THESE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSEthesesups.ups-tlse.fr/66/1/Portet_Benedicte.pdfF. Etude par LC/DAD/(-)-APCI-MSn de l’extrait acétate d’éthyle de feuilles de Piper

UNIVERSITE PAUL SABATIER TOULOUSE III

UFR DE PHARMACIE

Année : 2007 N° d’ordre…

THESE

En vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE

Délivré par l’Université Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline : Chimie

Spécialité: Chimie – Biologie – Santé

Présentée et soutenue publiquement le 19 Octobre 2007 par

Bénédicte PORTET

RECHERCHE BIOGUIDEE DE MOLECULES

ANTIPALUDIQUES D’UNE PLANTE GUYANAISE

Piper hostmannianum var. berbicense

Directeur de thèse : Professeur Claude MOULIS

Co-directeur de thèse : Professeur Isabelle FOURASTE

JURY

M. A. LATTES Professeur à l’Université de Toulouse III Président

M. L. ANGENOT Professeur à l’Université de Liège Rapporteur

M. F. TILLEQUIN Professeur à l’Université de Paris V Rapporteur

Mme E. T. GOMES Professeur à l’Université de Lisbonne Examinateur

M. G. MASSIOT Directeur de Recherche CNRS-Pierre Fabre, UMS 2597 Examinateur

M. C. MOULIS Professeur à l’Université de Toulouse III Directeur de thèse

Mme. I. FOURASTE Professeur émérite à l’Université de Toulouse III Membre invité

Laboratoire de pharmacochimie des substances naturelles et pharmacophores redox – UMR -152

Faculté de pharmacie, Université Paul Sabatier, 35 chemin des maraîchers, 31062 Toulouse Cedex 9

A notre Président de Thèse,

Monsieur le Professeur Armand LATTES

Professeur de chimie, à l’Université Paul Sabatier de Toulouse.

Qu’il nous soit ici permis de vous remercier très sincèrement pour avoir jugé ce

travail malgré vos nombreuses obligations.

Nous sommes particulièrement honorés de vous avoir vu assurer la Présidence de ce

Jury de Thèse.

A notre Jury de Thèse,

Monsieur le Professeur Luc ANGENOT

Professeur de pharmacognoise, à l’Université de Liège.

Nous vous remercions vivement d’avoir accepté de juger ce travail.

Nous sommes très sensible à l’honneur que vous nous faites d’en être le rapporteur.

Nous sommes très honorés d’avoir pu bénéficié de vos remarques éclairées et tenons à

vous assurer de notre grande estime et de notre profonde gratitude.

Monsieur le Professeur François TILLEQUIN

Professeur de pharmacognosie, à l’Université de Paris V.

Qu’il nous soit ainsi permis de vous remercier très sincèrement pour avoir

spontanément accepté de juger ce travail et d’en être le rapporteur.

Nous sommes très honorés d’avoir pu bénéficier de vos conseils et tenons à vous

assurer de notre considération la plus respectueuse.

Madame le Professeur Elsa Teixera GOMES

Professeur de pharmacognosie, à l’Université de Lisbonne.

Nous vous remercions vivement d’avoir accepté de juger ce travail.

Nous avons été touché par votre gentillesse et par l’intérêt porté sur nos travaux de

recherche.

Monsieur le Docteur Georges MASSIOT

Directeur de recherche CNRS-Pierre Fabre

Vous avez, malgré vos obligations, accepté de juger ce travail.

Nous sommes très heureux d’avoir pu bénéficié de vos remarques et de vos conseils.

Nous sommes particulièrement honorés de votre présence à notre Jury de Thèse.

Monsieur le Professeur Claude MOULIS

Professeur de pharmacognosie à l’Université Paul Sabatier de Toulouse.

Nous sommes très honorés d’avoir pu bénéficié de vos remarques et de vos

compétences tout au long de ces trois années de thèse.

Nous tenons à vous présenter notre profonde reconnaissance et notre respect.

Nous garderons en mémoire vos grandes qualités, tant humaines, qu’intellectuelles,

votre gentillesse et votre humour.

Madame le Professeur Isabelle FOURASTE

Professeur de pharmacognosie à l’Université Paul Sabatier de Toulouse.

Vous nous avez accueilli dans votre laboratoire avec la plus grande bienveillance.

Vos encouragements et votre confiance nous ont guidé tout au long de ce travail.

En témoignage de notre profonde gratitude, veuillez trouvez ici nos remerciements les

plus sincères.

Un grand merci à tous les membres de l’UMR-152 et plus particulièrement à Nicolas, Momo,

Karine, Valérie et Séverine pour leur conseils avisés et à tous les doctorants dont Lucia,

Amélie, et Vincent pour leur soutien tout le long de ces trois années de thèse.

i

Table des matières

Abréviations p1

Lexique de botanique p4

I. Introduction p6

II. Synthèse bibliographique p8

A. Description de la plante étudiée p8

A. I. Données botaniques p8

A. I. 1 Les Piperaceae p8

Position systématique des Piperaceae p8

Caractères morphologiques généraux des Piperaceae p9

Quelques Piperaceae célèbres p10

A. I. 2 Piper hostmannianum var. berbicense p11

Le genre Piper p11

Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC p12

Utilisation en médecine traditionnelle p13

Description anatomique p13

A. II. Données phytochimiques p16

A. II. 1 Données phytochimiques sur le genre Piper p16

Généralités p16

Les alcaloïdes p16

Les flavonoïdes p16

Les kawapyrones p16

Les stéroïdes p16

Les lignanes p17

Molécules antipaludiques isolées dans le genre Piper p18

A. II. 2 Données phytochimiques sur Piper hostmannianum var. berbicense p20

Etude de la composition de l’écorce p20

Etude de la composition des feuilles p20

ii

B. Flavonoïdes et spectrométrie de masse p22

B. I Généralités p22

B. I. 1 Définition, classification et biosynthèse des flavonoïdes p22

Définition p22

Classification p22

Biosynthèse p23

B. I. 2 Les chalcones et les dihydrochalcones p25

Définition p25

Activités biologiques p26

B. I. 3 Les flavanones p27

Définition p27

Activités biologiques p27

B. II Application de la spectrométrie de masse à l’étude de la fragmentation des

flavonoïdes minoritaires p29

B. II. 1 Travaux réalisés en ionisation électronique p29

B. II. 2 Ionisation par electrospray et ionisation chimique à pression atmosphérique (ESI

et APCI) p37

Ionisation par electrospray (ESI) p37

Ionisation chimique à pression atmostphérique (APCI) p42

C. Généralités sur le paludisme p45

C. I. Epidémiologie p45

Des chiffres alarmants p45

Répartition géographique p45

C. II. Le parasite et le vecteur p46

C. II. 1 Les parasites du genre Plasmodium p46

Classification p46

Cycle de reproduction p48

C. II. 2 Le vecteur : un moustique femelle du genre Anopheles p50

Classification p50

Les principales espèces p50

La nécessité d’un repas sanguin p50

C. III. Les manifestations cliniques p51

Phase d’incubation p51

Phase d’invasion p51

iii

Phase d’état p51

C. IV. Prévention et traitement du paludisme p52

C. IV. 1. Prévention du paludisme p52

La lutte anti-vectorielle p52

La chimioprophylaxie p52

C. IV. 2 Le traitement du paludisme p53

C. IV .2. 1 Les principaux antipaludiques p53

Les schizonticides p53

Les gamétocytocides p58

Phénomènes de résistance de P. falciparum aux antipaludiques p59

C. IV. 2. 2 Les remèdes traditionnels : une alternative ? p60

C. V Généralités sur les cibles thérapeutiques p61

III. Résultats et discussion p63

D. Etude phytochimique bioguidée de Piper hostmannianum var. berbicense p63

D. 1 Matériel végétal p63

D. 2 Travaux préliminaires : étude comparative des deux variétés de Piper

hostmannianum Guyanaises p63

D. 3 Extraction p67

D. 4 Purification p68

D. 4. 1 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016 p69

D. 4. 1. 1 Purification de la fraction F1 p70

Purification de la fraction F1.2 p71



D. 4. 1. 2 Purification de la fraction F3 p72

D. 4. 2 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016bis p72

D. 4. 2. 1 Purification de la fraction F4’ p73

D.4.2.2 Purification de la fraction F5’ p74

D.4. 3 Purification de l’extrait chloroformique du lot 1016 p74

D. 4. 3. 1 Purification de la fraction G5 p76



iv

D. 5 Détermination structurale p78

D. 5. 1 Détermination structurale des composés de type dihydrochalcone p79

D. 5. 1. 1 Détermination structurale du composé Host9 p79






D. 5. 1. 7 Bilan des molécules isolées de type dihydrochalcone p98

D. 5. 2 Détermination structurale des composés de type chalcone p100




D. 5. 2. 4 Bilan des molécules isolées de type chalcone p110

D. 5. 3 Détermination structurale des composés de type flavanone p112








D. 5. 3. 8 Bilan des molécules isolées de type flavanone p131

D. 6 Résultats des tests biologiques p133

D. 6. 1 Activités biologiques in vitro p133

D. 6. 2 Activités biologiques in vivo p135

D. 7 Bilan de l’étude phytochimique bioguidée de P. hostmannianum var. berbicense p137

E. Etude de la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et flavanones par

spectrométrie de masse p138

E. 1 Travaux préliminaires p138

E. 2 Etude de la fragmentation des chalcones par (-)-APCI p140

E. 2. 1 Fragments A ou B p141

E. 2. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutres p142

v

E. 2. 3 Cas particulier de la chalcone Host6 p144

E. 2. 4 Bilan : clé d’identification des composés de type chalcone p144

E. 3 Etude de la fragmentation des dihydrochalcones par (-)-APCI p146


E. 3. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutres p148

E. 3. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type dihydrochalcone p150

E. 4 Etude de la fragmentation des flavanones par (-)-APCI p151


E. 4. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutre p152

E. 4. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type flavanone p154

E. 5 Comparaison de la fragmentation des dérivés chalcones et dihydrochalcones en APCI en

mode négatif p155

Comparaison des fragments A ou B obtenus p155

Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres p155

E. 6 Comparaison de la fragmentation des chalcones/dihydrochalcones et flavanones par

APCI en mode négatif p156

Comparaison des fragments obtenus A ou B obtenus p156


E. 7 Comparaison de la fragmentation des chalcones et des flavones en spectrométrie de

masse (techniques d’ionisation douces) p158

Comparaison des fragments obtenus A ou B obtenus p158


E. 8 Conclusion de l’étude de la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et flavanones

par (-)-APCI p159

F. Etude par LC/DAD/(-)-APCI-MS n de l’extrait acétate d’éthyle de feuilles de Piper

hostmannianum var. berbicense p160

F. 1 Profil chromatographique p160

F. 2 Identification des composés présents dans l’extrait AcOEt p162

� Composé de rapport m/z 271 à Tr 15.34 min p162





vi







F. 3 Bilan de l’analyse par LC/DAD/APCI-MSn p194

IV. Conclusions et perspectives p196

V. Matériels et méthodes p200

G. Matériels et méthodes p200

G. 1 Matériel végétal et extraction p200

Identification de la plante p200

Préparation des échantillons p200

Extraction p200

-Extraction par l’ASE 100 Dionex® p200

-Extraction par lixiviation p201

G. 2 Méthodes chromatographiques analytiques p201

G. 2. 1 Chromatographie sur couche mince (CCM) p201

G. 2. 2 Chromatographie liquide haute performance (HPLC/DAD-UV) p202

G. 2. 3 Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse p203

G. 3 Méthodes chromatographiques préparatives p203

G. 3.1 Chromatographie sur colonne ouverte (CC) p203

G. 3. 2 Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) p204

G. 3. 3 Chromatographie SPE sur cartouches de silice C18 (Vac Elut®) p204

G. 3. 4 Chromatographie liquide haute performance semi-préparative (HPLC semi-prep)

p205

G. 4 Méthodes physico-chimiques p205

G. 4. 1 Point de fusion p205

G. 4. 2 Pouvoir rotatoire p205

G. 4. 3 Spectrométrie Ultraviolet (UV) p205

G. 4. 4 Spectrométrie Infra-Rouge (IR) p206

vii

G. 4. 5 Spectrométrie de masse (SM) p206

Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) p206

Spectrométrie de masse haute résolution p206

Ionisation par electrospray (ESI) p207

G. 4. 6 Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) p207

G. 4. 7 Diffraction aux rayons p208

G. 5 Tests biologiques p208

G. 5. 1 Tests réalisés sur P. falciparum p208

G. 5. 1.1 La culture in vitro p208

G. 5. 1. 2 La synchronisation p209

Principe p209

Mode opératoire p209

G. 5. 1. 3 Evaluation de l’activité antiplasmodiale p210

Principe p210


Détermination de la CI50 p210

G. 5. 2 Tests de cytotoxicité réalisés sur des cellule MCF-7 p211

Principe p211


G. 5. 3 Tests in vivo sur souris p211

VI. Références bibliographiques p213

VII. Annexes p222

Données spectroscopiques des composés étudiées p222

Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et 2D du composé Host9 (dihydrochalcone) p238

Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et 2D du composé Host12 (chalcone) p242

Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et 2D du composé Host10 (flavanone) p246

Publication p250

1

Abréviations

(1), (2), (3) etc. :désignation des composés mentionnés dans la synthèse

bibliographique.

[α]D : pouvoir rotatoire.

ACT : Artemisinin Combination Therapy.

AcOEt : acétate d’éthyle.

APCI : ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric pressure

chemical ionization).

APG : Angiosperm Phylogeny Group.

ADN : Acide désoxyribonucléique.

ARN : Acide ribonucléique.

ASE : Automatic Sampler Extractor.

br s : singulet élargi (broad singulet).

CC : Chromatographie sur Colonne ouverte.

CCM : Chromatographie sur Couche Mince.

CNRMI : Centre National de Références pour les Maladies d’Importation.

CoA : Coenzyme A.

CDCl3 : chloroforme deutéré.

CHCl3 : chloroforme.

CH2Cl2 : dichlorométhane.

CI50 : Concentration Inhibitrice à 50%, concentration nécessaire pour avoir

50% d’inhibition de croissance du parasite.

COSY : Correlated SpectroscopY.

CQ : Chloroquine.

δC : déplacement chimique du carbone.

δH : déplacement chimique du proton.

DE50 : Dose Efficace à 50%. Si on mesure la parasitémie, il s’agit de la

concentration qui permet de diminuer la parasitémie des souris de 50%

par rapport aux souris témoins.

DHFR : Dihydrofolate reductase.

DHPS : Dihydroptéroate synthétase.

DMEM : Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium.

DMSO-d6 : diméthylsulfoxyde deutéré.

2

Dox : Doxorubicine.

DTT : Dithiothréitol.

d : doublet.

dd : doublet dédoublé.

ddd : doublet de doublet dédoublé.

EI : ionisation électronique (electronic ionization).

ESI : ionisation par électrospray (electrospray ionization).

FAB : ionisation par bombardement d’atomes rapides

(Fast atom bombardment).

H2O : eau distillée.

Host1, Host2, etc : Désignation des composés isolés.

Hex : Hexane.

HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation.

HPLC : High Pressure Liquid Chromatography.

HRMS : Spectrométrie de masse haute résolution (High Resolution Mass

spectrometry).

HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence.

Hz : Hertz.

IR : Infra-Rouge.

J : constante de couplage.

LC/MS :chromatographie liquide à haute performance couplée à la

spectrométrie de masse (Liquid chromatography/Mass Spectrometry).

m : multiplet.

m/z : rapport masse/charge atomique.

MDR : Multiple Drug Resistant.

MeOD : Méthanol deutéré.

MeOH : Méthanol.

MPLC : Chromatographie liquide moyenne pression (Medium Pressure Liquid

chromatography).

NOESY : Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy.

OMS : Organisation Mondiale de la Santé.

ORTEP :Oak Ridge Thermal Ellipsoid Plot. Il s’agit d’un programme

informatique permettant de dessiner la structure de molécules

cristallines.

3

ppm : partie par millions.

RDA : Rétro Diels-Alder.

RMN 1H : Résonance magnétique nucléaire du proton.

RMN 13C : Résonance magnétique nucléaire du carbone.

s : singulet.

SPE : Solid Phase Extraction.

TIC : Total Ion Current (Courant ionique total).

Tol : toluène.

uma : unité de masse atomique.

UMR : Unité Mixte de Recherche.

UV : Ultra-violet.

WHO : World Health Organization.

XTT : 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tetrazolium-5-

carbonilide de sodium.

4

Lexique de botanique

Actinomorphe : qualifie une corolle ayant plusieurs plans de symétrie (en étoile).

Albumen : tissu de réserve, généralement triploïde, résultant de la croissance de l’embryon

accessoire obtenu lors de la double fécondation des Angiospermes, entre un gamète mâle et

les deux noyaux centraux du sac embryonnaire.

Apex : sommet.

Carpelles : définissent les organes reproducteurs femelles formant le pistil ou gynécée.

Drupe : fruit en partie charnu possédant le plus souvent un seul noyau (ex : cerise).

Epiphyte : qualifie des espèces de végétaux qui vivent sur les troncs, les branches, les feuilles

d’un autre végétal.

Glabre : dépourvu de poils.

Monoaperturé : se dit d’un pollen présentant un seul pore (ou fente de sortie).

Nucelle : tissu de réserve, diploïde, d’origine maternelle, il est en général transitoire et

disparaît lors de la croissance de l’embryon. S’il persiste dans la graine, il est alors appelé

périsperme.

Oppositifolié : inséré du côté opposé d'où naît la feuille.

Ovaire supère : l’ovaire est insérée dans la fleur au dessus des pétales et sépales.

Pennée (nervation) : une nervure principale et des nervures secondaires régulièrement

disposées de chaque côté.

Perianthe : l’ensemble des pétales (corolle) et des sépales (calice).

5

Péricarpe : enveloppe du fruit, provenant du développement des parois du carpelle.

Périsperme : tissu de réserve, diploïde, d’origine maternelle qui est le nucelle.

Placentation : désigne la disposition des ovules à l’intérieur de l’ovaire. Une placentation

basilaire indique que les ovules sont fixés à la base des carpelles.

Pubescent : se dit d’une feuille, d’une tige qui est couverte de poils fins et courts.

Sessile : qualifie une fleur, un fruit ou une feuille sans pédoncule ou pétiole.

Stipules: petites pièces foliacées, à la base du pétiole, au niveau de son insertion sur la tige.

I. Introduction

6

Endémie parasitaire majeure, le paludisme ou malaria sévit dans les régions tropicales

et sub-tropicales de l’hémisphère sud. Plus de deux milliards de personnes sont susceptibles

de contracter la maladie à travers le monde. Actuellement, malgré l’arsenal thérapeutique

existant, peu de médicaments sont disponibles sur le marché et sont accessibles aux

populations concernées. De plus, le développement de phénomènes de résistance du parasite

aux traitements actuels renforce le besoin urgent de trouver de nouveaux antipaludiques.

Dans le monde, près de 80% de la population a recours aux plantes médicinales par

manque d’accès aux médicaments prescrits mais aussi parce que les plantes ont pu démontrer

une réelle efficacité. Deux antipaludiques actuels sont issus de plantes traditionnellement

utilisées dans leur pays d’origine contre les fièvres et le paludisme. Il s’agit de l’écorce d’un

arbre originaire des flancs de la cordillère andine (Cinchona calisaya et autres espèces de

Cinchona) et d’une herbacée originaire de Chine, Artemisia annua. Ces découvertes

encouragent la recherche de nouveaux antipaludiques au sein de la biodiversité végétale.

Le laboratoire de pharmacochimie des substances naturelles et pharmacophores redox,

sous le label UMR-152 IRD-UPS, concentre une partie de ses recherches sur la découverte de

substances naturelles bioactives et étudie, par leur intermédiaire, les mécanismes redox

impliqués dans l'invasion érythrocytaire de Plasmodium. La sélection des plantes est réalisée

par des chercheurs de l’IRD implantés en Amérique du Sud successivement en Bolivie, en

Guyane et au Perou. Ce Laboratoire résulte de l’association d’une unité propre de l’IRD (UR

043) et d’une unité de l’Université Paul Sabatier (EA 3030).

En 2000, l’unité de recherche (R043) « Pharmacochimie des substances naturelles » s’est

associée avec l’unité de service US 024 Biodival, le centre de recherche sur les substances

naturelles (UMR CNRS/Pierre Fabre) et le laboratoire d’immunologie cellulaire des

infections parasitaires (U511 Inserm) dans l’élaboration d’un projet de recherche intitulé

« Recherche de molécules antipaludiques : criblage à haut débit de la faune et de la flore

tropicale » pour répondre aux finalités du programme VIHPAL (devenu PAL+ en 2001)

[VIHPAL, 1999-2000].

Ce projet consistait notamment à exploiter l’extractothèque de l’IRD constituée d’extraits

marins et végétaux, ces derniers provenant essentiellement de la flore guyanaise, afin de

déterminer leur activité sur des cibles liées au paludisme. Ces extraits ont été criblés sur des

I. Introduction

7

cibles pharmacologiques à haut débit au centre de criblage pharmacologique (UMR IPBS-

CNRS/Pierre Fabre) à Toulouse, et sur culture de P. falciparum in vitro au sein de l’UR 043.

Parmi les extraits actifs testés sur une cible spécifique de P. falciparum (test d’activité sur une

protéine kinase, la Pfnek-1* [Dorin et al., 2001]), l’extrait acétate d’éthyle des feuilles de

Piper hostmannianum var. berbicense s’est avéré potentiellement actif. L’activité a été

confirmée ultérieurement à l’UMR-152 par des tests in vitro sur des souches de P. falciparum

révélant une CI50 de 8 µg/ml.

L’objectif de mon travail de thèse a consisté à rechercher par bioguidage les

substances naturelles antiplasmodiales présentes dans les feuilles d’une Piperaceae, Piper

hostmannianum var. berbicense.

� Dans un premier chapitre, nous résumerons une étude bibliographique sur les

connaissances botaniques et phytochimiques de la famille des Piperaceae et de

l’espèce étudiée. Nous développerons également l’utilisation de la spectrométrie de

masse comme outil d’analyse et d’identification de composés naturels et plus

particulièrement de flavonoïdes (chalcones, dihydrochalcones et flavanones). Une

présentation du paludisme et des remèdes actuels terminera cette synthèse

bibliographique.

� Le second chapitre sera consacré à l’étude phytochimique bioguidée de Piper

hostmannianum var. berbicense. Nous détaillerons les étapes de fractionnement et

nous décrirons l’identification des composés isolés avant de présenter les résultats des

tests biologiques obtenus in vitro et in vivo.

� Dans le troisième chapitre, nous présenterons le travail au cours d’un stage en

spectrométrie de masse réalisé à l’UCL (Université Catholique de Louvain) à

Bruxelles au sein du laboratoire d’analyse physico chimique des médicaments et

pharmacognosie dirigé par le Pr. Joëlle Quetin-Leclercq. L’étude de la fragmentation

en spectrométrie de masse des composés isolés sera présentée avant l’application de la

LC/MSn dans l’étude approfondie d’un extrait brut de Piper hostmannianum var.

berbicense.

* La Pfnek est une kinase spécifique de P. falciparum dont l’inhibition bloque le developpement du cycle cellulaire. Cette enzyme phosphoryle une Pfmap-2 qui est une MAP kinase (Microtubules Associated Protein) spécifique de P. falciparum.

II. Synthèse bibliographique

8

A. Description de la plante étudiée

A. I. Données botaniques

A. I. 1 Les Piperaceae

Position systématique des Piperaceae

La famille des Piperaceae comprend entre 1400 et 3000 espèces réparties en une dizaine de

genres dont les deux principaux représentants sont le genre Piper et le genre Peperomia

[Spichiger, 2000]. Ce sont des herbes, arbustes (Piper) ou arbres parfois grimpants ou

épiphytes, aromatiques présents dans les régions tropicales et sub-tropicales de l’hémisphère

sud et plus particulièrement en Amérique du Sud (voir Fig. 1).

Fig. 1 : Répartition mondiale des Piperaceae [Stevens, 2001].

Selon les classifications classiques pré-moléculaires [Cronquist, 1988], les Piperaceae sont

des dicotylédones appartenant à l’ordre des Pipérales, ordre qui comprend également les

Chlorantaceae et les Saururaceae (voir Tableau 1).

Classification Classique (Cronquist, 1988)

Règne PlantaeSous-règne Tracheobionta (plantes vasculaires)Embranchement Spermaphytes (plantes à graines)Sous-embranchement Angiospermae (plantes à fleurs)Classe Magnoliopsida (Dicotylédones)Sous-classe MagnoliidaeOrdre PipéralesFamille Piperaceae

Tableau 1 : Place des Piperaceae selon

la classification classique de Cronquist [1988].


9

Parmi les classifications basées essentiellement sur des critères morphologiques et

anatomiques, celle de Cronquist est la plus utilisée.

En 1998, un groupe de chercheurs (Angiosperm Phylogeny Group, APG) élabore un nouveau

système de classification basé sur des critères phylogénétiques. Il prend en compte tous les

caractères héritables, depuis ce qui est visible (base des classifications traditionnelles)

jusqu’aux séquences d’ADN, en passant par les protéines et les données de la paléontologie.

Le séquençage de certaines parties du génome comme l’ADN des mitochondries ou l’ARN

des ribosomes a permis au cours des dernières années de faire des progrès importants

[Spichiger, 2000]. Aujourd’hui, il s’agit de la classification la plus utilisée : APG I 1998.

Ainsi, au sein des Angiospermes, les Piperaceae sont des dicotylédones à pollen uni-aperturé

présentées sous le terme de paléoherbes car elles partagent de nombreuses plésimorphies avec

les Monocotylédones (voir Tableau 2)

Classification selon APG I Classification selon APG IIDivision Angiospermes AngiospermesClasse Angiospermes monoaperturés Angiospermes monoaperturésSuper-ordre / MagnoliidesOrdre Pipérales PipéralesFamille Piperaceae Piperaceae

Tableau 2 : Place des Piperaceae selon les classifications phylogénétiques

APG I et APG II .

Cependant cette classification a été révisée en 2003 : APG II 2003 [Password, 2003]. Cela

traduit les efforts faits en systématique pour tenir compte des dernières avancées en matière

de biologie moléculaire.

Selon de nouvelles considérations phylogénétiques [Graham et Olmstead, 2000; Lee et al.,

1999] le super-ordre des Magnoliides a été créé comprenant l’ordre des Laurales, des

Magnoliades, des Pipérales et un nouvel ordre, les Canellales, regroupant deux familles, les

Canellaceae et les Winteraceae. La place des Piperaceae selon ces nouveaux critères est

présenté dans le Tableau 2.

Caractères morphologiques généraux des Piperaceae

Ce sont des plantes herbacées ou arbustes parfois épiphytes, présentant des nœuds enflés ou

articulés. Les poils tecteurs sont simples et les feuilles sont généralement entières, simples,

alternes à nervation palmée ou pennée. Elles dégagent souvent par froissement une odeur


10

forte et piquante. Les stipules sont absentes ou soudées au pétiole (parfois engainées dans le

pétiole). Les inflorescences indéterminées sont des épis épais densément couverts de petites

fleurs, terminales ou axillaires, souvent déplacées en position oppositifoliée suite au

développement du rameau axillaire. Les fleurs actinomorphes, hermaphrodites ou unisexuées

(plantes monoïques ou dioïques) sont minuscules, chacune à l’aisselle d’une bractée peltée

largement triangulaire. Le périanthe est absent. Les étamines entre une et dix, souvent six, à

filet généralement libre. Les grains de pollen sont monosulqués ou monoaperturés. Les

carpelles, entre une et quatre, sont soudées. L’ovaire supère est à placentation basilaire. Les

stigmates entre un et quatre sont capités, lobés ou plumeux. Il y a un ovule par ovaire. Les

fruits sont habituellement des drupes, l’albumen est peu développé et complété par un

périsperme. Les faisceaux conducteurs des tiges sont disposés en plusieurs anneaux

concentriques ou dispersés dans un parenchyme comprenant des cellules sécrétrices à huile

essentielle [Campbell et al., 2001].

Quelques Piperaceae célèbres

Au sein de la famille des Piperaceae, les plantes du genre Piper sont les plus célèbres et les

plus utilisées. Plusieurs d’entre elles possèdent un intérêt alimentaire, médicinal et certaines

sont devenues indispensables à l’homme.

- La plus connue est le poivrier commun ou Piper nigrum L. (Fig. 2). C’est l’une des épices

les plus anciennement connues. Il est originaire du sud-ouest de l’Inde (côte de Malabar) et

cultivé maintenant en Inde (Kerala), en Malaisie, au Sri Lanka mais aussi en Amérique du

Sud (Brésil). Le fruit est une drupe de 4-8 mm de diamètre, passant du vert au rouge au cours

de la maturation. Le poivre doit son odeur à la présence de 10 à 35 ml/kg d’huile essentielle

riche en carbures terpéniques et sa saveur brulante à des amides (5-10%) [Bruneton, 1999].

- Nous pouvons aussi citer le betle ou Piper betle L. dont les feuilles sont utilisées comme

stimulant, antiseptique et pour rafraîchir l'haleine. Elles sont également utilisées en infusion

pour traiter l'indigestion, comme onguent ou en inhalation contre les maux de tête, comme

traitement contre la constipation, comme décongestionnant et aide à la lactation. Dans la

médecine ayurvédique, elles sont employées comme aphrodisiaque. En Malaisie, elles sont

utilisées pour traiter les maux de tête, l'arthrite et les rhumatismes.

En Inde, les feuilles sont mâchées avec de la chaux (oxyde de calcium) et de la noix d'arec

dans une préparation qui prend le nom de bétel. La chaux agit comme alcalin, l'arec libère


11

alors l'alcaloïde, arécoline, qui favorise la salivation, la salive devenant teintée de rouge. On

ajoute parfois du tabac à la préparation [Duke, 2002; Duriyaprapan, 2003].

- Le kava ou Piper methysticum Forst. est une Piperaceae originaire du Pacifique occidental.

Il ne pousse que dans les îles du Vanuatu et quelques îles avoisinantes. Il est largement utilisé

en médecine traditionnelle pour ses propriétés anesthésiantes. En Occident, le kava est utilisé

en infusion pour lutter contre les symptômes du stress, de l'anxiété et de la dépression [Duke,

2002].

Fig. 2: Piper nigrum (http://mobot.mobot.org/cgi-bin/search_vast).

A. I. 2 Piper hostmannianum var. berbicense

Le genre Piper

Le genre Piper comprend plus de 1000 espèces réparties dans les régions tropicales et sub-

tropicales (Fig. 3). Ce sont des arbres ou arbustes, rarement des lianes, fréquemment

rencontrés dans les forêts humides des régions de l’hémisphère sud [Jaramillo et Manos,

1988].

Fig. 3: Distribution géographique des espèces du genre Piper [Jaramillo et Manos, 1988].


12

Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC

Piper hostmannianum var. berbicense est une plante originaire d’Amérique du Sud et plus

particulièrement de Bolivie, Colombie, Brésil, Equateur, mais surtout du Venezuela et en

Guyane (www.mobot.org). Il possède un autre synonyme : Arthante berbicensis (Miq) C.DC

(International plant names index : www.ipni.org).

Quatre variétés de cette espèce sont signalées (www.mobot.org). Ainsi, nous distinguons :

- Piper hostmannianum var. hostmannianum.

- Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC, 1869 (Fig. 4).

- Piper hostmannianum var. glabrirameum Trel. & Yunck, 1950.

- Piper hostmannianum var. ramiflorum C.DC, 1869.

En Guyane, les deux premières variétés sont présentes.

(a) (b)

Fig. 4 : (a) P. hostmannianum var. berbicense, photo prise en Guyane.

(b) Récolte de P. hostmannianum var. berbicense dans la forêt guyanaise.

Description morphologique des deux variétés de Piper hostmannianum guyanaises

Piper hostmannianum (Miq.) C.DC (1869)

Arbuste rameux de 3 m de haut, ou liane rampante. Tiges pubescentes. Feuilles sans glandes,

pétioles de 5 - 10 mm de long. Feuilles elliptiques ou ovales 13-22×6×10 cm. Présence de

poils le long des nervures, surtout sur la face inférieure de la feuille. Base des feuilles oblique,

avec un coté légèrement plus long que l’autre de 3-5 mm, obtus ou aigu, apex acuminé.

Nervation pennée, les nervures secondaires arrangées en 3-4 paires à partir de la nervure


13

centrale, partant de la nervure centrale à angle ouvert, ensuite se recourbant brutalement pour

s’orienter presque parallèlement à la marge.

Epis dressés, 10-12 cm de long, de blanc verdâtre à jaune. Pédoncules de 10 mm de long,

pileux, les bractées florales sont très découpées. Les fleurs présentent des stigmates sessiles.

Les fruits (baies) oblongs ou en forme de trigone ont un apex glabre ou pubérulent. Floraison

mai, août septembre, octobre. Fructification entre mai et septembre. Commun en zone lisière

de forêt, en zones non inondées [Candolle, 1869; Mori et al., 2002].

Piper hostmannianum var. berbicense (Miq.) C. DC

Cette variété présente les mêmes caractéristiques morphologiques que la variété précédente

mais le jeune bourgeon foliaire terminal présente une pubescence plus dense que P.

hostmaniannum. De plus, on peut distinguer la présence de poils hirsutes de taille supérieure à

1 mm. Sommet des fruits (baies) velues [Candolle, 1869; Mori et al., 2002].

La distinction de ces deux variétés sur le terrain a été permise grâce aux descriptions

précédentes.

Utilisation en médecine traditionnelle

En Guyane, la décoction des feuilles est utilisée comme anti-venin. Les feuilles peuvent être

directement appliquées sur les morsures de serpents [Van Andel, 2000].

Description anatomique de Piper hostmannianum var. berbicense

Feuille : la section transversale de la feuille de Piper hosmannianum var. berbicense (Fig. 5)

présente une nervure médiane légèrement incurvée à la face supérieure et fortement bombée à

la face inférieure, plus ou moins marquée de côtes.

Nervure médiane : Colorée par le réactif carmino-vert aluné , la section transversale présente

de la face supérieure à la face inférieure :

- L’ épiderme supérieur,

- Le parenchyme palissadique (une seule assise cellulaire),

- Le parenchyme lacuneux de part et d’autre du système conducteur constitué de

cellules arrondies dont certaines isolées sont sclérifiées et des cellules à huile

essentielle (40 µm de diamètre).


14

- Le système conducteur formé de faisceaux libéro-ligneux est disposé en arc (liber

déchiré lors de la dessication).

- Des amas de collenchyme prés de l’épiderme inférieur font face à chaque faisceau

libéro-ligneux. Ils sont délimités par une assise de cellules lignifiées.

Epiderme inférieur

Parenchyme palissadique

Cellule sclérifiée Cellules

à huile essentielle

Vaisseau de bois

Espace correspondant au liber

Epiderme supérieur

Poil tecteur

Collenchyme

Cellules fibreuses

Epiderme inférieur

Parenchyme palissadique

Cellule sclérifiée Cellules

à huile essentielle

Vaisseau de bois

Espace correspondant au liber

Epiderme supérieur

Poil tecteur

Collenchyme

Cellules fibreuses

Fig. 5 : Section transversale de la feuille

(grossissement × 40 et pour les agrandissements ×400)

- L’épiderme inférieur (Fig. 6) présente des poils tecteurs et des poils sécréteurs. La

cuticule s’interrompt au niveau des stomates. Au niveau des poils tecteurs, il y a

interruption de la cuticule ce qui n’est pas le cas pour les poils sécréteurs.

Cuticule

Epiderme inférieur

Chambre sous-stomatiquePoil sécréteur

(Face inférieure)

Poil tecteur

(Face inférieure)Cuticule

Epiderme inférieur

Chambre sous-stomatiquePoil sécréteur

(Face inférieure)

Poil tecteur

(Face inférieure)

Fig. 6 : Face inférieure, section transversale de la feuille

(grossissement × 400)


15

En passant en lumière polarisée, nous pouvons voir des cristaux en forme d’aiguilles (Fig. 7)

d’oxalate de calcium [Souza L.A., 2004] dans les cellules du parenchyme à proximité des

faisceaux libéro-ligneux.

A BA B

Fig. 7: Cristaux en aiguilles d’oxalate de calcium. A : en lumière normale, B : en lumière

polarisée (grossissement × 400)

Limbe : (Fig. 8) de la face supérieure à la face inférieure se distinguent :

- L’ épiderme supérieur constitué de cellules allongées,

- L’ hypoderme supérieur constitué d’une assise de cellules allongées à parois

cellulosiques,

- Le mésophylle hétérogène asymétrique constitué de parenchyme palissadique et de

parenchyme lacuneux . Il renferme des cellules à huiles essentielle,

- L’ hypoderme inférieur constitué d’une à deux assises de cellules allongées à parois

cellulosiques,

- L’ épiderme inférieur possédant des poils tecteurs.

Epiderme inférieur

Hypoderme

Hypoderme

Epiderme supérieur

Parenchyme palissadiqueParenchyme lacuneux

Cellule à huile essentielle

Poil tecteur

Vaisseaux-nervations secondaires

Fig. 8: Section transversale de la feuille : le limbe.

(grossissement × 40 et pour les agrandissements ×400)


16

A. II. Données phytochimiques

A. II. 1 Données phytochimiques sur le genre Piper

Généralités L’étude phytochimique des plantes du genre Piper a largement été étudié ces dernières années

faisant l’objet de revues générales [Parmer et al., 1997, 1998; Sengupta et Ray, 1987].

L’ensemble des composés isolés et identifiés est très hétérogène. Ainsi, Les constituants les

plus rencontrés sont des alcaloïdes, des flavonoïdes, des kawapyrones, des stéroïdes et des

lignanes dont nous allons donner quelques exemples de structures (Fig. 9).

Les alcaloïdes

Ce sont des alcaloïdes de type amides. Ces composés sont les plus rencontrés dans le genre

Piper. Parmi les amides, nous pouvons distinguer des isobutylamides et des amides de type

pyrrolidine ou pipéridine. Le plus connu est la pipérine (1) (Fig. 9) isolée des feuilles de Piper

nigrum reconnue pour ces propriétés antipyrétique et antiinflammatoire [Lee et al., 1984;

Tunmann, 1918].

Les flavonoïdes

Les flavonoïdes rencontrés sont essentiellement des chalcones, des dihydrochalcones, des

flavanones et quelques flavones. Les chalcones et dihydrochalcones isolées ont généralement

le cycle B non substitué sauf dans le cas de l’asébogénine 2 et des flavokawaïnes A (3) et C

(4) (Fig. 9) respectivement identifiées dans les feuilles de Piper aduncum [Orjala et al., 1994]

et Piper methysticum [Som, 1983].

Les kawapyrones

Ce sont des δ-lactones possédant un substituant styryle ou dihydrostyryle. La majorité des

composés a été isolé dans P. methysticum dont le plus connu est la methysticine (5) (Fig. 9).

Ces composés sont des antagonistes de la strychnine [Kretzschmar et al., 1970].

Les stéroïdes

Les stéroïdes isolés sont relativement peu nombreux. Nous distinguons essentiellement des

stérols (sitostérol, stigmastérol, daucostérol) et des acides ursoliques.


17

Les lignanes

Ce sont des composés dont le squelette résulte de l’établissement d’une liaison entre les

carbones β des chaînes latérales de deux unités dérivées du 1-phénylpropane. La sésamine (7)

a été le premier lignane isolé du genre Piper. Quelques néolignanes (ce sont également les

produits de condensation d’unités phénylpropaniques mais la liaison variable n’implique au

maximun qu’un seul carbone β) ont également été identifiés dont la kadsurénone (6) (Fig. 9)

isolée de Piper futokadsura.

O

O

N

O

1

OOH

OHO OH

2

OO

OHO R2

R1

3 R1=H; R2=OCH34 R1=H; R2=OH

O

O

O

O

O

5

O O

OO

O

6

Fig. 9 : Quelques molécules isolées du genre Piper.

Les plantes du genre Piper et plus généralement les Piperaceae sont des plantes à huile

essentielle. L’huile essentielle est généralement stockée dans les feuilles (présence de poils

sécréteurs et de cellules sécrétrices) ou dans le péricarpe des fruits ou des graines [Bruneton,

1999]. Elles sont riches en terpènes et plus particulièrement en sesquiterpenes (hydrocarbonés

ou oxygénés) [Dos Santos et al., 2001; Mundina et al., 1998; Vila et al., 2001]. La Fig. 10

présente quelques structures de sesquiterpènes rencontrés dans les huiles essentielles de

plantes du genre Piper.

O

O

O

OHH

7


18

Fig. 10 : Exemple de sesquiterpènes présents dans les huiles essentielles du genre Piper.

Molécules antipaludiques isolées dans le genre Piper

Quatre espèces de Piper ont été étudiées pour leurs propriétés antipaludiques. Il s’agit de :

- P. hispidum Sw.

- P. sarmentosum Roxb.

- P. chaba Hunter.

- P. polysyphonum C.DC .

Jenett-Siems et al. [1999] ont étudié l’activité antipaludique de quatorze plantes d’Amérique

du Sud utilisées en médecine traditionnelle. Les extraits lipophiles de cinq d’entre elles dont

P. hispidum s’avèrent être actifs suite à des tests in vitro sur deux souches de P. falciparum

(PoW : souche chloroquino-sensible et Dd2 : souche chloroquino-résistance). Le

fractionnement bioguidé de l’extrait lipophile des feuilles de P. hispidum a conduit à

l’identification de trois composés (Fig. 11).

O

O

O

O

OOH

OHO

OH

OOH

OHHO

DillapiolInactif

AsebogénineCI50= 16.9 µg/ml sur PoWCI50= 10.4 µg/ml sur Dd2

2', 4', 6'-trihydroxydihydrochalconeInactif

Fig. 11 : Molécules isolées des feuilles de P. hispidum.


19

Le fractionnement bioguidé des extraits hexanique et méthanolique des feuilles de P.

sarmentosum a permis l’identification de deux alcaloïdes de type amides (Fig. 12) avec des

activités respectives de CI50= 18.9 µg/ml et 6.5 µg/ml sur la souche chloroquino-résistante K1

de P. falciparum.

N

O

N

O

O

O

NO NO

Fig. 12

Rukachaisirikul et al. [2002] ont isolé des racines de Piper chaba Hunter un alcaloïde de type

amide présentant une structure dimérique (Fig. 13) avec une CI50 de 2.7 µg/ml sur la souche

chloroquino-résistante K1 de P. falciparum.

O N

O

O

N

O

O

O

Fig. 13

Un néolignane, la polysiphorine (Fig. 14) déjà isolée de P. polysiphonum [Ma et al., 1991], a

été identifiée dans les feuilles de Rhapidophora decursiva (Araceae) [Zhang et al., 2001] suite

à un fractionnement antiplasmodial bioguidé. Elle présente une CI50 de 4.04 µg/ml et de 3.68

µg/ml respectivement sur les souches D6 (souche chloroquino-sensible) et W2 (souche

chloroquino-résistante) de P. falciparum.

O

O

O

O

O

O

H

Fig. 14


20

A. II. 2 Données phytochimiques sur Piper hostmannianum var. berbicense

Bien que cette variété n’a fait l’objet d’aucune publication à ce jour, nous vous présenterons

ici les travaux phytochimiques réalisés sur P. hostmannianum C. DC.

� Etude de la composition de l’écorce

La composition de l’écorce a été étudié par Diaz et al. [1987] et a fait l’objet d’une

publication. En plus du linalol et du sitostérol, deux chromènes ((8) et (9), Fig. 27), deux

esters benzoïques ((10) et (11), Fig. 15) et trois flavanones ((12), (13) et (14), Fig. 15) ont été

isolés et identifiés de l’extrait hexanique.

O

O

O

O

O

O

8 9

O

O

R1O

OR2

10 R1=R2=H11 R1=R2=Ac

O

OOR1

R2

R3O

R4

12 R1=H R2=Me R3=Me R4=Me13 R1=Ac R2=Me R3=Me R4=Me14 R1=H R2=Me R3=H R4=H

Fig. 15 : Composés isolées de l’écorce de P. hostmannianum C.DC.

Les molécules nouvelles sont le chromène (8) et l’ester benzoïque (10). C’est la première fois

que des flavanones C-méthylées ((12) et (13) Fig. 15) sont isolées dans le genre Piper.

� Etude de la composition des feuilles

L’étude phytochimique des feuilles a fait récemment l’objet d’une publication en 2004 [Lago

et al., 2004]. La purification de l’extrait CH2Cl2/MeOH (2/1) a permis l’identification de

quatre nouveaux dérivés d’acide benzoïque (15), (16), (17) et (18) (Fig. 16) ainsi que les

molécules (8), (10), (14) (Fig . 15) préalablement identifiées dans les racines [Diaz et al.,

1987].


21

O

OH

RO

O

O

O

=R

=R

=R

15

16

17

O O

OH

OH

OH

18

Fig. 16

Les auteurs ont également étudié l’activité anti-fongique des molécules isolées sur

Cladosporium cladosporioides et C. sphaerospermum. La quantité totale nécessaire pour

inhiber à 100% la croissance de ces champignons est de 5 µg et de 0.5 µg sur CCM pour le

chromène (8) et l’ester benzoïque (18), les autres molécules étant inactives.

Après cette première partie consacrée à la description de la plante étudiée en terme de

caractères botaniques et phytochimiques, la seconde partie traite des flavonoïdes (et plus

particulièrement des chalcones, dihydrochalcones et flavanones) et des critères

d’identification établis pour les identifier en spectrométrie de masse.


22

B. Flavonoïdes et spectrométrie de masse

B. I Généralités

B. I. 1 Définition, classification et biosynthèse des flavonoïdes

Définition

Le terme « flavonoïde » désigne une très large gamme de composés naturels appartenant à la

famille des polyphénols. Ils sont considérés comme les pigments quasiment universels des

végétaux. Tous les flavonoïdes (plus de 4000) possèdent le même élément structural de base,

à savoir l’enchaînement 2-phénylchromane (Fig. 17) [Bruneton, 1999].

O

A

B

C

Fig. 17 : 2-phénylchromane.

C’est chez les Angiospermes que la diversité structurale des flavonoïdes est maximale. Ils

sont de façon très générale localisés dans les feuilles (dans l’épiderme ou entre l’épiderme et

le mésophylle), dans les fleurs (cellules épidermiques) ou encore dans les fruits (tégument

externe) [Bruneton, 1999].

Classification

Ils peuvent être regroupés en une douzaine de classes selon le degré d’oxydation du noyau

pyranique central, lequel peut-être ouvert et recyclisé en un motif furanique

(dihydrofuranone). La Fig. 18 illustre les principales classes de flavonoïdes.


23

O

O

O

O

OH

O

O

O

O

OH

O

OH

OH

O

O

OH

Flavones Flavonols

FlavanonesDihydroflavonols Flavan-3,4-diols

Chalcones Aurones Anthocyanidols

O

O

OH

Flavan-3-ols

1

2

3

45

6

7

81'

2'

3'

4'

5'

6'

12

3

4

56

1'

2'

3'

4'

5'

6'

α

β

O

Fig. 18 : Les principales classes de flavonoides [Bruneton, 1999].

De façon générale, les flavonoïdes peuvent être hydroxylés en position 3, 5, 7, 3’, 4’, 5’et/ou

6’ (suivant la numérotation présentée pour les flavones, Fig. 18). Un ou plusieurs de ces

groupes hydroxyles sont fréquemment méthylés, acétylés, prénylés ou sulfatés. Dans les

plantes, les flavonoïdes peuvent être présents sous forme C-ou O-glycosylés. Les formes

libres, sans sucres attachés sont appelés les génines ou aglycones [Bruneton, 1999].

Les « flavonoïdes minoritaires » sont représentés par les chalcones , les dihydrochalcones, les

aurones, les flavanones, les dihydroflavonols et les anthocyanidols (structures encadrées dans

la Fig. 18) [Harborne, 1993].

Biosynthèse des flavonoïdes (Fig. 19)

L’étape clé de la formation des flavonoïdes est la condensation de trois molécules de malonyl-

CoA avec un ester du coenzyme A et d’un acide hydroxycinnamique, en règle générale le 4-

coumaroyl-CoA, pour obtenir la 4, 2, 4’, 6’-tetrahydroxychalcone (réaction catalysée par la

chalcone synthase). Dans les conditions physiologiques normales, cette chalcone tend à

s’isomériser en flavanone sous l’action de la chalcone isomérase qui induit une fermeture

stéréospécifique du cycle conduisant à la seule (2S)-flavanone. Cette chalcone peut également

se cycliser en aurone. Il est le précurseur de toutes les classes de flavonoides comme le

montre la Fig. 21 [Bruneton, 1999].


24

HO

O

OCoAS

3

+

OH

O

CoAS

malonylCoA 4-coumaroylCoA

OOH

HO OH

OH

Chalcone

CS

OOH

HO

OH

Aurones

CI

O

O

OH

OH

HO

Flavanones

O

O

OH

OH

HO

Flavones

F3H

O

O

OH

OH

HO

3-OH-FlavanonesOH

R

R

O

OOH

HO

Isoflavones

OH

R

R

IFS

O

OH

OH

OH

HO

Flavan-3,4-diolsOH

R

R

DFR

O

O

OH

OH

HO

FlavonolsOH

R

R

O

OH

OH

HO

OH

R

R

3-OH-Anthocyanidines

Flavan-4-ols

3-déoxycyanidines

O

OG

OG

HO

OH

R'''

R'''

Anthocyanines

Flavan-3-ols

polymérisation

Proanthocyanines

(tannins condensés)

Fig. 19 : Biosynthèse des flavonoïdes.

CS : chalcone synthase ;CI : chalcone isomérase ; F3H : Flavanone 3-hydroxylase ; IFS :

isoflavone synthase ; DRF : dihydroflavonol reductase ; FS : flavonol synthase ; AS :

anthocyanin synthase. R=-H, -OH ou -OCH3 et OG= -O-sucre [Shirley, 1996].


25

Remarque : cas particulier des flavonoides C-méthylés

D’après Vederas et al. [Vederas et Leeper, 2000], la biosynthèse des chalcones C-méthylés

s’expliquerait par la présence d’ une méthylchalcone synthase qui catalyserait la réaction de

condensation entre un méthymalonylCoA et le 4-coumaroyl-CoA pour donner la chalcone

méthylée correspondante qui par suite des réactions présentées Fig. 19 conduirait aux autres

flavonoides C-méthylés. L’existence d’une telle enzyme constitue un des thèmes de recherche

de Schröder et al. [1998]. Néanmoins en septembre 2007, ce groupe de chercheurs n’a pas

encore isolé cette enzyme.

B. I. 2 Les chalcones et les dihydrochalcones

Définition

Les chalcones et par défaut les dihydrochalcones sont uniques au sein de la famille des

flavonoïdes. Dépourvus du cycle C central, les deux cycles A et B sont reliés par une chaîne

tricarbonée cétonique α, β insaturée (saturée dans le cas des dihydrochalcones). Les cycles A

et B sont équivalents aux cycles A et B des autres flavonoïdes mais leurs numérotations sont

inversées (Fig. 20).

O

1'

2'

3'

4'

5'

12

3

4

5

6

α

β

6'

A B

O

O

6'5'

1'2'

3'

4'

2

3

45

6

78

9

10

A

B

C

Fig. 20 : Numérotation du squelette chalcone (a) et flavanone (b).

La présence d’une double liaison conjuguée confère aux chalcones une couleur jaune. En

conséquence, les dihydrochalcones sont généralement incolores. La configuration de la

double liaison est généralement E dans les chalcones naturelles [Harborne, 1993]. Ces

composés sont rarement substitués sur le cycle B.

De manière équivalente aux autres flavonoïdes, les positions 2’, 4’ et 6’ du cycle A peuvent

être hydroxylées ou méthoxylées. Des dérivés glycosylés existent mais essentiellement O-

glycosylés (une seul chalcone C-glycosylée : 3’-glucosylisoliquiritigénine isolée de Cladrastis

platycarpa (Fabaceae) [Ohashi H., 1977]). Il existe de nombreux composés C-alkylés avec

(a) (b)


26

des substituants méthyles, prényles ou géranyles (Fig. 21) [Harborne, 1993]. Les flavonoïdes

C-alkylés sont présents au niveau de la cuticule foliaire et cela concerne surtout les plantes

des régions arides ou semi-arides, souvent pourvues de structures sécrétrices comme les

Piperaceae [Bruneton, 1999].

OOH

O O

O

HO

O

OHOH

O

OH

HOHO

OH

O

O

O

OHOH

O

OH

HOHO

OH

OOH

OHO

OH

Fig. 21 : Exemples de structures de chalcones et dihydrochalcones

glycosylées ou alkylées .

Activités biologiques des chalcones et dihydrochalcones

Les chalcones et les dihydrochalcones ont été étudiées pour leurs propriétés anticancéreuses

[Anto et al., 1995; Go et al., 2005], antiinflammatoires [Go et al., 2005; Nowakowska, 2006],

antioxydantes [Anto et al., 1995], antimicrobiennes [Nowakowska, 2006] et antiparasitaires

[Nowakowska, 2006].

Parmi les chalcones naturelles antipaludiques, la licochalcone A est la plus célèbre. Isolée de

la réglisse (Glycyrrhiza glabra), elle est particulièrement active in vitro avec une CI50 de 0.5

µg/ml sur les deux souches chloroquino-sensible (3D7) et résistante (Dd2) de P. falciparum

[Chen et al., 1994]. De plus, une étude in vivo sur des souris infectées par P. yoeii montre que

100% d’inhibition de parasitémie est obtenue après 3 à 6 jours de traitement [Kharazmi,

1997]. En ce qui concerne les dihydrochalcones, la plus connue est la Phloridzine (Fig. 22)

qui est une dihydrochalcone glycosylée isolée de Micromelum tephrocarpum (Rutaceae),

utilisée en médecine traditionnelle dans le traitement du paludisme. D’après Kutner et al.

