Dicroísmo Circular: análisis de proteínas

Gabriela Olvera A00806132Francisco Gallegos A00948383

Jorge Garza A01135359J. Gerardo López A00366856

IntroducciónEl dicroísmo circular se refiere a la diferencia de absorción de luz entre luz circular polarizada derecha e izquierda. La diferencia de absorción entre la luz derecha e izquierda crea un haz de luz resultante el cual sirve para el análisis de la estructura secundaria de proteínas, así como su plegamiento.

PrincipiosHaz de luz polarizado en un plano: Vibración en un solo plano.

Superposición de dos ondas polarizadas

Polarización CircularSi los dos haces de luz superimpuestos, aún con la misma amplitud y longitud de onda se superimponen PERO desfasados 90 o -90 grados, se obtiene una polarización circular: el haz resultante ya no está polarizado en el plano.

Polarización Circular

Desfasados 90 y -90 grados: Los picos y los cruces del plano de los dos haces ya no coinciden.

El haz que gira en sentido de las manecillas del reloj se le llama onda polarizada circular derecha (ED) y en el

sentido contrario se le denomina onda polarizada circular izquierda (EI).

Lo mismo pero al revés

Dos haces circulares suman un haz polarizado

en plano.

Interacción con MateriaAl interactuar con materia, la luz sufre dos fenómenos principales:

1. Absorción: la materia absorbe una parte de la luz por lo que disminuye su amplitud (intensidad).

2. Cambio en velocidad (refracción): cuando la luz pasa de un medio a otro.

Interacción con MateriaAbsorción

Refracción

Concepto: Dicroísmo CircularDicroísmo circular (CD):Cuando una muestra absorbe el rayo ED de una manera diferente (mayor

o menor) al EI. Al salir de la muestra el rayo no se encuentra polarizado circular ni planarmente, sino elípticamente:

Concepto: BirrefringenciaLa misma diferencia pero con refracción en vez de absorción, crea dispersión óptica rotatoria

(ORD):

Y la suma de ambos...

Estos fenómenos provocan una rotación del plano de polarización en un ángulo alpha y la distorsión de este plano también genera una elipse.

Equipo general• El proceso empieza con

un rayo de luz polarizada. La polarización va cambiando periódicamente.

• Al pasar por la muestra, el detector identifica si una molécula es ópticamente activa, ya que habrá un cambio en la absorción en algún período de polarización especial y la luz transmitida variará.

• La variación está directamente relacionada con el DC de la muestra a esa longitud de onda. Al hacer un barrido de varias longitudes se obtiene el espectro completo de DC. Que lleva a las interpretaciones.

Equipo de DCCaracterísticas importantes

Debe contar con fuente de luz polarizada.

Cuenta con generador de radiación (carburo de silicio) que se filtra y polariza.

Un modulador fotoelástico (cristal) produce la radiación circularmente polarizada.

La muestra se coloca disuelta en un solvente adaptado a longitud de onda deseada.

Aplicaciones● Determinación de estructura secundaria de

proteínas● Estudio de cambios de entorno (pH, temperatura,

etc.)● Determinación de conformación de ácidos

nucleicos● Estudio de interacciones proteína - proteína

InterpretaciónLa diferencia en la absorción entre el ED y el EI es muy pequeña, es usualmente entre 1/100 y 1/10 de un porciento, sin embargo se puede determinar de una manera muy precisa. Con estos datos se puede obtener la elepsicidad de la muestra.

Para poder comparar los valores de elipcicidad, se tienen que normalizar los valores, obteniendo la elipsicidad molar específica por residuo. Se debe de considerar la longitud del trayecto (l), la concentración ( c ), la masa molecular (M) y el número de residuos (nr).

Para analizar la estructura secundaria de las proteínas, cada estructura secundaria básica (hélice alfa, lámina beta o espiral) tiene un espectro de DC característico. Por lo tanto una proteína que consiste de estas tres diferentes estructuras debe de contener el espectro característico de cada una. Para interpretar estas gráficas se han creado gráficas estándar de proteínas con estructura conocida.

Estas interpretaciones tienen algunas limitaciones inherentes al método, por ejemplo no se considera las interacciones que pudieran tener los cromóforos entre otras regiones de la proteína y otros elementos, es por eso que el método no es muy exacto. Sin embargo este método es muy confiable para monitorear cambios en la conformación de proteínas en diferentes condiciones (estudios de desnaturalización, plegamiento, etc.)

Cada estructura secundaria tiene diferentes características del espectro DC en UV:

Alfa Hélice:

• Bandas negativas en 222 y 208 nm.

• Bandas positivas a 193 nm.

Láminas Beta-plegadas:

• Bandas negativas a 218 nm y positivas a 195nm.

Para la conformación de espiral:

• + a 212nm

• - A 195 nm

Ejemplo

Industria Biotecnológica

Técnicas de purificación

Producción de proteínas

Desplegamiento de proteínas

Incremento de condiciones desnaturalizantes– Temperatura– Químicos (urea)– pH extremo

Disminuye la estabilidad de la proteína

→ Se despliega

CD es una técnica muy útil debido a que los espectros de proteínas plegadas y desplegadas son muy diferentes. (Figura 1)

La transición de desplegamiento se puede terminar escogiendo una longitud de onda donde la diferencia en la señal de proteína plegada y no plegada sea muy grande.

Figura 1. Características del espectro en α-hélices, β-plegada y espirales aleatorios.

Dicroísmo Circular: Efecto del pH y del uso de agentes desnaturalizantes

• Espectro de dicroísmo circular de una apomioglobina (apoMb) como función de condiciones desnaturalizantes.

• Transición de desplegamiento inducida por pH y por urea (@222nm)

Fuentes1. http://www.informatics.indiana.edu/predrag/classes/2008springi619/week4_m.pdf2. http://www.biomachina.org/courses/structures/052.pdf3. http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/exposicion_dicroismo_circular_5050.pdf 4. http://www.photophysics.com/products/chirascan-cd-spectrometer5. http://www.ruppweb.org/cd/cdtutorial.htm6. Correa, D. & Ramos, C. (2009). The use of circular dichroism spectroscopy to study protein folding, form and

function. African Journal of Biochemistry Research 3(5): 164-1737. http://download.springer.com/static/pdf/362/art%253A10.1007%252Fs00249-004-0401-8.pdf?auth66=13816824

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