COURS CHM 2971 Hiver 2005 Chimie bio-analytiquethibaupi/CHM2971/DOC/CHM... · - distillation - chauffage - agitation ... acétate d’éthyle, chloroforme, isopropanol sont les plus

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3.4 Chromatographie liquideSchéma de l’appareil

Réservoir à solvants

Valve à double accès

Station de contrôle Pompe

Chambre de mélange

Pré-colonnne

Valve d’injection

Colonne de garde

Colonne de séparation

Four

Détecteur

Ordinateur,logiciel de contrôle

IntégrateurChromatogramme

Chromatographie sur colonne

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Mécanisme de rétention : basé sur différentes forces d’attraction- Van derWaals- Debye- Coulomb- Keesom- Et autres …

• Avantages de la chromatographie liquide– Pas de limitation par la volatilité et la stabilité thermique– Modification facile de la phase mobile– Grande diversité de phases stationnaires

3.4 Chromatographie liquideProcessus chromatographique

•

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COURS4

31 janvier 2006

Site internet du cours:http://www-bac.esi.umontreal.ca/~thibaupi/chm2971.html

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Liquide/Solide (CLS)• Adsorption• Échange d’ions (IEC ou IC)

– Cationique– Anionique

• Exclusion moléculaire (SEC)Liquide/Liquide (CLL)

• Partition– Phase normale, NPLC– Phase inverse, RPLC

- Pairage d’ions• Affinité

3.4 Chromatographie liquideModes chromatographique en LC

CHM 2971 H2006 5Harris, 6e éd. Tableau 25.12

3.4 Chromatographie liquideSélection d’un mode

CHM 2971 H2006 6Harris, 6e éd. Tableau 25.12

3.4 Chromatographie liquideSélection d’un mode (suite)

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3.4 Chromatographie liquidePrincipaux constituants

Réservoir de solvant

- Contenant en verre ou acier inoxydable- un ou plusieurs contenant du solvant pur ou un mélange spécifique

- Volume 500 ml- Dégazage: enlever les gaz dissous qui peuvent former des bulles etinterférer dans la séparation et la détection

- barbotage d’un gaz inerte (He, N2)- pompage sous vide- distillation- chauffage- agitation- sonification

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• Dispositif de pompage

- Obtention de hautes pressions (5000 psi)- rendement (débit demandé = débit délivré)- constance et reproductibilité (0,5%)- absence de pulsation (↓bruit de fond)- gamme de débits entre 0,1 et 10 ml/min- chambre de mélange efficace et de faible volume- résistance à la corrosion et aux solvants organiques

∆P très grandcomparativement

à la GC!

POURQUOI ?

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Perte de charge (∆P) dans une colonne (backpressure)– La pression nécessaire pour qu’une phase mobile traverse une

colonne chromatographique– En première approximation pour des particules sphériques et pour

un écoulement laminaire:

– Donc ∆P augmente lorsque dp diminue; lorsque η augmente; lorsqueL augmente.

– La perte de charge est plus importante en chromatographie liquidequ’en chromatographie gazeuse (η d’un liquide >> η d’un gaz)

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −=∆ 3

2

2

)1(180εεµη

p

x

dLP

η= viscosité de l’éluantL = longueur de la colonneε= porosité (~ 0,4 pour une sphère)dp = grosseur des particules (généralementde 3 à 10 µm)µx = vitesse linéaire de l’éluant


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Unités depression

(conversion)

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Pompe à pression direct

- application d’une pression au dessus d’unréservoir de solvant- aucune production de pulsation- volume du réservoir limité- système peu dispendieux- problème de solubilisation du gaz depressurisation

solvant

gaz

vers la colonne

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Pompe à seringue (pompe alternative)

- application d’une pression mécanique au dessus du solvant- aucune production de pulsation- volume du réservoir limité- système peu dispendieux- problème de déformation de la chambre de pompage

a: seringue b: joint d’étanchéitéc: pistond: moteure: aération

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Pompe réciproque- application d’une pression mécanique au dessus du solvant- production de pulsation (piston alternatif)- réservoir indépendant- système dispendieux

solvant du réservoir

vers la colonne

début du remplissage

début de L’expulsion

t

∆P

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amortissement

t

∆P

Pompes réciproques en tandem

• mélange de solvant- élution par gradient de solvant(analogie avec progr. de T en GC)

• amortissement des pulsations

vers la colonne

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• Système d’injection

- Valve avec 2 position :LOAD (chargement) et INJECT (injection)- Boucle:

