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Université Paris 6 – Pierre et Marie Curie
Ecole Doctorale « Diversité du Vivant » (ED 0392)
THESE DE DOCTORAT
Présentée par
Mathieu PERNICE
Pour obtenir le grade de :
DOCTEUR de l’UNIVERSITE PARIS 6
en Biologie Intégrée des Invertébrés
Diversité bactérienne associée aux organes excréteurs des Nautiloides :
caractérisation du système symbiotique, implications évolutives et
physiologiques
à soutenir le 23 novembre 2006
Jury :
Mme Renata BOUCHER-RODONI, Chargé de Recherche, CNRS, Paris Directrice de thèse
Mme Françoise GAILL, Directeur de Recherche, CNRS, Paris Rapporteur
Mr Gilles BŒUF Professeur, Université Paris 6, Paris Rapporteur
Mme Sylvie DUFOUR, Directeur de Recherche, CNRS, Paris Examinateur
Mme Nicole DUBILIER, Associate Researcher, MPI MM (Brême, Allemagne) Examinateur
Mme Margaret MCFALL-NGAI, Professor, University of Wisconsin (Madison, USA) Examinateur
Remerciements
Cette thèse a été financée par une allocation de recherche du ministère de l’Education Nationale et de
la Recherche ainsi que par la fondation Max Planck au cours d’un fellowship « Marie Curie Training
Site for Marine Microbiology » de trois mois à l’Institut Max Planck pour la Microbiologie Marine de
Brême en Allemagne.
Merci aux rapporteurs, Françoise Gaill et Gilles Bœuf, ainsi qu’aux examinateurs, Sylvie Dufour,
Nicole Dubilier et Margaret McFall-Ngai de me faire l’honneur de juger mon travail et de m’avoir
accordé du temps.
Merci à Renata Boucher-Rodoni, ma directrice de thèse, pour m’avoir permis de travailler sur ce
modèle magnifique qu’est le Nautile, pour sa relation amicale, et pour m’avoir toujours accordé
beaucoup d’attention, de confiance et de liberté. Au cours de ces trois années, je crois avoir réussi à
apprivoiser cette liberté et c’est à mes yeux une des choses les plus importantes que j’ai apprise
pendant ma thèse.
Ce travail a été réalisé au département Milieux et Peuplements Aquatiques du Muséum National
d’Histoire Naturelle dirigé par Dominique Doumenc, et je tiens à le remercier pour m’avoir accueilli
et soutenu.
Merci à Guy Boucher et Sylvie Dufour, respectivement directeur et sous directrice de l’unité de
recherche « Biologie des Organismes Marins et Ecosystèmes» (UMR 5178), pour les moyens mis à ma
disposition ainsi que pour leurs précieux conseils et leurs directions, parfois bien au-delà du cadre
technique.
Merci à tous les membres du BOME pour l’ambiance de travail agréable que vous avez contribué à
créer, pour tous les échanges scientifiques fructueux et pour toutes les discussions professionnelles ou
non que nous avons eues. Merci donc à Laure, pour ton efficacité, ta disponibilité et ton soutien moral
(ainsi que tes interludes scientifiques…). Merci à Isabelle pour ta gentillesse, ta connaissance des
cultures cellulaires et pour avoir pris le temps de corriger l’introduction et la discussion de cette
thèse. Merci à Madeleine pour ton aide technique indispensable et tes conseils avisés en histologie.
Merci à Aude et Sébastien pour votre disponibilité et vos recettes qui nous régalent à chaque point
manip… Merci à Bernard, Pierre, Rachid, Raymond pour vos discussions (scientifiques ou non)
animées du déjeuner. Merci à Françoise et Claude pour me tenir au courant des nouvelles du sud de
la Corse. Merci à Nadia, Marie-Paule, Drissia, Alain et Véronique pour votre aide. Merci à vous tous
qui avez fait de ces trois ans passés au BOME une si belle expérience.
Merci aux stagiaires, Audrey, Aurélie, Julie qui m’ont aidé sur certaines expériences. En plus de
l’aide technique que vous m’avez apportée, vous m’avez appris qu’encadrer un stagiaire n’est pas une
mince affaire. Il faut trouver la distance juste, le niveau de confiance adapté et vous laisser exprimer
les idées et faits scientifiques avec vos mots à vous.
Merci à tous les membres de l’unité « Chimie et Biochimie des Substances Naturelles» (UMR 5154) et
en particulier à Sylvie Rebuffat, à Jean Peduzzi, à Delphine Destoumieux-Garzòn, à Séverine Zirah, à
Gérard Gastine (« LA voix du Muséum »), Sophie et Gaëlle pour m’avoir accueilli dans votre
laboratoire, m’avoir encadré, et aidé à percer un peu plus les mystères entourant les substances
bioactives des bactéries marines.
Many thanks to Nicole Dubilier who helped me during my fellowship in Bremen with her knowledge of
symbiosis and her efficiency to always find a solution to any problem. I learnt a lot in these three
months and I feel lucky for working in the “symbiosis team”. I would like to thank the people from the
MPI for their help and the great moments I had during these three months: Gaute Lavick (I will
always remember how to make a hole in a Nautilus shell!!!) and Marcel Kuypers for their help in
isotopic experiments, Sylke and Jörg for their wonderful technical assistance, Claudia, Christian,
Phyllis, Jill, Caroline for their talks at any time. Un grand merci à tous les francophones du MPI:
Karine, Florence, Julie, Anne-lyse, Sébastien (que je n’ai fait que croiser mais qui a toujours su rester
disponible à distance) pour leur accueil et leur gentillesse.
Merci à Olivier Gros pour ses compétences en microscopie électronique et pour m’avoir fait partager
sa grande connaissance de l’histologie et son goût pour les berliners !!!
Merci à Claude Courties, pour son accueil à Banyuls et ses compétences en cytomètrie en flux.
Merci à Marc Geze pour ses conseils avisés en microscopie et les bons moments passés au service de
Photobiologie du Muséum.
Merci à Jocelyne Favet du laboratoire de Bactériologie de Genève pour son amitié et son aide dans
la caractérisation physiologique des bactéries.
Merci à Raffaele Peduzzi pour ses deux formidables écoles d’été à Piora ainsi que pour son accueil
chaleureux à l’institut cantonal de microbiologie de Bellinzona en compagnie de Mauro, Antonella,
Anna-Rita et Michele.
Merci à Fabrice Colin, directeur du centre IRD de Nouméa ainsi qu’à Jean-Pascal Torreton, Olivier
Pringault, Robert Leborgne (merci de m’avoir fait un peu mieux comprendre l’océanographie du
lagon calédonien) et Jean-Lou Justine pour leur aide dans le bon déroulement des missions de récolte
en Nouvelle-Calédonie.
Merci à Pascale Joannot pour ta relation amicale et pour avoir notamment initié et soutenu le projet
de mission au Vanuatu.
A ce propos, je tiens à remercier le gouvernement de Nouvelle-Calédonie et le secrétariat permanent
pour le Pacifique pour leur soutien financier qui a été déterminant.
Merci à Alain Gerbault (le maître ès biologie du Nautile), Richard Farman, Caroline Nalo et toute
l’équipe du Darmad qui ont participé, à des titres divers, à la mise à disposition des spécimens de
Nautile et m’ont fait un peu plus découvrir les secrets du Pacifique.
Merci aux amis thésards avec qui j’ai partagé mes impressions et mes états d’âmes d’apprenti
chercheur et aussi beaucoup de moments agréables : Delphine Pichon pour ton soutien et tes conseils
technique avisés, Marc Eléaume (les soirées au labo vont bientôt nous manquer..) et Olivier Brosseau
pour nos discussions céphalopodes-échinodermes-phylogénie et toutes les autres, Marjolaine
Matabos, Denis Duplat, Jerôme Murienne pour leur amitié continue, Sveva Grigioni que je n’ai fait
que croiser mais qui a su initier avec Renata Boucher-Rodoni tout ce travail sur les symbioses
bactériennes chez les céphalopodes au sein du BOME.
Merci aux amis, Lio, Fab, Eric, Mathieu, Morgan, Julien (sans qui je ne serai jamais venu à bout des
600m de sac de nœuds.. ) et tous les autres…
Merci enfin à toute ma famille qui a cru en moi et m’a soutenu contre vents et marées,
Je dédie cette thèse à mon grand-père paternel qui s’est éclipsé peu avant que j’entame ce long
chemin et qui m’a beaucoup appris par sa rigueur et son sens artistique.
Merci à vous mes parents sans qui je n’aurais jamais rien fait et à qui je dois ma volonté, mon goût du
travail et de l’effort. Vous avez su éveiller mon désir de découvrir, d’observer et de comprendre la
mer très tôt en m’emmenant voguer sur la Méditerranée à bord du Fatu-Hiva. Merci d’avoir
accompagné mes doutes et mes enthousiasmes et d’avoir su être présents à tout moment.
