y a pas

!Question 56 : Parmi les combinaisons proposées ci-dessous, laquelle ou lesquelles permet ou permettent de réaliser une amplification correcte ? a. 5’ CCTTCTGAGACCCCCCAGGC 3’ + 5’ GGATGACTTAGGGGTTTCCG 3’ FAUX : La seconde amorce proposée correspond à l’amorce anti-sens mais représentée de 3’ en 5’. b. 5’ GGAAGACTCTGGGGGGTCCG 3’ + 5’ GGATGACTTAGGGGTTTCCG 3’ FAUX : La première amorce proposée correspond à l’amorce anti-sens mais représentée de 3’ en 5’. c. 5’ GGAAGACTCTGGGGGGTCCG 3’ + 5’ CCTACTGAATCCCCAAAGGC 3’ FAUX : La première amorce proposée correspond à l’amorce anti-sens mais représentée de 3’ en 5’. d. 5’ CCTTCTGAGACCCCCCAGGC 3’ + 5’ GCCTTTGGGGATTCAGTAGG 3’ VRAI : La première amorce proposée correspond bien à l’amorce sens et la seconde proposée à l’amorce anti-sens. e. 5’ GCCTTTGGGGATTCAGTAGG 3’ + 5’ CCTTCTGAGACCCCCCAGGC 3’ VRAI : La première amorce proposée correspond bien à l’amorce anti-sens et la seconde à l’amorce sens. !Grâce au couple d’amorces adéquates, les produits de RT-PCR sont analysés et montrent, après électrophorèse, les résultats portés dans la figure B13. !

! Figure B13 : Electrophorèse des produits de RT-PCR obtenus grâce au couple d’amorces, correspondant à la séquence du clone X. Les pointillés indiquent des produits de RT-PCR de faible intensité. La ligne en pointillés fins est un simple guide d’alignement. La même expérience de RT-PCR est réalisée à l’aide d’amorces spécifiques de la séquence d’ARNm du clone Y. Les résultats sont portés dans la figure B14. !

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Figure B14 : Electrophorèse des produits de RT-PCR obtenus grâce au couple d’amorces correspondant à la séquence du clone Y. Les pointillés indiquent des produits de RT-PCR de faible intensité. La ligne en pointillés fins est un simple guide d’alignement.

!Question 57 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? L’ensemble des résultats obtenus par RT-PCR : a. Confirme l’existence de deux gènes différents correspondant aux clones X et Y FAUX : De même rien n’est encore prouvé, c’est une hypothèse qui est compatible bien qu’elle commence à s’émousser suite à la RT-PCR qui montre que l’emploi des amorces issues des clones X et Y commencent à donner des résultats se ressemblant de plus en plus. b. Montre que cette technique est plus sensible que le northern blot VRAI : On détecte plus de type d’ARNm CTP1 avec les amorces issues du même clone à l’origine des sondes X et Y utilisé en Nothern Blot précédemment. c. Démontre l’existence de deux ARNm d’un même gène de stabilité différente selon les tissus FAUX : C’est compatible avec les résultats mais ce n’est pas démontré. d. Montre que l’ADNc du clone Y correspond à un ARNm majoritairement exprimé dans les tissus de type musculaire VRAI : Les ARNm musculaires sont fortement mis en évidence suite à la RT-PCR utilisant des amorces issue du clone Y. e. Aucune de ces propositions n’est exacte FAUX

!Des médecins ont adressé à des chercheurs spécialistes de CPT, pour une étude génétique, une famille dont un enfant présentait une maladie sévère affectant le métabolisme d’oxydation du palmitate. Ces chercheurs réalisent à partir de fibroblastes un western blot chez l’enfant malade ainsi que chez ses parents, qui ne présentent aucun symptôme. Des résultats significatifs ne sont obtenus qu’avec l’anticorps reconnaissant CPT1A. Les résultats sont portés sur la figure B15.

!

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On retient que :

Les expériences de RT-PCR confirment l’expression tissu spécifique du gène CPT1, expression tissu spécifique s’exprimant par l’existence de différentes formes d’ARNm CPT1 en fonction du tissu dans lequel on se trouve.

On retient que :

La protéine CPT1 A n’est pas révélée chez l’enfant malade.