[1987] qui se sont intétéssés à son mode d’action, le composé agirait au niveau de la

membrane cytoplasmique des globules rouges [Kutner et al., 1987].


27

Fig. 22 : La licochalcone A et la phloridzine.

B. I. 3 Les flavanones

Définition

Ces molécules sont caractérisées par l’absence de double liaison en 2, 3 et par la présence

d’un centre d’asymétrie en 2. Chez les flavanones naturelles, le carbone 2 est normalement de

configuration S. Elles existent sous forme libre ou sous formes glycosylées. Sous forme libre,

les carbones en position 5 et 7 sur le cycle A peuvent être hydroxylées ou méthoxylées. Le

cycle B peut aussi être substitué en position 3’, 4’, 5’ et 6’. Les dérivés C-alkylés sont

relativement courants, surtout les dérivés C-prénylés ou C-géranylés (Fig. 23). Les dérivés C-

méthylés sont fréquemment rencontrés chez les Myrtaceae [Wollenweber et al., 2000]. Ce

type de composé a déjà été isolé des racines de P. hostmannianum [Diaz et al., 1987] (Fig.

15).

O

O

HO

OH4 R=OH 5 R=OCH3

R

OH

O

OOH

O

Fig. 23 : Exemples de flavanones C-alkylées.

Activités biologiques des flavanones

Les flavanones étant plus répandues dans le règne végétal que les chalcones et

dihydrochalcones, leurs activités biologiques ont particulièrement été étudiées. Ainsi on leur

attribue des propriétés antioxydantes [Stevens et al., 2003], antimicrobiennes, anticancéreuses

[Kofujita et al., 2004] et antipaludiques avec un intérêt particulier pour les dérivés C-alkylés.


28

Parmi les flavanones naturelles antiplasmodiales les plus actives, Kim et al. [2004] ont isolé

des flavanones prénylées relativement actives des feuilles d’Artemisia indica avec des CI50

comprises entre 4 et 7 µM sur la souche K1 chloroquino-résistante de P. falciparum (Fig. 24).

O

O

OH

HO

OR1

R2O

1 : R1=R2=CH32 : R1=R2=H3: R1=H, R2= CH34: R1=CH3, R2=H

O

O

RO

OH

HO

5 : R=CH36 : R=H

OH

Fig. 24 : Flavanones prénylées isolées des feuilles d’Artemisia indica.


29

B. II Application de la spectrométrie de masse à l’étude de la fragmentation

des flavonoïdes minoritaires

La spectrométrie de masse reste la technique privilégiée pour la détermination de la masse des

molécules. Différentes techniques d’ionisation existent dont les plus récentes sont les

techniques d’ionisation douces que sont l’électrospray (ESI : electrospray ionization) et

l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI : atmospheric pressure chemical

ionization). Les flavonoïdes ont été largement étudiés en spectrométrie de masse en particulier

les dérivés glycosylés [Hvattum et Ekeberg, 2003; Stobiecki, 2000]. Ces études ont permis

d’établir des schémas de fragmentation de ces composés dans le but de pouvoir les identifier

dans un extrait brut sans avoir à les isoler [Lee et al., 2005; Ye et al., 2005; Zhou et al., 2006].

Ainsi, l’introduction de la LC/MSn dans l’analyse des extraits de plante représente une étape

importante dans l’identification des produits naturels [Justesen et al., 1998; Lee et al., 2005;

Wolfender et al., 2000]. C’est la technique de choix pour caractériser rapidement sans

séparation chimique les éléments d’un mélange de composés naturels pour savoir s’ils sont

connus ou non.

Cette partie sera consacrée à la synthèse bibliographique des principales études en

spectrométrie de masse des chalcones, dihydrochalcones et flavanones en EI (ionisation

électronique), ESI et APCI. Cette synthèse nous permettra de comprendre précisément les

fragmentations de ces composés dans le but d’étudier et d’identifier par LC/MSn des

molécules de même génine dans l’extrait acétate d’éthyle de P. hostmannianum var.

berbicense (ce travail vous sera présenté dans la partie résultats de ce manuscrit).

B. II. 1 Travaux réalisés en ionisation électronique (EI)

Le premier spectre de masse de chalcones a été enregistré par Beynon en 1960 [Beynon,

1960]. En 1966, Audier [1966] montre pour la première fois que les 2’-hydroxychalcones

présentent une fragmentation spécifique dont le spectre de masse est identique à celui des

flavanones isomères. Cette isomérisation entre la forme 2’-hydroxychalcone et flavanone

(Fig. 25) a lieu dans la chambre d’ionisation du spectromètre sous l’effet de la température


30

[Itagaki et al., 1966; Van De Sande et al., 1972]. Cet équilibre existe aussi en solution en

milieu acide ou basique [Arcus et al., 1992; Old et Main, 1982].

O

OH

O

O

H

O

O

2'-hydroxychalcone flavanone

H

H

Fig. 25: Mécanisme possible d’isomérisation entre

2’hydroxychalcone ↔ flavanone dans la source d’ionisation du spectromètre

[Van De Sande et al., 1972].

Van De Sande et al. [1972] ont comparé pour la première fois la fragmentation des chalcones

et des flavanones. Dans le cas de la génine chalcone, les ions fragments majoritaires sont les

ions m/z 130, m/z 104 et m/z 78 qui proviennent respectivement du clivage entre le cycle A et

la fonction carbonyle, la fonction carbonyle et le carbone α, et entre le carbone β et le cycle B

comme illustré sur la Fig. 26. Ainsi, différents fragments sont obtenus suivant s’il y a perte du

cycle A ou du cycle B (remarque : un fragment de type A correspond à « la perte » du cycle

B).

Pour l’ion m/z 130, Van De Sande et al. [1972] ont ainsi proposé une structure cyclique (Fig.

26) provenant d’un réarrangement avec un proton en position ortho sur le cycle A, les auteurs

parlent d’« ortho effect ».


31

O

A

B

α

βH

O

A

m/z 130

B

m/z 104

A

m/z 78

Fig. 26 : Schéma de fragmentation du squelette chalcone par EI proposé par

Van de Sande et al. [1972].

En présence de substituants sur les cycles (Fig. 27), des ions fragments additionnels sont

obtenus, par exemple dans le cas d’une substitution par un groupement méthyle ou un

groupement méthoxyle :

O

A

B

α

βCH2

H

C

O

m/z 118

- CO C7H6

m/z 90

2'-methylchalcone

O

A

B

α

βO O

C

O

m/z 130

- CO

m/z 92

2'-methoxychalcone

C

O

- CO

C5H4

m/z 118

- C2H2 C9H8 C7H7

+

m/z 92 m/z 91

m/z 64

Fig. 27 : Schémas de fragmentation pour les 2’-méthylchalcone et les 2’-méthoxychalcone

proposés par EI par Van de Sande et al. [1972].


32

La Fig. 28 représente les fragmentations caractéristiques du squelette flavanone. La 2’-

hydroxychalcone correspondante (représentée Fig. 25) présente les mêmes ions fragments.

O

O

A

B

O

O

A

m/z 145

O

C

O

m/z 130

- CO

m/z 92

C

O

- CO

C5H4m/z 64

B

m/z 104

m/z 78

C4H4 +

m/z 52

-C2H2

-C2H2

Fig. 28 : Schéma de fragmentation du squelette flavanone par EI proposé par

Van de Sande et al. [1972].

Les schémas de fragmentation des chalcones établis jusqu’à présent ont tendance à se

contredire en ce qui concerne la structure des ions fragments. Ainsi, Ardanaz et al. [1991]

s’intéressent plus particulièrement à l’ion m/z 130 (issu du squelette chalcone) dont deux

structures ont été proposées jusqu’à présent. Une structure cyclique proposée par Van de

Sande et al. [1972] et une structure linéaire proposée par Rouvier [1976] (Fig. 29).

O

A

B

O

AO+

B

m/z 130 m/z 130

Fig. 29 : Deux mécanismes de formation de l’ion m/z 130.


33

En utilisant des dérivés deutérés et des chalcones substituées par des méthyles et des

halogènes, ils montrent que les deux hypothèses sont fausses et ils établissent alors la

structure de l’ion fragment m/z 130 présenté Fig. 30. L’ion ainsi formé provient de la perte du

radical phényl B et d’un radical Hβ•.

O

A

B

O

A

+

m/z 130

Fig. 30 : Structure de l’ion m/z 130 proposé par Ardanaz et al. [1991].

Jusqu’à présent les différents auteurs considèrent que l’identité virtuelle des spectres de masse

des 2’-hydroxychalcones et des flavanones isomères serait due à l’existence d’une espèce

intermédiaire instable de structure incertaine (voir Fig. 31). Ainsi, Guidugli et al. [1992]

étudient plus particulièrement la structure de l’ion moléculaire [M-H]+.Dans ce but, ils

s’intéressent aux ions minoritaires m/z 181 et m/z 152 obtenus pour le squelette flavanone et le

squelette 2’-hydroxychalcone et ils établissent des schémas de fragmentation basés sur des

expériences de marquage au deutérium (Fig. 31).

O

O

A

B

-HO+

O

-C2H2OO+

m/z 181

m/z 152

m/z 223m/z 224

Fig. 31 : Schéma de fragmentation proposé par Guidigli et al. [ 1992] pour l’obtention des

ions fragments m/z 181 et m/z 152 par EI.


34

Ardanaz et al. [1998] s’associent par la suite et étudient attentivement la fragmentation de la

génine chalcone en utilisant les techniques de MS2 et de marquage au deutérium et au carbone

13 en se focalisant sur la formation et la structure des ions m/z 192 et m/z 193 [Ardanaz et al.,

1998] provenant d’une perte respective de 15 uma (perte du radical CH3•) et de 16 uma (perte

de méthane) par rapport à l’ion moléculaire du squelette chalcone. Pour expliquer ces pertes

inattendues, il proposent les schémas de fragmentation suivant (Fig. 32 et 33).

O

A

B

O Om/z 208 m/z 208

Fig. 32 : Réaction de contraction de cycle de l’ion moléculaire du squelette chalcone par EI

selon Ardanaz et al. [1998].

Ainsi, il proposent un réarrangement de l’ion moléculaire suivant une réaction de contraction

de cycle pour aboutir à un ion moléculaire de structure tricyclique (m/z 208) avec un méthyle

en position α de la fonction carbonyle. A partir de cette structure, ils déduisent aisément la

formation de l’ion fragment m/z 193 en affirmant que celui-ci proviendrait de la perte d’un

radical méthyle (Fig. 33).

Dans le cas de la formation de l’ion m/z 192, le schéma de fragmentation reste très incertain

car il y a perte successive de deux radicaux.

Om/z 208O

O

-CH3 -H

O

-CH3

. . .

m/z 192 m/z 207 m/z 193

Fig. 33 : Schéma de formation des ions m/z 192 et m/z 193 par EI

selon Ardanaz et al. [1998].


35

L’étude en spectrométrie de masse des flavonoïdes prénylés a fait l’objet d’une revue en 1992

par Takayama et al. [1992]. Ils étudient les schémas de fragmentation dus à la dégradation des

groupements prénylés par EI et FAB/MS. Les spectres obtenus par EI présentent des

fragments caractéristiques dûs à la position du groupement prényle sur les cycles. En effet

pour les flavanones 6 ou 8 prenylées, nous retrouvons généralement les fragments [M-15]+,

[M-43]+et [M-55] + dont les schémas d’obtention sont présentés dans la Fig. 34. Dans le cas

des flavanones et des chalcones isomères, ils obtiennent des spectres similaires dus à

l’isomérisation thermique des flavanones en 2’hydroxychalcones.

O

O

m/z 356

OH

HOO

Om/z 341

R

O

HO

[M-15]+

OH

OH

R

O

Om/z 301

R

OH+

HO

[M-55]+

O

Om/z 337

R

OH+

HO

[M-43]+

RDA

OHO

OH+

O

m/z 165

Fig. 34 : Schémas de fragmentation d’une flavanone prénylée en position 6

(RDA : rétro Diels-Alder).

En 2002, Nowakowska [2002] s’intéresse à la fragmentation des bromoalkoxychalcones et

des morpholinoalkoxychalcones par EI et masse haute résolution. L’ensemble des dérivés de

chaque groupe présentent des fragmentations similaires. Les ions fragments issus de l’étude

des dérivés bromoalkoxychalcones sont présentés Fig. 35.

Suivant la coupure de la chaîne alkyle, il est facile d’identifier la chalcone correspondante.

Nous retrouvons la coupure en α de la double liaison et nous pouvons voir qu’un simple

clivage Csp3-O est à l’origine de la perte du radical (CH2)n-Br.


36

O

CH

CH

OH2C Brn

O

CH

CH

O+

H2C Brn

++

[M-77]+

+O

m/z 105

-CO

m/z 77

O

CH

CH

m/ z 207

m/z 223

Fig. 35 : Schéma de fragmentation des alkoxyhalogénochalcones.

La dernière publication qui traite de l’étude de la fragmentation par EI date de 2004

[Nowakowska, 2004]. Les auteurs s’intéressent à la fragmentation des chalcones substituées

sur le cycle B par des groupements hydroxyles, thiols ou carbamates. La Fig. 36 présente les

différents ions fragments obtenus quelque soit le substituant. Les clivages préférentiels ont

lieu en position α de la double liaison et au niveau de la liaison reliant le substituant au cycle

B.

O

A B R

m/z 77

-C2H2

C4H3+ m/z 51

O+

m/z 105

-CO Om/z 207

-CO

m/z 179

m/z 102

Fig. 36 : Schémas de fragmentation de chalcones substitués sur le cycle B

Nowakowska et al. [2004].


37

B. II. 2 Ionisation par electrospray et ionisation chimique à pression atmosphérique (ESI

et APCI)

Ionisation par electrospray (ESI)

Deux publications récentes traitent de l’analyse par ESI de flavanones et de dihydrochalcones

glycosylées [Hvattum et Ekeberg, 2003; Zhou et al., 2006]. Zhou et al. [2006] utilisent la

LC/MS pour détecter des flavonoïdes glycosylés dans un extrait par ESI en modes positif et

négatif. Les fragmentations des flavonoïdes glycosylées les plus rencontrés respectent le

schéma présenté Fig. 37. La nomenclature a été établi Ma et al. [1997].

O

O

OH

OO

OO

OH

OH

OHOHOH

OH

OH

0 1

2

34

1,3 B0

1,3 A0

Z0

Y0

B2

O,2 X0

0,2 A2

Z1Y1

B1

0,2 A1

0,2 X1

A

B

Fig. 37 : Nomenclature des ions obtenus après fragmentation en mode positif de flavanones O-diglycosylées.

Dans le spectre de masse enregistré en ESI en mode positif de l’hespéridine (voir structure

Fig. 37, l’ion m/z 303 correspond à la génine [Y0+H]+.

Composé R1 R2 R3 Masse

Naringine Néohespéridose H OH 580

Hespéridine Rutinose OH OCH3 610

Neohespéridine Néohespéridose OH OCH3 610

Isonaringine Rutinose H OH 580

O

O

R2

R3

O

R1

A

B

C

Fig. 38 : Molécules étudiées par Zhou et al. [2006].


38

Fig. 39 : Schéma de fragmentation en mode positif par ESI de l’hespéridine.

L’expérience MS2 sur ce fragment a permis d’observer les ions suivants : m/z 177, m/z 153,

m/z 285 et m/z 179 dont les schémas d’obtention sont représentés Fig. 39. Les ions

majoritaires sont les ions présents à m/z 177 et m/z 179 qui correspondent respectivement à

une réaction de rétro Diels-Alder et une perte du cycle B. Cette dernière fragmentation a

l’avantage de pouvoir déterminer le type de substituants sur le cycle A. Dans le cas de la

naringine, le même type de spectre de masse est obtenu en mode positif.

En mode négatif, les auteurs obtiennent des différences de fragmentation entre le couple

hespéridine/neohespéridine et naringine/isonaringine qui sont des couples d’isomères qui

diffèrent seulement par la liaison intersucre (Fig. 38). En effet, dans le cas de l’hespéridine,

lorsqu’ils réalisent la MS2 sur l’ion [M-H]+ ils obtiennent seulement l’ion m/z 301

correspondant à la génine, alors que dans le cas de la néohespéridine, des ions

supplémentaires sont obtenus.


39

Ainsi, le mode négatif a l’avantage d’aboutir à des fragmentations caractéristiques facilitant

leur identification par LC/MS dans un extrait.

Hvattum et Ekeberg [2003] s’intéressent à la fragmentation des flavonoïdes glycosylés

(quelque soit le noyau aglycone) et plus particulièrement au clivage homolytique des liaisons

O-sucres qui génèrent des radicaux aglycones stables en mode négatif. Ils constatent que dans

le cas particulier des flavanones et des dihydrochalcones glycosylées (Fig. 40), aucun ion

résultant de la fragmentation du radical aglycone n’est obtenu après avoir réalisé une

expérience MS2 sur l’ion [M-H]+. Les auteurs concluent que la présence d’une double liaison

entre les carbones 2 et 3 est nécessaire. Cette observation a l’avantage de pouvoir alors

déduire une génine dihydrochalcone ou flavanone dans le cas de l’identification de

flavonoïdes glycosylés inconnus présentant ce type de spectre dans un extrait par LC/MS.

OH

O

OH

HO

OO

HO

HO

OH

OH

O

O

O

O

OH

OH

O

O

O

OH

HO

HO

HO

HO

OH

Fig. 40: Phloridzine et hespéridine.

Fabre et al. [2001] ont étudié précisément la fragmentation des noyaux aglycones des

flavonoïdes de type flavone, flavonol et flavanone par ESI en mode négatif.

De façon générale, les fragments obtenus suivent le schéma de fragmentation présenté Fig.

41. La nomenclature adoptée est celle de Ma et al [1997]. Les notations i,jA- et i,jB- sont

utilisées pour désigner les ions produits contenant les cycles, respectivement A et B et les

notations i,j concernent les liaisons qui ont été scindées.


40

O

O

OH

HO

OH

A

B

0 1

2

34

1,4 B-

1,2 B-

1,3 B-

0,4 B-

1,4 A-

1,3 A-

Fig. 41 : Nomenclature simplifiée pour désigner les fragments flavonoïdes en mode négatif .

En ce qui concerne les flavanones commerciales étudiées par Fabre et al. [2001], en plus des

fragmentations présentées Fig 41, des pertes de neutre sont observées : perte de CO, CO2 mais

aussi des perte de CH3 dans le cas d’une flavanone méthoxylée. L’étude du spectre de masse

de la génine flavanone permet de confirmer une perte facilitée de CO correspondant à une

réaction de contraction du cycle C.

En ce qui concerne les chalcones, Zhang et Brodbelt [2003] ont étudié par ESI leur

fragmentation en comparant trois modes d’ionisation : protonation, déprotonation et

complexation avec un métal (nickel, cuivre ou cobalt). Le mode positif (protonation) ne

convient pas dans le cas des chalcones, aucun adduit n’est visible (adduits protonés, sodés ou

potassés). En mode négatif, les auteurs ont réalisé des fragmentations sur des chalcones avec

des substituants hydroxyles et méthoxyles (mono- ou poly-) sur les deux cycles. Il obtiennent

de façon générale deux types de fragmentation suivant que le noyau A ou B est « perdu »

comme pour l’étude de la fragmentation en impact électronique (Fig. 26).

Sur l’ensemble des fragmentations obtenues, des fragmentations générales peuvent être

déduites (Fig. 42). Nous retrouvons les clivages déjà établis par impact électronique mais

avec des fragments supplémentaires.


41

O

A BFragments de type A (cycle B perdu) Fragments de type B (cycle A perdu)

-H

O

-H

-H

O

-H

-H

-H

O

-H

(avec des substituants OH obligatoirement)

CH2Pas de fragments

m/z 77m/z 129

m/z 77 m/z 129

m/z 103

m/z 91

Fig. 42 : Schémas généraux de fragmentation du squelette chalcone par ESI en mode

négatif selon Zhang et Brodbelt [2003].

Ces fragmentations sont proposées suite à des expériences de MSn qui conduisent à des pertes

de neutres : CO, CO2, CH≡CH, H2O. Ces pertes confirment s’il s’agit d’un fragment de type

A ou B. Les pertes de CO et CO2 sont communément observées et sont très présentes pour les

chalcones avec des substituants hydroxyles.

Pour les chalcones substituées sur le cycle B en méta ou para par des hydroxyles, les auteurs

observent des pertes de C2H2O (- 42 uma). Pour les chalcones avec des substituants

hydroxyles ou méthoxyles, les pertes de radical méthyle et de méthane sont fréquentes. Ces

pertes avaient déjà été observées en EI par Ardanaz et al. [1998]. Ils ont également comparé

la fragmentation des 2’-hydroxychalcones et des flavanones isomères. Les mêmes ions sont

observés mais l’abondance des fragments est différente. Enfin, le mode par complexation

s’avère être une alternative pour caractériser les chalcones isomères.


42

Ionisation chimique à pression atmostphérique (APCI)

En ce qui concerne les flavanones, la méthode d’ionisation par APCI a été largement utilisée

notamment en ce qui concerne les dérivés glycosylés [Stobiecki, 2000; Wolfender et al.,

2000] et l’analyse d’extrait de plantes [Justesen, 2001; Justesen et al., 1998].

Justesen et al. [2000] ont étudié la composition en flavonoïdes d’extraits d’herbes

aromatiques par LC/MS en APCI en mode négatif. Parmi les témoins utilisés, deux sont

communs avec ceux utilisés par Fabre et al. [2001]. Il s’agit de l’ériodictyol et de la

naringénine. En comparant les spectres de masse selon les deux méthodes d’ionisation, les

spectres sont identiques.

Dans une revue sur l’application de la LC/MS en phytochimie, Wolfender et al. [2000]

rapportent les spectres de masse de différentes génines de flavonoïdes dont les flavanones. En

mode positif, les ions fragments majoritairement obtenus sont présentés Fig. 43.

O

O

OH

HO

OH

A

B

0 1

2

34

1,3 B+

1,4 B+-2H

1,3 A+

1,4 B+-2H-CO-CO

Fig. 43 : Principaux ions fragments obtenus en APCI en mode positif pour les

flavanones selon Wolfender et al. [2000].

L’étude de la fragmentation des chalcones en APCI en mode positif a fait l’objet d’une

publication récente en 2006 par Tai et al. [2006]. De nombreuses chalcones substituées par

des hydroxyles, méthoxyles, nitros et des halogènes ont été étudiées. Les auteurs ont constaté

que les différents composés obéissent aux mêmes règles de fragmentation (Fig. 44) excepté

pour les dérivés nitro où aucune perte de CO n’est observée.


43

O

A B R2R1AR1

O+

AR1

-CO

AR1O

O+

B R2

-CO

B R2

+ H

Fig. 44 : Schéma de fragmentation général des chalcones substituées en APCI en mode positif

selon Tai et al. [2006].

Le mécanisme de fragmentation proposé pour expliquer la perte de CO est présenté Fig. 45.

Comme le montre cette figure, la molécule de CO peut être éliminée suite à un réarrangement

du squelette avec formation d’une nouvelle liaison carbone-carbone pour donner l’ion d.

OH+

A B R2R1

H OH

A B R2R1

H

O

-CO

R1 R2B R2

AR1

AR1

BR2

a b

c

d

Fig. 45 : Schéma de fragmentation expliquant la perte de CO en APCI en mode positif selon

Tai et al. [2006].

Parmi les autres pertes de neutre, l’élimination d’H2O est obtenue pour tous les composés. Le

schéma de fragmentation proposé (Fig. 46) fait intervenir une réaction de formation de cycle à

sept carbones.


44

OH+

A B R2R1

H

R1

+HO

R2

R2R1

HOH

R2

R1

-C2H2R1

R2

-H2O

Fig. 46 : Schéma de fragmentation expliquant la perte d’H2O en APCI en mode positif selon

Tai et al. [2006].

Ainsi, d’après Tail et al [2006], l’élimination d’H2O impliquerait la fonction cétone et un

hydrogène du cycle B.

Après ces deux premières parties consacrées à la description de la plante, aux flavonoïdes et à

la spectrométrie de masse, cette troisième et dernière partie présente quelques généralités sur

le paludisme.


45

C. Généralités sur le paludisme

Endémie parasitaire majeure, le paludisme ou malaria est une érythrocytopathie due à un

hématozoaire du genre Plasmodium, transmis par la piqûre d’un moustique, une anophèle

femelle.

C. I. Epidémiologie

Des chiffres alarmants

Selon les estimations de l'Organisation Mondiale de la Santé [WHO, 2005], cette maladie

parasitaire tue un enfant toutes les trente secondes en Afrique et est responsable d’un à trois

millions de décès par an dans le monde. Le nombre de personnes contaminées est estimé

entre 300 et 600 millions, dont la grande majorité se trouve en Afrique (90% des cas)

[Rinaldi, 2004].

Répartition géographique

Cette parasitose pose aujourd’hui un problème de santé publique pour plus de 100 pays,

représentant un total de plus de 2,4 milliards de personnes, soit environ 40% de la population

mondiale [WHO, 2005]. Ces pays sont essentiellement des pays en développement situés en

Afrique, Asie et Amérique latine (Fig. 47).

Fig. 47 : Répartition mondiale des cas de paludisme dans le monde selon l’OMS

[WHO, 2005].


46

L'Afrique est le continent le plus touché par le paludisme. Le danger est quasi nul en Afrique

du Nord, mais majeur en Afrique de l'Est, en Afrique subsaharienne et en Afrique équatoriale.

En Asie, le paludisme est absent des grandes villes et plutôt rare dans les plaines côtières. Le

danger est majeur dans les zones rurales du Cambodge, de l'Indonésie, du Laos, de la

Malaisie, des Philippines, de la Thaïlande, du Vietnam et en Chine dans le Yunnan ainsi qu’ à

Hainan. Dans les Antilles, le paludisme sévit à Haïti et près de la frontière de la République

Dominicaine. En Amérique centrale, il existe quelques micro-zones, mais le risque est

relativement faible. En Amérique du Sud, le risque est faible dans les grandes villes, mais réel

dans les zones rurales en Bolivie, en Colombie, en Équateur, au Pérou et au Venezuela, et

majeur dans toute la zone amazonienne.

Outre ces zones à risques, le paludisme peut se propager de différentes manières :

� Le paludisme d’importation ou des voyageurs : déclaration au CNRMI (Centre

National de Références pour les Maladies d’Importation) ; 3000 à 5000 cas annuels en

France dont 90% en provenance d’Afrique.

� Le paludisme des aéroports : la transmission par des anophèles voyageuses peut se

faire lors d’étés chauds autour des grands aéroports internationaux (cas de Roissy en

1994, 7 cas)

� Le paludisme autochtone : c’est la transmission en France chez un sujet n’ayant pas

voyagé en pays d’endémie depuis un an. Cependant, les départements d’Outre-Mer

font partie de la France (la Guyane faisant partie des zones d’endémie palustre, tous

les cas sont donc considérés comme autochtones).

C. II. Le parasite et le vecteur

C. II. 1 Les parasites du genre Plasmodium

Classification

Selon la dernière classification de Levine [1988] amendée par Cox [1991], le genre

Plasmodium appartient à l’embranchement des Apicomplexa (Sporozoaires), à la classe des

Haemosporida, à l’ordre des Haemosporida et à la famille des Plasmodiidae.


47

Les Plasmodium sont des parasites des hématies ils sont parfois nommés hématozoaires (Fig.

48).

Fig. 48 : Globules rouges infectés par P. falciparum (coloration au Giemsa).

Quatre espèces sont responsables de la maladie chez l’Homme [Mendis et al., 2001].

� P. falciparum Welch

Essentiellement rencontré en Afrique tropicale, en Amérique centrale et du Sud et en Asie du

Sud Est, il s’agit de l’espèce la plus pathogène car responsable de cas mortels. De plus, P.

falciparum développe aujourd’hui une résistance contre la chloroquine dans de nombreux

pays, posant ainsi le problème de la prévention médicamenteuse de la maladie.

� P. vivax Grassi et Feletti

C’est la deuxième espèce rencontrée en Afrique et surtout en Asie, en Amérique latine et, à un

moindre degré, en Afrique de l’Est. Environ 10 à 20% des cas d’infection par P. vivax dans le

monde se produisent en Afrique, au sud du Sahara. En Afrique australe et orientale, P. vivax

représente autour de 10% de cas de malaria mais dans moins de 1% de cas en Afrique centrale

occidentale [Mendis et al., 2001].

� P. malariae Grassi et Feletti

Cette espèce a une distribution mondiale très inégale. Elle n'est pas meurtrière mais peut

entraîner des rechutes jusqu'à 20 ans après la primo-infection.

� P. ovale Stephens

Principalement rencontrée en Afrique de l'ouest, cette espèce ne tue pas mais peut entraîner

des rechutes 4 à 5 ans après la primo-infection. Elle infecte préférentiellement les globules

rouges non matures, ce qui limite la parasitémie.


48

Cycle de reproduction (Fig. 49)

Le cycle de reproduction des Plasmodium est complexe et comporte deux étapes essentielles :

une phase asexuée qui se déroule chez l’Homme et une phase sexuée qui débute chez

l’Homme et qui se termine chez le moustique (Anopheles).

Fig. 49 : Cycle de reproduction des Plasmodium.

(http://membres.lycos.fr/lfinot/images/Affiche.jpg)

� Phase asexuée chez l’Homme [Mouchet, 2004]

Le cycle du Plasmodium chez l’Homme débute par l’inoculation, lors de la piqûre du

moustique, du parasite sous forme de sporozoïte qui en une heure via la circulation sanguine,

passe dans le foie. Après une phase de division dans les hépatocytes, il produit des schizontes

hépatiques : c’est la phase pré-erythrocytaire (avant l’invasion du globule rouge) ou exo-

erythrocytaire (hors globule rouge). Arrivé à maturité, après huit à dix jours, le schizonte

éclate, libérant plusieurs milliers de mérozoïtes (40 000 pour P. falciparum).


49

Ces mérozoïtes pénètrent dans les hématies où ils se transforment en trophozoïtes puis en

schizontes érythrocytaires dont chacun comporte seize ou trente-deux noyaux fils. Chaque

noyau donne un mérozoïte lorque le globule rouge éclate. Ce mérozoïte va ensuite parasiter

une hématie saine et le cycle schizogonique recommence. C’est la phase érythrocytaire du

cycle.

Spécificités de P. falciparum : Dans le cas de P. falciparum, seul le début du cycle se déroule

dans le sang périphérique : la phase de division du schizonte érythrocytaire se produit dans les

organes profonds. Le développement de tous les parasites est synchrone chez un même sujet

et ce cycle érythrocytaire dure 48 heures, d’où le nom de fièvre tierce maligne qui lui était

donné bien avant que ne fut découvert le parasite. L’éclatement des globules rouges

correspond à l’épisode fébrile qui caractérise le paroxysme de l’accès. Après plusieurs cycles

asexués de P. falciparum, le malade, s’il a survécu, guérit spontanément.

Après neuf à onze jours, apparaissent dans le sang des formes sexuées non pathogènes, les

gamétocytes mâles et femelles. Ces gamétocytes n’évoluent pas chez l’Homme et ne peuvent

poursuivre leur évolution que lorsqu’ils sont ingérés par des Anopheles, assurant ainsi la

pérennisation de l’espèce.

� Phase sexuée chez l’anophèle [Mouchet, 2004]

Lors de son repas sanguin, l’anophèle avale des gamétocytes mâles et femelles. Dans son

estomac, ils se transforment en gamètes. Leur fécondation engendre un œuf (ookinète) qui se

différencie en sporozoïtes dans les glandes salivaires du moustique. Lorsque le moustique ira

piquer une personne pour prendre un repas de sang, les sporozoïtes seront introduits dans cette

personne via la salive. Un nouveau cycle peut alors commencer.


50

C. II. 2 Le vecteur : un moustique femelle du genre Anopheles

Classification

Le vecteur (Fig. 50) est un moustique (ordre des diptères) appartenant au genre Anopheles, de

la famille des Culicidae, sous famille des Anophelinae. Plus de 450 espèces d'Anopheles ont

été à ce jour décrites mais seulement une soixantaine sont des espèces vectrices responsables

de la transmission du parasite à l'Homme (source : http://www.pasteur.fr).

Fig. 50 : Un moustique vecteur du paludisme (Anopheles freeborni) prenant son repas de sang

(http://www.pasteur.fr).

Les principales espèces

Les principaux vecteurs du paludisme en Afrique sont: Anopheles gambiae, A. arabiensis

(indifférenciable morphologiquement du précédent), A. funestus, A. nili et A. moucheti. En

Amérique, quatres espèces sont particulièrement impliquées : A. darlingi, A. albimanus, A.

pseudopunctipennis et A. quadrimaculatus. Enfin en Asie, nous pouvons citer A. stephensi (un

moustique "urbain"), A. farauti, A. sinensis, A. tellessarus et A.minimus.

La nécessité d’un repas sanguin

Pour chaque production d'œufs (100 ou plus), c'est à dire tous les 2 ou 3 jours, la femelle doit

prendre un repas de sang : elle peut se nourrir, comme le fait le mâle, de nectar ou du jus des

fruits, mais le sang est indispensable pour la production des œufs. La ponte a lieu 3 jours

après le repas. En période de température élevée, le potentiel reproductif de la femelle

anophèle est considérable : ceci constitue un des facteurs majeurs à l'origine du "succès" du

parasite du paludisme. La femelle anophèle doit cependant avoir survécu 4 à 5 cycles de

production d'œufs avant de pouvoir devenir infectante. Sa durée de vie (variable selon les

conditions, notamment climatiques) est d'environ un mois.

Les moustiques mâles ne piquent pas et ne transmettent donc jamais le paludisme.


51

C. III. Les manifestations cliniques

Phase d’incubation

L’incubation dure en principe une à deux semaines, période nécessaire à la formation des

schizontes intra-erythrocytaires. Elle peut être beaucoup plus longue et les symptomes

n’apparaissent que plusieurs semaines voire plusieurs mois plus tard.

Phase d’invasion

Les premières manifestations cliniques du paludisme d’invasion sont souvent très banales et

réalisent un état infectieux fébrile de type grippal ou typhoïdique. Elle s’accompagne de

myalgies, céphalées parfois vomissements et diarrhées. A ce stade, la maladie risque fort

d’être méconnue si on n’y pense pas spécialement.

Phase d’état

Elle correspond aux schizogonies érythrocytaires. Au bout de quelques jours, le malade

semble guérir mais apparaissent alors de grands accès fébriles intermittents caractéristiques,

en principe rythmé par l’éclatement des schizontes mûrs et le déversement du pigment

palustre dans le sang. L’accès palustre dure quelques heures et se déroule en trois phases très

suggestives avec la séquence « frissons-chaleur-sueur », d’abord de grands frissons avec froid

intense généralisé ensuite un pic thermique à 40-41°C de deux à trois heures avec faciès

congestif et peau brûlante et enfin sueurs profuses laissant le malade épuisé. Dans le cas de

l’espèce P. falciparum, on parle de fièvre tierce avec accès palustre les 1er, 3ème et 5ème jours

etc suivant un rythme de 48 heures.

A ce stade de la maladie, deux éventualités sont à distinguer : si le malade reste en terre

palustre, l’affection pourra durer fort longtemps, entretenue par des contaminations itératives

avec tous les dangers des complications viscérales du paludisme chronique ; si le malade

quitte la région impaludée, il ne court plus le risque de nouvelles infestations et la maladie

s’éteint généralement d’elle-même en quelques mois pour P. falciparum. Cependant des

rechutes sont possibles pendant les deux ans qui suivent dues aux hypnozoïtes hépatiques

(phase de dormance de schizontes hépatiques) [Houngnikpo, 2004; Mouchet, 2004].


52

C. IV. Prévention et traitement du paludisme

C. IV. 1. Prévention du paludisme

La lutte anti-vectorielle

La prévention est l’un des piliers de la stratégie mondiale contre le paludisme. En l’absence

de vaccin efficace disponible, elle repose sur la lutte contre les vecteurs et sur la

chimioprophylaxie limitée par la résistance aux médicaments.

Le principal objectif de la lutte anti-vectorielle contre le paludisme consiste à réduire

considérablement à la fois le nombre d’infections et le taux d’infection par le parasite ainsi

que les épisodes cliniques en luttant contre le moustique vecteur et en réduisant et/ou en

interrompant la transmission. Les principales interventions opérationnelles consistent en des

pulvérisations d’insecticide à effet rémanent à l’intérieur des habitations ainsi que l’utilisation

de moustiquaires à imprégnation durable. Suite à des effets irritants et toxiques, le DTT a été

remplacé par des pyréthrinoïdes.

Ces interventions essentielles peuvent être complétées localement par d’autres méthodes (lutte

larvaire ou aménagement de l’environnement, par exemple) dans le contexte de la gestion

intégrée des vecteurs. La mise en œuvre efficace et soutenue de ces interventions de lutte

antivectorielle exige une volonté politique et un engagement clair des autorités nationales

ainsi qu’un soutien à long terme des partenaires financiers [WHO, 2005].

Malgré tous les efforts mis en œuvre pour lutter contre le vecteur, celui-ci développe une

résistance aux insecticides actuels et, la mise au point de nouveaux insecticides est une

entreprise longue et coûteuse.

La chimioprophylaxie

Les médicaments utilisés en prophylaxie (prévention lors d’un voyage en pays endémique)

seront développés dans le paragraphe concernant le traitement du paludisme.


53

C. IV. 2 Le traitement du paludisme

Le traitement du paludisme dépend de plusieurs facteurs notamment de l’espèce de parasite en

cause, de la gravité de l’infection, de l’âge de la personne atteinte et du profil de résistance

aux médicaments antipaludéens suivant la région où le malade a contracté la maladie.

C. IV . 2. 1 Les principaux antipaludiques

Il existe plusieurs médicaments antipaludiques [Basco et al., 1994] et nous nous limiterons ici

aux principaux utilisés. Ces médicaments peuvent être utilisés soit en prophylaxie, soit en

thérapeutique (après le diagnostic d'une infection). Nous pouvons distinguer deux grandes

classes d’antipaludéens, les schizonticides (les plus nombreux) et les gamétocytocides.

Les schizonticides

Il existe des produits utilisés en monothérapie ou en associations médicamenteuses [Mouchet,

2004].

� Molécules utilisés en monothérapie

• Les dérivés quinoléiques

Les antipaludiques contenant un noyau quinoléine se répartissent en deux groupes : les

quinoléines de type I représentées essentiellement par les amino-4-quinoléines (chloroquine et

amodiaquine) et les quinoléines de type II représentées par les amino-alcools (quinine,

méfloquine, halofantrine) [Touze et al., 2002].

� Quinoléine de type I

Il s’agit d’amino-4-quinoléines de synthèse qui sont essentiellement la chloroquine

(Nivaquine) et l’amodiaquine (Flavoquine) (Fig. 51).


54

N

HN

OH

N

ClAmodiaquine

N

HN

Cl

N

Chloroquine

Fig. 51 : L’amodiaquine et la chloroquine.

- La chloroquine

La chloroquine, premier dérivé de synthèse de la quinine a été pendant plus de cinquante ans

le médicament idéal tant pour le traitement des accès que pour la prophylaxie. Son champ

d’utilisation ne cesse de se rétrécir avec le développement de résistances [Mouchet, 2004].

- L’amodiaquine

Elle a été rejetée de la prophylaxie en raison de rares troubles hépatiques et hématologiques.

Bien que les résistances à ce produit soient fréquentes, elles sont en général de faible niveau et

n’entraînent pas d’échec thérapeutique. Plusieurs états (Kenya, Tanzanie par exemple…)

placent ce produit en première ligne en cas de développement trop important de résistances à

la chloroquine [Mouchet, 2004].

L’utilisation de ces composés (quinine, amodiaquine) se trouve confrontée au problème

majeur de l’extension des souches de P. falciparum résistantes à ces médicaments.

� Quinoléines de type II

- La quinine (Quinimax, Quinine Lafran, Quinoforme, Surquina)

La quinine (Fig. 52) est le plus ancien des antipaludiques. Elle a été découverte en 1820 et a

constitué jusqu’aux années 1930, le seul médicament contre le paludisme. Il s’agit d’un

alcaloïde naturel extrait des écorces de Quinquina (Cinchona sp., Rubiaceae).


55

N

O

N

H

H

OH

Fig. 52 : La quinine.

Ses propriétés pharmacologiques et en particulier la possibilité de l’administrer par voie

intraveineuse en font le médicament de choix lors du traitement du paludisme grave, d’autant

qu’il existe peu de résistances à ce produit (surtout en Asie).

Cette molécule est principalement utilisée pour le traitement curatif des accès palustres

pernicieux (neuropaludisme), en traitement curatif et en prophylaxie en cas de résistance aux

autres quinoléines de synthèse (chloroquine). Cependant, les effets indésirables sont

nombreux dont les plus graves sont le cinchonisme (se traduisant par une atteinte de la 8ème

paire de nerfs craniens, bourdonnement d’oreilles), des troubles cardio-vasculaires, de la vue

mais aussi des troubles digestifs.

- Les dérivés de synthèse de type aryl-amino-alcools

Nous pouvons citer, L’halofantrine (Halfan), la méfloquine (Lariam) (Fig. 53).

Cl

Cl

CF3

HO

N

Halofantrine

N

NH

HO

CF3

CF3 Méfloquine

Fig. 53 : L’halofantrine et la méfloquine.


56

- La méfloquine

La méfloquine est active sur les quatre espèces de Plasmodium et malgré quelques résistances

très localisées en Thaïlande et au Vietnam, elle reste très utilisée en Asie contre les souches

multi-résistantes. Nous verrons par la suite qu’elle est très souvent associée avec des dérivés

de l’artémisinine [Mouchet, 2004].

La méfloquine est en général plutôt bien tolérée, les effets secondaires sont relativement

faibles (nausées, vertiges, vomissements).

- l’halofantrine

L’halofantrine était réservée, dans l’esprit de ses concepteurs, au traitement des souches

résistantes. Le produit est cher (plus de 4 euros la cure, soit 130 fois le prix de la chloroquine).

Ses effets cardiotoxiques limitent son utilisation sans contrôle. Elle se prescrit uniquement par

voie orale pour des accès simples.

• Les antifolates

Le principal représentant est le Fansidar qui est l’association d’un sulfamide antibiotique, la

sulfadoxine et d’une diaminopyrimidine antifolinique, la pyriméthamine (Fig. 54).

Fig. 54 : La sulfadoxine-pyriméthamine.

L’association des deux composés n’engendre pas de contre-indications ou d’interactions

spécifiques. Ce médicament est utilisé en cas de résistance aux 4-aminoquinoléines ou en cas

de contre-indication aux autres antipaludiques. Malheureusement, des cas de résistances sont

également apparus dans certains pays.


57

Les antifolates agissent au niveau de la voie de synthèse des folates, qui sont essentiels à la

biosynthèse des acides nucléiques du parasite. Les antifoliques inhibent la dihydroptéroate

synthétase (DHPS) qui produit l’acide folique, les antifoliniques inhibent la dihydrofolate

réductase (DHFR) qui produit l’acide folinique.

• Artémisinine et dérivés

L’artémisinine (Fig. 55) est extraite d’une armoise chinoise, Artemisia annua (Qinghaosu). Il

s’agit d’un antipaludique de la pharmacopée chinoise utilisé depuis plus de 2000 ans. C’est

une lactone sesquiterpénique présentant un pont endoperoxide. Ces principaux dérivés

d’hémisynthèse sont l’artésunate (Arsunax, Rectocap) et l’artéméther (Paluther) (Fig. 55).

O

OO

O

H

H

H

O

OO

H

H

H

H OCH3

O

OO

H

H

H

O

O

HO

Artémisinine ArtémétherArtésunate

Fig. 55 : Artémisinine et dérivés.

Ils sont efficaces, agissent très rapidement et sont très bien tolérés. En raison de leur courte

durée de vie, il est recommandé de les utiliser en association ce qui permet de réduire la durée

du traitement et la probabilité d’apparition de résistances.

� Associations médicamenteuses

La combinaison thérapeutique consiste à associer au moins deux médicaments schizonticides

dont les modes d’action sont indépendants et dont les cibles biochimiques sont différentes afin

d’améliorer leur efficacité et de retarder le développement et la résistance à chacun des

constituants [Mouchet, 2004].


58

Les associations médicamenteuses recommandées par l’OMS sont celles à base

d’artémisinine (ou dérivés), on les appelle les ACT : Artemisinin-based Combination

Therapy.

En effet, depuis 2001, l’OMS recommande aux pays où le paludisme est devenu résistant aux

traitements traditionnels, comme la chloroquine, de passer à ces associations. Quatre ACT

sont recommandés par l’OMS : artémether-lumefantrine, artésunate-méfloquine, artésunate-

amodiaquine et artésunate-sulfadoxyne/pyriméthamine (OMS, communiqués de presse).

Depuis 2001, 40 pays (dont 20 en Afrique) ont officiellement adopté ces médicaments pour

traiter le paludisme. En 2004 seulement 18 pays ont pris cette mesure. Quatorze pays ont

retenu l'association artémether-luméfantrine pour les traitements antipaludiques de première

intention. En 2001, l'OMS a passé avec Novartis Pharma AG un accord aux termes duquel

Novartis fournit à l'OMS sa spécialité à base d'artémether-luméfantrine (Coartem®) à prix

coûtant pour approvisionner les secteurs publics des pays en développement où le paludisme

est endémique.

Les combinaisons à base d’artémisinine sont les meilleurs médicaments disponibles

actuellement pour le traitement de la malaria à P. falciparum.

Les gamétocytocides

Ils détruisent les formes sexuées du parasite permettant ainsi d’interrompre la transmission de

l’infection au moustique. Les plus connus sont les 8-aminoquinoléines dont le principal

représentant est la primaquine (Fig. 56). Ce produit ne doit pas être administré aux sujets

déficients en G6PD (Glucose-6-Phosphate Deshydrogénase) car cela peut entraîner des

accidents hémolytiques. Dans certains pays, ils peuvent représenter plus de 30% de la

population.


59

N

HN

NH2

O

Primaquine

Fig. 56 : La primaquine.

La quinine et la chloroquine présentent aussi une activité gamétocytocidale sur P. malariae et

P. vivax mais pas sur P. falciparum [Vangapandu S., 2007].

Phénomènes de résistance de P. falciparum aux antipaludiques [Anglaret, 2003]

� Résistance à la chloroquine

C’est la résistance la plus répandue qui s’étend régulièrement dans le monde depuis les années

soixante. Actuellement, plus de 50% des souches isolées en France au cours d’accès palustre

d’importation sont chloroquino-résistantes.

� Résistance aux autres antipaludiques

- Fansidar (pyriméthamine-sufadoxine) : la résistance se développe actuellement en Asie et

en Afrique de l’est.

- Lariam (méfloquine) et Halfan (Halofantrine) : des cas de résistance ont commencé à

apparaître récemment, mais sont encore très rares.

- Quinimax (Quinine) : On constate des cas de diminution de la sensibilité à la quinine dans

la région où la chloro-résistance est fréquente, en particulier en Asie. Ceci a conduit à

augmenter la posologie dans les accès graves survenant chez des patients venant de ces

régions.


60

La carte (Fig. 57) présentée dans le dernier rapport de l’OMS [WHO, 2005], illustre les

différentes zones de résistance dans le monde.

Fig. 57 : Répartition géographique des cas de résistance de P. falciparum aux molécules

antipaludiques (données de 2004) [WHO, 2005].

C. IV. 2. 2 Les remèdes traditionnels : une alternative ?

L’utilisation de remèdes traditionnels implique l’usage à des fins médicales de plantes, (voir

de parties d’animaux et de minéraux ) pour soigner, diagnostiquer ou préserver la santé. En

Afrique, en Asie et en Amérique latine, différents pays font appel aux remèdes traditionnels.

En Afrique, jusqu’à 80% de la population a recours à la médecine traditionnelle. Au Ghana,

au Mali, au Nigéria et en Zambie, le traitement de première intention pour 60% des enfants

atteints de forte fièvre due au paludisme fait appel aux plantes médicinales, administrées à

domicile [OMS, 2000].

Cependant, il est nécessaire de faire une évaluation de ces plantes dans le but de veiller à leur

réelle efficacité et à leur non-toxicité. Ainsi, les plantes du genre Quassia et Simarouba

d’Amérique du Sud semblent renfermer des composés toxiques [Mouchet, 2004].

Néannmoins, les succès en clinique de la quinine et de l’artémisine, molécules naturelles

isolées respectivement de Cinchona sp. et Artemisia sp. encouragent la recherche de nouvelles

molécules antipaludiques issues de la biodiversité végétale.


61

C. V Généralités sur les cibles thérapeutiques

Le Plasmodium dispose pour son développement intraérythrocytaire d’un métabolisme et de

moyens de défense spécifiques qui constituent autant de cibles aux antipaludiques [Touze et

al., 2002]. On distingue ainsi :

� La vacuole digestive : elle est le siège de la digestion de l’hémoglobine, de la

cristallisation de l’hème et où l’on retrouve des moyens de défense contre le stress

oxydant.

� Le cytoplasme comportant deux organites essentiels :1) le système mitochondrial où

se déroulent le tranfert d’électrons et les processus enzymatiques indispensables à la

glycolyse et à la production d’énergie ; 2) l’apicoplaste qui est un reliquat d’ancien

chloroplaste.

� La membrane constituée de phospholipides et de canaux calciques. Elle est le siège

d’un trafic nutritionnel et dispose de protéines kinases intervenant dans la transduction

du signal.

Le tableau suivant résume le mode d’action et les molécules cibles des médicaments

antipaludéens [Genton B., 2007] (Fig. 58) :

Classe médicament Membre Localisation-cible Molécule-cible

Antifolates PYR, PG Cytosol DHFRSDX, DAP DHPS

Quinolines CQ, AQ, QUIN, Vacuole digestive Hème, autres?MEF, HALLUM, PRIM

Artémisinines Dihydroartémisinines Vacuole digestive Pf ATP6, Hèmeet dérivés cytosol

Naphtoquinones ATQ Mitochondire Cytochrome bc

Antibiotiques DOX, TET Apicoplate Apicoplates, ribosome PYR= pyriméthamine, PG= proguanil, SDX= sulphadoxine, DAP= dapsone, DHFR= dihydrofolate réductase,

DHPS= dihydroptéroate synthase, CQ= chloroquine, AQ= amodiaquine, QUIN= quinine, MEF= méfloquine,

HAL= halofantrine, LUM= luméfantrine, PRIM= primaquine, PfATP6= P. falciparum ATPase6, ATQ=

atovaquone, DOX=doxycycline, TET= tétracycline.

Fig. 58 : Mode d’actions et molécules cibles des médicaments antipaludéens

[Genton B., 2007].


62

Les deux principales classes d’antipaludiques représentées par les quinolines et les dérivés de

l’artémisinine agiraient au niveau de la vacuole digestive du parasite dont nous allons

développer les trois principales voies métaboliques [Touze et al., 2002].

- La digestion de l’hémoglobine

Elle est effectuée par des protéinases vacuolaires (aspartiques protéases, plasmapepsines I, II

II et IV , cystéine protéases etc..). Elles assurent le clivage de l’hémoglobine. Ce sont des

cibles thérapeutiques prometteuses.

- La cristallisation de l’hème

Les plasmodies ingèrent et dégradent l’hémoglobine pour obtenir des acides aminés

indispensables à leur survie. La ferriprotoporphyrine IX qui est un produit de cette

dégradation est un hème oxydé qui se dimérise et ces dimères se polymérisent en un pigment

inerte appelé hémozoïne. L’hème étant toxique pour le parasite, des molécules capables

d’empêcher cette polymérisation sont des molécules potentiellement antipaludiques.

- Le stress oxydant

Comme la plupart des microorganismes, les plasmodies sont capables de déclencher une

cascade de réactions oxydatives au sein des macrophages et des polynucléaires. Elles font

intervenir une peroxydase, de l’eau oxygénée et différentes enzymes. Les réactions de

peroxydations qui en découlent aboutissent à la production de radicaux libres toxiques pour le

parasite. On parle alors de stress oxydatif. La voie du stress oxydatif est utilisée en

thérapeutique en ayant recours à des composés oxydo-réducteurs pouvant catalyser la

production d’oxydants et de radicaux libres dans l’hématie parasitée.La principale source de

stress oxydant résulte de la dégradation de l’hémoglobine en acides aminés nécessaires au

développement du parasite. Cette dégradation se produit au sein de la vacuole digestive du

parasite et engendre la production d’hème libre toxique (FerIIprotoporphyrin-IX : FP)

induisant la production d’espèces radicalaires oxygénées (O2•-, OH•, H2O2), source d’un stress

oxydant. Pour se protéger, le parasite sous l’action de protéases de la vacuole, séquestre

l’hème sous une forme crystalline appelée hémozoïne ou pigment malarique.

III. Résultats et discussion

63

D. Etude phytochimique bioguidée de Piper hostmannianum var.

berbicense

D. 1 Matériel végétal

Le matériel végétal a été récolté en Guyane française et un échantillon de chaque lot récolté a

été déposé à l’herbier de l’IRD de Cayenne (les numéros d’herbiers sont énumérés au

paragraphe D. 2). Après avoir été récoltées, les feuilles ont été séchées, puis envoyées par

colis à l’UMR-152 à Toulouse.

Plusieurs lots de feuilles ont été récoltés entre juillet 2003 et février 2006. L’authentification

de la drogue a été permise suite à une étude comparative des lots selon des critères

botaniques, phytochimiques et biologiques. Cette étude nous a permis de distinguer les deux

variétés de Piper hostmannianum présentes en Guyane :

- Piper hostmannianum var. hostmannianum (Miq) C.DC.

- Piper hostmannianum var. berbicense (Miq) C.DC.

Comme nous avons pu le décrire précédemment, ces deux variétés présentent des

caractéristiques morphologiques très proches entraînant une difficulté à les distinguer sur le

terrain.