Merci à toi Seb, pour la complicité qui nous unit, pour m’avoir supporté et soutenu pendant toutes ces
années, ton rôle dans le bon déroulement de cette thèse a été primordial. J’ai beaucoup de chance de
t’avoir pour frère.
Et à Fleur, pour avoir partagé tous ces moments avec moi et pour en partager encore…toujours
Table des matières
1
Table des matières Introduction générale................................................................................................. 9 Chapitre I – Contexte général de l’étude................................................................... 15 1 – « la Planète des bactéries » (Jay-Gould, 1996) ................................................... 17 1.1 – Une diversité métabolique indispensable......................................................... 17 1.2 – Un océan de bactéries…................................................................................... 18 2 – La symbiose......................................................................................................... 20 2.1 – Définition ......................................................................................................... 20 2.2 – « La symbiose comme source de nouveauté » (Maynard Smith, 1989) .......... 21 2.3 – Les symbioses bactériennes chez les céphalopodes......................................... 24 2.3.1 – Symbioses des organes lumineux.................................................................. 25 2.3.2 – Symbioses des glandes nidamentaires accessoires........................................ 25 Chapitre II – Le Nautile : un modèle à part.............................................................. 27 1 – Evolution et adaptations morphologiques ........................................................... 29 1.1 – Histoire évolutive des céphalopodes : « Nautilus, le survivant » (Boyle & Rodhouse, 2005)........................................................................................ 29 1.2 – Structure et principales adaptations morphogiques.......................................... 30 1.2.1 – Une coquille en guise de « flotteur »............................................................. 31 1.2.1.1 – Structure de la coquille............................................................................... 31 1.2.1.2 – Flottabilité ................................................................................................. 31 1.2.1.3 – Ajustements du contenu en liquide et gaz de la coquille ........................... 33 1.2.2 – Un organe de locomotion permettant une grande manoeuvrabilité .............. 34 1.2.3 – Des tentacules sans ventouses mais avec de nombreuses fonctions ............. 34 1.2.4 – Quatre branchies pour un métabolisme différent .......................................... 34 1.2.5 – Des yeux dépourvus de cristallin .................................................................. 35 2 – Ecologie et Biologie ............................................................................................ 35 2.1 – Distribution géographique et diversité spécifique............................................ 35 2.2 – Distribution bathymétrique, nourriture et prédation ........................................ 36 2.3 – Reproduction et développement....................................................................... 38 3 – Physiologie .......................................................................................................... 39 3.1 – « Un métabolisme à toute épreuve» (Boutilier et al, 1996) ............................. 39 3.2 – Digestion .......................................................................................................... 41 3.3 –Excrétion .......................................................................................................... 41 3.3.1 – Le système excréteur..................................................................................... 42 3.3.2 – Fonctionnement du système excréteur .......................................................... 43 3.3.3 – Une originalité physiologique, évolutive et…symbiotique ?........................ 43 Chapitre III – Identification, Localisation et Quantification des symbiotes bactériens chez deux espèces de Nautiles : implications physiologiques et évolutives .................................................................................................................. 45 1 – Objectifs généraux de l’étude ............................................................................. 47
Table des matières
2
2 – Origine des échantillons et campagnes .............................................................. 49 3 – Méthodes ............................................................................................................ 49 3.1 – Caractérisation de la diversité bactérienne....................................................... 51 3.1.1 – L’ARNr 16S comme marqueur moléculaire ................................................. 51 3.1.2 – Tests statistiques............................................................................................ 53 3.1.3 – Analyses phylogénétiques ............................................................................. 53 3.1.4 – Gènes fonctionnels ........................................................................................ 54 3.2 – Etude de la distribution des bactéries par la technique de CARD-FISH ......... 55 3.3 – Quantification des bactéries par cytomètrie en flux......................................... 57 3.4 – Isolement des bactéries en culture pure............................................................ 57 3.5 – Screening des souches à activité antimicrobienne et caractérisation des substances bioactives................................................................................................. 58 3.5.1 – Détection des activités antimicrobiennes ...................................................... 58 3.5.2 – Extraction, concentration et caractérisation des substances bioactives........ 60 3.6 – Etude du métabolisme du complexe symbiotique par la méthode d’incubations et analyses isotopiques ....................................................................... 62 3.7 – Co-culture des cellules de Nautile et bactéries associées................................. 63 4 - Résultats .............................................................................................................. 64 4.1 – Mise en évidence et caractérisation d’une double symbiose dans les organes excréteurs de N. macromphalus ................................................................................ 64 Article : Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of Nautilus macromphalus (Cephalopoda : Nautiloidea) ..................................................................................... 67 4.2 – Développement d’un modèle cellulaire de l’association N. macromphalus- bactérie ...................................................................................................................... 95 Article : Primary co-culture as a complementary approach to explore the diversity of bacterial symbionts in marine invertebrates : the example of Nautilus macromphalus (Cephalopoda : Nautiloidea) .............................................. 97 4.3 – Activité métabolique des symbiotes bactériens chez N. macromphalus.......... 106 4.3.1 – Recherche et séquençage de gènes fonctionnels codant pour des enzymes impliquées dans la nitrification et la dénitrification bactérienne .............................. 106 4.3.2 – Implication des symbiotes bactériens dans le métabolisme azoté................. 107 4.3.2.1 – Mesure de l’activité métabolique des symbiotes bactériens dans un milieu enrichi en nitrates (NO3
-) ............................................................................... 107 4.3.2.2 – Mesure de l’activité métabolique des symbiotes bactériens dans un milieu enrichi en ammonium (NH4
+) et en nitrates (NO3-) ....................................... 109
4.4 – Etude comparative de la diversité bactérienne associée à N. pompilius sur deux sites de collecte : spécificité de la symbiose et influence des facteurs biogéographiques ...................................................................................................... 111 4.4.1 – Influence des facteurs biogéographiques sur la caractérisation moléculaire des symbiotes de N. pompilius ................................................................................ 112 4.4.2 – Les symbiotes bactériens présents chez N. pompilius aux Philippines et au Vanuatu possèdent la même distribution spatiale ................................................ 113
Table des matières
3
4.5 – Activités antimicrobiennes des souches isolées de N. pompilius (Philippines): rôle potentiel dans la colonisation et l’écologie microbienne des organes symbiotiques ............................................................................................................. 115 Article ‘Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial agents in the excretory organs of Nautilus pompilius (Cephalopoda, Nautiloidea) ................ 117 4.6 – Caractérisation des substances bioactives responsables de l’activité antimicrobienne des vibrios isolées de N. pompilius ................................................ 142 4.6.1 – Mise en évidence de la présence de plusieurs fractions avec une activité antimicrobienne par purification sur HPLC .............................................................. 142 4.6.2 – Les substances bioactives responsables de l’activité antimicrobienne des vibrios ne sont pas de nature peptidique ................................................................... 143 Chapitre IV – Discussion générale, conclusions et perspectives .............................. 147 1 – Diversité bactérienne associée à différentes espèces de Nautiloides .................. 149 2 – Evolution des symbioses des Nautiloides ........................................................... 150 3 – Transmission des symbiotes bactériens............................................................... 152 4 – Eco-physiologie du système symbiotique ........................................................... 155 5 – Synthèse .............................................................................................................. 158 Bibliographie............................................................................................................. 161 Annexes..................................................................................................................... 183 Liste des encadrés et planches photo Encadré 1 : Le cycle de l’azote en milieu océanique ................................................ 19 Encadré 2 : Exemples d’interactions symbiotiques liées à la fixation d’azote ......... 23 Encadré 3 : Rôle de l’azote dans le contrôle de la flottabilité chez les céphalopodes ............................................................................................................. 32 Planche photo 1 (Nautile).......................................................................................... 40 Encadré 4 : Diversité des bactéries ........................................................................... 52 Encadré 5 : Les interactions microbiennes, source de substances bioactives ........... 59 Planche photo 2 (De Nouméa à Brême…)................................................................ 193 Planche photo 3 (A la pêche aux nautiles au milieu de Pacifique…) ....................... 194
Table des matières
4
Table of contents
5
