Rev. Fr. Transfus. I-I6mobiol., 1993, 36, 451-464 451

MEMOIRE ORIGINAL

Corr61ation entre I 'ARN du virus de l'h6patite C (VHC)

et les anticorps anti-VHC dans une population d'h6modialys6s

par F. Bouchardeau*, P. Chauveau**, N. Le Marrec*, I. R6ach***, C. Naret**, A. Girault*, M. Zamroud* ,

B. Zins**, P. Finetti***, A.M. Courouc6*.

* Inst i tut National de Transfus ion Sanguine, 6, rue Alexandre-Cabanel, 75015 Paris (France).

** Centre m6dical Edouard-Rist , 14, rue Boileau, 75016 Paris (France).

*** Centre m6dico-chirurgical de la Porte-de-Choisy, 6, place de Port-au-Prince, 75013 Paris (France).

RESUME

Dans une populat ion de 75 hdmodialysds, I 'ARN du virus de l'hdpatite C (ARN-VHC) a dtd recherchd par polymerase chain reaction (PCR). Pour chaque patient le s tatut en anticorps anti-VHC a dt~ d~termind par ELISA et par RIBA-2 en cas de rdsultat positi[. Le taux des transaminases a dtd ddtermin~ chaque mois au cours de l 'annde pr~cddant la fin de l'dtude. Soixante patients avaient des rdsultats sdrologiques sur les 4 derni~res ann~es et parmi eux 39 ont eu une recherche de virdmie VHC par PCR au cours des 2 derni~res ann~es sur au moins 4 prdl~vements. Les neu[ patients anti-VHC ndgatifs dtaient ndgati[s par PCR. Sur 7 patients pr~sentant un pro[il RIBA-2 inddter- mind, 3 ~taient positi[s par PCR (1/ I avec un anticorps anti-C33c isold et 2 /6 avec un anticorps anti-C22-3 isol~). Parmi les 59 patients positifs par RIBA-2, 57 ~taient virdmiques pour le virus de l'h~patite C. Sur les

Tirds ?t par t : F. Bouchardeau, INTS, 6, rue A.-Cabanel, 75015 Pads

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2 patients ndgati[s, l'un dtait devenu ndgati[ par PCR aprOs un traite- ment par interfdron. Sur les 38 patients sans injection aigu~, dtudids par PCR sur 5 prdldvements successi[s, 11 ont dt~ trouvds ARN- VHC n~gati[s (dont 7 anti-VHC n~gati[s et 3 ,, inddterminds ,,) et 23 ARN-VHC positi[ sur tousles dchantillons ; une vir~mie intermittente a dt~ observde chez 4 autres patients.

La probabilit~ d'in[ection par le VHC augmente en [onction de la dur~e de dialyse et du nombre de trans[usions refues. Le taux des ALAT dtait corr~ld a la virdmie VHC. Les rdsultats obtenus montraient une bonne corrdlation entre la prdsence des anticorps anti-VHC et la positivitd en ARN-VHC (97 %).

S UMMAR Y

Correlation between HCV viraemia (PCR) and antibodies to HCV in hemodialyzed patients.

Polymerase chain reaction (PCR) was applied to detect HCV-RNA in 75 hemodialyzed patients. Anti-HCV status was determined by ELISA-2 and by RIBA-2 [or reactive samples by ELISA. ALT levels were monthly determined during the year preceding the end o[ the study. For 60 patients, anti-HCV serology was known since 1989 and 39 o[ them were tested [or the presence o[ HCV-RNA at least [our times during the 2 preceding years.

The 9 patients who were negative [or anti-HCV antibodies were negative by PCR. 0[ the 7 patients with an indeterminate profile by RIBA-2, 3 were positive by PCR : 1/1 with C-33c band only and 2/6 with C22-3 band only. 0[ the 59 patients reactive by RIBA-2, 57 were HCVRNA positive. O[ the 2 HCV-RNA negative patients, one had been PCR positive be[ore interferon therapy. O[ the 38 patients without acute hepatitis tested by PCR on 5 successive samples, all the specimens o[ 11 and 23 patients were HCV-RNA negative and HCV-RNA positive respec- tively. In 4 patients, a transient viremia was observed. The group o[ HCV-RNA positive patients had mean ALT levels greater than those who were negative. A correlation was established between HCV in[ection and both the time on dialysis and the number o[ blood trans[usions. A high concordance (97%) was observed between antibodies to HCV and HCV-RNA.

INTRODUCTION

Le clonage d'une pattie du g6nome du virus de l'h6patite C (VHC) isol6 h partir de plasma de chimpanz6s exp6rimentalement infect6s r6alis6 par Choo et al en 1989 [7] a transform6 le diagnostic des h6patites non-A, non-B (NANB). Le virus de l'h6patite C, virus h ARN, a 6t6

VIRUS DE L 'HEPATITE C: PCR ET ANTICORPS 453

identifi6 comme 6tant l 'agent responsable de la majorit6 des h6patites NANB post-transfusionnelles [1, 2]. Un test de I re g6n6ration utilisant un antigone recombinant cod6 par une partie non structurale du VHC (NS4) d6velopp6 en 1990 [22] a permis les premiers d6pistages chez les donneurs de sang [8, 19]. Courant 1991, I 'addition de 2 nouvelles prot6ines (produits des gbnes core et prot6ase) a permis aux tests de 2 e g6n6ration de prendre le relais et d ' augmemer la sensibilit6 du d6pistage des anticorps anti-VHC [20, 21, 32]. Parallblement un immunoblot RIBA-2 incluant 4 antigbnes recombinants 6tait utilis6 comme test compl6mentaire aux tests ELISA en vue de la confirmation de la s6ropo- sitivit6 anti-VHC. L'amplification g6nique (PCR) utilis6e pour la raise en 6vidence des s6quences d'ARN dn virus de l 'h6patite C est un outil suppl6mentaire pour le diagnostic d 'une infection par le VHC [ 14]. Dans cette 6tude condulte dans une population d'h6modialys6s transfus6s ou non, le statut vis-/~-vis du virus de l 'h6patite C a 6t6 6tudi6 par ELISA et RIBA-2 pour les anticorps anti-VHC et par PCR pour la vir6mie VHC et les r6sultats ont 6t6 corr616s/~ diff6rents parambtres li6s/~ l 'exposition au virus.

