Diagnostic de la tuberculose par examen … · Un guide technique pour l’examen microscopique direct des frottis d’ex-pectoration, inspiré par celui élaboré en 1969 par le

61

GUIDE TECHNIQUE

Diagnostic de la tuberculosepar examen microscopiquedirect des expectorations

dans les pays à faibles revenus

Cinquième édition

2000

Union Internationale Contre la Tuberculoseet les Maladies Respiratoires

68 boulevard Saint Michel, 75006 Paris, France

63

COMITÉ DE RÉDACTION

Mohammed Akhtar

Gisela Bretzel

Fadila Boulahbal

David Dawson

Lanfranco Fattorini

Knut Feldmann

Thomas Frieden

Marta Havelková

Isabel N de Kantor

Sang Jae Kim

Robert Küchler

Frantz Lamothe

Adalbert Laszlo

Nuria Martin Casabona

A Colin McDougall

Håkan Miörner

Graziella Orefici

C N Paramasivan

S R Pattyn

Ana Reniero

Hans L Rieder

John Ridderhof

Sabine Rüsch-Gerdes

Salman H Siddiqi

Sergio Spinaci

Richard Urbanczik

Véronique Vincent

Karin Weyer

A partir d’un avant-projet préparé par Adalbert Laszlo, pour l’Union Internationale Contre laTuberculose et les Maladies Respiratoires.

Conception graphique : Edik Balaian

Traduction française : Jacques Prignot

Édition : Fadila Boulahbal, Arnaud Trébucq

64

Un guide technique pour l’examen microscopique direct des frottis d’ex-pectoration, inspiré par celui élaboré en 1969 par le Dr J. Holm, à l’époqueDirecteur de l’Union Internationale Contre la Tuberculose, a été publié pour la pre-mière fois en 1978 par l’UICT sous forme de Guide Technique concernant leDiagnostic de la Tuberculose par Microscopie Directe. Ce guide a été inséré dansles troisième et quatrième éditions du Guide de la Tuberculose pour les Pays àFaibles Revenus éditées par l’UICTMR. Il a été conçu comme un simple standardde référence concernant le recueil, la conservation et le transport des échan-tillons d’expectorations, ainsi que pour l’examen des frottis d’expectoration parl’examen microscopique. Il visait à répondre aux besoins des travailleurs de lasanté dans les pays à faibles revenus et à haute prévalence où se trouvait lagrande majorité des cas de tuberculose dans le monde.

Depuis sa première publication, il y a plus de vingt années, ce guide est restéinchangé. Aujourd’hui, la tuberculose est une des causes principales de décès dusà un agent infectieux unique parmi les adultes dans les pays à faibles revenus,où elle reste un problème majeur de santé publique. Malgré d’importants progrèsdans les technologies modernes de diagnostic, l’instrument de base pour lesservices de diagnostic de la tuberculose – la microscopie des frottis d’expecto-ration – n’a pas connu de modifications techniques. Toutefois, le contexte danslequel il est appliqué, c’est à dire le Programme National de Tuberculose, s’estaffiné de façon considérable au cours des deux dernières décennies.

L’utilisation du guide sur le terrain a révélé au fil des années des omissionset des manques de précision auxquels il fallait répondre. De plus, les aspects desécurité contre la contamination et de contrôle de qualité de l’examen micro-scopique n’avaient pas été couverts suffisamment dans l’édition antérieure. Ona donc pensé que le Guide Technique de l’UICTMR devait être révisé pour mieuxrefléter son caractère de santé publique et pour le maintenir en adéquation avecles stratégies modernes de lutte antituberculeuse. Ce document a été revu avecsoin par les membres de la Section Bactériologie et Immunologie de l’UICTMR,par les directeurs du Réseau de Laboratoires de Référence Supranationaux de laTuberculose de l’OMS et de l’UICTMR ainsi que par d’autres professionnels émi-nents dans le domaine de la lutte antituberculeuse.

DR ADALBERT LASZLO

Ottawa 2000

PRÉFACE

65

1. INTRODUCTION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

2. LE LABORATOIRE DE MICROSCOPIE DES EXPECTORATIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

2.1 Rôle du laboratoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

2.2 Conformation physique du laboratoire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

2.3 Matériel nécessaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

2.4 Préparation des colorants pour le Ziehl-Neelsen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69• Carbol fuchsine de Ziehl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70• Solution aqueuse de phénol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70• Solutions d’agent décolorant. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70• Solution de contre-coloration au bleu de méthylène. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

3. RECUEIL ET TRANSPORT DES PRÉLÈVEMENTS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.1 Les prélèvements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 713.1.1 Prélèvements pour le diagnostic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 713.1.2 Prélèvements pour le suivi du traitement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

3.2 Mode de recueil des expectorations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

3.3 Les crachoirs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

3.4 Transport des échantillons d’expectoration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

3.5 Enregistrement du patient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4. PRÉPARATION DES FROTTIS POUR L’EXAMEN MICROSCOPIQUE . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.1 Identification des lames . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.2 Confection de l’étalement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

4.3 Fixation du frottis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.4 Coloration du frottis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 784.4.1 Méthode de coloration de Ziehl-Neelsen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

• Coloration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78• Décoloration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79• Contre-coloration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.4.2 Qualité de l’étalement et de la coloration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

5. EXAMEN MICROSCOPIQUE DES FROTTIS D’EXPECTORATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

5.1 Le microscope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

5.2 Utilisation du microscope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

5.3 Examen microscopique des frottis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

TABLE DES MATIÈRES

66

5.4 Echelle de positivité des résultats de l’examen au microscopedes expectorations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

5.5 Enregistrement et communication des résultats de l’examen microscopique 84

5.6 Conservation des frottis en vue de l’assurance qualité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

6. ASSURANCE QUALITÉ DE L’EXAMEN MICROSCOPIQUE DES EXPECTORATIONS 85

6.1 Définitions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

6.2 Procédures. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

7. BIOSÉCURITÉ AU LABORATOIRE DE MICROSCOPIE POUR LA TUBERCULOSE . . . 86

7.1 Aspects généraux. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

7.2 Aspects spécifiques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

8. GESTION DES PRODUITS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

RÉFÉRENCES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

LECTURES SUGGÉRÉES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

Annexe 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93• Prévention des faux positifs en microscopie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93• Conséquences des faux positifs en microscopie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93• Prévention des faux négatifs en microscopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93• Conséquences des faux négatifs en microscopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Annexe 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94• Entretien du microscope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

Annexe 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95• Guide pour la solution des problèmes de microscopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

Dans les pays à faibles revenus et à pré-valence élevée de tuberculose, l’examenmicroscopique des frottis d’expectoration –ou bacilloscopie – est, et restera probable-ment dans un avenir prévisible le seul outil

acceptable en terme de coût-efficacité pourdiagnostiquer les patients atteints de tuber-culose contagieuse et pour suivre leurs pro-grès sous traitement. L’examen microsco-pique des frottis d’expectoration est unetechnique simple, peu coûteuse et appro-priée, relativement aisée à exécuter et à lire.On obtient des résultats appropriés avec unesensibilité très élevée pour la détection dessujets transmettant les bacilles tuberculeux ;elle fournit la plupart des indicateurs essen-tiels de laboratoire et d’épidémiologie néces-saires pour l’évaluation du ProgrammeNational de Tuberculose (PNT).

67

1. INTRODUCTION

2. LE LABORATOIRE DE MICROSCOPIEDES EXPECTORATIONS

Les objectifs des laboratoires de la tuber-culose au sein d’un PNT sont :– le diagnostic des cas contagieux res-ponsables de la transmission du bacille dela tuberculose dans la communauté ;– le suivi du traitement jusqu’à la guérison.

2.1 Rôle du laboratoire

Dans les pays en développement, le plusgrand nombre des diagnostics bactériolo-giques de tuberculose est assuré dans leslaboratoires périphériques dont la responsa-bilité principale est de fournir au PNT l’exa-men microscopique de diagnostic, en sebasant sur une bacilloscopie des expectora-tions après coloration de Ziehl-Neelsen (ZN).Ces laboratoires, localisés dans les centresde santé, les postes de santé, les hôpitaux,etc., ont habituellement du personnel tech-nique qualifié, apte à exécuter, parmi d’autresobligations, la bacilloscopie des frottis d’ex-pectoration. Ils devraient être aptes à assurerles fonctions suivantes :– pratiquer toute les bacilloscopies d’expec-toration demandées dans leur zone de recru-tement, habituellement un district (50 000-150 000 habitants) ;– servir de centre de référence pour les uni-tés de recueil d’échantillons ;– coordonner avec les Laboratoires Régionaux(intermédiaires) le transfert d’échantillons pourlesquels les cultures ou les tests de sensibilitéaux médicaments sont indiqués ;– recueillir les échantillons pendant lesheures d’ouverture du Centre de Santé ;

– envoyer les informations au LaboratoireRégional ;– respecter les directives nationales d’assu-rance qualité ;– commander, gérer et stocker les fourni-tures de laboratoire.

2.2 Conformation physiquedu laboratoire

L’aménagement détaillé du laboratoirede microscopie peut varier considérablementselon les situations locales. Il est difficile defournir un schéma modèle applicable demanière générale car au fil du temps, dansbeaucoup de pays, les services de diagnosticde la TB ont été intégrés dans les services dediagnostic d’un laboratoire général. Idéa-lement, le laboratoire de bacilloscopie pour laTB devrait comprendre diverses sections dis-tinctes (Figure 1) (adapté de Collins et coll1) :– un espace pour une paillasse ou pour unetable (A) pour les échantillons entrants(Figures 1 et 2) ;– une paillasse de travail bien éclairée (B)pour la préparation des frottis (Figures 1 et3) ;

– un évier de coloration (C) muni d’eau cou-rante (Figures 1 et 4) ;

– un évier (D) muni d’eau courante pour lelavage des mains ;

– une zone de paillasse (E) pour la lecture aumicroscope, juste devant une fenêtre (Figures1 et 5) ;

– une zone de paillasse ou une table (F) pourles registres du laboratoire et la zone deconservation des lames (Figures 1 et 6) ;

– une armoire (G) pour les vêtements destechniciens (Figure 1).

Si la paillasse est en matériel poreux, uneplaque plane non poreuse en formica, enmarbre, en métal galvanisé ou en aluminiumdevrait recouvrir la paillasse. Ce plateaudevrait avoir une largeur de 80 cm et desrebords hauts de 5 cm. Le rebord antérieurdoit être rabattu à 90o pour épouser le bordde la table et faciliter ainsi les manipulations(Figure 3). Ces dernières doivent se faire stric-tement au dessus du plateau, qui devrait êtredécontaminé chaque jour après utilisation,en l’imbibant avec un germicide antitubercu-leux (par exemple du phénol à 5 % ou unesolution à 0,1 % d’hypochlorite de soude*[NaClO], connue aussi comme blanc deménage, Chlorox, Javel, etc.).

2.3 Matériel nécessaire

Les détails du matériel sont mentionnésà la Figure 31. Porte-lames pour la préparation des frottis2. Séchoir pour les lames3. Crachoir placé le plus près possible à

droite du porte-lames4. Applicateurs en bois5. Lampe à alcool/Bec Bunsen

68

Figure 1

Figure 2

* Le blanc de ménage contient 5 % de NaClO(50 g/litre). On prépare une solution à 0,1 % conte-nant 1 g de NaClO/litre en diluant 20 ml de blanc deménage dans 1 litre d’eau. Cette solution est utiliséecomme un désinfectant à usage multiple dans lessituations de « propreté relative ».