Table of contents General introduction.................................................................................................. 9 Chapter I – General background of the study ........................................................... 15 1 –“Planet of the bacteria” (Jay-Gould, 1996) .......................................................... 17 1.1 – An essential metabolic diversity ...................................................................... 17 1.2 – An ocean of bacteria…..................................................................................... 18 2 – Symbiosis ............................................................................................................ 20 2.1 – Definition ......................................................................................................... 20 2.2 – “Generating novelty by symbiosis” (Maynard-Smith, 1989)........................... 21 2.3 – Bacterial symbiosis in Cephalopods ................................................................ 24 2.3.1 – Symbioses in light organs ............................................................................. 25 2.3.2 – Symbioses in accessory nidamental glands................................................... 25 Chapter II – Nautilus : an original model................................................................. 27 1 – Morphological evolution and adaptations ........................................................... 29 1.1 – Evolution of Cephalopods : « nautilus, the survivor » (Boyle & Rodhouse, 2005)........................................................................................ 29 1.2 – Structure and main morphological adaptations................................................ 30 1.2.1 – A shell for buoyancy ..................................................................................... 31 1.2.1.1 – Shell structure............................................................................................. 31 1.2.1.2 – Buoyancy ................................................................................................... 31 1.2.1.3 – Adjustments of liquid and gas content in the shell..................................... 33 1.2.2 – A locomotion organ allowing important manoeuvrability............................ 34 1.2.3 – Tentacles without suckers but with several functions................................... 34 1.2.4 – Four gills for a different metabolism............................................................. 34 1.2.5 – Eyes without lens .......................................................................................... 35 2 – Ecology and Biology........................................................................................... 35 2.1 – Geographical distribution and specific diversity.............................................. 35 2.2 – Bathymetric distribution, food and predation .................................................. 36 2.3 – Reproduction and development........................................................................ 38 3 – Physiology........................................................................................................... 39 3.1 – “Nautilus, the art of metabolic maintenance” (Boutilier, 1996) ...................... 39 3.2 – Digestion .......................................................................................................... 41 3.3 –Excretion .......................................................................................................... 41 3.3.1 – The excretory system .................................................................................... 42 3.3.2 – How the excretory system works ................................................................. 43 3.3.3 – A physiological, evolutionary and… symbiotic originality? ........................ 43 Chapter III – Identification, Localisation and Quantification of bacterial symbionts in two nautilus species : physiological and evolutionary: implications... 45 1 – General Objectives of the study ......................................................................... 47
Table of contents
6
2 – Origin of the samples and field trips .................................................................. 49 3 – Methods .............................................................................................................. 49 3.1 – Characterisation of bacterial diversity.............................................................. 51 3.1.1 – 16S rRNA as a molecular marker ................................................................. 51 3.1.2 – Statistical tests ............................................................................................... 53 3.1.3 –Phylogenetic analyses .................................................................................... 53 3.1.4 – Functional genes............................................................................................ 54 3.2 –Study of bacteria distribution by CARD-FISH................................................. 55 3.3 – Bacteria quantification by flow cytometry....................................................... 57 3.4 – Bacteria isolation on culture media.................................................................. 57 3.5 – Screening of antimicrobial active strains and characterisation of bioactive substances.................................................................................................................. 58 3.5.1 – Detection of antimicrobial activities ............................................................. 58 3.5. 2 – Extraction, concentration and characterisation of bioactive substances ..... 60 3.6 – Study of the symbiotic complex metabolism by organ incubation and isotopic analyses........................................................................................................ 62 3.7 – Co-culture of nautilus cells and associated bacteria......................................... 63 4 - Results ................................................................................................................. 64 4.1 – Characterisation of a dual symbiosis in the excretory organs of N. macromphalus ...................................................................................................... Article : Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of N. macromphalus (Cephalopoda : Nautiloidea) ..................................................................................... 67 4.2 – Development of a cellular model of the association N. macromphalus-bacteria ........................................................................................ 95 Article : Primary co-culture as a complementary approach to explore the diversity of bacterial symbionts in marine invertebrates : the example of Nautilus macromphalus (Cephalopoda : Nautiloidea) .............................................. 97 4.3 – Metabolic activity of bacterial symbionts in N. macromphalus....................... 106 4.3.1 – Detection and sequencing of functional genes involved in Nitrogen metabolism ................................................................................................................ 106 4.3.2 – Implication of bacterial symbionts in Nitrogen metabolism......................... 107 4.3.2.1 – Measure of bacterial symbionts metabolic activity in a nitrate(NO3
-) enriched medium....................................................................................................... 107 4.3.2.2 – Measure of bacterial symbionts metabolic activity in an ammonia (NH4
+) and nitrate(NO3
-) enriched medium ......................................................................... 109 4.4 – Comparative study of the bacterial diversity associated to N. pompilius from two different locations: specificity of symbiosis and influence of biogeographical factors ........................................................................................................................ 111 4.4.1 – Influence of biogeographical factors on the molecular characterisation of N. pompilius symbionts........................................................................................ 112 4.4.2 – Bacterial symbionts in N. pompilius from Philippines and from Vanuatu have the same distribution......................................................................................... 113 4.5 – Antimicrobial activities of strains isolated from N. pompilius (Philippines): potential role in colonisation and microbial ecology of symbiotic organs ............... 115
Table of contents
7
Article ‘Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial agents in the excretory organs of Nautilus pompilius (Cephalopoda, Nautiloidea) ................ 117 4.6 – Characterisation of bioactive substances responsible of antimicrobial activity of vibrios isolated from N. pompilius........................................................................ 142 4.6.1 – HPLC purification shows that several fractions have an antimicrobial activity....................................................................................................................... 142 4.6.2 – The bioactive substances responsible for vibrios antimicrobial activity are not peptides ............................................................................................................... 143 Chapitre IV – General discussion, conclusions and perspectives ............................. 147 1 – Bacterial diversity among various nautilus species ............................................ 149 2 – Evolution of symbiosis in Nautiloids .................................................................. 150 3 – Symbiosis transmission to the next generation .................................................. 152 4 – Ecophysiology of the symbiotic system.............................................................. 155 5 – Conclusion........................................................................................................... 158 Bibliography.............................................................................................................. 161 Appendix ................................................................................................................... 183 List of boxes Box 1 : Nitrogen cycle in Ocean ............................................................................... 19 Box 2 : Symbiotic interactions involved in Nitrogen fixation .................................. 23 Box 3 : Role of Nitrogen in the control of cephalopods buoyancy........................... 32 Picture box 1.............................................................................................................. 40 Box 4 : Diversity of bacteria ..................................................................................... 52 Box 5 : Microbial interactions as a source of bioactive compounds......................... 59 Picture box 2.............................................................................................................. 193 Picture box 3.............................................................................................................. 194
Table of contents
8
Introduction générale
9
Introduction générale
Introduction générale
10
Introduction générale
11
Introduction générale
Comme l’a souligné Stephen Jay Gould (1996), nous vivons à l’âge des bactéries. Elles
furent les premiers organismes vivants sur notre planète, s’installent partout où la vie est
possible, plus nombreuses que n’importe quels autres types d’organismes et constituant
probablement le composant le plus important de la biomasse sur Terre (Prescott et al, 2003).
L’influence des micro-organismes sur le monde vivant s’exerce de manière indirecte par la
métabolisation des nutriments présents dans l’environnement (Azam, 2001) mais aussi, de
manière plus directe, par la maintenance d’étroites associations avec les organismes au cours
des générations (McFall-Ngai, 1998). En effet, le fourmillement de vie bactérienne présent
dans tous les compartiments de la biosphère est une contrainte d’adaptation importante pour
les autres organismes (McFall-Ngai, 2002) et les interactions symbiotiques avec les bactéries
semblent avoir joué un rôle capital dans l’évolution de la vie (Maynard Smith & Szathmáry,
1999) en étant, notamment, à l’origine de la cellule eucaryote (Margulis, 1993).
Au cours des deux dernières décennies, l’étude des symbioses bactériennes a connu un
essor rapide et a permis la caractérisation de nouvelles associations symbiotiques au sein de
nombreux phylums (Douglas, 1994; Dale et al, 2001 ; Kushmaro et al, 1996; Graf, 1999 ;
Hansen & Olafson, 1999, pour revue voir McFall-Ngai, 2002). Cependant, aujourd’hui
encore, il semble difficile de préciser la fonction d’un grand nombre de ces associations ainsi
que leur rôle exact dans l’évolution des organismes vivants. A cet égard, l’étude des lignées
animales d’origine ancestrale peut fournir des informations importantes sur l’influence des
symbioses bactériennes dans des adaptations évolutives majeures. Dans ce contexte, les
associations bactériennes abritées au sein des organes excréteurs des Nautiloides (Schipp et al,
1985, 1990) s’avèrent être d’un intérêt tout particulier pour différentes raisons : d’un point de
vue évolutif, ces animaux sont les représentants de la lignée la plus ancienne des
Céphalopodes dont l’origine remonte à près de 500 millions d’années (Ward, 1987) ; et d’un
point de vue physiologique, le système excréteur des Nautiles présente des caractéristiques
uniques au sein des Céphalopodes qui semblent être le fruit d’adaptations majeures à leur
mode de vie (Denton, 1974 ; Martin, 1983 ; Schipp et al, 1985). Ainsi, l’étude des interactions
symbiotiques dans les organes excréteurs des Nautiloides peut permettre de mieux
comprendre l’influence des bactéries dans l’incroyable « succès évolutif » de cette lignée.