D. 2 Travaux préliminaires : étude comparative des deux variétés de Piper

hostmannianum Guyanaises

Le matériel végétal

Les différents lots de feuilles de Piper hostmannianum sont les suivants :

- le premier lot : le lot 1016 a été récolté en juillet 2003, il présente une activité modérée

(extrait à l’acétate d’éthyle, CI50= 10 µg/ml) sur P. falciparum suite à un criblage

réalisé par les laboratoires Pierre Fabre. Ce résultat a été validé par des tests in vitro au

sein de notre laboratoire.


64

- Le second lot : le lot 1032 a été récolté en juin 2005.

- Première série de lots récoltés en juillet 2005 : GB3141, GB3142, GB3143, GB3144,

GB3145.

- Seconde série de lots récoltés en novembre 2005 : GB3162, GB3163, GB3164,

GB3165, GB3166, GB3167, GB3168.

- Troisième série de lots récoltés en décembre 2005 : GB3169, GB3169bis, GB3171,

GB3172, GB3174, GB3175, GB3176, GB3177, GB3178, GB3179, GB3180,

GB3181, GB3182, GB3183, GB3184, GB3185 et odonne /delnatte6.

Un partie de l’étude phytochimique bioguidée a été réalisée sur le premier lot, le lot 1016 (lot

actif in vitro sur P. falciparum). Néanmoins, il a été nécessaire d’être réapprovisionner en

matière première pour pouvoir continuer notre étude.

Extraction

Environ 2 g de chaque lot a été broyé et extrait par l’acétate d’éthyle à l’aide d’un extracteur

ASE 100 Dionex (voir partie Matériels et méthodes).

Remarque : l’acétate d’éthyle a été choisi, car ce solvant avait déjà été utilisé lors d’un

premier criblage in vitro de plantes guyanaises sur P. falciparum au sein des laboratoires

Pierre Fabre, cf introduction).

Comparaison des lots 1016, 1032 et de la première série de lots récoltés en juillet 2005

Profils des extraits en CCM

La Fig. 59 suivante représente les profils en CCM (de gauche à droite) des lots 1016, 1032,

GB3141, GB3142, GB3143, GB3144, GB3145 sous UV à 254 nm et à 365 nm, après

pulvérisation du réactif à la vanilline sulfurique et à 365 nm après pulvérisation du réactif de

Neu.


65

A

B

C

D

Fig. 59 : CCM réalisées dans un mélange Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2), A : révélation à 254

nm, B : révélation à 365 nm, C : révélation après vaporisation de vanilline sulfurique, D :

révélation à 365 nm après pulvérisation du réactif de Neu.

Ainsi, nous pouvons constater qu’il y a deux types de profils phytochimiques :

- Un profil regroupant les lots 1016, GB3141 et GB3144.

- Un second profil regroupant les lots 1032, GB3142, GB3143 et GB3145.

Activités in vitro sur P. falciparum

Les extraits AcOEt des 7 lots sont testés in vitro sur P .falciparum et les résultats sont

présentés dans le Tableau 3 suivant :

Lots CI 50 en µg/mL

1016 10 1032 30

GB3141 9.2 GB3142 28 GB3143 32 GB3144 10 GB3145 32

Tableau 3 : Résultats des tests in vitro sur P .falciparum des extraits AcOEt des différents

lots de P. hostmannianum.


66

Etude botanique

Les différents lots sont envoyés au Pr. Ricardo Callejas-Posada en Colombie, spécialiste des

plantes de la famille des Piperaceae.

Bilan de l’étude comparative

Le Tableau 4 suivant récapitule les différents résultats concernant la comparaison des profils

CCM des différents lots avec ceux des lots 1016 et 1032, les activités biologiques et l’étude

botanique.

Lots herbiers Profils CCM identique au lot :

1016 ou1032

Actif ou inactif sur P.falciparum

Résultats de l’étude botanique

GB3141 1016 actif P. hostmannianum var. berbicense GB3142 1032 inactif P. hostmannianum

var. hostmannianum GB3143 1032 inactif P. hostmannianum

var. hostmannianum GB3144 1016 actif P. hostmannianum var. berbicense

GB3145 1032 inactif P. hostmannianum var. hostmannianum

Tableau 4: Récapitulatif de l’étude comparative des lots de Piper GB3141, GB3142,

GB3143, GB3144, GB3145.

Le Tableau 4 permet d’identifier deux variétés de Piper hostmannianum. Ainsi, les lots dont

les profils CCM sont identiques au lot 1016 (lot actif) sont identifiés comme P.

hostmannianum var. berbicense et ceux dont les profils CCM sont identiques au lot 1032 (lot

inactif) sont identifiés comme P. hostmannianum.

Les autres lots ont été extraits de la même façon et leurs profils CCM ont été comparés aux

lots 1016 (lot actif) et 1032 (lot inactif). Les lots dont le profil CCM était identique au lot

1016 ont été testés in vitro sur P. falciparum pour confirmation.

- Tous les lots de la seconde série récoltés en novembre 2005 avec un profil CCM

identique au lot 1032 sont inactifs, il s’agit donc de Piper hostmannianum.


67

- Parmi les lots de la troisième série, récoltés en décembre 2005, les lots avec un profil

CCM identique au lot 1016 actif sont : GB3169, GB3169bis, GB3171, GB3174,

GB3179, GB3186, GB3187, GB3193 et odonne/delnatte6. Il s’agit donc de P.

hostmannianum var. berbicense.

Conclusion

Cette étude nous a permis de distinguer les deux variétés de Piper hostmannianum guyanaises

grâce à une étude comparative en botanique, en phytochimie (étude des profils CCM) et en

biologie (évaluation de l’activité antiplasmodiale). Ainsi, nous avons constaté que seulement

une des deux variétés est active in vitro sur P. falciparum. Il s’agit de la variété berbicense.

Notre étude phytochimique bioguidée a été tout d’abord réalisé sur le lot 1016 (500 g de

poudre de feuilles) et sur les autres lots actifs qui ont été rassemblés par la suite (au total : 988

g de poudre de feuilles). Ce nouveau lot reconstitué a été nommé 1016bis.

D. 3 Extraction

Après avoir pulvérisé les feuilles de P. hostmannianum var. berbicense, la poudre a été

lixiviée à froid successivement par du n-hexane, du chloroforme et du méthanol. Les résultats

des tests in vitro sur P. falciparum sont présentés dans le Tableau 5 :

Extrait Masse extrait en g (rendement en %)

CI 50 en µµµµg/mL

n-hexane 15 (3) 8 Chloroforme 15 (3) 22

Méthanol 25 (5) 50 Tableau 5 :Résultats in vitro sur P. falciparum des extraits bruts

de P. hostmannianum var. berbicense.

L’extrait le plus actif est l’extrait hexanique. Les molécules les plus actives sont donc très

certainement des molécules apolaires.

Les profils CCM des extraits hexanique (H) et chloroformique (Ch) sont présentés Fig. 60.


68

A B C D E

Fig. 60 : Profils CCM des extraits hexanique et chloroformique. A : 254 nm, B :365

nm, C : 365 nm après pulvérisation du réactif de Neu, D : Visible après pulvérisation

du réactif à la vanilline sulfurique, E : Visible après pulvérisation du réactif de

Dragendoorf.

Nous avons pu voir dans la partie bibliographique que les plantes du genre Piper sont connues

pour renfermer des alcaloïdes de type amide. Ainsi, nous avons révélé les CCM avec du

réactif de Dragendorff et aucune coloration brune n’est apparue. Par contre certains composés

réagissent positivement au réactif de Neu. Nous sommes donc en présence de polyphénols et

très certainement de flavonoïdes.

D’après la synthèse bibliographique, il doit très certainement s’agir de dérivés chalcones,

dihydrochalcones ou flavanones [Parmer et al., 1997].

Nous décidons donc de réaliser la purification de l’extrait hexanique puis de l’extrait

chloroformique par ordre d’activité décroissante.

D. 4 Purification

Plusieurs procédés de purification ont été employés concernant essentiellement des techniques

chromatographiques qui seront détaillées dans la partie Matériels et méthodes (colonne

ouverte, colonne moyenne pression, colonne haute pression etc..). Les fractions présentant des

profils identiques en CCM sont réunies et sont ensuite testées in vitro sur P. falciparum. Les

fractions qui se révèlent les plus actives sont ensuite purifiées.

H H Ch H H Ch Ch Ch H Ch


69

D. 4. 1 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016

L’extrait hexanique étant le plus actif, nous avons réalisé sa purification en vue d’isoler la ou

les molécules responsables de cette activité. Pour un extrait brut, une CI50 de 8 µg/ml

démontre une activité tout à fait encourageante pour les principes actifs qu’il contient,

d’autant plus qu’ils sont dilués parmi des centaines d’autres molécules inactives.

L’extrait hexanique recueilli est concentré à sec sous pression réduite (15 g), puis fractionné

grossièrement par chromatographie sur colonne ouverte de silice, éluée successivement par un

mélange Hex/AcOEt (de 100% Hex à 100% AcOEt) puis par 100% de MeOH. Onze

fractions sont obtenues, notées F1 à F11 (Fig. 61).

UV à 365 nm après pulvérisation du réactif de

Neu. Eluant : Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)

Visible après pulvérisation du réactif à la

vanilline sulfurique. Eluant :

Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)

Fig. 61 : CCM bilan des 11 fractions obtenus suite au premier fractionnement sur l’extrait

hexanique (la première fraction correspond à l’extrait hexanique).

Les molécules les plus apolaires sont éluées en premier puis viennent les molécules les plus

polaires. Les composés présents dans les dernières fractions (F10 et F11) ne migrent pas car

elles sont trop polaires pour ce système de solvant (Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)).

Chacune des fractions est évaluée in vitro sur P. falciparum et les résultats sont présentés dans

le Tableau 6 suivant :

ExtH F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11


70

Fractions Masse en g des fractions CI50 en µg/ml

F1 4.9 9

F2 0.42 12.2

F3 2.03 10.1

F4 1.12 17

F5 0.49 20

F6 0.89 25

F7 2.74 20

F8 0.37 16

F9 0.91 17

F10 0.67 17

F11 0.56 27

Tableau 6: Résultats des tests in vitro sur P. falciparum pour les fractions F1 à F11. Les

valeurs d’CI50 sont relatives à la souche chloroquino-résistante FcB1.

Nous décidons de purifier :

- Dans un premier temps les fractions F1 et F3 car il s’agit des fractions les plus actives

et elles sont parmi les plus importantes en quantité. Il semble que les composés actifs

soient apolaires. Leur réaction positive au réactif de Neu en CCM nous permet

d’envisager la présence de flavonoïdes antiplasmodiaux.

- Dans un second temps, les fractions F4’ et F5’ (équivalente en CCM aux fractions F4

et F5) obtenues après purification de l’extrait hexanique du lot 1016bis..

D. 4. 1. 1 Purification de la fraction F1 (Fig. 62)

A partir de la fraction F1 (CI50= 9 µg/ml), nous réalisons une colonne moyenne pression de

silice normale que nous éluons successivement par un mélange Hex/AcOEt (de 100% Hex à

100 % AcOEt) puis par 100% de MeOH. Treize fractions sont obtenues dont les plus actives

sont les fractions F1.2 (1350 mg, CI50= 3.8 µg/ml), F1.3 (92 mg, CI50= 3.3 µg/ml) et F1.4

(167 mg, CI50= 4.2 µg/ml).


71

Purification de la fraction F1.2

Deux composés purs ont été isolés, Host1 (10 mg, CI50=5.9 µg/ml) et Host2 (20 mg,

IC50=51.5 µg/ml) après avoir réalisé successivement deux purifications sur des cartouches

greffées C18 (Vac elut) éluées par un mélange MeOH/H2O.

F1 4900 mg

F1.1 27 mg

F1.2 1350 mg

F1.4 167 mg

F1.3 92 mg

F1.5 104 mg

F1.6 99 mg

F1.8 402 mg

F1.10 210 mg

F1.9 115 mg

F1.11 112 mg

F1.13 128 mg

F1.12 590 mg

F1.3.4 20 mg

F1.3.3 12 mg

F1.3.2 20 mg

F1. 3.1 17 mg

Host3 1.7 mg

Host4 1.8 mg

Host5 1.5 mg

F1. 4.3 26 mg

F1.4.1 18 mg Host7

30 mg

F1. 2.8 36 mg

F1. 2.7 13 mg

F1.2.6 26 mg

F1. 2.5 12 mg

F1. 2.3 38 mg

F1. 3.4 159 mg

F1. 2.1 5 mg

Host1 10 mg

Host2 20 mg

F1. 2.3.1 5 mg

F1. 2.3.3 6 mg

F1. 2.3.2 2 mg

Vac elut C18 MeOH/H2O (85/15)



Host6 1.5 mg

HPLC semi-préparative MeOH/H2O

F1.7 106 mg

100 % Hex 98/2 98/2 97/3 97/3 97/3 90/10 90/10 80/20 80/20 50/50100 % AcOEt

100 % MeOH

MPLC Silice normale Hex/AcOEt

80/20 85/15 90/1085/15 90/10 93/7 98/2 100 % MeOH

Vac elut C18 MeOH/H2O

F1 4900 mg

F1.1 27 mg

F1.2 1350 mg

F1.4 167 mg

F1.3 92 mg

F1.5 104 mg

F1.6 99 mg

F1.8 402 mg

F1.10 210 mg

F1.9 115 mg

F1.11 112 mg

F1.13 128 mg

F1.12 590 mg

F1.3.4 20 mg

F1.3.3 12 mg

F1.3.2 20 mg

F1. 3.1 17 mg

Host3 1.7 mg

Host4 1.8 mg

Host5 1.5 mg

F1. 4.3 26 mg

F1.4.1 18 mg Host7

30 mg

F1. 2.8 36 mg

F1. 2.7 13 mg

F1.2.6 26 mg

F1. 2.5 12 mg

F1. 2.3 38 mg

F1. 3.4 159 mg

F1. 2.1 5 mg

Host1 10 mg

Host2 20 mg

F1. 2.3.1 5 mg

F1. 2.3.3 6 mg

F1. 2.3.2 2 mg




Host6 1.5 mg


F1.7 106 mg

100 % Hex 98/2 98/2 97/3 97/3 97/3 90/10 90/10 80/20 80/20 50/50100 % AcOEt

100 % MeOH


80/20 85/15 90/1085/15 90/10 93/7 98/2 100 % MeOH

Vac elut C18 MeOH/H2O

Fig. 62 : Schéma de purification de la fraction F1.


Quatre composés ont été isolés Host3 (1.7 mg, CI50= 33.5 µg/ml), Host4 (1,8 mg, CI50= 100

µg/ml, Host5 (1.5 mg, CI50= 97.5 µg/ml) et Host6 (1.5 mg, CI50= 29 µg/ml) suite à une

purification sur une cartouche C18 Vac elut éluée en mode isocratique par un mélange

MeOH/H2O (85/15) suivie d’une HPLC semi-préparative (RP-18, débit : 3 ml/min ; t=0 min

80% MeOH ; t=10 min 100% MeOH pendant 10 minutes puis retour aux conditions initiales).


72


Un composé a été isolé, Host7 (30 mg, CI50= 3.0 µg/ml) après une purification sur une

cartouche C18 Vac elut® éluée en mode isocratique par un mélange MeOH/H2O (85/15).

D. 4. 1. 2 Purification de la fraction F3 (Fig. 63)

F3 2030 mg

F3.1 1100 mg

F3.2 800 mg

F3. 2..2 500 mg

F3.2.1 108 mg

F3. 2.1..1 32 mg

F3. 2.1..2 8 mg

F3. 2.1.3 12 mg

Host8 4 mg

Host9 10 mg

Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3

Colonne sephadex LH20 100 % CHCl3

MPLC silicé gréfée C18 MeOH/H2O (60/40)


F3 2030 mg

F3.1 1100 mg

F3.2 800 mg

F3. 2..2 500 mg

F3.2.1 108 mg

F3. 2.1..1 32 mg

F3. 2.1..2 8 mg

F3. 2.1.3 12 mg

Host8 4 mg

Host9 10 mg



MPLC silicé gréfée C18 MeOH/H2O (60/40)



La fraction F3 (2.03 g, CI50=10.1 µg/ml) est purifiée par chromatographie d’exclusion en

utilisant du Sephadex (LH20) éluée par 100% de CHCl3. La fraction F3.2 est purifiée de la

même façon pour éliminer les traces de pigments résiduels. Après une purification sur

colonne moyenne pression de silice greffée C18 et une HPLC semi-préparative (RP-18, débit :

3 ml/min, mode isocratique MeOH/H2O 60/40), les deux composés Host8 (4 mg, CI50= 100

µg/ml) et Host9 (10 mg, CI50= 3.4 µg/ml) sont isolés.

D. 4. 2 Purification de l’extrait hexanique issu du lot 1016bis

Nous travaillons les fractions F4’ (3.05 g) et F5’ (2.17 g), (équivalentes en CCM aux fractions

F4 et F5) moins actives mais qui présentent des composés majoritaires. Ces deux fractions


73

sont issues de la purification du lot 1016bis dont le protocole d’extraction est identique au lot

1016.

Remarque : masse poudre de feuilles : 988 g ; obtention de 30 g d’extrait hexanique.

D. 4. 2. 1 Purification de la fraction F4’ (Fig. 64)

F4’ 3050 mg

F4.1 1800 mg

F4.4 93 mg

F4.4 135 mg

F4.2 975 mg


F4.1.2 215 mg

F 4.1.1 638 mg


F4.1.2.1 3 mg

F4.1.2.2 7 mg

F4.1.2.3 110 mg

F4.1.2.4 17 mg

F4.1.2.5 28 mg

F4.1.2.6 9 mg

F4.1.2.7 30 mg


Host11 20 mg

Host10 20 mg

Colonne sephadex

LH20 100 % CHCl3

98/2 96/4 90/10 80/20 50/50 100 % Ae 100 % MeOH

F4’ 3050 mg

F4.1 1800 mg

F4.4 93 mg

F4.4 135 mg

F4.2 975 mg


F4.1.2 215 mg

F 4.1.1 638 mg


F4.1.2.1 3 mg

F4.1.2.2 7 mg

F4.1.2.3 110 mg

F4.1.2.4 17 mg

F4.1.2.5 28 mg

F4.1.2.6 9 mg

F4.1.2.7 30 mg


Host11 20 mg

Host10 20 mg

Colonne sephadex

LH20 100 % CHCl3

98/2 96/4 90/10 80/20 50/50 100 % Ae 100 % MeOH

Fig. 64 : Schéma de purification de la fraction F4’.

La fraction F4’ (3.05 g, CI50=17 µg/ml) est purifiée par chromatographie d’exclusion en

utilisant du Sephadex® (LH20) éluée par 100% de CHCl3. la fraction F4.1 obtenue est à

nouveau purifiée sur LH20. Les deux fractions F.4.1.2 et F.4.2 sont réunies car elle présentent

le même profil en CCM. Après une purification sur colonne moyenne pression de silice

normale (élution par un mélange Hex/AcOEt), et une purification sur une cartouche greffée

C18 (élution par un mélange MeOH/H2O 70/30), deux composés Host10 (20 mg, CI50=12

µg/ml) et Host11 (20 mg, CI50=4.7 µg/ml) sont isolés.


74

D.4.2.2 Purification de la fraction F5’ (Fig. 65)

F5’ 2170 mg

F5.1 1600 mg

F5.2 218 mg

F5. 1.2 315 mg

F 5.1.1 608 mg



F4.4 7.7 mg

Host12 50 mg

F4.2 86 mg

50/50 50/50 75/25


(50/50 puis 25/75)

F5’ 2170 mg

F5.1 1600 mg

F5.2 218 mg

F5. 1.2 315 mg

F 5.1.1 608 mg



F4.4 7.7 mg

Host12 50 mg

F4.2 86 mg

50/50 50/50 75/25


(50/50 puis 25/75)


La fraction F5’ (2.17 g, CI50=20 µg/ml) est purifiée par chromatographie d’exclusion en

utilisant du Sephadex® (LH20) éluée par 100% de CHCl3. la fraction F5.1 obtenue (riche en

pigments) est à nouveau purifiée sur LH20. Les deux fractions F.5.1.2 et F.5.2 sont réunies

car elle présentent le même profil en CCM. Après une purification sur colonne moyenne

pression de silice normale (élution Hex/AcOEt 50/50 puis 25/75), le composé Host12 (50 mg,

CI50=4.6 µg/ml) est isolé.

D.4.3 Purification de l’extrait chloroformique du lot 1016

Ce travail a été effectué avec la collaboration d’un stagiaire de Master II Recherche, Mickaël

Meyniel. Pour cet extrait, nous n’avons pas pu faire de bioguidage pour cause d’engorgement

à la plateforme de biologie.

L’extrait chloroformique recueilli est concentré à sec sous pression réduite (15 g), puis

fractionné grossièrement par chromatographie sur colonne ouverte de silice, éluée

successivement par un mélange Hex/CHCl3, de 100% Hex à 100% CHCl3, puis 50/50

CHCl3/MeOH puis 100% MeOH. Dix fractions sont obtenues, notées G1 à G10 (Fig. 66).


75

UV à 365 nm après pulvérisation du réactif de

Neu. Eluant : Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)

Visible après pulvérisation du réactif à la

vanilline sulfurique. Eluant :

Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)

Fig. 66 : CCM bilan des 10 fractions obtenues (la première fraction correspond à l’extrait

chloroformique brut)

Nous pouvons constater que nous avons également des composés qui réagissent positivement

au réactif de Neu supposant des molécules de type flavonoïde.

Fractions Masse en g des fractions

G1 0.18

G2 0.05

G3 0.01

G4 0.68

G5 1.09

G6 3.68

G7 0.95

G8 5.32

G9 0.08

G10 0.29

Tableau 7 : Bilan massique des fractions G1 à G10.

D’après le bioguidage réalisé sur l’extrait hexanique, les composés actifs sont de nature

apolaire, nous décidons par conséquent de purifier les fractions G5, G6 et G7.

ExtC G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10


76

D. 4. 3. 1 Purification de la fraction G5

Comme le montre la CCM de la Fig. 67, la fraction F5 présente un composé majoritaire. Sa

comparaison en CCM avec les composés isolés de l’extrait hexanique laisse supposer qu’il

s’agit du composé Host9.

Fig. 67 : CCM comparative de F5 et Host9. Eluant Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2).

La fraction est purifiée sur colonne de silice normale avec 100% de CHCl3, et 900 mg du

composé Host9 sont obtenus.

D. 4. 3. 2 Purification de la fraction G6 (Fig. 68)

G6 3.6800 mg

G6.1 2100 mg

G6.2 930 mg

G6.3 350 mg

G6.2.1 410 mg

G6.2.2 370 mg

G6.2.3 150 mg

G6.2.2.1 150 mg

G6.2.2.3 30 mg

Host13 127 mg


puis 100 % MeOH


puis 100 % MeOH

100 % CHCl3100 % CHCl3

100 % CHCl3100 % CHCl3

100 % CHCl3100 % CHCl3


puis 100 % MeOH

100 % MeOH

100 % MeOH

100 % MeOH

G6 3.6800 mg

G6.1 2100 mg

G6.2 930 mg

G6.3 350 mg

G6.2.1 410 mg

G6.2.2 370 mg

G6.2.3 150 mg

G6.2.2.1 150 mg

G6.2.2.3 30 mg

Host13 127 mg


puis 100 % MeOH


puis 100 % MeOH

100 % CHCl3100 % CHCl3

100 % CHCl3100 % CHCl3

100 % CHCl3100 % CHCl3


puis 100 % MeOH

100 % MeOH

100 % MeOH

100 % MeOH

Fig. 68 : Schéma de purification de la fraction G6.


77

La fraction G6 (3.68 g) est purifiée par chromatographie d’exclusion en utilisant du

Sephadex® (LH20) éluée par 100% de CHCl3, puis par 100% de MeOH. Cette purification est

répétée encore deux fois sur les fractions suivantes G.6.2 et G.6.2.2 conduisant à l’isolement

du composé Host13 (127 mg, CI50= 23.5 µg/ml).

D. 4. 3. 3 Purification de la fraction G7 (Fig. 69)

G7 950 mg

G7.1 586 mg

G7.3 257 mg

G7.3.1 135 mg

G7.3.2 110 mg

Colonne Sephadex LH20 100 % CHCl3 puis 100 % MeOH


G7.3.2.4 25 mg

G7.3.2.3 13 mg

G7.3.2.2 42 mg

G7.3.2.1 15 mg

Host14 9.9 mg


Host15 2.6 mg

Host16 7.7 mg

100 % CHCl3 100 % MeOH

100 % MeOH100 % CHCl3

75/25 50/50 25/75 100 % Ae


G7 950 mg

G7.1 586 mg

G7.3 257 mg

G7.3.1 135 mg

G7.3.2 110 mg



G7.3.2.4 25 mg

G7.3.2.3 13 mg

G7.3.2.2 42 mg

G7.3.2.1 15 mg

Host14 9.9 mg


Host15 2.6 mg

Host16 7.7 mg

100 % CHCl3 100 % MeOH

100 % MeOH100 % CHCl3

75/25 50/50 25/75 100 % Ae


Fig. 69 : Schéma de purification de la fraction G7.

La fraction G7 (0.95 g) est purifiée par chromatographie d’exclusion en utilisant du

Sephadex (LH20) éluée par 100% de CHCl3, puis par 100% de MeOH. Nous répétons la

même purification pour la fraction G7.3. Trois composés sont isolés Host14 (9.9 mg, CI50=

23 µg/ml) , Host15 (2.6 mg, CI50= 28 µg/ml), Host16 (7.7 mg, CI50= 19 µg/ml) suite à une

purification sur colonne moyenne pression de silice normale (éluée par un mélange

Hex/AcOEt, 100% Hex jusqu’à 100% AcOEt, puis 100% MeOH) et une HPLC semi-

préparative éluée par un mélange MeOH/H2O (RP-18, débit : 3 ml/min ; t=0 min 60%

MeOH ; t=20 min 100% MeOH pendant 10 minutes puis retour aux conditions initiales).


78

D. 5 Détermination structurale

Au total, 16 composés (Fig. 70) ont été isolés dont treize proviennent de l’extrait hexanique

(Host1 à Host13) et trois proviennent de l’extrait chloroformique (Host14 à Host16).

Fig. 70 : CCM des composés Host1 à Host16 sous UV à 365 nm après pulvérisation

du réactif de Neu.

Pour faciliter les explications concernant la détermination structurale des composés isolés,

nous présenterons successivement l’identification des molécules de type dihydrochalcones

(dans l’ordre suivant : Host9, Host7, Host2, Host3, Host4 et Host5), chalcones (dans l’ordre

suivant, Host11, Host12 et Host6) et flavanones (dans l’ordre suivant Host1, Host8, Host10,

Host13, Host14, Host15 et Host16).

Remarque : L’élucidation des structures est basée sur les données spectroscopiques (UV, IR,

MS, RMN 1H, RMN 13C, COSY, HSQC, HMBC et NOESY).


79

D. 5. 1 Détermination structurale des composés de type dihydrochalcone

D. 5. 1. 1 Détermination structurale du composé Host9

Ce composé se présente sous la forme de cristaux incolores (pf 178 °C, cristallisation dans le

CH2Cl2). Il réagit avec le réactif de Neu en affichant une fluorescence jaune sous UV à 365

nm laissant envisager une structure de type phénolique.

Spectroscopie UV et spectroscopie IR

Le spectre UV montre deux maxima d’absorption à 230 nm et 290 nm correspondant aux

absorptions des deux cycles A et B de composés de type flavonoïde [Mabry et al., 1970]. Le

spectre infra-rouge indique la présence de groupements : hydroxyle (3264 cm-1), carbonyle

(1646 cm-1) et aromatique (1526 cm-1, 1497 cm-1 et 1466 cm-1) et montre également la

présence de bandes d’absorption des liaisons C-H aromatiques (3022 cm-1) et C-H

aliphatiques (2915 cm-1 et 2850 cm-1).

Spectroscopie de masse et spectroscopie de RMN

Sur le spectre de masse réalisé en APCI en mode négatif, nous observons un ion quasi-

moléculaire à m/z 271 [M-H]- suggérant une masse atomique de 272 uma. Le spectre RMN du 13C (Fig. 71) enregistré en J-modulé indique la présence de 16 atomes de carbone dont 6

carbones quaternaires, 7 groupements CH, 2 méthylènes et un méthyle. L’ensemble de ces

informations nous permet d’attribuer au composé Host9 la formule brute C16H16O4 avec un

degré d’insaturation de 9.


80

Fig. 71 : Spectre RMN du 13C en J-modulé du composé Host9 (125 MHz, DMSO-d6).

A ce stade, nous pouvons conclure que nous sommes en présence d’un flavonoïde de type

dihydrochalcone renfermant deux cycles aromatiques, une fonction carbonyle et deux

méthylènes à 45.6 ppm (C-α) et à 30.5 ppm (C-β) (Fig. 71).

De plus, le spectre RMN du 1H présente (Fig. 72):

-Un singulet d’intensité 1H à δH 12.3 ppm attribué à OH-2’ caractéristique d’une liaison

hydrogène intramoléculaire entre un phénol et un groupement carbonyle [Harborne, 1993].

-Un massif compris entre δH 7.25 ppm et 7.27 ppm intégrant pour quatre hydrogènes attribués

à H-2, H-3, H-5 et H-6 et un triplet d’intensité 1H à δH 7.19 ppm attribué à H-4 qui

correspondent à des signaux caractéristiques du cycle B d’un flavonoïde monosubstitué

[Mabry et al., 1970].

-Un singulet d’intensité 3H à δH 3.75 ppm correspondant à un groupement méthoxyle

aromatique.


81

Fig. 72 : Spectre RMN du 1H du composé Host9 (500 MHz, DMSO-d6).

Il s’agit donc d’une dihydrochalcone dont le cycle B est non substitué et le cycle A substitué

par deux groupements hydroxyles et un groupement méthoxyle.

L’analyse des spectres RMN 2D HSQC et HMBC nous permet d’identifier le composé Host9

à la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone déjà isolée dans d’autres espèces de Piper

[Burke et Nair, 1986; Orjala et al., 1994] (Fig. 73).

OOH

OHO

2'

4' 6'

2

6 4

α

β

Fig. 73 : Structure de la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone , Host9.


82


Ce composé se présente sous la forme d’une huile incolore et réagit positivement au réactif de

Neu pour donner une fluorescence marron-orangé sous UV à 365 nm.


Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 210 nm et 290 nm. Le spectre IR

présente les mêmes bandes d’absorption que le composé Host9.


Le spectre de masse obtenue en APCI en mode négatif présente un ion quasi-moléculaire de

rapport m/z 407 [M-H]- suggérant une masse moléculaire de 408 uma. Le spectre MS/MS de

cet ion présente trois ions fils majoritaires respectivement à m/z 389 (perte de 18 uma), m/z

349 (perte de 58 uma) et m/z 337 (perte de 70 uma) (Fig. 74).

Fig. 74 : Spectre MS/MS du composé Host7 enregistré en APCI en mode négatif.

Le spectre de RMN du 13C en J-modulé (Fig. 75) présente en plus des 15 atomes de carbone

du noyau dihydrochalcone et du groupement -OCH3, 10 atomes de carbone supplémentaires

par rapport au composé Host9 : un carbone quaternaire (δC 141.7 ppm) quatre groupements

CH (δC 124.51 ppm, 43.8 ppm, 34.9 ppm, 28.12 ppm) deux méthylènes (δC 30.8 ppm, 46.4


83

ppm) et trois méthyles (δC 24.1 ppm, 21.9 ppm, 16.4 ppm), ce qui nous permet d’envisager

une formule brute de C26H32O4 avec un degré d’insaturation de 11. Ce substituant

supplémentaire présente alors une formule brute équivalente à C10H18 (en rajoutant un atome

d’hydrogène) suggérant une structure de type monoterpène.

Fig. 75 : Spectre de RMN du 13C du composé Host7 (100 MHz, CDCl3).

Le spectre RMN du 1H présente les mêmes signaux que le composé Host9 :

-Un singulet à δH 13.7 ppm attribué à OH-2’.

-Un massif de protons aromatiques entre δH 7.31 et 7.35 ppm attribué aux protons

aromatiques du cycle B.

-Un singulet à δH 6.07 ppm attribué au H-3’.

-Un singulet intégrant pour 3H δH à 3.81 ppm attribué à un groupement méthoxyle

aromatique.

-Un multiplet à δH 3.42 ppm attribué au CH2-α.


84

-Un triplet à δH 3.03 ppm attribué au CH2-β.

Ainsi l’ensemble de ces signaux confirment une structure de type 2’,6’-dihydroxy-4’-

méthoxydihydrochalcone [Burke et Nair, 1986] (Fig. 76).

OOH

OHO

2'

4' 6'

2

6 4

α

β

Fig. 76 : 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone.

De plus, le spectre 1H indique :

-Un groupement isopropyle : deux méthyles à δH 0.82 et 0.85 ppm sous forme de doublet (J=

6.7 Hz) et un groupement CH à δH 1.49.

-Un méthyle vinylique à δH 1.8 ppm sous forme de singulet.

-Deux groupements méthylènes sous forme de multiplets entre δH 1.4-1.8 ppm et δH 2.12

ppm.

-Un groupement CH déblindé à δH 3.9 ppm sous forme de « doublet large ».

-Un proton éthylénique à δH 5.5 ppm sous forme de s.

L’ensemble de ces informations associées aux informations déduites de l’analyse du spectre

de RMN du 13C nous confirme la présence d’une sous-unité monoterpénique identifiée

comme étant un p-menthène.

Ainsi la perte de 70 uma observée dans le spectre MS/MS de l’ion moléculaire a été

interprétée comme résultant d’une réaction de type rétro-diels Alder au niveau du p-menthène

[Ichino, 1989] (Fig. 77) :


85

+

70 umap-menthène

Fig. 77 : Réaction de type rétro Diels –Alder au niveau du p-menthène.

Ainsi le composé Host7 est une 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxy-dihydrochalcone substituée par

un unité p-menthène. L’étude des spectres HMBC et COSY va nous permettre de déterminer

la manière dont ces deux sous-unités sont liées.

le spectre RMN 2D HMBC (Fig. 78 et 80) montre que les carbones C-6’ (δC 159 ppm) et C-5’

(δC 109 ppm) corrèlent avec le proton à δH 3.9 ppm. Le carbone correspondant (d’après le

spectre HSQC) δC 35 ppm est donc directement relié par liaison C-C au cycle A de la sous-

unité dihydrochalcone. Ce carbone à δC 35 ppm est attribué au carbone C-5’’.

Fig. 78 : Agrandissement spectre HMBC corrélation du H-5’’ (δH 3.9 ppm).


86

De la même manière, le H-5’’ corrèle aussi avec deux autres carbones : un carbone

quaternaire éthylénique à 141 ppm (qui porte le méhyle à δH 1.8 ppm) et un groupement CH à

δC 43.7 ppm. Ceci est confirmé grace à l’étude du spectre COSY (Fig. 79) qui démontre que

le H-5’’ corrèle avec trois protons : δH 1.56 ppm (CH à δC 43.7 ppm), δH 1.7 ppm (CH3 porté

par le carbone éthylénique à 141 ppm) et δH 5.5 ppm (proton éthylénique).

Fig. 79 : Agrandissement spectre COSY du composé Host7.

Ainsi, nous pouvons attribuer le carbone à δC 43.7 ppm au C-4’’, le carbone éthylénique à δC

141 ppm au C-1’’, le méthyle à 1.8 ppm au C-7’’ et le CH éthylénique au C-6’’. Il nous reste

à positionner le groupement isopropyle et deux groupements méthyles de l’unité p-menthène.

Les corrélations en HMBC (Fig. 80) nous permettent d’identifier le composé Host7 à la

méthyllinderatine déjà isolée des feuilles de Lindera umbellata (Lauraceae) [Ichino, 1989] et

de Piper aduncum [Orjala et al., 1993]. Cependant, dans ces deux plantes, la molécule ne

présente pas le même pouvoir rotatoire, elle existe sous deux formes énantiomèriques. La

mesure du pouvoir rotatoire (αD= -41°, CHCl3, c=0.1) confirme qu’il s’agit de la (-)-


87

méthyllindératine (Fig. 80) (et non de la (+)-méthyllindératine) déjà isolée des feuilles de

Piper aduncum.

OOH

OHO

H

H

6'

2'

4'

5''

7''

6'' 5'' 9''

10''

4'' 8''

α

β

4

Fig. 80 : Structure de la (-)-méthyllindératine et corrélations HMBC du composé Host7.


88


Ce composé a été obtenu sous la forme de cristaux jaunes (pf 58-60°C prismes, cristallisation

dans le MeOH). Il réagit positivement au réactif de Neu pour afficher une fluorescence jaune

en UV à 365 nm.


Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 234 nm et 292 nm. Le spectre infra-

rouge présente les mêmes bandes d’absorption que les deux composés précédemment

identifiés Host9 et Host7.


Le spectre de masse haute résolution enregistré ESI–Q-TOF-HRMS en mode négatif présente

un ion quasi-moléculaire de m/z 407.2242 (calculé 407.2222) [M-H]- en accord avec la

formule brute C26H32O4. Il s’agit d’un isomère du composé Host7.

Bien que le composé semble être pur en CCM, l’ensemble des signaux des spectres RMN du 1H et du 13C sont dédoublés (Fig. 81) suggérant la présence de deux composés. Après

plusieurs essais de séparation selon différentes techniques chromatographiques, nous n’avons

pas réussi à les séparer.

D’après l’intégration des signaux en RMN du 1H , nous sommes donc en présence d’un

mélange d’isomères dont le rapport est de l’ordre de 55/45 L’élucidation structurale est basée

sur les signaux du composé majoritaire nommé Host2a (par défaut le composé minoritaire

sera nommé Host2b).


89

Fig. 81: Spectre de RMN du 13C du composé Host2 (125 MHz, CDCl3).

Le spectre de RMN du 1H présente les signaux caractéristiques d’une 2’,6’-dihydroxy-4’-

méthoxydihydrochalcone [Burke et Nair, 1986]: δH 13.90 (OH-2’, 1H, s), 7.21-7.29 (5H, m,

cycle B), 3.06 (H-β, 2H, t), 3.49 (H-α, 2H, m), 6.02 (H-3’,1H, s), 3.83 (OCH3, 3H, s).

Le spectre de RMN du 13C confirme les signaux de la sous-unité dihydrochalcone et montre

dix signaux supplémentaires: trois méthyles (δC 29.2 ppm, 20.9 ppm et 22.1 ppm), trois

méthylènes (δC 30.1 ppm, 20.5 ppm et 35.3 ppm), trois groupements CH (δC 44 ppm, 27.2

ppm et 26.3 ppm) et un carbone quaternaire (δC 77.9 ppm) déblindé, portant très certainement

un atome d’oxygène.

Comme le composé Host7, le composé Host2 est une dihydrochalcone substituée par une

unité monoterpénée et plus particulièrement par une unité p-menthane et non p-menthène du à

l’absence de signaux éthyléniques.

D’après le nombre d’insaturations et l’absence de doubles liaisons éthyléniques, la sous unité

p-menthane et la sous-unité dihydrochalcone sont reliées entre elles en formant un cycle. Les


90

expériences de RMN 2D COSY, HSQC et HMBC vont nous permettre de déterminer les

différents points de liaisons des deux sous-unités.

Fig. 82 : Agrandissement du spectre HMBC du composé Host2.

Comme pour le composé Host7, une corrélation en HMBC est observée entre le carbone δC

106.8 ppm (C-5’) et le proton à δH 3.39 ppm, nous permettant d’attribuer celui-ci au proton H-

5’’. Ainsi la première liaison entre les deux sous-unités est une liaison C-C entre le carbone

C-5’ et le carbone C-5’’. De plus, les protons du groupement méthyle δC 29.2 ppm (δH 1.37

ppm) corrèlent en HMBC (Fig. 82) avec le carbone C-6’ (δC 158.9 ppm) et le carbone

quaternaire à δC 77.9 ppm. Nous pouvons alors conclure que le méthyle à δC 29.2 ppm

correspond au C-7’’ et le carbone quaternaire à δC 77.9 ppm correspond au carbone C-1’’.

Ainsi, l’unité p-menthane est reliée à l’unité dihydrochalcone selon une liaison C-O entre le

carbone C-1’’ et l’oxygène porté par le carbone C-6’. Un cycle à six est alors formé entre la

sous-unité p-menthane et la sous-unité dihydrochalcone.


91

Les structures des composés Host2a et Host2b sont confirmées suite à une analyse aux

Rayons X (Fig. 83).

Fig. 83: Diagramme ORTEP de Host2a et Host2b. Les atomes d’oxygène sont représentés en

rouge.

La Fig. 83 montre que le monoterpène adopte une conformation chaise dans laquelle le

groupement méthyle est en position équatoriale pour les deux isomères. Par contre le

groupement isopropyle est en position axiale dans le composé majoritaire Host2a et en

position équatoriale dans le composé minoritaire Host2b. En effet, le spectre NOESY

confirme ces résultats car des corrélations sont observées entre les protons H-5’’ et H-4’’ sur

le spectre du composé Host2a.

Les structures de ces deux composés Host2a et Host2b (Fig. 84) sont nouvelles dans le règne

végétal. Il s’agit respectivement des composés 2’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4β-isopropyl-

1β-méthyl-cyclohexane-1-O-5-yl) dihydrochalcone et 2’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4α-

isopropyl-1β-méthyl-cyclohexane-1-O-5-yl) dihydrochalcone [Portet et al., 2007].

1'

2'3'

4'5'

6'

7"

8"9" 10"

1

23

4

56

1"

2"3"4"

5" 6"

α

β

O

OOH

O

O

OOH

O

Fig. 84 : Structure des composés (a) : Host2a et (b) : Host2b.

(a) (b)


92


Ce composé se présente sous la forme d’une poudre blanche. Il réagit également positivement

au réactif de Neu pour donner une fluorescence orangée sous UV à 365 nm.


Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 232 nm et 292 nm, et le spectre IR

présente les mêmes bandes que le composé Host9.


Le spectre de masse enregistré en ESI-Q-TOF-HRMS indique un ion quasi-moléculaire en

mode positif m/z 425.2286 [M+H]+ (calculé 425.2328) en accord avec la formule brute

C26H32O5. Le composé Host3 présente donc un atome d’oxygène supplémentaire par rapport

aux composés Host7 et Host2.

L’étude des spectres de RMN 1H et 13C ainsi que leur comparaison avec les spectres des

composés précédents confirme qu’il s’agit d’un dérivé 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxy-

dihydrochalcone substitué par un monoterpène en position C-5’ : nous pouvons observer des

corrélations en HMBC avec les carbones C-5’ (δC 112.9 ppm) et C-6’ (δC 161.7 ppm) et un

proton à δH 3.07 ppm attribué au H-5’’.

En ce qui concerne la partie monoterpénée, le spectre RMN du 13C révèle deux méthylènes à

δC 30.3 ppm et 19.4 ppm, trois groupements CH à δC 46.8 ppm, 41.1 ppm et 89.2 ppm au lieu

de trois méthylènes (δC 35.3 ppm (C-2’’), 20.5 ppm (C-3’’), 30.1 ppm (δC C-6’’) et deux

groupement CH (δC 44 ppm (C-4’’) et 27.2 ppm (C-5’’)) observés précédemment pour le

composé Host2a. Ainsi, les différences entre les composés Host3 et Host2 concernent la

substitution de l’unité p-menthane sur l’unité dihydrochalcone et la présence d’un atome

d’oxygène supplémentaire.

Le caractère déblindé du groupement CH à δC 89.2 ppm suggère qu’il porte un atome

d’oxygène ou une fonction alcool. De plus l’expérience de RMN 2D COSY révèle que le


93

proton H-5’’ (δH 3.07 ppm, t) couple avec le proton δH 4.54 ppm (porté par le carbone δC 89.2

ppm) avec une constante de couplage de J= 5.7 Hz. Ainsi, ce proton peut être attribué au

proton H-6’’. La sous-unité dihydrochalcone est ainsi reliée à la sous-unité p-menthane au

niveau d’une liaison C-C (C-5’/C-5’’) et d’une liaison C-O-C (C6’-O-C6’’) pour former un

cycle à cinq atomes comme l’adunctin E déjà isolé des feuilles de Piper aduncum [Orjala et

al., 1993].

OOH

OO

OHH H

1''

2''3''4''

5'' 6''

7''

8''

9''

10'' H

2'

4' 6'

Fig. 85 : Interactions NOE pour le composé Host3.

De plus, le spectre NOE révèle des intéractions (Fig. 85) entre le proton H-4’’ (δH 1.19

ppm)/H-5’’ (δH 3.07 ppm), H-5’’ (δH 3.07 ppm)/H-6’’ (δH 4.54 ppm) et H-6’’ (δH 4.54

ppm)/H-7’’ (δH 1.41 ppm). Ainsi la configuration relative au niveau des carbones C-4’’/C-5’’

et C-1’’/C-7’’ peut être établie montrant que le groupement isopropyle et le groupement

méthyle sont en position TRANS l’un de l’autre (Fig. 85) (alors que dans l’adunctin E les deux

groupement sont en position CIS).

L’ensemble des données précédentes a permis d’établir la structure du composé Host3 (Fig.

84) . C’est un diastéréoiosomère de l’adunctin E, il s’agit de la rel-(1’’ R,4’’R,5’’S,6’’S)-2’-

hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4-isopropyl-1-méthyl-cyclohexan-1-ol-5, 6-O-yl)

dihydrochalcone, nouveau composé naturel [Portet et al., 2007].


94


Ce composé présente exactement les mêmes caractéristiques spectrales que le composé

Host3 : même spectre UV, même spectre infra-rouge, même spectre de masse. Néanmoins il

ne présente pas le même Rf en CCM et, en ce qui concerne la spectrométrie de RMN 1H et 13C , les mêmes signaux sont obtenus avec de légères différences au niveau des déplacements

chimiques (Fig. 86).

Fig. 86: Spectre RMN du 1H du composéHost4

(500 MHz, CDCl3).

Dans le cas du composé Host4, le proton H-5’’ apparaît sous la forme d’un doublet dédoublet

avec comme constantes de couplage J= 10.4, 5.7 Hz. Dans ce cas le H-5’’ et le H-4’’ sont en

position TRANS l’un de l’autre alors que le H-5’’ est en position CIS avec le H-6’’. Nous

retrouvons ainsi la configuration de l’adunctine E déjà isolée par Orjala et al. [1993] (Fig.

87).

Ces résultats sont confirmés par le spectre NOESY dans lequel aucune corrélation n’est

observée entre le H-5’’ et le H-4’’.


95

Le composé Host4 correspond donc à l’adunctine E (Fig. 87) :

OOH

OO

OHH H

1''

2''3''4''

5'' 6''

7''

8''

9''

10''

2'

4' 6'

Fig. 87: Structure du composé Host4 (aduntine E).


Ce composé présente les mêmes caractéristiques spectrales que les composés Host3 et Host4

en ce qui concerne la spectroscopie UV , infra-rouge et spectrométrie de masse. Il présente la

même formule brute C26H32O5.

L’étude des données spectrales de RMN 1H et 13C ainsi que leur comparaison avec les

données des composés précédents montre qu’il s’agit d’un dérivé de la 2’,6’-dihydroxy-4’-

méthoxy-dihydrochalcone substituée au niveau du C-5’ par un monoterpène (corrélations

observés en HMBC entre le carbone C-5’ (δC 113.17 ppm) et le proton à δH 3.12 ppm attribué

au H-5’’).

L’étude comparative des deux spectres de RMN du 13C des composés Host5 et Host3 (Fig.

88) révèle deux différences majeures concernant un carbone quaternaire et un groupement

CH. Dans le cas du composé Host3, le carbone quaternaire C-1’’ et le groupement CH C-6’’

présentent respectivement des déplacements chimiques de δC 81.9 ppm et de 89.2 ppm alors

que dans le cas du composé Host5, les carbones équivalents présentent des déplacements

chimiques de δC 69.3 ppm et δC 92.4 ppm (δH 4.16 ppm).


96

Fig. 88 : Comparaison des spectres RMN du 13C des composés Host3 et Host5

(125 MHz, CDCl3).

De plus, le spectre RMN du 1H présente deux signaux correspondant à des phénols à 13.26

ppm et 13.59 ppm. Ces deux protons sont attribués au groupements phénoliques OH-2’ et

OH-6’. Ainsi la sous –unité dihydrochalcone est reliée par une seule liaison C-C (C-5’/C-5’’)

et le carbone C-1’’ et le carbone C-6’’ présente un pont époxyde Fig. 89.

OOH

OHO

OH

H

1''

2''3''4''

5'' 6''

7''

8''

9''

10'' H

2'

4'6'

Fig. 89: Structure du composé Host5 et

corrélations observées sur le spectre NOESY.


97

Le spectre 2D NOESY présente des corrélations entre le H-5’’ (δH 3.12 ppm)/H-6’’ (δH 4.16

ppm) et H-6’’ (δH 4.16 ppm)/H-7’’ (δH 1.39 ppm). De plus, le H-5’’ présente deux constantes

de couplage à J=5.7 Hz et 11 Hz. Ainsi la configuration relative au niveau des carbones

C-1’’/C-7’’ et C-4’’/C-5’’ peut être établie : le groupement isopropyle et le groupement

méthyle sont donc en position CIS l’un de l’autre (Fig. 88).

L’ensemble des données précédentes nous permet ainsi d’établir la structure du composé

Host6 comme étant la rel-(1’’ R,4’’S,5’’S,6’’R)-2’-hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-

(4-isopropyl-1,6-epoxy-1-méthyl-cyclohexane-5-yl) dihydrochalcone.


98

D. 5. 1. 7 Bilan des molécules isolées de type dihydrochalcone

Au total 7 dihydrochalcones ont été isolées dont six d’entre elles sont substituées par un

monoterpène ce qui en fait leur originalité. Les composés Host2a, Host2b, Host3 et Host 5

sont des molécules nouvelles (en rouge dans les tableaux). Les déplacements chimiques

relatifs aux atomes d’hydrogène et aux atomes de carbone sont rassemblés dans les Tableaux

8 et 9 ci-dessous. Host9 Host7 Host2a Host2b Host3 Host4 Host5

500 MHz, DMSO d6 400 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3 500 MHz, CDCl3DihydrochalconeH-2 to H-6 7.19-7.27 m 7.23-7.31 m 7.21-7.29 m 7.21-7.29 m 7.21-7.31 m 7.21-7.31 m 7.21-7.29 mH- α 3.33 t (7.5) 3.42 ddd (7.3, 4.9, 1.6) 3.49 m 3.49 m 3.41 m 3.37 m 3.37 mH-β 2.91 t (7.5) 3.03 t (7.3) 3.06 t (8.0) 3.06 t (8.0) 3.07 t (7.9) 3.06 t (7.9) 3.05 t (7.5)H-3' 5.97 s 6.07 s 6.02 s 6.01 s 6.09 s 6.07 s 6.06 s H-5' 5.97 s / / / / / /

OH-2' 12.33 s 13.74 s 13.90 s 13.90 s 13.26 s 13.26 s 13.26 s

OCH3-4' 3.75 s 3.81 s 3.83 s 3.80 s 3.84 s 3.84 s 3.84 s

MonoterpeneHa-2" / 2.12 m 1.74 m 1.99 m 1.79 m 2.01 m 1.78 m

Hb-2" / / 1.61 m 1.53 m 1.68 m 1.60 m 1.67 m

Ha-3" / 1.79 m 1.53 m 1.63 m 1.21 m 1.33 m 1.42 m

Hb-3" / 1.4 m / / 1.67 m 1.37 m /

H-4" / 1.56 m 1.21 m 1.24 m 1.11 m 1.08 m 1.08 mH-5" / 3.39 m 3.39 m 3.49 m 3.07 t (5.7) 3.10 dd (11, 5.7) 3.12 dd (11, 5.7)Ha-6" / 5.50 s 1.91 dd (13.4, 3.4) 1.81 m / / /Hb-6" / / 1.51 dd (13.4, 5.3) 1.73 m 4.54 dd (5.7,1.2) 4.52 dd (5.7,1.2) 4.16 dd (5.7,1.2)

CH3-7" / 1.81 s 1.36 s 1.37 s 1.41 s 1.46 s 1.39 s

H-8" / 1.49 m 1.78 m 1.22 m 1.88 m 1.85 m 1.87 mCH3-9" / 0.82 d (6.7) 1.08 d (6.8) 1.09 d (6.6) 0.90 d (7.0) 0.86 d (7.0) 0.92 d (7.0)

CH3-10" / 0.85 d (6.7) 0.97 d (6.8) 0.75 d (6.6) 0.86 d (7.0) 0.83 d (7.0) 0.86 d (7.0)

Tableau 8: Déplacements chimiques en RMN du 1H des protons des composés Host9, Host7,

Host2a, Host2b, Host3, Host4 et Host5.


99

Host9 Host7 Host2a Host2b Host3 Host4 Host5125 MHz, DMSO d6 100 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3 125 MHz, CDCl3

Dihydrochalcone1 142.0 142.2 141.8 141.8 141.2 141.3 141.32/6 128.8 128.6 128.3 128.3 128.2 128.4 128.43/5 128.7 128.8 128.4 128.4 128.6 128.3 128.34 126.3 126.1 125.9 125.8 126.3 126.0 126.0α 45.6 46.4 45.5 45.5 44.2 44.7 43.7β 30.5 30.8 30.7 30.7 30.6 30.1 30.2C=O 205.1 205.2 204.9 204.8 203.4 203.3 203.31' 105.0 106.1 104.7 104.9 102.7 102.7 102.72' 164.5 165.2 158.9 159.3 165.5 165.3 165.33' 93.7 92.2 91.2 91.0 92.9 92.9 92.84' 165.9 163.9 162.3 163.2 161.3 161.6 161.95' 93.7 109.1 106.8 103.5 112.9 112.9 113.26' 164.5 158.8 165.4 165.3 161.7 161.8 161.9CH3O 55.8 55.8 55.7 55.1 55.5 55.5 55.5

Monoterpene

1" / 141.7 77.9 76.7 81.9 80.9 69.32" / 30.8 30.1 36.9 30.3 31.8 35.33" / 22.3 27.2 28.4 19.4 17.2 17.24" / 43.8 44.0 49.9 46.8 46.3 46.65" / 34.9 20.5 22.5 41.1 39.8 39.66" / 124.5 35.3 40.2 89.2 87.6 92.47" / 24.1 29.2 28.7 21.2 22.0 28.28" / 28.12 26.3 29.6 26.9 27.2 27.29" / 16.4 20.9 22.4 15.3 15.4 15.4

10" / 21.9 22.1 20.4 21.8 21.8 21.8

Tableau 9: Déplacements chimiques en RMN du 13C des carbones des composés Host9,

Host7, Host2a, Host2b, Host3, Host4 et Host5.