69

Figure 3

1. Porte-lames pour la préparation des frottis2. Séchoir pour les lames3. Crachoir placé le plus près possible à droite

du porte-lames4. Applicateurs en bois

5. Lampe à alcool / Bec Bunsen6. Pince sans griffes7. Poubelle métallique avec couvercle, destinée au recueil

du matériel contaminé8. Boîte de lames gravées pour les frottis

6. Pince sans griffes7. Poubelle métallique avec couvercle, des-

tinée au recueil du matériel contaminé8. Boite de lames gravées pour les frottis

NOTE : Si le technicien est gaucher, ilpeut être plus pratique de disposer sur latable tous ou la plupart des éléments de laFigure 3 exactement en position inverse(c.-à-d. image en miroir).

2.4 Préparation des colorantspour le Ziehl-Neelsen

La méthode de choix pour la bacillosco-pie des frottis d’expectoration est la colora-tion de Ziehl-Neelsen (ZN) car elle est la seuleà fournir régulièrement de bons résultats

sans nécessiter un équipement spécial. Pourla préparation des réactifs nécessaires, il fautune balance, qui n’est pas toujours dispo-nible dans un laboratoire périphérique : lapréparation des réactifs au LaboratoireNational de Référence ou dans le laboratoireintermédiaire le plus proche est dès lors l’op-tion fréquemment choisie. Les avantages decette option, c’est à dire une meilleure stan-dardisation et une meilleure garantie de qua-lité, l’emportent sur les inconvénients d’uneconservation prolongée. Les techniques decoloration à froid comme les méthodes deKinyoun ou de Tan Thiam Hok ne sont pasrecommandées : il est prouvé qu’elles ne per-mettent que difficilement la détection debacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) dansles échantillons paucibacillaires et que lacoloration pâlit rapidement. La microscopie à

fluorescence, qui est recommandée lorsquela charge de travail quotidienne dépasse 50échantillons, n’a pas sa place dans la plupartdes laboratoires périphériques des pays àfaibles revenus.

a) Carbol fuchsine de Ziehl

Solution stock de fuchsine alcoolique à 3 %(solution A)

Fuchsine basique*.............. 3 g†

Alcool 95 %‡........................ jusqu’à 100 ml

Placer la quantité requise de fuchsinedans un flacon (ou dans un cylindre) graduéet ajouter la quantité d’éthanol ou d’alcoolméthyle nécessaire pour obtenir un volumetotal de 100 ml ; bien agiter jusqu’à dissolu-tion complète. De petites quantités de cettesolution doivent être filtrées préalablementà la coloration.

b) Solution aqueuse de phénol(solution B)

Cristaux de Phénol§ ............ 5 gEau distillée, si possible..... jusqu’à 90 ml

Avant d’ajouter l’eau, liquéfier les cris-taux de phénol dans un flacon en les chauf-fant légèrement.

Pour préparer la solution de travail defuchsine phéniquée de Ziehl, mélanger 10 mlde la solution A à 90 ml de la Solution B.

c) Solutions d’agent décolorant

– Solution alcool-acide

Alcool 95 % ......................... 970 mlAcide chlorhydriqueconcentré (35 %)**............. 30 ml

Ou quand l’alcool n’est pas disponible :

– Solution aqueuse d’acide sulfurique à 25 %

Eau, distillée si possible..... 300 mlAcide sulfuriqueconcentré†† .......................... 100 ml

Placer 300 ml d’eau dans un flacon d’unlitre du type Erlenmeyer. Ajouter lentement100 ml d’acide sulfurique concentré en le lais-sant couler le long de la paroi du flacon. Lemélange va chauffer. Ne jamais mettre l’eaudans l’acide sulfurique concentré ; ceci peutprovoquer des éclaboussures explosives.

70

Figure 4

d) Solution de contre-colorationau bleu de méthylène

Chlorure de bleude méthylène‡‡. . . . . . . . . . 0,3 gEau, distillée si possible . . jusqu’à 100 ml

* Chlorure de pararosaniline, contenu minimal encolorant 88 % (C19H18NCl) Sigma P 1528 ou équiva-lent.† Les poudres de colorant sont rarement pures, ensorte que la pesée doit être corrigée pour assurer unecoloration adéquate. Le pourcentage de colorant dis-ponible dans le contenu est fréquemment indiqué surl’étiquette du récipient original. Le poids corrigé estobtenu en divisant la quantité de colorant désirée parla fraction décimale du colorant disponible. Parexemple, si la quantité de colorant désirée est de 3 get le pourcentage de colorant disponible de 75 %, laquantité effective de colorant à peser est de 3/0,75 =4 g de colorant impur. Si le contenu en colorant est de88 % ou davantage, la pesée ne doit pas être corri-gée.‡ Ethanol 95 % (C2H5OH)-Pharmacopée des Etats-UnisXVIII, 20, 1067 (1970). La qualité industrielle est auto-risée.§ Phénol approximativement à 99 % (C6H6O) – SigmaP 3653 ou son équivalent.** Acide chlorhydrique concentré (HCl) – La qualitéindustrielle est autorisée.†† Acide sulfurique concentré (H2SO4) – La qualitéindustrielle est autorisée.‡‡ Chlorure de methylthionine, contenu minimal encolorant 82 % (C16H18CIN3S) – Sigma M 9140 ou sonéquivalent.

71

Figure 6Figure 5

3. RECUEIL ET TRANSPORT DES PRÉLÈVEMENTS

1er frottis d’expectoration,15 % de plus grâceau second et les 5 % restants par le troisième.

3.1.2 Prélèvements pour le suividu traitement

Le traitement de la tuberculose comportedeux phases : la phase intensive qui durehabituellement 2 à 3 mois et la phase decontinuation, durant de 4 à 10 mois selon letype de traitement. Quel que soit le régime detraitement, un échantillon d’expectoration du« MATIN » doit être prélevé à la fin de laphase intensive du traitement pour détermi-ner si le patient peut passer à la phase decontinuation si l’examen microscopique estnégatif ou au contraire doit continuer laphase intensive si la microscopie reste posi-tive. Il y a lieu de prélever un autre échan-tillon d’expectoration au 5e mois de la phasede continuation pour contrôler l’évolution dupatient et détecter un éventuel échec du trai-tement ainsi qu’un troisième au moment del’achèvement de la chimiothérapie (6 ou8e mois), pour contrôler la guérison. Leséchantillons d’expectoration à la fin du trai-tement sont souvent difficiles à obtenir, beau-coup de patients n’expectorent plus à cemoment. Le schéma exact des examens d’ex-pectoration pour le suivi varie selon le régimede traitement et devrait être précisé dans lemanuel du PNT.

3.1 Les prélèvements

3.1.1 Prélèvements pour le diagnostic

Dans les conditions de travail du PNT, ilest recommandé de recueillir trois échan-tillons d’expectoration : un échantillon « SURPLACE », c’est-à-dire lorsque le malade seprésente à la consultation – un échantillon lelendemain matin au réveil à la maison, ditéchantillon du « MATIN » – un troisièmeéchantillon sera prélevé « SUR PLACE »,lorsque le malade se présente de nouveauau laboratoire muni du prélèvement fait à lamaison.

Les prélèvements devront êtres collectésde préférence au cours d’une période de deuxjours, chez toute personne qui se présentedans les structures de santé, parce qu‘elle ades symptômes respiratoires depuis plus de3 semaines. Ces échantillons doivent êtreexaminés au microscope au laboratoire leplus proche.

Un cas de tuberculose à microscopiepositive est défini comme étant un sujet seprésentant avec des symptômes respiratoireset dont au moins deux frottis d’expectorationsont positifs à l’examen microscopique.

Cette approche, appelée égalementdépistage passif, détecte environ 80 % dessujets suspects de TB positifs à l’examen du

3.2 Mode de recueildes expectorations

C’est au moment où les sujets suspectsde tuberculose toussent que le risque decontamination pour les professionnels de lasanté est le plus élevé. Pour cette raison, leséchantillons d’expectoration devraient êtreprélevés à l’air libre, à l’abri des regards etaussi loin que possible d’autres personnes. Adéfaut, l’on devrait utiliser un local séparé etbien ventilé.

L’agent de santé chargé du recueil del’expectoration devrait rassurer les sujets sus-pects de tuberculose en leur expliquant lesraisons de l’examen et leur donner des indi-cations sur la manière de tousser qui permetde produire une expectoration provenant dela profondeur du thorax. Si le patient est

capable de lire, on peut lui fournir en com-plément des instructions écrites.

Avant de refermer le crachoir, l’agent desanté devrait s’assurer que le volume del’échantillon est suffisant (3 ml au moins) etqu’il contient non seulement de la salive maisaussi des produits visqueux ou purulents dontla présence augmente la sensibilité de ladétection des bacilles par la microscopie.Toutefois, même si le prélèvement paraît sali-vaire, ou, comme cela se produit fréquemmentdans les échantillons « sur place », si lesvolumes sont inférieurs à 3 ml, il faut néan-moins examiner l’échantillon car il est parfoissusceptible de donner des résultats positifs.

Un échantillon d’expectoration doit êtreclassifié par examen macroscopique comme« salivaire » lorsqu’il est constitué principale-ment de salive, comme « muqueux » si lemucus est dominant, comme « purulent » lors-qu’il est jaune comme du pus, comme « muco-purulent » lorsque des particules jaunâtressont visibles au sein du mucus et comme« sanglant » lorsqu’il contient du sang. La pré-sence de sang devrait toujours être notée carelle peut indiquer une maladie plus sévère etpourrait interférer avec la lecture du frottis.

L’agent chargé du recueil du crachat four-nira un crachoir marqué du code du centre desanté et où l’identification du patient sera ins-crite sur le corps du crachoir, jamais sur lecouvercle (Figure 7 C). Il demandera à la per-

72

Il est fortement recommandé de faire :– l’examen de trois échantillons d’expec-toration – « SUR PLACE » + « DU MATIN »+ « SUR PLACE » – pour le diagnostic descas de tuberculose.– l’examen d’un échantillon unique d’ex-pectoration « DU MATIN » à trois reprisespour le suivi du traitement : une fois à lafin de la phase intensive, une fois au coursde la phase de continuation et une fois àla fin du traitement.

Figure 7

A

C

B

73

Figure 8

A

C

B

sonne subissant l’examen de tenir le crachoirprès de la bouche et d’expectorer dans celui-ci (Figure 7 B). Cet échantillon est appelé unéchantillon « SUR PLACE ». Si aucune expec-toration n’est produite, le crachoir doit êtreconsidéré comme utilisé et être éliminé. Lescrachoirs seront fermés hermétiquement ets’ils doivent être adressés à un laboratoirevoisin, placés dans le coffret approprié des-tiné au transport. Après recueil, les échan-tillons seront enregistrés, conservés dans unendroit frais, transportés au laboratoire sanstrop de délai, c’est à dire au moins deux foispar semaine et examinés au microscope dansles 24 heures.

Dans des situations très particulières oùles structures de santé disposant de micro-scope sont éloignés des centres de santé, l’ex-pectoration recueillie peut être étalée sur lameau centre de santé et ce sont les lames fixéesqui sont alors adressées au laboratoire le plusproche. Toutefois, ce procédé est déconseillési le personnel n’est pas sérieusement pré-paré à cette tâche, car les frottis fixés, ayantété préparés par un personnel non entraînésont souvent d’une mauvaise qualité et lesrésultats obtenus ne sont pas fiables.