MATERIEL ET METHODES

Population

Une population de 75 patients trait6s dans 2 unit6s d 'h6modialyse a 6t6 6tudi6e. Elle a 6t6 s61ectionn6e en fonction de la s6rologie VHC connue ant6rieurement. Dans 1 des 2 unit6s de dialyse, 52 des 62 patients anti-VHC positif et 8 des 53 patients anti-VHC n6gatif ont 6t6 s61ectionn6s pour l '6tude [5]. Ces 60 patients avaient eu une s6rologie anti-VHC pratiqu6e tous les 6 mois depuis 1989 et pour certains sur des pr61bve- merits ant6rieurs conserv6s en s6roth6que. Pour 39 de ces 60, une recherche de vir6mie VHC par PCR a 6t6 pratiqu6e depuis 1991 sur au moins 4 pr61bvemems faits ~ 6 rnois d'intervalle. Dans l 'autre unit6 de dialyse, sur 56 h6modialys6s, les 14 patients connus anti-VHC positif et un seul des patients connus anti-VHC n6gatif ont 6t6 s61ectionn6s. La totalit6 de ces 75 patients ont eu une recherche de vir6mie VHC par PCR sur un pr616vement de 1993 coupl6e/ t une s6rologie anti-VHC.

Cette population se composait de 46 hommes et 29 femmes avec une moyenne d'gtge de 49 4- 18,4 ans et une dur6e de moyenne de dialyse de 11,6 4- 6 ans. Pour tousles patients les taux de l 'alanine aminotranf6rase (ALAT) ont 6t6 d6termin6s tous les mois et la moyenne des taux observ6s pendant l 'ann6e pr6c6dant la fin de l '6tude a 6t6 retenue. Le taux moyen des ALAT pour la population 6tait de 21,7 + 16 UI/L Le nombre moyen de transfusions reques par ces patients 6tait de 40 (0-693), 8 n 'ayant jamais 6t6 transfus6s.

Le statut de chaque patient vis-/~-vis du virus de l 'h6patite B 6tait connu. Soixante-quatre patients 6taient immunis6s soit naturel lement

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soit apr6s vaccination contre le virus de l'h6patite B. Onze patients 6taient porteurs de l'antigbne HBs dont 5 avec antig6ne HBe et pr6sence dans le s6rum d'ADN du VHB et 6 avec anticorps anti-HBe et sans ADN d6tectable. Cinq patients 6taient porteurs du virus de l'immunod6ficience humaine (VIH).

Techniques de ddpistage et de confirmation des anticorps anti-VI-IC

Tousles pr61~vements de chaque patient ont 6t6 6tudi6s par la technique ELISA anti-VHC 2 e g6n6ration (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, N.Y, USA) et par immunoblot RIBA-2 (Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA). Cet immunoblot d6tecte 4 anticorps dirig6s contre 4 antigbnes du VHC, 2 dirig6s contre la partie non-structurale NS4 (C5-1-1 et C100-3), 1 dirig6 contre la partie non-structurale NS3 (C33-c) et un dirig6 comte l'antig~ne de la partie core (C22-3). Un r6sultat est positif si au moins deux anticorps sont pr6sents. La r6activit6 contre 1 seul antigone entraine un r6sultat ind6termin6.

Technique d'amplification g6nique

ECHANTILLONS

Les pr6cautions de pr61~vemem et de conservation recommand6es par Bosch et al. [3], ont et6 prises lors de la collecte des 6chantillons destin6s h l'6tude PCR. Les s6rums ont 6t6 d6cant6s dans les 2 h 3 heures apr~s le pr61~vement. Ils ont 6t6 rapidement congel6s h - 80 °C et conserv6s ~ cette temp6rature jusqu'h l'extraction de I'ARN.

EXTRACTION DE L'ARN

Pour l'extraction, la m6thode d6crite par CHOMCZYNSKI et SACCHI [6] a 6t6 employ6e. Cette m6thode utilise le thiocyanate de guanidine- ph6nol-chloroforme. Deux cents ktl de s6rum, d6congel6s une seule fois

4 °C, ont 6t6 additionn6s ~ 600 ~1 de solution d6naturante contenant du thiocyanate de guanidine 4M, du citrate de sodium 25 mM pH 7, du sarcosyl 0,5 %, du 2-mercapto6thanol 0,1 Me t h 600 pl de ph6nol satur6 en Tris/EDTA. Aprbs l'addition de 100pl de chloroforme, le tube a 6t6 incub6 15 m i n h 4 °C. Apr~s centrifugation 15 rain ~ 4 °C, la phase aqueuse a 6t6 ajout6e a un volume 6gal de chloroforme, suivi d'une centrifugation de 5 min ~ 4 °C. Cette op6ration est r6p6t6e deux fois. L'ARN a 6t6 pr6cipit6 avec de l'isopropanol contenant 1 pg de glycog~ne (Boehringer) pendant une nuit ~ - 20 °C. Aprbs une centrifugation de 15 min ~ 4 °C, I'ARN a 6t6 lav6 avec 1 ml d'6thanol/: 70 % et s6ch6 ~ Fair pendant 30 rain. Le culot a 6t6 repris dans 20 ktl d'eau distill6e st6rile.

VIRUS DE L'HEPATITE C: PCR ET ANTICORPS 455

AMORCES

Les amorces ont 6t6 choisies darts la partie hautement conserv6e 5'non-codante du g6nome du VHC [27,28, 29].