100

D. 5. 2 Détermination structurale des composés de type chalcone


Ce composé a été obtenu sous la forme de cristaux orange (aiguilles, pf 124 °C, cristallisation

dans le MeOH). En CCM, ce composé présente une coloration jaune après révélation au

réactif de Neu en lumière visible, et aucune flurorescence n’est observé à 365 nm.


Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 300 nm et 340 nm. Ces deux absorptions

correspondent aux absorptions des cycles A et B d’un flavonoïde où le cycle B est conjugué

avec une double liaison C=C.

Le spectre infra-rouge indique la présence de groupements : hydroxyle (3369 cm-1), carbonyle

(1628 cm-1), éthylénique (1606 cm-1) et aromatique (1541 cm-1, 1495 cm-1 et 1450 cm-1). Il

montre également la présence de bandes d’absorption des liaisons C-H éthyléniques (3100

cm-1), aromatiques (3022 cm-1) et C-H aliphatiques (2915 cm-1 et 2850 cm-1).

Ces premières informations indiquent que nous sommes en présence d’un flavonoïde et

certainement d’une chalcone. L’étude des spectres RMN du 1H et du 13C nous permettra de

confirmer cette hypothèse.


Le spectre de masse obtenu en APCI en mode négatif présente un ion quasi-moléculaire m/z

297 [M-H]- suggérant une masse atomique de 298 uma. Le spectre de RMN du 13C (Fig. 90)

enregistré en J-modulé indique la présence de 18 atomes de carbones dont 8 carbones

quaternaires, 7 groupements CH, et trois méthyles. L’ensemble de ces informations nous

permet d’attribuer au composé Host11 la formule brute C18H18O4 avec un degré

d’insaturation de 10.


101

Fig. 90 : Spectre RMN du 13C du composé Host11 enregistré en J-modulé

(75 MHz, CDCl3).

A ce stade, nous pouvons confirmer que nous sommes en présence d’un flavonoïde de type

chalcone renfermant deux cycles aromatiques, une fonction carbonyle et deux groupements

CH éthyléniques à 142.9 ppm (C-β) et à 128.8 ppm (C-α) (Fig. 90).

De plus, le spectre de RMN du 1H présente (Fig. 91):

-Un signal singulet à 13.6 ppm d’intensité 1H attribué à OH-2’ caractéristique d’une liaison

hydrogène intramoléculaire entre un groupement phénol et une fonction carbonyle [Harborne,

1993].

-Un doublet dédoublé à δH 8.01 ppm (J= 15.6, 3 Hz) d’intensité 1H attribué à H-α [Harborne,

1993].

-Un doublet dédoublé à δH 7.86 ppm (J= 15.6, 1.5 Hz) d’intensité 1H attribué à H-β

[Harborne, 1993].


102

-Un multiplet d’intensité 1H entre δH 7.63 et 7.66 ppm attribué à H-4, un multiplet d’intensité

4H entre 7.39 et 7.70 ppm attribué à H-2, H-3, H-5 et H-6 caractéristique du cycle B d’un

flavonoïde monosubstitué [Mabry et al., 1970].

-Un singulet d’intensité 3H à δH 3.67 ppm caractéristique d’un groupement méthoxyle

aromatique.

- Deux singulets d’intensité 3H à δH 2.16 et 2.18 ppm caractéristique de deux groupements

méthyles substitué sur un cycle aromatique.

Fig. 91 : Spectre RMN du 1H du composé Host11 (300 MHz, CDCl3).

Nous sommes donc en présence d’une chalcone dont le cycle B est non substitué et le cycle A

est substitué par deux méthyles, deux hydroxyles et un méthoxyle. L’étude du spectre de

RMN 2D HMBC va nous permettre de positionner les différents substituants sur le cycle A.

Les corrélations observées en HMBC (Fig. 92) montrent que le proton à δH 13.6 ppm (OH-2’)

corrèle avec le carbone à 162.1 ppm: il s’agit donc du carbone C-2’. De plus, ce carbone ainsi

que les carbones à δC 159.2 ppm et δC 106.7 ppm corrèlent avec les protons du groupement


103

méthyle à 2.16 ppm. Ainsi, les carbones à δC 159.2 ppm et δC 106.7 ppm sont respectivement

attribués aux carbones C-4’ et C-3’.

De la même façon, le carbone à δC 159.2 ppm (C-4’) ainsi que les carbones à δC 158.9 ppm et

108.9 ppm corrèlent avec les protons du groupement méthyle à δH 2.18 ppm. Ainsi, les

carbones à δC 158.9 ppm et δC 108.9 ppm sont respectivement attribués aux carbones C-6’ et

C-5’.

De plus, le carbone à δC 158.9 ppm (C-6’) corrèle avec les protons du groupements

méthoxyles à δH 3.67 ppm. Ainsi, le groupement méthoxyle est substitué sur le carbone C-6’

et les deux groupements OH sur les positions C-2’ et C-4’. Les positions C-3’ et C-5 sont

substituées par les deux groupement méthyles.

OOH

OHO

2'

4'6'

α

β 2

46

Fig. 92: Corrélations HMBC du composé Host11 (2’,4’-dihydroxy-3’,5’-diméthyl-6’-

méthoxychalcone).


Host11 comme étant de la 2’,4’-dihydroxy-3’,5’-diméthyl-6’-méthoxychalcone (Fig. 92). Ce

composé a déjà été isolé des feuilles de Syzygium samarangense (Myrtaceae) [Resurreccion-

Magno et al., 2005] de Psorothamnus polydenius (Fabaceae) [Salem et Werbovetz, 2005] et

des écorces de Cyathocalyx crinatus [Shibata et al., 2000] (Annonaceae). C’est la première

fois que cette chalcone est isolée d’une espèce de la famille des Piperaceae.


104

D. 5 .2. 2 Détermination structurale du composé Host12

Ce composé a été obtenu sous la forme de cristaux jaune-orangé (aiguilles, pf 145 °C). En

CCM, il prend une couleur jaune après révélation au réactif de Neu en lumière visible, et

aucune fluorescence n’est observée sous UV à 365 nm.


Les données des spectres UV et IR sont identiques à celles du composé Host11.


Nous observons sur le spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif un ion quasi-

moléculaire m/z 283 [M-H]- suggérant une masse molaire de 284 uma. L’étude du spectre de

RMN 13C enregistré en J-modulé (Fig. 93) révèle la présence de 17 carbones dont 6 carbones

quaternaires, 8 groupements CH et deux méthyles. L’ensemble de ces informations permet

d’attribuer au composé Host12 la formule brute C17H16O4 avec un degré d’insaturation de 10.

Ainsi le composé Host12 a un groupement méthyle de moins que le composé Host11.

Fig. 93: Comparaison des spectres RMN du 13C des composés Host12 et Host11 (75 MHz,

CDCl3 et acétone-d6.


105

Comme le montre la Fig. 93, la différence majeure entre les deux spectres RMN du 13C des

composés Host11 et Host12 concerne la région des carbones aromatiques entre δC 90 ppm et

110 ppm.

Ainsi, le composé Host12 présente deux carbones quaternaires à δC 103.7 ppm et 105.3 ppm

et un groupement CH aromatique (δC 90.8 ppm) au lieu de trois carbones quaternaires

aromatiques à δC 106.6 ppm (C-3’), 108.9 ppm (C-5’) et 109.1 ppm (C-1’) dans le cas du

composé Host11.

L’ensemble de ces informations suggère que le composé Host12 est une chalcone dont le

cycle B est non substitué et le cycle A substitué par deux groupements hydroxyles, un

groupement méthoxyle et un méthyle.

Les corrélations HMBC (Fig. 94) nous permettent de positionner les différents substituants.

Ainsi le proton à δH 14.5 ppm (OH-2’) corrèle avec le carbone à 165.7 ppm: il s’agit donc du

carbone C-2’. De plus, ce carbone ainsi que les carbones à δC 162.7 ppm et δC 103.7 ppm

corrèlent avec les protons du groupement méthyle à 2.02 ppm. Ainsi, les carbones à δC 162.7

ppm et δC à 103.7 ppm sont respectivement attribués aux carbones C-4’ et C-3’. Les protons

du groupement méthoxyle corrèlent avec le carbone à δC 161 ppm que nous pouvons attribuer

par déduction au carbone C-6’.

OOH

OHO

2'

4'6'

α

β 2

46

Fig. 94: Structure et corrélations HMBC observées pour le composé Host12 :

2’,4’-dihydroxy-3’-méthyl-6’-méthoxychalcone.


Host12 comme étant la 2’,4’-dihydroxy-3’-méthyl-6’-méthoxychalcone (ou stercurensine)

déjà isolée dans des plantes de la famille des Myrtaceae dont Syzygium samarangense

(Myrtaceae) [Mustafa et al., 2005; Resurreccion-Magno et al., 2005]. Comme pour la

chalcone précédente, celle-ci n’avait jamais été isolée des plantes de la famille des Piperaceae.


106


Ce composé se présente sous la forme d’une huile jaune. En CCM, il exhibe une couleur

jaune après révélation au réactif de Neu sous UV à 365 nm.


Le spectre UV présente deux maxima d’absorption à 230 nm et 290 nm. Le spectre IR révèle

la présence de groupements hydroxyles (3500 cm-1), d’une fonction ester (1700 cm-1), d’une

fonction carbonyle (1616 cm-1) et d’un cycle aromatique (1550 cm-1, 1500 cm-1, 1455 cm-1).


Le spectre de masse haute résolution obtenu en ESI-Q-TOF-HRMS en mode positif donne un

ion quasi-moléculaire à m/z 479.2367 (calculé 479.2434) [M+H]+ qui correspond à une masse

moléculaire de 478 uma avec une formule brute de C29H34O6 (degré d’insaturation de 13).

L’étude du spectre de RMN du 1H (Fig 95) révèle la présence de :

-Deux signaux singulets à δH 12.23 ppm et 12.06 ppm caractéristiques de deux protons

phénoliques [Harborne, 1993].

-Un multiplet intégrant pour 5H entre δH 7.06 ppm et 7.12 ppm caractéristique du cycle B

d’un flavonoïde monosubstitué [Mabry et al., 1970].

-Deux signaux intégrant chacun pour 1H à δH 5.13 ppm et 5.55 ppm caractéristiques de deux

protons éthyléniques.

-Un singulet intégrant pour 3H à δH 4.03 ppm caractéristique d’un méthyle en position α

d’une fonction ester.

-Un singulet intégrant pour 3H à δH 3.79 ppm caractéristique d’un groupement méthoxyle

aromatique.


107

-Un singulet intégrant pour 3H à δH 1.90 ppm caractéristique d’un méthyle aromatique.

-Deux singulets intégrant pour 3H à δH 1.64 ppm et 1.73 ppm caractéristiques de deux

méthyles vinyliques.

Fig. 95: Spectre de RMN du 1H du composé Host6 (500 MHz, CDCl3).

De plus, le spectre RMN du 13C indique la présence de :

-Quatre méthylènes à δC 37.4 ppm, 37.3 ppm, 30.2 ppm, et 26.4 ppm.

-Deux groupements CH à δC 45.1 ppm et 51.5 ppm.

-Six carbones sp2 aromatiques attestant l’existence d’un second cycle aromatique.

L’ensemble de ces informations suggère que le composé Host6 est une « pseudo-chalcone »

dont le cycle B est non substitué, le cycle A totalement substitué et dont les groupements CH

α et β habituellement oléfiniques sont ici aliphatiques (δC 51.5 ppm et 45.1 ppm) laissant

supposer une substitution par un groupement prénylé (deux méthyles vinyliques, un proton

oléfinique et deux méthylènes). Cette hypothèse est confirmée par la comparaison des


108

données spectrales de la partie terpénée du composé Host6 avec les données de la (+-)-

nicolaiodésine C (Fig. 96) isolée des racines de Renealmia nicolaioides (Zingiberaceae) [Gu

et al., 2002].

OOH

OHO

Fig.96 : Structure de la (+-)-nicolaiodesin.

Remarque : la numérotation utilisé dans l’attribution des carbones est la même que celle

adoptée pour la (+-)-nicolaiodesine (nomenclature IUPAC).

Les différences principales concernent le cycle A. Les corrélations HMBC et NOESY vont

nous permettre dans un premier temps de positionner les différents substituants sur le cycle A.

Les corrélations observées en HMBC (Fig. 97) montrent que le carbone à δC 108.6 ppm

corrèlent avec les protons du méthyle aromatique à δH 1.90 ppm et les deux hydrogènes des

groupements phénoliques à δH 12.06 ppm et 12.23 ppm. Ces considérations nous permettent

d’attribuer ce carbone au carbone C-5 et les deux groupements phénols sont ainsi portés

respectivement par les carbones C-4 et C-6. De plus, la présence d’un second proton à δH

12.06 ppm (OH-4) suggère que le proton de ce phénol interagit par liaison hydrogène avec la

fonction ester à δC 170.9 ppm. Nous pouvons alors positionner cette fonction méthyle ester en

position C-3 sur le cycle A. Le dernier substituant : le groupement méthoxyle est donc en

position C-2.


109

OOH

HO

O O

O

2

3

4

56

6'

5'A

B

1'

Fig. 97: Corrélations observées en HMBC (ligne continue) et en NOE (ligne discontinue)

pour le composé Host6.

Concernant la position du substituant prénylé, des corrélations NOE sont observées entre les

protons du groupement méthoxyle et les protons H-5’ (δH 2.49 ppm) et H-6’(δH 4.21 ppm). La

chaîne prénylée est donc en position C-3’ comme dans la (+-)-nicolaiodesin.

La valeur de la constante de couplage J= 11 Hz pour H-1’ et H-6’ indique un couplage

TRANS diaxial entre les protons H-1’ et H-6’. La configuration relative du composé Host6 est

présentée Fig. 97.

L’ensemble des données précédentes nous permet d’identifier le composé Host6 comme étant

la (1’R*, 6’R*)-(4,6-dihydroxy-5-méthyl-3-methylester-2-méthoxyphényl)-(3’-isohexenyl-1’-

phénylcyclohex-3’-enyl) méthanone, nouveau composé naturel [Portet et al., 2007] (Fig. 97).


110

D. 5. 2. 4 Bilan des molécules isolées de type chalcone

Au total 2 chalcones (Host11 et Host12) et une « pseudochalcone » (Host6) ont été isolées.

L’originalité structurale de ces molécules réside dans la présence de substituants méthyles sur

les cycles aromatiques. Ces trois composés ont été découvertes pour la première fois dans le

genre Piper et le composé Host6 est une molécule nouvelle (en rouge dans les tableaux

suivants). Les déplacements chimiques relatifs aux atomes d’hydrogène et aux atomes de

carbone sont rassemblés dans les Tableaux 10 et 11 ci-dessous.

Host11 Host12 Host6300 MHz, CDCl3 300 MHz, acétone d6 500 MHz, CDCl3

H-2, H-3, H-5, H-6 7.19-7.27 m 7.39-7.44 m 1' 3.11 ddd (6.4, 10.6, 10.6)

H-4 7.63-7.66 m 7.70-7.72 m 2' 2.25 a

H-α 8.01 dd (15.6, 3) 8.03 dd (15.6, 4.1) 4' 5.55 br s

H-β 7.86 dd (15.6, 1.5) 7.76 dd (15.6, 2.4) 5' 2.49 a

(CH3)C-3' 2.16 s 2.05 s 6' 4.21 (5.4, 10.2, 10.2)

(CH3)C-5' 2.18 s / 7'a 2.12 a

H-5' / 6.18 s 7'b 2.03 a

OH-2' 13.61 s 13.5 s 8' 5.13 (6.8)

OCH3-4' 3.67 s 3.94 s 10' 1.64 s

11' 1.73 s

12' 2.05, 2.13 m

2"/6" 7.12 a

3"/5" 7.12 a

4" 7.06 a

OH-6 12.23 s

OH-4 12.06 s

OCH3-2 3.79 s

CH3-5 1.90 s

C=O(CH3)-3 4.03 s

a la mutiplicité n’est pas précisée car les signaux ne sont pas bien définis.

Tableau 10: Déplacements chimiques en RMN du 1H des composés

Host11, Host12 et Host6.


111

Host11 Host12 Host675 MHz, CDCl3 75 MHz, acétone d6 125 MHz, CDCl3

1 135.4 135.7 1 111.22/6 128.4 128.3 2 163.83/5 129.0 128.9 3 99.44 130.2 130.0 4 164.8α 128.8 127.8 5 108.6β 142.9 141.5 6 164.2C=O 193.4 192.4 7 210.81' 109.1 105.3 1' 45.12' 162.1 165.7 2' 37.33' 106.6 103.7 3' 137.44' 159.2 162.7 4' 118.95' 108.9 90.8 5' 30.26' 158.9 160.9 6' 51.5

CH3O 62.5 55.4 7' 37.4

(CH3)C-3' 7.6 6.2 8' 124.1

(CH3)C-5' 8.3 / 9' 131.7

10' 17.711' 25.812' 26.41" 143.82"/6" 127.53"/5" 128.14" 126.2

OCH3 65.2

(CH3)C-5 7.3

C=O 210.8OC=O 170.9

Tableau 11: Déplacements chimiques en RMN du 13C des composés

Host11, Host12 et Host6.


112

D. 5. 3 Détermination structurale des composés de type flavanone


Ce composé se présente sous la forme d’une poudre blanche. Il réagit positivement au réactif

de Neu en affichant une fluorescence jaune sous UV à 365 nm.


Son spectre UV présente deux maxima d’absorption à 234 nm et 295 nm correspondant à

l’absorption des cycles A et B d’un flavonoïde [Mabry et al., 1970]. Le spectre IR indique la

présence de groupements : hydroxyle (3435 cm-1), carbonyle (1635 cm-1) et aromatique (1580

cm-1, 1550 cm-1), ainsi que des bandes d’absorptions des liasons C-H aromatiques,

éthyléniques (3050-3100 cm-1) et aliphatiques (2978 cm-1, 2957 cm-1).

Spectrométrie de masse et spectrométrie de RMN

Le spectre de masse obtenu en APCI en mode négatif donne un ion m/z 391 [M-H]- qui

correspond à une masse de 392 uma. De plus, le spectre MS/MS (Fig. 98) révèle un ion m/z

321 indiquant une perte de 70 uma comme pour le composé Host7.

Fig 98 : Spectre MS/MS du composé Host1 enregistré en APCI en mode négatif.


113

Cette information suggère que le composé Host1 présente une sous-unité p-menthène comme

le composé Host7 (la méthyllindératine).

Le spectre de RMN du 13C (Fig. 98) indique la présence de 25 carbones dont 8 carbones

quaternaires, 11 groupements CH, 3 méthylènes et trois méthyles. Le composé Host1 a donc

une formule brute de C25H28O4 avec un degré d’insaturation de 12.

Parmi les 25 carbones, nous distinguons les 10 carbones de la sous-unité p-menthène (signaux

en rouge sur la Fig. 99) [Ichino et al., 1990]:

-Le groupement isopropyle : deux méthyles à δC 16.4 ppm (C-9’’), 21.7 ppm (C-10’’) et deux

groupements CH à δC 27.9 ppm (C-8’’) et 44.0 (C-4’’).

-Deux méthylènes à δC 22.0 ppm (C-5’’) et 30.6 ppm (C-6’’).

-La double liaison et le méthyle vinylique à δC 23.7 ppm (C-7’’), 141.0 ppm (C-1’’), 124.4

ppm (C-2’’).

-Un groupement CH allylique à δC 34.3 ppm (C-3’’).


114

Fig. 99 : Spectre de RMN du 13C du composé Host1 enregistré en J-modulé (100 MHz,

CDCl3).

De plus, le spectre RMN du 1H (Fig. 100) indique :

-Un singulet d’intensité 1H à δH 12.5 ppm caractéristique d’un proton d’un groupement

phénol qui réalise une liaison hydrogène avec une fonction carbonyle.

-Un massif d’intensité 5H entre δH 7.4-7.5 ppm caractéristique du cycle B non substitué d’un

flavonoïde [Mabry et al., 1970].

-Un singulet d’intensité 1H à δH 6.03 ppm caractéristique d’un proton du cycle A d’un

flavonoïde.

-Un doublet dédoublé d’intensité 1H à δH 5.4 ppm (J=12.9, 3.1 Hz).

-Un méthylène formant un système AB de deux dd à δH 3.09 ppm (J= 17.1, 12.9 Hz) et 2.83

ppm (J= 17.1, 3.1 Hz).


115

Fig. 100 : Spectre de RMN du 1H du composé Host1 (500 MHz, CDCl3).

Nous sommes donc en présence d’un flavonoïde dont le cycle B est non substitué et le cycle

A est tétrasubstitué. Les déplacements chimiques des groupements CH et CH2 sont identiques

aux déplacements des carbones en position C-2 et C-3 d’une flavanone [Mabry et al., 1970].

Les signaux de RMN du 1H décrits précédemment sont dédoublés (Fig. 100) mais leur

intégration démontre qu’il n’y a qu’un seul composé et que la sous-unité flavanone est sous

forme racémique.

Les spectres enregistrés en RMN 2D (COSY, HSQC et HMBC) confirment la présence d’une

génine flavanone de type pinocembrine [Miyakado et al., 1976] (présence de groupements

hydroxyles en position 5 et 7). Les corrélations observées en HMBC vont nous permettre de

relier la sous-unité flavanone et la sous-unité p-menthène.

Dans le spectre HMBC (Fig. 101), le proton du groupement phénol à δH 12.5 ppm (OH-5)

corrèle avec les carbones à δC 164.7 ppm (C-5), δC 110.3 ppm (C-6) et δC 102.6 ppm (C-10)

et le carbone à δC 110.3 ppm (C-6) corrèle avec le proton à δH 3.9 ppm (H-3’’). De la même

façon, le proton de l’autre groupement phénol à δH 6.92 ppm (OH-7) corrèle avec les carbones

à δC 161.2 ppm (C-7), et δC 110.3 ppm (C-6). Par conséquent, l’unité p-menthène est relié à la


116

génine flavanone au niveau du carbone C-6 en réalisant une liaison C-C entre le carbone C-6

de l’unité flavanone et le carbone C-3’’ de l’unité p-menthène.

Fig. 101 : Agrandissement du spectre HMBC du composé Host1.

La mesure du pouvoir rotatoire (αD= -32.5°, CHCl3, c=0.5) ainsi que les données précédentes

confirment que le composé Host1 est identifié comme étant la lindératone (Fig. 102) déjà

isolée des feuilles de deux variétés de Lindera umbellata (Lauraceae) [Ichino et al., 1990].

O

OOH

HO

5

7

1''

3''

5'' 8''

4'

Fig. 102 : Structure de la lindératone : Host1.


117

D.5.3.2 Détermination structurale du composé Host8


de Neu en affichant une fluorescence marron-orangé sous UV à 365 nm.


Les données spectrales en UV et en IR sont identiques au composé Host1.


Le spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif donne un ion quasi-moléculaire m/z

269 [M-H]- suggérant une masse moléculaire de 270 uma. L’étude du spectre de RMN du 13C

enregistré en J-modulé atteste la présence de 16 carbones dont 7 carbones quaternaires, 7

groupements CH, un méthylène et un méthyle. Par déduction, ce composé a une formule brute

de C16H14O4 avec un degré d’insaturation de 10.

Le spectre RMN du 1H révèle :

-Un groupement phénol à δH 12.35 ppm (liaison hydrogène avec une fonction carbonyle

aromatique). La position 5 est donc substituée par un phénol [Harborne, 1993].

-Un cycle aromatique monosubstituée entre δH 7.4-7.5 ppm correspondant au cycle B d’un

flavonoïde [Mabry et al., 1970].

-Un proton aromatique à δH 6.03 ppm correspondant au cycle A d’un flavonoïde

pentasubstitué [Mabry et al., 1970].

-Un groupement CH à δH 5.43 ppm correspondant au H-2 d’une flavanone [Mabry et al.,

1970].

-Un méthyle avec deux protons non équivalents à δH 3.10 ppm et 2.85 ppm correspondant aux

protons H-3 d’une flavanone [Mabry et al., 1970].


118

-Un méthyle aromatique à δH 2.09 ppm.

L’ensemble de ces informations indique que le composé Host8 est une flavanone dont le

cycle B est non substitué et le cycle A substitué par deux groupements OH et un méthyle. Les

corrélations observées en HMBC permettent de positionner les substituants sur le cycle A

(Fig. 103).

O

OOH

HO

H

5

7

2

3

Fig. 103 : Corrélations observées en HMBC pour le composé Host8.

Les informations précédentes ainsi que la mesure du pouvoir rotatoire confirme que le

composé Host8 est la 5,7-dihydroxy-6-méthylflavanone ou plus communément appelée

strobopinine déjà isolée des écorces de Piper hostmannianum [Diaz et al., 1987] (Fig. 103).


119


Ce composé se présente sous la forme de cristaux jaunes clairs. Il réagit positivement au

réactif de Neu pour afficher une fluorescence jaune sous UV à 365 nm.


Le composé présente les mêmes caractéristiques spectrales que le composé Host1.


Le spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif indique un ion m/z 283 [M-H]-

suggérant une masse de 284 uma. Il présente 14 uma de plus que le composé Host8 ce qui

permet d’attribuer au composé Host10 la formule brute C17H16O4 avec un degré

d’insaturation de 10.

La comparaison des spectres de RMN du 13C (Fig. 104) des composés Host10 et Host8

montre que les différences concernent la présence d’un méthyle aromatique et d’un carbone

quaternaire aromatique supplémentaires.

Fig. 104 : Comparaison des spectres du 13C des composés Host8 et Host10

(75 MHz, CDCl3).


120

Ainsi la position en C-8 est substituée par un second méthyle aromatique.

L’ensemble des données précédentes nous permet d’identifier le composé Host10 comme

étant la 6,8-diméthyl-pinocembrine (Fig. 105) déjà isolée des écorces de Piper

hostmannianum [Diaz et al., 1987] et de certaines plantes de la famille des Myrtaceae

[Mustafa et al., 2005].

O

OOH

HO

Fig. 105 : Structure de la 6,8-diméthylpinocembrine : Host10.


121

D.5.3.4 Détermination structurale du composé Host13


de Neu pour afficher une fluorescence jaune sous UV à 365 nm.


Les caractéristiques spectrales en UV et en IR sont identiques aux trois derniers composés. Il

s’agit donc d’un composé de type flavonoïde.


Le spectre de masse obtenue en APCI en mode négatif donne un ion m/z 285 [M-H]-

suggérant une masse de 286 uma. Le spectre RMN du 13C enregistré en J-modulé révèle 16

carbones dont 7 carbones quaternaires, 7 groupements CH, un méthylène et un méthyle.

L’ensemble de ces informations confère au composé Host13 la formule brute C16H14O5 avec

un degré d’insaturation de 10.

Le spectre de RMN du 1H présente (Fig. 106):

-Un proton d’un groupement phénol à δH 12.04 ppm (liaison hydrogène avec une fonction

carbonyle aromatique). La position 5 est donc substituée par un phénol [Harborne, 1993].

-Quatre protons du cycle B d’un flavonoïde entre δH 6.9 ppm et 7.4 ppm [Mabry et al., 1970]

qui apparaissent sous la forme de deux doublet intégrant chacun pour 2H à δH 7.36 ppm et δH

6.9 ppm avec une constante de couplage de 8.7 Hz. Le cycle B est donc parasubstitué par un

phénol en C-4’.

-Deux protons du cycle A d’un flavonoïde entre δH 6.0 et 6.5 ppm [Mabry et al., 1970] qui

apparaissent sous la forme de deux doublets dédoublés intégrant chacun pour 1H à δH 6.05

ppm et 6.09 ppm avec des constantes de couplage de 2.3 Hz et 0.7 Hz. Il s’agit respectivement

des protons H-6 et H-8 du cycle A d’un flavonoïde.


122

-Un proton à δH 5.37 ppm sous la forme de doublet dédoublé avec des constantes de couplage

de 13 Hz et 3 Hz. Il s’agit du proton H-2 d’une flavanone.

-Trois protons d’un méthoxyle aromatique sous la forme d’un singulet large à δH 3.8 ppm.

Comme le montre la Fig. 106, nous pouvons distinguer un doublet en haut du signal avec une

constante de 0.7 Hz. Ainsi, les protons du groupement méthyle couplent avec les protons H-6

et H-8 ce qui nous permet de positionner le méthoxyle en position 7 sur le cycle A.

Fig. 106 : Spectre RMN du 1H du composé Host13 (300 MHz, CDCl3).

Ainsi, l’ensemble de ces informations nous permet de dire que le composé Host13 est une

flavanone dont le cycle A est subsitué en 5 par un phénol et en 7 par un méthoxyle et dont le

cycle B est subsituée en 4’ par un phénol. L’étude des spectres RMN 2D (COSY, HSQC et

HMBC) confirme notre hypothèse.


123

Nous pouvons alors identifier le composé Host13 comme étant la 5,4’-dihydroxy-7-

méthoxyflavanone (Fig. 107) ou plus communément appelée sakuranetine déjà isolée des

feuilles de Piper aduncum [Dutta et Som, 1978].

O

OOH

O

OH

Fig. 107 : Structure de la 5,4’-dihydroxy-7-méthoxyflavanone (sakuranetine, composé

Host13).


124


Ce composé a été obtenu sous la forme d’une poudre jaune pâle. Il réagit positivement au

réactif de Neu pour afficher une fluorescence bleu sous UV à 365 nm.


Les caractéristiques spectrales en UV et en IR sont identiques aux quatre flavanones

précédemment décrites.


Le spectre de masse obtenu en APCI en mode négatif donne un ion quasi-moléculaire m/z 299

[M-H] - suggérant un masse de 300 uma. Le spectre RMN du 13C enregistré en J-modulé (Fig.

108) permet de déterminer la formule brute C17H16O5 avec un degré d’insaturation de 10.

La comparaison des spectre RMN du 1H et du 13C (Fig. 108) avec ceux du composé Host13

montre que le composé Host14 est une flavanone.

Fig. 108 : Comparaison des spectres RMN du 13C des composés Host13 (75 MHz, CDCl3) et

Host14 (125 MHz, MeOD).


125

Les seules différences concernent l’absence de proton phénolique vers δH 12 ppm et la

présence d’un second méthoxyle aromatique (δH 3.86 ppm, δC 54.9 ppm) pour le composé

Host14.

Le second méthoxyle aromatique est donc positionné en C-5 ce qui explique l’absence de

proton phénolique vers δH 12 ppm (impossibilité de réaliser une liaison hydrogène avec la

fonction carbonyle).

L’ensemble des informations précédentes nous permet d’identifier le composé Host14 comme

étant la 4’-hydroxy-5,7-diméthoxyflavanone (Fig. 109) déjà isolée de Baccharis latifolia

(Asteraceae) [Bohlmann et Ates, 1984; Bohlmann et al., 1979] mais c’est la première fois que

ce composé est isolée au sein du genre Piper.

O

OO

O

OH

Fig. 109 : Structure de la 4’-hydroxy-5,7-diméthoxyflavanone : Host14.


126


Ce composé se présente sous la forme d’une poudre jaune pâle. Il réagit positivement au





Spectroscopie de masse et de RMN


[M-H] - suggérant un masse de 300 uma. Il s’agit donc d’un isomère du composé Host15.

L’étude du spectre de RMN du 13C enregistré en J-modulé confirme la même formule brute

C17H16O5. Les spectres MS/MS des composés Host14 et Host15 sont présentés Fig. 110.

[M-H] -

[M-H-15]-[M-H-42]-

1,3B-

Spectre MS/MS de Host14

[M-H] -

[M-H-15]-[M-H-42]-

1,3B-


[M-H] -


[M-H-15]-

[M-H-30]-

[M-H-42]-1,3A- 1,2A-

[M-H] -


[M-H-15]-

[M-H-30]-

[M-H-42]-1,3A- 1,2A-

Fig. 110 : Spectres MS/MS des composés Host14 et Host15 obtenus en (-)-APCI.


127

Nous pouvons constater que deux ions fils sont communs aux deux composés. Il s’agit de

l’ion m/z 284 et m/z 257 qui correspondent respectivement à une perte de 15 uma et 42 uma.

La perte de 15 uma correspond à la perte d’un méthyle et la perte de 42 uma correspond à la

perte de C2H2O caractéristique de la fragmentation des flavanones [Fabre et al., 2001].

Le composé Host14 présente un ion fils majoritaire à m/z 119 caractéristique de la perte d’un

p-hydroxyphényléthène [Hanaee et al., 1997]. Or dans le cas du composé Host15, cet ion

n’apparaît pas, ce qui prouve qu’il n’y a pas de groupement OH en position 4’ sur le cycle B

comme pour le composé Host14. Néanmoins, nous avons deux ions fils à m/z 165 et m/z 178

qui correspondent aux fragments 1,3A- et 1,2A- déjà identifiés dans des flavanones dont le cycle

A est substitué par un groupement phénol et un groupement méthoxyle [Fabre et al., 2001].

L’ensemble de ces informations apportées par la spectrométrie de masse nous permet

d’envisager une flavanone dont le cycle A est substitué par un OH et un méthoxyle et dont le

cycle B est substitué par un méthoxyle (en tenant compte de la formule brute).

L’étude des spectres de RMN va nous permettre de confirmer cette hypothèse. Les spectres de

RMN du 1H et du 13C sont identiques à ceux du composé Host14 avec de légères différences

au niveau des déplacements chimiques (Fig. 111).

Fig. 111 : Comparaison des spectres de RMN du 13C des composés Host14 et Host15

(125 MHz, MeOD).


128

De plus, nous retrouvons, en plus des signaux des protons H-2 (δH 5.36 ppm) et H-3 (δH 2.68

ppm et 3.06 ppm) du cycle C:

-Aucun signal de proton phénolique vers δH 12 ppm.

-Quatre protons du cycle B entre δH 6.8 ppm et 7.3 ppm [Mabry et al., 1970] qui apparaissent

sous la forme de deux doublet intégrant chacun pour 2H à δH 7.33 ppm et δH 6.83 ppm avec

une constante de couplage de 8.7 Hz. Le cycle B est donc parasubstitué en C-4’.

-Deux protons du cycle A d’un flavonoïde entre δH 6.0 et 6.5 ppm [Mabry et al., 1970] qui

apparaissent sous la forme de deux doublets intégrant chacun pour 1H à δH 6.18 ppm et 6.20

ppm avec une constante de couplage de 2.3 Hz. Il s’agit respectivement des protons H-6 et H-

8 du cycle A.

-Deux groupements méthoxyles aromatiques à δH 3.85 ppm et 3.86 ppm, chacun sous forme

de singulet.

Ainsi, le composé Host15 est une flavanone dont :

-Le cycle A est substitué en C-5 et en C-7 par un groupement méthoxyle et un phénol.

-Le cycle B est substitué en C-4’ par un groupement méthoxyle.

Les spectres RMN 2D, COSY, HSQC et HMBC confirment cette hypothèse. L’ensemble des

données précédentes nous permet d’identifier le composé Host15 comme étant la 7-hydroxy-

4’,5-dimethoxyflavanone (Fig. 112) communément appelée tsugafoline déjà isolée des

feuilles de Tsuga diversifolia (Pinaceae) [Tanaka et al., 1989].

O

OO

HO

O

5

7

4'

Fig. 112 : Structure de 7-hydroxy-4’,5-dimethoxyflavanone : Host15.


129


Ce composé se présente sous la forme d’une poudre jaune pâle. Il réagit positivement au





Spectroscopie de masse et de RMN


[M-H] - suggérant un masse de 284 uma. Il s’agit donc d’un isomère du composé Host10.

L’étude du spectre RMN du 13C enregistré en J-modulé confirme qu’il s’agit d’une flavanone

avec la même formule brute que le composé Host10 : C17H16O4 avec un degré d’insaturation

de 10.

Le spectre de RMN du 1H montre :

-Aucun signal de proton phénolique vers δH 12 ppm.

-Un proton aromatique du cycle A à δH 6.15 ppm [Mabry et al., 1970].

-Le cycle B n’est pas substitué (massif intégrant pour 5H entre δH 7.36-7.54 ppm) [Mabry et

al., 1970].

-Un groupement méthoxyle aromatique à δH 3.81 ppm.

-Un méthyle aromatique à δH 2.02 ppm.


130

Ainsi, le composé Host16 est une flavanone dont le cycle B est non substitué et le cycle A

substitué par un groupement méthoxyle, un phénol et un méthyle aromatique. L’étude des

spectres RMN 2D va nous permettre de positionner les différents substituants.

L’étude des corrélations HMBC (Fig. 113) révèle que le carbone à δC 160.4 ppm corrèle avec

les protons du groupement méthoxyle. L’absence de protons phénoliques vers δH 12 ppm

confirme qu’il n’y a pas de groupement phénol en C-5. Ainsi, le groupement méthoxyle est en

position 5 sur le cycle 1 et le carbone à δC 160.4 ppm est attribué au carbone C-5. De plus le

carbone C-5 et le carbone à δC 163.4 ppm corrèlent avec le proton à δH 6.15 ppm. Ainsi, le

carbone à δC 163.4 ppm est attribué au carbone C-7. Les protons du méthyle aromatique à δH

3.81 ppm corrèle avec le carbone C-7 et les carbones à δC 162.4 ppm et δC 104.4 ppm ce qui

nous permet d’attribuer respectivement ces carbones à C-9 et C-8.

O

OO

HO

5

7

8

Fig. 113 : Corrélations HMBC observées pour le composé Host16.

L’ensemble des informations précédentes nous permet d’identifier le composé Host16 comme

étant la 7-hydroxy-5-méthoxy-8-méthylflavanone (Fig. 113) déjà isolée des feuilles de

Pityrogramma pallida (Adiantaceae) [Markham, 1987]. C’est la première fois que ce

composé est isolé au sein du genre Piper.


131

D. 5. 3. 8 Bilan des molécules isolées de type flavanone

Au total 7 flavanones ont été isolées dont l’originalité réside dans la présence de substituants

méthyles sur les cycles aromatiques pour trois d’entre elles (Host10, Host8 et Host 16). Les

déplacements chimiques en RMN relatifs aux atomes d’hydrogène et aux atomes de carbone

sont rassemblés dans les Tableaux 12 et 13 ci-dessous.

Host1 Host8 Host10 Host13 Host14 Host15 Host16

500 MHz, CDCl3 300 MHz, CDCl3 300 MHz, CDCl3 300 MHz, CDCl3 500 MHz, MeOD 500 MHz, MeOD 500 MHz, MeODFlavanoneH-2' - H-6' 7.4-7.5 m 7.4-7.5 m 7.4-7.44 m 7.36 d (8.6) 7.33 d (8.6) 7.43 d (8.6) 7.4-7.5 mH-3'- H-5' 7.4-7.5 m 7.4-7.5 m 7.4-7.44 m 6.90 d (8.6) 6.83 d (8.6) 7.00 d (8.6) 7.4-7.5 mH-4' 7.4-7.5 m 7.4-7.5 m 7.4-7.44 m / / / 7.4-7.5 mH- 2 5.43 dd (13, 3) 5.43 dd (13, 3) 5.43 dd (13, 3) 5.37 dd (13, 3) 5.36 dd (13, 3) 5.38 dd (13, 3) 5.45 dd (13, 3)H-3α 3.10 dd (17.1, 13) 3.10 dd (17.1, 13) 3.07 dd (17.1, 13) 3.10 dd (17.1, 13) 3.06 dd (17.1, 13) 3.08 dd (17.1, 13) 2.97 dd (17.1, 13)H-3β 2.84 dd (17.1, 3) 2.85 dd (17.1, 3) 2.87 dd (17.1, 3) 2.79 dd (17.1, 3) 2.68 dd (17.1, 3) 2.79 dd (17.1, 3) 2.77 dd (17.1, 3)H-6 / / / 6.09 dd (2.3, 0.7) 6.2 s 6.10 s 6.15 sH-8 6.04 s 6.03 s / 6.05 dd (2.3, 0.7) 6.19 s 6.11 s /OH-5 12.49 s 12.34 s 12.24 s 12.04 s / / /OH-7 6.93 s / / / / / /OCH3-5 / / / / 3.86 s 3.93 s 3.81 s

OCH3-7 / / / 3.83 d (0.7) 3.85 s / /

OCH3-4' / / / / / 3.88 s /

CH3-6 / 2.09 s 2.10 s / / / /

CH3-8 / / 2.09 s / / / 2.02 s

MonoterpeneH-2" 5.51 s large / / / / / /Ha-3" 3.90 d large / / / / / /

H-4" 1.56 m / / / / / /H-5" 1.45 m / / / / / /H-6" 2.15 m / / / / / /CH3-7" 1.80 s / / / / / /

H-8" 1.62 m / / / / / /CH3-9" 0.88 d (6.9) / / / / / /

CH3-10" 0.91 d (6.9) / / / / / /

Tableau 12 : Déplacements chimiques en RMN du 1H des composés Host1, Host8, Host10,

Host13, Host14, Host15 et Host16.


132

Host1 Host8 Host10 Host13 Host14 Host15 Host16125 MHz, CDCl3 75 MHz, CDCl3 75 MHz, CDCl3 75 MHz, CDCl3 125 MHz, MeOD 125 MHz, MeOD 125 MHz, MeOD

Flavanone2 79.1 79.2 78.7 79.1 78.9 78.6 78.53 44.75 43.5 43.6 43.3 44.8 44.9 45.04 195.9 195.9 196.4 195.9 191.0 190.7 191.15 164.7 162.6 157.6 164.2 168.8 162.8 160.46 110.3 104.0 103.0 95.2 93.6 92.8 92.17 161.2 160.6 160.9 168.1 162.4 162.4 163.38 96.6 94.8 102.0 94.3 92.4 95.7 104.49 162.0 103.0 159.6 162.9 165.5 165.3 162.410 102.6 161.7 102.9 103.2 105.2 104.3 104.21' 138.7 138.5 139.3 130.9 129.7 131.1 139.62' 128.9 128.9 128.6 128.6 127.6 127.5 128.33' 128.7 128.8 128.8 115.7 114.9 113.6 128.04' 126.2 126.2 125.9 156.0 157.6 159.9 125.85' 128.7 128.8 128.8 115.7 114.9 113.6 128.06' 128.9 128.9 128.6 128.6 127.6 127.5 128.3OCH3-5 / / / / 54.9 54.8 54.7

OCH3-7 / / / 55.8 54.3 / /

OCH3-4' / / / / / 54.3 /

CH3-6 / 6.7 7.7 / / / /

CH3-8 / / 6.9 / / / 6.6Monoterpene1" 141.0 / / / / / /2" 124.4 / / / / / /3" 34.3 / / / / / /4" 44.0 / / / / / /5" 22.0 / / / / / /6" 30.6 / / / / / /7" 23.7 / / / / / /8" 27.9 / / / / / /9" 16.4 / / / / / /10" 21.7 / / / / / /

Tableau 13 : Déplacements chimiques en RMN du 13C des composés Host1, Host8, Host10,

Host13, Host14, Host15 et Host16.


133

D. 6 Résultats des tests biologiques

D. 6. 1 Activités biologiques in vitro

L’ensemble des tests biologiques ont été effectuées à la plateforme de biologie de l’UMR-152

par Séverine Chevalley (Ingénieur en biologie) et par Eliane Pelissou (Technicienne en

biologie).

L’évaluation de l’activité antipaludique in vitro a été réalisée sur la souche chloroquino-

résistante FcB1. Les composés Host1 à Host9 ont également été testés sur la souche F32

chloroquino-sensible [Portet et al., 2007].

Les tests ont été effectués au moyen d’une technique radio-isotopique basée sur la méthode

décrite par Desjardins et al. |1979] et modifiée by Valentin et al. |1997]. Le test consiste à

utiliser comme indicateur de croissance des parasites, l’incorporation d’hypoxanthine tritiée

dans leur acide nucléïques. Les parasites sont maintenus en culture continue selon la méthode

décrite par Trager et Jensen [1976] (voir la partie Matériels et méthodes).

Le Tableau 14 présente les critères de sélection que nous avons choisis pour l’activité

antiplasmodiale (concernant des extraits) en fonction de la valeur de l’CI50 obtenue.

IC 50 en µg/ml Activité

<0.1 Très bonne

De 0,1 à 5 Bonne De 5 à 10 Modérée

>11 Inactif

Tableau 14 : Evaluation de l’activité antiplasmodiale en fonction de la valeur de l’CI50.

L’évaluation de la cytotoxicité a été réalisée sur une souche de cellules de tumeur mammaire

MCF-7. La méthode utilisée repose sur l’estimation de l’inhibition de la prolifération des

cellules par spectrophotométrie (voir la partie Matériels et méthodes). L’étude de la

cytotoxicité permet d’avoir des indications préliminaires sur la sélectivité des molécules. Le

Tableau 15 présenté à la page suivante résume les résultats in vitro sur l’ensemble des

composés isolés.


134

P. falciparum Cellules humaines IS FcB1b IS F32c

F32 (2) FcB1 (2)a MCF7 (2)

Host1

10.33 ± 0.18 15.06 ± 9.38 52.29 ± 1.80 3.47 5.06

Host2

101.27 ± 4.56 125.23 ± 28.05 242.64 ± 3.46 1.94 2.4

Host3

68.4 ± 3.33 79.01 ± 11.67 153.30 ± 116.74 1.94 2.24

Host4

126.75 ± 4.21 233.49 ± 3.33 137.97 ± 138.42 0.59 1.09

Host5

229.95 ± 1.67 / 229.95 ± 1.67 1 /

Host6

55.44 ± 7.40 60.67 ± 8.89 120.29 ± 125.74 1.98 2.17

Host7

5.64 ± 1.04 5.27 ± 2.24 68.63 ± 10.4 13.02 12.17

Host8

168.52 23.57 366.48 4.98 281.48 125.71 0.76 2.19

O

OHO

OH

O

OOH

O

O

OO

OH

H HO H

O

OO

OH

H HOH

O

O HO

OH

H O

OOH

HO O

O O

O

OH

OH

OH

H

O

OOH

HO

P. falciparum Cellules humaines IS FcB1b IS F32c

F32 (2) FcB1 (2)a MCF7 (2)

Host9

12.69 ± 0.26 16.91 ± 2.60 187.51 ± 109.18 11.09 14.78

Host10

/ 37.32 ± 6.97 161.97 ± 14.9 4.3 /

Host11

/ 12.4 ± 4.74 27.68 ± 7.35 2.23 /

Host12

/ 11.61 ± 6.47 20.77 ± 4.48 1.79 /

Host13

/ 86.54 ± 6.18 / / /

Host14

/ 80 ± 4.71 / / /

Host15

/ 96.66 ± 4.71 / / /

Host16

/ 73.94 ± 9.96 / / /

OH

O HO

O

O

OOH

HO

OOH

HO O

OO H

HO O

O

OOH

O

O H

O

OO

O

O H

O

OO

HO

O

O

OO

HO

Extrait hexanique (CI 50 en µg/ml) / 8 ± 1 25 ± 3 3.12 /

Extrait chloroformique (CI 50 en µg/ml) / 22 ± 3 / / /CQ (CI50 en nM) 60 ± 10 145 ± 10 ND ND ND

DOX ND ND 0,4 ND ND

Tableau 15: Résultats des activités biologiques in vitro (en µM) pour les extraits et les molécules isolées.


135

Comme le montre le Tableau 15, les molécules actives sur la souche FcB1 de P. falciparum

sont issues de l’extrait hexanique, il s’agit des composés Host1 (CI50= 5.9 µg/ml), Host7

(CI50= 2.15 µg/ml), Host9 (CI50= 4.6 µg/ml), Host11 (CI50= 4.7 µg/ml) et Host12 (CI50= 4.6

µg/ml). Nous n’avons pas concentré l’activité car les composés ont une activité proche de

celle de l’extrait hexanique de départ (CI50= 8 µg/ml). Nous pouvons supposer que l’activité

de l’extrait pourrait être due à la combinaison de plusieurs molécules ou à des composés

minoritaires présents dans l’extrait hexanique qui n’ont pas encore été identifiés.

L’activité antiparasitaire de flavonoïdes minoritaires C-alkylées ou C-prénylées a déjà été

reportée dans la littérature [Frölich et al., 2005; Yenesew et al., 2004] mais c’est la première

fois que des dérivés C-terpénés (Host1 et Host7) sont décrits comme possédant une activité

antiplasmodiale.

Les tests de cytotoxicité montrent que les composés actifs sont cytotoxiques surtout en ce qui

concerne les chalcones Host11 et Host12 qui ont des indices de sélectivité de l’ordre de 1.

D’autres auteurs ont démontré le potentiel cytotoxique du composé Host11 (avec des valeurs

de CI50 proches de celles obtenues dans le présent travail) sur des cellules cancéreuses KB.

[Qian et al., 2005] confirmant ainsi nos résultats.

De plus, le composé Host11 semblerait avoir un effet inhibiteur de la fonction MDR

(Multiple Drug Resistant) sur des cellules cancéreuses. Cet effet semble lié à une interaction

avec l’expression des ARN messagers des protéines MDR. D’autres pompes du même type

présentes chez le parasite pourraient être inhibées par Host11, on devrait aussi évaluer son

effet comme réverseur de la résistance à la chloroquine [Lakshmanan et al., 2005].

D. 6. 2 Activités biologiques in vivo

Les composés Host7 et Host9 sont les plus actifs in vitro et ont un indice de sélectivité

supérieur à 10. Ce potentiel (activité/sélectivité) nous a permis d’envisager un test in vivo

pour ces deux molécules [Likhitwitayawuid et al., 1993].

Le test utilisé est le test de Peters (voir partie Matériels et méthodes) qui consiste à inoculer

pendant quatre jours le produit à tester par voie intrapéritonéale à des souris infectées par P.

vinckei petteri [Peters, 1970].


136

Les résultats sont présentés dans le Tableau 16 suivant :

Traitement Dose na Parasitémie moyenne b Taux d'inhibition Temps moyen de(mg. Kg. J) (± ecart-type) de parasitémie b survie (en jour)

Témoin 10 38 ± 13.7 / 7.7 ± 1.4

Host7 20 5 7.8 ± 6.7 80% 11.1 ± 1.59

20 5 5.4 ± 6.6 90% 12.6 ± 6.8Host9 10 5 16 ± 20 72% 15.2 ± 7.1

1 5 34 ± 22 40% 13.8 ± 5.8

CQc 10 5 0 100% > 215 5 0 100% 13.5 ± 0.51 5 33 ± 14,4 13% 7.1 ± 1.1

a Nombre de souris par groupe.

b à J4.

C Chloroquine.

Tableau 16 : Résultats des tests in vivo des composés Host7 et Host9 sur des souris infectées

par P. vinckei petteri.

Nous observons une diminution significative de la parasitémie : 80% pour le composé Host7

(20 mg/kg) et entre 40% et 90% pour le composé Host9 au J5. Pour le composé Host9 qui a

pu être testé à trois concentrations nous observons un effet-dose, avec une ED50 de 3.8 mg/kg

qui est proche de celle de la chloroquine (3 mg/kg).

Pour le composé Host7, le temps de survie est de trois jours et demi de plus par rapport au

témoin DMSO. Concernant le composé Host9, aux deux doses les plus élevées (10 et 20

mg/kg), le temps de survie est équivalent à celui des souris traitées par la chloroquine à la

dose de 5 mg/kg.

Ces résultats sont particulièrement encourageants mais montrent que la guérison n’est pas

complète aux doses testées. Il serait intéressant de retester les deux composés à des doses

supérieures pour obtenir 100% d’inhibition de parasitémie et obtenir une guérison totale des

souris. Il serait aussi intéressant d’envisager un traitement par voie orale.

Ainsi, bien que les résultats in vitro montraient une faible sélectivité (> 10), il semblerait que

les deux composés ne soient pas particulièrement toxiques pour la souris. Ces résultats sont

probablement dus au choix des cellules MCF-7. En effet, ces cellules sont, par comparaison à

d’autres lignées (CHO, A375, etc.), peu sensibles à l’action de xénobiotiques. Elles forment


137

donc, en association avec la culture de P. falciparum un couple très sélectif en ce qui

concerne l’activité des produits.

Enfin, lorsque des tests in vivo sont réalisés, les composés sont métabolisés dans l’organisme

des souris avant d’atteindre la cible au niveau de la cellule, ce dernier point peut expliquer, en

partie les différences d’activités observées lors des test in vitro et in vivo.

D. 7 Bilan de l’étude phytochimique bioguidée de P. hostmannianum var.

berbicense

� Au total 17 molécules ont été isolées dont 3 chalcones, 7 dihydrochalcones et 7

flavanones. Cinq molécules sont nouvelles et présentent des structures originales

caractérisées par la combinaison d’une sous-unité dihydrochalcone et d’une sous-unité

terpénique.

� L’évaluation de l’activité antiplasmodiale des molécules isolées montre que les

molécules les plus actives ont des CI50 comprises entre 5 et 15 µM sur la souche FcB1

de P. falciparum.

� Deux molécules avec un indice de sélectivité égal ou supérieure à 10 ont pu être

évaluées in vivo sur des souris infectées par P. vinckei petteri et plus de 80%

d’inhibition de la parasitémie est observée après quatre jours de traitement. De plus, le

temps de survie des souris traitées par Host7 et Host9 est équivalent à celui des souris

traitées par la chloroquine à la dose de 5 mg/kg.