L’agent de santé fournira au malade unnouveau crachoir pré-étiqueté, lui expliqueracomment il devra l’utiliser pour recueillirl’échantillon du « MATIN » et lui montrera lafaçon de fermer hermétiquement le crachoiravant de le rapporter au centre de santé.

3.3 Les crachoirs

Deux types de crachoirs peuvent êtrerecommandés pour le recueil de l’expectora-tion dans le respect de la sécurité pour lemalade et le personnel et celui de la qualitéde l’expectoration recueillie. L’un que l’ontrouve sur la liste des produits disponibles àl’UNICEF (Figure 7 A) est une boîte rigide àlarge ouverture et à couvercle fileté, enmatière plastique transparente, incassable,facile à détruire par combustion. Il peut êtreutilisé pour un grand nombre de diagnosticsde routine (expectoration, selles, parexemple). Son couvercle à pas de vis peutêtre fermé hermétiquement pour prévenir ladessiccation de l’échantillon et les fuites.

L’autre est un crachoir en verre épais,dont le couvercle métallique est lui aussifileté, du type « Flacon Universel » (Figure

8 A). Le « Flacon Universel » peut être réuti-lisé après nettoyage soigneux et désinfectionà l’autoclave pendant 30 minutes à 121 oC. Siun autoclave n’est pas disponible, on recom-mande l’emploi d’une casserole à pressiondu type ménager (cocotte-minute).

Quelque soit le type de crachoirs utilisé,s’ils doivent être transportés, il est recom-mandé d’utiliser des boîtes de transportadaptées au type de crachoir. On utilise descoffrets en métal, en bois ou en mousse depolystyrène, fabriqués sur commande. Laboîte de transport en bois est un compromisraisonnable entre robustesse, poids et coût.Elle peut être fabriquée localement par lemenuisier sur les recommandations fournies(Figure 8 B, C).

3.4 Transport des échantillonsd’expectoration

Le transport des échantillons est néces-saire dans les pays où les équipements delaboratoire font défaut et où l’on fait appel àdes unités de recueil des échantillons. Demême, un transport est nécessaire lorsquedes projets de recherche opérationnels inté-ressant le PNT sont entrepris, comme parexemple la surveillance de la résistance auxmédicaments antituberculeux. Il y a lieu desélectionner les moyens de transport les plusrapides et d’un rapport coût-efficacité opti-mal. La flore de contamination n’interfère passur l’acido-résistance des mycobactéries maiselle peut liquéfier l’expectoration, ce qui rendplus difficile l’étalement du frottis et rend lalecture moins fiable. Les échantillons devantêtre mis en culture, seront conservés au réfri-gérateur en attendant leur envoi et devrontarriver au laboratoire dans les 3 à 4 jours.

Les crachats seront accompagnés d’uneliste identifiant les échantillons d’expectora-tion contenus dans le coffret de transportainsi que le formulaire de Demande d’exa-men d’expectoration (Figure 9) pour chacundes échantillons. Avant l’envoi depuis la for-mation sanitaire, l’agent de santé vérifie pourchaque coffret :– si le nombre total de crachoirs dans le cof-fret correspond à celui de la liste d’accompa-gnement et du nombre de formulaires deDemande d’examen d’expectoration ;– si le numéro d’identification de chaque cra-choir correspond à celui inscrit sur la listed’accompagnement et à celui inscrit sur leformulaire ;– si les formulaires de Demande d’examend’expectoration contiennent les informations

requises pour chacun des patients suspectsde TB.

Après avoir achevé cette vérification,l’agent de la santé :– note la date sur la liste d’accompagnement ;– met cette liste ainsi que le formulaire deDemande d’examen d’expectoration dansune enveloppe qui sera fixée à l’extérieur ducoffret de transport.

3.5 Enregistrement du patient

L’information provenant du formulaire deDemande d’examen d’expectoration seraentièrement transcrite aux endroits appro-priés dans le Registre de la Tuberculose auLaboratoire (Figure 10). Toute l’informationexigée dans le registre du laboratoire doitêtre reportée, c’est à dire qu’un espace blancne correspond pas à un oubli d’enregistre-ment mais à l’absence d’information.

Le registre du laboratoire de l’UICTMR adeux caractéristiques essentielles et utiles :il fait la distinction entre la bacilloscopie del’expectoration pour diagnostic ou pour suiviet attribue une seule ligne à chaque patientsuspect de tuberculose examiné et non àchaque échantillon d’expectoration exa-miné*.

Le numéro d’ordre du registre du labo-ratoire commence à 1 le 1er janvier de chaqueannée et augmente de 1 à chaque patient jus-qu’au 31 décembre de la même année.

74

* Ceci permet de chiffrer le taux de cas à bacillosco-pie positive parmi les suspects, puis de planifier lescommandes de fournitures de laboratoire à partir dunombre de cas à microscopie positive déclarés.

4. PRÉPARATION DES FROTTISPOUR L’EXAMEN MICROSCOPIQUE

4.1 Identificationdes lames

Le personnel de laboratoire inscrira pourchacun des échantillons le code du labora-

toire, le numéro d’ordre du registre du labo-ratoire ainsi qu’un identificateur de laséquence des échantillons, c’est-à-dire 1 pourle premier, 2 pour le deuxième et 3 pour letroisième prélèvement (Figure 11).

75

Figure 9. Formulaire de demande d’examen d’expectoration

DEMANDE D’EXAMEN D’EXPECTORATION

Nom de l’Unité de Traitement Date

Nom du malade

Age Sexe (cocher la case) : M [ ] F [ ]

Adresse précise

Raison de l’examen (cocher la case) : Diagnostic [ ] Examen de suivi [ ]

Signature du responsable du recueil des crachats

Le formulaire dûment rempli doit être rapidement transmis à l’Unité de Traitement

Date Examen effectué par (Signature)

* caractéristiques de l’expectoration à l’œil nu (muco-purulent, traces de sang, salive)

RÉSULTATS (à compléter au laboratoire)

No d’ordre du laboratoire

+ + ++ ++1-9négAspect*Echantillon

1

2

3

Date

Résultats (cochez)

76

Figure 10. Registre de la tuberculose au laboratoire

RE

GIS

TR

E D

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

E A

U L

AB

OR

AT

OIR

EA

nnée

No

d’o

r-d

reD

ate

Nom

Sex

eM

/FA

geN

omd

e l’u

nité

de

trai

tem

ent

Ad

ress

e (p

our

les

pat

ient

sve

nus

pou

rd

iagn

ostic

)

Rai

son

de

l’exa

men

*

diag

nost

icsu

ivi

Rés

ulta

tséc

hant

illon

s

12

3

Sig

natu

reO

bse

rvat

ions

* C

onsu

ltez

la r

aiso

n d

e l’e

xam

en d

ans

la D

eman

de

d’e

xam

en d

’exp

ecto

ratio

n

4.2 Confection de l’étalement

Les crachoirs seront disposés l’un derrièrel’autre. Les numéros d’ordre du laboratoiredoivent coïncider avec l’information corres-pondante sur le formulaire de Demanded’examen d’expectoration qui les accom-pagne. On recommande l’utilisation de lamesneuves ; cependant, comme celles-ci sontsouvent graisseuses, elles ont tendance àadhérer entre elles et ont besoin d’être net-toyées à l’alcool puis séchées soigneusementà l’air. Si l’on ne dispose pas d’alcool, leslames peuvent être placées sur une flammepour éliminer les graisses. Dans les conditionsatmosphériques prévalant dans la plupart despays à faibles revenus, on recommande l’uti-lisation de lames tropicalisées (chaque lameest séparée de la suivante par une languettede papier imperméable). Le code du labora-toire, le numéro d’ordre et l’identification dela séquence peuvent être gravés au moyend’un diamant-marqueur à une extrémité de lalame. Lorsqu’on ne dispose pas de diamant-marqueur, on peut utiliser une mèche den-taire déclassée, à pointe arrondie, enserréedans l’extrémité conique d’un stylo en matièreplastique3. Si l’on dispose de lames à extré-mités dépolies, on peut employer un crayonordinaire à mine de plomb.• Vérifier qu’il y a concordance entre lesnuméros des lames et ceux des crachoirs.• Prendre le crachoir correspondant aunuméro de la lame.• Ouvrir soigneusement le crachoir pour évi-ter la production d’aérosols.• Briser un applicateur en bois ou en bam-bou (Figure 12), choisir des particules jaunes,purulentes dans l’expectoration avec l’extré-mité déchiquetée de l’applicateur brisé.Utiliser l’extrémité brisée des deux morceaux

de l’applicateur pour dissocier les particulesles plus grandes.• Etaler l’expectoration régulièrement sur lazone centrale de la lame grâce à un mouve-ment continu de rotation (Figure 13) ; onrecommande un étalement d’environ 20 mmsur 10 (Figure 11).• Placer les lames sur le séchoir avec la sur-face d’étalement vers le haut et laisser sécherà l’air durant environ 30 minutes.• Refermer le crachoir, qui ne devrait pas êtreéliminé avant que les résultats ne soient luset enregistrés.

Les applicateurs ne peuvent être utilisésqu’une seule fois. Pour s’en défaire, les pla-cer dans une poubelle contenant une solu-tion aqueuse de phénol à 5 % ou une solutiond’hypochlorite de soude à 0,5 %*, puis lespasser à l’autoclave ou à l’incinérateur.ATTENTION : les vapeurs sont très toxiques

77

Figure 11

Figure 12

Figure 13

* L’hypochlorite de soude est un agent oxydant trèspuissant, corrosif pour le métal. On prépare une solutionà 0,5 % contenant 5 g de NaClO/litre en diluant 100 mlde blanc de ménage dans 1 litre d’eau. Cette solution estutilisée en présence de « conditions de saleté ».

4.3 Fixation du frottis

Procéder à la fixation des lames séchéesen les tenant avec une pince et en les pas-sant sur la flamme 5 fois pendant environ4 secondes, la face d’étalement tournée versle haut (Figure 14). Ne pas fixer par la cha-leur les lames humides et éviter un échauf-fement excessif.

78

Figure 14

4.4 Coloration du frottis

4.4.1 Méthode de colorationde Ziehl-Neelsen

Coloration

• Placer les lames fixées sur le support decoloration selon leur numéro d’ordre, la faced’étalement vers le haut. Les lames devraientêtre séparées par un intervalle d’1 cm et nejamais se toucher l’une l’autre.• Recouvrir les lames l’une après l’autre aumoyen de la solution de travail de fuchsinephéniquée de Ziehl à 0,3 % filtrée (Figure 15).En plaçant une bande de papier absorbantcomme un papier filtre ou même du papierjournal, on retiendra la solution de colorationet on évitera le dépôt de cristaux de fuchsinesur le frottis.• Chauffer les lames par le dessous aumoyen de la flamme d’un bec Bunsen, d’unelampe à alcool ou d’un tampon d’ouateimbibé d’alcool, jusqu’à émission de vapeur.Il ne faut jamais aller jusqu’à l’ébullition de lasolution de colorant. Ne pas laisser le colo-rant se dessécher (Figure 16).