SR1 : amorce externe anti-sens (20nt) 5 '-TGCACGGTCTACGAGACCTC-3 ' SR2 : amorce interne anti-sens (21nt) 5'-GGGCACTCGCAAGCACCCTAT-3' SF1 : amorce externe sens (20nt) 5 '-GCCATGGCGTTAGTATGAGT-3 ' SF2 : amorce exteme sens (20nt) 5'-GTGCAGCCTCCAGGACCCCC-3' Les produits d'amplification 6taient respectivement de 258 et 211

paires de bases. La sonde utilis6e pour l'hybridation correspond ~t la s6quence

comprise entre les deux amorces SR2 et SF2. La s6quence n 'a pas de point commun avec les amorces.

SRF : sonde (39nt) 5 '-ACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTYFCTFGGAT-3 '

SYNTHI~SE DE L'ADN COMPLEMENTAIRE

L'ADN comp16mentaire de I'ARN du VHC a 6t6 obtenu par transcrip- tion inverse de 5 ~tl d'ARN dans 20 pl de milieu r6actif contenant 50 pmol de l 'amorce anti-sens SR1, 0,5mM/1 de dNTP, 10mM/l H6pes, 0,2 raM/1 EDTA, 200 tmit6s de M-MLV Reverse Transcriptase (Gibco BRL) et 20 unit6s de RNase Inhibitor (Boehringer). La synth6se de I'ADN compl6mentaire a 6t6 r6alis6e ~ 37 °C pendant 1 heure. La r6action a 6t6 arr&6e pendant 10 min ~ 72 °C [31].

AMPLIFICATION

5 ~l d'ADN complementaire ont 6t6 m61ang6s ~t 50 ~1 de milieu de r6action PCR contenant 0,2 mM/I de dNTP, 50 pmol des amorces SR2 et SF2, 1,5 mM/I MgC12, 50 mM/I KCI, 10 mM/I Tris-HCI pH 8,3 et 1,2 unit6s d'ampli Taq polym6rase (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT).

Pour la PCR, 35 cycles d'amplification ont 6t6 effectu6s comprenant, la d6naturation 1 min ~ 92 °C, I'hybridation des amorces 1 rain ~ 55°C et l'extension 1 min h 72 °C. Ces diff6rentes 6tapes ont 6t6 r6alis6es dans l'incubateur programmable (programmable DNA thermal cycler 480-Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT).

Tousles s6rums ont 6t6 analys6s en double ~ partir de deux extrac- tions diff6rentes.

REVELATION

Les produits d'amplification ont 6t6 visualis6s par coloration au bromure d'6thidium aprbs 61ectrophor~se en gel d'agarose 1%. Apr6s

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transfert sur membrane de nylon, l'hybridation a 6t6 r6alis6e avec la sonde oligonucl6otidique sp6cifique marqu6e h la p6roxydase permettant une d6tection par chemiluminescence (Amersham, Buckinghamshire, England).

PRt~CAUTIONS ET VALIDATION DE LA T E C H N I Q U E

Afin d'emp6cher l'action des RNases, des proc6dures de manipula- tion st6riles ont 6t6 employ6es.

Afin de r6duire le risque de contamination au cours de la PCR, un certain nombre de pr6cautions ont 6t6 prises [23]. Tous les r6actifs et les 6tapes de la PCR ont 6t6 effectu6es dans une m6me pi6ce. Les produits amplifibs ont 6t6 analys6s dans une autre pi6ce.

Afin de contr61er le risque de contamination, des t6moins n6gatifs (soit de l'eau distill6e, soit des s6rums n6gatifs) ont 6t6 introduits chaque 6tape de la PCR.

Afin de s'assurer de la sp6cificit6 et de la sensiblit6 de la technique 30 plasmas de donneurs de sang n6gatifs pour le virus de l'h6patite C et 40 plasmas de patients pr6sentant une h6patite C chronique ont 6t6 test6s. Par ailleurs nous avons particip6 h une 6tude de standardisation de la technique PCR propos6e par Amsterdam avec le panel Eurohep HCV- RNA [34]. Les r6sultats 6taient satisfaisants.

RESULTATS

Trois groupes de patients ont 6t6 d6finis en fonction du statut en anticorps anti-VHC par ELISA et RIBA-2 observ6 en 1993. (Tabl. I). Le groupe I comprenait 9 patients dont les anticorps anti-VHC 6taient n6gatifs par ELISA. Le groupe II 6tait compos6 de 7 patients positifs par ELISA et ne pr6sentant qu'une seule bande par RIBA-2 (1 patient positif

Groupe Nombre patients

Tableau I Rdsultats de la sdrologie et de la PCR/VHC chez 75 patients.

Temps de dialyse et taux moyen des ALAT dans les 3 groupes.

Anti-VHC PCR/VHC

positive

0 N6gatif

II Ind6termin6

III 59 Positif

n6gat~ve

9 100 %

3* 4*

57 2 97 %

Dur6e dialyse (ans)

ALAT UI/L

7,4 :t: 5,6 10,8

11,1 13,6

12,5 4- 5,8 24,3

* Une seule bande par RIBA-2 • 1 sur la prot6ine C33-c (PCR positif) ; 6 sur la prot6ine C22-3 (2 PCR positif et 4 PCR n6gatif).

VIRUS DE L 'HEPATITE C: PCR ET ANTICORPS 457

star la bande C33-c et 6 sur la bande C22-3). Dans le groupe I I I l e s 59 patients 6talent positifs par ELISA et 6talent confirm6s par RIBA-2 avec une r6action positive sur au moins deux bandes.

Darts les groupes I, I I et I I I on retrouvait respect ivement 0, 2 et 3 patients anti-V1H positif et 1 (ADN-VHB positif), 1 et 9 (dont 4 ADN-VHB positif) pa t iems AgHBs positif.

Les 9 patients du groupe I, n6gatifs en anti-VHC, 6talent n6gatifs par PCR en 1993 et 7 d ' en t re eux 6tudi6s 5 fois depuis 1991 fournissaient 6galement un r6sultat n6gatff.