L’analyse du rôle des bactéries dans l’adaptation des organismes concerne des domaines
scientifiques et techniques variés (évolution, écologie, physiologie, biologie cellulaire,
Introduction générale
12
biologie moléculaire…) et doit donc bénéficier d’approches pluridisciplinaires (McFall-Ngai,
2002). Jusqu’ici les symbiotes bactériens hébergés par les organes excréteurs des Nautiles
n’avaient été l’objet que d’observations en microscopie électronique (Schipp et al, 1990). Le
premier objectif de cette étude a donc été la caractérisation phylogénétique de la diversité
bactérienne associée à N. macromphalus afin d’apporter de nouvelles informations concernant
la spécificité et l’histoire évolutive de ce système symbiotique.
Le second objectif se place dans un contexte écologique et a concerné l’analyse de la
répartition spatiale des symbiotes bactériens à l’intérieur de l’hôte et de leur contribution à sa
physiologie. Cet objectif a été mené en deux temps avec tout d’abord, l’exploration de la
distribution spatiale des bactéries in situ afin de tester l’hypothèse d’une structuration des
populations symbiotiques en relation avec l’organisation fonctionnelle de l’organe hôte. Puis
dans un deuxième temps, l’étude s’est focalisée sur les activités métaboliques des populations
bactériennes afin d’évaluer l’implication des symbiotes dans la physiologie du Nautile. La
gestion des déchets azotés semblant être une adaptation majeure des céphalopodes à leur
mode de vie (Denton, 1974 ; Boucher-Rodoni & Mangold, 1994), l’étude physiologique s’est
principalement concentrée sur le métabolisme azoté des symbiotes bactériens.
Les travaux menés au cours de cette thèse ont porté sur une espèce endémique de
Nouvelle-Calédonie, Nautilus macromphalus, et une espèce cosmopolite, Nautilus pompilius,
dont la distribution couvre la majeure partie de la zone Indo-Pacifique (depuis la mer
d’Andaman jusqu’aux Iles Fidji ; Norman, 2000). Ces deux espèces abritent des bactéries
symbiotiques dans leur système excréteur (Schipp et al, 1990) ce qui a permis de conduire des
études comparatives et d’analyser les facteurs biogéographiques sur ces symbioses.
Le troisième objectif de cette thèse a donc ciblé la description comparative de la diversité
bactérienne associée à ces deux espèces de Nautile afin de déceler des différences potentielles
au sein des populations de bactéries. Dans le cas d’une transmission environnementale, la
sélection d’une bactérie est généralement contrôlée par les barrières imposées par le système
immunitaire de l’hôte mais aussi plus ponctuellement par des phénomènes de compétition
entre bactéries (Prescott et al, 2003; Bultman et al, 1998). Dans le but de déterminer si la
présence de certaines bactéries pouvait être liée à des phénomènes de compétition au sein du
système symbiotique, le potentiel antimicrobien des souches bactériennes associées aux deux
espèces de Nautile a été évalué et les substances bioactives produites, caractérisées à l’aide de
différentes méthodes biochimiques.
Enfin, un quatrième objectif a consisté à développer un protocole de mise en culture et
maintenance des bactéries symbiotiques en présence des cellules d’appendices péricardiques
Introduction générale
13
de N. macromphalus. Dans l’avenir, un tel outil pourrait s’avérer particulièrement intéressant
dans la perspective d’étudier les processus complexes qui régissent la reconnaissance
hôte/symbiotes au niveau cellulaire.
Le premier chapitre de ce manuscrit présente le contexte général de l’étude c'est-à-dire
d’une part l’omniprésence des bactéries et l’importance de leur rôle dans les grands cycles
biogéochimiques puis d’autre part, la symbiose bactérienne en tant que facteur d’adaptation et
son importance dans le milieu marin et plus particulièrement chez les céphalopodes.
Le second chapitre se concentre sur le Nautile et expose l’originalité de ce modèle
biologique en tant qu’hôte du fait de ses caractéristiques évolutives, écologiques et
physiologiques.
Le troisième chapitre présente les objectifs du travail, l’approche méthodologique utilisée
et les manuscrits correspondants aux résultats obtenus.
Le chapitre quatre discute les principaux résultats concernant la diversité, l’évolution, la
transmission et le potentiel métabolique des bactéries symbiotiques associées aux Nautiloides
et propose des perspectives de recherche pour les travaux futurs.
Introduction générale
14
Chapitre I : Contexte général de l’étude
15
Chapitre I :
Contexte général de l’étude
Chapitre I : Contexte général de l’étude
16
Chapitre I : Contexte général de l’étude
17
Chapitre I – Contexte général de l’étude
1. “La planète des bactéries” (Jay Gould, 1996) Comme le décrit S. Jay Gould (1996) notre planète a toujours été dans « l'Âge des
Bactéries » depuis que les premiers fossiles -des bactéries bien
sûr- furent ensevelis dans des roches stratifiées appelées
stromatolithes, il y a plus de 3 milliards d'années (Figure 1). Les
bactéries ont été et sont toujours les formes dominantes de vie sur
la Terre. Notre faiblesse à saisir ce fait biologique pourtant
évident provient en grande partie de leur taille microscopique
(Thiomargarita namibiensis, la plus grande bactérie du monde
atteint la taille maximale de 750 µm). Pourtant, les bactéries sont
présentes dans toute la biosphère : des hautes couches de
l'atmosphère aux plus grandes profondeurs de l'océan et
démontrent une incroyable diversité (voir Chapitre III.3, Encadré 4, page 52).
1.1 Une diversité métabolique indispensable
Ce sont les réactions de production d’énergie qui illustrent le mieux l’adaptabilité
extraordinaire des bactéries (Neidhardt et al, 1990). En effet, au cours de leur croissance et de
leur métabolisme, les micro-organismes peuvent produire de la matière organique par
réduction du carbone inorganique (autotrophie) ou se nourrir de constituants organiques
préexistants d'origine animale ou végétale (hétérotrophie) (Tableau 1). Sources de carbone
Autotrophes CO2 principale source de carbone biosynthétique
Hétérotrophes Molécules organiques préformées provenant d’autres organismes
Sources d’énergie Phototrophes Lumière
Chimiotrophes Oxydation de composés organiques et inorganiques
Sources d’éectrons
Lithotrophes Molécules inorganiques réduites
Organotrophes Molécules organiques
Elles peuvent de plus capturer l’énergie radiante du soleil (phototrophie) ou oxyder des
molécules organiques (organotrophie) pour libérer de l’énergie et disposent de deux sources
Tableau 1 : Source de carbone, d’énergie et d’électrons existants chez les bactéries (modifié de Prescott et al, 2003)
Figure 1 : Les stromatolithes de Shark Bay en Australie
Chapitre I : Contexte général de l’étude
18
d’électrons potentielles: les molécules inorganiques réduites (lithotrophie) ou l’oxydation de
composés organiques (organotrophie). Par leur incroyable potentiel métabolique, les bactéries
procèdent à un formidable recyclage biogéochimique des nutriments auquel participent tous
les éléments cruciaux à la vie. Ainsi, grâce à l’intervention des bactéries, le carbone, le soufre,
l’azote, le phosphore, le fer et le manganèse reviennent à une forme utilisable par les
organismes supérieurs (Margulis & Sagan, 1997). Tous les cycles biogéochimiques sont reliés
entre eux et les transformations métaboliques de ces nutriments ont des impacts au niveau
planétaire (Figure 2).
1.2 Un océan de bactéries…
En occupant plus de 70% de la surface du globe, les écosystèmes marins représentent une
partie prépondérante de la biosphère au sein de laquelle l'omniprésence et le rôle de bactéries
n’ont été documentés que depuis une trentaine d’années (Jay Gould, 1996). Pourtant, de toute
évidence, leur biomasse y est très importante (plus de 90% des surfaces biologiques de la mer
des Sargasses seraient habitées par des bactéries ; Fuhrman et al, 1992) et elles y influencent
profondément les grands cycles biogéochimique du carbone, du soufre et notamment celui de
l’azote qui sera traité plus particulièrement au cours de ce travail (Kettle & Andreae, 2000 ;
Kuypers et al, 2003; Wingenter et al, 2004; Wagner & Biebl, 2006 ; voir Encadré 1, page 19 ).
Figure 2 : Une vue cosmique du recyclage des minéraux chez les micro-organismes, les organismes supérieurs et le monde chimique non-vivant (extrait de Prescott et al, 2003).