• Laisser les lames recouvertes d’une solu-tion chaude et fumante de fuchsine phéni-quée pendant 5 minutes en repassant laflamme si c’est nécessaire• Rincer les lames délicatement à l’eau pourécarter l’excès de fuchsine phéniquée(Figure 17).

Figure 15

Figure 16

Figure 17

79

• Evacuer l’excès d’eau de rinçage des lames(Figure 18). Les frottis d’expectoration ontune couleur rouge.

Figure 19

Figure 18

Décoloration

• Recouvrir les lames au moyen d’acide sul-furique à 25 % ou d’une solution d’alcool-acide et laisser agir pendant 3 minutes, aprèscela la coloration rouge devrait avoir presquedisparu (Figure 19). En cas de nécessité, répé-ter cette séquence durant deux minutes sup-plémentaires.

• Laver délicatement l’acide sulfurique oul’alcool-acide et l’excès de colorant à l’eau(Figure 20). Evacuer des lames l’excès d’eaude rinçage (Figure 21).

Figure 20

Figure 22

Figure 21

Contre-coloration

• Recouvrir les lames l’une après l’autre avecla solution de contre-coloration (bleu deméthylène à 0,3 %) et laisser agir pendant1 minute (Figure 22).

80

Figure 23

Figure 24

• Rincer les lames à l’eau individuellement(Figure 23).

• Evacuer l’eau des lames et les laissersécher à l’air (Figure 24).

La technique de coloration de Ziehl-Neelsendemande :

– 5 minutes pour la coloration ;– 3 minutes pour la décoloration ;– 1 minute pour la contre-coloration.

4.4.2 Qualité de l’étalementet de la coloration

L’aspect d’un frottis coloré correcte-ment est bleu clair sous l’effet du bleu deméthylène. Si la couleur est bleu foncé, lefrottis est trop épais, dans ces conditions iln’est pas possible de lire un texte au tra-vers de la lame :

– exemple d’un bon frottis (Figure 25).

Figure 25

Figure 26

– exemples d’un mauvais frottis (Figure 26).

BON FROTTIS

81

5. EXAMEN MICROSCOPIQUEDES FROTTIS D’EXPECTORATION

5.1 Le microscope

Pour l’examen des frottis, on doit dispo-ser d’un microscope binoculaire à deuxobjectifs – un objectif standard d’agrandisse-ment 40 × et un objectif à immersion d’agran-dissement 100 × – ainsi que d’oculairesd’agrandissement moyen (8 × ou 10 ×)(Figure 27).

On recommande vivement les micro-scopes munis d’une option de miroir focali-sant la lumière, car ils sont utiles en cas decoupure d’électricité et nécessaires dans leslaboratoires où celle-ci fait défaut. Le miroira une surface plane pour la lumière artificielleet une surface concave pour la lumière natu-relle. Une source de lumière est insérée dansla base du microscope ; une ampoule halo-gène assure un éclairage satisfaisant. Leslampes halogènes ont une luminosité plusélevée et une durée de vie plus longue queles ampoules au tungstène.

En dehors des périodes d’utilisation, lesmicroscopes seront protégés de la poussière,de la chaleur et de l’humidité en les mettantdans leur coffret. Le système optique dumicroscope est constamment menacé par ledéveloppement de champignons. Cela peutêtre empêché en équipant le coffret d’unelampe de 20 watts que l’on tient allumée pen-dant l’entreposage du microscope. L’objectif,l’oculaire, le condenseur et la source lumi-neuse seront nettoyés chaque jour, en lesessuyant au moyen d’un papier pour lentille.

5.2 Utilisation du microscope

Pour augmenter le pouvoir résolutif del’objectif, il faut placer une goutte d’huile àimmersion sur la lame colorée et sèche.L’applicateur d’huile à immersion ne doit pastoucher la lame afin d’éviter une contamina-tion croisée par des BAAR. Le mieux est d’uti-liser de l’huile à immersion synthétique. Elleest bon marché et facile à éliminer des lameset du système optique du microscope. Parcontre, Il ne faut jamais utiliser d’huile de cèdre

comme huile à immersion car elle forme aprèsséchage une pâte épaisse qui pourrait endom-mager les lentilles du microscope. Des moyensde fortune comme l’huile de lin, de palme oud’olive ou la paraffine liquide donnent desrésultats tout à fait insuffisants. Certaines huilesà immersion peuvent dissoudre la fuchsine4 :en conséquence, la coloration de ZN peut pâlirplus rapidement. Il y a lieu de recommanderl’emploi d’hydrocarbures synthétiques et depolymères avancés à index de réfraction de1,5, car ils ne sèchent pas, ne durcissent pas etn’ont pas de pouvoir dissolvant*.

La lame colorée est placée sur la platine,le condenseur étant relevé le plus possible.On ajuste la source lumineuse en vue d’unéclairage optimal en regardant dans l’ocu-laire avec l’objectif standard 40X.

On sélectionne une zone contenant plusde leucocytes (cellules de pus) que de cel-lules épithéliales (plus fréquentes dans lasalive) avant d’y laisser tomber une goutted’huile à immersion.

En abaissant lentement l’objectif à immer-sion, un fin film d’huile se forme entre la lameet l’objectif. On utilise alors la vis micromé-trique pour la mise au point du champ. Il fautéviter que l’objectif touche la lame.

Des informations complémentaires surl’utilisation et la manipulation du microscopese trouvent à la référence 5.

5.3 Examen microscopiquedes frottis

Les bacilles acido-résistants se présententen rouge vif ou en rosé sur un fond contre-coloré en bleu. Leur forme est très variable(filaments courts ressemblant à des coquesou filaments allongés). Ils peuvent être colo-rés de façon uniforme ou inégale et peuvent

* Huile à immersion type A ou B (R.P. Cargille Labs,Inc. Cedar Grove, NJ. Catalogue No 16484, ou huile àimmersion de marque VWR, Resolve, CatalogueNo 48218, ou son équivalent).

82

Figure 27

1) oculaire ; 2) cercle d’objectifs ; 3) objectif ; 4) platine ; 5) condenseur ; 6) levier de diaphragme ; 7) vis macrométrique pour mise au point grossière ;

8) vis micrométrique pour mise au point de lecture ; 9) source de lumière.

même paraître granuleux. Ils apparaissent iso-lément ou en amas de taille variable. Ils seprésentent typiquement comme des bâton-nets incurvés, longs et effilés.

L’examen microscopique des frottis sefait selon une procédure systématique etstandardisée qui débute à l’extrémité gauchedu frottis, se poursuit sur une ligne du frottisen déplaçant la lame de gauche à droite, puisen la déplaçant d’arrière en avant on lit unedeuxième ligne parallèle de droite à gauche,puis si nécessaire une autre ligne est exami-née en allant de gauche à droite. Il y a envi-ron 100 champs microscopique dans l’axelongitudinal d’un frottis de 2 cm. Trois lignesde frottis examinés correspondent à 300champs microscopiques contrôlés. La lecturecommence à la périphérie du champ et setermine au centre. (Figure 28).

Le microscopiste doit mettre environ5 minutes pour lire 100 champs, et quand iltravaille à temps plein, il ne faut pas s’at-tendre à ce qu’il prépare et lise par jour plusde 25 échantillons d’expectoration colorés auZN. Il ne faut pas traiter en une fois plus de 10à 12 échantillons. Toutefois, cette situationn’arrive que rarement, même dans les labo-ratoires périphériques de pays à haute inci-dence. Lorsque la microscopie des frottisd’expectoration pour TB est totalement inté-grée dans les services généraux de soins desanté primaires, il est nécessaire d’assurerau microscopiste une charge de travail suffi-sante pour maintenir la compétence néces-saire à l’exécution du test.

83

Figure 28

Nombre de BAAR Enregistrement / communication

Pas de BAAR sur au moins 100 champs 0 / négatif

1 to 9 BAAR sur 100 champs* nombre réel de BAAR‡

10 to 99 BAAR sur100 champs† +

1 to 10 BAAR par champ sur au moins 50 champs† ++

> 10 BAAR par champ sur au moins 20 champs† +++

Tableau 1 Echelle de positivité des résultats de bacilloscopiedes expectorations recommandée par l’UICTMR

* La découverte de 1 à 3 bacilles sur 100 champs n’est pas en bonne corrélation avec la positivité de la culture. L’interprétationde la signification de ce résultat devrait être laissée au PNT et non au microscopiste. Il est recommandé de préparer un nou-veau frottis provenant du même échantillon d’expectoration et de le réexaminer† En pratique, la plupart des microscopistes lisent quelques champs et confirment leur observation par un balayage visuelrapide des champs restants.‡ On recommande de mentionner les décomptes réels de BAAR pour permettre à l’autorité compétente de déterminer sice nombre coïncide avec la définition de cas du PNT.

5.4 Echelle de positivitédes résultats de l’examen aumicroscope des expectorations

Les informations concernant le nombrede bacilles décelés sont très importantes carelles reflètent le degré de contagiosité dupatient ainsi que la sévérité de la maladie.Pour cette raison, il faut formuler les résultatsde la bacilloscopie des frottis d’expectorationde manière non seulement qualitative, maisaussi semi-quantitative. L’UICTMR recom-mande l’échelle suivante pour les résultatsde bacilloscopie des frottis (Tableau 1).

Un bulletin indiquant un résultat positifpour un frottis d’expectoration est un docu-ment sur lequel repose le diagnostic de tuber-culose pulmonaire. Lorsque c’est possible,les frottis positifs devraient être confirméspar un deuxième lecteur.

5.5 Enregistrementet communication des résultatsde l’examen microscopique

Une fois que la lecture des frottis est ter-minée et les contrôles nécessaires éventuelsassurés (frottis positif et frottis douteux), lemicroscopiste reporte les résultats définitifssur le registre du laboratoire (les résultatspositifs doivent être inscrits à l’encre rouge)et sur la fiche réponse (partie inférieure duformulaire de Demande d’examen d’expec-toration), il inscrit la date de la lecture du frot-tis et présente le document à la signature duresponsable du laboratoire.

Les formulaires de Demande d’examend’expectoration seront renvoyés au centre detraitement ou au Médecin traitant dans lesdeux jours ouvrables. Si l’expectoration a ététransférée à partir d’une autre unité de santé,le patient recevra une copie du formulairerempli mais l’original sera adressé au centrede traitement. Les résultats ne doivent jamaisêtre remis seulement au patient. Si le patientnéglige de transmettre les résultats au centrede traitement, il se peut qu’il ne soit pas missous traitement.

Après avoir terminé l’examen de chaquelot de prélèvements, le technicien enregistrela date d’examen sur la liste d’envoi. Les cof-frets de transport sont nettoyés au moyend’un chiffon imbibé d’un germicide pour lebacille tuberculeux (phénol à 5 % ou hypo-chlorite de soude à 0,1 %). Le technicienassure le renvoi au centre de santé d’originele plus tôt possible de la liste d’envoi correc-tement remplie et de la boîte de transport des

prélèvements. Attention : les deux solutions(phénol et hypochlorite de soude) sont extrê-mement corrosives ; l’emploi de gants pro-tecteurs est donc impératif.

5.6 Conservation des frottisen vue de l’assurance qualité

Les lames examinées seront conservéesau laboratoire pendant la durée prescrite parle PNT pour permettre la supervision et laréalisation des tests de concordance (voirchapitre 6).