Des 7 patients du groupe II, 3 6talent positifs par PCR dont le patient avec des anticorps anti-C33-c isol6 et 2 des 6 patients avec un anticorps anti-C22-3 isol6. Aucun de ces 3 patients vir6miques en 1993 n 'avai t et6 6tudi6 par PCR ant6rieurement . Le statut anti-VHC des 6 patients ,< anti-C22-3 isol6 ,> 6tait connu ant6r ieurement : 3 d ' en t re eux avaient toujours eu une s6rologie identique depuis au moins Janvier 1989, Fun 6tant positif par PCR en 1993 et les deux autres toujours trouv6s n6gatifs par PCR sur au moins 4 pr616vements depuis 1991 ; pour les 3 autres patients, l 'ant icorps anti-C22-3 seul prOsent en 1993 6tait un anticorps r6siduel, d ' au t res types d 'an t icorps anti-VHC 6tant pr6sents sur les pr616vements ant6rieurs c o m m e l'illustre ten exemple fourni dans le t ab leau II, qui mon t re 6galement qu ' aucune vir6mie n ' a 6t6 d6tect6e chez ce pat ient (B.V) depuis 1991. Les deux autres patients de ce groupe, 6tudi6s une seule fois par PCR, donnaient un r6sultat positif et n6gatif respect ivement .

Dans le groupe III, 17 des 59 pa t iems avaient sur le pr61bvement de 1993, 2 bandes positives en RIBA-2 dont 1 sur les prot6ines 5-1-1 et C22-3 et 16 sur les prot6ines C22-3 et C33-c. Ces 16 patients 6talent positifs par PCR. Quatre d ' en t re eux 6tudi6s par PCR depuis 1991 ont donn6 6galement un r6sultat positif sur chacun des 4 t~ 5 pr616vements. Onze de ces 16 patients 6talent connus anti-VHC positifs depuis au moins 1989.

Tableau II Evolution du profil en RIBA-2 chez 1 patient anti-VHC positff.

R~sultats PCR et taux des ALAT

Patient B.V.

Date

Jan-87 Jui-87 Jni-89 Jan-90 Jui-90 Jan-91 Jan-92 Jui-92 Jan-93

C 5-1-1

RIBA-2 ARN-VHC ALAT

C 100-3 C 33-c C 22-3 PCR UI/L

4 4 4 4 nt* 3 3 3 4 nt* 0 0 1 2 nt* 0 0 1 4 nt* 8 0 0 0 4 nt* 0 0 0 3 n6gatif 4,5 0 0 0 3 n6gatif 0 0 0 3 n6gatif 4,5 0 0 0 4 n6gatif

nt* : non test6s = conditions de pr61evement inad6quates pour la recherche d'ARN-VHC. Les r6activit6s observ6es par RIBA-2 sur chaque prot6ine sont exprirn6es de 1 h 4 en fonction de l'intensit6 des bandes O signifie absence de r6activit6.

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Le patient qui avait des anticorps anti-5-1-1 et anti-C22-3 poss6dait 6galement un anticorps anti-C33-c sur les pr61bvements pr6c6dents. Sur un suivi de 2 ans, ce patient a pr6sent6 5 pr61~vements n6gatifs par PCR.

Un total de 42 patients pr6sentaiem 3 h 4 bandes par RIBA-2 sur les prot6ines cod6es par les r6gions NS3, NS4 et core. Un seul patient de ce groupe etait n6gatif par PCR en 1993. I1 a pr6sent6 une s6roconversion anti-VHC en Janvier 1991. I16tait PCR positif sur 4 pr61~vements pendant la phase aigu~ de la maladie, a 6t6 trait6 par interf6ron h partir d'octobre 1991 et I'ARN du VHC n'a plus 6t6 d6tect6 sur les 3 pr61bvements post6rieurs. Quarante et un patients 6taient vir6miques en 1993 et 22 d'entre eux ont 6t6 suivis par PCR depuis 1991 : 19 ont pr6sent6 un r6sultat positif sur les 5 pr61~vements, 3 ont fourni 4 r6sultats positifs sur 5 et 1 patient 6tait positif 3 fois sur 5. L'exemple d'un patient (O.L) suivi par PCR sur plusieurs pr61bvements et dont la s6rologie anti-VHC 6tait connue depuis 1984 est illustr6 dans le tableau III. Aprbs une h6patite clinique en 1984, le profil RIBA-2 6tait complet jusqu'en Mai 1985. Le patient a ensuite 6t6 greff6 puis a 6t6 repris en dialyse en mai 1989. A cette date le RIBA-2 6tait positif sur la bande C22-3 seulement. Au cours de l'ann6e 1990 le profil RIBA-2 6tait/~ nouveau complet et ce jusqu'au dernier pr61~vemem disponible en janvier 1993. De Janvier 1991 Janvier 1993, 5 pr61bvements disponibles pour la recherche de I'ARN- VHC ont donn6 un r6sultat posifif.

Au total, sur 38 patients ayant eu 5 recherches d'ARN du VHC sur une p6riode de 2 ans (sans tenir compte du patient ayant eu une infection aigu~ au d6but du suivi), 34 (89,5 %) r6sultats identiques ont 6t6 obtenus sur les 5 pr61evements (23 positifs et 11 n6gatifs). Chez les 4 autres une vir6mie intermittente a 6t6 observ6e (Tabl. IV).

Tableau I / I Evolutzon du profll en RIBA-2 chez i pat ient anti-VHC posffi[.

Rdsultats PCR et taux des ALAT.

Patient O L

Date

F6v-84 Oct-84 Mai-85 Jui-89 Jan-90 Jui-90 Sep-90 Jan-91 Jui-91 Fev-92 Jui-92 Jan-93

RIBA-2 ARN-VHC ALAT

C 5-1-1 C 100-3 C 33-c C 22-3 PCR UI/L

0 0 2 4 nt* 135 4 4 4 4 nt* 2 2 2 4 nt* 0 0 0 4 nt* 34 0 0 3 4 nt* 24 2 2 4 4 nt* 88 2 1 4 4 nt* 58 2 0 3 4 positif 2 1 4 4 positif 15 1 1 4 4 positif 1 1 3 4 positif 13 2 2 4 4 positif 12

nt* non test6s = conditions de pr61~vement inad6quates pour la recherche d'ARN-VHC. Les r6activit6s observ6es par RIBA-2 sur chaque prot6ine sont exprim6es de 1 A 4 en fonction de l'intensit6 des bandes. 0 signifie absence de r6activit6.