138

E. Etude de la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et

flavanones par spectrométrie de masse

Ce travail est le résultat d’un stage de deux mois effectué au sein du laboratoire CHAM (unité

d’analyse physico-chimique des médicaments et pharmacognosie) à la faculté de médecine de

l’université catholique de Louvain à Bruxelles. Il a été encadré par le Professeur Joëlle

Quetin-Leclercq et le Professeur Jean-Louis Habib-Jiwan.

Le but de ce stage était d’étudier la fragmentation des chalcones, dihydrochalcones et

flavanones identifiées dans les feuilles de P. hostmannianum var. berbicense à l’aide de

témoins commerciaux de structure voisine.

Une meilleure connaissance de la fragmentation de ces composés permettra de mieux les

identifier dans un extrait brut de plante par LC/MS. Cette application fera l’objet de la

prochaine partie de ce manuscrit.

E. 1 Travaux préliminaires

L’ensemble des spectres de masse a été obtenu sur un spectromètre de masse à trappe d’ions.

Après avoir étudié l’ionisation des composés en ESI et en APCI selon les deux modes

d’ionisation (positif et négatif), nous avons pu constater que les meilleurs résultats* sont

obtenus en APCI en mode négatif.

Les paramètres d’ionisation et les conditions expérimentales sont présentés dans la partie

Matériels et méthodes.

* Remarque : les molécules s’ionisent beaucoup mieux en APCI qu’en ESI. La fragmentation

des ions en MSn est plus facile à interpréter dans le cas du mode négatif. De plus, l’utilisation

du mode négatif est largement favorisée dans l’étude de la composition d’un extrait de plante

par LC/MSn car il conduit généralement à une meilleure sélectivité et une meilleure

sensibilité [Fabre et al., 2001; Wolfender et al., 2000].

Nous allons étudier la fragmentation de trois classes de flavonoïdes (chalcone,

dihydrochalcone et flavanone) en adoptant la nomenclature de Ma et al. [1997] que nous

appliquons au squelette chalcone et dihydrochalcone comme le montre la Fig. 114. Les


139

fragments obtenus sont de type A ou de type B (remarque : un fragment de type A correspond

à la perte du cycle B). L’exposant correspond à la coupure du (ou des) liaison(s) qui conduit à

l’obtention de ces fragments.

O

O

A

B

0 1

2

34

1,3 B-1,4 A-

1,3 A-

1,2 A-

0,3 A- R2

R1

O

A

B

R1

R2

01

2

3

0 A-

0 B-

1 A-

1 B-

2 A-

2 B-

Squelette flavanone Squelette (dihydro)chalcone

Fig. 114 : Nomenclature adoptée pour les fragments de type A ou B obtenus pour un squelette

flavanone ou un squelette (dihydro)chalcone.

En plus des fragments de type A ou B observés, nous parlerons de « perte de neutres ». Ce

terme considère les pertes de molécules neutres (CO, CO2, H2O) mais aussi les pertes de

radicaux (CH3 etc..).

Pour chaque classe de flavonoïde, un récapitulatif des ions significatifs sera établi en vue

d’élaborer (par MS et UV) une clé d’identification spécifique par type de flavonoïde étudié.


140

E. 2 Etude de la fragmentation des chalcones par (-)-APCI

L’ensemble des molécules étudiées est présenté dans le Tableau 17 suivant :

OOH

HO O

Host11 (284 g/mole)

OOH

HO O

Host12 (298 g/mole)

OOH

HO O

OO

Host6 478 g/mole

O

TémoinC1 (Chalcone 208 g/mole)

OOH

TémoinC2 (2’-hydroxychalcone 224 g/mole)

O

O

TémoinC3 (4’-methoxychalcone 238 g/mole)

Chalcones isolées Chalcones témoins

Tableau 17

Seules quatre chalcones sur six s’ionisent (Host6, Host11, Host12 et TémoinC2). Les

chalcones TémoinC1 et TémoinC3 s’ionisent difficilement en négatif du fait de l’absence de

groupements OH. Sur les quatre chalcones étudiées, la chalcone Host6 présente une structure

complexe dont la fragmentation sera étudiée de façon indépendante.

Le Tableau 18 résume les différents ions fragments obtenus pour les chalcones Host11,

Host12 et TémoinC2.


141

Molécules

Host12 Host11 TémoinC2Fragments

Energie de collision % 37% 37% 38%

Pertes de neutres

[M-H]- 283 (100) 297 (14) 223 (35)

[M-H-H2]-

281 (12) 295 (1) 221 (42)

[M-H-CH3]-

268 (88) 282 (100) /

[M-H-H2O]- / / 205 (14)

[M-H-CO]- 255 (4) 269 (1) 195 (100)

[M-H-CH3-CO]- 240 (6) 254 (4) /

[M-H-C2H2O]- 241 (21) 255 (2) /

[M-H-C2H2O-CH3]-

226 240 /

[M-H-C2H2O-CH3-CO]- 198 212 /

[M-H-CO2]-

239 (5) 253 (1) 179 (1)

Fragments de type A

0A- (perte de 130 uma) 153 (8) 167 (2) /

[1A - CH3]-(perte de 119 uma) 164 (38) 178 (26) /

1A- (perte de 104 uma) 179 (7) 193 (1) /

OOH

HO O

OOH

HO O

OOH

Remarque : les chiffres entre parenthèse correspondent au % relatif des ions sur le spectre MS2.

Tableau 18 : Bilan des ions fragments négatifs obtenus pour les chalcones Host11, Host12 et

TémoinC2 en (-)-APCI.

E. 2. 1 Fragments A ou B

Du fait de l’absence de substitution sur le cycle B pour ces composés, seuls des fragments de

type A sont obtenus, car ceux-ci s’ionisent très facilement (de part la présence de nombreux

substituants).

Deux fragments sont observés correspondant respectivement aux fragments 0A- et 1A-. De

plus une expérience de MS3 montre qu’un fragment de type [1A-CH3]- est obtenu après la

perte d’un groupement méthyle en MS2 comme le montre la Fig. 115.


142

OOH

OHO -H

m/z 283

OHO -H

m/z 179

-CH3

OOH

OHO -H

m/z 268

OHO -H

m/z 164

OH

OHO -H

m/z 153O

O

OO

MS2 MS2

MS2

MS3

0A- 1A-

[1A-CH3]-

Fig. 115 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host12 (fragments de type A).

Une expérience de MS3 nous a permis de conclure que la perte de 119 uma (Tableau 18)

correspond à une perte successive de CH3 suivi d’une perte de 104 uma (vinylbenzene).

Ainsi, une perte de 104 (vinylbenzene) nous permet de conclure à l’absence de substituant sur

le cycle B.

Concernant le TémoinC2, aucun fragment de type A ou B n’est observé en mode négatif.

E. 2. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutres

En plus des clivages conduisant à une perte du cycle B, de petites pertes de neutre sont

observées (CO, H2, H2O, CH3).

La perte de CO conduit en MS2 à l’ion fils majoritaire pour le TémoinC2. Cette perte est

communément rencontrée pour les chalcones avec un groupement hydroxyle [Zhang et

Brodbelt, 2003]. Pour les chalcones méthoxylées Host11 et Host12, la perte dominante en

MS2 est celle du radical méthyle alors que la perte de CO est observée seulement en MS4. Elle

n’intervient qu’après la perte de C2H2O et de CH3 (Tableau 18 : [M-H-C2H2O-CH3]- et [M-

H-C2H2O-CH3-CO]-).


143

Une perte de 42 uma est également observée et elle correspond à la perte de C2H2O, déjà

obtenue pour d’autres flavonoïdes [Fabre et al., 2001] et certaines chalcones [Zhang et

Brodbelt, 2003] en ESI en mode négatif. La structure que nous proposons ici est la même que

celle proposée par Fabre et al. [2001] (Fig. 116) pour les flavanones. Cependant sa formation

devient plus complexe de part la nécessité de deux coupures de liaisons alors que pour les

flavanones, la présence du cycle C facilite la contraction de cycle.

Enfin, la perte de CO2 est très peu observée, les ions correspondant de faible intensité (voir

Tableau 18) ne sont pas significatifs.

Fig. 116 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host11

(Fragments de type A et perte de neutres). L’ion fragment en rouge correspond au fragment

majoritaire observé en MS2.

OOH

OHO

-H

m/z 283

OOH

OHO

m/z 268

-H

A B

-CH3

OH

HO

m/z 240-CO

-H

O

HO O

-H

-C2H2O

m/z 241

O

OHO -H

m/z 226

-CH3 -CO

OHO

m/z 198

-HO

HO O

-H

m/z 164

OO

OH

OHO

m/z 153

-H

OHO -H

m/z 179

OO

HO O

-H

m/z 164

OO

HO O-H

-CO2

m/z 135

-CH3

MS2

MS2

MS2

MS2

MS3

MS3

MS3

MS3

MS3

MS4

0A-

1A-


144

E. 2. 3 Cas particulier de la chalcone Host6

Le schéma de fragmentation proposé est représenté Fig. 117. Les principales fragmentations

concernent la perte de la fonction méthyle ester qui se produit suite à une perte successive de

méthanol et de CO2 pour donner les ions m/z 445 et m/z 401. De plus, de part la présence d’un

cyclohexène, une réaction de type rétro Diels-Alder a lieu conduisant à la chalcone

correspondante (m/z 341) suite à la perte du dérivé myrcène (76 uma). Ainsi les principales

fragmentations sont dues à des pertes de neutre (CH3OH, CH3, CO2 etc..) plutôt que des

fragments de type A ou B.

O

O

O O

OH

HO

OOH

O

-32

-CH3OH

m/z 477

m/z 445

-H

-H

-44

-C02

OOH m/z 401

-H

OOH

O

m/z 361

-H

-C6H12

OOH

HO O

O

m/z 341

-H

RDA

O

-C10H16

-CO2 m/z 317

OOH

O

m/z 361

-H

O

O

O

O

O

O

O

OOH

O

-H

-C6H12

MS2

MS2

MS2

MS3

MS2 MS4

Fig. 117 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host6. (Fragments de type A

et perte de neutres). L’ion fragment en rouge correspond au fragment majoritaire observé en

MS2.

E. 2. 4 Bilan : clé d’identification des composés de type chalcone

L’étude de la fragmentation des chalcones isolées ainsi que de leurs témoins commerciaux

nous permet d’établir une clé d’identification de cette classe de flavonoïdes.


145

- En spectroscopie UV, deux maxima d’absorptions sont observés vers 300 nm et 340

nm qui correspondent respectivement au cycle A et au cycle B conjugué (unité

vinylbenzene) [Harborne, 1993; Mabry et al., 1970]. L’UV permet de présumer le

squelette chalcone.

- En spectroscopie de masse :

� Deux fragments de type A sont caractéristiques, il s’agit des fragments 0A- et 1A- indiquant la présence de substituants sur ce cycle. De façon similaire,

l’absence de fragment de type B nous informe de l’absence de substituants sur

le cycle B. La masse des fragments 0A- et 1A- renseigne sur la nature et le

nombre de substituants sur le cycle A.

Une perte de 104 uma indique une absence de substitution sur le cycle B.

� Une perte de CO (28 uma) majoritaire en MS2 nous informe de la présence de

groupements hydroxyles. De manière équivalente, une perte de 15 uma en MS2

correspondant à la perte d’un groupement méthyle nous permet d’identifier de

façon significative une chalcone méthoxylée.

� La perte de CO2 en MS2 est très faible voire inexistante pour les chalcones.


146

E. 3 Etude de la fragmentation des dihydrochalcones par (-)-APCI

L’ensemble des molécules étudiées sont présentées dans le Tableau 19. Nous pouvons

distinguer :

-Quatre dihydrochalcones monoterpénées isolées (Host2, Host3, Host5 et Host7 sans

compter le composé Host4 qui est un stéréoisomère de Host3).

-Une dihydrochalcone simple (Host9).

-Une dihydrochalcone témoin notée TémoinDC.

O

OOH

O

O

OO

OH

H HOH

Host2 (408 g/mole) Host3 (424 g/mole)

O

OHO

OH

H O

O

OH

OH

OH

H


OH

OHO

O

Host9 (272 g/mole)

OH

OHO

O

O

TémoinDC (302 g/mole)

Dihydrochalcones monoterpénées isolées Dihydrochalcone isolée

simple

Témoin dihydrochalcone

simple

Tableau 19

De façon générale, l’ensemble des molécules s’ionisent bien en négatif. Cependant les

dihydrochalcones substituées par des monoterpènes saturés étaient très instables dès

l’expérience de MS3. Seuls les spectres en MS2 ont pu être enregistrés ce qui est insuffisant

pour comprendre la fragmentation de ces composés. Des pertes communes sont observées


147

mais leur interprétation est difficile et les propositions de structure ne sont toujours pas

élucidées. Le Tableau 20 résume les différents fragments obtenus pour l’ensemble des

dihydrochalcones :

Tableau 20 : Bilan des ions fragments négatifs obtenus pour les dihydrochalcones étudiées en

(-)-APCI.


148


Nous n’observons que des fragments de type A même pour la dihydrochalcone TémoinDC

qui présente un méthoxyle sur le cycle B.

Deux fragments sont observés correspondant respectivement aux fragments 0A- et 1A-. De

plus, une expérience de MS3 montre qu’un fragment de type [1A-CH3]- est obtenu après la

perte d’un groupement méthyle en MS2 (Fig. 118) comme dans le cas des chalcones (voir Fig.

115). Ce fragment [1A -CH3]- est le plus abondant des fragments de type A.

OOH

OHO -H

m/z 271

-CH3

OOH

OHO -H

m/z 268

OHO-H

m/z 152

OH

OHO -H

m/z 139

O OH

OO

-Hm/z 165

OH

O

MS2 MS2

MS2

0A- 1A-

1A--CH3

MS3

Fig. 118 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host9 (fragments de type A).

Pour les dihydrochalcones monoterpénées, nous avons en plus une coupure au niveau des

liaisons reliant la sous-unité dihydrochalcone à la sous-unité monoterpénique (voir Tableau

20). Cette information nous permet d’identifier la masse du monoterpène.

E. 3. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutres

En plus des clivages conduisant à une perte du cycle B, de petites pertes de neutres sont

observées (H2O, CO, CH3).

La perte de neutre majoritaire est la perte d’H2O dont le schéma de fragmentation a déjà été

proposé pour les chalcones en APCI en mode positif [Tai et al., 2006] mais jamais pour les

dihydrochalcones.


149

Nous proposons une structure (voir Fig. 119) où la perte d’H2O est due à un substituant OH

du cycle A et à un H du groupement CH2-β. Nous obtenons alors une structure pentacyclique.

Ainsi, la perte d’H2O ne peut pas faire intervenir le carbonyle (comme le propose Tai et al.

[2006] en APCI en mode positif) car une expérience de MS4 montre qu’il y a perte de CO

après pertes successives d’H2O et de CH3 (Fig. 119).

OOH

O OH

-H

m/z 271

OOH

O

-H

m/z 253

-H2O

OOH

O

-H

m/z 238

-CH3

OH

O

-H

m/z 210

-18 -15

-CO-28

A B

MS2 MS3

MS4

Fig. 119 : Schéma de fragmentations proposé pour la perte d’H2O pour le composé Host9.

L’ion fragment en rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2

Nous observons également une perte de CH3 (Fig. 119) mais elle est observée en MS3 après

une perte d’H2O et non en MS2 comme dans le cas des chalcones (voir Fig. 116).

Enfin, aucune perte de CO, de CO2 ou de C2H2O n’est observée pour l’ensemble des

dihydrochalcones étudiées.

En ce qui concerne les dihydrochalcones monoterpénées, une grande énergie de collision est

nécessaire pour réaliser la fragmentation des ions en MS2. En plus des pertes précédentes

deux pertes de neutre de 58 uma (C4H10 ou C3H6O, [De Hoffmann et al., 1999]) et 72 uma

(C2O3, [De Hoffmann et al., 1999]) sont observées mais leurs localisations n’ont pu être

expliquées.


150

E. 3. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type dihydrochalcone

L’étude de la fragmentation des dihydrochalcones isolées ainsi que de leurs témoins

commerciaux nous permet d’établir une clé d’identification de cette classe de flavonoïdes.


nm qui correspondent respectivement au cycle A et au cycle B [Harborne, 1993;

Mabry et al., 1970].


� Deux fragments de type A sont caractéristiques, il s’agit des fragments 0A- et 1A- indiquant la présence de substituants sur ce cycle. La masse des fragments 0A- et 1A- renseigne sur la nature et le nombre de substituants sur le cycle A.

� Une perte d’H2O (18 uma) majoritaire observée en MS2 indique la présence

d’un groupement OH sur le cycle A (nécessaire à l’obtention de la structure

pentacyclique). De manière équivalente, une perte de 15 uma en MS3

correspond à la perte d’un groupement méthyle nous permettant d’identifier de

façon significative une chalcone méthoxylée.

� Aucune perte de CO, CO2 ou C2H2O n’est observée en MS2 pour les

dihydrochalcones.


151

E. 4 Etude de la fragmentation des flavanones par (-)-APCI

L’ensemble des flavanones étudiées sont présentées dans le Tableau 21 :

O

OOH

HO

O

OOH

HO

Host1 (392 g/mole) Host8 (256 g/mol)

O

OOH

HO

O

OOH

O

OH


O

OO

O

OH

O

OO

HO

O


O

OOH

O

Host16 (284 g/mole)

O

OOH

HO O

O

TémoinF1 (256 g/mole) TémoinF2 (224 g/mole)

O

O

HO O

O

O

TémoinF3 240 g/mole TémoinF4 (254 g/mole)

O

OO

O

OO

O

TémoinF5 (254 g/mole) TémoinF6 (284 g/mole)

O

O

OH

O

TémoinF7 (270 g/mole)

Flavanones isolées Témoins flavanones

Tableau 21

Toutes les molécules ont pu être détectées en mode négatif même la flavanone TémoinF2 qui

ne possède pas de substituant hydroxyle. Le Tableau 22 suivant résume les différents

fragments obtenus pour l’ensemble des flavanones.


152

Molécules Host1 Host8 Host10 Host13 Host14 Host15% d' énergie de collision 44 44 37 33 33 42Fragments

Perte de neutres

[M-H]- 391 (100) 269 (80) 283 (100) 285 (1) 299 (100) 299 (100)

[M-H-H2]- / / 281 (21) / 297 (3) /

[M-H-CH3]-

/ / / 284 (5) 284 (61)

[M-H-CO]- / 241 (27) 255 (13) / / /

[M-H-CO2]-

/ 225 (70) 239 (7) / 255 (2) 255 (4)

[M-H-H2O]- 373 (3) 251 (11) / / / /

[M-H-C2H2O]- 349 (31) 227 (100) 241 (20) / 257 (6) 257 (6)

[M-H-C2H2O-CO]- 321 199 213 / / /

[M-H-C3O2]-

323 (33) 201 (7) / / / /

[M-H-C2H2O-CO2]-

305 183 (17) / / / /

[M-H-C2H2O-CH3]- / / / / / 242 (3)

[M-H-CH3-CH3]-

/ / / / 269 (1) 269 (16)

[M-H-CO-CH3]-

/ / / / / /

[M-H-CH3-CO]- / / / / / 256 (6)

[M-CH3-H2O]- / / / / / /

[M-H-CH3-CH3-CO]- / / / / / /

[M-H-CH3-CH3-CO2]-

/ / / / / /

Fragments

1,3A- 287 (11) 165 (34) 179 (3) 165 (100) / 165 (19)

1,3A--CO2 / 121 (5) 135 (1) 121 (1) / /

1,2A- / 178 (21) 192 (7) / / 178 (24)

1,4A- / / / / / /

0,3A- / / / 150 (3) / /

[M-H-cycle B]- / / 205 (2) 191 (8) / /

1,3B- / / / 119 (4) 119 (60) /

O

OOH

HO O

OO

HO

O

O

OO

O

OH

O

OOH

O

OH

O

OOH

HOO

OOH

HO

Host16 TémoinF1 TémoinF2 TémoinF3 TémoinF4 TémoinF5 Témoi nF637 44 37 37 37 40 37

283 (100) 255 (100) 223 (100) 239 (96) 253 (46) 253 (8) 283 (16)

281 (46) / 221 (23) / / / /

268 (61) / / / 238 (100) 238 (4) 268 (18)

255 (2) 227 (3) 195 (63) / 225 (2) 225 (100) 255 (100)

239 (2) 211 (37) 179 (1) / / / /

/ / 205 (10) / / / /

241 (74) 213 (64) / 197 (100) / / /

213 185 / 169 / / /

/ 187 (1) / / / / /

/ 169 / / / / /

226 / / / / / /

/ / / / / / 253 (12)

/ / / / / 210 (1) 240 (3)

/ / / / / / /

/ / / / / /

/ / / / / / 225

/ / / / / / 209

179 (14) 151 (23) / 135 (11) / / /

135 (2) 107 (3) / 91 (1) / / /

/ / / 148 (3) / / /

153 (1) / / / / 123 (3) 153 (4)

164 (14) / / / / / /

/ / 145 (2) / / / /

/ / / / / / /

O

OO

HO O

OOH

HO O

OO

O

O

O

OO

OO

O

HO O

O

O

TémoinF742

269 (45)

/

254 (100)

/

/

251 (63)

/

/

/

/

/

/

/

226 (18)

236 (24)

/

/

165 (26)

121 (2)

/

/

/

191 (4)

/

O

O

OH

O

Remarque : les chiffres entre parenthèse correspondent au % relatif des ions sur le spectre MS2.

Tableau 22


153


Les différents clivages des liaisons observés sont représentés Fig. 120 selon la nomenclature

adopté par Ma et al. [1997].

O

O

A

B

0 1

2

34

1,3 B-1,4 A-

1,3 A-

1,2 A-

0,3 A- R2

R1

Fig. 120 : Nomenclature des fragments obtenus pour les flavanones en (-)-APCI.

Comme le montre le Tableau 22 et la Fig. 120, la majorité des fragments observés sont des

fragments de type A. Pour les fragments de type B, seules les flavanones porteuses de

substituants hydroxyles sur le cycle B donnent des fragments B (voir Tableau 22). En effet,

la perte de 119 uma est caractéristique de flavanones substituées par un hydroxyle sur le cycle

B (Host13 et Host14).

Ces différents clivages ont déjà été observés et étudiés pour les flavones, flavonols et

flavanones par Fabre et al [Fabre et al., 2001].

E. 4. 2 Fragments obtenus suite à des pertes de neutre

En plus des clivages conduisant à une perte du cycle B, de petites pertes de neutre sont

observées (H2, H2O, CO, CO2 etc.).

Des pertes d’H2 et d’H2O sont observées mais il est difficile d’établir un schéma de

fragmentation car ces pertes ne sont observées que pour certaines flavanones.

Des pertes de CO, CO2 et C2H2O sont observées pour l’ensemble des composés. Au moins

une des trois pertes a lieu sauf dans le cas du composé Host13 (voir Tableau 22) où il n’y a


154

qu’un fragment majoritaire qui correspond au fragment 1,3A-. Ces trois pertes de neutres ont

lieu au niveau du cycle C (voir Fig. 121: exemple avec la strobopinine, Host8).

O

OOH

HO

m/z 269

-H

-H

OH

HO O

m/z 241

-CO

-C2H2O

OH

HO O -H

-CO2

O -H

m/z 183

m/z 227

O -H

m/z 199

HO

-CO

-CO2

OH

HO

-H

m/z 225

MS2

MS2

MS2

MS3

MS3

Fig 121 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host8 (strobopinine). L’ion

fragment en rouge correspond au fragment majoritaire obtenu en MS2.

Dans le cas des flavanones méthoxylées, la perte de CH3 reste en général relativement

minoritaire par rapport aux autres pertes de neutre que sont les pertes de CO, CO2 ou C2H2O

sauf dans le cas de la pinocembrine méthoxylée (TémoinF7) et de la 4’-méthoxyflavanone

(TémoinF4).

E. 4. 3 Bilan : clé d’identification des composés de type flavanone

L’étude de la fragmentation des flavanones isolées ainsi que de leurs témoins commerciaux

nous permet d’établir une clé d’identification de cette classe de flavonoïdes.


nm qui correspondent respectivement au cycle A et au cycle B [Harborne, 1993;

Mabry et al., 1970]. Ainsi les dihydrochalcones et les flavanones présentent les


155

mêmes maxima d’absorption mais les fragments obtenus en spectrométrie de masse en

(-)-APCI vont nous permettre de différencier les deux types de noyaux flavonoïdiques.


� Les fragments de type A les plus rencontrés sont les fragments 1,3A- (le plus

abondant) et 1,2A- qui nous renseignent sur la nature et le nombre de

substituants sur le cycle A. En ce qui concerne les fragments de type B, une

perte de 119 uma est caractéristique d’un parahydroxyphénol sur le cycle B

(1,3B-).

� En MS2, les pertes les plus importantes sont les pertes de 28 uma (CO), 44 uma

(CO2) et 42 uma (C2H2O) qui ont lieu au niveau du cycle C du noyau

flavanone. Dans le cas de flavanones méthoxylées, la perte de 42 uma (C2H2O)

est plus abondante que la perte de 15 uma (CH3).

E. 5 Comparaison de la fragmentation des dérivés chalcones et

dihydrochalcones en APCI en mode négatif

� Comparaison des fragments A ou B obtenus

Les coupures observées pour les chalcones et leurs équivalents hydrogénés sont identiques.

Trois fragments de type A sont obtenus. Il s’agit des fragments 0A- et 1A- et [1A-CH3]-. Nous

pouvons constater qu’aucun clivage n’a lieu entre les carbones α et β.

� Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres

Pour les chalcones, la perte prépondérante est la perte de CH3 (dans le cas des dérivés

méthoxylés uniquement) et nous pouvons observer des pertes de CO, CO2 et C2H2O.

Dans le cas des dihydrochalcones, la perte prédominante est la perte d’H2O même dans le cas

de composés méthoxylés, et aucune perte de CO, CO2 ou C2H2O n’est observée directement.

La perte de CO est observée seulement en MS4 après perte successive d’H2O et de CH3.


156

Ainsi, les chalcones et les dihydrochalcones ont tendance à se fragmenter de la même façon

sauf en ce qui concerne les pertes de neutre qui sont radicalement différentes. De plus en

spectroscopie UV, les deux noyaux présentent des maxima d’absorption différents de part la

présence d’une double liaison conjuguée dans le cas des chalcones.

Nous allons maintenant comparer la fragmentation des chalcones/dihydrochalcones par

rapport à celle des flavanones.

E. 6 Comparaison de la fragmentation des chalcones/dihydrochalcones et

flavanones par APCI en mode négatif

� Comparaison des fragments obtenus A ou B obtenus

En comparant les coupures observées pour les trois génines, nous pouvons considérer que les

fragments 0A- et 1A- des chalcones et dihydrochalcones sont équivalents aux fragments 1,4 A-

et 1,3 A- obtenus dans le cas des flavanones comme le montre la Fig. 122 :

O

O

A

B

0 1

2

34

1,4 A-

1,3 A-

R2

R1

O

OH

R1 R2

0A-

1A-

0 1 2 3

Fig. 122

Néanmoins, les flavanones présentent des fragments A ou B supplémentaires dû à la présence

du cycle C (voir Fig. 120). Ce sont essentiellement des différences au niveau des pertes de

neutre (paragraphe suivant) qui permettent de distinguer les deux génines.


157

De plus, en spectroscopie UV, les chalcones ont des absorptions différentes des flavanones et

des dihydrochalcones [Harborne, 1993; Mabry et al., 1970].

� Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutres

Le même type de pertes de neutres est observé pour les flavanones et les chalcones en ce qui

concerne les pertes de CO, CO2, C2H2O et CH3. Cependant nous avons des différences

d’intensité. En effet, si nous prenons l’exemple de la chalcone Host12 et de la flavanone

Host16 qui sont des isomères, les mêmes ions fragments sont obtenus (voir Fig. 123). Nous

retrouvons notamment les ions fils m/z 268 et m/z 241 qui correspondent respectivement à des

pertes de 15 uma et 42 uma que nous attribuons à des pertes de CH3 et de C2H2O.

Fig. 123 : Comparaison des spectres MS2 des composés Host12 et Host16 obtenus

en (-)-APCI.

Ainsi nous pouvons constater que dans le cas des chalcones, la perte de CH3 est majoritaire

par rapport à la perte de C2H2O et inversement pour les flavanones.

Ce phénomène peut s’expliquer en considèrant que la perte de C2H2O conduit à la même

structure pour les deux types de génine (Fig. 123). La formation de ce fragment est difficile à

réaliser dans le cas des chalcones car cela nécessite la coupure de deux liaisons covalentes.

Ainsi cette constatation nous permettra de distinguer la génine flavanone de la génine

chalcone dans l’identification de nouveaux composés présents dans un extrait.


158

E. 7 Comparaison de la fragmentation des chalcones et des flavones en

spectrométrie de masse (techniques d’ionisation douces)

La fragmentation des flavones n’a pas été étudiée lors de ce stage mais il est important

d’étudier les différences de fragmentation entre les chalcones et les flavones en spectrométrie

de masse. En effet, les deux types de noyaux présentent les mêmes maxima d’absorption en

spectroscopie UV, ainsi, lors de l’étude d’un extrait par LC/DAD/MSn, seule l’étude des

spectres de masse nous permettra de différencier les deux types de noyaux flavonoïdiques.

La fragmentation des flavones a été étudiée en ESI en mode négatif par le Dr. Nicolas Fabre,

Maître de conférences au sein de l’UMR-152.

Nous nous sommes donc basés sur les travaux de Fabre et al. [2001] pour établir une

comparaison de fragmentations entre les chalcones et les flavones.

� Comparaison des fragments A ou B obtenus

Les flavones présentent les mêmes fragments de type A ou B observées pour les flavanones

(Fig. 120). Le fragment majoritaire obtenu est le fragment 1,3A- qui est équivalent au fragment 1A- observé dans le cas des chalcones (Fig. 122).

� Comparaison des fragments obtenus suite à des pertes de neutre

De façon générale, les flavones présentent des pertes de CO, de CO2 et de C2H2O. La perte de

CO2 est très souvent la perte majoritairement observée [Fabre et al., 2001]. Cependant dans le

cas des flavones méthoxylées, un seul fragment est obtenu correspondant à la perte d’un

radical méthyle et aucune autre perte de neutre n’est observée [Fabre et al., 2001].

Dans le cas des chalcones, la perte de CO2 est très faible voire inexistante. Dans le cas des

chalcones méthoxylées, la perte du radical méthyle est la perte majoritaire observée, mais

d’autres pertes de neutres sont également obtenues, notamment la perte de C2H2O (perte de 42

uma) (Fig. 123). Ainsi l’étude des pertes de neutre nous permettra de différencier un dérivé

chalcone d’un dérivé flavone.


159

E. 8 Conclusion de l’étude de la fragmentation des chalcones,

dihydrochalcones et flavanones par (-)-APCI

Le Tableau 23 suivant récapitule l’ensemble des critères permettant l’identification des

chalcones, dihydrochalcones, flavanones mais aussi des flavones en tenant compte de la

spectroscopie UV et des ions significatifs obtenus suite à une fragmentation par MSn en (-)-

APCI et (-)-ESI (pour les flavones) [Fabre et al., 2001].

Flavonoïde

Chalcone Flavone Dihydrochalcone Flavanone

Spectroscopie UV

maxima d'absorptions 300 nm et 340 nm 300 nm et 340 nm 230 nm et 290 nm 230 et 290 nm

Spectroscopie de masseAPCI en mode négatif

Fragments de type A ou B 0A- , 1A- 1,3A- 0A- , 1A- 1,3A- et 1,4A-

[1A-CH3]- (le plus abondant) (le plus rencontré) [1A-CH3]

- (le plus abondant) (les plus rencontrés)

Perte de neutre majoritaire perte de CH3 (15 uma) perte de CO2 perte d'H2O (18 uma) perte de CO (28 uma)

(en MS2) perte de CH3 ou de CO2 (44 uma)

(pour dérivé méthoxylé) ou de C2H2O (42 uma)

perte de C2H2O (42 uma) perte de 33 uma perte de C2H2O (42 uma)

/ (perte d'H2O+perte de CH3)

Autres pertes de neutre

significatives (en MS 2)(flavonoïdes méthoxylées) perte de CH3 (15 uma) perte de C2H2O (42 uma)

plus abondante que la / / plus abondante que la

perte de C2H2O (42 uma) perte de CH3 (15 uma)

O

AR

B R'

O

AR

B R'

O

AR

B R'

O

O

AR

B R'

O

Tableau 23 : Clés d’identification des noyaux chalcones, dihydrochalcones, flavanones et

flavones par spectroscopie UV et spectroscopie de masse en (-)-APCI.

Ce travail nous a permis d’établir « une clé d’identification » regroupant des ions significatifs

pour chaque type de génine.

Nous allons maintenant étudier l’application de ces résultats à l’étude par LC/DAD/(-)-APCI-

MSn de l’extrait acétate d’éthyle de Piper hostmannianum var. berbicense.


160

F. Etude par LC/DAD/(-)-APCI-MS n de l’extrait acétate d’éthyle

de feuilles de Piper hostmannianum var. berbicense

Nous avons choisi d’identifier les principaux composés présents dans l’extrait acétate

d’éthyle de Piper hostmannianum var. berbicense par LC/DAD/(-)-APCI-MSn sans isolement

au préalable (identification dite « on line ») en utilisant les critères d’identification établis

dans l’étude précédente. Les conditions chromatographiques et spectrométriques utilisées

dans cette étude sont détaillées dans la partie Matériels et méthodes.

F. 1 Profil chromatographique

Les chromatogrammes obtenus après détection UV à 340 nm et après détection par

spectrométrie de masse (TIC : Total Ion Current-APCI négatif) sont représentés Fig. 124.

Fig. 124 : (a) Chromatogramme (TIC ) de l’extrait AcOEt avec détection APCI négatif

(b) Chromatogramme de l’extrait AcOEt enregistré en UV à 340 nm.

(b)

(a)


161

L’étude du Courant Ionique Total et des spectres de masse en MS2 et MS3 correspondant à

des rapports m/z identiques aux flavonoïdes isolés de la plante nous a permis de sélectionner

11 composés (Tableau 24 et Fig. 124) dont nous avons étudié la fragmentation.

Temps de rétention en minutes (TIC) Rapport m/z (mode APCI négatif)

8.92 327

12.14 327

12.48 301

15.34 271

15.73 283

16.87 283

17.14 311

18.01 341

18.61 297

22.52 311

22.76 341

Tableau 24

La plupart des composés sont des isomères. Ainsi, nous distinguons :

- Deux isomères de masse 284 g/mole




Ainsi que trois composés de masses respectives 272 g/mole, 298 g/mole et 302 g/mole.

Remarque : le pic à Tr 21.16 n’a pas été étudié car le spectre de masse donnait quatre ions

majoritaires. Il s’agit donc d’un mélange de composés et leur fragmentation en MS2 n’a pas

donné de bons résultats dû à un nombre d’ions insuffisant.


162

L’identification des composés sera permise grâce à l’étude de leur spectre UV et de leurs

spectres de masse (MS, MS2 et MS3). Nous étudierons les composés par ordre croissant de

leur masse.

F. 2 Identification des composés présents dans l’extrait AcOEt

� Composé de rapport m/z 271 à Tr 15.34 min

Le profil du spectre UV du composé de rapport m/z 271 à Tr 15.34 min montre deux maxima

d’absorption à 211 nm et 286 nm ce qui nous permet d’envisager une structure de type

dihydrochalcone ou flavanone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry

et al., 1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig. 125

suivante.

120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

50

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Re

lativ

e A

bun

da

nce

271,2

272,3

125,1111,0 273,2146,9 270,5152,1 286,2192,8181,1174,3127,9 197,3 236,9 256,9245,4221,1206,1253,2

271,1

238,2254,2

152,1272,1

239,3165,1 257,1139,1 173,1124,1 273,1210,2 237,7121,1 197,2179,3 226,6

Fig. 125 : De haut en bas : spectre MS et spectre MS2 du composé m/z 271 à Tr 12.14 min.

Ce composé a une masse de 272 g/mole comme l’atteste le spectre de masse enregistré en (-)-

APCI m/z 271 [M-H]-.

Le spectre MS2 montre trois ions fils à m/z 253, m/z 238 uma et m/z 152 uma qui

correspondent respectivement à des pertes de 18 uma, 33 uma et 119 uma. La perte

majoritaire est la perte de 18 uma qui correspond à une perte d’H2O. Or nous avons pu voir


163

que dans le cas des dihydrochalcones la perte majoritaire est la perte d’H2O: Il s’agit donc

d’une dihydrochalcone.

L’ion fragment m/z 152 correspond donc au fragment de type A : [1A-CH3]-. Il s’agit donc

d’une dihydrochalcone dont le cycle A est substitué par deux groupements OH et par un

groupement méthoxyle.

Le spectre MS2 de ce composé est comparé au spectre MS2 de la 2’,6’-dihydroxy-4’-

méthoxydihydrochalcone (Host 9, Fig. 126) déjà isolée et identifiée dans l’extrait hexanique.

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

253.20

271.14

238.26

152.10

165.14139.09124.06 210.23197.1890.85 226.63253.34

271.12

238.36152.18

165.24124.13 226.54138.94 184.09

Fig. 126 : Comparaison des spectres MS2 de l’ion m/z 271 à Tr 15.34 min

et du composé Host9.

Nous pouvons constater que les deux spectres sont équivalents. Il s’agit donc de la 2’-6’-

dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone (Host9) dont la structure et le schéma de

fragmentations sont représentés Fig. 127.

Spectre MS/MS de l’ion m/z 271 (Tr 15.34min)



164

OOH

O OH

-H

m/z 271

OOH

O

-H

m/z 253

-H2O

OOH

O

-H

m/z 238

-CH3

OH

O

-H

m/z 210

-18 -15

-CO-28

A B

OH

O OH

O OH

OO

-H

m/z 165

O

m/z 152

MS2

MS2

MS2

MS3

MS4

1A-

1A--CH3

Fig. 127 : Schéma de fragmentations de la 2’-6’-dihydroxy-4’-methoxydihydrochalcone

(Host9). L’ion fragment en rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2.


165






suivante.

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z

37

0

5

10

15

20

25

30

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Re

lativ

e A

bun

dan

ce

283.25

125.04 271.27 306.85284.25110.97

146.89 285.12102.97 156.87132.80 179.18 196.86 233.19121.14 261.34224.99 252.09283.15

241.16

284.18255.20192.09

239.21179.07164.06 242.17205.13 256.20135.01 285.14213.21 268.21151.10111.05 227.2996.98


Le spectre de masse donne un ion quasi-moléculaire m/z 283 [M-H]- en accord avec une

masse de 284 g/mole.

Le spectre MS2 présente deux ions fils majoritaires à m/z 255, m/z 241 correspondant

respectivement à des pertes de 28 uma (perte de CO) et de 42 uma (C2H2O). Notre clé

d’identification (Tableau 23) nous permet d’envisager une structure de type flavanone.

Aucune perte de méthyle n’est observée, il n’y a donc aucun groupement méthoxyle.

Nous avons deux autres ions fils à m/z 192 (perte de 91 uma) et m/z 179 (perte de 104 uma).

Ces deux fragments sont des fragments de type A, il s’agit des fragments 1,2A- et 1,3A-. Le

cycle B est donc non substitué et le cycle A est substitué par deux OH et deux groupements

méthyles.


166

Le spectre MS2 de ce composé de masse m/z 283 est comparé aux spectres MS2 de la 6,8-

diméthylpinocembrine (Host10) (Fig. 129) déjà isolée dans l’extrait hexanique.

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

35

0

5

10

15

20

25

30

Re

lativ

e A

bun

danc

e

283,2

241,2

255,2 284,2192,1

239,2179,1164,1 242,2205,1 256,2135,0 285,1270,1213,2151,1111,1 227,3121,997,0283,2

281,4241,3284,2

255,3192,2 239,3179,2 242,5 256,3 285,1205,3164,2135,2 268,2213,3 221,1111,1 151,0121,193,0



Les deux spectres sont identiques. Il s’agit donc de la 6,8-diméthylpinocembrine (Host10)

dont le schéma de fragmentations est représentée Fig. 130.

O

OOH

HO

m/z 283

-H

-H

OH

HO O

m/z 255

-CO

-C2H2O

OH

HO O -H

OH

HO O

O

-H

m/z 192

OH

HO

O

O

-H

m/z 179

MS2

MS2

m/z 241

1,2A-

1,3A-

MS2

MS2

Fig. 130 : Schéma de fragmentations de la 6,8-diméthylpinocembrine (Host10). L’ion

fragment en rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2.

Spectre MS2 de l’ion m/z 283 (Tr 15.73min)



167




chalcone ou flavone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993; Mabry et al.,

1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig. 131 suivante.

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z

35

0

5

10

15

20

25

30

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Re

lativ

e A

bund

anc

e

283.20

125.03

110.96

311.18284.21146.90102.91 271.19 306.85285.18148.87 170.83126.01112.97 179.02 222.94 233.14 265.15254.89209.00197.02

268.03

283.10

164.01

241.16

269.02 284.10

240.14179.10153.11136.06 270.02255.22 285.04210.94192.10 226.15177.18104.98 136.98111.24


Le spectre de masse donne un ion quasi-moléculaire m/z 283 [M-H]- en accord avec une

masse de 284 g/mole.

Le spectre MS2 présente cinq ions majoritaires à m/z 268, m/z 241, m/z 179, m/z 164 et m/z

153. Les ions fragments m/z 268 et m/z 241 correspondent respectivement à des pertes de 15

uma (perte de CH3) et de 42 uma (perte de C2H2O). Il s’agit donc d’une chalcone et non d’une

flavone) méthoxylée. En effet, dans le cas des flavones, seule la perte de CH3 est observée

(voir clé d’identification Tableau 23).

Les ions fragments m/z 179 (perte de 104 uma), m/z 164 (perte de 119 uma) et m/z 153

correspondent à des fragments de type A. Il s’agit respectivement des fragments 1A-, [1A-

CH3]- et 0A-. Il s’agit donc d’une chalcone dont le cycle A est substituée par deux OH, un

méthoxyle et un méthyle.


168

Le spectre MS2 de ce composé est comparé au spectre MS2 de la 2’,4’-dihydroxy-6’-méthoxy-

3’-méthylchalcone (Host12) (Fig. 132).

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

m/z

84

0

10

20

30

40

50

60

70

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90R

ela

tive

Abu

nda

nce

268,0

283,1

164,0

241,2

269,0 284,1

240,2179,1153,1136,1 255,2210,9 270,1192,1 285,0226,2154,1 177,1105,0 149,0111,291,0 128,8283,1

268,2

164,2

284,1241,3269,2

165,3 179,2153,2 240,3 242,4136,2 255,3 285,1192,2 270,1224,2177,1 211,2110,9 133,1105,181,0 93,0



Les deux spectres sont identiques. Il s’agit donc de la chalcone Host12: 2’,4’-dihydroxy-6’-

méthoxy-3’-méthylchalcone dont la structure et le schéma de fragmentations proposés sont

présentés Fig. 133.

OOH

OHO

-H

m/z 283

OOH

OHO

m/z 268

-H

A B

-CH3

O

HO O

-H

-C2H2O

m/z 241

HO O

-H

m/z 164

OH

OHO

m/z 153

OHO

-H

-H

m/z 179

OO O

O

-CH3

MS2

MS2

MS2

MS2

0A-

[1A-CH3]-1A-

Fig. 133 : Schéma de fragmentations proposé pour la chalcone Host12. L’ion fragment en

rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2.




169





1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig. 134 suivante.

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z

35

0

5

10

15

20

25

30

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Re

lativ

e A

bu

nd

ance

125.04

297.17

291.28277.23146.91161.04129.00 271.18170.88 179.02 285.16214.93196.96 222.91 236.91 243.05 267.04

282.00

178.02

283.01297.11

254.07150.09 179.03 284.00281.27167.09 193.10 269.15237.06224.99205.23141.28126.04


Le spectre de masse enregistré en (-)-APCI présente un ion majoritaire m/z 297 [M-H]- en

accord avec une masse de 298 g/mole.

Le spectre MS2 présente deux ions majoritaires à m/z 282 (perte de 15 uma) et m/z 178.

Puisque un autre ion est observé en plus de la perte de CH3, il s’agit donc d’une chalcone

méthoxylée (voir clé d’identification Tableau 23). L’ion fragment à m/z 178 correspond alors

au fragment A : [1A-CH3]-, fragment A majoritaire (voir clé d’identification Tableau 23).

Le spectre MS2 de cet ion est comparé au spectre MS2 de la 2’,4’-dihydroxy-6’-méthoxy-3’-

méthylchalcone (Host11) déjà isolée dans l’extrait hexanique (Fig. 135).


170

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

22

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

282.00

178.02

283.01297.11

254.07150.09 179.03 298.12284.00281.27167.09 193.10 237.06224.99141.28126.04282.02

178.09

283.00297.09

283.99254.22179.16 298.08150.14 281.37193.11167.08 240.03205.26 226.35124.96109.78



Les deux spectres sont identiques, il s’agit donc de la 2’,4’-dihydroxy-6’-méthoxy-3’-

méthylchalcone (Host11) dont la structure et le schéma de fragmentations sont présentés Fig.

136.

OOH

OHO

-H

m/z 297 OOH

OHO

m/z 282

-H

A B

-CH3

OH

HO

m/z 254-CO

-H

O

m/z 193

OH

OHO

m/z 167

-H

OHO

OO

-CH3

OHO

OO

-H -H

m/z 178

MS2

MS2

MS2

MS3

MS3

0A-

1A-

[1A-CH3]-

Fig. 136 : Schéma de fragmentations proposé pour le composé Host11. L’ion fragment en

rouge correspond au fragment majoritaire observé en MS2

Spectre MS/MS de l’ion m/z 297 (Tr 18.61min)



171






suivante.

100 150 200 250 300 350 400 450 500m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Re

lati

ve A

bu

nd

an

ce

327.05

301.24

111.02 147.00 424.37 469.09283.47 343.06 386.89173.22 222.98269.07

127.05 173.19

112.06 285.99169.15 241.28178.16


Le spectre de masse indique la présence de deux ions quasi-moléculaires à m/z 301 et m/z 327

(le composé à m/z 327 sera étudié dans le paragraphe suivant) en accord avec des masses

respectives de 302 g/mole et 328 g/mole.

Le spectre MS2 de l’ion m/z 301 présente un ion majoritaire à m/z 269 (perte de 32 uma) et

cinq autres ions à m/z 286 (perte de 15 uma), m/z 241 (perte de 60 uma), m/z 173 (perte de

128 uma), m/z 127 (perte de 174 uma) et m/z 112 (perte de 189 uma). Les perte de 32 uma et

15 suggèrent des pertes de CH3OH et de CH3.

Dans le but d’avoir des informations supplémentaires, nous avons réalisé un expérience de

MS3 sur l’ion m/z 269, le spectre obtenu est présenté dans la Fig. 138 suivante.


172

Fig. 138 : De haut en bas : spectre MS2 et spectre MS3 du composé m/z 301 à Tr 12.48 min

L’ion m/z 269 donne :

-un ion m/z 254 (perte de 15 uma) ce qui correspond à une perte d’un CH3.

-un ion m/z 241 (perte de 28 uma) ce qui correspond à une perte de CO.

-un ion m/z 225 (perte de 44 uma) ce qui correspond à une perte de CO2.

-un ion m/z 178 (perte de 91 uma) ce qui correspond à la perte d’un méthylbenzene.

Aucune perte de C2H2O n’est observée, il ne s’agit donc pas d’une flavanone méthoxylée. Ces

informations indiquent que nous sommes en présence d’une dihydrochalcone doublement

méthoxylée dont un des groupements méthoxyles est perdu sous la forme d’une molécule de

CH3OH et l’autre méthoxyle est sur le cycle A car un groupement méthyle est perdu en MS3.

La structure que nous proposons est une dihydrochalcone α-méthoxylé dont la fragmentation

est représentée Fig. 139. Le groupement méthoxyle supplémentaire ne peut pas être placé sur

un des deux cycles aromatiques car aucune perte de CH3OH ne pourrait avoir lieu d’après ce

que nous avons pu constater en étudiant en introduction directe la fragmentation de ce type de

composés.


173

OOH

O

O

m/z 301

OH-H

-CH3

OOH

O

O

m/z 286

OH-H

-CH3OH

OH

O O

O

-H

-CO

OH

O

O -H

m/z 241

-CO2

OH

O

-H

m/z 225

OH

OO

O

-H

m/z 178

-cycle B

OH

m/z 134-cycle A

m/z 269

-H

BA

MS2

MS2

MS3

MS3

MS3

MS3

Fig.139 : Schéma de fragmentations proposé pour l’ion m/z 301 à Tr 12.48 min.

La structure proposée serait une molécule nouvelle. Les dihydrochalcones α-hydroxylées

étant relativement peu rencontrées [Alvarez et Delgado, 1999; Fukai et al., 1996], il serait

intéressant de pouvoir isoler cette molécule afin de pouvoir confirmer la structure proposée.


174






suivante.

140 160 180 200 220 240 260 280 300m/z

51

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

311,2

146,9283,2271,1 301,0148,8 156,9 285,4250,9171,1 222,2207,0 264,3141,0 234,1181,3 190,8283,1

311,1241,1

284,1268,1

269,0207,0 242,1 295,0191,9179,0164,0 267,2239,1227,1212,0138,7 153,1 298,0


Sur le spectre de masse enregistré en (-)-APCI, nous observons un ion quasi-moléculaire m/z

311 [M-H]- suggérant une masse atomique de 312 g/mole.

Le spectre MS2 de ce composé présente un ion majoritaire m/z 283 (perte de 28 uma)

correspondant à une perte de CO. De plus, deux autres ions fragments sont observés à m/z 268

et m/z 241.

Pour avoir plus d’informations, nous réalisons le spectre MS3 à partir de l’ion fils majoritaire

m/z 283. Le spectre obtenu est présenté dans la Fig. 141 suivante.


175

Fig. 141 : Spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 à Tr 17.14 min.



-un ion m/z 241 (perte de 42 uma) ce qui correspond à une perte de C2H2O.

Il s’agit donc d’une flavanone méthoxylée (et pas une dihydrochalcone car nous n’avons pas

de perte d’H2O). Les deux autres ions observés à m/z 164 (perte de 119 uma) et m/z 179 (perte

de 104 uma) correspondent aux fragments A : 0,3A- et 1,3A-.

Il s’agit donc d’une flavanone dont le cycle B est non substitué et le cycle A est substitué par

un OH, un méthoxyle et un méthyle. Le spectre MS3 est comparé au spectre MS2 de la 7-

hydroxy-5-méthoxy-8-méthylflavanone (Host16) déjà isolée dans l’extrait hexanique (Fig.

142).


176

Fig. 142 : Spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 et spectre MS2 du composé Host16.

Les deux spectres sont équivalents. Ainsi, l’ion de masse m/z 283 qui correspond à une masse

de 284 g/mole a la même structure que le composé Host16 dont le schéma de fragmentations

est présenté dans la Fig. 143.

O

OO

HO

-H

m/z 283

-H

-C2H2O

O

HO O-H

m/z 241

O

OO

HO

m/z 268

-CH3

O

HO

O

O

-H

m/z 179

1,3 A-

O

HO

O-H

m/z 164

MS2

MS2

MS2

MS2

0,3 A-

Fig. 143 : Schéma de fragmentations du composé Host16. L’ion fragment en rouge

correspond au fragment majoritaire observé en MS2


Spectre MS2 de Host16


177

Or le composé m/z 311 à Tr 17.14 min perd 28 uma pour donner l’ion m/z 283. Ainsi, pour ce

composé nous proposons la structure présentée Fig. 144 dans laquelle nous avons rajouté une

fonction aldéhyde supplémentaire sur le cycle A pour expliquer la perte de 28 uma.

La structure proposée est une flavanone connue déjà isolée d’une Myrtaceae (Cleistocalyx

operculatus), il s’agit de la 8-formyl-5-hydroxy-7-méthoxy-6-méthylflavanone [Chun-Lin Ye,

2004]. La différence concernant l’ion m/z 283 avec Host16 provient de la position des

substituants sur le cycle A mais seule une expérience HMBC en RMN 2D permettrait de

placer les substituants correctement.

O

OH

O

-H

m/z 311

-CH3

O

OOH

O

-H

O

O

m/z 283

-CO

(Isomère de Host16)

O

OH

O -H

m/z 296O

O

MS2

MS2

Fig. 144 : Structure proposée pour l’ion m/z 311 à Tr 17.14 min. Il s’agit de la 8-formyl-5-

hydroxy-7-methoxy-6-méthylflavanone. L’ion fragment en rouge correspond au fragment

majoritaire observé en MS2.


178


Ce composé est un isomère du composé précédent. Le profil du spectre UV de ce composé

montre deux maxima d’absorption à 286 nm et 338 nm ce qui nous permet d’envisager une

structure de type chalcone ou flavone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993;

Mabry et al., 1970]. Le spectre de masse (MS) et le spectre MS2 sont présentés dans la Fig.

145 suivante.

160 180 200 220 240 260 280 300m/z

33

0

5

10

15

20

25

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

311,2

299,1271,3146,9 283,1170,9 287,2157,1 185,0 253,2 257,2232,8215,1194,9 236,9223,0210,8283,1

311,1

191,9

281,1268,1 295,1163,9

194,0 279,1 296,0181,1 251,2235,1165,2 267,3 293,0152,0 241,1207,0 224,5211,1199,5


Le spectre MS2 donne un ion fils majoritaire à m/z 283 comme précédemment. Nous réalisons

un expérience MS3 et nous comparons ce spectre MS3 avec le spectre MS3 du composé

précédent (Fig. 146).