- Différent volumes disponibles- Injecter 3-5 fois le volume de laboucle (reproductibilité)-Injection manuel ou automatisé

•Injection idéale

- rapide afin d’éviter laperturbation de l’équilibreétablie dans le système- reproductible

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Boucle d’injection

LOAD INJECT

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• Colonne de garde

- petite colonne placé entre l’injecteur et lacolonne de séparation- contient le même remplissage que lacolonne analytique- permet de prévenir l’adsorption irréversiblesde contaminant sur la colonne

- provenant de l’échantillon- du solvant

- prolonge la durée de vie de la colonne

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3.4 Chromatographie liquide

• Colonne

– Acier inoxydable (résistance à P~350 atm)– Diamètre des particules : 3 à 10 µm

• support granuleux• silice et alumine les plus communs

– poreux, pores de 70 à 300 Å– porosité superficielle– non poreux

• Aire : 50 à 250 m2/g

Principaux constituants

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3.4 Chromatographie liquidePhase stationnaire

Silice

- solide ? polaire- CLS- mode adsorption

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Limitations de la silice

– pH• >2 (hydrolyse Si-O-Si-R)• <8 (dissolution)

– Tampon• phosphate (inorganique) vs

Tris (organique)• Molarité

– Température

⇒ Solution : supports polymériques (PS-DVB)


Solubilité de la silice en fn du pH

Phase stationnaire

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Modification desgroupes silanols

- réactions de greffons- obtention de phasesstationnaires liquides(CLL)- mode partage

Phase stationnaire

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PolairesAmino R = (CH2)3NH2

Cyano R = (CH2)3CNDiol R = [(CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH]

Non polairesOctadécyl (C18)R = (CH2)17CH3

Octyl (C8)R = (CH2)7CH3

Phenyl (C5H6)R = (CH2)3C6H5


NPLC– Phase stationnaire : polaire– Phase mobile : non polaire– Ordre d’élution :

• non polaire → polaire– Force de l’éluant :

• non polaire (faible), polaire (fort)

RPLC– Phase stationnaire : non polaire– Phase mobile : polaire– Ordre d’élution :

• polaire → non polaire– Force de l’éluant :

• non polaire (fort), polaire (faible)

Phase stationnaire

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•

•

•••

•

••

Facteurs affectant la chromatographie en phase inverse

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Influence de la taille des particules sur NAvantage : N ↑ Inconvénient : ∆P ↑

3500

pdLN ≈

Phase stationnaire

µ

+ -


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Influence de la porosité des particules


analyte

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Capacité de la colonne

Phase stationnaire

raisonnable

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1- Capacité dela colonne

2- Élargissementdes pics 3- Capacité de

la colonne vs dp

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Caractéristiques:• Mélange eau/solvant organique ou solvant/solvant en proportions

variables. Acétonitrile, méthanol, éthanol, hexane, dichlorométhane,acétate d’éthyle, chloroforme, isopropanol sont les plus communs

– acétonitrile: couramment utilisé pour la séparation de peptide– isopropanol: séparation de protéines hydrophobes et ↑MM– éthanol: séparation de protéines hydrophobe

• Propriétés recherchées:• Pureté• Solubilisation des échantillons• Compatibilité avec le détecteur• Faible viscosité (η↓)• T ébullition pas trop basse• Inerte chimiquement• Prix abordable• Force éluotropique (polarité)

3.4 Chromatographie liquidePhase mobile

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Viscosité et mélange desolvants

-La viscosité des mélangeeau-alcool augmente demanière significative jusqu’àune proportion 1:1- le choix d’un mélange desolvant doit être effectué enconnaissance de cause

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Force éluante (éluotropique):

• Le choix du solvant en LC est critique car il contrôle la sélectivité et ladurée d’une séparation. Les contraintes pratiques sont:– Solubilité des analytes– Force éluante (εo) : capacité d’un solvant à désorber les molécules

d’analyte de la phase stationnaire. C’est une fonction de la polaritédu solvant par rapport à la polarité de la phase stat.

• Les solvants sont classés par ordre de force éluante pour faciliterleur choix afin de contrôler le facteur de capacité (k’) desanalytes. Résolution maximale lorsque 2 < k’ < 5.

• Plus la force éluante est élevé, plus k’ ↓• En chromatographie sur phase stationnaire polaire (NPLC et CLS) :

– Force éluante augmente quand la polarité de l’éluant augmente• En chromatographie sur phase stationnaire non polaire (RPLC) :

– Force éluante augmente quand la polarité de l’éluant diminue

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Force éluotropique

Documents

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