Figure B15 : En 1 le père, 2 la mère, 3 l’enfant malade, 4 Individu sain contrôle. Les bandes de faible intensité correspondent à des hybridations non spécifiques. !!!Question 58 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? A ce stade, les résultats obtenus chez le malade, sont compatibles avec : a. La synthèse d’une protéine instable totalement dégradée VRAI : Cela expliquerait l’absence de bande au Western Blot chez l’enfant malade. b. La synthèse d’ARNm codant CPT1A totalement dégradé VRAI : Une absence d’ARNm induirait une absence de protéine CPT1 A chez l’enfant malade. c. L’absence de transcription du gène codant CPT1A par hyperméthylation des promoteurs VRAI : Cela induirait une absence d’ARNm CPT1 A et donc une absence de protéine CPT1 A. d. La présence de mutations d’épissage VRAI : Cela pourrait aboutir par exemple à un décalage du cadre de lecture, à l’apparition d’un codon stop prématuré et à la production d’une protéine CPT1 A tronquée et donc non reconnue par l’anticorps anti-CPT1 A ou encore cela aboutirait à une dégradation instantanée de cette protéine CPT1 A tronquée (pour éviter son agrégation). e. Une délétion totale du gène CPT1A VRAI : Si on a absence du gène CPT1 A, on a absence de l’ARNm codant pour CPT1 A et donc absence de la protéine CPT1 A. !Des RT-PCR chevauchantes sont réalisées sur les ARNm du malade à l’aide d’amorces spécifiques de CPT1A. Un produit de RT-PCR F1 inclut, chez le sujet témoin, les exons 13, 14 et 15, l’autre fragment F2 comprend les exons 15, 16 et 17. Les résultats observés sont portés sur les figures B16A et B16B. Chez le malade, on retrouve deux fragments surnuméraires à l’état hétérozygote : F1 M-602 bp et F2 M-350 bp

! Figure B16 : Etude par RT-PCR du malade (M) et d’un sujet témoin (C) !Le fragment F1 M-602 bp a été identifié chez le père à l’état hétérozygote Le fragment F2 M-350 bp a été identifié chez la mère à l’état hétérozygote

! !

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On retient que :

Le patient possède deux types d’ARNm : un ARNm plus long au niveau de ses exons 13, 14 et 15 (de 602 bp au lieu de 489 bp), et un ARNm plus court au niveau des exons 15, 16 et 17 (350 au lieu de 503 bp). Le premier ARNm anormal (M-602) est hérité de son père et le second ARNm anormal (M350) est hérité de sa mère.

!Pour mieux comprendre ces anomalies, on détermine la séquence des fragments surnuméraires chez le sujet malade c’est à dire, F1.M-602 bp purifié et F2.M-350 bp purifié. Les résultats sont portés sur la figure B17. La séquence du fragment F1.M-602 bp montre la présence de l’exon 13 et un fragment compris dans l’intron 13 (figure B17A1). La séquence du fragment F2.M-350 bp montre la présence des exons 15 et 17 (figure B17B1).

! Figure B17 : A1 et B1 sont les séquences obtenues chez le sujet malade A2 et B2 sont les séquences obtenues chez le sujet témoin !A : A1 partie de séquence du fragment de 602 bp recouvrant les exons 13 à 15 A2 partie de séquence du fragment de 489 bp recouvrant les exons 13 à 15 !B : B1 partie de séquence du fragment de 350 bp recouvrant les exons 15 à 17

B2 partie de séquence du fragment de 503 bp recouvrant les exons 15 à 17 !!Question 59 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? A ce stade, les anomalies observées comparées au sujet témoin, permettent d’affirmer chez le malade la présence : a. D’une anomalie d’épissage possible avec rétention d’un fragment de l’intron 13 pour F1 M-602 bp VRAI. b. D’une duplication de l’intron 13 dans le gène CPT1A pour F1 M-602 bp FAUX : On a une rétention d’une partie de l’intron 13, mais aucune information nous indiquerait que cet intron se serait dupliqué. c. D’une anomalie d’épissage possible avec saut de l’exon 16 pour le fragment F2 M-350 bp

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On retient que :

L’ARNm anormal M602 comprend une rétention d’une partie de l’intron 13.

L’ARNm anormal M350 comprend une délétion de l’exon 16.

VRAI d. D’une délétion du gène CPT1A qui emporte l’exon 16 et toute la partie 3’du gène CPT1A FAUX : Si cette hypothèse était valide, l’on n’aurait pas d’exon 17 au sein de l’ARNm. e. Aucune de ces propositions n’est exacte !Pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires au niveau génomique, les chercheurs ont entrepris le séquençage de l’intégralité du gène CPT1A chez le malade et ont identifié deux variations de séquence chez le malade, non retrouvées chez le sujet témoin. La première est une délétion de TT dans une séquence répétée en T (figure B18), délétion située en 3’ dans l’intron 13 à l’état hétérozygote. Cette délétion a également été retrouvée chez le père. Aucune autre anomalie n’est retrouvée au voisinage immédiat de la région de 113 bp insérée dans F1 M-602 bp. !La seconde est une variation de séquence G>A qui a été retrouvée chez le malade dans le site accepteur d’épissage de l’intron 15 à l’état hétérozygote et qui est transmise par la mère.

!Question 60 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ?