179

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

91

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce268,0

283,1

281,1

284,2163,9 280,2

255,1241,2162,7 225,2 307,2178,9 190,176,0 113,7 136,1 312,2207,5 285,2283,1

241,0

268,0

284,0163,9 267,4242,0179,0135,8 269,2239,0226,0210,8156,1 285,0191,994,1

gb3186-06#966-970 RT: 22,34-22,43 AV: 3 NL: 3,51E4 F: - c APCI Full ms3 311,18@37,00 283,12@37,00 [ 75,00-320,00]

gb3186-06#735-741 RT: 16,96-17,09 AV: 7 NL: 3,87E4 F: - c APCI Full ms3 311,18@37,00 283,12@37,00 [ 75,00-320,00]

Fig. 146 : Spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 à Tr 22.52 et spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 à

Tr 17.14 min.

Nous obtenons les mêmes ions fragments avec des différences d’intensité concernant les ions

m/z 268 (perte de 15 uma par rapport à l’ion m/z 283) et m/z 241 (perte de 42 uma par rapport

à l’ion m/z 283).

Or nous avons pu constater que dans le cas des chalcones et flavanones isomères méthoxylées

(Tableau 23), la perte de 15 uma (perte de CH3) est plus importante que la perte de 42 uma

(perte de C2H2O) dans le cas des chalcones comme nous pouvons le voir pour le composé m/z

311 à Tr 22.52 (Fig. 146).

Ainsi, le composé à Tr 22.52 min est l’isomère chalcone du composé m/z 311 à Tr 17.14. Il

s’agit d’un composé déjà connu, isolé d’une Myrtaceae (Cleistocalyx operculatus), il s’agit de

la 3’-formyl-4’,6’-dihydroxy-2’-méthoxy-5’-méthylchalcone [Chun-Lin Ye, 2004]. Sa

structure et son schéma de fragmentation sont présentés dans la Fig. 147.

Spectre MS3 de l’ion m/z 311/283 (Tr 22.52min)

Spectre MS3 de L’ion m/z 311/283 (Tr 17.14min)


180

O

OH

HO

-H

m/z 311 -CH3

O

O

-COm/z 283

O

OH

HO

-H

O

O

m/z 295

O

OH

HO

-H

O

OOH

OHO

-H

m/z 283

OOH

OHO

m/z 268

-H

A B

-CH3

O

HO O

-H

-C2H2O

m/z 241

OH

OHO

m/z 153

-H

OHO -H

m/z 179

OO

HO O

-H

m/z 164

OO

-CH3

MS2

MS2

MS2

MS2 MS3

0A-

1A-

Fig. 147 : (a) Schéma de fragmentations de l’ion m/z 311 conduisant aux ions m/z 295 et m/z

283. (b) Schéma de fragmentations de la Chalcone Host12.

Nous pouvons constater que l’ion m/z 283 du composé m/z 311 à Tr 22.52 correspond à l’ion

m/z 283 du composé Host12 déjà isolé de l’extrait hexanique.

La position des substituants sur le cycle A reste à confirmer mais seule une expérience

HMBC en RMN 2D peut nous donner cette information.

(a)

(b)


181





et al., 1970]. Le spectre de masse (MS), le spectre MS2 et le spectre MS3 sont présentés dans

la Fig. 148 suivante.

100 150 200 250 300 350 400 450 500m/z

12

0

2

4

6

8

10

57

0

10

20

30

40

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

100

0

20

40

60

80

327.05

328.04

110.97 146.91 329.05313.19 412.88370.82156.86 438.62283.24 478.94222.98208.97 236.98283.18

284.15

309.05241.30 282.47179.20 326.95164.12 211.24135.20104.98283.12

241.23

268.16

284.11

164.11 242.25179.15226.16153.16136.07 180.20105.03 243.21 285.00 313.08

Fig. 148 : De haut en bas : spectre MS, spectre MS2 et spectre MS3du

composé m/z 327 à Tr 8.92 min.

Nous pouvons observer sur le spectre de masse un ion quasi-moléculaire m/z 327 [M-H]- qui

suggère une masse de 328 g/mole.

Le spectre MS2 présente un ion fils majoritaire m/z 283 (perte de 44 uma) sur lequel nous

avons réalisé une expérience MS3 (Fig. 148).





182

Il s’agit donc d’une flavanone méthoxylée (et pas une dihydrochalcone car nous n’avons pas

de perte d’H2O) Les deux autres ions observés à m/z 164 (perte de 119 uma) et m/z 179 (perte

de 104 uma) correspondent respectivement aux fragments 0,3A- et 1,3A-.. Nous retrouvons les

mêmes ions fragments que pour la flavanone méthoxylée Host16 déjà isolée de l’extrait

hexanique (Fig. 149).

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z

19

0

2

4

6

8

10

12

14

16

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

283,1

241,3

268,2

242,3164,1 179,2 267,3269,2226,2 240,4211,1136,1 153,2 165,1 180,2 255,2105,1 198,2111,1 133,191,2

283,1

241,1

268,1

281,3

179,0163,9 242,1 269,0267,2240,4165,1 226,0180,0135,1 251,1198,0 266,4138,0 154,9 210,8

Fig. 149 : Spectre MS3 de l’ion m/z 327/283 et spectre MS2 du composé Host16.

Ainsi l’ion m/z 283 correspondant à une masse de 284 g/mole présente la même structure que

le composé Host16.

L’ion m/z 327 présente 44 uma supplémentaire. Nous proposons de rajouter une fonction

acide carboxylique sur le cycle A du composé Host16. La molécule proposée et son schéma

de fragmentations sont présentés dans la Fig. 150 suivante.




183

O

OO

HO

O

-H

HO

m/z 327

-H2O

O

O

-H

m/z 309

-CO2

O

OO

HO

-H

m/z 283

O

O

O

MS2

MS2

O

OO

HO

-H

m/z 283

-H

-C2H2O

O

HO O-H

m/z 241

O

OO

HO

m/z 268

-CH3

O

HO

O

O

-H

m/z 1791,3 A-

O

HO

O-H

m/z 164

MS2

MS2

MS2

MS2

0,3 A-

Fig. 150 : (a) Schémas de fragmentations de l’ion m/z 327 conduisant aux ions m/z 309 et m/z

283. (b) Schémas de fragmentations de la flavanone Host16. les ions fragments en rouge

correspondent aux ions majortaires obtenus en MS2.

La fonction carboxylique a été placée sur le cycle A car si elle était sur le cycle B, nous

aurions dû avoir des ions fils correspondant. De plus, biogénétiquement, ce genre de fonction

se retrouve généralement sur le cycle A.

La séparation étant réalisée en phase inverse, le temps de rétention très rapide de ce composé

s’explique par son caractère très polaire dû à la présence de la fonction acide carboxylique.

Cette observation nous permet de confirmer notre hypothèse de structure pour ce composé.

(a)

(b)


184


Ce composé est un isomère du composé précédent. Le profil du spectre UV de ce composé

montre deux maxima d’absorption à 295 nm et 338 nm ce qui nous permet d’envisager une

structure de type chalcone ou flavone (voir clé d’identification Tableau 23) [Harborne, 1993;

Mabry et al., 1970]. Le spectre de masse (MS), le spectre MS2 et le spectre MS3 sont

présentés dans la Fig. 151 suivante.

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z

19

0

5

10

15

67

0

10

20

30

40

50

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

100

0

20

40

60

80

327,0

301,2

302,2125,1 147,0 318,9283,3133,0 156,9 257,3 300,5171,0 233,3 269,2223,1193,2 250,6209,1179,1283,2

284,2

309,0268,3164,2 241,3153,2 327,0179,4 284,9211,2 255,5136,0 197,4 226,0122,3

283,1

268,1

164,1284,1

241,3269,1

240,3179,2153,2136,1 255,3211,1192,2 226,1 299,7132,9

Fig. 151 : De haut en bas : spectre MS, spectre MS2 et spectre MS3

du composé m/z 327 à Tr 12.14 min.

Nous pouvons observer sur le spectre de masse un ion quasi-moléculaire m/z 327 [M-H]- qui

suggère une masse de 328 g/mole.


avons réalisé une expérience MS3 (Fig. 151).

L’ion m/z 283 donne les mêmes ions que le composé précédent :




185

La Fig. 152 compare le spectre MS3 du composé m/z 327 à Tr 12.14 min et le spectre MS3 du

composé précédent m/z 327 à Tr 8.92 min.

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

91

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce283,1

268,1

164,1

284,1

241,3269,1

240,3179,1153,2136,1 255,3211,1192,2 282,4105,0 299,7119,194,5 325,582,8283,1

241,3

268,2

284,1

242,3164,1 179,2 267,3269,2226,2211,1136,1 153,2 165,1 180,2 255,2105,1 207,3 284,9112,2 299,682,9 98,9 318,7

Fig. 152 : Spectre MS3 de l’ion m/z 327/283 à Tr 12.14 et spectre MS3 de l’ion m/z 327/283 à

Tr 8.92 min.

Nous obtenons les mêmes ions fragments avec des différences d’intensité concernant les ions

m/z 268 (perte de 15 uma par rapport à l’ion m/z 283) et m/z 241 (perte de 42 uma par rapport

à l’ion m/z 283).

Or nous avons pu constater que dans le cas des chalcones et flavanones isomères méthoxylées

(Tableau 23), la perte de 15 uma (perte de CH3) est plus importante que la perte de 42 uma

(perte de C2H2O) dans le cas des chalcones comme nous pouvons le voir pour le composé m/z

327 à Tr 12.14 (Fig. 152).

Ainsi, le composé m/z 327 à Tr 12.14 min est l’isomère chalcone du composé m/z 327 à Tr

8.92. La structure et le schéma de fragmentations de ce composé sont présentés dans la Fig.

153 suivante.




186

O

OH

HO

-H

m/z 327

-H2O

OOH

-H

O

OOH

HO

-H

O

O OH

OO

O

m/z 309

m/z 283

-CO2

MS2

MS2

OOH

OHO

-H

m/z 283

OOH

OHO

m/z 268

-H

A B

-CH3

O

HO O

-H

-C2H2O

m/z 241

HO O

-H

m/z 164

OH

OHO

m/z 153

OHO

-H

-H

m/z 179

OO

OO

-CH3

MS2

MS2

MS2

MS2

0A-

1A-

[1A-CH3]-

Fig. 153 : (a) Schémas de fragmentations de l’ion m/z 327 conduisant aux ions m/z 309 et m/z

283. (b) Schémas de fragmentations du composé Host12. L’ion fragment en rouge correspond

à l’ion majoritaire obtenu en MS2.

Ainsi, les deux composés de masse 328 g/mole sont des isomères dont l’un présente une

génine flavanone et l’autre une génine chalcone. De plus les structures proposées présentent

(a)

(b)


187

toutes les deux une fonction carboxylique, pouvant expliquer leur élution rapide sur colonne

en phase inverse.





et al., 1970]. Le spectre de masse (MS), le spectre MS2 et le spectre MS3 sont présentés dans

la Fig. 154 suivante.

Fig. 154 : De haut en bas : spectre MS, spectre MS2 du composé m/z 341 à Tr 18.01 min

Nous observons sur le spectre de masse enregistré en (-)-APCI un ion m/z 341 [M-H]- en

accord avec une masse de 342 g/mole.

Le spectre MS2 donne un ion m/z 283 (perte de 58 uma) et un ion fils majortaire à m/z 271

(perte de 70 uma). Cet ion fils est fragmenté suite à une expérience de MS3 (Fig. 155).


188


Le spectre MS3 donne les ions suivants :

-un ion majoritaire m/z 253 (perte de 18 uma par rapport à m/z 271) suggérant la perte d’H2O.

-un ion m/z 238 (perte de 33 uma par rapport à m/z 271).

Une perte majoritaire d’H2O nous permet de considérer que le composé est une

dihydrochalcone (clé d’identification, Tableau 23). De plus, nous obtenons les mêmes ions

que la dihydrochalcone Host9 déjà isolée de l’extrait hexanique et déjà identifié dans l’extrait

par LC/MS à un temps de rétention de 15.34 min.

La comparaison des spectres est présentée dans la Fig. 156 suivante.


189

120 140 160 180 200 220 240 260m/z

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0,9

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7R

ela

tive

Ab

un

da

nce

253,1

271,1

254,1238,0151,9

255,9138,9 257,1164,9153,2 182,9 251,1105,1 237,2178,5 207,2

253,2

271,1

238,3 254,2152,1

239,3165,1 257,1153,2139,1 173,1124,1 151,1 210,2121,1 180,2 197,2 228,8221,0108,4

Fig. 156 : Spectre MS3 de l’ion m/z 341/271 à Tr 12.14 et spectre MS2 de l’ion m/z 271 à Tr

15.34 min.

Nous pouvons constater que les deux spectres sont identiques. Ainsi l’ion m/z 271

correspondant à une masse de 272 g/mole est la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone.

L’ion m/z 341 présente 58 unités de masse supplémentaires par rapport à l’ion m/z 283 et 70

unités de masse supplémentaires par rapport à l’ion m/z 271.

Nous pouvons envisager deux hypothèses en ce qui concerne la formule brute correspondant à

une perte de 58 uma: C4H10 ou C3H6O [De Hoffmann et al., 1999].

Sachant que la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone (Host9) a été identifiée à un

temps de rétention de 15.34 minutes, ce composé de masse 342 g/mole qui présente un temps

de rétention de 18.01 min (séparation sur colonne en phase inverse) est donc plus apolaire.

L’hypothèse d’une perte de 58 uma correspondant à une perte de C4H10 est donc la plus

plausible et donc la différence de 70 unités de masse correspondrait à C5H10, un fragment

isoprénique.

Ainsi, nous proposons une structure de type dihydrochalcone dont un des substituants sur le

cycle A serait un isoprène. La structure et le schéma de fragmentations proposés sont

présentés Fig. 157.

Spectre MS3 de l’ion m/z 341/271 à Tr 18.01min

Spectre MS2 de l’ion m/z 271 à Tr 15.34min


190

OH

OOH

O

-H

m/z 341

-H2O

OH

O

-H

m/z 323

O

-C4H10OH

OOH

O

-H

m/z 283

-C5H10

OH

OOH

O

-H

m/z 271

MS2

MS2

MS2

OOH

O OH

-H

m/z 271

OOH

O

-H

m/z 253

-H2O

OOH

O

-H

m/z 238

-CH3

OH

O

-H

m/z 210

-18 -15

-CO-28

A B

OH

O OH

O OH

OO

-H

m/z 165

O

m/z 152

MS2

MS2

MS2

MS3

MS4

1A-

1A--CH3

Fig. 157 : (a) Schéma de fragmentations de l’ion m/z 341 conduisant aux ions m/z 323, 283 et

271. (b) Schéma de fragmentations de la 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone

(Host9). Les ions fragments en rouge correspondent aux ions majoritaires obtenus par MS2.

La structure proposée serait nouvelle. Des dihydrochalcones isoprénylées ont déjà été isolées

dans la nature, notamment dans les racines de Brosimum acutifolium (Moraceae) [Takashima

et Ohsaki, 2002].

(a)

(b)


191


Le profil du spectre UV du composé m/z 341 à Tr 22.76 min montre deux maxima



1970]. Le spectre de masse (MS), le spectre MS2 et le spectre MS3 sont présentés dans la Fig.

160 suivante.

140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z

95

0

10

20

30

40

50

60

70

80

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

341,2

277,2

146,9 342,1

148,9156,9 271,2 327,0315,1285,2170,9 306,9197,0 214,8176,9 343,0220,9 253,1233,0

309,0

294,0341,1

310,0297,1

342,1189,9 325,9311,1265,1 293,2237,1222,0 280,9241,2 308,3140,9 195,0 209,2161,9 179,1

Fig. 158 : De haut en bas : spectre MS, spectre MS2 du composé m/z 341 à Tr 18.01 min.

Le spectre de masse révèle un ion m/z 341 [M-H]- suggérant une masse molaire de 342

g/mole.


avons réalisé une expérience MS3 (Fig. 159). La perte de 32 uma suggère la perte d’une

molécule de CH3OH. De plus, nous distinguons la présence d’un ion m/z 326 (perte de 15

uma) ce qui laisse supposer que le composé est une chalcone ou une flavone méthoxylée.


192


Le spectre MS3 conduit respectivement pour les ions majoritaires à une perte de CH3 (m/z

294, perte de 15 uma), de MeOH (m/z 277, perte de 32 uma) et de CO2 (m/z 265) par rapport à

l’ion m/z 309.

La présence de ces trois ions suggère que nous sommes en présence d’un composé qui

présente un substituant méthyle ester comme dans le cas du composé Host6 (structure Fig.

160).

OOH

HO O

OO

Fig. 160 : Rappel de la structure du composé Host6.

La structure et le schéma de fragmentations que nous proposons sont présentés dans la Fig.

161.


193

O

OH

HO

-H

m/z 341O

O O

-CH4O

O

OH

-H

m/z 309O

O

O

-CH3

O

OH

-H

m/z 294O

O

O

-CO2

O

OH

-H

m/z 265O

OH

O

O

m/z 191(perte de 119 uma)-CH3

O

OH

HO -H

m/z 294O

O O

-H

MS2

MS2

MS3

MS3

O

O

MS3

Fig. 161 : Schéma de fragmentations proposé de l’ion m/z 341 à Tr 22.76 min. L’ion fragment

en rouge correspond au fragment majoritaire obtenu en MS2.

Nous avons choisi la génine chalcone plutôt que la génine flavone car nous avons déjà isolé et

identifié dans la plante le composé Host6 (Fig. 160) dont le précurseur correspondrait à cette

chalcone.

Néanmoins, dans le spectre MS2, nous n’avons pas les ions fragments qui correspondent aux

fragments A : 1A-, [1A-CH3]- et 0A- qui seraient attendus à m/z 238, m/z 223 et m/z 210.

Pour confirmer l’identification de ce composé, il serait souhaitable de pouvoir l’isoler et de

réaliser des expériences de RMN.

Ainsi le composé Host6 (Fig. 159) pourrait être le produit d’une réaction de Diels-Alder entre

la chalcone identifiée ici et un dérivé myrcène.


194

F. 3 Bilan de l’analyse par LC/DAD/APCI-MSn

� L’étude par LC/DAD/MS de l’extrait AcOEt nous a permis d’identifier des molécules

déjà isolées dans l’extrait hexanique mais aussi de repérer de nouvelles structures d’un

point de vue phytochimique (Tableau 25).

� Au total 6 composés nouveaux dans la plante et dans le genre ont été identifiés dont au

moins 4 composés de structures nouvelles.

� Les molécules nouvelles présentent des génines de type flavanone, dihydrochalcone et

chalcone et présentent des substituants originaux de type méthyle, méthoxyester ou

monoterpéne.

Bien que l’utilisation des données en spectroscopie UV et MS nous a permis d’identifier de

nombreux composés, elles présentent certaines limites. Les règles de fragmentation que nous

avons établi ne sont valables que si l’on considère des chalcones, dihydrochalcones ou

flavanones de structure simple.

La spectrométrie de RMN reste néanmoins la méthode la plus sûre pour établir la structure

d’un composé inconnu.


195

Temps de rétention Abondance Composés nouveaux

en minutes (TIC)

Relative des

composés (TIC)

(N) ou déjà identifiés (C)

en phytochimie

Structure

8.92 328 21 N

12.14 328 28 N

12.48 302 28 N

15.34 272 19 C

15.73 284 5 C

Masse molaire en

g/mole

O

OO

HO

O

HO

O

OH

HO

O

O OH

OOH

O

O

OH

OOH

O OH

O

OOH

HO


en minutes (TIC)

Relative des

composés (TIC)


en phytochimie

Structure

16.87 284 6 C

17.14 312 1 C

18.01 342 1 N

18.61 298 6 C

22.52 312 2 C

Masse molaire en

g/mole

OOH

OHO

O

OH

O

O

O

OH

OOH

O

OOH

OHO

O

OH

O

O

O


en minutes (TIC)

Relative des

composés (TIC)


en phytochimie

Structure

22.76 342 2 N

Masse molaire en

g/mole

O

OH

HO

O

O O

Tableau 25 : Bilan des molécules identifiées dans l’extrait AcOEt de P. hostmannianum var. berbicense par LC/DAD/APCI-MSn

IV. Conclusions et perspectives

196

Les plantes restent la source prédominante de médicaments pour la majorité de la population

mondiale, en particulier dans les pays en voie de développement. Environ 40 % des

médicaments sont ainsi dérivés de la nature [Newman et Cragg, 2007]. Dans le cas de la lutte

contre le paludisme, les succès en clinique de la quinine et de l’artémisinine, molécules

naturelles isolées respectivement de Cinchona sp. et Artemisia sp. encourage la recherche de

nouvelles molécules antipaludiques issues de la biodiversité végétale.

Mon travail de thèse s’est inscrit dans le cadre des travaux de recherche du laboratoire

de pharmacochimie des substances naturelles et pharmacophores redox (UMR-152) dont l’un

des objectifs est de découvrir de nouveaux candidats médicaments dans le domaine des

maladies parasitaires (paludisme, leishmaniose) à partir d’espèces végétales de Guyane, de

Bolivie ou du Pérou.

Le but de ce travail était de réaliser l’étude phytochimique bioguidée d’une plante guyanaise

Piper hostmannianum var. berbicense en vue de l’identification de molécules potentiellement

antiplasmodiales. Le stage en spectrométrie de masse au laboratoire de pharmacognosie de

l’UCL à Bruxelles sous la direction du Pr. Joëlle Quetin-Leclercq a consisté à étudier la

fragmentation de composés de type chalcone, dihydrochalcone et flavanone en vue de pouvoir

les identifier dans un extrait brut par LC/MSn.

Etude phytochimique bioguidée de Piper hostmannianum var. berbicense

La sélection du matériel végétal sur le terrain s’est avérée difficile car deux espèces de

Piper hostmannianum sont présentes en Guyane Française et leur différenciation selon des

critères botaniques est une tâche particulièrement difficile pour des non-spécialistes. La

comparaison des profils phytochimiques des extraits de deux variétés de plantes ainsi que

l’évaluation de leur activité antiplasmodiale nous a permis de distinguer sans aucune

ambiguïté les deux variétés. Seule la variété berbicense démontre une potentielle activité

antiplasmodiale. Une application future serait la comparaison des profils phytochimiques par

LC/MS.

L’étude phytochimique bioguidée des extraits hexanique et chloroformique des

feuilles de Piper hostmannianum var. berbicense a conduit à l’isolement de 17 composés dont

3 chalcones, 7 dihydrochalcones et 7 flavanones. Cinq composés présentent des structures


197

nouvelles. L’originalité des molécules isolées réside dans la présence de substituants terpénés

ou méthylés relativement rares dans le règne végétal.

L’ensemble des composés isolés ont été évalués in vitro sur deux souches de P. faciparum,

une souche chloroquino-résistante, FcB1 et une souche chloroquino-sensible, F32. Leur

cytotoxicité a été évaluée sur des cellules de tumeur mammaire MCF-7. Sur 17 composés

isolés, 6 molécules sont potentiellement actives : une flavanone (Host1), deux

dihydrochalcones (Host7 et Host9) et deux chalcones (Host11 et Host12) avec des CI50

comprises entre 2 et 6 µg/ml. Les molécules ayant une activité proche de celle de l’extrait de

départ (CI50= 8 µg/ml), nous pouvons supposer que l’activité est due à la combinaison de

plusieurs molécules ou à des composés minoritaires qui n’ont pas été identifiés.

Par conséquent, il serait intéressant de pouvoir évaluer l’éventuelle synergie d’action des deux

composés les plus actifs et qui présentent le meilleur indice de sélectivité à savoir les deux

dihydrochalcones Host7 et Host9. Cette étude est actuellement en cours au sein de la

plateforme de biologie de l’UMR-152.

De plus, l’activité in vivo de ces deux dihydrochalcones (Host7 et Host9) a été évaluée sur

des souris infectées par P. vinckei petteri. Les résultats obtenus montrent une diminution

significative de la parasitémie : 80% pour le composé Host7 (20 mg/kg) et entre 40% et 90%

pour le composé Host9 au J5.

Pour le composé Host7, le temps de survie est de trois jours et demi de plus par rapport au

témoin chloroquine. Concernant le composé Host9, aux deux doses les plus élevées (10 et 20

mg/kg), le temps de survie est équivalent voir supérieur à celui de la chloroquine.

Ces résultats très encourageant doivent être confirmés par d’autres expériences avec des doses

plus importantes pour obtenir 100% de guérison et évaluer le temps de survie des souris. Il

serait aussi intéressant d’envisager un traitement par voie orale.

Bien que les doses testées soient relativement importantes (jusqu’à 20 mg/kg), nous n’avons

pas de problème de disponibilité car le composé Host9 est le composé majoritaire ( environ 1

g) de l’extrait chloroformique (15 g) de cette plante (voir paragraphe D. 4. 3. 1). Concernant

le composé Host7, une hémisynthèse à partir du composé Host9 serait potentiellement

envisageable en réalisant la condensation du p-menthène sur l’unité dihydrochalcone pour

pouvoir en disposer plus rapidement en plus grande quantité .


198

Le mode d’action de ces composés restent encore à déterminer bien que des études récentes

ont pu démontré que les molécules de type chalcone seraient des inhibiteurs de cystéine

protéases [Dominguez et al., 2001; Li et al., 1996].

Etude en spectrométrie de masse des chalcones, dihydrochalcones et flavanones

Afin de mieux appréhender « on-line » l’identification par LC/MS de ces composés,

nous avons étudié la fragmentation des molécules isolées et de quelques témoins

commerciaux de même génine en APCI en mode négatif sur un spectromètre de masse à

trappe d’ions.

Des règles de fragmentations ont pu être établies mettant en évidence des ions diagnostics

spécifiques de ces structures. Un clé d’identification a pu être établie en tenant compte des

informations apportées par les spectres UV et les spectres enregistrés en MSn. La comparaison

des différents fragments obtenus dans les cas des chalcones, dihydrochalcones et flavanones

montre des différences essentiellement au niveau des pertes de neutre. Ainsi, les chalcones

méthoxylées perdent plus facilement leur groupement méthyle alors que dans le cas des

dihydrochalcones méthoxylées la perte d’H2O est majoritaire.

Les chalcones et flavanones isomères présentent des spectres MS2 identiques (avec une même

énergie de collision) qui diffèrent seulement au niveau de l’intensité des fragments. Les

flavanones méthoxylées ont ainsi une perte de C2H2O (perte de 42 uma) favorisée par rapport

à la perte d’un radical méthyle (et inversement dans le cas des chalcones méthoxylées).

L’identification d’un type de noyau flavonoïde chalcone, dihydrochalcone ou flavanone peut

donc être résolue rapidement grâce à l’analyse des son spectre de masse enregistré en MS2 et

de son spectre UV.

L’application directe de ce travail a été menée sur l’extrait acétate d’éthyle de Piper

hostmannianum var. berbicense. Les spectres MS, MS2 et MS3 de onze composés ont été

étudiés. Quatre d’entre eux ont été identifiés aux composés déjà isolés dans l’extrait

hexanique par comparaison de leur spectre MS2. Les structures des sept autres composés ont

été proposées sur la base des fragments obtenus en MS2 et en MS3 en considérant les règles de

fragmentation établies dans la première partie de ce stage. Les structures proposées sont des

chalcones, dihydrochalcones ou flavanones présentant des substituants méthylés, méthoxylés


199

ou ester. Il serait intéressant de pouvoir isoler ces composés et de confirmer leurs structures

par des analyses en RMN 1D et 2D dans le but de pouvoir évaluer leur potentiel

antiplasmodial. L’application des résultats de cette étude a déjà pu être réalisée sur des

composés isolés au Pérou sur d’autres plantes du genre Piper démontrant la réelle efficacité

de cette technique.

En conclusion, ce travail de thèse a permis d’isoler par bioguidage 17 composés de P.

hostmannianum var. berbicense dont six d’entre eux révèlent une potentielle activité

antiplasmodiale. La technique du bioguidage présente néanmoins des limites car des

composés actifs minoritaires sont ainsi difficilement détecté dans une fraction qui en

dénombre des centaines de molécules inactives.

L’identification de molécules de type chalcones et dihydrochalcones démontre leur intérêt

comme source de substances naturelles aux activités antiparasitaires prometteuses.

Face à l’urgence de la découverte de nouvelles molécules antipaludiques, la détection rapide

de molécules potentiellement actives notamment par LC/MS devient une réelle nécessité.

Cette technique est néanmoins plus facile à réaliser dans le cas des flavonoïdes dont les

propriétés spectrales sont caractéristiques et bien connues que pour d’autres classes de

composés. Celle-ci devrait être facilitée au fur et à mesure du progrès des avancées techniques

en analytique et notamment de la LC/RMN. Les sujets d’études dans ce domaine ne manquent

donc pas et chaque plante est un réservoir potentiel de métabolites avec des caractéristiques

phytochimiques originales

V. Matériels et méthodes

200

G. Matériels et méthodes

G. 1 Matériel végétal et extraction

Identification de la plante

Tous les échantillons étudiés ont été récoltés entre juillet 2003 et février 2006 sur la piste de

Saint Elie en Guyane Française. Ils ont été identifiés par le Dr. Geneviève Bourdy, chargé de

recherche à l’IRD et cette identification a été confirmée par le Pr. Ricardo Callejas Posada de

l’Université d’Antioquia en Colombie. Les échantillons d’herbiers (1016, 1032, GB3141,

GB3142, GB3143, GB3144, GB3145, GB3162, GB3163, GB3164, GB3165, GB3166,

GB3167, GB3168, GB3169, GB3169bis, GB3171, GB3172, GB3174, GB3175, GB3176,

GB3177, GB3178, GB3179, GB3180, GB3181, GB3182, GB3183, GB3184, GB3185 et

odonne /delnatte6) ont été déposés à l’herbarium de l’IRD de Cayenne.

Préparation des échantillons

Au cours de ces recherches, nous avons travaillé sur des feuilles de Piper hostmannianum var.

berbicense. Elles ont été séchées en Guyane à température ambiante et à l’abri de la lumière

avant d’être envoyées à Toulouse. Elles ont été pulvérisées à l’aide d’un broyeur Retsch® avec

un tamis de 0,5 mm. Cette poudre est conservée à température ambiante, à l’abri de la lumière

et de l’humidité.

Extraction

• Extraction par l’ASE 100 Dionex

Les lots ont d’abord été extraits en petite quantité (environ 2 g de poudre) par l’acétate

d’éthyle à l’aide d’un extracteur ASE 100 de marque Dionex avant d’être envoyés à tester in

vitro sur P. falciparum. Cet appareil permet une extraction rapide en utilisant des solvants à

températures variables et à pression élevée (100 Bars). Les conditions d’extraction sont :

-Cartouche d’extraction de 10 ml.

-Nombre de cycles : 2.

-Température ambiante.


201

• Extraction par lixiviation

Les lots actifs sont ensuite extraits en grande quantité (500 g pour le lot 1016 et 900 g pour le

lot 1016bis) successivement par de l’hexane, du chloroforme et du méthanol.

La lixiviation (ou percolation) consiste à faire passer un solvant au travers d’une poudre de

plante jusqu’à épuisement de cette dernière. La percolation, même si elle est coûteuse en

temps et en solvant, offre l’avantage d’assurer une extraction quasi-totale des principes actifs

à température ambiante, diminuant ainsi les risques de dégradation.

G. 2 Méthodes chromatographiques analytiques

G. 2. 1 Chromatographie sur couche mince (CCM)

Utilisés à chaque étape pour le suivi et le contrôle des purifications, les chromatogrammes sur

couche mince permettent de vérifier la présence et l’état de pureté des produits suivis.

Les analyses sur couche mince sont réalisées en phase normale sur des plaques d’aluminium

recouvertes d’un gel de silice Silicagel 60 F254 (Merck). Le développement des plaques

s’effectue dans des cuves en verre saturées avec l’éluant approprié. Cette phase mobile est

constituée d’un mélange binaire ou tertiaire de solvants selon le type de séparation souhaitée.

Dans notre cas, les systèmes de solvants pour les différentes classes de composés sont les

suivants (les proportions sont données en volume et ils sont classés par polarité croissante) :

• Tol/AcOEt/MeOH (80/18/2)

• CHCl3/MeOH (90/10)

• CHCl3/MeOH/H2O (65/25/4)

L’observation des CCM s’effectue en lumière visible et sous UV (254 et 365 nm), avant et,

dans certains cas, après révélation par les réactifs appropriés.

L’utilisation de différents réactifs permet de rassembler judicieusement les fractions récoltées

suite aux différentes séparations chromatographiques.


202

Les réactifs utilisés pour le présent travail sont les suivants :

• Réactif à la Vanilline sulfurique (Révélateur universel).

Préparer une solution composée de 1 g de vanilline, 2 ml d’acide sulfurique et de l’éthanol à

95% q.s.p. 100 ml. Après pulvérisation, chauffer la plaque de CCM à 110°C pendant 5

minutes environ. Plusieurs colorations apparaissent en fonction du type de composés.

• Réactif de Neu ou NP/PEG (Révélateur des flavonoïdes).

Préparer une solution A composée de 1 g d’acide amino-2-éthyldiphénylborique et de 100 mL

de méthanol et une solution B composée de 5 g de PEG 4000 et de 100 ml d ‘éthanol.

Pulvériser un mélange de 10 mL de solution A et 8 mL de solution B (préalablement

mélangées avant pulvérisation). Chauffer la plaque de CCM à 110 °C pendant 2 minutes

environ. Observés en lumière UV à 365 nm, les flavonoïdes apparaissent sous forme de taches

fluorescentes jaunes, vertes ou orange [Wagner et Bladt, 2001].

• Réactif de Dragendorff (Révélateur des alcaloïdes).

Préparer une solution composée de 0,85 g de nitrate basique de bismuth et 10 g d’acide

tartrique dans 40 mL d’eau (solution A) et une solution contenant 16 g de KI dans 40 mL

d’eau (solution B). Mélanger extemporanément 5 mL de A, 5 ml de B, 100 ml d’eau et 20 g

d’acide tartrique. Vaporiser le mélange sur la plaque. Les alcaloïdes apparaissent sous forme

de taches oranges [Merck, 1975].

G. 2. 2 Chromatographie liquide haute performance (HPLC/DAD-UV)

Les analyses HPLC/UV(DAD) ont été effectuées à l'aide d'une chaîne HPLC Merck Hitachi

Lachrom munie d’une pompe Lachrom 7100 et d’un détecteur UV à barrettes de diodes

(DAD-UV) Merck Hitachi Lachrom 7455 pilotés par le logiciel D-7000 HSM (Merck).

Les analyses ont été réalisées en phase inverse avec une colonne HPLC de type Pursuit XRs

RP-18 (Varian) (5 µm, 250 x 4.6 mm). Les solvants utilisés sont de qualité HPLC et le débit

est fixé à 1 ml/min.

En règle générale, pour l’analyse HPLC/UV des extraits bruts, des solutions de 1 à 3 mg/ml

de solvant ont été utilisées. Pour toutes les analyses, les conditions chromatographiques ont

consisté en un gradient de MeOH/H2O. Le solvant d’injection est de composition identique à

celui du solvant initial de l’analyse et le volume d’injection fixé à 20 µL.


203

Conditions chromatographiques particulières :

• Composés Host3, Host4, Host5 et Host6 : élution selon un gradient MeOH/H2O : t=0

min 80% MeOH ; t=10 min 100% MeOH pendant 10 minutes puis retour aux

conditions initiales en 5 minutes.

• Composés Host8 et Host9 : élution en mode isocratique MeOH/H2O 60/40.

• Composés Host14, Host15 et Host16 : élution selon un gradient MeOH/H2O : t=0

min 60% MeOH ; t=20 min 100% MeOH pendant 10 minutes puis retour aux

conditions initiales en 5 minutes.

G. 2. 3 Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

Les analyses LC-MS ont été effectuées sur l’appareillage constitué des éléments suivants :

� Système HPLC TSP (Thermo Separation Product) muni d’une pompe quaternaire (P

4000), d’un autosampler (AS 3000) et d’un détecteur UV à barrettes de diodes (6000LP).

Elution selon un gradient MeOH/H2O : t=0 min jusqu’à t=20 min 60% MeOH jusqu’à 100%

MeOH pendant 5 min puis retour aux conditions initiales en 5 minutes. Débit 1 ml/min.

Détection UV réglée à 360 nm.

� Spectromètre de masse à trappe d’ions LCQ Finnigan équipé d’une interface d’ionisation

APCI et contrôlé par le logiciel Xcalibur. Température de la source : 420 °C, 37% d’énergie

de collision.

G. 3 Méthodes chromatographiques préparatives

G. 3. 1 Chromatographie sur colonne ouverte (CC)

Pour les chromatographies sur colonnes ouvertes, plusieurs types de phases ont été mises en

œuvre dans des colonnes en verre. La taille et le diamètre de la colonne sont choisis en

fonction de la quantité d’échantillon à purifier et de la résolution souhaitée.


204

Pour les chromatographies d’adsorption, la phase stationnaire utilisée est la silice en phase

normale SDS 60 Å 70-200 µm (SDS) préalablement activée quelques heures à l’étuve à 110

°C. L’élution est réalisée par simple gravité. La quantité de silice utilisée est généralement 30

à 50 fois supérieure à la quantité d’échantillon déposée. L’extrait à fractionner est adsorbé sur

une quantité de silice correspondant à environ 2 fois sa masse et le dépôt de l’extrait a lieu

sous forme solide.

Les chromatographies d’exclusion sont réalisées sur gel de Sephadex® LH20.

Les fractions recueillies sont regroupées selon les résultats de l’analyse par CCM.

G. 3. 2 Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC)

La chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) est réalisée à l’aide d’une pompe

Büchi 688, sur colonnes de chromatographie moyenne pression en verre Büchi remplies soit

avec de la silice SDS 60 Å 6-35 µm (SDS) en phase normale (préalablement activée quelques

heures à l’étuve à 110 °C), soit avec de la silice en phase inverse de type C18 90 Å 40-60 µm

(AIT).

L’échantillon est introduit sous forme solide mélangé à la phase stationnaire. Les systèmes

d’élution utilisés sont généralement des mélanges binaires dans des proportions variables au

cours de l’élution. La colonne est éluée avec un débit d’environ 20 mL/min et la pression est

en moyenne de 2 Bar.

Les fractions recueillies sont regroupées selon les résultats de l’analyse par CCM.

G. 3. 3 Chromatographie SPE sur cartouches de silice C18 (Vac elut®)

Les colonnes prêtes à l’emploi Analytichem Mega Bond ElutTM (Varian) utilisées sont garnies

de silice greffée C18. Ces cartouches, associées à une unité de filtration sous vide Vac Elut®

SPS 24 (Analytichem International), autorisent un réglage de débit précis à l’aide d’une

molette et d’un manomètre, sous vide contrôlé.


205

G. 3. 4 Chromatographie liquide haute performance semi-préparative (HPLC semi-

prep)

Les purifications ont été effectuées à l'aide d'une chaîne HPLC Merck Hitachi Lachrom munie

d’une pompe Lachrom 7100 et d’un détecteur UV à barrettes de diodes (DAD-UV) Merck

Hitachi Lachrom 7455 pilotés par le logiciel D-7000 HSM (Merck).

Les analyses ont été réalisées en phase inverse avec une colonne HPLC de type Microsorb

Dynamax RP-18 (Varian) (5 µm, 250 x 10 mm). Les solvants utilisés sont de qualité HPLC et

le débit est fixé à 3 mL/min.

G. 4 Méthodes physico-chimiques

G . 4. 1 Point de fusion

La mesure du point de fusion est réalisée sur un appareil Electrothermal 9100.

G 4. 2 Pouvoir rotatoire

Le pouvoir rotatoire a été mesuré sur un polarimètre de type Perkin-Elmer 241 à la longueur

d’onde de la raie D du sodium (λ= 589 nm) dans une cuve de 1 cm à température ambiante.

Le pouvoir rotatoire spécifique [α]D, exprimé en degré, est calculé à partir de la formule

suivante :

[α]D = 1000 . α / l . c

(α : angle de rotation, en degré, lu sur le polarimètre, l : longueur, en dm, de la cuve de

mesure, c : concentration de la molécule en solution en g/L)

G. 4. 3 Spectrométrie Ultraviolet (UV)

Les spectres UV des composés ont été mesurés dans le méthanol à l’aide d’un

spectrophotomètre de type Perkin-Elmer UV/Vis Lambda 20, double faisceau permettant des

lectures directes contre liquide de compensation. Les mesures se font dans des cuves de quartz

à trajet optique de 1 cm.


206

G. 4. 4 Spectrométrie Infra-rouge (IR)

Les spectres infra-rouge des molécules ont été réalisés au moyen d’un spectrophotomètre

Perkin-Elmer Paragon 1000 FT-IR dans des pastilles de KBr.

G. 4. 5 Spectrométrie de masse (MS)

Les spectres de masse en introduction directe et en LC/MS ont été réalisées sur un

spectromètre de masse à trappe d’ions LCQ Finnigan équipé d’une interface d’ionisation

APCI et contrôlé par le logiciel Xcalibur. Température de la source : 370 °C ; Débit : 15

µl/min ; Energie de collision appliquée pour les fragmentations en MS/MS est réglée de

manière à obtenir une transmission optimale des ions fils (en général entre 33% et 40% de 5

V).

Ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

APCI

L’APCI est une technique d’ionisation qui fait appel à des réactions ions-molécules en phase

gazeuse à pression atmosphérique. C’est une technique analogue à l’ionisation chimique (CI)

où les ions primaires sont produits par des décharges Corona sur un aérosol de solvant.

L’éluat chromatographique (maximum 2 ml/min) est directement introduit dans un nébuliseur

pneumatique où il est converti en un fin brouillard à l’aide d’un jet d’air ou d’azote à haute

vitesse. Les gouttelettes sont alors déplacées par le flux gazeux au travers d’un tube de quartz

chauffé, appelé chambre de désolvatation / vaporisation. La chaleur transférée aux gouttelettes

de l’aérosol va permettre la vaporisation de la phase mobile et de l’échantillon dans le courant

de gaz. Le contrôle de la température dans cette chambre rend les conditions de vaporisation

dépendantes du débit et de la nature de la phase mobile. Le gaz chaud (120 °C) et les

substances sortent de ce tube pour arriver dans la région de transfert de la source se trouvant à

pression atmosphérique où ils sont ionisés chimiquement par le transfert de protons en mode

positif et le transfert d’électrons en mode négatif. En général, la phase mobile vaporisée joue

le rôle de gaz ionisant en produisant des ions quasi-moléculaires [De Hoffmann et al., 1999].

Spectrométrie de masse haute résolution

Les spectres de masse de haute résolution ont été enregistrés en ESI sur un appareil Q-Tof

Ultima (Waters). Ces analyses ont été menées par Véréna Poinsot du Laboratoire des


207

Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique de l’Université Paul

Sabatier de Toulouse.

Ionisation par Electrospray (Electro Spray Ionisation) ESI

L’ionisation est ici produite par application, à pression atmosphérique, d’un fort champ

électrique (3 à 6 KeV) sur un liquide traversant un capillaire à un faible débit (1-10 µl.min-1).

Ce champ provoque une accumulation de charges à la surface du liquide, situé à l’extrémité

du capillaire. La rupture de la phase liquide forme des gouttelettes hautement chargées

(Spray). L’évaporation du solvant contenu dans ces gouttelettes va provoquer leur

rétrécissement jusqu’au sommet où des forces coulombiennes répulsives vont approcher le

niveau des forces de cohésion de celle-ci et provoquer leur explosion. Ces gouttelettes

subissent alors une cascade de fissions donnant des gouttelettes de plus en plus petites,

jusqu’au moment où le champ électrique en leur surface devient suffisant pour provoquer la

désorption des ions. Ces ions ainsi produits sont porteurs d’un grand nombre de charges s’il

existe plusieurs sites ionisables sur la molécule [De Hoffmann et al., 1999].

G. 4. 6 Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN)

Les spectres de résonance magnétique nucléaire ont été enregistrés au service commun de

RMN de l’Université Paul Sabatier de Toulouse sur des appareils de type Brüker Avance 300

et 400 (fréquences de 300.13 (1H) et 75.46 MHz (13C), et 400.13 (1H) et 100.03 MHz (13C)),

ou Brüker Avance 500 avec cryosonde (fréquences de 500.13 (1H) et 125.75 MHz (13C))

selon la quantité de produit à analyser et la résolution souhaitée.

Les échantillons ont été solubilisés dans les solvants deutérés CDCl3, DMSO-d6, MeOD

(Euriso-top, Gif sur Yvette) dans des tubes analytiques de 5 mm de diamètre.

Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en ppm par rapport au tétraméthylsilane

(TMS) ; les constantes de couplage sont exprimées en Hz.

Les programmes de séquences impulsionnelles standard fournies par Brüker ont été utilisées

pour chaque type d’analyse.


208

Corrélations homonucléaires

-COSY (1H – 1H): cette expérience fournit des informations sur les couplages homonucléaires

2J et 3J (protons séparés par deux ou trois liaisons) entre les protons voisins et ceux qui sont

adjacents.

-NOESY (1H – 1H) : cette technique permet d’observer, dans l’espace, les corrélations entre

protons (effets Overhauser) d’une même molécule.

Corrélations hétéronucléaires

-HSQC (1JH–C) : cette technique permet d'observer les couplages chimiques entre les carbones

et les protons directement liés entre eux.

-HMBC (2JH–C, 3JH–C) : cette technique permet la détection des couplages longue distance 2JH–

C et 2JH–C.

G. 4. 7 Diffraction aux rayons X

Les expériences ont été menées au service commun de l’Université Paul Sabatier de Toulouse

sur un diffractomètre Bruker-AXS CCD 1000 avec une radiation MoKα (λ = 0.71073 Å). La

résolution des structures a été faite à l’aide du logicierl SHELXS [Sheldrick, 1990]. Les

expériences ont été réalisées par le Pr. Heinz Gornitzka du Laboratoire d’hétérochimie

fondamentale et appliquée de l’Université Paul Sabatier de Toulouse.

G. 5 Test biologiques

G. 5. 1 Tests réalisés sur P. falciparum

G. 5. 1. 1 La culture in vitro

La première culture de P. falciparum fut réalisée par Trager et Jensen en 1976, ce qui permit

un développement considérable de l’étude du parasite et des drogues anti-paludiques. Les

tests in vitro sur Plasmodium nécessitent l’accessibilité permanente à une souche cultivée qui

fournit les parasites. Le milieu nutritif est composé de RPMI 1640 (Lonza) enrichi de 10% de

sérum humain AB+ (Etablissement Français du Sang) et de L-glutamine (2 mM) (acide aminé


209

essentiel) (Lonza). Ce milieu est changé tous les jours afin de renouveler les nutriments et de

rehausser le pH (autour de 7,2), les parasites libérant dans le milieu l’acide lactique issu du

métabolisme du glucose. Pour une bonne compatibilité sérique, les globules rouges sont de

groupe O et de Rhésus positif. La culture, placée dans un incubateur, est maintenue à 37 °C

dans un air humidifié et enrichi en CO2 (5%). La parasitémie est maintenue à 2% par dilution

quotidienne permettant ainsi le développement du parasite dans des conditions optimales. La

parasitémie est estimée par comptage visuel au microscope (x 1000) à partir d’un frottis

sanguin, coloré au Giemsa. Lorsque la parasitémie est supérieure à 2%, elle est abaissée par

division du culot globulaire centrifugé (avec ajout de globules rouges sains).

G. 5. 1. 2 La synchronisation [Lambros et Vanderberg, 1979]

Principe

Les tests biologiques sont réalisés sur une population de parasites de même génération. La

synchronisation de la souche repose sur la lyse simultanée de tous les globules rouges

parasités par des schizontes. En effet, afin de garantir l’accès aux métabolites plasmatiques, le

parasite perméabilise la membrane érythrocytaire mais la rend aussi sensible aux chocs

osmotiques. A un stade avancé du parasite, l’ajout de sorbitol dans le milieu lyse les

érythrocytes parasités par les schizontes mûrs alors que les autres globules résistent à ce choc.

Il ne reste alors que des globules rouges sains ou des globules parasités par des mérozoïtes et

des jeunes trophozoïtes (stade anneaux).

Mode opératoire

La culture est centrifugée (à 500 g pendant 5 min.), le surnageant est remplacé par neuf

volumes de solution de D-sorbitol (5% dans de l’eau distillée). Une fois homogénéisée, la

culture est placée à 37°C pendant 10 minutes puis centrifugée (à 500 g pendant 5 min.), ce qui

permet d’isoler le culot de globules rouges parasités par des formes anneaux, alors que les

lysats cellulaires sont en suspension.


210

G. 5. 1. 3 Evaluation de l’activité antiplasmodiale

Principe

P. falciparum est incapable de synthétiser ex novo les bases puriques (adénine, guanine)

contrairement aux bases pyrimidiques (uracile, thymine, cytosine). Il a donc besoin d’utiliser

les purines exogènes pour la synthèse de ses nucléotides puriques.

L’hypoxanthine est le précurseur principal utilisé par le parasite pour la synthèse des

nucléotides puriques. L’introduction d’hypoxanthine tritiée dans le milieu permet (par suivi

de la radioactivité β), de quantifier l’incorporation de ce précurseur dans le parasite et ainsi

d’évaluer le développement du parasite. L’incorporation étant plus grande dans les schizontes

que dans les anneaux, l’hypoxantine radio-marquée est introduite un jour après la préparation

des plaques.

Les souches de P. falciparum utilisées sont les souches FcB1 et F32. La souche FcB1,

originaire de colombie, est résistante à la chloroquine et la souche F32, originaire de

Tanzanie, est sensible à la chloroquine.

Mode opératoire

Les tests sont réalisés sur des plaques à 96 puits remplis d’un volume fixe d’hématies

parasitées (parasitémie de 1,0% et hématocrite de 1,5%). Les fractions à tester (à différentes

concentrations) sont alors additionnées en triplicata dans les puits. Après 24 heures

d’incubation à 37 °C, l‘hypoxantine tritiée est ajoutée à raison de 0,25 µCi/puits (Perkin

Elmer à 1 µCi/ml, France), et les plaques sont remises dans l’incubateur pendant 24 heures. A

la fin du cycle, les plaques sont congelées à - 20°C pour provoquer l’hémolyse des

érythrocytes. Après décongélation (4ème jour), les acides nucléiques sont collectés sur filtres à

l’aide d’un collecteur de cellules automatique (Perkin Elmer, France). La radioactivité

déposée sur le filtre (séché au micro-onde et enveloppé dans un plastique dans lequel sont

ajoutés 4 ml de liquide de scintillation (Betaplate Scint, Perkin Elmer) est alors mesurée par

un compteur β (Microbeta Trilux, Perkin Elmer).

Détermination de la CI50

L’ CI 50 (concentration de l’échantillon qui inhibe 50% de la croissance du parasite) est

déterminée par interpolation linéaire, à l’aide du rapport du % de parasitémie sur le

logarithme des concentrations des échantillons.


211

G. 5. 2 Tests de cytotoxicité réalisés sur des cellules MCF-7

Il s’agit de mesurer la cytotoxicité d’échantillons sur des cellules MCF-7 (cellules mammaires

cancéreuses humaines). La méthode utilisée repose sur l’estimation de l’inhibition de la

prolifération des cellules par spectrophotométrie.

Principe

Le principe repose sur la réduction enzymatique d'un sel de tétrazolium appelé XTT (sodium

2,3 Bis (2-méthoxy-4-nitro-5 sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanolide. Ce XTT est

réduit par les déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes, en présence du

coenzyme Q, il se forme un composé hydrosoluble orangé. Celui-ci est dosable par

spectrophotométrie à 450 nm.

Mode opératoire

Les cellules sont comptées sur une cellule de Malassez (plaque de microscope quadrillée). La

culture est ensemencée dans une plaque 96 puits à raison de 30 000 cellules par puits dans 200

µl de milieu. Les plaques sont mises dans l’incubateur (24 h à 37 °C, air humidifié, 5% CO2).

Le 2ème jour, les échantillons sont ajoutés au milieu (DMEM enrichi de 10% de sérum de veau

foetal) à différentes concentrations (0,1 ; 1 ; 10 et 100 µg/ml), puis les plaques sont mises à

incuber pendant 48 heures. Au 4ème jour, le XTT et le coenzyme Q sont ajoutés puis les

plaques sont mises à incuber pendant 3 heures de plus. La réaction est alors arrêtée par ajout

de SDS à 10% et l’absorbance de chaque puits est mesurée à 450 nm.

G. 5 . 3 Test in vivo sur souris

Les souris utilisées sont des souris swiss non consanguines (Le genest-sur-isle). Nous avons

utilisé la technique décrite par Peters en 1970. Sur des lots de cinq souris, l’inoculation est

faite par voie intra péritonéale à partir d’une suspension parasitaire de P. vinckeï petteri avec

100 µl de sang contenant 2.107 GRP par ml (J1). Le traitement commence deux heures après

l’infection. Les souris sont traitées par voie intra péritonéale avec une dose de produit à tester,

une fois par jour, pendant quatre jours consécutifs (J1, J2, J3, et J4).

Un lot de 5 souris traitées avec le solvant de la drogue (DMSO, qui sert à dissoudre le produit

à tester) constitue le groupe témoin de l’infection. Chaque concentration de produit à tester est

administrée à un lot de 5 souris. Au cinquième jour, J5, la parasitémie des souris traitées est


212

évaluée, par microscopie, par rapport au lot témoin et le pourcentage d’inhibition est calculé

selon la formule suivante :

% d’inhibition= (parasitémie du groupe témoin – parasitémie du groupe traité) x100

parasitémie du groupe témoin

La survie des souris est également évaluée par rapport au lot témoin.

VI. Références bibliographiques

213

Alvarez, L., Delgado, G., 1999. C-and O-Glycosyl-alpha-hydroxydihydrochalcones from Eysenhardtia polystachya. Phytochemistry 50, 681-687.