Chapitre I : Contexte général de l’étude
19
Encadré 1 : Le cycle de l’azote en milieu océanique La fixation de l’azote gazeux, ainsi que la disponibilité des composés azotés (nitrate,
nitrite et ammonium) et leur recyclage par les deux grands processus biochimiques intervenant dans le cycle de l’azote (nitrification et dénitrification, Figure 3) limite la production primaire dans de nombreuses régions océaniques du monde (Fallowski, 1997).
Lors du processus de dénitrification, qui est considéré comme la forme prévalente de perte des composés azotés « fixables » en milieu marin (Galloway et al, 1995) le nitrate est utilisé par des bactéries hétérotrophes dénitrifiantes comme oxydant dans la respiration anaérobie pour être réduit en azote gazeux dans un processus à étapes multiples, auquel participent quatre enzymes : la nitrate réductase, la nitrite réductase, la réductase de l’oxide nitrique et la réductase de l’oxide nitreux.
NO3
- NO2- NO N2O N2
Cependant, des intermédiaires transitoires à la chaîne de réactions comme le NO2
- (nitrite) ou le N2O (oxyde nitreux) peuvent aussi s’accumuler (Albrecht et al, 1997 ; Hunt et al, 2003). De plus, deux types de nitrites réductases peuvent catalyser la formation de NO chez les bactéries. L’une est codée par le gène nirS et contient les cytochrome oxydases c et d1 (par exemple chez Pseudomonas aeruginosa), l’autre est codée par le gène nirK et s’identifie à une protéine à cuivre (par exemple chez Alcaligenes).
Le processus de nitrification se déroule, quant à lui, en conditions aérobies, et repose sur
l’activité d’au moins deux genres différents de bactéries chimiolithoautotrophes. Dans un premier temps, l’ion ammonium (NH4
+) est oxydé en nitrite (NO2-) par des bactéries
nitrifiantes du genre Nitrosomonas et Nitrosococcus. L’oxydation du nitrite en nitrate (NO3-)
dépend de l’activité d’autres bactéries du genre Nitrobacter ou des micro-organismes chimiolithoautotrophes apparentés. Lorsque les deux genres travaillent ensemble, l’ammonium (NH4
+) est ainsi directement oxydé en nitrate (NO3-).
La découverte récente de bactéries apparentées aux Planctomycetes combinant nitrification et dénitrification anaérobie, et oxydant ainsi l’ion ammonium en N2O et N2 à de faibles teneurs en oxygène (réaction connue sous le nom d’anammox ; Strous et al, 1999 ; Thamdrup & Dalsgaard, 2002) a ouvert de nouvelles perspectives en montrant que ce processus pouvait être à l’origine de près de 40% des pertes de matière azotée dans certaines zones océaniques (Kuypers et al, 2003). Ainsi, au fur et à mesure que s’étoffent nos connaissances du cycle de l’azote, il apparaît que le cycle simple des anciens manuels ne constitue plus une représentation précise des processus biogéochimiques naturels.
Nitrate réductase Nitrite réductase
Réductase de l’oxide nitrique
Réductase de l’oxide nitreux
Figure 3 : Cycle d’azote en milieu océanique (d’après M. Kuypers).
Chapitre I : Contexte général de l’étude
20
Un exemple frappant du rôle prépondérant de cette « biosphère cachée » (Kerr, 1997)
reste la découverte, à la fin des années 1970, à plusieurs milliers de mètres sous les océans
dans l’obscurité la plus totale et sans aucun apport de matière organique, de communautés
animales d’une incroyable densité associées aux sources hydrothermales (Lonsdale, 1977). En
effet, ces écosystèmes sont basés sur une production primaire assurée par des bactéries
chimiosynthétiques qui vivent libres ou en symbiose avec les organismes et qui sont capables
d’exploiter l’énergie chimique contenue dans des composés réduits des fluides hydrothermaux
pour assurer la fixation du carbone (Felbeck et al, 1981 ; pour revue voir Duperron, 2006).
Les sites hydrothermaux forment ainsi un exemple spectaculaire de l’importance que peuvent
avoir les bactéries, et leurs associations avec les organismes supérieurs, dans les écosystèmes
océaniques. Toutefois, on sait aujourd’hui que de telles associations symbiotiques sont en fait
très répandues dans le milieu naturel et ont joué un rôle clé à certains moments de l’évolution,
en modifiant profondément la structure et le « destin de l’arbre de la vie » (Combes, 2001).
2. La symbiose 2.1 Définition
En 1879, l’auteur du terme symbiose, l’Allemand Anton De Bary définit sous ce vocable
toute forme d’association permanente entre deux organismes distincts durant au moins une
partie de leur cycle vital (De Bary, 1879). Cette définition a longtemps été discutée car elle
évoque en fait un contact physique durable entre deux organismes et ne donne aucune
information sur le type d’interaction existant et les bénéfices qui lui sont associés. Les
interactions symbiotiques peuvent ainsi être positives (elles n’engagent alors que des
bénéfices : mutualisme, protocoopération et commensalisme) ou négatives (elles engagent
alors des bénéfices mais aussi des coûts : prédation, parasitisme, amensalisme et compétition)
(Figure 4).
La fantastique diversité du vivant fait que dès que des espèces différentes s’associent, la
discrimination entre les coûts et les bénéfices devient complexe, le bénéfice observé étant un
bénéfice net, bilan entre les bénéfices bruts et les coûts bruts (Smith, 1992). Ainsi, la
distinction entre les différents types d’interactions peut devenir un véritable casse tête
(Combes, 2001), ce qui conduit généralement les auteurs à utiliser le terme symbiose dans son
sens original, les partenaires étant discriminés par leur taille, le plus « grand » étant l’hôte et
le plus « petit » le symbiote (Smith & Douglas, 1987). Au cours de ce travail, les termes
d’hôte et de symbiote seront employés dans ce contexte général.
Chapitre I : Contexte général de l’étude
21
Pour s'associer à l'hôte, les symbiotes disposent de deux modes de transmission :
• vertical : le transfert de l'hôte à sa progéniture se fait par héritage parental
• horizontal : la transmission se fait par réinfection à chaque génération par le milieu
environnant.
Le mécanisme de transmission verticale se retrouve fréquemment dans les interactions de type
mutualistes mais reste assez rare chez les parasites (Combes, 1995).
2.2 La symbiose comme source de nouveauté (Maynard Smith, 1989)
Comme le souligne J. Maynard Smith (1989), en autorisant la réunion de deux
informations génétiques en provenance de deux sources indépendantes, la symbiose permet
non seulement de pallier à d’éventuelles carences mais aussi de générer de la nouveauté. En
effet, dans une association symbiotique, quelle que soit la nature des interactions, les
informations génétiques de deux espèces peuvent interagir de différentes manières et conduire
à des transformations importantes:
Figure 4 : Les différents types d’interactions symbiotiques. Caractéristiques fondamentales des interactions positives (+) et négatives (-) qui existent entre différents organismes (modifié de Prescott et al, 2003).
Chapitre I : Contexte général de l’étude
22
• Croisement d’information : les informations génétiques des deux espèces participent à
des degrés divers à la réalisation du phénotype de l’autre, en étendant son expression
dans le phénotype du partenaire, c’est ce que R. Dawkins a appelé le « phénotype
étendu » (Dawkins, 1982). Ce type d’interactions peut donner lieu à des exemples
spectaculaires dans la nature comme la formation des nodules racinaires chez les
légumineuses (voir Encadré 2, page 23)
• Echange d’information : les informations génétiques des deux espèces interagissent
directement en échangeant des séquences d’ADN. Un exemple marquant généré par ce
type d’interactions est l’association symbiotique entre le mollusque Elysia chlorotica
et les chloroplastes de l’algue Vaucheria litorea qui sont acquis par le mollusque au
cours de ses repas (Rumpho et al, 2000). Malgré l'absence de leur habitat algal, les
chloroplastes peuvent continuer à photosynthétiser dans la limace de mer pendant près
de 10 mois. En effet, un transfert génétique semble avoir permis au mollusque
d’acquérir des gènes issus de l’algue qui sont essentiels au maintien de l’activité des
chloroplastes (Pennisi, 2006).
La transformation la plus spectaculaire initiée par une association symbiotique est sans
conteste celle de la cellule eucaryote. En effet, les mitochondries et les chloroplastes ne sont
en fait rien d’autres que des bactéries parfaitement intégrées à la cellule eucaryote (Figure 5 ;
Margulis, 1991).
A B
Figure 5, A : Schéma illustrant l’évolution des trois grands domaines du vivant. B : L’origine de la cellule eucaryote selon la théorie des endosymbioses successives développée par L. Margulis (extrait de Lopez-Garcia &Moreira, 1999).