VIRUS DE L 'HEPATITE C: PCR ET ANTICORPS

Tableau IV Vartaaon de la virdmie VHC chez les 38 patients ayant eu 5 pr~l~vements consdcutifs.

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Patients

N6gatifs P 5/56chanttllons

Positifs C 3/5 6chantiUons

4/56chantillons R 5/5 6chantillons

GroupeI GroupeII C22-3

Groupe HI

28

1 3

23

Corr61ation avee le taux des ALAT

Le taux moyen des ALAT pendant l'ann6e pr6c6dant la fin de l'6tude (janvier 1993) est significativement diff6rent (p < 0,01) entre les patients anti-VHC positif et PCR n6gatif en 1993 et les patients anti-VHC positif et PCR positif : 7,8 UI/1 versus 23,4 UI/1. Aucune diff6rence n'est n o t & ~t l'int6rieur de ces 2 groupes en fonction du profil observ6 par RIBA-2 (Tabl. V). Le taux moyen des ALAT est similaire entre les 9 patients anti-VHC n6gatif (10,8 UI/1) et les 6 patients anti-VHC positif et PCR n6gatif (7,8 UI/1). Quatorze de ces 15 patients ont pr6sent6 des taux d'ALAT normaux durant le suivi. Le quinzibme patient 6tait celui qui a s6roconverti en d6but d'6tude et dont le taux des ALAT est redevenu normal aprbs traitement par interf6ron.

Les porteurs du virus de l'h6patite B sont r6partis dans ces trois groupes et le taux des ALAT chez ces patients n'est pas diff6rent du taux moyen observ6 dans chaque groupe, h l 'exception du patient anti-VHC n6gatif. I1 est h noter que ce patient est positif en ADN-VHB (Tabl. V).

Tableau V Taux des ALAT en fonction du statut VHC sur le dermer pr~l~vement. Antworps et PCR.

Anti-VHC Nombre PCR ALAT patients UI/L

N6gatif 9 N6gative 10,8

Ind6termm6 4 N6gative 8,3 Positlf 2 7,2

Ind6termin6 3 Positive 22 Positif 57 24,9

Moyenne ALAT (UI/L)

10,8

7,8

23,4

Ag HBs pomtif

Nombre ALAT(UI/L)

1" 27

1 8,8

9** 26,4

* patient ADN-VHB positif. ** 4 /9 patients ADN-VHB positaf

460 BOUCHARDEAU F. et coll.

Corr61ation avec la dur6e de dialyse et le nombre de transfusions

Parmi les 9 patients n6gatifs pour les anticorps anti-VHC, la dur6e moyenne de dialyse 6tait la plus courte (7,4 ± 5,6 ans) compar6e/~ celle des patients ayant 6t6 expos6s au VHC (12,2 ± 5,8 ans). Le nombre de transfusions reques n'6tait pas diff6rent entre les 2 groupes (39,6 versus 40,2). Cependant si l 'on excepte un patient du groupe n6gatif ayant requ 273 transfusions, la diff6rence entre les 2 groupes devient significative (10,1 versus 40,2) Notons cependant clue 8 des 66 patients ayant des anticorps anti-VHC n'avaient jamais requ de transfusions. Deux d'entre eux sont 6galement VIH positif : l 'un est toxicomane et l 'autre venant d'Afrique sub-saharienne 6tait contamin6 par les deux virus/: son arriv6e en France.

DISCUSSION

Le but de cette 6tude 6tait d'6tudier la corr61afion entre les anticorps anti-VHC, la vir6mie VHC et le taux des ALAT dans tme population d'h6modialys6s d'une part et de d6finir l'influence de la dur6e de dialyse et du nombre de transfusions sur le risque de portage du virus de l'h6patite C d'autre part.

Lors de la r6alisation de la PCR, touttes les pr6cantions n6cessaires ont 6t6 prises afin d'obtenir des r6sultats sp6cifiques et reproductibles [23]. Les primers ont 6t6 choisis dans la r6gion 5'NC, r6gion hautement conserv6e clans les diff6rentes souches du virus VHC comme plusieurs 6tudes l'ont d6montr6 [15, 18].

Seulement 9 patients anti-VHC n6gatifs ont 6t6 inclus dans cette 6tude ~t titre de contr61e. Une s6rologie anti-VHC n6gative est retrouv6e chez respectivement 46 % [5]. et 75 % des patients des deux unit6s Ces 9 patients 6taient tous n6gatifs par PCR et ce, sur plusieurs pr61bvements pour la majorit6 d'entre eux. Des r6sultats identiques ont 6t6 obtenus dans d'autres 6tudes [10].

Sur 7 patients avec un profil ind6termin6 en RIBA-2, 6 pr6sentaient une bande C22-3 isol6e par RIBA-2 dont 4 6taient n6gatifs en ARN-VHC. Les 2 patients ,< C22-3 isol6 ,, positifs en ARN-VHC 6taient porteurs du VIH, ce qui peut probablement expliquer cette r6ponse immune partieUe aux prot6ines du virus. Cependant, m6me en absence d'immunod6pres- sion la perte de certains anticorps anti-VHC, notamment de ceux dirig6s contre les prot6ines cod6es par la r6gion NS4, est assez souvent observ6e chez des sujets vir6miques comme ceci a 6t6 montr6 au cours de cette 6tude et rapport6 par d'antres [11]. Ceci montre l'int6r6t des prot6ines C33-c (NS3) et C22-3 (core) pour reconnaitre des infections HCV surve- nues plusieurs ann6es auparavant. [5]. Ces prot6ines sont 6galement essentielles pour mettre en 6vidence des s6roconversions [ 11]. Parmi les 60 patients PCR positifs, 59 poss6daient des anticorps anti-C22-3, 58

VIRUS DE L'HI~PATITE C : PCR ET ANTICORPS 461

poss6daient des anticorps anti-C33-c et seulemem 41 (68 %) des anticorps anti-C100-3 e t / ou 5-1-1.