Les lames seront débarrassées de l’huileà immersion avant leur stockage dans desboîtes réservées à cet effet. On déconseilled’enlever l’huile à immersion de la lame enla prélevant par un papier pour lentille car lefrottis pourrait être détaché de la lame et enoutre, l’huile ne serait jamais complètementéliminée. On recommande d’enlever l’huile àimmersion des lames en les trempant dansle xylène (xylol)* et en les séchant avant de lesstocker dans des boites à lames jusqu’à lasupervision suivante. Il y a lieu de conserverles lames positives et les lames négativesdans l’ordre numérique et dans des boites àlames séparées. Les boites de lames rempliesdoivent être fermées et gardées autant quepossible à l’abri de la chaleur et de l’humiditéjusqu’à ce qu’elles fassent l’objet d’un échan-tillonnage pour relecture. Les lames nedevraient être ni séchées ni emmagasinéessous une lumière à UV directe. L’échantil-lonnage et la relecture des lames seront pra-tiqués aussi vite que possible car la conser-vation prolongée des lames dans desconditions climatiques tropicales peut provo-quer un atténuation de la coloration de ZN etentraîner des résultats de contrôle erronés.

84

* Xylène, Réactif ACS Sigma mélangé X 2377 ou sonéquivalent. Un substitut du xylène, plus sur, moinstoxique et moins inflammable est disponible6.

6.1 Définitions

L’assurance qualité de l’examen micro-scopique des expectorations est une compo-sante obligatoire du programme de luttecontre la tuberculose. Elle concerne l’en-semble du processus, depuis le recueil desexpectorations, la préparation du frottis, sacoloration, l’examen microscopique jusqu’àl’enregistrement et la communication durésultat.

Le but des programmes d’assurance qua-lité est d’améliorer l’efficience et la fiabilitédes services de microscopie des frottis. Lestrois composantes principales d’un pro-gramme d’assurance qualité sont donnéesci-dessous.• Contrôle interne de qualité. Le contrôle dequalité est un processus de suivi interne,effectif et systématique qui vise à détecter lafréquence des erreurs et à la comparer auxlimites fixées pour une performance accep-table du test. Il s’agit d’un mécanisme àmettre en place dans tous les laboratoirespour qu’ils puissent au moins valider la com-pétence de leurs services de diagnostic.• Test de compétence. Il est connu égale-ment comme Evaluation Externe de laQualité. Il s’agit d’un programme visant à per-mettre aux laboratoires participants d’appré-cier leurs capacités en comparant leurs résul-tats à ceux obtenus sur les mêmeséchantillons dans d’autres laboratoires duréseau, par exemple les Laboratoires Régio-naux ou Nationaux.• Amélioration de la qualité. L’améliorationde la qualité est un processus par lequel lescomposantes des services de diagnostic parexamen microscopique des frottis sont ana-lysées afin d’examiner les moyens d’élimi-ner de façon permanente les obstacles quis’opposent à leur succès. Le recueil des don-nées, l’analyse des données, l’identificationdes problèmes et des solutions créatives pources problèmes sont les composantes-clé dece processus. Il implique un suivi continuainsi que l’identification des défaillances, sui-vis d’une action corrective pour prévenir laréapparition des erreurs.

6.2 Procédures

Le contrôle de qualité interne concerneplus particulièrement celui de la coloration.Les nouveaux lots de solutions de colorantsdoivent systématiquement être testés. Ceciimplique habituellement la coloration de frot-tis non colorés, mais connus comme positifset négatifs. De plus il est recommandé d’in-clure dans chaque série de colorationsquelques lames non colorées à résultatconnu. En outre, la relecture des lames posi-tives par un autre technicien est hautementsouhaitée : en pratique toutefois, très peu delaboratoires périphériques disposent de deuxmicroscopistes pour la tuberculose. Dans cecas, le médecin responsable du centre doitêtre capable de relire les frottis positif ou dou-teux. Un contrôle du registre du laboratoiredoit être effectué régulièrement par un autreresponsable du centre ou par le médecinpour vérifier que toutes les rubriques prévuesdans le registre sont correctement remplies,qu’il n’y a pas d’erreurs de report des infor-mations et des résultats. Un aspect essentielde l’assurance qualité réside dans l’observa-tion directe des techniciens de laboratoire àtous les stades de leur travail de routine parun superviseur expérimenté.

Evaluation de la Compétence. Il y aquatre méthodes principales pour tester lacompétence pour la microscopie des cra-chats.

• L’envoi de frottis fixés, non colorés à partirdu Laboratoire de Référence vers le labora-toire périphérique permet de contrôler lacoloration, la lecture et l’enregistrement.• L’observation de la qualité de toutes lesétapes de l’examen microscopique des frot-tis d’expectoration lors des visites de super-vision sur le terrain.• L’envoi de frottis colorés et lus au micro-scope depuis le laboratoire périphérique versle Laboratoire de Référence pour relecture.• Le prélèvement d’un échantillon de lamesprovenant de patients enregistrés en lessélectionnant dans le Registre de laTuberculose du District.

85

6. ASSURANCE QUALITÉ DE L’EXAMENMICROSCOPIQUE DES EXPECTORATIONS

Les quatre méthodes ont des avantageset des inconvénients distincts ; il est dès lorsconseillé de les mettre en œuvre selon lesbesoins et les circonstances de chaque PNT.

Dans le contexte qui nous concerne,l’amélioration de la qualité consiste à corrigerles déficiences dans la performance et la lec-ture des bacilloscopies de frottis en prenantdes mesures appropriée pour y remédier. Le

recyclage des techniciens qui font preuved’une performance inférieure à l’optimum estde la responsabilité des laboratoires d’unniveau supérieur dans le réseau, c’est à direles Laboratoires de Référence Régionaux etCentraux. Une discussion plus détaillée desprogrammes d’assurance qualité en micro-biologie de la tuberculose est fournie dansles références 7 et 8.

86

7. BIOSÉCURITÉ AU LABORATOIRE DE MICROSCOPIEPOUR LA TUBERCULOSE

7.1 Aspects généraux

Les techniciens de laboratoire sont res-ponsables de leur propre sécurité et de cellede leurs collaborateurs. La transmission deMycobacterium tuberculosis résulte essen-tiellement de micro-aérosols, c’est à dire debacilles tuberculeux contenus dans les« noyaux de gouttelettes » d’un diamètre de1 à 5 microns, qui sont suffisamment petitspour atteindre les alvéoles pulmonaires, etsuffisamment grands pour adhérer auxparois des alvéoles pulmonaires.

La lutte contre l’infection au laboratoiredoit viser à réduire la production d’aérosols.Une bonne ventilation est nécessaire à la pro-tection de l’équipe du laboratoire contre l’in-fection par les noyaux de gouttelettes véhi-culés par l’air.. Pour assurer aisément laventilation et un courant directionnel entraî-nant les particules véhiculées par l’air à dis-tance du technicien de laboratoire, on doitsituer judicieusement les portes et lesfenêtres (voir Figure 4). Quand on dispose ducourant électrique, on peut utiliser des extra-cteurs pour aspirer l’air du laboratoire.

Les techniciens doivent se laver les mainschaque fois qu’ils entrent au laboratoire ouqu’ils le quittent. Pendant ses prestations, lepersonnel portera des vêtements protecteurs,comme des blouses de laboratoire. Il lesdéposera dans les armoires avant de quitterle laboratoire. L’accès au laboratoire ne seraautorisé qu’à la seule équipe de laboratoire.

Pour l’étalement et la coloration, le portde gants à jeter est souhaitable. Toutefois, ilreprésente une dépense importante pour les

laboratoires périphériques car ils sont sup-posés être jetés après chaque manipulationde laboratoire. Les gants jetables sont prévuspour une seule utilisation mais dans beau-coup de laboratoires, on a tendance à lesréutiliser jusqu’à déchirure. Cette utilisationinadéquate donne une sensation de faussesécurité et conduit à des négligences qui ontsouvent un impact négatif sur les conditionsde biosécurité du laboratoire : les gants conta-minés sont utilisés pour prendre en main oupour faire fonctionner un équipement de labo-ratoire qui dans d’autres conditions ne seraitjamais contaminé. Vu que dans la plupart descirconstances où ce guide sera utilisé, l’emploides gants n’est pas praticable, on recom-mande fortement le trempage des mains dansl’alcool à 70 %, suivi d’un lavage dans unesolution détergente, d’un rinçage à l’eau etd’un séchage au papier.

Le port de masques chirurgicaux conven-tionnels ne réduit pas significativement lerisque d’infection par inhalation d’aérosols. Anouveau, l’accent doit être porté sur la réduc-tion de la production d’aérosols pendant lesmanipulations de laboratoire par l’adoptionet l’application strictes des Bonnes Pratiquesde Laboratoire8.

Il est interdit de manger, de boire et defumer au laboratoire.

7.2 Aspects spécifiques

Le risque de créer des aérosols varieconsidérablement selon les procédés de labo-ratoire considérés :

l Recueil des échantillons

Les expectorations des patients suspectsde tuberculose sont souvent recueillies aulaboratoire lui-même. Cette pratique exposeles techniciens de laboratoire à un risqueélevé de contagion par aérosol et ne devraitdans aucun cas être autorisée. Comme men-tionnées au Chapitre 1, des précautions pourdiminuer ce risque peuvent être prises endemandant au suspect de tuberculose decouvrir sa bouche pendant la toux et en luifaisant produire ses échantillons à l’extérieur,où les aérosols seront dilués et même stéri-lisés par la lumière UV ou la lumière solairedirecte.

l Préparation des frottis

Quoique l’ouverture des crachoirs etl’étalement des expectorations puissent pro-duire des aérosols, ces manipulations com-portent un risque de transmission moindre

que la toux non protégée d’un patient à bacil-loscopie positive. Il y a peu d’arguments pourconclure que la préparation des frottis d’ex-pectoration entraîne un accroissement durisque d’infection tuberculeuse. Toutefois,l’absence de preuve n’est pas une preuved’absence du risque, et les travailleurs delaboratoire doivent être prudents et restervigilants à tout moment.

Un équipement coûteux et sophistiquén’est pas un substitut valable pour une« bonne pratique de laboratoire » en micro-biologie. De plus, les cabinets de biosécuritéexistants sur le marché exigent un entretienannuel important par des experts, ce quientraîne des dépenses rarement prises encompte au moment de l’achat de l’équipe-ment. Les cabinets de biosécurité qui ne sontpas entretenus correctement donnent unefausse impression de sécurité ; il en est demême pour ceux qui sont préparés de façonartisanale. Le modèle proposé dans la pre-mière édition de ce guide s’est avéré impra-

87

Figure 29

88

ticable après vingt années d’expérience sur leterrain dans les pays à faibles revenus. Dansces conditions, il s’avère que les cabinets debiosécurité ne sont pas d’une grande utilitédans les laboratoires périphériques qui selimitent à la seule bacilloscopie des frottis.

l Désinfection, stérilisationet évacuation des produitscontaminés

Après l’examen des frottis, il faut enleverles couvercles de tous les crachoirs utilisés.Les crachoirs utilisés, leurs couvercles et lesapplicateurs sont placés dans une poubellecontenant une solution de phénol à 5 % oud’hypochlorite de soude à 0,5 % où ils sontcomplètement immergés. Ultérieurement,ces produits peuvent être traités à l’autoclave.Si l’on ne dispose pas d’un autoclave, tous lesproduits doivent être brûlés dans un inciné-rateur, dans une fosse à l’air libre ou un fût depétrole (Figure 29). NB : les fumées produitespar la combustion d’une grande quantité decrachoirs en matière plastique sont toxiques.