Chapitre I : Contexte général de l’étude
23
Encadré 2 : Exemples d’interactions symbiotiques liées à la fixation d’azote
L’azote est un des quatre constituants essentiels de la matière vivante et aucun eucaryote ne possède les gènes de la nitrogénase permettant de le fixer sous forme gazeuse (N2) pour le transformer en ammoniac (NH3), ultérieurement incorporable aux protéines (Combes, 1995). La symbiose Légumineuse-Rhizobium
Lorsque la racine d’une légumineuse en grandissant rencontre les bactéries Rhizobiums, elle les incorpore dans des nodules racinaires (Figure 6) et c’est là que se fait ensuite la fixation de l’azote (Pagan et al, 1975). Dans cette association symbiotique des Légumineuses avec les Rhizobiums, c’est un ensemble d’enzymes, codées par une vingtaine de gènes qui permet aux bactéries fixatrices d’azote de procéder à cette réaction (Orme-Johnson, 1985).
Cet exemple illustre remarquablement le croisement d’informations qui peut être généré par une symbiose (concept du « phénotype étendu » de Dawkins, 1982 ; voir page précédente). Il y a non seulement échange de produits, mais il s’établit également un dialogue entre les partenaires, sous la forme d’une série de signaux moléculaires. Brièvement, les cellules pilifères des racines de légumineuses émettent des substances chimiques de reconnaissance (flavonoïdes) qui attirent les bactéries et provoquent chez elles l’expression d’une série de gènes (nod) (Broughton et al, 2001). Ces gènes codent pour des protéines qui sont reconnues par les cellules pilifères des légumineuses et provoquent alors une série de changements dans la racine hôte permettant la formation du nodule racinaire. Ce type d’associations symbiotiques existe chez d’autres plantes supérieures avec des actinomycètes (Frankia) et des cyanobactéries (Anoeboena). La symbiose Termite-bactérie
Les termites ont un régime alimentaire particulièrement pauvre en azote (seulement 0,05% du bol alimentaire chez certaines espèces), qui a mené beaucoup d'espèces à acquérir une microflore bactérienne importante dans leur tube digestif (Figure 7) afin notamment d’augmenter leur disponibilité en azote (Lilburn et al, 2001). L’interaction symbiotique avec ces bactéries (spirochètes et bacteroides, notamment) permet non seulement le recyclage des produits azotés liés à l’excrétion (acide urique) (Potrikus & Breznak, 1981) mais aussi l'acquisition d’azote nouveau par la fixation de N2. Cela pourrait ainsi fournir plus de 60 % des besoins azotés des termites (Tayasu et al, 1994). Des interactions bactériennes similaires ont été mises en évidence chez les blattes (Cruden & Markovetz, 1987).
A B
BA
Figure 6, A : Nodules racinaires chez Trifolium subterraneum ; B : l’intérieur d’un nodule vu en microscopie électronique montrant les Rhizobiums (15000X). (Photo : Megen Long)
Figure 7, A : Observations d’une coupe transversale de panse de Reticulitermes flavipes ; B : Observations des spirochètes symbiotiques en microscopie électronique (extrait de Breznak, & Pankratz, 1977 ; Graber et al, 2004).
Chapitre I : Contexte général de l’étude
24
Cette hypothèse, au départ très audacieuse, a été démontrée par la biologiste Lynn Margulis
qui grâce à l’analyse comparée de l’ADN des bactéries et de celui des organites de la cellule
eucaryote a accumulé les preuves définitives que nos cellules sont le fruit d’associations
symbiotiques successives dont on pense que la première remonte au moins à un milliard
d’années (Margulis, 1993). Ainsi, l’association symbiotique d’une archaebactérie et d’une
spirochète est à l’origine du premier organisme eucaryote vivant (LECA pour Last Eukaryotic
Common Ancestor), puis l’acquisition successive d’une alpha protéobactérie et d’une
cyanobactérie par symbiose a respectivement généré la mitochondrie (chez les animaux et les
végétaux) et le chloroplaste (chez les végétaux) (Margulis et al, 2006).
La cellule qui a donné naissance à l’arbre majeur de l’évolution, règne animal et végétal
confondus, est donc issue de la rencontre et du mariage de plusieurs être vivants, au départ
indépendants les uns des autres (Combes, 1995). Depuis, la symbiose a joué un rôle
prépondérant dans l’évolution de nombreux taxons et selon Price (1991), le nombre d’espèces
issues de symbioses constituerait près de 54% de la diversité actuelle.
2.3 Les symbioses bactériennes chez les céphalopodes
Depuis son origine, il y a près d’un milliard d’années, le processus d'évolution des
métazoaires a eu lieu en grande partie dans la mer, un environnement aquatique grouillant de
bactéries qui ont baigné les tissus des organismes vivants les plus précoces. Cet
environnement microbien a été une contrainte d’adaptation importante au cours de l’évolution
(McFall-Ngai, 2002) et il n’est donc pas surprenant qu’on y trouve d’innombrables exemples
d’associations animal-bactéries (Kushmaro et al, 1996 ; Dubilier et al, 2001, Webster et al,
2001 ; Kimura et al, 2003 ; Rajan, 2005). La première de ces associations symbiotiques est
très certainement apparue chez les invertébrés marins qui possèdent la plus importante
diversité taxonomique dans la biosphère actuelle et probablement la plus grande variété de
symbioses animal-bactérie (McFall-Ngai & Ruby, 2000).
Parmi les exemples d’association invertébrés marins-bactérie, la présence de symbiotes
bactériens chez les céphalopodes est connue depuis longtemps. En effet, les travaux
précurseurs de Zirpolo (1917) chez Sepia, Sepiola et Rondeletiola ont mis en évidence deux
organes symbiotiques qui ont fait ensuite l'objet de nombreux travaux : les organes lumineux
et les glandes nidamentaires accessoires.
Chapitre I : Contexte général de l’étude
25
2.3.1 Symbioses des organes lumineux
La présence des bactéries Vibrio dans les organes lumineux de certaines espèces de
Sepiolidés et de Loliginidés, ainsi que leur importance dans le
comportement anti-prédateur de ces céphalopodes sont
aujourd'hui communément admises et, depuis près de vingt ans,
l’association symbiotique Euprymna scolopes-Vibrio fischeri est
la plus largement étudiée (Wei & Young, 1989 ; Montgomery &
Mc Fall-Ngai, 1994 ; Cloud-Hansen et al, 2006) (Figure 8).
L’émission de peptidoglycanes par les vibrios présentes dans
l’environnement permet leur reconnaissance par la sépiole dès son
éclosion (Nyholm et al, 2000). L'infestation par les vibrios induit
ensuite la morphogenèse des organes lumineux chez la sépiole
(Ruby, 1996). Cette association symbiotique aboutit à un
comportement anti-prédateur original puisque la sépiole utilise la
bioluminescence des bactéries pour rendre sa silhouette invisible à
la vue des prédateurs (émission ventrale d’une lumière identique à celle de la lune ou des
étoiles) (pour revue voir Nyholm & McFall-Ngai, 2004).
2.3.2 Symbioses des glandes nidamentaires accessoires
Une communauté bactérienne variée (alpha- et gamma-protéobactéries, Gram positives,
Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides) est présente dans les glandes nidamentaires accessoires
de différentes espèces de cinq familles de décapodes
(Loliginidés, Sepiidés, Sepiolidés, Sépiadaridés,
Idiosepiidés ; Figure 9 ; Grigioni et al, 2000 ; Barbieri
et al, 2001; Pichon et al, 2005). La présence et la
répartition phylogénétique des symbiotes bactériens
semblent être fonction de la biogéographie de l’hôte
ou de sa taxonomie (Pichon et al, 2005). Les glandes
nidamentaires accessoires ont la particularité de se
teinter en orange à maturité sexuelle et les symbiotes
bactériens pourraient participer à cette coloration en
permettant l’accumulation de pigments caroténoides (Tableau 2 ; Bloodgood, 1977).
Figure 8 : Dissection d’Euprymna tasmanica montrant les organes lumineux (photo : David, P.)
10 µm10 µm
Figure 9 : Photo de FISH montrant les bactéries dans les GNA de Sepia officinalis (Grigioni et al, 2000)
Chapitre I : Contexte général de l’étude
26
Organes Hôtes Symbiotes Rôle (* présumé) Références Organes lumineux
Sépiolidés, Photololiginidés
Vibrio, Photobacterium
Morphogénèse de l’organe lumineux et
luminescence
Montgommery & McFall-Ngai, 1994,
Ruby, 1996
Glandes nidamentaires
accessoires
Sepiidés, Sépiolidés
Sépiadaridés Loliginidés Idiosepiidés
Gram +, α- et γ-protéobactéries,
Cytophaga-Flavobacteria-
Bacteroides
Production de caroténoïdes*
Grigioni et al, 2000; Barbieri et al, 2001; Pichon et al, 2005
Glandes salivaires
Octopodidés (Hapalochlaena sp.)