Cependant, une r6activit6 isol6e sur l 'une de ces 2 prot6ines essentiel- les ne permet pas de sp6culer sur l 'existence ou non d 'une vir6mie. Cette vir6mie semble plus volontiers associ6e h u n profil C33c isol6 qu 'h un profil C22-3 isol6 comme diverses 6tudes l 'ont sugg6r6 [12, 17] et no tamment celle de Li et al [24] montrant que 39 % et 75 % des profils ind6termin6s C22-3 et C33-c respectivement 6taiem ARN-VHC positif. Les r6actifs de 3 e g6n6ration qui vont 6tre utilis6s au cours de l 'ann6e 1993 permet t ront peut-6tre d'affiner cette corr61ation [13]. Avec les r6actifs anti-VHC actuels de 2 e g6n6ration, il est clair que la pr6sence d'ARN du VHC est beaucoup plus souvent associ6e h la pr4sence d 'au moins 2 types d 'ant icorps anti-VHC qu 'h une r6activit6 anticorps isol6e : 97 % (57/59) versus 43 % (3/7) dans notre 6tude. Des r6sultats similaires ont 6t6 rapport6s chez 94 % (46/49) de donneurs de sang anti-VHC positifs [12] et dans 96 % (27/28) d'h6patites C post-transfusionnelles [33]. Chez des donneurs de sang MCOMLSH et al. [25] rapportaient un score plus faible de 86 %. Dans notre 6tude, chez seulement 2 patients sur 59 (3 %) la positivit6 en anti-VHC par RIBA-2 n'6tait pas associ6e/t une vir6mie VHC. Pour un patient, le r6sultat n6gatif par PCR a 6t6 obtenu apr6s t rai tement par interf6ron, ce qui avait pr6c6demment 6t6 rapport6 [16]. Le deuxi6me patient 6tait n6gatif par PCR sur 5 pr616vements cons6cutifs sur 2 ann6es ce qui semble indiquer une possible 6radication du virus.

L'6volution particulihre du profil en RIBA-2 du patient (O.L) semble confirmer l 'hypothhse qu 'une r6infection par une souche diff6rente du virus VHC est possible. Cela a 6t6 pr6c6demment d6crit par McOMISH el al. [25] chez des donneurs de sang et par OKaMOTO et al. [30] chez des h6mophiles.

Neuf patients ARN-VHC positif 6taient porteurs de l 'antighne HBs dont 4 avaient une replication active du virus de l 'h6patite B. Le VHB ne semble pas avoir un effet inhibiteur sur la r6plication de virus VHC comme cela avait 6t6 d6crit pr6c4demment [ 11 ].

Une nette corr61ation entre le taux des ALAT et la pr6sence ou l 'absence de I'ARN du VHC a 6t6 trouv6e. Les patients PCR positif quelque soit leur profil anticorps avaient un taux d'ALAT significative- ment plus 41ev6 que les patients anti-VHC positif et PCR negatif lesquels avaient un taux d'ALAT identique ~ celui observ6 chez les patients n 'ayant jamais 6t6 infect6s par le VHC. Des r6sultats similaires ont 6t6 rapport6s par Mondelli et al [26], dans une 6tude men6e chez des h6modialys6s off 66 % des patients anti-VHC positif avaient des ALAT anormalement 61ev6es. Par contre, dans une 6tude r6alis6e chez 51 patients h6modialys6s par CHAN et al. [4], 80 % des patients anti-VHC et ARN-VHC positifs avaient un taux d'ALAT normal.

Bien que le nombre de patients n6gatifs en anti-VHC soit faible, les corr61ations entre l ' infection par le VHC et la dur6e du trai tement par h6modialyse ainsi que le nombre de transfusions revues qui ont 6t6 6tablies, sont en concordance avec ceUes 6tablies lors de l '6tude de la

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totalit6 de la populat ion de l 'une des uni t& [5]. Dans cette 6tude, il avait 6t6 clairement 6tabli une relation significative entre l ' infection par le VHC et la dur6e du t ra i tement par h6modialyse (p < 0,001) ainsi qu 'avec le n o m b r e de transfusions regues (p < 0,01). ELISAF et al. [9] apportaient la m 6 m e conclusion dans une 6tude r6alis6e chez des h6modialys6s.

Dans notre 6tude, 6 des 8 patients non transfus6s 6taient infect6s par le VHC (anticorps anti-VHC et ARN-VHC positifs) et 80 % des patients ayant regu plus de 50 transfusions 6taient positifs par PCR. Si les transfusions semblent avoir jou6 un r61e impor tan t dans la transmission du virus de l 'h6pati te C dans les unit6s d 'h6modialyse, des patients non transfus6s positifs en ARN-VHC indiquent que d ' au t res modes de conta- minat ion par le VHC existent dans cette population, c o m m e ceci a 6galement 6t6 observ6 par d ' au t res auteurs [26]. Le mat6riel de dialyse peut 6tre consid6r6 c o m m e l 'un de ces v6hicules. Cependant , cette d6monst ra t ion n 'es t pas faite et si ce mat6riel contr ibue ~ la propagat ion du virus, ce r61e est mineur compar6/~ celui qu' i l jouait dans l ' infection par le VHB dans cette population. En effet, l ' incidence de l ' infection par le VHC chez les patients h6modialys6s a consid6rablement chut6 aprbs 1989 oth les patients regoivent moins de transfusions et regoivent des d6riv6s sanguins anti-VHC n6gatifs. Dans une unit6, cette incidence qui 6tait de 3,7 % (3/81) en 1989, 6tait de 1% (1/93) en 1990 [5] et de 0 % (0/98) en 1991 et 1992.