Au cas où l’on utilise à la fois matériel àusage unique ainsi que des crachoirs en

verre, ces derniers doivent être placés dansun récipient séparé pour y être bouillis etlavés avant réutilisation. D’autres objets,comme les porte-lames, le séchoir et la sur-face de travail seront désinfectés avec unesolution de phénol à 5 % ou d’hypochloritede soude à 0,5 %.

Après avoir subi le contrôle de qualité,les lames positives seront cassées et traitéescomme les autres objets tranchants. Leslames négatives peuvent soit être cassées etjetées, soit, si nécessaire, être nettoyées etréutilisées pour un travail autre que la tuber-culose (par exemple la malaria ou l’hémato-logie).

Les lames dont les frottis sont négatifsdoivent être bouillies pendant une demi-heure dans une solution de savon ou dedétergent (produit pour la vaisselle), lavées àl’eau courante, essuyées avec un linge fin,séchées à l’air, examinées pour confirmerl’absence de griffes, nettoyées au moyen d’untampon d’ouate trempé dans l’alcool etemmagasinées pour réutilisation.

Qu’elles soient négatives ou positives, leslames pour TB ne doivent jamais être réutili-sées pour le travail en TB.

8. GESTION DES PRODUITS

Les programmes doivent budgétiserleurs commandes de manière rationnelle afind’assurer un débit continu de fournitures delaboratoire. La seule base quantifiable pourcette planification est le nombre de patientsenregistrés pour lesquels des examensmicroscopiques ont été effectués. Le nombreet le pourcentage de patients à bacilloscopiepositive peut être déterminé en se basant surle registre du laboratoire.

Si l’on suppose que le taux de positivitédes frottis parmi les cas suspects est de 10 %,que chaque cas suspect de tuberculose exigetrois examens d’expectoration et que chaquecas confirmé de tuberculose à bacilloscopiepositive a trois examens de suivi, le nombrede lames pour microscopie et de crachoirsnécessaires pour chaque cas à bacilloscopiepositive est de :

1 malade positif 3 lames9 malades suspects non positifs 27 lamespour le malade positif,3 examens de contrôle 3 lamessoit pour un cas positif, 33 lameset 33 crachoirs [(1 +9) × 3 + 3 = 33.]

Le calcul pour les commandes est effec-tué à l’aide de la Fiche de commande pour lematériel de laboratoire (Figures 30 et 30 bis) :– le nombre total de patients à bacilloscopiepositive (nouveaux cas ou cas de retraite-ment) enregistrés dans les deux derniersRapport trimestriel sur le dépistage des tuber-culeux est introduit dans la colonne intitulée« Nombre de malades » ;– les réquisitions pour le semestre suivant(A) sont calculées en multipliant le nombre depatients par un facteur prédéterminé basé sur

la supposition que 10 suspects de TB doiventêtre examinés pour chaque cas à bacillosco-pie positive ;– les réquisitions pour le stock de réserve (B)correspondent à deux fois la quantité néces-saire pour 6 mois (A × 2) ;– la quantité de actuellement en stock (C)dans le magasin de district est inscrite (fairel’inventaire physique) ;• la commande totale (D) représente lasomme de la quantité nécessaire pour lesemestre suivant (A) plus la quantité néces-saire pour le stock de réserve (B) moins lestock actuel (C) au moment où le formulairede commande est complété.

Les commandes de réserve correspon-dent aux fournitures nécessaires pour fonc-tionner un an.

Les commandes en matériel de labora-toire sont relativement limitées et pour cetteraison, elles peuvent être faites tous les6 mois plutôt que tous les 3 mois.

Les quantités de fuchsine basique, debleu de méthylène, d’éthanol et de phénolsont calculées pour la méthode de colorationde ZN recommandée par l’UICTMR, en sup-posant que 5 ml de chacune des solutionssont nécessaires pour chaque lame. On sup-pose par ailleurs que deux gouttes ou 0,1 mld’huile sont utilisés pour chaque lame.

89

90

Figu

re 3

0.

PR

OG

RA

MM

E N

AT

ION

AL

DE

LU

TT

E C

ON

TR

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

E

FIC

HE

DE

CO

MM

AN

DE

PO

UR

LE

MA

TÉ

RIE

L D

E L

AB

OR

AT

OIR

E

Insc

rire

le n

omb

re d

e no

uvea

ux c

as T

PM

+ d

u d

erni

er s

emes

tre

(sel

on le

«R

app

ort

trim

estr

iel s

ur le

dép

ista

ge d

es t

uber

cule

ux»)

Les

calc

uls

sont

bas

és s

ur le

s as

som

ptio

ns d

es b

esoi

ns s

uiva

nts

pour

une

lam

e: 5

ml d

e fu

chsi

ne, 5

ml d

’aci

de s

ulfu

rique

à 2

5%

et 5

ml d

e bl

eu d

e m

éthy

lène

. Les

qua

n-tit

és d

e ré

actif

s né

cess

aire

s po

ur 1

000

lam

es s

ont i

ndiq

uées

dan

s la

2e

colo

nne.

Ces

qua

ntité

s on

t ser

vi d

e ba

se p

our c

alcu

ler l

es b

esoi

ns c

orre

spon

dant

à u

n ca

s di

a-gn

ostiq

ué.

1Le

fact

eur e

st b

asé

sur l

’ass

ompt

ion

que

10 s

uspe

cts

ont e

u de

s ex

amen

s po

ur c

haqu

e ca

s po

sitif

(3 la

mes

cha

cun)

et 3

exa

men

s de

sui

vi p

our l

e ca

s dé

pist

é.

Item

Fuch

sine

~0.

5 g

=15

g

15 g

100

ml

1 25

0 m

l

250

g

500

ml

1 00

0

1 00

0

Ble

u d

e m

éthy

lène

~0.

5 g

=

Hui

le à

imm

ersi

on~

3.3

ml =

Aci

de

sulfu

rique

~41

ml =

Phé

nol

~8.

3 g

=

Mét

hano

l~

17 m

l =

Lam

es~

33 =

Cra

choi

rs~

33 =

Qua

ntit

ére

qui

se p

our

100

0 la

mes

Fact

eur1

No

mb

red

e m

alad

es

Qua

ntit

é re

qui

sep

our

6m

ois

de

fonc

tio

nnem

ent

A

Qua

ntit

é p

our

1 an

née

de

rése

rve

A ~

2 =

B

Act

uelle

men

ten

sto

ckC

Co

mm

and

eto

tale

A +

B –

C =

D

91

PR

OG

RA

MM

E N

AT

ION

AL

DE

LU

TT

E C

ON

TR

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

E

FIC

HE

DE

CO

MM

AN

DE

PO

UR

LE

MA

TÉ

RIE

L D

E L

AB

OR

AT

OIR

E A

U N

IVE

AU

PÉ

RIP

HÉ

RIQ

UE

Insc

rire

le n

omb

re d

e no

uvea

ux c

as T

PM

+ d

u d

erni

er s

emes

tre

(sel

on le

«R

app

ort

trim

estr

iel s

ur le

dép

ista

ge d

es t

uber

cule

ux»)

Les

calc

uls

sont

bas

és s

ur le

s as

som

ptio

ns q

u’il

faut

5 m

l de

chaq

ue s

olut

ion

pour

une

lam

e.1

Le fa

cteu

r est

bas

é su

r l’a

ssom

ptio

n qu

e 10

sus

pect

s on

t eu

des

exam

ens

pour

cha

que

cas

posi

tif (3

lam

es c

hacu

n) e

t 3 e

xam

ens

de s

uivi

pou

r le

cas

dépi

sté.

Item

Sol

utio

n co

lora

nte

~16

5 m

l =

Sol

utio

n d

e d

écol

orat

ion

~16

5 m

l =

Sol

utio

nd

e co

ntre

col

orat

ion

~16

5 m

l =

Hui

le à

imm

ersi

on~

3.3

ml =

Lam

es~

33 =

Cra

choi

rs~

33 =

No

mb

red

e m

alad

esFa

cteu

r1Q

uant

ité

req

uise

po

ur 6

mo

is d

efo

ncti

onn

emen

t A

Qua

ntit

é re

qui

sep

our

1 a

nnée

de

rése

rve

A ~

2 =

B

Act

uelle

men

ten

sto

ckC

Co

mm

and

eto

tale

A +

B–

C =

D

Figu

re 3

0 bi

s.

92

Références

1. Collins C H, Grange J M, Yates M D.Organization and practice in tuberculo-sis bacteriology. London : Butterworths,1985.

2. Laboratory Biosafety Manual. 2nd ed.Geneva : WHO, 1993 : pp. 60-61.

3. McDougall A C. An inexpensive slidemarker made from a dental bur and aplastic pen. Lep Rev 1992 ; 63 : 79-80.

4. Smithwick R C. Laboratory manual foracid-fast microscopy. 2nd ed. USDepartment of Health, Education, andWelfare, Public Health Service. Atlanta,GA : Centers for Disease Control,Bacteriology Division, 1976.

5. The Microscope. A Practical Guide. WHOProject : ICP TUB 001. New Delhi, India :WHO Regional Office for South-East Asia,1999.

6. McDougall A C. The use of xylene (xylol)in medical laboratories. Lep Rev. 1989 ;60 : 67.

7. Woods G L, Ridderhof J C. Quality assu-rance in the mycobacteriology labora-tory. In : Clinics in Laboratory Medicine.Philadelphia, PA : W B Saunders, 1996 :Vol. 16, Number 3.

8. Kumari S, Bathia R, Heuck C C. Qualityassurance in bacteriology and immuno-logy. WHO Regional Publication, South-East Asia Series No 28. New Delhi, India :WHO Regional Office for South-East Asia,1998.

Lectures suggérées

1. Bacteriology of tuberculosis. The speci-men. Microscopy examination. Technicalnote no 26. Washington, DC : Pan Ame-rican Health Organization, 1984.

2. Minamikawa M. Laboratory Manual forthe National Tuberculosis Programme ofNepal. National Tuberculosis Centre.JICA/HMG National TB Control Project(II). March 1998.

3. De Kantor I N, Kim S J, Frieden T, LaszloA, Luelmo F, Norval P Y, Rieder H L,Valenzuela P, Weyer K. Laboratory ser-vices in tuberculosis control. WHO GlobalTuberculosis Programme. WHO/TB/98.258. Geneva : WHO, 1998.

4. Manual of norms and technical proce-dures for tuberculosis bacteriology. Part1 Smear microscopy. Technical note 26.Washington, DC : Pan American HealthOrganization, 1984.

5. Manual for Laboratory Technicians.Revised National Tuberculosis ControlProgramme (RNTCP). Nirman Bhavan,New Delhi, India : Central TB Division,Directorate General of Health Services,Ministry of Health and Family Welfare,1997.

6. Module for Laboratory Technicians.Nirman Bhavan, New Delhi, India :Central TB Division, Directorate Generalof Health Services, Ministry of Health andFamily Welfare, 1997.

7. Rieder H L, Chonde T M, Myking H,Urbanczik R, Laszlo A, Kim S J, Van DeunA, Trébucq A. The Public Health ServiceNational Tuberculosis Reference Labo-ratory and the National LaboratoryNetwork. Minimum requirements, roleand operation in a low income country.Paris : IUATLD, 1998.