γ-protéobactéries ? Production de tétrodotoxine*
Hwang et al, 1989
Organes
excréteurs Coleoidés
Nautiloidés Pseudomonadales ? Recyclage des
déchets azotés* Schipp et al, 1990
Grigioni et al, 1999
D’autres associations symbiotiques ont été suggérées dans les glandes salivaires de
certains octopodes du genre Hapalochlaena. Ce groupe de pieuvres, dont la morsure est
mortelle pour l’homme, paralyse ses proies en leur injectant de la tétrodotoxine (Sheumack et
al, 1978, Norman, 2000). La production de tétrodotoxine par des symbiotes bactériens
présents dans les glandes salivaires a été suggérée après isolement et culture des bactéries sur
milieu artificiel (Hwang et al, 1989).
La présence de populations bactériennes dans les appendices péricardiques de Nautile a
été observée en microscopie électronique chez Nautilus macromphalus et Nautilus pompilius
(Schipp et al, 1985). Après culture et caractérisation des bactéries à partir d’extraits
d’appendices péricardiques, Schipp et ses collaborateurs ont suggéré l’appartenance de ces
symbiotes bactériens au groupe des Pseudomonadales (Schipp et al, 1990). Cependant, on sait
aujourd’hui que la culture sur milieu artificiel ne permet de révéler qu’environ 0,001 à 15 %
de la diversité bactérienne totale selon l’environnement (Amann, 1995) (voir Chapitre III.3.1,
page 51). Des études comparatives récentes (Grigioni et al, 1999), utilisant des techniques
moléculaires ont permis de détecter la présence de bactéries dans le système excréteur de
deux espèces de céphalopodes à coquille calcifiée : Nautilus macromphalus (coquille externe)
et Sepia officinalis (coquille interne). La caractérisation moléculaire des symbiotes bactériens
présents dans le système excréteur ainsi que l’examen de leur implication potentielle dans le
métabolisme azoté du Nautile, dernier survivant des céphalopodes à coquille calcifié a donc
été le sujet de ce travail de thèse.
Tableau 2: Caractéristiques (identité et rôle des symbiotes bactériens) des principales associations bactériennes chez les céphalopodes (modifié de Pichon, 2005). ?: signifie que l’identification des bactéries n’a été suggérée qu’à partir de culture bactérienne sur milieu artificiel.
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
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Chapitre II :
Le Nautile, un modèle à part
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
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Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
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Chapitre II – Le Nautile, un modèle à part
1. Evolution et adaptations morphologiques De tout temps, le Nautile et sa coquille ont inspiré de nombreux artistes et poètes et c’est
en partie grâce aux romans de Jules Verne que le nom de Nautile devint populaire à la fin du
XIXème siècle. Mais c’est aux yeux des naturalistes que le Nautile occupe probablement la
place la plus importante, car il est le dernier représentant vivant des céphalopodes à coquille
externe et appartient à la sous classe des Nautiloides dont l’origine remonte à la fin du
Cambrien (~500 millions d’années).
1.1. Histoire évolutive des céphalopodes: « Nautilus, le survivant »)
Les céphalopodes sont des mollusques exclusivement marins dont les premiers fossiles,
issus de la famille des Ellesmeroceratides, datent du Cambrien (le plus vieux fossile de
céphalopode connu : Plectronoceras cambria, date d’environ 510 millions d’années, Chen &
Teichert, 1983). Le groupe a connu une première diversification à la fin du Cambrien et lors
de l'Ordovicien (il y a environ 400-500 millions d’années, Figure 10) mais la plupart de ces
familles se sont éteintes au cours du Paléozoïque.
Figure 10 : Arbre illustrant l’évolution des céphalopodes. Depuis l’origine de l’ancêtre commun au Cambrien, trois sous classes majeures de céphalopodes ont évolué :
- les Ammonoides (aujourd’hui éteints) - les Coléoides (Teuthoides, Sepioides,
Octopodes sur le schéma) - les Nautiloides
Ces deux dernières représentent les céphalopodes actuels (Ward, 1988)
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
30
Seules les sous-classes des Ammonoides et des Nautiloides ont persisté et se sont
diversifiées de manière remarquable au cours du Mézozoïque (les Nautiloides connaissent
leur apogée au Carbonifère avec près de 75 genres) (Shimanskiy, 1967). La sous classe des
Coléoides (à laquelle appartiennent tous les céphalopodes actuels à l’exception du Nautile)
semble, quant à elle, être apparue au cours du Dévonien (~350 millions d’années) (Reitner &
Engeser, 1982). Au cours de l’évolution, ces trois familles de céphalopodes ont subi une
succession de crises sévères d’extinction (Tetcher et al, 1979). Les Ammonoides furent ainsi
plusieurs fois proches d’une extinction qui survient finalement à la fin du Crétacé (~65
millions d’années). Les sous classes des Nautiloides et Coléoides, en dépit d’un déclin au
cours du Tertiaire, ont survécu jusqu’à nos jours, représentant ainsi les céphalopodes actuels.
D’importants changements morphologiques sont intervenus chez les Coléoides au cours
du Tertiaire et leur coquille, anciennement externe, a connu une internalisation voire une
disparition chez certains groupes (voir Encadré 3, page 32) (Mangold & Bidder, 1989).
La sous-classe des Nautiloides qui semble avoir conservé la plupart de ses caractères
morphologiques ancestraux, regroupe donc les derniers représentants des céphalopodes à
coquille calcifiée externe (Ward et al, 1987 ; Pernice et al, 2006). Cependant, malgré leurs
ressemblances morphologiques avec la famille des Ammonoides, les Nautiles ne sont pas des
« fossiles vivants » mais des animaux extrêmement spécialisés, qui occupent une niche
particulière dans l’écosystème des récifs coralliens de la zone Indo-Pacifique. En effet, des
études phylogénétiques récentes concernant les gènes mitochondriaux suggèrent que les deux
genres actuels: Nautilus et Allonautilus (Ward & Saunders, 1997) ont une origine relativement
récente (quelques millions d’années selon Woodruff et al, 1987) et subissent actuellement un
phénomène de diversification (Wray et al, 1995).
1.2. Structure et principales adaptations morphologiques
Les Nautiles présentent de nombreuses caractéristiques morphologiques qui les
distinguent des autres céphalopodes actuels. Ce sont, pour la plupart, des adaptations dues à
leur coquille épaisse cloisonnée. Leur corps est subdivisé en trois parties (Figure 11):
• La région antérieure qui comprend les tentacules, le bulbe buccal, les yeux,
l’hyponome ou entonnoir, et le capuchon ;
• Une région viscérale formée par les organes du système circulatoire, le tube digestif,
l’appareil reproducteur et l’appareil excréteur ;
• Le siphon, tube mince enveloppé par une gaine calcaire et protéique qui va de la partie
la plus postérieure du corps à la loge la plus interne de la coquille.
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
31
Le capuchon proéminent, qui se trouve au-dessus de la tête et des tentacules, clôt l’animal qui
se retrouve ainsi à l’intérieur de la coquille.
1.2.1. Une coquille en guise de« flotteur»
1.2.1.1.Structure de la coquille
La coquille externe des Nautiles, fortement calcifiée, a une double fonction protectrice et
hydrostatique (Ward, 1987). Elle est composée de carbonate de calcium cristallisé sous forme
d’aragonite et comprend une grande chambre d’habitation (qui contient le corps de l’animal)
et une série de chambres cloisonnées (de 34 à 36 en moyenne chez un individu adulte). Avec
la croissance, la coquille s’agrandit sur ses bords externes et forme successivement des
nouvelles chambres pour atteindre sa taille maximale (de 150 à 250 mm selon les espèces) à
la maturité sexuelle de l’animal (environ 5-6 ans).
1.2.1.2.Flottabilité
Les chambres cloisonnées de la coquille contiennent du liquide en faible quantité et
surtout un gaz composé à plus de 90 % d'azote, à une pression d’environ 0.7-0.9 Atm
(Denton, 1974). Ce volume de gaz permet à l’animal de compenser le poids important de sa
coquille et d’adapter sa densité moyenne à celle de l'eau de mer environnante ce qui lui
procure une flottabilité neutre (voir Encadré 3, page 32).
Figure 11: Schéma d’une coupe transversale de Nautilus macromphalus présentant l’organisation en trois régiosn ainsi que les principales caractéristiques morphologiques (modifié d’après Würtz, 1989).