En conclusion, la possibilit6 de d6pister les anticorps anti-VHC chez les donneurs de sang a la rgement contr ibu6/ t la diminution des h6patites C post-tranfusionnelles [8, 19] et une tr6s forte association a 6t6 observ6e entre la pr6sence d 'ant icorps anti-VHC et celle du virus de l 'h6pati te C.

REMERCIEMENTS. -- Ce travail a b6n6fici6 du concours des labora- toires Ortho Diagnostic System que nous remercions.

R E F E R E N C E S

[1] AACH R.D., STEVENS C.E., HOLLINGER F.B., MOSLEY J.W., PETERSON D.A., TAYLOR P.E., JOHNSON R.G., BAPmOSA L.H., NEMO G.J. - Hepatitis C Virus infection in post-transfusion hepatitis. An Analysis with First- and Second- Generation Assays. N. Engl. J. Med., 1991, 325, 1325-1329.

[2] ALTER H.J., JETr B.W., POLITO A.J., FARCI P., MELPOLDER J . C . , SHIH J . W . , SHIMIZU Y., PURCELL R. - Analysis of the Role of Hepatitis C Virus in Transfusion-associated Hepatitis. In : Viral hepatitis and liver disease, 6dit6 par Hollinger F.B, Lemon SM, and Margolis H. S., Baltimore, Williams et Wilkins, 1990, 396-402.

[3] BuscH M.P., WILBER J.C., JOHNSON P., TOBLER L., EVANS C.S. -- Impact of specimen handling and storage on detection of hepatitis C virus RNA. Trans- fusion, 1992, 32, 420-425.

[4] CHAN T.M., LOK A.S.F., CHENG I.K.P., CHAR R.T. - Prevalence of Hepatitis C Virus Infection in Hemodialysis Patients : A Longitudinal Study Comparing the Results of RNA and Antibody Assays. Hepatology, 1992, 17, 5-8.

[5] CHAUVEAU P., COUROUCE A.M., LEMAREC N., NARET C. , POIGNET J.L., GIRAULT A., RAMDAME M . , DELONS S. -- Antibodies to hepatitis C virus by second generation test in hemodialyzed patients. Kid. Inter., 1993, 43, $149-$152.

VIRUS DE L'HEPATITE C : PCR ET ANTICORPS 463

[6] CHOMCZYNSKI P., SACCHI N. - Single-Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium-Thiocynate-Phenol-Chloroform Extraction. Anal. Biochem., 1987,162, 156-159.

[7] CHOO Q.L., Kuo G., WEINERA.J., OVERBY L.R., BRADLEY D.W., HOUGHTON M. - Isolation of a cDNA Clone Derived from a Blood Borne Non-A, Non-B Viral Hepatitis Genome. Science, 1989, 244, 359-362.

[8] DONAHUE J.G., MUNOZ A., NESS P.M., BROWN D.E., YAWN D.H., McALIASTER H.A., REITZ B.A., NELSON K.E. - The declining risk of post-transfusion hepatitis C virus infection. N. Engl. J. Med., 1992, 327, 369-373

[9] ELISAF M., TSIANOS E., MAVRIDIS A., DARDAMANIS M., PAPPAS M., SIAMOPOULOS K.C. - Antibodies Against Hepatitis C Virus (Anti-HCV) in Haemodialysis Patients : Association with Hepatitis B Serological Markers. Nephro. Dial. Transplant., 1991, 6, 476-479.

[ 10] EVANS C.S., TOBLER L., POLITO A., STEWART J., CHIEN D., WILBER J., QUAN S., DELANEY S. , Kuo G., BUSCH M. P. - Comparative evaluation of supplemental hepatitis C virus antibody test systems. Transfusion, 1992, 32, 408-414.

[11] FARCI P., LONDON W.T., WONG D.C., DAWSON G.J., VALLARI D.S., ENGLE R., PURCELL R.H. - The Natural History of Infection with Hepatitis C Virus (HCV) in Chimpanzees: Comparaison of Serologic Responses Measured with First-and Second-Generation Assays and Relationship to HCV Viremia. J. Infect. Dis., 1992, 165, 1006-1011.

[12] FOLLETT E.A.C., DOW B.C., McCoMISH F., LEE YAP P., HUGHES W., MITCHELL R., SIMMONDS P. - HCV confirmatory testing of blood donors. Lancet, 1991, 338, 1024.

[13] GARCIA-SAMANIEGO J., ENRIQUEZ A., SORIANO V., GUTIERREZ M., BAQUERO M., MUNOZ F. - Third-Generation Recombinant Immunoblot Assay to Confirm Hepatitis C Virus Indeterminate Serological Samples. Vox Sang., 1993, 64, 191-192.

[14] GARSON J.A., TEDDER R.S., BRIGGS M., TUKE P., GLAZEBROOK J.A., TRUTE A., PARKER D., BARBARA J.A.J. , CONTRERAS M. , ALOYSIUS S. - Detection of hepatitis C viral sequences in blood donations by ,, nested ,, polymerase chain reaction and prediction of infectivity. Lancet, 1990, 335, 1419-1422.

[15] GARSON J.A., RING C., TuKE P., TEDDER R.S. - Enhanced detection by PCR of hepatitis C virus RNA. Lancet, 1990, 336, 878-879.

[ 16] HAGIWARA H., HAYASHI N., KASAHARA A., MITA L., FAKEHARA T., FUSAMOTO H., KAMADA T. -- Three cases of posttransfusion hepatitis C treated with interfe- run-alpha. Confirmation of a carrier state by detection of hepatitis C virus RNA after interferon therapy. Dig. Dis. Sci., 1992, 37, 631-634.

[17] HALFON P., ROUSSEAU S., TAMALET C., ANTONI M., GEROLAMI V., LEVY M., BOURLIERE M., PLANELLS R., CARTOUZOU G. - Indeterminate Second-Genera- tion Hepatitis C Recombinant Immunoblot Test : Detection of Hepatitis C Virus Infection by Polymerase Chain Reaction. J. Infect. Dis., 1992, 166, 449.