Anglaret, X., Mortier, E., 2003. Maladies infectieuses. Estem. Anto, R. J., Sukumaran, K., Kuttan, G., Rao, M. N., Subbaraju, V., Kuttan, R., 1995.

Anticancer and antioxidant activity of synthetic chalcones and related compounds. Cancer Lett 97, 33-37.

Arcus, V. L., Simpson, C. D., Main, L., 1992. An enolate intermediate in chalcone-flavanone

isomerization; saturation kinetics and a change in the rate-limiting step in the general-acid-catalyzed cyclization of 2',6'-dihydroxy-3,4,4'-trimethoxychalcone in amine buffer solutions. Journal of Chemical Research, Synopses, 80-81.

Ardanaz, C., Kavka, J., Guidugli, F. H., Favretto, D., Traldi, P., 1998. An unexpected methyl

loss observed in electron ionization of chalcones. Rapid Communications in Mass Spectrometry 12, 139-143.

Ardanaz, C. E., Kavka, J., Curcuruto, O., Traldi, P., Guidugli, F., 1991. On the structure of

[C9H6O]+. ions originating by electron impact induced decomposition of chalcone. Rapid Communications in Mass Spectrometry 5, 569-573.

Audier, H. E., 1966. Mass spectrometry of flavone compounds. Bulletin de la Societe

Chimique de France, 2892-2899. Basco, L. K., Ruggeri, C., Le Bras, J., 1994. Molécules antipaludiques: mécanismes d'action,

mécanismes de résistance et relations structure-activité des schizontocides sanguins. Masson.

Beynon, J. H., 1960. Mass Spectrometry and Its Applications to Organic Chemistry. Bohlmann, F., Ates, N., 1984. Three prenylated flavonoids from Helichrysum athrixiifolium.

Phytochemistry 23, 1338-1339. Bohlmann, F., Knauf, W., King, R. M., Robinson, H., 1979. Ein neues Diterpen und weitere

Inhaltsstoffe aus Baccharis-Arten. Phytochemistry 18, 1011–1014. Bruneton, J., 1999. Pharmacognosie: phytochimie, plantes médicinales. Paris. Burke, B., Nair, M., 1986. Phenylpropene, benzoic acid and flavonoid derivatives from fruits

of Jamaican Piper species. Phytochemistry 25, 1427-1430. Campbell, C. S., Kellogg, E. A., Stevens, P., Judd, W. S., Bouharmont, J., Evrard, C. M.,

2001. Botanique systématique: Une perspective phylogénétique. De Boeck Université. Candolle, D., 1869. Prodromus systematis naturalis, regni vegetabilis, section 16 (1). Edition

Masson et fils, Paris, 1869 (page 287). Chen, M., Theander, T. G., Christensen, S. B., Hviid, L., Zhai, L., Kharazmi, A., 1994.

Licochalcone A, a new antimalarial agent, inhibits in vitro growth of the human


214

malaria parasite Plasmodium falciparum and protects mice from P. yoelii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38, 1470-1475.

Chun-Lin Ye, Y.-H. L., 2004. Flavonoids from Cleistocalyx operculatus. Phytochemistry 65,

445-447. Cox, E., 1991. EG 1991. Systematics of parasitic Protozoa. J. I, 55-80. Cronquist, A., 1988. The evolution and classification of flowering plants. Columbia

University Press, New-York. De Hoffmann, E., Charette, J., Stroobant, V., 1999. Spectrométrie de masse. Dunod, Paris. Desjardins, R. E., Canfield, C. J., Haynes, J. D., Chulay, J. D., 1979. Quantitative assessment

of antimalarial activity in vitro by a semiautomated microdilution technique. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 16, 710-718.

Diaz , P. P., Tiberio, A. C., Joseph-Nathan, P., 1987. A chromene, an isoprenylated methyl

hydroxybenzoate and a C-methyl flavanone from the bark of Piper hostmannianum. Phytochemistry 26, 809-811.

Dominguez, J. N., Charris, J. E., Lobo, G., Gamboa de Dominguez, N., Moreno, M. M.,

Riggione, F., Sanchez, E., Olson, J., Rosenthal, P. J., 2001. Synthesis of quinolinyl chalcones and evaluation of their antimalarial activity. Eur J Med Chem 36, 555-560.

Dorin, D., Le Roch, K., Sallicandro, P., Alano, P., Parzy, D., Poullet, P., Meijer, L., Doerig,

C., 2001. Pfnek-1, a NIMA-related kinase from the human malaria parasite Plasmodium falciparum Biochemical properties and possible involvement in MAPK regulation. European journal of biochemistry 268, 2600-2608.

Dos Santos, P. R., de Limas Moreira, D., Guimaraes, E. F., Kaplan, M. A., 2001. Essential oil

analysis of 10 Piperaceae species from the Brazilian Atlantic forest. Phytochemistry 58, 547-551.

Duke, J. A., 2002. Handbook of Medicinal Spices. CRC Press, Floride. Duriyaprapan, S., Khuankhamnuan, C., Tanpanich, S, 2003. The plant resources of south-east

Asia III WOCMAP Congress on Medicinal and Aromatic Plants-Volume 1: Bioprospecting and Ethnopharmacology 675, 15-21.

Dutta, S., Som, J., 1978. Flavonoids from Piper aduncum. Journal of the indian chemical

society 55, 932. Fabre, N., Rustan, I., de Hoffmann, E., Quetin-Leclercq, J., 2001. Determination of flavone,

flavonol, and flavanone aglycones by negative ion liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 12, 707-715.


215

Frölich, S., Schubert, C., Bienzle, U., Jenett-Siems, K., 2005. In vitro antiplasmodial activity of prenylated chalcone derivatives of hops (Humulus lupulus) and their interaction with haemin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 55, 883-887.

Fukai, T., Sheng, C. B., Horikoshi, T., Nomura, T., 1996. Isoprenylated flavonoids from

underground parts of Glycyrrhiza glabra. Phytochemistry 43, 1119-1124. Genton B., D. A. V., 2007. Malaria:nouvelles stratégies de traitement. Forum Medical en

Suisse 7, 386-392. Go, M. L., Wu, X., Liu, X. L., 2005. Chalcones: An Update on Cytotoxic and

Chemoprotective Properties. Current Medicinal Chemistry 12, 483-499. Graham, S. W., Olmstead, R. G., 2000. Evolutionary significance of an unusual chloroplast

DNA inversion found in two basal angiosperm lineages. Current Genetics 37, 183-188.

Gu, J.-Q., Park, E. J., Vigo, J. S., Graham, J. G., Fong, H. H. S., Pezzuto, J. M., Kinghorn, A.

D., 2002. Activity-guided isolation of constituents of Renealmia nicolaioides with the potential to induce the phase II enzyme quinone reductase. Journal of Natural Products 65, 1616-1620.

Guidugli, F. H., Kakva, J., Santillan, R. L., Garibay, M. E., Joseph-Nathan, P., 1992. Origin

of the [M - H]+ ion in flavanone. Organic Mass Spectrometry 27, 1299-1304. Hanaee, J., Schilling, F. R., Partzsch, G. M., Brasse, H., Schwarz, G., Macias, F. A.,

Molinillo, J. M. G., Torres, A., Varela, R. M., Castellano, D., 1997. Bioactive flavonoids from Helianthus annuus cultivars. Phytochemistry 45, 683-687.

Harborne, J. B., 1993. The flavonoids: advances in research since 1986. Chapman &

Hall/CRC, London. Houngnikpo, M., 2004. Des maux pour les mots de l'Afrique. L'Harmattan. Hvattum, E., Ekeberg, D., 2003. Study of the collision-induced radical cleavage of flavonoid

glycosides using negative electrospray ionization tandem quadrupole mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry 38, 43-49.

Ichino, K., 1989. Two flavonoids from two Lindera umbellata varieties. Phytochemistry 28,

955-956. Ichino, K., Tanaka, H., Ito, K., 1990. Revised structures of linderatone and methyllinderatone.

Heterocycles 31, 549-553. Itagaki, Y., Kurokawa, T., Sasaki, S., Chang, C. T., Chen, F.-C., 1966. The mass spectra of

chalcones, flavones, and isoflavones. Bulletin of the Chemical Society of Japan 39, 538-543.

Jaramillo, M. A., Manos, P. S., 1988. Phylogeny and patterns of floral diversity in the genus

Piper (Piperaceae) 1. Botanical Soc America.


216

Jenett-Siems, K., Mockenhaupt, F. P., Bienzle, U., Gupta, M. P., Eich, E., 1999. In vitro

antiplasmodial activity of Central American medicinal plants. Tropical Medicine and International Health 4, 611-615.

Justesen, U., 2000. Negative atmospheric pressure chemical ionization low-energy collision

activation mass spectrometry for the characterization of flavonoids in extracts of fresh herbs. Journal of Chromatography, A 902, 369-379.

Justesen, U., 2001. Collision-induced fragmentation of deprotonated methoxylated flavonoids,

obtained by electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry 36, 169-178.

Justesen, U., Knuthsen, P., Leth, T., 1998. Quantitative analysis of flavonols, flavones, and

flavanones in fruits, vegetables and beverages by high-performance liquid chromatography with photo-diode array and mass spectrometric detection. J Chromatogr A 799, 101-110.

Kharazmi, A., 1997. Discovery of oxygentade chalcones as novel antimalarial agents. Annals

of Tropical Medicine And Parasitology 91, 91-96. Kim, Y. C., Kim, H. S., Wataya, Y., Sohn, D. H., Kang, T. H., Kim, M. S., Kim, Y. M., Lee,

G. M., Chang, J. D., Park, H., 2004. Antimalarial Activity of Lavandulyl Flavanones Isolated from the Roots of Sophora flavescens. Biological & Pharmaceutical Bulletin 27, 748-750.

Kofujita, H., Yaguchi, M., Doi, N., Suzuki, K., 2004. A novel cytotoxic prenylated flavonoid

from the root of Morus alba. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 73, 113-116.

Kretzschmar, R., Meyer, H. J., Teschendorf, H. J., 1970. Strychnine antagonistic potency of

pyrone compounds of the kavaroot (Piper methysticum Forst.). Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS) 26, 283-284.

Kutner, S., Breuer, W. V., Ginsburg, H., Cabantchik, Z. I., 1987. On the mode of action of

phlorizin as an antimalarial agent in in vitro cultures of Plasmodium falciparum. Biochem Pharmacol 36, 123-129.

Lago, J. H. G., Ramos, C. S., Casanova, D. C. C., de Morandim, A., Bergamo, D. C. B.,

Cavalheiro, A. J., Bolzani, V. d. S., Furlan, M., Guimaraes, E. F., Young, M. C. M., Kato, M. J., 2004. Benzoic Acid Derivatives from Piper Species and Their Fungitoxic Activity against Cladosporium cladosporioides and C. sphaerospermum. Journal of Natural Products 67, 1783-1788.

Lakshmanan, V., Bray, P. G., Verdier-Pinard, D., Johnson, D. J., Horrocks, P., Muhle, R. A.,

Alakpa, G. E., Hughes, R. H., Ward, S. A., Krogstad, D. J., 2005. A critical role for PfCRT K76T in Plasmodium falciparum verapamil-reversible chloroquine resistance. The EMBO Journal 24, 2294-2305.


217

Lambros, C., Vanderberg, J. P., 1979. Synchronization of Plasmodium falciparum Erythrocytic Stages in Culture. The Journal of parasitology 65, 418-420.

Lee, E. B., Shin, K. H., Woo, W. S., 1984. Pharmacological study on piperine. Arch Pharm

Res 7, 127-132. Lee, J., Bernasconi-Quadroni, F., Soltis, D. E., Soltis, P. S., Zanis, M., Zimmer, E. A., Chen,

Z., Savolainen, V., Chase, M. W., 1999. The earliest angiosperms: evidence from mitochondrial, plastid and nuclear genomes. Nature 402, 404-407.

Lee, J. S., Kim, D. H., Liu, K.-H., Oh, T. K., Lee, C. H., 2005. Identification of flavonoids

using liquid chromatography with electrospray ionization and ion trap tandem mass spectrometry with an MS/MS library. Rapid Communications in Mass Spectrometry 19, 3539-3548.

Levine, N. D., 1988. The Protozoan Phylum Apicomplexa. CRC Press Boca Raton, Fla. Li, R., Chen, X., Gong, B., Selzer, P. M., Li, Z., Davidson, E., Kurzban, G., Miller, R. E.,

Nuzum, E. O., McKerrow, J. H., 1996. Structure-based design of parasitic protease inhibitors. Bioorg Med Chem 4, 1421-1427.

Likhitwitayawuid, K., Angerhofer, C. K., Chai, H., Pezzuto, J. M., Cordell, G. A.,

Ruangrungsi, N., 1993. Cytotoxic and antimalarial alkaloids from the tubers of Stephania pierrei. Journal of Natural Products 56, 1468-1478.

Ma, Y., Han, G. Q., Li, C. L., Cheng, J. R., Arison, B. H., Hwang, S. B., 1991. Neolignans

from Piper polysyphorum C. DC. Yao Xue Xue Bao 26, 345-350. Ma, Y. L., Li, Q. M., Van den Heuvel, H., Claeys, M., 1997. Characterization of flavone and

flavonol aglycons by collision-induced dissociation tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 11, 1357-1364.

Mabry, T. J., Markham, K. R., Thomas, M., 1970. The systematic identification of flavonoids.

Springer. Markham, K. R., Wollenweber, E., Schilling, G., 1987. Structure revision for two C-methyl

flavanones from Pityrogramma pallida. Journal of Plant Physiology 131, 45-48. Mendis, K., Sina, B. J., Marchesini, P., Carter, R., 2001. The neglected burden of Plasmodium

vivax malaria. Am J Trop Med Hyg 64, 97-106. Merck, E., 1975. Révélateurs pour la chromatographie sur couche mince et sur papier. Miyakado, M., Kato, T., Ohno, N., Mabry, T. J., 1976. Pinocembrin and (+)-ß-eudesmol from

Hymenoclea monogyra and Baccharis glutinosa. Phytochemistry 15, 846. Mori, S. A., Cremers, G., Gracie, C., de Granville, J. J., Heald, S. V., Hoff, M., Mitchell, J.

D., 2002. Guide to the vascular plants of central French Guiana. Part 2. Dicotyledons. Mem. New York Bot. Gard 76, 1-776.


218

Mouchet, J., 2004. Biodiversité du paludisme dans le monde. John Libbey Eurotext. Mundina, M., Vila, R., Tomi, F., Gupta, M. P., Adzet, T., Casanova, J., Canigueral, S., 1998.

Leaf essential oils of three panamanian piper species. Phytochemistry 47, 1277-1282. Mustafa, K., Perry, N. B., Weavers, R. T., 2005. Lipophilic C-methylflavonoids with no B-

ring oxygenation in Metrosideros species (Myrtaceae). Biochemical Systematics and Ecology 33, 1049-1059.

Newman, D. J., Cragg, G. M., 2007. Natural Products as Sources of New Drugs over the Last

25 Years. Journal of Natural Products 70, 461-477. Nowakowska, Z., 2002. Electron ionization induced fragmentation of 4-hydroxychalcone

derivatives. Rapid Communications in Mass Spectrometry 16, 634-637. Nowakowska, Z., 2004. Structural assignment of chalcones and differentiation of their

isomeric derivatives by electron ionization induced fragmentation. Rapid Communications in Mass Spectrometry 18, 2513-2516.

Nowakowska, Z., 2006. A review of anti-infective and anti-inflammatory chalcones. Eur J

Med Chem. Ohashi H., G. M., Immamura H., 1977. A C-glucosyl-chalcone from the wood of Cladrastis

platycarpa. Phytochemistry 16, 1106-1107. Old, K. B., Main, L., 1982. The kinetics and mechanism of the cyclization of some 2'-

hydroxychalcones to flavanones in basic aqueous solution. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2: Physical Organic Chemistry (1972-1999), 1309-1312.

OMS, 2000. La situation actuelle du paludisme dans le monde Orjala, J., Wright, A. D., Behrends, H., Folkers, G., Sticher, O., Ruegger, H., Rali, T., 1994.

Cytotoxic and antibacterial dihydrochalcones from Piper aduncum. Journal of Natural Products 57, 18-26.

Orjala, J., Wright, A. D., Erdelmeier, C. A. J., Sticher, O., Rali, T., 1993. New monoterpene-

substituted dihydrochalcones from Piper aduncum. Helvetica Chimica Acta 76, 1481-1488.

Parmer, V. S., Jain, S. C., Bisht, K. S., Jain, R., Taneja, P., Jha, A., Tyagi, O. D., Prasad, A.

K., Wengel, J., Olsen, C. E., 1997. Phytochemistry of the genus Piper. Phytochemistry 46, 597-673.

Parmer, V. S., Jain, S. C., Gupta, S., Talwar, S., Rajwanshi Singh, V. K., Kumar, R., Azim,

A., Malhotra, S., Kumar, N., Jain, R., 1998. Polyphenols and alkaloids from Piper species. Phytochemistry 49, 1069-1078.


219

Password, F., 2003. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG II. Botanical Journal of the Linnean Society 141, 399-436.

Peters, W., 1970. Chemotherapy and Drug Resistance in Malaria. Academic Press, London. Portet, B., Fabre, N., Roumy, V., Gornitzka, H., Bourdy, G., Chevalley, S., Sauvain, M.,

Valentin, A., Moulis, C., 2007. Activity-guided isolation of antiplasmodial dihydrochalcones and flavanones from Piper hostmannianum var. berbicense. Phytochemistry.

Qian, F., Ye, C. L., Wei, D. Z., Lu, Y. H., Yang, S. L., 2005. In vitro and in vivo reversal of

cancer cell multidrug resistance by 2', 4'-dihydroxy-6'-methoxy-3', 5'-dimethylchalcone. J Chemother 17, 309-314.

Resurreccion-Magno, M. H. C., Villasenor, I. M., Harada, N., Monde, K., 2005.

Antihyperglycaemic flavonoids from Syzygium samarangense (Blume) Merr. and Perry. Phytotherapy Research 19, 246-251.

Rinaldi, A., 2004. Fighting malaria at the crossroads. EMBO Reports 5, 847-851. Rouvier E, M. H., Cambon Aimé, 1976. Etude en spectrométrie de masse. Organic Mass

Spectrometry 11, 800-813. Rukachaisirikul, T., Prabpai, S., Champung, P., Suksamram, A., 2002. Chabamide, a novel

piperine dimer from stems of Piper chaba. Planta medica 68, 853-855. Salem, M. M., Werbovetz, K. A., 2005. Antiprotozoal compounds from Psorothamnus

polydenius. Journal of Natural Products 68, 108-111. Schröder, J., Raiber, S., Berger, T., Schmidt, A., Schmidt, J., Soares-Sello, A. M., Bardshiri,

E., Strack, D., Simpson, T. J., Veit, M., 1998. Plant polyketide synthases: a chalcone synthase-type enzyme which performs a condensation reaction with methylmalonyl-CoA in the biosynthesis of C-methylated chalcones. Biochemistry 37, 8417-8425.

Sengupta, S., Ray, A. B., 1987. The chemistry of Piper species: a review. Fitoterapia 58, 147-

165. Sheldrick, G. M., 1990. Phase annealing in SHELX-90: direct methods for larger structures.

Acta Crystallographica, Section A: Foundations of Crystallography A46, 467-473. Shibata, K., Tatsukawa, A., Umeoka, K.-I., Lee, H. S., Ochi, M., 2000. Crinatusins, bioactive

Diels-Alder adducts from Cyathocalyx crinatus. Tetrahedron 56, 8821-8824. Shirley, B. W., 1996. Flavonoid biosynthesis: a new function for an old pathway. Trends in

plant science 1, 377-382. Som, U. K., Dutta, C.P., 1983. National academy of science letters 6, 271.


220

Souza L.A., M. J. H., Oliveira H.G, 2004. Comparative morphology and anatomy of the leaf and stem of Peperonia dahlstedii C.DC., Ottonia martiana Miq. and Piper diospyrifolium Kunth. Gayana botanica 6, 6-17.

Spichiger, R.-É., V. V. Savolainen, D. Jeanmonod, 2000. Botanique systématique des plantes

à fleurs. Presses polytechniques et universitaires romandes, Lausanne. Stevens, J. F., Miranda, C. L., Frei, B., Buhler, D. R., 2003. Inhibition of peroxynitrite-

mediated LDL oxidation by prenylated flavonoids: the alpha, beta-unsaturated keto functionality of 2'-hydroxychalcones as a novel antioxidant pharmacophore. Chem Res Toxicol 16, 1277-1286.

Stevens, P., 2001. Angiosperm phylogeny website.

http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb. Stobiecki, M., 2000. Application of mass spectrometry for identification and structural

studies of flavonoid glycosides. Phytochemistry 54, 237-256. Tai, Y., Pei, S., Wan, J., Cao, X., Pan, Y., 2006. Fragmentation study of protonated chalcones

by atmospheric pressure chemical ionization and tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 20, 994-1000.

Takashima, J., Ohsaki, A., 2002. Brosimacutins AI, Nine New Flavonoids from Brosimum

acutifolium. Journal of Natural Products 65, 1843-1847. Takayama, M., Fukai, T., Hano, Y., Nomura, T., 1992. Mass spectrometry of prenylated

flavonoids. Heterocycles 33, 405-434. Tanaka, R., Matsunanga, S., Sasaki, T., 1989. A New Flavanone Derivative from the Leaves

of Tsuga diversifolia. Planta Med 55, 570-571. Touze, J. E., Fourcade, L., Pradines, B., Hovette, P., Paule, P., Heno, P., 2002. Les modes

d'action des antipaludiques intérêt de l'association atovaquone-proguanil. Medecine tropicale 62, 219-224.

Trager, W., Jensen, J. B., 1976. Human malaria parasites in continuous culture. Science 193,

673-675. Tunmann, 1918. Apotheker Zeitung 33, 353 Valentin, A., Benoit-Vical, F., Moulis, C., Stanislas, E., Mallie, M., Fouraste, I., Bastide, J.-

M., 1997. In vitro antimalarial activity of penduline, a bisbenzylisoquinoline from Isopyrum thalictroides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 41, 2305-2307.

Van Andel, T. R., 2000. Non-Timber Forest Products of the Northwest District of Guyana,

Part I and II. Tropenbos-Guyana Series 8A and 8B. Georgetown: Tropenbos-Guyana Programme.

Van De Sande, C., Serum, J. W., Vandewalle, M., 1972. Organic mass spectrometry. XII.

Mass spectra of chalcones and flavanones. Isomerization of 2'-hydroxychalcone and flavanone. Organic Mass Spectrometry 6, 1333-1346.


221

Vangapandu S., J. M., Kaur K., Patil P., Patel S., Jain R., 2007. Recent advances in

antimalarial drug development. Medicinal research reviews 27, 65-107. Vederas, J. C., Leeper, F. J., 2000. Biosynthesis: Aromatic Polyketides, Isoprenoids,

Alkaloids. Springer. VIHPAL, 1999-2000. Programme VIHPAL: action concertée incitative 1999-2000. Ministère

de la recherche Française, pp. 1-96. Vila, R., Milo, B., Tomi, F., Casanova, J., Ferro, E. A., Canigueral, S., 2001. Chemical

composition of the essential oil from the leaves of Piper fulvescens, a plant traditionally used in Paraguay. J Ethnopharmacol 76, 105-107.

Wagner, H., Bladt, S., 2001. Plant drug analysis. A thin layer chromatography Atlas.

Springer New York. WHO, 2005. World malaria report 2005 (WHO). Wolfender, J. L., Waridel, P., Ndjoko, K., Hobby, K. R., Major, H. J., Hostettmann, K., 2000.

IT-MS n for the dereplication of flavonoids and related compounds in crude plant extracts. Analusis 28.

Wollenweber, E., Wehde, R., Dorr, M., Lang, G., Stevens, J. F., 2000. C-methyl-flavonoids

from the leaf waxes of some Myrtaceae. Phytochemistry 55, 965-970. Ye, M., Yan, Y., Guo, D.-a., 2005. Characterization of phenolic compounds in the Chinese

herbal drug Tu-Si-Zi by liquid chromatography coupled to electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 19, 1469-1484.

Yenesew, A., Induli, M., Derese, S., Midiwo, J. O., Heydenreich, M., Peter, M. G., Akala, H.,

Wangui, J., Liyala, P., Waters, N. C., 2004. Anti-plasmodial flavonoids from the stem bark of Erythrina abyssinica. Phytochemistry 65, 3029-3032.

Zhang, H. J., Tamez, P. A., Hoang, V. D., Tan, G. T., Hung, N. V., Xuan, L. T., Huong, L.

M., Cuong, N. M., Thao, D. T., Soejarto, D. D., 2001. Antimalarial compounds from Rhaphidophora decursiva. J. Nat. Prod 64, 772-777.

Zhang, J., Brodbelt, J. S., 2003. Structural characterization and isomer differentiation of

chalcones by electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry 38, 555-572.

Zhou, D.-y., Xu, Q., Xue, X.-y., Zhang, F.-f., Liang, X.-m., 2006. Identification of O-

diglycosyl flavanones in Fructus aurantii by liquid chromatography with electrospray ionization and collision-induced dissociation mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 42, 441-448.

VII. Annexes

222

Host1 5,7-dihydroxy-6-p-menthen-flavanone

Lindératone [Ichino et al., 1990]

O

OHO

OH

C25H28O4 392 g/mole

Aspect : poudre blanche Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –32,4 (c 0,5, CHCl3). UV : λmax (MeOH) 295, 335 nm. IR : (KBr) υmax 3435 (br OH), 1635 (C=O), 1620, 1580 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 391. RMN 1H : (CDCl3 400 MHz) δ 12.48, 12.49 ( ½ H × 2, s× 2 , OH chelated), 7.4-7.5 (5H, m, Ar-H), 6.92, 6.93 (½ H × 2, s× 2, OH), 6.03, 6.04 (½ H × 2, s× 2, H-8), 5.51 (1H, brs, H-2”), 5.41, 5.46 (½ H × 2, dd, J= 3.1, 12.9 Hz, H-2), 3.90 (1H, brd, H-3”), 3.09, 3.10 (½ H × 2, dd, J= 12.9, 17.1 Hz, H-3α), 2.82, 2.84 ((½ H × 2, dd, J= 3.1, 17.1 Hz, H-3β), 2.15 (2H, m, H-6”), 1.80 (1H, s, H-1”), 1.62 (1H, m, H-8”), 1.82, 1.45 (2H, m, H-5”), 0.88, 0.89, 0.90, 0.91 (3/2 H × 4, d× 2, J=6.9 Hz) RMN13C : (CDCl3, 100 MHz) δ 195 (C, C-4), 164.7 (C, C-5), 162.0 (C, C-9), 161.2 (C, C-7), 141.0 (C, C-1”), 138.7 (C, C-1’), 128.8 (CH, C-2’, C-3’), 128.7 (CH, C-5’, C-6’), 126.2 (CH, C-4’), 124.4 (CH, C-2”), 110.3 (C, C-6), 102.6 (C, C-10), 96.6 (CH, C-8), 79.1 (CH, C-2), 44.0 (CH, C-4”), 43.8 (CH2, C-3), 34.3 (CH, C-3”), 30.6 (CH2, C-6”), 27.9 (CH, C-8”), 23.7 (CH3, C-7”), 22.0 (CH2, C-5”), 21.7 (CH3, C-10”), 16.4 (CH3, C-9”).

VII. Annexes

223

Host2 2’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4α-isopropyl-1β-méthyl-cyclohexane-1-O-5-yl)

dihydrochalcone ; Hostmanin A et Hostmanin B [Portet et al., 2007]

O

OOH

O O

OOH

O

C26H32O4 408 g/mole

Aspect : cristaux. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –31 (c 0.15, MeOH). UV : λmax (MeOH) 206, 292 nm. IR : (KBr) υmax 3425 (chelated OH), 1616 (C=O), 1585 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 407. RMN 1H : Host2a (CDCl3, 500 MHz), δ 13.90 (1H, s, OH-2’), 7.29-7.21 (4H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.02 (1H, s, H-3’), 3.83 (3H, s, OCH3), 3.49 (2H, m, H-α), 3.39 (1H, m, H-5’’), 3.06 (2H, t, H-β), 1.91 (1H, dd , J= 13.4 , 3.4 Hz, Ha-6’’), 1.78 (1H, m, H-8’’), 1.74 (1H, m, Ha-2’’), 1.61 (1H, m, Hb-2’’), 1.53 (2H, m, H-3’’), 1.51 (1H, dd, J= 13.4, 5.3 Hz, Hb-6’’), 1.36 (3H, s, H-7’’), 1.21 (1H, m, H-4’’), 1.08 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-9’’), 0.97 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-9’’). Host2b (CDCl3, 500 MHz), δ 13.90 (1H, s, OH-2’), 7.29-7.21 (4H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.01 (1H, s, H-3’), 3.80 (3H, s, OCH3), 3.49 (2H, m, H-α), 3.49 (1H, m, H-5’’), 3.06 (2H, t, H-β), 1.99 (1H, m, Ha-2’’),1.81 (1H, m, Ha-6’’), 1.73 (1H, Hb-6’’), 1.63 (2H, m, H-3’’), 1.53 (1H, m, Hb-2’’), 1.37 (3H, s, H-7’’), 1.24 (1H, m, H-4’’), 1.22 (1H, m, H-8’’),1.09 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-9’’), 0.75 (3H, d, J= 6.8 Hz, H-9’’). RMN13C : Host2a (CDCl3, 125 MHz), δ 204.9 (C, C=O), 165.4 (C, C-6’), 162.3 (C, C-4’), 158.9 (C, C-2’), 141.8 (C, C-1), 128.4 (CH, C-3, C-5),128.3 (CH, C-2, C-6), 125.9 (CH, C-4), 106.8 (CH, C-5’), 104.7 (C, C-1’), 91.2 (C, C-3’), 77.9 (C, C-1”), 55.7 (CH3, OCH3), 45.5 (CH2, C-α), 44.0 (C, C-4”), 35.3 (CH, C-6”), 30.7 (CH2, C-β), 30.1 (CH2, C-2”), 29.2 (CH3,

C-7’’), 27.2 (CH2, C-3”), 26.3 (CH, C-8”), 22.1 (CH3, C-10”), 20.9 (CH3, C-9”), 20.5 (CH, C-5”). Host2b (CDCl3, 125 MHz), δ 204.8 (C, C=O), 165.3 (C, C-6’), 163.2 (C, C-4’), 159.3 (C, C-2’), 141.8 (C, C-1), 128.4 (CH, C-3, C-5),128.3 (CH, C-2, C-6), 125.8 (CH, C-4), 103.5 (CH, C-5’), 104.9 (C, C-1’), 91.0 (C, C-3’), 76.7 (C, C-1”), 55.1 (CH3, OCH3), 45.5 (CH2, C-α), 49.9 (C, C-4”), 40.2 (CH, C-6”), 30.7 (CH2, C-β), 36.9 (CH2, C-2”), 28.7 (CH3, C-7’’), 28.4 (CH2, C-3”), 29.6 (CH, C-8”), 20.4 (CH3, C-10”), 22.4 (CH3, C-9”), 22.5 (CH, C-5”).

VII. Annexes

224

Host3 rel-(1’’ R,4’’R,5’’S,6’’S)-2’-hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4-isopropyl-1-méthyl-

cyclohexan-1-ol-5, 6-O-yl) dihydrochalcone; Hostmanin C [Portet et al., 2007]

O

OO

OH

H H

OH

C26H32O5 424 g/mole

Aspect : poudre blanche. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 + 4 (c 0.17, MeOH). UV : λmax (MeOH) 232, 285 nm. IR : (KBr) υmax 3390 (br OH), 1633 (C=0), 1600, 1580 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 423. RMN 1H : (CDCl3 , 500 MHz) δ 13.26 (s, OH-2’), 7.3-7.2 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.09 (1H, s, H-3’), 4.54 (1H, dd, J= 5.7, 1.2 Hz, H-6”), 3.84 (3H, s, CH3), 3.41 (2H, m, H-α), 3.07 (1H, t, J=5.7, H-5”), 3.07 (2H, t, J= 7.9 Hz, H-β), 1.88 (1H, m, H-8”), 1.79 (1H, m, Ha-2”), 1.68 (1H, m, Hb-2”), 1.67 (2H, m, Hb-3”), 1.41 (3H, s, H-7”), 1.21 (2H, m, Ha-3”), 1.11 (1H, m, H-4’’), 0.90 (3H, d, J=7 Hz, H-9”), 0.86 (3H, d, J=7 Hz, H-10”). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 203.4 (C, C=O), 165.5 (C, C-2’), 161.7 (C, C-6’), 161.3 (C, C-4’), 141.2 (C, C-1), 128.6 (CH, C-3, C-5),128.2 (CH, C-2, C-6), 126.3 (CH, C-4), 112.9 (C, C-5’), 102.7 (C, C-1’), 92.9 (CH, C-3’), 89.2 (CH, C-6”), 81.9 (C, C-1”), 55.5 (CH3, OCH3), 44.2 (CH2, C-α), 46.8 (C, C-4”), 41.1 (CH, C-5”), 30.6 (CH2, C-β), 30.3 (CH2, C-2”), 26.9 (CH, C-8”), 21.8 (CH3, C-10”), 21.2 (CH3, C-7’’), 19.4 (CH2, C-3”), 15.3 (CH3, C-9”).

VII. Annexes

225

Host4 rel-(1’’ R,4’’S,5’’S,6’’S)-2’-hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4-isopropyl-1-méthyl-

cyclohexan-1-ol-5, 6-O-yl) dihydrochalcone; Adunctine E [Ichino et al., 1990]

O

OO

OH

H H

OH

C26H32O5 424 g/mole

Aspect : poudre blanche. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 +16.3 (c 0,65, MeOH) UV : λmax (MeOH) 232, 285 nm. IR : (KBr) υmax 3390 (br OH), 1633 (C=0), 1600, 1580 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 423. RMN 1H : (CDCl3 , 500 MHz) δ 13.26 (s, OH-2’), 7.3-7.2 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.07 (1H, s, H-3’), 4.52 (1H, dd, J= 5.7, 1.2 Hz, H-6”), 3.84 (3H, s, CH3), 3.37 (2H, m, H-α), 3.10 (1H, dd, J= 11, 5.7 Hz, H-5”), 3.06 (2H, t, J= 7.9 Hz, H-β), 2.01 (1H, m, Ha-2”), 1.85 (1H, m, H-8”), 1.60 (1H, m, Hb-2”), 1.46 (3H, s, H-7”), ”), 1.37 (1H, m, H-4’’), 1.37 (2H, m, Hb-3”), 1.33 (2H, m, Ha-3), 0.86 (3H, d, J=7 Hz, H-9”), 0.83 (3H, d, J=7 Hz, H-10”). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 203.3 (C, C=O), 165.3 (C, C-2’), 161.8 (C, C-6’), 161.6 (C, C-4’), 141.3 (C, C-1), 128.4 (CH, C-2, C-6), 128.3 (CH, C-3, C-5), 126.0 (CH, C-4), 113.2 (C, C-5’), 102.7 (C, C-1’), 92.9 (CH, C-3’), 87.6 (CH, C-6”), 80.9 (C, C-1”), 55.5 (CH3, OCH3), 46.3 (C, C-4”), 44.7 (CH2, C-α), 39.8 (CH, C-5”), 31.8 (CH2, C-2”), 30.1 (CH2, C-β), 27.2 (CH, C-8”), 22.0 (CH3, C-7’’), 21.8 (CH3, C-10”), 17.2 (CH2, C-3”), 15.4 (CH3, C-9”).

VII. Annexes

226

Host5 rel-(1’’ R,4’’S,5’’S,6’’R)-2’-hydroxy-4’-hydroxy-4’-méthoxy-5’,6’-O-(4-isopropyl-1,6-epoxy-

1-méthyl-cyclohexane-5-yl) dihydrochalcone

O

OHO

OH

H O

C26H32O5 424 g/mole

Aspect : poudre blanche. UV : λmax (MeOH) 230, 283 nm. IR : (KBr) υmax 3390 (br OH), 1633 (C=0), 1600, 1580 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 423. RMN 1H : 1H NMR (CDCl3 , 500 MHz) δ 13.26 (s, OH-2’), 7.3-7.2 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.07 (1H, s, H-3’), 4.52 (1H, dd, J= 5.7, 1.2 Hz, H-6”), 3.84 (3H, s, CH3), 3.37 (2H, m, H-α), 3.12 (1H, dd, J= 11, 5.7 Hz, H-5”), 3.05 (2H, t, J= 7.5 Hz, H-β), 1.87 (1H, m, H-8”), 1.78 (1H, m, Ha-2”), 1.67 (1H, m, Hb-2”), 1.42 (2H, m, H-3”), 1.39 (3H, s, H-7”), 1.08 (1H, m, H-4’’), 0.92 (3H, d, J=7 Hz, H-9”), 0.86 (3H, d, J=7 Hz, H-10”). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 203.3 (C, C=O), 165.3 (C, C-2’), 161.8 (C, C-6’), 161.6 (C, C-4’), 141.3 (C, C-1), 128.4 (CH, C-2, C-6), 128.3 (CH, C-3, C-5), 126.0 (CH, C-4), 112.9 (C, C-5’), 102.7 (C, C-1’), 92.8 (CH, C-3’), 92.4 (CH, C-6”), 69.3 (C, C-1”), 55.5 (CH3, OCH3), 46.6 (C, C-4”), 43.7 (CH2, C-α), 39.6 (CH, C-5”), 35.3 (CH2, C-2”), 30.2 (CH2, C-β), 28.2 (CH3, C-7’’), 27.2 (CH, C-8”), 21.8 (CH3, C-10”), 17.2 (CH2, C-3”), 15.4 (CH3, C-9”).

VII. Annexes

227

Host6 (1’R*, 6’R*)-(4,6-dihydroxy-5-méthyl-3-methylester-2-méthoxyphényl)-(3’-isohexenyl-1’-

phénylcyclohex-3’-enyl) méthanone. Hostmanine D

OOH

HO O

O O

C29H34O6 478 g/mole

Aspect : prismes jaunes. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –31 (c 0.15, MeOH). UV : λmax (MeOH) 206, 292 nm. IR : (KBr) υmax 3425 (chelated OH), 1616 (C=O), 1585 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 477. RMN 1H : (CDCl3 , 500 MHz) δ 12.23 (1H, s, OH-6), 12.06 (1H, s, OH-4), 7.10-7.12 (4H, m, H-2’’, H-3’’, H-5’’, H-6’’), 7.06 (1H, m, H-4’’), 5.55 (1H, brs, H-4’), 5.13 (1H, d, J= 6.8 Hz, H-8’), 4.21 (1H, ddd, J= 10.2, 10.2, 5.4 Hz, H-6’), 4.03 (3H, s, (C=O)O-CH3)), 3.79 (3H, s, OCH3), 2.49 (2H, m, H-5’), 2.25 (2H, m, H-2’), 2.05-2.013 (2H, m, H-12’), 2.12 (1H, m, Ha-7’), 2.03 (1H, m, Hb-7’), 1.90 (3H, s, CH3-5), 1.73 (3H, s, H-10’), 1.64 (3H, s, H-11’). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 210.8 (C, C=O, C-7), 170.9 (C, O-C=O), 164.8 (C, C-4), 164.2 (C, C-6), 163.8 (C, C-2), 137.4 (C, C-3’), 131.7 (C, C-9’), 128.1 (C, C-3’’-C-5’’), 127.5 (C, C-2’’-C-6’’), 124.1 (C, C-8’), 118.9 (C, C-4’), 111.2 (C, C-1), 108.6 (C, C-5), 99.4 (C, C-3), 65.2 (CH3, O-CH3), 51.5 (CH, C-6’), 45.1 (C, C-1’), 37.3 (CH2, C-2’), 37.4 (CH2, C-7’), 30.2 (CH2, C-5’), 26.4 (CH2, C-12’), 25.8 (CH2, C-11’), 17.7 (CH3, C-10’), 7.3 (CH3, CH3-C).

VII. Annexes

228

Host7 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxy-5’-p-menthen-dihydrochalcone. (-)-méthyllindératin

O

OHO

OH C26H32O4 408 g/mole

Aspect : huile incolore. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –40.1 (c 0,1, CHCl3). UV : λmax (MeOH) 211, 289 nm. IR : (KBr) υmax 3359 (br OH), 1623 (C=O), 1580, 1450 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 407. RMN 1H : (CDCl3 , 400 MHz) ) δ 13.74 (1H, s, OH-2’), 7.31 (4H, m, H-2, H-3, H-5, H-6), 7.23 (1H, m, H-4), 7.1 (1H, s, OH-6’), 6.07 (1H, s, H-3’), 5.50 (1H, s, H-6”), 3.81 (3H, s, OCH3), 3.42 (2H, ddd, J=1.6, 4.9, 7.3 Hz, H-α), 3.39 (1H, brd, J=10 Hz, H-5”), 3.03 (2H, t, J= 7.3 Hz, H-β), 2.12 (2H, m, H-2”), 1.81 (3H, s, H-7”), 1.79 (1H, m, Ha-3”), 1.56 (1H, m, H-4”), 1.49 (1H, m, H-8”), 1.4 (1H, m, Hb-3”), 0.85 (3H, d, J=6.7 Hz, H-10”), 0.82 (3H, d, J=6.7 Hz, H-9”) RMN13C : (CDCl3, 100 MHz), δ 205.2 (C, C=O), 165.2 (C, C-2’), 163.9 (C, C-4’), 158.8 (C, C-6’), 142.2 (C, C-1), 141.7 (C, C-1”), 128.8 (CH, C-3, C-5), 128.6 (CH, C-2, C-6), 126.1 (CH, C-4), 124.5 (CH, C-6”), 109.1 (C, C-5’), 106.1 (C, C-1’), 92.2 (CH, C-3’), 55.8 (CH3, OCH3), 46.4 (CH2, C-α), 43.8 (CH, C-4”), 34.9 (CH, C-5”), 30.8 (CH2, C-2”), 28.1 (CH, C-8”), 24.1 (CH3, C-7”), 21.9 (CH3, C-10”), 16.4 (CH3, C-9”).

VII. Annexes

229

Host8 5,7-dihydroxy-6-méthylflavanone. Strobopinine

[Diaz et al., 1987]

O

OOH

HO

C16H14O4 270 g/mole

Aspect : poudre blanche. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –90,4 (c 0,05, CHCl3). UV : λmax (MeOH) 295, 335 nm. IR : (KBr) υmax 3125 (OH), 1635 (C=O), 1620,1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 269. RMN 1H : 1H NMR (CDCl3 , 500 MHz) δ 12.34 (s, OH), 7.4-7.5 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 6.03 (1H, s, H-8), 5.43 (1H, dd, J=13, 3.0 Hz, H-2), 3.10 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.85 (1H, dd, J= 3.0, 17.1 Hz, H-3β), 2.09 (3H, s, CH3-6). RMN13C : (CDCl3, 125 MHz), δ 195.9 (C, C=O), 162.6 (C, C-5), 161.7 (C, C-9), 160.6 (C, C-7), 138.5 (C, C-1’), 128.8 (CH, C-2’, C-6’), 128.9 (CH, C-3’, C-5’), 126.2 (CH, C-4’), 104.0 (C, C-6), 103.0 (C, C-10), 94.8 (CH, C-8), 79.2 (C-2), 43.5 (CH2, C-3), 6.7 (CH3-6).

VII. Annexes

230

Host9 2’,6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone

[Burke et Nair, 1986 ; Orjala et al., 1994]

OH

OHO

O C16H16O4 272 g/mole

Aspect : poudre blanche UV : λmax (MeOH) 211, 286 nm. IR : (KBr) υmax 3264 (br, OH), 1646 (C=O), 1600, 1526 cm-1 (cycle aromatique) MS : (-)-APCI, m/z 271. RMN 1H : 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ 12.33 (1H, s, OH-2’), 7.27 (5H, m, H-2, H-6, H-3, H-5, H-6), 5.97 (2H, s, H-3’, H-5’), 3.75 (3H, s, CH3O), 3.33 (2H, t, J=7,5 Hz, H-α), 2.91 (2H, t, J=7,5 Hz, H-β). RMN13C : (DMSO-d6, 125 MHz), δ 205.1 (C, C=O), 165.9 (C, C-4’), 164.5 (C, C-2’,C-6’), 142.0 (C, C-1), 128.8 (CH, C-2, C-6), 128.7 (CH, C-3, C-5), 126.3 (CH, C-4), 105.0 (C, C-1’), 93.7 (CH, C-3’, C-5’), 55.8 (CH3, OCH3), 45.6 (CH2, C-α), 30.5 (CH2, C-β).

VII. Annexes

231

Host10 5,7-dihydroxy-6,8-diméthylflavanone. 6,8-diméthylpinocembrine.

[Diaz et al., 1987 ; Mustafa et al., 2005]

O

OOH

HO

C17H16O4 284 g/mole

Aspect : cristaux jaunes clairs. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –48 (c 3,8, CH3COCH3). UV : λmax (MeOH) 221, 294 nm. IR : (KBr) υmax 3120 (OH), 1635 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 283. RMN 1H : 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ 12.24 (s, OH-5), 7.4-7.44 (5H, m, H-2’, H-3’, H-4’, H-5’, H-6’), 5.43 (1H, dd, J= 13, 3.0 Hz, H-2), 3.07 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.87 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β), 2.10 (3H, s, CH3-6), 2.09 (3H, s, CH3-8). RMN13C : (CDCl3, 75 MHz), δ 196.4 (C, C=O), 157.6 (C, C-5), 159.6 (C, C-9), 160.9 (C, C-7), 139.3 (C, C-1’), 128.6 (CH, C-2’, C-6’), 128.8 (CH, C-3’, C-5’), 125.9 (CH, C-4’), 103.0 (C, C-6), 102.9 (C, C-10), 102.0 (CH, C-8), 78.7 (C-2), 43.6 (CH2, C-3), 7.7 (CH3-6), 6.9 (CH3-8).

VII. Annexes

232

Host11 2’,4’-dihydroxy-3’,5’-diméthyl-6’-méthoxychalcone

[Resurreccion-Magno et al., 2005 ; Salem et Werbovetz, 2005 ; Shibata et al., 2000]

OOH

HO O

C18H18O4 298 g/mole

Aspect : poudre blanche. UV : λmax (MeOH) 300, 340 nm. IR : (KBr) υmax 3369 (br, OH), 1628 (C=O), 1606 (C=C), 1526 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 297. RMN 1H : (CDCl3, 300 MHz) δ 13.6 (1H, s, OH-2’), 8.01 (1H, dd, J= 15.6, 3 Hz, H-α), 7.86 (1H, dd, J= 15.6, 1.5 Hz, H-β), 7.27-7.19 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 3.67 (3H, s, CH3O), 2.16 (3H, s, (CH3)C-3’), 2.18 (3H, s, (CH3)C-5’). RMN13C : (CDCl3, 75 MHz), δ 193.4 (C, C=O), 159.2 (C, C-4’), 162.1 (C, C-2’,C-6’), 142.9 (C, C-β), 135.4 (C, C-1), 130.2 (CH, C-4), 129.0 (CH, C-3, C-5), 128.8 (C, C-α), 128.4 (CH, C-2, C-6), 109.1 (C, C-1’), 108.9 (CH, C-5’), 106.6 (CH, C-3’), 62.5 (CH3, OCH3), 8.3 (CH3, CH3-5’),7.6 (CH3, CH3-3’).

VII. Annexes

233

Host12 2’,4’-dihydroxy-3’-méthyl-6’-méthoxychalcone

[Mustafa et al., 2005 ; Resurreccion-Magno et al., 2005]

OOH

HO O

C17H16O4 283 g/mole

Aspect : cristaux jaune-orangé. UV : λmax (MeOH) 305, 347 nm. IR : (KBr) υmax 3362 (br, OH), 1632 (C=O), 1604 (C=C), 1526 cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 283. RMN 1H : (CH3COCH3-d6, 300 MHz) δ 13.6 (1H, s, OH-2’), 8.03 (1H, dd, J= 15.6, 4.1 Hz, H-α), 7.76 (1H, dd, J= 15.6, 2.4 Hz, H-β), 7.44-7.39 (5H, m, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6), 3.94 (3H, s, CH3O), 2.05 (3H, s, (CH3)C-3’). RMN13C : (CH3COCH3-d6, 75 MHz), δ 192.4 (C, C=O), 159.2 (C, C-4’), 162.7 (C, C-2’,C-6’), 141.5 (C, C-β), 135.7 (C, C-1), 130.2 (CH, C-4), 130.0 (CH, C-3, C-5), 127.8 (C, C-α), 128.4 (CH, C-2, C-6), 105.3 (C, C-1’), 90.8 (CH, C-5’), 103.7 (CH, C-3’), 55.4 (CH3, OCH3), 6.2 (CH3, CH3-3’).

VII. Annexes

234

Host13 5,4’-dihydroxy-7-méthoxyflavanone. Sakuranetine.

[Dutta et Som, 1978]

O

OOH

O

OH

C16H14O5 286 g/mole

Aspect : poudre blanche. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 –8 (c 7.92, CH3COCH3). UV : λmax (MeOH) 220, 292 nm. IR : (KBr) υmax 3118 (OH), 1630 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 285. RMN 1H : (CDCl3, 300 MHz) δ 12.04 (s, OH-5), 7.36 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-2’, H-6’), 6.90 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-3’, H-5’), 6.09 (1H, dd, J= 2.3, 0.7 Hz, H-6), 6.05 (1H, dd, J= 2.3, 0.7 Hz, H-8), 5.37 (1H, dd, J= 13., 3.0 Hz, H-2), 3.83 (3H, s, OCH3), 3.10 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.79 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β). RMN13C : (CDCl3, 75 MHz), δ 195. (C, C=O), 164.2 (C, C-5), 162.9 (C, C-9), 168.1 (C, C-7), 130.9 (C, C-1’), 128.6 (CH, C-2’, C-6’), 115.7 (CH, C-3’, C-5’), 156.0 (CH, C-4’), 95.2 (C, C-6), 103.2 (C, C-10), 94.3 (CH, C-8), 79.1 (C-2), 43.3 (CH2, C-3), 55.8 (CH3, OCH3-7).

VII. Annexes

235

Host 14 4’-hydroxy-5,7-diméthoxyflavanone

[Bohlmann et Ates, 1984 ; Bohlmann et al., 1979]

O

OO

O

OH

C17H16O5 300 g/mole

Aspect : poudre jaune pâle. UV : λmax (MeOH) 220, 290 nm. IR : (KBr) υmax 3122 (OH), 1632 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 299. RMN 1H : 1H NMR (MeOD, 500 MHz) δ 7.33 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-2’, H-6’), 6.83 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-3’, H-5’), 6.2 (1H, dd, H-6, J= 2.3, 0.7 Hz), 6.19 (1H, dd, J= 2.3, 0.7 Hz, H-8), 5.36 (1H, dd, J= 13., 3.0 Hz, H-2), 3.86 (3H, s, OCH3-5), 3.85 (3H, s, OCH3-7), 3.06 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.68 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β). RMN13C : (MeOD, 125 MHz), δ 191.0 (C, C=O), 168.8 (C, C-5), 165.5 (C, C-9), 162.4 (C, C-7), 129.7 (C, C-1’), 127.6 (CH, C-2’, C-6’), 114.9 (CH, C-3’, C-5’), 157.6 (CH, C-4’), 93.6 (C, C-6), 105.2 (C, C-10), 92.4 (CH, C-8), 78.9 (C-2), 44.8 (CH2, C-3), 54.9 (CH3, OCH3-5), 54.3 (CH3, OCH3-7).

VII. Annexes

236

Host15 7-hydroxy-4’,5-diméthoxyflavanone.

[Tanaka et al., 1989]

OH

O

OO

HO

O

C17H16O5 300 g/mole

Aspect : poudre jaune pâle. Pouvoir rotatoire : [αD] 25 +7 (c 0.47, Pyr) UV : λmax (MeOH) 220, 290 nm. IR : (KBr) υmax 3122 (OH), 1632 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 299. RMN 1H : 1H NMR (MeOD, 500 MHz) δ 7.43 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-2’, H-6’), 7.00 (2H, d, J= 8.6 Hz, H-3’, H-5’), 6.1 (1H, dd, H-6, J= 2.3, 0.7 Hz), 6.11 (1H, dd, J= 2.3, 0.7 Hz, H-8), 5.38 (1H, dd, J= 13, 3.0 Hz, H-2), 3.93 (3H, s, OCH3-5), 3.88 (3H, s, OCH3-4’), 3.08 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.79 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β). RMN13C : (MeOD, 125 MHz), δ 190.7 (C, C=O), 162.8 (C, C-5), 165.3 (C, C-9), 162.4 (C, C-7), 131.1 (C, C-1’), 127.5 (CH, C-2’, C-6’), 113.6 (CH, C-3’, C-5’), 159.9 (CH, C-4’), 92.8 (C, C-6), 104.3 (C, C-10), 95.7 (CH, C-8), 78.6 (C-2), 44.9 (CH2, C-3), 54.8 (CH3, OCH3-5), 54.3 (CH3, OCH3-4’).

VII. Annexes

237

Host16 7-hydroxy-5-méthoxy-8-méthylflavanone

[Markham, 1987]

O

OO

HO

C17H16O4 284 g/mole

Aspect : poudre jaune pâle. UV : λmax (MeOH) 220, 290 nm. IR : (KBr) υmax 3122 (OH), 1632 (C=O), 1620, 1587cm-1 (cycle aromatique). MS : (-)-APCI, m/z 283. RMN 1H : 1H NMR (MeOD, 500 MHz) δ 7.5-7.4 (5H, m, H-2’, H-3’, H-4’, H-5’, H-6’), 6.15 (1H, dd, H-6, J= 2.3, 0.7 Hz), 2.02 (3H, s, CH3-8), 5.38 (1H, dd, J= 13, 3.0 Hz, H-2), 3.81 (3H, s, OCH3-5), 2.97 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3α), 2.77 (1H, dd, J= 17.1, 3 Hz, H-3β). RMN13C : (MeOD, 125 MHz), δ 191.1 (C, C=O), 160.4 (C, C-5), 162.4 (C, C-9), 163.3 (C, C-7), 139.6 (C, C-1’), 128.3 (CH, C-2’, C-6’), 128.0 (CH, C-3’, C-5’), 128.0 (CH, C-4’), 92.1 (C, C-6), 104.2 (C, C-10), 104.4 (CH, C-8), 78.5 (C-2), 45.0 (CH2, C-3), 6.6 (CH3, CH3-8).