8. Fujiki A. TB microscopy. Tokyo, Japan :The Research Institute of Tuberculosis,Japan Anti-Tuberculosis Association,Japan International Cooperation Agency,Hachioji International Training Centre,1998.

9. Tuberculosis control : a manual ofmethods and procedures for integratedprograms. Scientific Publication No 498.Washington, DC : Pan American HealthOrganization, 1986.

10. Enarson D A, Rieder H L, Arnadottir T,Trébucq A. Management of tuberculo-sis : a guide for low income countries.5th ed. Paris : IUATLD, 2000.

93

PRÉVENTION DES FAUX POSITIFS EN MICROSCOPIE

• Utiliser des lames neuves

• Utiliser un applicateur neuf pour chaque échantillon

• Utiliser de la fuchsine phéniquée filtrée

• Ecarter les lames les unes des autres pendant la coloration

• Ne pas utiliser de bacs à coloration

• Ne pas laisser la fuchsine phéniquée sécher sur la lame

• Ne pas toucher le frottis avec l’applicateur d’huile à immersion

• Ne pas mettre l’objectif à immersion au contact du frottis

• Identifier complètement et avec précision les crachoirs, les lames et les formulaires du labo-ratoire

• Vérifier si le numéro du formulaire de Demande d’examen d’expectoration correspond à celuidu crachoir avant de communiquer les résultats

• Enregistrer et communiquer les résultats avec précision

CONSÉQUENCES DES « FAUX POSITIFS » EN MICROSCOPIE

• Traitements non nécessaires – Gaspillage de médicaments

• Perte de confiance dans le PNT

PRÉVENTION DES FAUX NÉGATIFS EN MICROSCOPIE

• S’assurer que l’échantillon contient des expectorations et pas seulement de la salive

• S’assurer qu’il y a au moins 3 ml d’expectoration

• Sélectionner des particules visqueuses, muco-purulentes pour l’étalement

• Les frottis ne doivent être ni trop épais ni trop minces

• Colorer les frottis pendant 5 minutes

• Décolorer les frottis pendant 3 minutes

• Contre-colorer pendant 1 minute

• Lire l’ensemble des 100 champs avant de déclarer la lame négative

• Des BAAR bien colorés doivent apparaître sur les frottis de contrôle, connus comme positifs

• Identifier avec soin les crachoirs, les lames et les formulaires de laboratoire

• Collationner le numéro indiqué sur le formulaire de Demande d’examen d’expectoration etcelui du crachoir

• Enregistrer et communiquer les résultats avec précision.

CONSÉQUENCES DES « FAUX NÉGATIFS » EN MICROSCOPIE

• Le patient n’est pas mis sous traitement, ce qui entraîne une souffrance individuelle, la dis-sémination de la tuberculose et un risque élevé de décès.

• On peut négliger de prolonger la phase intensive du traitement, d’où un traitement inadéquat.

• Perte de confiance dans le PNT

ANNEXE 1

94

ANNEXE 2

ENTRETIEN DU MICROSCOPE

Le microscope est l’outil principal des services de diagnostic de la TB du PNT. Unemanipulation correcte et l’entretien du microscope par l’équipe du laboratoire sontessentiels pour prolonger sa durée d’utilisation. Il y a lieu de respecter les donnéessuivantes :

• Le microscope non utilisé doit être entreposé dans un environnement sec, libre detoute poussière ou vibration.

• Eviter d’exposer le microscope à la lumière solaire directe, aux moisissures et à l’hu-midité.

• Placer un gel de silice dans le coffret de conservation du microscope ; reconstituerle gel de silice par chauffage lorsqu’il devient rose.

• Nettoyer le microscope avant et après usage au moyen d’un papier pour lentille.

• Essuyer la surface de la lentille à immersion avec un morceau d’ouate propre avantet après usage. Ne pas utiliser l’alcool pour nettoyer les lentilles.

• La lentille à immersion dans l’huile ne devrait pas venir au contact du frottis

• N’utiliser que la vis micrométrique en cas d’emploi de lentille à immersion.

95

ANNEXE 3

GUIDE POUR LA SOLUTION DES PROBLÈMES DE MICROSCOPIE

PROBLÈME CAUSES POSSIBLES SOLUTION

Champ sombreCondenseur trop bas

Diaphragme fermé

Relever le condenseur

Ouvrir le diaphragme

L’image à faiblegrossissementn’est pas claire

Huile sur l’objectif

Poussière sur la surfacesupérieure de l’objectif

Objectif endommagé

Nettoyer l’objectif

Dévisser l’objectifet le nettoyer

Remplacer l’objectif

Image trouble

Le côté « frottis »de la lame est en dessous

Présence d’une bulle d’airdans l’huile

Huile de mauvaise qualité

Objectif sale

Retourner la lame

Déplacer l’objectifà immersion d’un côté

à l’autre

Changer d’huile

Nettoyer l’objectif

Dans le champ,ombres sombres

se déplaçant avec l’oculairequand on le fait tourner

Oculaire sale

Oculaire ou objectif contaminépar des champignons

Griffes sur la surfacede l’oculaire

Nettoyer l’oculaire

Le remplacement de l’oculairepeut être nécessaire

Le remplacement de l’oculairepeut être nécessaire

97

COMPOGRAVURE

IMPRESSION, BROCHAGE

I M P R I M E R I E C H I R A T

42540 ST-JUST-LA-PENDUE

OCTOBRE 2001

DÉPÔT LÉGAL2001 N° 3145

IMPRIMÉ EN FRANCE

99

FORMULAIRES

VI. ANNEXE 2

FORMULAIRE 1PROGRAMME NATIONAL DE LUTTE CONTRE LA TUBERCULOSE

DEMANDE D’EXAMEN D’EXPECTORATION

Nom de l’Unité de Traitement Date

Nom du malade

Age Sexe (cocher la case) : M [ ] F [ ]

Adresse précise

Raison de l’examen (cocher la case) : Diagnostic [ ] Examen de suivi [ ]

Signature du responsable du recueil des crachats

Le formulaire dûment rempli doit être rapidement transmis à l’Unité de Traitement

Date Examen effectué par (Signature)

* caractéristiques de l’expectoration à l’œil nu (muco-purulent, traces de sang, salive)

RÉSULTATS (à compléter au laboratoire)

No d’ordre du laboratoire

+ + ++ ++1-9négAspect*Echantillon

1

2

3

Date

Résultats (cochez)

FORMULAIRE 2

PR

OG

RA

MM

E N

AT

ION

AL

DE

LU

TT

E C

ON

TR

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

E

RE

GIS

TR

E D

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

E A

U L

AB

OR

AT

OIR

EA

nnée

No

d’o

r-d

reD

ate

Nom

Sex

eM

/FA

geN

omd

e l’u

nité

de

trai

tem

ent

Ad

ress

e (p

our

les

pat

ient

sve

nus

pou

r d

ia-

gnos

tic)

Rai

son

de

l’exa

men

*

diag

nost

icsu

ivi

Rés

ulta

tséc

hant

illon

s

12

3

Sig

natu

reO

bse

rvat

ions

* C

onsu

ltez

la r

aiso

n d

e l’e

xam

en d

ans

la D

eman

de

d’e

xam

en d

’exp

ecto

ratio

n

FORMULAIRE 3

PR

OG

RA

MM

E N

AT

ION

AL

DE

LU

TT

EC

ON

TR

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

EFI

CH

E D

E T

RA

ITE

ME

NT

AN

TIT

UB

ER

CU

LEU

XN

od

’ord

re:

12

34

56

78

910

1112

1314

1516

1718

1920

2122

2324

2526

2728

2930

31Jo

urM

ois

Coc

hez

la c

ase

corr

esp

ond

ante

dès

que

les

méd

icam

ents

ont

été

ad

min

istr

ésV

oir

au v

erso

pou

r la

pha

se d

e co

ntin

uatio

n

Moi

s

0 2 5 7 > 7

Dat

e /

No

de

lab

o

Rés

ulta

ts d

el’e

xam

en d

el’e

xpec

tora

tion

Poi

ds

(kg)

Dat

e d

e la

pro

chai

neco

nsul

tatio

n

{TH

} =

thi

oacé

tazo

ne/is

onia

zide

; S

= s

trep

tom

ycin

e;

{RH

} =

rifa

mpi

cine

/ison

iazi

de;

E =

éth

ambu

tol;

Z =

pyr

azin

amid

e

STH

RH

ZE

SR

HZ

E

S{T

H}

ZE

{RH

}S

ZE

{RH

}

Rég

ime

et p

osol

ogie

pre

scrit

s:

I.P

HA

SE

IN

ITIA

LE I

NT

EN

SIV

ED

ate

Nom

:

Ad

ress

e:

Cen

tre

de

San

téA

geS

exe

: M

[ ]

F [

]

Typ

e d

e m

alad

ie:

Pul

mon

aire

E

xtra

-pul

mon

aire

(si

te)

Nou

veau

Rec

hute

Ech

ecTr

ansf

éré

Trai

tem

ent

aprè

s ab

anb

on

Aut

re (

pré

cise

r)

THE

HR

H

retraitement

3 fois par semaine

(5 mois)

nouveaucas (q

uotidien)

(2STH

/10TH=

10 mois

;2R

HZE/6TH

=6 m

ois)

II.PH

AS

E D

E C

ON

TIN

UA

TIO

NInscrire régim

e et dosage p

rescrit:

Jour

Mois

12

34

56

78

910

1112

1314

1516

1718

1920

2122

2324

2526

2728

2930

31

Ob

servations:

Marq

uer d’un X

le jour de la p

rise supervisée d

es méd

icaments ou la d

ate de d

istribution d

es méd

icaments. Tirer une ligne horizontale p

ourind

iquer le nom

bre d

e jours de traitem

ent auxquels la p

rovision de m

édicam

ents correspond

.