[ 18] HAN J.H., SHYAMALA V., RICHMAN K.H., BRAUER M.J., IRVINE B., URDEA M. S., TEKAMP-OLSON P., KUO G., CHOO Q.L., HOUGHTON M. - Characterization of the terminal regions of hepatitis C viral RNA : Identification of conserved se- quences in the 5 'untranslated region and poly(A) tails at~the 3 end. Proc.Natl. Acad. Sci., 1991, 88, 1711-1715.

[19] JAPANESE RED CROSS NON-A, NON-B HEPATITIS RESEARCH GROUP.- Effect of scree- ning for hepatitis C virus antibody and hepatitis B virus core antibody on incidence of post-transfusion hepatitis. Lancet,. 1991, 338, 1040-1041.

[20] KOLHO E. - Specificity and sensitivity of first and second generation anti-HCV ELISA in a low prevalence population. Transfusion Medicine, 1992, 2, 239-242.

[21] KOLHO E., NAUKKARINEN R., KRUSlUS T. - Transmission of HCV infection by RIBA indeterminate and positive blood traits. Transfusion Medicine, 1992, 2, 243-248.

[22] Kuo G., CHOO Q.L., ALTER H.J., GITNICK G.L., REDEKER A.G., PURCELL R.H., MIYAMURA Z., DIENSTAG J.L., ALTER M.J., STEVENS C.E., TEGTMEIER G.E.,

464 BOUCHARDEAU F. et coll.

BONINO F., COLOMBO M., LEE W.S . , Kuo C., BERGEN K., SHUSTER J. R., OVERBY L.R., BRADLEY D.W., HOUGHTON M. - Art Assay for Circulating Antibodies to a Major Etiologic Virus of Human Non-A, Non-B Hepatitis. Science, 1989, 244, 362-364.

[23] KwoK S., HIGUCHI R. - Avoiding false positives with PCR. Nature, 1989, 339, 237-238.

[24] LI X.M., REDDY K.R., JEFFERS L.J., PARKER T., DE MEDINA M., SCHIFF E.R. - Indeterminate hepatitis C. Lancet, 1993, 341, 835.

[25] McOMISH F., CHAN S.W., DOW B.C., GILLON J., FRAME W.D., CRAWFORD N.J., YAP P.L., FOLLETT E.A.C., SIMMOnDS P. - Detection of three types of hepatitis C virus in blood donors : investigation of type-specific differences in serologic reactivity and rate of alanine aminotransferase abnormalities. Transfusion, 1993, 33, 7-13.

[26] MONDELLI M.U., SMEDILE V., PIAZA V., VILLA G., BARBIERI C., GATTARELLO G., MANCINI F., RAIMONDO G. - Abnormal Alanine Aminotransferase Activity Reflects Exposure to Hepatitis C Virus in Haemodialysis Patients. Nephrol. Dial. Transplant., 1991, 6, 480-483.

[27] NOVATI R., THIERS V., D'ARMINIO MONEORTE A., MAISONNEUVE P., PRINCIPI N., CONTI M., LAZARIN A., BRECHOT C. - Mother-to-Child Transmission of Hepati- tis C Virus Detected by Nested Polymerase Chain Reaction. J. Infect. Dis., 1992, 165, 720-723.

[28] OKAMOTO H., OKADA S., SUGIYAMA Y., YOTSUMOTO S., TANAKA T., YOSHIZAWA H., TSUDA F., MIYAKAWA Y., MAYUMI M. - The 5'-Terminal Sequence of the Hepatitis C Virus Genome. Japan. J. Exp. Med., 1990, 60, 167-177.

[29] OKAMOTO H., OKADA S., SUGIYAMA Y., TANAKA T., SUGAI Y., MHANE Y., MACHIDA A., MISHIRO S., YOSHIZAWA H., MIYAKAWA Y., MAYUMI M. - Detection of Hepatitis C Virus RNA by a Two-Stage Polymerase Chain Reaction with Two Pairs of Primers Deduced from the 5'-Noncoding Region. Japan. J. Exp. Med., 1990, 60, 215-222.

[30] OKAMOTO H., SUGIYAMA Y., OKADA S., KuRAI K., AKAHANE Y., SUGAI Y., TANAKA T., SATO K., MIYAKAWA Y., MAYUMI M. - Typing hepatitis C vilaaS by polymerase chain reaction with type-specific primers : application to clinical surveys and tracing infectious sources. J. Gen. Virol., 1992, 73, 673-679.

[31] SELLNER L.N., COELEN R.J., MACKENZIE J.S. - Reverse transcriptase inhibits Taq polymerase activity. Nucl. Acids Res., 1992, 20, 1487-1490.

[32] VAN DEN POLL C.L., CUYPERS H.T.M., REESINK H.W., WEINER A.J., QUAN S., DI NELLO R., VAN BOVEN J.J.P., WINKLE I., MULDER-FOLKERTS D., EXEL-OE- HLERS P.J., SCHAASBERG W., LEENTVAAR-KYUPERS A., POLITO A., HOUGHTON M., LELIE P.N. - Confirmation of hepatitis C virus infection by new four-antigen recombinant immunoblot assay. Lancet, 1991, 33 7, 317-319.

[33] WANG J.T., WANG T.H., LIN J.T., SHEUJ.C., LEE C.Z., CHEN D.S . - Improved Serodiagnosis of Posttransfusion Hepatitis C Virus Infection by a Second- Generation Immunoassay Based on Multiple Recombinant Antigens. Vox Sang., 1992, 62, 21-24.

[34] ZAAIJER H.L., CUYI~ERS H.T.M., REESlNK H.W., WINKLE I.N., GERKEN G., LELIE P.N. - Reliability of polymerase chain reaction for detection of hepatitis C virus. Lancet, 1993, 341, 722-724.