VII. Annexes

238

Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et RMN 2D du composé Host9 2’, 6’-dihydroxy-4’-méthoxydihydrochalcone

Spectre UV enregistré dans le MeOH, C= 10-3 M.

Spectre IR (pastille KBr)

VII. Annexes

239

Spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif dihydrochalcone #1 RT: 0,03 AV: 1 NL: 4,18E5T: - c Full ms [ 50,00-1000,00]

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

271,3

255,5

272,4253,5

281,4285,3

267,4227,5 238,4309,3 367,5205,5 220,3 297,3 313,1 435,3419,3 461,1375,1356,3 473,5349,4 401,1 483,7449,6 493,5

Spectre RMN du 1H enregistré au 500 MHz dans le DMSO-d6

VII. Annexes

240

Spectre RMN du 13C enregistré au 125 MHz dans le DMSO-d6

Spectre RMN 2D COSY

ppm (f2)5.010.0

5.0

10.0

ppm (f1)

VII. Annexes

241

Spectre RMN 2D HSQC

ppm (f2)5.010.0

50

100

ppm (f1)

Spectre RMN 2D HMBC

ppm (f2)5.010.0

50

100

150

200ppm (f1)

VII. Annexes

242

Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et RMN 2D du composé Host12 2’,4’-dihydroxy-3’-méthyl-6’-méthoxychalcone

Spectre UV enregistré dans le MeOH, C= 10-3 M.


VII. Annexes

243

Spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif Chalcone1 #1 RT: 0,01 AV: 1 NL: 2,42E6T: - c ms [ 50,00-1000,00]

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

283,5

284,5

435,5

285,4436,5255,5 267,8241,5 451,3319,5286,5 301,5205,5 212,7 496,8467,3407,9393,3350,6 423,7 489,3375,5339,5 358,8

Spectre de RMN du 1H enregistré au 300 MHz dans l’acétone-d6

VII. Annexes

244

Spectre RMN du 13C enregistré au 75 MHz dans l’acétone-d6

Spectre RMN 2D COSY

ppm (f2)5.010.015.0

0

50

100

150

ppm (f1)

VII. Annexes

245

Spectre RMN 2D HMBC

ppm (f2)5.010.015.0

0

50

100

150

200

ppm (f1)

VII. Annexes

246

Spectres UV, IR, MS, RMN 1D et RMN 2D du composé Host10 6, 8-diméthypinocembrine

Spectre UV enregistré dans le MeOH, C= 10-3 M


VII. Annexes

247

Spectre de masse enregistré en APCI en mode négatif Dimethylpinocembrin #95-96 RT: 1,57-1,60 AV: 2 NL: 2,58E6T: - c Full ms2 283,20@33,00 [ 75,00-290,00]

200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Re

lativ

e A

bu

nd

an

ce

283,2

284,2

241,3285,2255,4 282,6242,5239,3205,2 265,5211,3 217,3 225,2

Spectre RMN du 1H enregistré au 300 MHz dans le CDCl3

VII. Annexes

248

Spectre RMN du 13C au 75 MHz enregistré dans le CDCl3

Spectre RMN 2D COSY

ppm (f2)5.010.0

5.0

10.0

ppm (f1)

VII. Annexes

249

Spectre RMN 2D HSQC

ppm (t2)5.010.0

0

50

100

150

ppm (t1)

Spectre RMN 2D HMBC

ppm (t2)5.010.0

0

50

100

150

200

ppm (t1)

Activity-guided isolation of antiplasmodial dihydrochalconesand flavanones from Piper hostmannianum var. berbicense

Benedicte Portet a, Nicolas Fabre a,*, Vincent Roumy a, Heinz Gornitzka b,Genevieve Bourdy a, Severine Chevalley a, Michel Sauvain a,

Alexis Valentin a, Claude Moulis a

a UMR 152, IRD – Universite Paul Sabatier Toulouse 3, Faculte des Sciences Pharmaceutiques, 31062 Toulouse Cedex 09, Franceb Laboratoire Heterochimie Fondamentale et Appliquee du CNRS (UMR 5069), Universite Paul Sabatier, 31062 Toulouse Cedex 09, France

Received 20 November 2006; received in revised form 6 February 2007

Available online 29 March 2007

Abstract

The bioassay-guided purification of an n-hexane extract from the leaves of Piper hostmannianum var. berbicense led to the isolation offour monoterpene or prenyl-substituted dihydrochalcones (1a, 1b, 2, 3) as well as the known compounds 2 0,6 0-dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalcone (4), linderatone (5), strobopinin (6), adunctin E (7) and (ÿ)-methyllinderatin (8). Their structures wereestablished on the basis of NMR and X-ray analysis. (ÿ)-Methyllinderatin, linderatone and 2 0,6 0-dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalconeexhibited the most potent antiplasmodial activity with IC50 values of 5.64, 10.33 and 12.69 lM, respectively against both chloroquine-sensitive and resistant strains of Plasmodium falciparum (F32,FcB1). The activity of (ÿ)-methyllinderatin was confirmed in vivo againstPlasmodium vinckei petteri in mice (80% of reduction of parasitemia) at a dose of 20 mg/kg/day.Ó 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Keywords: Piper hostmannianum var. berbicense; Piperaceae; Dihydrochalcones; Flavanones; Antiplasmodial activity; Plasmodium falciparum

1. Introduction

Due to the rising prevalence of Plasmodium falciparum

resistance to chloroquine and other antimalarial drugs,the treatment of malaria is becoming increasingly difficult(Hyde, 2002; Winstanley et al., 2002). There is an urgentneed to discover new drugs that are safe and effective forthe prophylaxis and treatment of malaria (Biagini et al.,2003). Previous findings of antimalarial agents such as qui-nine and artemisinin from medicinal plants also encour-aged the possibility of finding new antimalarial drugsfrom plant source (Schwikkard and van Heerden, 2002).In part of our research aiming to uncover antimalarialagents from the biodiversity of French Guiana, the n-hexane extract of leaves of Piper hostmannianum var. berbi-

cense (Miq.) C. DC. (Piperaceae) exhibited interestingactivity against Plasmodium falciparum (IC50 = 8 lg/ml).The phytochemical investigation of the genus Piper, widelydistributed in the tropical and subtropical regions of theworld, has reported the isolation of several classes of anti-protozoal compounds such as alkaloids (Rukachaisirikulet al., 2002, 2004), lignans (Lee and Ley, 2003; Ma et al.,1991), chalcones and dihydrochalcones (Jenett-Siemset al., 1999). From a phytochemical point of view, thisplant species is known to contain chromenes, flavanonesand benzoic acid derivatives evaluated for their antifungicactivity (Diaz et al., 1987; Lago et al., 2004). In the presentinvestigation, an activity bioassay-guided fractionation ofn-hexane extract by a variety of chromatographic methodshas led to the isolation of four new dihydrochalcones (1a,1b, 2, 3) as well as the known compounds 2 0,6 0-dihy-droxy-4 0-methoxydihydrochalcone (4) linderatone (5), stro-bopinin (6), adunctin E (7) and (ÿ)-methyllinderatin (8)

0031-9422/$ - see front matter Ó 2007 Elsevier Ltd. All rights reserved.

doi:10.1016/j.phytochem.2007.02.006

* Corresponding author. Tel.: +33 5 62 25 68 48; fax: +33 5 61 55 43 30.E-mail address: [email protected] (N. Fabre).

www.elsevier.com/locate/phytochem

Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320

PHYTOCHEMISTRY

(see Fig. 1). The structure of 1 has been confirmed bymeans of X-ray crystallography. The in vitro activity ofthe isolated compounds was assessed against both chloro-quine-resistant (FcB1) and chloroquine-sensitive (F32)strains of Plasmodium falciparum and MCF7 cells wereused to evaluate the cytotoxicity. In addition, the majordihydrochalcone, (ÿ)-methyllinderatin (8), was evaluatedfor in vivo antimalarial activity against Plasmodium vinckei

petteri in mice.

2. Results and discussion

Compound 1 obtained as yellow prisms had the molec-ular formula C26H32O4, determined by ESI-Q-TOF-HRMS at m/z 407.2242 [MÿH]ÿ (calcd. 407.2222). Its IR

spectrum contained absorption bands due to hydrogen-bonded OH (3400 cmÿ1), conjugated carbonyl (1616cmÿ1) and aryl (1585 cmÿ1) moieties. Although the productappeared to be homogeneous by TLC, structurally relatedexamination of the 1H and 13C NMR spectra indicated thatit was still a mixture as there was slight doubling up of cer-tain signals. Indeed, the 13C NMR spectrum of 1 displayeda set of major peaks accompanied by corresponding lessintense peaks in a ratio of approximately 55:45. However,various HPLC separations of compound 1 failed to resolveit, suggesting that the latter could be an inseparable mix-ture of two structurally close isomers. Structure elucidationwas thus primarily based on the major peaks in its 1H and13C NMR spectra. In the 1HNMR spectrum of 1 (Table 1),signals characteristic of a 2 0,6 0-dihydroxy-4 0-methoxy-dihydrochalcone derivative were clearly observed at dH

Fig. 1. Dihydrochalcones and flavanones isolated from the leaves of P. hostmannianum var. berbicense.

B. Portet et al. / Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320 1313

13.90 (OH chelated), 7.21–7.29 (5H, m), dH 3.06 (2H, t), dH3.49 (2H, m), dH 6.02 (1H, s) and dH 3.83 (3H, s) (Burkeand Nair, 1986) supported by kmax in the UV spectrumat 234 nm and 292 nm. The 13C NMR spectrum confirmedthe signals of the dihydrochalcone and contained ten addi-tional resonances with three methyls at dC 29.2 (C-700), dC20.9 (C-900), and dC 22.1 (C-1000), three methylene carbons(dC 30.1 (C-600), dC 20.5 (C-300), dC 35.3 (C-200)), threemethine carbons (dC 44.0 (C-400), dC 27.2 (C-500), dC 26.3(C-800)) and a quaternary carbon at dC 77.9 (C-100), bearingan O-atom. The latter, associated with the molecular for-mula, suggested that the dihydrochalcone was substitutedby a saturated cyclic monoterpene moiety (Tables 1 and2). Indeed, the 1H NMR spectrum showed signals charac-teristic of an isopropyl moiety (dH 1.78, 1.08, 0.97(H-800(Me)2)) and a methyl group (dH 1.36 (H-7 0)). Thisspectroscopic data (Tables 1 and 2) was quite similar to ap-menthane unit (Senda and Imaizumi, 1975). The positionof the p-menthane unit on the dihydrochalcone moiety wasestablished with the combined results of COSY, HSQC andHMBC experiments. The chemical shift of H-500 at dH 3.39was indicative of a CH group adjacent to an aryl moiety asseen in methyllinderatin (Ichino, 1989). This hypothesiswas supported by HMBC correlations between H-500 (dH3.39) and C-5 0 (dC 106.8) denoting that p-menthane wasC-linked to the dihydrochalcone core between C-500 andC-5 0. In the HMBC spectrum (see correlations in Fig. 2),protons of the methyl group (dH 1.36) displayed correla-tions with the deshielded quaternary carbon at dC 77.9(C-100) and the aromatic carbon C-6 0 (dC 158.9) of thedihydrochalcone which indicated that the p-menthane unitwas O-linked to the dihydrochalcone unit between C-100

and (O-(C-6 0)) thus forming a six-membered ring betweenthe p-menthane unit and the dihydrochalcone core. The

proposed structures 1a and 1b (Fig. 1) with their relativeconfiguration were eventually confirmed by a single-crystalX-ray analysis. The structure showed that the monoterpeneunit adopted a chair conformation in which the methylgroup at C-700 appeared to be in equatorial position in

Table 11H NMR spectral data for compounds 1–3 (500 MHz, in CDCl3)

a

H 1a (major dia) 1b (minor dia) 2 H 3

Dihydrochalcone moiety

H-2 to H-6 7.21–7.29 m 7.21–7.29 m 7.21–7.31 m 10 3.11 ddd (10.6, 10.6, 6.4)

H-a 3.49 m 3.49 m 3.41 m 20 2.25a

H-b 3.06 t (8.0) 3.06 t (8.0) 3.07 t (7.9) 40 5.55 br s

H-3 0 6.02 s 6.01 s 6.09 s 50 2.49 a

OH-2 0 13.90 s 13.90 13.26 s 60 4.21 ddd (10.2, 10.2, 5.4)

OCH3-40 3.83 s 3.80 s 3.84 s 70a 2.12 a

Monoterpene moiety 70b 2.03 a

Ha-200 1.74 m 1.99 m 1.79 m 80 5.13 t (6.8)

Hb-200 1.61 m 1.53 m 1.68 m 100 1.64 s

Ha-300 1.53 m 1.63 m 1.21 m 110 1.73 s

Hb-300 – – 1.67 m 120 2.05, 2.13

H-400 1.21 m 1.24 m 1.19 m 200/600 7.12

H-500 3.39 m 3.49 m 3.07 t (5.7) 300/500 7.12

Ha-600 1.91 dd (13.4, 3.4) 1.81 m 400 7.06

Hb-600 1.51 dd (13.4, 5.3) 1.73 m 4.54 dd (5.7, 1.2) OH-6 12.23 s

CH3-700 1.36 s 1.37 s 1.41 s OH-4 12.06 s

H-800 1.78 m 1.22 m 1.88 m OCH3-2 3.79 s

CH3-900 1.08 d (6.8) 1.09 d (6.6) 0.90 d (7.0) CH3-5 1.90 s

CH3-1000 0.97 d (6.8) 0.75 d (6.6) 0.86 d (7.0) C@OOCH3-3 4.03 s

a Multiplicity patterns were unclear due to signal overlapping.

Table 213C NMR data of compounds 1–3 (125 MHz in CDCl3)

C 1a (major dia) 1b (minor dia) 2 C 3

Dihydrochalcone moiety

1 141.8 141.8 141.2 1 111.2

2/6 128.3 128.3 128.2 2 163.8

3/5 128.4 128.4 128.6 3 99.4

4 125.8 125.9 126.2 4 164.8

a 45.5 45.5 44.2 5 108.6

b 30.7 30.7 30.6 6 164.2

C@O 204.9 204.8 203.4 7 210.8

1 0 104.7 104.9 102.7 10 45.1

2 0 165.4 165.3 165.6 20 37.3

3 0 91.2 91.0 92.9 30 137.4

4 0 162.3 163.2 161.3 40 118.9

5 0 106.8 103.5 112.9 50 30.2

6 0 158.9 159.3 161.7 60 51.5

CH3O 55.7 55.1 55.5 70 37.4

Monoterpene moiety 80 124.1

100 77.9 76.7 81.9 90 131.7

200 35.3 40.2 30.3 100 17.7

300 20.5 22.5 19.4 110 25.8

400 44.0 49.9 46.8 120 26.4

500 27.2 28.4 41.1 100 143.8

600 30.1 36.9 89.2 200/600 127.5

700 29.2 28.7 21.2 300/500 128.1

800 26.3 29.6 26.9 400 126.2

900 20.9 22.4 15.3 OCH3-2 65.2

1000 22.1 20.4 21.8 CH3-5 7.3

C@OOCH3 170.9

C@OOCH3 52.8

1314 B. Portet et al. / Phytochemistry 68 (2007) 1312–1320

the two isomers. On the other hand, the position of the iso-propyl group appeared to be in axial position in the majorisomer 1a and in equatorial position in the minor isomer1b. The NOESY spectrum confirmed this result by display-ing interactions between H-500 (dH 3.39) and H-400 (dH 1.21)in the major isomer. As shown in Fig. 3, the two diastere-oisomers which co-crystallized, were perfectly ordered andpacked around an approximate inversion center. Althoughthe absolute configuration could not be determined, it wasarbitrarily assigned (Fig. 3). Therefore the structures ofthese two new monoterpene-substituted dihydrochalconeswere elucidated as 2 0-hydroxy-4 0-methoxy-5 0,6 0-O-(4b-iso-propyl-1b-methyl-cyclohexane-1-O-5-yl)dihydrochalcone(1a) and 2 0-hydroxy-4 0-methoxy-5 0,6 0-O-(4a-isopropyl-1b-methyl-cyclohexane-1-O,5-yl) dihydrochalcone (1b) andthe trivial names hostmanin A and hostmanin B were pro-posed. Compound 2 obtained as a white amorphous pow-der was assigned the molecular formula C26H32O5 from itsESI-Q-TOF-HRMS (m/z 425.2286 [M+H]+ (calcd.425.2328)) and suggested that 2 differed from 1 by an addi-tional oxygen atom. All the spectral data of compound 2

(Tables 1 and 2) indicated it to be also a 5 0-monoterpene-substituted 2 0-6 0-dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalcone

derivative. Concerning this monoterpene moiety, the 13CNMR spectrum displayed two methylene carbons (dC30.3 (C-200), 19.4 (C-300)) and three methine carbons (dC46.8 (C-400), 41.1 (C-500), 89.2 (C-600)) instead of three meth-ylene carbons (dC 35.3 (C-200), 20.5 (C-300), 30.1 (C-600)) andtwo methine carbons (dC 44.0 (C-400), 27.2 (C-500)), for com-pound 1 as shown in Table 2. Thus the difference between 1

and 2 referred to the substitution of the saturated cyclicmonoterpene moiety and the presence of an additionalalcohol function in 2. The low-field signal of the C-100 (dC81.9) suggested that this quaternary carbon bore the addi-tional alcohol function. Thus the p-menthane unit might belinked to the dihydrochalcone core as in compound 1 withan hydroxyl group in C-600. Nevertheless, this hypothesiswas rejected. Indeed, in the COSY spectrum, correlationcross-peak was seen between H-500 (dH 3.07) and H-600 (dH4.54) with a coupling constant of J(H500,H600) = 5.7 Hz.The latter consideration and the presence of the deshieldedsignal for H-600 at dH 4.54 supported by HMBC correlationbetween H-500 (dH 3.07) and C-6 0 (dC 161.7) revealed thatthe second connectivity of the p-menthane unit was locatedat C-600. Thus the p-menthane unit and the dihydrochal-cone core formed a five-membered ring as in agreementwith the spectral data of adunctin E previously isolatedfrom Piper aduncum (Orjala et al., 1993). Nevertheless the2D NOESY experiment revealed NOE interactionsbetween H-400 (dH 1.19)/H-500 (dH 3.07), H-500 (dH 3.07)/H-600 (dH 4.54), and H-600 (dH 4.54)/H-700 (dH 1.41), thusestablishing the relative configuration at (C-400)/(C-500)and (C-100)/(C-600), the isopropyl and methyl group (C-700)being trans to each other. The structure of 2 wasestablished as a diastereoisomer of adunctin E as(100R,400R,500S,600S)-2 0-hydroxy-4 0-methoxy-5 0, 6 0-O-(4-iso-propyl-1-methyl-cyclohexan-1-ol-5, 6-O-yl) dihydrochal-cone and named hostmanin C. Compound 3 was isolatedas an optically inactive yellow oil. The molecular formulaC29H34O6 was determined by ESI-Q-TOF-HRMS at m/z479.2367 [M+H]+ (calcd. 479.2434). The infrared spectrumcontained a broad band at 3500 cmÿ1 due to hydrogen-bonded OH, conjugated ester carbonyl (1700 cmÿ1), conju-gated carbonyl (1616 cmÿ1) and aromatic ring (1550 cmÿ1).The 1H NMR spectrum of compound 3 exhibited signalsassignable to a dimethylallyl group at dH 1.64 and dH1.73, one aromatic methyl at dH 1.90, an aromatic methoxygroup at dH 3.79, an aryl methyl ester at dH 4.03, twoolefinic signals at dH 5.13 and dH 5.55, a monosubstitutedphenyl group at dH 7.06–7.12 and two hydrogen-bondedOH at dH 12.06 and dH 12.23. The 13C NMR spectrum fur-ther disclosed the presence of four methylene carbons (dC37.4, 26.4, 37.3, 30.2), two methine carbons (dC 45.1 and51.5) and six fully substituted sp2 carbons attesting thepresence of a second aromatic ring. This data led us tothink that 3 should be a prenylated dihydrochalcone inwhich the ring A was totally substituted. This was sup-ported by the comparison with the 1H and 13C NMR dataof the known geranylated dihydrochalcone (±)-nicolaiode-sin C (Gu et al., 2002) which essentially displayed

Fig. 3. ORTEP drawing showing the oxygen atom and solid-state

conformation of 1a and 1b.

Fig. 2. Selected COSY (dotted line) and HMBC (solid line) correlations

for 1a.


differences in the resonances due to ring A. In the HMBCspectrum, a quaternary aromatic carbon at dC 108.6 wasseen to correlate with the aromatic methyl at dH 1.90 andwith the two hydrogen-bonded phenolic protons at dH12.06 and dH 12.23 (Fig. 4). This consideration suggestedthat the aromatic methyl was located in C-5 position inthe aromatic ring A and a hydroxyl group was borne byC-4 and C-6, respectively. Moreover, the presence of thesecond chelated hydroxyl group at dH 12.06 allowed us toassign the aromatic methyl ester in C-3 to a chemical shiftat (dH 4.03) for the methyl group correlating with the car-bonyl ester at (dC 170.9) in the HMBC spectrum. Longrange correlations in the HMBC spectrum permitted toassign the last substituent in ring A, the methoxy groupat dH 3.79 in C-2. The presence of two methine carbonsC-6 0 and C-1 0 in a and b position, respectively of carbonylfunction suggested that the di-prenylated moiety wassubstituted in these positions. This was supported byNOE interactions between the aromatic methoxy group(dH 3.79) with H-5 0 (dH 2.49) and H-6 0 (dH 4.21) (Fig. 4).

The relative stereochemistry at (C-1 0) and (C-6 0) wasdeduced from the J-value between H-1 0 and H-6 0

(J = 11 Hz) indicating a trans diaxial coupling in a normalhalf-chair conformation (Tuntiwachwuttikul et al., 1984).In order to distinguish the two possibilities of the attach-ment of the prenyl side chain, we have observed long rangeHMBC correlations between H-4 0 (dH 5.55) and C-(5 0) (dC30.2)/C-(6 0) (dC 51.5) which confirmed the attachment ofthe prenyl unit to C-3 0 like (±)-nicolaiodesin C (Guet al., 2002). Compound 3 was determined as a racemateon the basis of the optical rotation profile, the structureshown in Fig. 4 is one of the two possible representationsof the relative stereochemistry. Thus the structure of com-pound 3 was assigned as (1 0R*,6 0R*)-(4,6-dihydroxy-5-methyl-3-methylester-2-methoxyphenyl)-(3 0-isohexenyl-1 0-phenylcyclohex-3 0-enyl) methanone and named hostmaninD. According to Shibata et al. (2000), these compoundscould be conceivably derived from a non-enantioselectiveDiels–Alder reaction between the related chalcone andthe acyclic monoterpene myrcene. Although numerouscompounds containing cyclohexene moiety have beenfound in nature (Gu et al., 2002; Pancharoen et al., 1987;Shibata et al., 2000; Tuntiwachwuttikul et al., 1984), thisconstitutes the first report of this type of compoundisolated in the genus Piper. The structures of the knowncompounds 4–8 were determined by comparison of theirphysical and spectroscopic features with those reported inthe literature and identified as 2 0,6 0-dihydroxy-4 0-meth-oxydihydrochalcone (Burke and Nair, 1986), linderatone(Ichino et al., 1990), strobopinin (Mayer, 1990), adunctinE (Orjala et al., 1993) and (ÿ)-methyllinderatin (Ichino,1989), respectively. When tested in vitro against Plasmo-

dium falciparum (Table 3), at least two compounds (5 and8) were considered to be potentially interesting. Thedihydrochalcone 8 was as active as observed for similarmolecules (Froelich et al., 2005). When tested on human

Fig. 4. Selected NOESY (dotted line) and HMBC (solid line) correlations

for compound 3.

Table 3

Biological activity (lM) of the compounds 1–8

P. falciparum Human cells CAR FcB1a CAR F32b

F32 (2)c FcB1 (2) MCF7 (3)

1 101.27 ± 4.56d 125.23 ± 28.05 242.64 ± 3.46 1.9 2.4

2 68.4 ± 3.33 79.01 ± 11.67 233.49 ± 3.33 2.9 3.4

3 55.44 ± 7.40 60.67 ± 8.89 207.12 ± 2.96 3.4 3.7

4 12.69 ± 0.26 16.91 ± 2.60 27.51 ± 5.23 1.63 2.2

5 10.33 ± 0.18 15.06 ± 9.38 52.29 ± 1.80 3.4 5.1

6 168.52 ± 23.57 366.48 ± 4.98 366.67 ± 5.23 1.0 2.2

7 126.75 ± 4.21 233.49 ± 3.33 233.49 ± 3.3 1.0 1.82

8 5.64 ± 1.04 5.27 ± 2.24 68.63 ± 10.4 13.0 12.2

CQe 60 · 10ÿ3 145 · 10ÿ3 ND ND ND

Doxf ND ND 0.4 ND ND

a CAR cytotoxic/antiplasmodial (FcB1) ratio.b CAR cytotoxic/antiplasmodial (F32) ratio.c Number of independent experiment.d Means ± SD.e CQ, chloroquine positive control for P. falciparum inhibition.f Dox, doxorubicin; positive control for MCF7 inhibition.


cell lines, the most efficient compound (8) against P. falci-parum had a CAR (cytotoxicity antiplasmodial ratio)higher than 10, a value that allowed to perform anin vivo test (Likhitwitayawuid et al., 1993). When testedin vivo against P. vinckei petteri, a clear decrease in para-sitaemia (80% at day 5) was observed for the mice treatedwith 8 when compared to control mice (Table 4). The sur-vival time was only of 3.5 additional days when comparedto control thus a complete cure was not achieved at thedose tested.

3. Experimental

3.1. General experimental procedures

Melting points were determined on an Electrothermal9100 apparatus. Optical rotations were measured on a Per-kin–Elmer 241 polarimeter with a sodium lamp(k = 589 nm) in a 1 cm microcell. The UV spectra wererecorded on an Anthelie 2 Advanced spectrometer. IRspectroscopy was performed on a Perkin–Elmer Paragon1000 FT-IR spectrophotometer. NMR (500 and400 MHz for 1H NMR, 125 and 100 MHz for 13C NMR)were obtained with CDCl3 and DMSO-d6 as solvent on aBruker Avance 500 equipped with a TBI z-gradient 5 mmprobe and a Bruker ARX 400 spectrometer. 1D and 2D(COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR experiments wereperformed at 298 K using standard pulse sequences. Chem-ical shifts (d) are given in ppm relative to TMS with cou-pling constant (J) reported in Hz. APCI-MS (positiveand negative-ion mode) spectra were recorded on anLCQ DecaXPmax Thermo Electron mass spectrometer.HRESI-MS spectra (positive and negative-ion mode) wereobtained on a Q-Tof Ultima (Waters) apparatus. Columnchromatography and medium-pressure column chromatog-raphy were performed on silica gel 60 SDS 70–200 lm and6–35 lm, respectively. Reversed-phase chromatographieswere accomplished with RP-18 Mega Bond ElutÒ Variancartridge and RP-18 (40–60 lm, AIT). Analytical and pre-parative HPLC were performed using lBondapack C18 col-umn (10 lm, 3.9 · 300 mm, Waters) and Dynamaxmicrosorb C18 column (5 lm, 10 · 250 mm, Varian) witha UV-DAD Hitachi L 7455 as detector. TLC was carriedout on precoated silica gel 60 F254 aluminium plates

(Merck). Spots were detected under UV (254 and 366nm) before spraying with diphenylborate reagent or a van-illin sulfuric solution followed by heating the plate at110 °C. All solvents were spectral grade or distilled fromglass prior to use.

3.2. Plant material

Leaves of Piper hostmannianum var. berbicense (Miq.)C. DC. were collected in French Guiana in the Saint Elietropical rain forest and identified by Dr Ricardo Calle-jas-Posada R (Univ Antioquia, Inst Biol, Fac CienciasExactas & Nat, Apartado Postal 1226, Medellin, Colom-bia, [email protected]). This samplingspot is a permanent investigation area containing up to800 identified trees. A herbarium voucher specimen(1016) was deposited at the IRD herbarium of Cayenne(CAY).

3.3. Extraction and isolation

Air-dried and powdered leaves of P. hostmannianum

var. berbicense (500 g) were successively percolated withn-hexane (10 l), chloroform (20 l) and methanol (25 l).The dried n-hexane extract was found to exhibit the high-est antiplasmodial activity with an IC50 = 8 lg/ml againstthe growth of chloroquine-resistant strain (FcB1). Theisolation process was guided throughout by the resultsof the antiplasmodial activity and bioautographic TLCassays. After evaporation of the solvent under reducedpressure, the oily residue (15 g) was subjected to columnchromatography (7.5 · 120 cm) on silica gel (400 g,70–200 lm) and sequentially eluted with n-hexane, ethylacetate and methanol to afford 14 fractions (500 ml each).Fractions F1 and F3 eluting with n-hexane–ethyl acetate75:25 proved to be the most active in the antiplasmodialassay. Fraction F1 (4.9 g) was further purified by silicagel (150 g, 6–35 lm) medium-pressure column chromatog-raphy (3.5 · 17.5 cm) using a mixture of n-hexane–ethylacetate of increasing polarity as eluent to give 13 fractions(150 ml each). The purification of the most potentfractions F1.2, F1.3, F1.4 was further investigated. FromF1.2 (1.35 g), linderatone 5 (10 mg) and compound 1

(20 mg) were obtained after repeated purification on anRP-18 (30 g, 40–60 lm) medium-pressure column (2.5 ·

Table 4

In vivo activity of (ÿ)-methyllinderatin 8 against P. vinckei petteri in mice

Treatment Dose (mgÿ1 kgÿ1 dayÿ1) n a Mean (±SD) parasitaemiab Reduction of parasitaemia b (%) Mean survival time (day)

Control 10 38.1 ± 3.7 7.7 ± 1.3

8 20 5 7.8 ± 6.7 80 11.1 ± 1.59

CQc 10 5 0 100 >21

1 5 33 ± 14.4 13 7.1 ± 1.1

a Number of mice by group.b At day 4.c Chloroquine.


20 cm) chromatographic separation eluted with MeOH–H2O 80:20. Fraction F1.3 (192 mg) was purified bychromatography on a reversed-phase silica gel cartridge(VarianÒ, Mega Bond Elut) (MeOH–H2O 85:15) followedby a semi-preparative HPLC (RP-18 at a 3 ml/min flowrate; elution from 80% to 100% MeOH in H2O over10 min; 100% MeOH during 10 min; finally returning tothe initial condition) to yielded compounds 2 (1.7 mg), 3(1.5 mg), and adunctin E (7) (1.8 mg). From F1.4(167 mg), (ÿ)-methyllinderatin 8 (30 mg) was obtainedafter purification on a reversed-phase silica gel cartridge(VarianÒ, Mega Bond Elut) (MeOH–H2O 85:15). 2 0,6 0-Dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalcone 4 (10 mg) andstrobopinin 6 (4 mg) were isolated from fraction F3(1.03 g) after a SephadexÒ LH-20 column (2.5 · 20 cm)using CHCl3 as eluting solvent followed by RP-18 columncartridge (VarianÒ, Mega Bond Elut) separation (MeOH–H2O 60:40) and semi-preparative HPLC (RP-18 at a 3 ml/min flow rate of MeOH–H2O 60:40).

3.4. Hostmanin A rel-(100R,400R,500R)-2 0-hydroxy-4 0-

methoxy-5 0,6 0-O-(4-isopropyl-1-methyl-cyclohexane-1-O,

5-yl)dihydrochalcone (1a) and hostmanin B rel-

(100R,400S,500R)-2 0-hydroxy-4 0-methoxy-5 0,6 0-O-

(4-isopropyl-1-methyl-cyclohexane-1-O,5-

yl)dihydrochalcone (1b)

Yellow prisms: mp 58–60 °C (from MeOH); ½a�25D ÿ 31

(MeOH, c 0.15); UV kMeOHmax (log e) 234 (3.00), 292

(3.15) nm; IR tCHCl3max 3425 (chelated OH), 1616 (C@O),

1585 (aromatic ring) cmÿ1; 1H NMR (500 MHz, CDCl3),see Table 1; 13C NMR (125 MHz, CDCl3) see Table 2;APCI m/z 407 [MÿH]+; HRESIMS m/z 407.2242 (calcd.407.2222) for C26H32O4.

3.5. Hostmanin C rel-(100R,400R,500S,600S)-2 0-hydroxy-4 0-

methoxy-5 0,6 0-O-(4-isopropyl-1-methyl-cyclohexan-1-ol-5,

6-O-yl)dihydrochalcone (2)

White amorphous powder: ½a�25D þ 4 ðMeOH; c 0:17Þ;UV kMeOH

max (log e) 232 (3.70), 285 (3.78) nm; IR tCHCl3max

3390 (br OH), 1633 (C@O), 1600, 1580 (aromatic ring),1215 (C–OH) cmÿ1; 1HNMR (500 MHz, CDCl3) see Table1; 13C NMR (125 MHz, CDCl3) see Table 2; APCI m/z 423[MÿH]+; HRESIMS m/z 425.2286 (calcd. 425.2328) forC26H32O5.

3.6. Hostmanin D rel-(1 0R*,6 0R*)-(4,6-dihydroxy-5-methyl-

3-methylester-2-methoxyphenyl)-(3 0-isohexenyl-1 0-

phenylcyclohex-3 0-enyl) methanone (3)

Yellow oil: ½a�25D 0 (MeOH, c 0.1); UV kMeOH

max (log e) 232(3.23), 292 (3.52) nm; IR tCHCl3

max 3500 (br OH), 1700 (O–C@0), 1616 (C@O), 1580 (aromatic ring) cmÿ1; 1H NMR(500 MHz, CDCl3) see Table 1; 13C NMR (125 MHz,

CDCl3) see Table 2; APCI m/z 477 [MÿH]+; HRESIMSm/z 479.2367 (calcd. 479.2434) for C29H34O6.

3.7. 2 0-6 0-Dihydroxy-4 0-methoxydihydrochalcone (4)

Colourless plates: mp 175 °C (from CH2Cl2) (Burke andNair, 1986), 174–175 °C; UV kMeOH

max 232 (4.94) 287(5.08) nm; IR tCHCl3

max 3264 (br, OH), 1646 (C@O), 1600,1526 (aromatic ring) cmÿ1; APCI m/z 271 [MÿH]+; 1HNMR and 13C NMR (Orjala et al., 1994).

3.8. Linderatone (5)

Amorphous powder: ½a�25D ÿ 32:4 ðCHCl3; c 0:5Þ; UV

kMeOHmax (log e) 295 (3.98), 335 (3.57); IR tCHCl3

max 3435 (brOH), 1635 (C@O), 1620, 1580 (aromatic ring) cmÿ1; APCIm/z 391 [M+H]+; 1H NMR and 13C NMR (Ichino et al.,1990).

3.9. Strobopinin (6)

Solid: mp 228–230 °C (from Et2O) (Mayer, 1990) 223–232 °C; ½a�25D ÿ 90:4ðCHCl3; c 0:05Þ; UV kMeOH

max (log e) 295(3.61), 335 (3.43) nm; IR tCHCl3

max 3125 (chelated OH), 1635(C@O), 1620, 1587 (aromatic ring) cmÿ1; APCI m/z 269[MÿH]+; 1H NMR and 13C NMR (Mayer, 1990).

3.10. Adunctin E (7)

White amorphous powder: ½a�25D þ 16:3 (MeOH, c 0.65);

UV kMeOHmax (log e) 232 (3.70), 285 (3.78) nm; IR tCHCl3

max 3390(br OH), 1633 (C@O), 1600, 1580 (aromatic ring), 1215 (C–OH) cmÿ1; APCI m/z 423 [MÿH]+; 1H NMR and 13CNMR (Orjala et al., 1993).

3.11. (ÿ)-Methyllinderatin (8)

Colourless oil: ½a�25D ÿ 40:1ðCHCl3; c 0:1Þ; UV kMeOH

max

(log e) 211 (4.72), 289 (4.54) nm; IR tCHCl3max 3359 (br OH),

1623 (C@O), 1580, 1450 (aromatic ring) cmÿ1; APCI m/z407 [MÿH]+; 1H NMR and 13C NMR (Ichino, 1989).

3.12. Plasmodium in vitro culture and antiplasmodial activity

Parasites were cultured according to the methoddescribed by Trager and Jensen (Trager and Jensen,1976) with modifications described by Benoit et al.(1995). The cultures were synchronized every 48 h by 5%D-sorbitol lysis (Lambros and Vanderberg, 1979) (Merck,Darmstadt, Germany). The F32-Tanzania strain was con-sidered as a chloroquino-sensitive strain (chloroquineIC50: 60 nM), and FcB1-Columbia was considered as chlo-roquino-resistant strain (chloroquine IC50: 145 nM). In

vitro antimalarial activity testing was performed by [3H]-hypoxanthine (Amersham-France) incorporation asdescribed by Desjardins et al. (1979) with modifications(Valentin et al., 1997).


3.13. In vitro cytotoxicity evaluation

Human breast adenocarcinoma (MCF-7) cells werecultured in DMEM culture media containing 2 mML-glutamine (Cambrex, Emerainville, France) supple-mented with 1% fetal calf serum (FCS) (Cambrex) andincubated under standard conditions (37 °C, 5% CO2).All experiments were carried out using cells in the expo-nential phase of growth. Cells were trypsinized, resus-pended in DMEM containing 10% FCS and seeded(200,000 cells/ml) in 96-well plates. After 24 h the mediumwas replaced by fresh medium containing the compoundsat concentrations ranging from 1 to 100 lg/ml. At theend of the treatment (48 h) cell viability was evaluatedby measuring the activity of the mitochondrial enzymesuccinate deshydrogenase. The medium was replaced by50 ll of a sodium 2,3–bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophe-nyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt (XTT)(Sigma, Saint Quentin Fallavier, France) in water solu-tion (0.5 mg/ml), and cells were incubated for 180 min.The reaction was stopped by addition of a SDS solution(10% in water). XTT was converted to a formazan prod-uct, detected by spectrophotometry at 450 nm. IC50 val-ues were determined graphically from the dose–responsecurves (Tabbi et al., 2002).

3.14. In vivo antiplasmodial activity testing

In order to test the in vivo antimalarial activity, a 4-day-suppressive assay was performed on CD female mice, usingP. vinckei petteri (Peters, 1965). Mice (mean body weight:20 ± 2 g) were infected with 106 infected red blood cellsin RPMI on day 0. Groups of five mice were treated intrap-eritonally from day 0–3 with one dose (20 mg/kg) of themost efficient drug 8. On day 4, Giemsa stained smearswere made for each mouse after tail blood sampling. Para-sitaemia was estimated by visual counting of at least 5000erythrocytes. Controls were mice treated with RPMI aloneor chloroquine (1 and 10 mg/kg). The inhibition percentagewas calculated with the following formula: (control para-sitaemia – parasitaemia with drugs)/ (control parasitaemia)X 100. Mice were maintained under institutional animalguidelines.

3.15. X-ray crystallographic analysis of 1

C26H32O4, M = 408.52, monoclinic, P21, a = 11.739(1)A, b = 16.054(1) A, c = 12.667(1) A, b = 111.718(2)°,V = 2217.9(3) A3, Z = 4, T = 173(2) K. Nine thousandnine hundred and sixteen reflections (6272 independent,Rint = 0.0438) were collected. Largest electron density res-idue: 0.138 e Aÿ3, R1 (for I > 2r(I)) = 0.0494 and wR2 =0.0976 (all data) with R1 = RiFo| ÿ |Fci/R |Fo| andwR2 ¼ ðRwðF 2

o ÿ F2cÞ

2= RwðF 2

oÞ2Þ0:5. All the data for this

structure was collected at low temperatures using an oil-coated shock-cooled crystal on a Bruker-AXS CCD 1000diffractometer with Mo Ka radiation (k = 0.71073 A).

The structure was solved by direct methods (SHELXS-97, (Sheldrick, 1990)) and all non-hydrogen atoms wererefined anisotropically using the least-squares method onF2 (SHELXL-97, Program for Crystal Structure Refine-ment, G.M. Sheldrick, University of Gottingen 1997).

4. Supplementary material

The crystallographic data for the structures reported inthis paper has been deposited with the Cambridge Crystal-lographic Data centre as supplementary publication(Deposition No. CCDC 624770). This data can be obtainedfree of charge, by request to the Director, via www.ccdc.ca-m.ac.uk/conts/retrieving.html (or from the CCDC, 12Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK; fax: +44 1223336033; e-mail: [email protected]).

Acknowledgements

We thank Jean-Marie Chantraine and Christian Mor-etti from IRD research unit (US084) for the first plantcollecting and the French Ministry of Research for Na-tional Science Grant from ACI Pal +. Martine Kniebhi-eler and Frederic Ausseil from Pierre Fabre Medicament– CNRS research unit (UMS 2646) are acknowledgedfor technical support and Georges Massiot from PierreFabre Medicament – CNRS research unit (UMS 2597),for his advice. The authors are grateful to Dr. VerenaPoinsot from Laboratoire des IMRCP (UMR 5623UPS/CNRS) Toulouse, for high resolution mass spec-trometry; Eliane Pelissou from UMR 152, for technicalassistance in biological evaluations and Dr. RicardoCallejas Posada for scientific plant determinations. Final-ly, Universite Paul Sabatier is also acknowledged for itstechnical platforms.

References

Benoit, F., Valentin, A., Pelissier, Y., Marion, C., Dakuyo, Z., Mallie, M.,

Bastide, J.M., 1995. Antimalarial activity in vitro of Cochlospermum

tinctorium tubercle extracts. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 89,

217–218.

Biagini, G.A., O’Neill, P.M., Nzila, A., Ward, S.A., Bray, P.G., 2003.

Antimalarial chemotherapy: young guns or back to the future? Trends

Parasitol. 19, 479–487.

Burke, B., Nair, M., 1986. Phenylpropene, benzoic acid and flavonoid

derivatives from fruits of Jamaican Piper species. Phytochemistry 25,

1427–1430.

Desjardins, R.E., Canfield, C.J., Haynes, J.D., Chulay, J.D., 1979.

Quantitative assessment of antimalarial activity in vitro by a semiau-

tomated microdilution technique. Antimicrob. Agents Chemother. 16,

710–718.

Diaz, D.P.P., Tiberio, A.C., Joseph-Nathan, P., 1987. A chromene, an

isoprenylated methyl hydroxybenzoate and a C-methyl flavanone from

the bark of Piper hostmannianum. Phytochemistry 26, 809–811.

Froelich, S., Schubert, C., Bienzle, U., Jenett-Siems, K., 2005. In vitro

antiplasmodial activity of prenylated chalcone derivatives of hops


(Humulus lupulus) and their interaction with hemin. J. Antimicrob.

Chemother. 55, 883–887.

Gu, J.-Q., Park, E.J., Vigo, J.S., Graham, J.G., Fong, H.H.S., Pezzuto,

J.M., Kinghorn, A.D., 2002. Activity-guided isolation of constituents

of Renealmia nicolaioides with the potential to induce the phase II

enzyme quinone reductase. J. Nat. Prod. 65, 1616–1620.

Hyde, J.E., 2002. Mechanisms of resistance of Plasmodium falciparum to

antimalarial drugs. Microbes Infect. 4, 165–174.

Ichino, K., 1989. Two flavonoids from two Lindera umbellata varieties.

Phytochemistry 28, 955–956.

Ichino, K., Tanaka, H., Ito, K., 1990. Revised structures of linderatone

and methyllinderatone. Heterocycles 31, 549–553.

Jenett-Siems, K., Mockenhaupt, F.P., Bienzle, U., Gupta, M.P., Eich, E.,

1999. In vitro antiplasmodial activity of Central American medicinal

plants. Trop. Med. Int. Health 4, 611–615.

Lago, J.H.G., Ramos, C.S., Casanova, D.C.C., de Morandim, A.,

Bergamo, D.C.B., Cavalheiro, A.J., Bolzani, V.d.S., Furlan, M.,

Guimaraes, E.F., Young, M.C.M., Kato, M.J., 2004. Benzoic acid

derivatives from Piper species and their fungitoxic activity against

Cladosporium cladosporioides and C. sphaerospermum. J. Nat. Prod.

67, 1783–1788.

Lambros, C., Vanderberg, J.P., 1979. Synchronization of Plasmodium

falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418–420.

Lee, A.-L., Ley, S.V., 2003. The synthesis of the anti-malarial natural

product polysphorin and analogues using polymer-supported reagents

and scavengers. Org. Biomol. Chem. 1, 3957–3966.

Likhitwitayawuid, K., Angerhofer, C.K., Chai, H., Pezzuto, J.M.,

Cordell, G.A., Ruangrungsi, N., 1993. Cytotoxic and antimalarial

alkaloids from the tubers of Stephania pierrei. J. Nat. Prod. 56, 1468–

1478.

Ma, Y., Han, G.Q., Li, C.L., Cheng, J.R., Arison, B.H., Hwang, S.B.,

1991. Neolignans from Piper polysyphorum C. DC.. Yaoxue Xuebao

26, 345–350.

Mayer, R., 1990. Flavonoids from Leptospermum scoparium. Phytochem-

istry 29, 1340–1342.

Orjala, J., Wright, A.D., Behrends, H., Folkers, G., Sticher, O., Ruegger,

H., Rali, T., 1994. Cytotoxic and antibacterial dihydrochalcones from

Piper aduncum. J. Nat. Prod. 57, 18–26.

Orjala, J., Wright, A.D., Erdelmeier, C.A.J., Sticher, O., Rali, T., 1993.

New monoterpene-substituted dihydrochalcones from Piper aduncum.

Helv. Chim. Acta 76, 1481–1488.

Pancharoen, O., Picker, K., Reutrakul, V., Taylor, W.C.,

Tuntiwachwuttikul, P., 1987. Constituents of the Zingiberaceae.

X. Diastereomers of [7-hydroxy-5-methoxy-2-methyl-2-(4 0-methyl-

pent-3 0-enyl)-2H-chromen-8-yl][3n00-methyl-2n00-(300 0-methylbut-200 0-enyl)

-6n00-phenylcyclohex-3n00-enyl]methanone (panduratin B), a constituent

of the red rhizomes of a variety of Boesenbergia pandurata. Aust. J.

Chem. 40, 455–459.

Peters, W., 1965. Drug resistance in Plasmodium berghei Vincke and Lips,

1948. 3. Multiple drug resistance. Exp. Parasitol. 17, 97–102.

Rukachaisirikul, T., Prabpai, S., Champung, P., Suksamram, A., 2002.

Chabamide, a novel piperine dimer from stems of Piper chaba. Planta

Med. 68, 853–855.

Rukachaisirikul, T., Siriwattanakit, P., Sukcharoenphol, K., Wongvein,

C., Ruttanaweang, P., Wongwattanavuch, P., Suksamrarn, A., 2004.

Chemical constituents and bioactivity of Piper sarmentosum. J.

Ethnopharmacol. 93, 173–176.

Schwikkard, S., van Heerden, F.R., 2002. Antimalarial activity of plant

metabolites. Nat. Prod. Rep. 19, 675–692.

Senda, Y., Imaizumi, S., 1975. Carbon-13 pulse Fourier transform NMR

of menthol stereoisomers and related compounds. Tetrahedron 31,

2905–2908.

Sheldrick, G.M., 1990. Phase annealing in SHELX-90: direct methods for

larger structures. Acta Crystallogr. A46, 467–473.

Shibata, K., Tatsukawa, A., Umeoka, K.-I., Lee, H.S., Ochi, M., 2000.

Crinatusins, bioactive Diels–Alder adducts from Cyathocalyx crinatus.

Tetrahedron 56, 8821–8824.

Tabbi, G., Cassino, C., Cavigiolio, G., Colangelo, D., Ghiglia, A., Viano,

I., Osella, D., 2002. Water stability and cytotoxic activity relationship

of a series of ferrocenium derivatives. ESR insights on the radical

production during the degradation process. J. Med. Chem. 45, 5786–

5796.

Trager, W., Jensen, J.B., 1976. Human malaria parasites in continuous

culture. Science 193, 673–675.

Tuntiwachwuttikul, P., Pancharoen, O., Reutrakul, V., Byrne, L.T., 1984.

(1 0RS,20SR,60 RS)-(2,6-Dihydroxy-4-methoxyphenyl)[30-methyl-20-

(3n00-methylbut-2n00-enyl)-60-phenylcyclohex-3 0-enyl]methanone (pan-

duratin A) – a constituent of the red rhizomes of a variety of

Boesenbergia pandurata. Aust. J. Chem. 37, 449–453.

Valentin, A., Benoit-Vical, F., Moulis, C., Stanislas, E., Mallie, M.,

Fouraste, I., Bastide, J.-M., 1997. In vitro antimalarial activity of

penduline, a bisbenzylisoquinoline from Isopyrum thalictroides. Anti-

microb. Agents Chemother. 41, 2305–2307.

Winstanley, P.A., Ward, S.A., Snow, R.W., 2002. Clinical status and

implications of antimalarial drug resistance. Microbes Infect. 4, 157–

164.


TITLE : Bioguided research of antimalarial compounds from a plant of Guyana : Piper

hostmannianum var. berbicense

ABSTRACT :

Malaria is an infectious disease that occurs in one hundred countries located in tropical and

subtropical regions in the world. The emergence of resistant strains to antimalarial drugs in

use makes it necessary to discover new antimalarials. Previous findings of antimalarial agents

such as quinine and artemisinin from medicinal plants also encouraged the possibility of

finding new active drugs from plant sources. In our search aiming to discover new

antimalarial from the biodiversity of French Guiana, the n-hexane extract and the chloroform

extract of the leaves of Piper hotmannianum var berbicense revealed a potential

antiplasmodial activity with IC50 between 8 and 20 µg/ml. After purification, seventeen

compounds have been isolated. Their structures were established on the basis of NMR

experiments, mass spectroscopy and X-ray analysis. The antiplasmodial and cytotoxic in vitro

activities of all isolated compounds were assessed against chloroquine-sensitive and

chloroquine-resistant P. falciparum strains and MCF-7 cells. Moreover, the most active

compounds with the best selectivity were evaluated for in-vivo antimalarial activity against P.

vinckei petteri in mice. We have investigated the specific fragmentation patterns of the

flavanones, chalcones and dihydrochalcones previously isolated in mass spectrometry by (-)-

APCI in the university of Bruxelles . The present approach have been applied to study the

flavonoids in the ethyl acetate extract of the leaves of P. hostmannianum var. berbicense by

LC/UV/APCI-MSn. Based on the identification rules by MS spectroscopy, five new molecules

were tentatively characterized including flavanones, chalcones and dihydrochalcones.

KEY WORDS : Piperaceae, chalcones, flavanones, NMR, mass spectrometry, malaria, P.

falciparum.

AUTEUR : Bénédicte PORTET TITRE : Recherche bioguidée de molécules antipaludiques d’une plante guyanaise : Piper hostmannianum var. berbicense.

DIRECTEUR DE THESE : Pr. Claude MOULIS

CO-DIRECTEUR DE THESE : Pr. Isabelle FOURASTE

LIEU ET DATE DE LA SOUTENANCE : Faculté des sciences pharmaceutiques de Toulouse le 19 octobre 2007.

RESUME : Le paludisme est une maladie parasitaire qui touche une centaine de pays situés dans les zones tropicales et sub-

tropicales de l’hémisphère sud. L’apparition des phénomènes de résistance du parasite aux médicaments actuels

souligne le besoin urgent de nouveaux agents antipaludiques. La découverte de deux antipaludéens majeurs (la

quinine et l’artémisinine) issus des plantes médicinales encourage la recherche de nouveaux médicaments issus

de la biodiversité végétale. A la suite d’un screening à haut débit sur une centaine de plantes originaires de

Guyane Française, les extraits hexanique et chloroformique des feuilles de Piper hostmannianum var. berbicense

ont révélé une activité antiplasmodiale potentielle avec des CI50 comprises entre 8 et 20 µg/ml. Après

purification de ces extraits par diverses méthodes chromatographiques, 17 molécules de type chalcone,

dihydrochalcone et flavanone ont été isolées et identifiées par plusieurs techniques spectroscopiques (UV, IR

RMN, SM, rayons X). L’activité antiplasmodiale de ces molécules a été évaluée in vitro sur des souches de

Plasmodium falciparum. Des cellules de type MCF-7 ont été utilisées pour évaluer leurs cytotoxicités. De plus,

le potentiel antiplasmodial des composés les plus actifs a pu être confirmé par des tests in vivo sur des souris

infectées par P. vinckei petteri. Une étude en spectrométrie de masse au sein de la Faculté de pharmacie de

Bruxelles a permis d’étudier la fragmentation des molécules isolées. Ainsi, l’analyse par LC/MS d’un extrait brut

de P. hostmannianum var. berbicense a permis l’identification de cinq nouvelles molécules de type chalcone,

dihydrochalcone et flavanone.

MOTS-CLES : Piperaceae, chalcones, flavanones, RMN, spectrométrie de masse, paludisme,

P. falciparum.

DISCIPLINE : Chimie, spécialité chimie-biologie

UMR-152 IRD-UPS Laboratoire de pharmacochimie des substances naturelles et pharmacophores redox. Faculté des sciences pharmaceutiques. Toulouse.

Documents

THESE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSEthesesups.ups-tlse.fr/66/1/Portet_Benedicte.pdfF. Etude par LC/DAD/(-)-APCI-MSn de l’extrait acétate d’éthyle de feuilles de Piper