FORMULAIRE 4

PROGRAMME NATIONAL DE LUTTE CONTRE LA TUBERCULOSE

Type de malade**

Nou-veau

Rechute Echec REP Transféré Autre

Dated’enre-

gistrement

No

d’ordre Nom (en entier) SexeM/F Age Adresse

Nomde l’Unité

de traitement

Datedébut

traitementRégime*

Site

P/EP

* Nouveau cas : HRZE = 8 mois ou STH = 12 mois* Retraitement : SHRZE

** Nouveau : malade qui n’a jamais reçu de traitement antitu-berculeux pour plus d’un mois

** Rechute : malade qui a été déclaré guéri, mais qui est denouveau frottis positifs

Echec : frottis positifs 5 mois ou plus après le début de la chimiothérapieREP : reprise de traitement après abandon, revient frottis positifsTransféré : malade inscrit sur le registre d’un autre centre et transféré dans ce centre

REGISTRE DE LA TUBERCULOSE FORMULAIRE 4

Résultat de l’examen d’expectoration (en fonction du nombre de mois de traitement) Date du résultat du traitement***

ObservationsRésultat des frottis :

négatifs(guéri)

non faits(traitement

terminé)

positifs(échec)

Décédé Perdude vue Transféré

Avant-traitement

Résultat No lame/Date Résultat No lame/

Date Résultat No lame/Date Résultat No lame/

Date Résultat No lame/Date

2 mois 5 mois 7 mois 11 mois

Année

*** Frottis négatifs : (guéri) 2 frottis négatifs dont l’un au cours du dernier mois de traitement*** Frottis non faits : (traitement terminé) pas de résultat d’examen bacilloscopique au cours du dernier mois de traitement*** Frottis positifs : (échec) frottis positifs 5 mois ou plus après début de traitement (confirmé par un deuxième frottis)

Décédé : malade décédé en cours de traitement, quelle que soit la cause du décèsPerdu de vue : malade qui n’est pas venu chercher ses médicaments pendant 2 mois consécutifsTransféré : malade qui a été transféré dans la juridiction d’un autre centre

FORMULAIRE 5PROGRAMME NATIONAL DE LUTTE CONTRE LA TUBERCULOSER

AP

PO

RT

TR

IME

ST

RIE

L S

UR

LE

DÉ

PIS

TA

GE

DE

S T

UB

ER

CU

LEU

X

No

m d

e l’u

nité

de

trai

tem

ent

Pat

ient

s en

regi

stré

s p

end

ant

le

trim

estr

e d

e 20

Nom

de

l’age

nt d

u C

entr

e ch

argé

du

rap

por

t

Sig

natu

reD

ate

CA

S E

NR

EG

ISTR

ÉS

DA

NS

LE

TR

IME

STR

E

NO

UV

EA

UX

CA

S À

FR

OTT

IS P

OS

ITIF

S S

EU

LEM

EN

T

Nou

veau

x ca

sR

echu

tes

Ech

ecs

Rep

rises

trai

tem

ents

< 1

5 an

s

FRO

TTIS

-NÉ

GA

TIFS

FRO

TTIS

-PO

SIT

IFS

15 a

ns +

EX

TRA

-P

ULM

ON

AIR

ES

TOTA

L

0-14

15-2

425

-34

35-4

445

-54

55-6

465

+

MF

MF

MF

MF

MF

MF

MF

Mas

culin

Fém

inin

Tota

l

Cla

sse

d’â

ge (

ans)

TOTA

L

Exp

licat

ion

s p

our

rem

plir

le

form

ula

ire

:Tr

imes

tres

1ertr

imes

tre

– 1er

janv

ier

au 3

1 m

ars

3etr

imes

tre

– 1er

juill

et a

u 30

sep

tem

bre

2etr

imes

tre

– 1er

avril

au

31 j

uin

4etr

imes

tre

– 1er

octo

bre

au

31 d

écem

bre

Op

tionn

el:

NO

MB

RE

DE

PA

TIE

NTS

MIS

AU

TR

AIT

EM

EN

T D

UR

AN

T LE

TR

IME

STR

E,

EN

FO

NC

TIO

N D

U R

ÉG

IME

TH

ÉR

AP

EU

TIQ

UE

2RH

ZE

/6TH

2STH

/10T

H12

TH2S

RH

ZE

/1R

HZ

E/5

R3H

3E3

FORMULAIRE 6

PR

OG

RA

MM

E N

AT

ION

AL

DE

LU

TT

E C

ON

TR

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

E

RA

PP

OR

T D

ES

RÉ

SU

LTA

TS

DE

TR

AIT

EM

EN

T P

OU

R L

ES

CA

S D

E T

UB

ER

CU

LOS

E P

ULM

ON

AIR

EÀ

FR

OT

TIS

PO

SIT

IFS

EN

RE

GIS

TR

ÉS

15

MO

IS A

UP

AR

AV

AN

T

No

m d

e l’u

nité

de

trai

tem

ent

Pat

ient

s en

regi

stré

s p

end

ant

le

tr

imes

tre

de

20

Nom

de

l’age

nt d

u C

entr

e ch

argé

du

rap

por

t

Sig

natu

reD

ate

Typ

e d

e m

alad

eR

égim

e th

érap

eutiq

ueFr

ottis

néga

tifs

(gué

ri)

Frot

tisno

nfa

its(tr

aite

men

tte

rmin

é)

Frot

tisp

ositi

fs(é

chec

)D

écéd

éP

erd

ud

e vu

eTr

ansf

éré

Tota

l

No

uvea

ux c

asà

fro

ttis

-po

siti

fs

nom

bre

*

——

——

——

——

2RH

ZE

/6TH

2STH

/10T

H

Cas

à f

rott

isp

osi

tifs

en

retr

aite

men

t

nom

bre

*

——

——

——

——

* se

lon

le f

orm

ulai

re d

u R

app

ort

trim

estr

iel

sur

le d

épis

tage

des

tub

ercu

leux

2SR

HZ

E/1

RH

ZE

/5R

3H3E

3

FORMULAIRE 7

PR

OG

RA

MM

E N

AT

ION

AL

DE

LU

TT

E C

ON

TR

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

E

FIC

HE

DE

CO

MM

AN

DE

PO

UR

LE

S M

ÉD

ICA

ME

NT

S A

NT

ITU

BE

RC

ULE

UX

Insc

rire

le n

omb

re d

e ca

s d

u d

erni

er t

rimes

tre

(sel

on l

e R

app

ort

trim

estr

iel

sur

le d

épis

tage

des

tub

ercu

leux

)

Méd

icam

ent

{RH

} 15

0/75

2RH

ZE

/6TH

Cas

Fact

eur*

Tota

l

A

~21

0 =

~0

=0

~54

0 =

Z 4

00~

210

=~

0 =

0~

320

=

S 1

g~

0 =

0(~

60)

=~

60 =

{TH

} 15

0/30

0~

180

=~

360

=~

0 =

0

H10

0~

0 =

0~

0 =

0~

100

=

E 4

00~

150

=~

0 =

0~

450

=

2(S

)TH

/10T

H

Cas

Fact

eur*

Tota

l

B

2SR

HZ

E/1

RH

ZE

/5R

3H3E

3To

tal

A+

B+

C=

D

Cas

Fact

eur*

Tota

l

C

Item

Qua

ntité

req

uise

E (

= D

)

Rés

erve

néc

essa

ire

F(=

E)

Act

uelle

men

t en

sto

ck

{TH

} 50

/100

{EH

} 40

0/15

0**

Ser

ingu

es/A

igui

lles

Eau

pou

r in

ject

ion

(5m

l)

Com

man

de

tota

le

E+

F–

GG

{RH

} 15

0/75

Z 4

00

S 1

g

{TH

} 15

0/30

0

H10

0

E 4

00

Dat

e :

Nom

et

sign

atur

e:

*Fac

teur

: no

mbr

e de

com

prim

és p

ris e

n m

oyen

ne p

ar u

n m

alad

e.**

Pou

r ch

aque

pat

ient

che

z qu

i {T

H}

doit

être

rem

plac

é pa

r {E

H}

à ca

use

des

effe

ts s

econ

daire

s, 3

60 c

ompr

imés

de

{EH

} do

iven

t êt

re c

omm

andé

s.

FORMULAIRE 8

PR

OG

RA

MM

E N

AT

ION

AL

DE

LU

TT

E C

ON

TR

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

E

FIC

HE

DE

CO

MM

AN

DE

PO

UR

LE

MA

TÉ

RIE

L D

E L

AB

OR

AT

OIR

E

Insc

rire

le n

omb

re d

e no

uvea

ux c

as T

PM

+ d

u d

erni

er s

emes

tre

(sel

on l

e «

Rap

por

t tr

imes

trie

l su

r le

dép

ista

ge d

es t

uber

cule

ux»)

Les

calc

uls

sont

bas

és s

ur l

es a

ssom

ptio

ns d

es b

esoi

ns s

uiva

nts

pour

une

lam

e:

5 m

l de

fuc

hsin

e, 5

ml

d’ac

ide

sulfu

rique

à 2

5%

et

5m

l de

ble

u de

mét

hy-

lène

. Le

s qu

antit

és d

e ré

actif

s né

cess

aire

s po

ur 1

000

lam

es s

ont

indi

quée

s da

ns l

a 2e

colo

nne.

Ces

qua

ntité

s on

t se

rvi

de b

ase

pour

cal

cule

r le

s be

soin

s co

r-re

spon

dant

à u

n ca

s di

agno

stiq

ué.

1Le

fac

teur

est

bas

é su

r l’a

ssom

ptio

n qu

e 10

sus

pect

s on

t eu

des

exa

men

s po

ur c

haqu

e ca

s po

sitif

(3

lam

es c

hacu

n) e

t 3

exam

ens

de s

uivi

pou

r le

cas

dép

isté

.

Item

Fuch

sine

~0.

5 g

=15

g

15 g

100

ml

1 25

0 m

l

250

g

500

ml

1 00

0

1 00

0

Ble

u d

e m

éthy

lène

~0.

5 g

=

Hui

le à

im

mer

sion

~3.

3 m

l =

Aci

de

sulfu

rique

~41

ml

=

Phé

nol

~8.

3 g

=

Mét

hano

l~

17 m

l =

Lam

es~

33 =

Cra

choi

rs~

33 =

Qua

ntit

ére

qui

se p

our

100

0 la

mes

Fact

eur1

No

mb

red

e m

alad

es

Qua

ntit

é re

qui

sep

our

6m

ois

de

fonc

tio

nnem

ent

A

Qua

ntit

é p

our

1 an

née

de

rése

rve

A ~

2 =

B

Act

uelle

men

ten

sto

ckC

Co

mm

and

eto

tale

A +

B –

C =

D

FORMULAIRE 8bis

PR

OG

RA

MM

E N

AT

ION

AL

DE

LU

TT

E C

ON

TR

E L

A T

UB

ER

CU

LOS

E

FIC

HE

DE

CO

MM

AN

DE

PO

UR

LE

MA

TÉ

RIE

L D

E L

AB

OR

AT

OIR

E A

U N

IVE

AU

PÉ

RIP

HÉ

RIQ

UE

Insc

rire

le n

omb

re d

e no

uvea

ux c

as T

PM

+ d

u d

erni

er s

emes

tre

(sel

on l

e «

Rap

por

t tr

imes

trie

l su

r le

dép

ista

ge d

es t

uber

cule

ux»)

Les

calc

uls

sont

bas

és s

ur l

es a

ssom

ptio

ns q

u’il

faut

5 m

l de

cha

que

solu

tion

pour

une

lam

e.1

Le f

acte

ur e

st b

asé

sur

l’ass

ompt

ion

que

10 s

uspe

cts

ont

eu d

es e

xam

ens

pour

cha

que

cas

posi

tif (

3 la

mes

cha

cun)

et

3 ex

amen

s de

sui

vi p

our

le c

as d

épis

té.

Item

Sol

utio

n co

lora

nte

~16

5 m

l =

Sol

utio

n d

e d

écol

orat

ion

~16

5 m

l =

Sol

utio

nd

e co

ntre

col

orat

ion

~16

5 m

l =

Hui

le à

im

mer

sion

~3.

3 m

l =

Lam

es~

33 =

Cra

choi

rs~

33 =

No

mb

red

e m

alad

esFa

cteu

r1Q

uant

ité

req

uise

po

ur 6

mo

is d

efo

ncti

onn

emen

t A

Qua

ntit

é re

qui

sep

our

1 a

nnée

de

rése

rve

A ~

2 =

B

Act

uelle

men

ten

sto

ckC

Co

mm

and

eto

tale

A +

B–

C =

D

Documents

Diagnostic de la tuberculose par examen … · Un guide technique pour l’examen microscopique direct des frottis d’ex-pectoration, inspiré par celui élaboré en 1969 par le