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Voici une séquence d’ADN où les exons sont représentés en majuscules et les introns en minuscules :

5’ATCGTATCCGTGACCgtcctaatgttaaactgatcagtagactagGATCCTGACTAGCTAG 3’

On appelle gt le site donneur d’épissage et ag le site accepteur d’épissage.

Dans la grande majorité des cas, on peut considérer que :

Au sein d’un exon :

L’apparition d’un site donneur d’épissage peut entrainer une diminution la taille de l’ARNm.

L’apparition d’un site accepteur d’épissage peut entrainer une diminution de la taille de l’ARNm.

!Au sein d’un intron :

L’apparition ou la disparition d’un site donneur d’épissage peut entrainer une augmentation de la taille de l’ARNm.

L’apparition d’un site accepteur d’épissage peut entrainer une augmentation de la taille de l’ARNm.

La disparition d’un site accepteur d’épissage peut entrainer une diminution de la taille de l’ARNm.

Les cas présentés ci-dessous représenteront la très grande majorité des cas pathologiques trouvant leur origine dans l’épissage présentés au concours, cependant il est toujours possible de trouver des contre exemples.

Je vous conseille d’apprendre à retrouver ces cas généraux, et surtout de bien comprendre le raisonnement qui les sous-tend, pour, en cas de besoin, être capable de les retrouver rapidement, et de prendre du recul par rapport à un cas atypique.

A ce stade, les anomalies observées transmises par la mère correspondent : a. A une mutation du site accepteur d’épissage de l’intron 15 qui induit un saut de l’exon 16 VRAI : En absence de ce site accepteur d’épissage, on aura non seulement épissage de l’intron 15 mais aussi de l’exon 16, on aura épissage jusqu’au site accepteur d’épissage retrouvé en fin d’intron 16 et donc saut de l’exon 16. b. A une mutation qui crée un site cryptique accepteur d’épissage, préférentiellement utilisé durant l’épissage FAUX : Si l’on crée un site cryptique accepteur d’épissage au sein d’un intron, on aura donc rétention d’une partie de cet intron (mais pas de saut d’exon), et si l’on crée un site cryptique accepteur d’épissage au sein de l’exon 16 on aura disparition d’une partie de l’exon 16, mais pas dans son intégralité (la partie de l’exon 16 située après ce nouveau site cryptique d’épissage sera elle conservée et donc aurait été détectée lors du Sanger). c. A une mutation synonyme qui affecte l’épissage FAUX : Il me semble qu’une mutation synonyme est une mutation touchant un exon, or ce genre de mutation aurait pu aboutir à l’apparition d’un site donneur ou accepteur d’épissage au sein d’un exon certes. Mais cela n’aurait tronqué qu’une partie de l’exon 16, et non son intégralité. d. A une mutation qui active un site cryptique dans l’exon 17 Une mutation induisant l’apparition d’un site cryptique d’épissage dans l’exon 17 diminuerait la taille de l’exon 17, mais n’affecterait pas l’exon 16. !e. Aucune de ces propositions n’est exacte !Devant l’incompréhension du cas paternel et après relecture de la séquence génomique normale de l’intron 13 deux motifs particuliers de part et d’autre du fragment de 113 bp attirent l’attention des chercheurs (figure B18).

! !Question 61 : Quelle est la ou quelles sont les proposition(s) exacte(s) ? A ce stade, les anomalies observées transmises par le père sont compatibles avec : a. Une activation de sites cryptiques démasqués par la délétion du dinucléotide TT à la fin de l’intron 13 VRAI : La délétion TT modifie la structure tridimensionnelle de l’ARNm et il est possible qu’elle démasque un site donneur d’épissage dans l’intron 13 qui sera préférentiellement utilisé et aboutira à une rétention d’une partie de l’intron 13. b. Une variation de séquence qui crée un site accepteur d’épissage AG cryptique en 5’ du fragment de 113 bp FAUX : On nous dit clairement dans l’énoncé que l’on a une délétion TT, ainsi la seule variation de séquence observable est celle située à la jonction de la délétion TT. c. Une variation de séquence qui crée un site donneur d’épissage GT cryptique en 3’ du fragment de 113 bp FAUX : De même, on nous dit clairement dans l’énoncé que l’on a une délétion TT, ainsi la seule variation de séquence observable est celle située à la jonction de la délétion TT. d. Deux variations de séquence de part et d’autre du fragment de 113 bp créant un exon dans l’intron 13 FAUX : De nouveau on nous dit clairement dans l’énoncé que l’on a une délétion TT, ainsi la seule variation de séquence observable est celle située à la jonction de la délétion TT.

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e. Une absence d’épissage du fragment de 113 bp qui ne peut avoir lieu car les sites donneurs et accepteurs d’épissage sont en position inverse FAUX : Une inversion des sites donneurs et accepteurs d’épissage ne peut pas être observée suite à une simple délétion de deux nucléotides TT.

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Documents

Correction du concours 2010 2011