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
32
Encadré 3 : Rôle de l’azote dans le contrôle de la flottabilité chez les céphalopodes
Le maintien de la position verticale dans la colonne d'eau représente un coût énergétique majeur
dans le milieu marin (Webber et al, 2000). Afin de minimiser ce coût, de nombreux organismes pélagiques ont développé diverses stratégies dans le but de réduire leur densité par rapport à celle de l'eau de mer (Seibel et al, 2004). L’importance de ces stratégies est particulièrement bien illustrée chez les céphalopodes dont le succès au cours du Paléozoïque semble dû en grande partie au développement de coquilles cloisonnées qui leur a permis d’assurer une flottabilité neutre (Denton, 1974). Le phénomène de régression de la coquille présenté par toutes les espèces de céphalopodes actuels, à l’exception du Nautile, s’est accompagné de changements dans leur mode de vie qui se concrétisent par une adaptation progressive soit au milieu benthique soit à un mode de déplacement actif. En fait, la plupart des caractéristiques de l’évolution des céhalopodes ont été interprétées comme une réponse au besoin de contrôler la flottabilité (Clarke, 1988, Mangold & Bidder, 1989). Ainsi, la coquille cloisonnée externe contenant du gaz et permettant la gestion de la flottabilité (chez les espèces fossiles éteintes et chez le Nautile) a été substituée soit par une coquille interne fonctionnant de la même façon (chez Sepia et Spirula) soit par l’accumulation directe de gaz ou liquides plus légers que l’eau de mer dans le coelome et entre les tissus (chez les Calmars et les Octopodes pélagiques) (Figure 12 ; Clarke et al, 1979 ; Packard & Wurtz, 1994 ; Seibel et al, 2004).
L’azote est le principal constituant des gaz et liquides utilisés par les Céphalopodes dans le souci de gérer leur flottabilité (Denton & Taylor, 1964, Denton, 1974). Chez les espèces sans coquille calcifiée, la stratégie la plus répandue consiste à substituer les ions sodium par des ions ammonium ce qui permet de créer des liquides de densité plus faible (Clarke et al, 1979). Ainsi, les composés ammoniacaux peuvent représenter 50 à 60 % de la masse corporelle de certains calmars Cranchiidés (avec des concentrations en ammonium de près de 500nM, Voight et al, 1994). Chez les espèces à coquille calcifiée, les études de Denton concernant la production et l’utilisation de l’azote par Sepia, Spirula et Nautilus ont permis de confirmer que le gaz accumulé dans leurs coquilles externes ou internes provient de leur métabolisme protéique (Denton, 1974). L’auteur souligne d’ailleurs que le même mécanisme se déroulerait chez les Nautiloides et les Coléoides.
Les céphalopodes sont des organismes ammonotéliques, c’est-à-dire que plus de 70% de l'azote organique dissout excrété par l'animal est sous forme ammoniacale (Boucher-Rodoni, 1989). Cependant, Boucher-Rodoni & Mangold (1994) ont clairement mis en évidence que la Seiche et le Nautile présentent un faible taux d’excrétion d’ammonium. Etant donné que ces animaux accumulent de l’azote gazeux dans leur coquille calcaire pour leur flottabilité, ces auteurs ont suggéré qu’une partie de l’ammonium qui n’est pas excrété, pourrait directement être transformé en azote gazeux par des bactéries symbiotiques. Cependant, de telles interactions symbiotiques impliquant des micro-organismes à la fois nitrifiant et dénitrifiant n’ont, jusqu’ici, jamais été mises en évidence.
Figure 12 : Différentes adaptations liées au contrôle de la flottabilité chez les céphalopodes (A) fossiles et actuels : - coquille cloisonnée chez Nautilus, Spirula et Sepia (B, C, D, E) - liquide contenu dans les cavités coelomiques des Cranchiidés (F). (Norman, 2005 ; Boyle & Rodhouse, 2005)
B A
F
C
D
E
Nautilus Spirula
Cranchia
Sepia
Sepia
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
33
La coquille résiste à la pression hydrostatique de l'eau environnante jusqu’à 750m de
profondeur (Ward & Martin, 1978), la pression et le volume de gaz dans la coquille sont
indépendants donc de la profondeur. Les Nautiles peuvent ainsi flotter de manière quasi-
neutre dans toute la gamme de profondeurs auxquelles ils vivent sans avoir à changer
significativement le volume de gaz contenu dans leur coquille. Cette capacité est, pour
certains auteurs, (Boutilier et al, 1996 ; Norman, 2000 ; Webber et al, 2000) une des
principales adaptations des Nautiloides leur ayant permis de survivre face à la prédation et à la
compétition.
1.2.1.3.Ajustements du contenu en liquide et gaz de la coquille
Les Nautiles peuvent parfois ajuster légèrement la quantité de liquide présent dans les
chambres de leur coquille grâce à une extension de tissu vascularisé appelé « siphon » (Ward
et al, 1981). Ce siphon qui relie toutes les chambres cloisonnées au corps de l’animal (Figure
11, page 31) est très riche en mitochondries et en pompes à sodium ce qui lui permet de
« pomper » activement le sodium présent dans le liquide des chambres (Mangold & Bidder,
1989). Ce liquide devient alors plus dilué que le sang et que l’eau de mer entourant l’animal.
Il est ainsi rejeté à l’extérieur de manière passive par la pression osmotique (Figure 13).
Des mécanismes de diffusion passive permettent aussi le transport du gaz présent dans le
sang de l’animal vers les chambres de la coquille et inversement. Contrairement à ce qu’on a
longtemps cru, ces ajustements du contenu en liquide et gaz de la coquille ne sont pas utilisés
par les Nautiles pour réaliser leurs migrations verticales (voir Chapitre II.2.2, page 36). En
effet, la vitesse à laquelle le liquide est normalement expulsé (environ 1 ml par loge et par
jour) est sans rapport avec la vitesse de remontée effective de l’animal vers la surface (Ward,
Figure 13 : Schéma d’une coupe transversale de siphon de Nautilus macromphalus représentant les mécanismes de diffusion qui permettent de vider le liquide présent dans la coquille (modifié d’après Würtz, 1989).
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
34
1987). Ce sont en fait des phases de nage active à l’aide de l’organe locomoteur (voir ci-
dessous) qui permettent de réaliser ces migrations dans la colonne d’eau, tandis que le
contenu en gaz suffisant pour une flottabilité neutre est maintenu dans la coquille.
1.2.2. Un organe de locomotion permettant une grande manoeuvrabilité
L’organe de locomotion principal est représenté par l’hyponome, qui est situé au-dessous
des tentacules (Figure 11, page 32), et qui, en provoquant un jet d’eau (système de « jet-
propulsion » commun aux céphalopodes), permet à l’animal de se mouvoir « à reculons ».
Contrairement à l’entonnoir des autres céphalopodes, constitué d’un tube, l’hyponome des
Nautiles est formé par une couche musculaire enroulée sur elle-même. Extrêmement mobile et
flexible, il peut s’étirer au-delà de l’ouverture de la coquille ce qui permet à l’animal de se
diriger avec une grande manoeuvrabilité. Pour les mouvements rapides, l’action de
l’hyponome est renforcée par la contraction des gros muscles rétracteurs.
1.2.3. Des tentacules sans ventouses mais avec de nombreuses fonctions
Contrairement aux autres céphalopodes, les Nautiles possèdent de nombreux tentacules
(environ 90) qui ne présentent aucune ventouse. Ils se différencient en trois groupes
spécialisés pour assumer différentes fonctions (Figure 14):
• Fonction chimiosensorielle pour les
tentacules oculaires et certains tentacules
digitaux impliqués dans la recherche des
aliments (Bidder, 1962)
• Fonction tactile et préhensile pour certains
tentacules digitaux externes qui sont dotés
d’une série de crêtes transversales leur
permettant d’adhérer fortement
• Fonction reproductrice pour les tentacules
internes buccaux qui peuvent être modifiés
en organes sexuels (comme l’organe
reproducteur mâle, appelé spadix ; Ward,
1987).
1.2.4. Quatre branchies pour un métabolisme différent
Les Nautiles appartiennent au groupe des tétrabranchiaux car ils possèdent deux paires de
branchies, contrairement aux autres céphalopodes qui n’en possèdent qu’une paire. Elles
Figure 14 : Schéma représentant les différents types de tentacules chez le Nautile (Würtz, 1989)
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
35
occupent la partie intérieure de la cavité palléale (Figure 11, page 32) et sont aérées par les
mouvements d'eau créés par le siphon. Leur grande taille permet à l’animal d’exploiter des
faibles teneurs en oxygène avec une activité métabolique plus faible que celle des
céphalopodes dibranchiaux (O’Dor et al, 1993 ; voir Chapitre II, 3.1, page 39)
1.2.5. Des yeux dépourvus de cristallin
De gros yeux pédonculés se trouvent de chaque côté de la tête du Nautile et, contrairement
à ceux des autres céphalopodes, ils sont dépourvus de cristallin et fonctionnent selon le
principe de la chambre noire. La pupille, orifice circulaire qui fait communiquer la partie
interne de l’œil avec le milieu extérieur, est en mesure de se contracter ou de se dilater en
fonction de la variation d’intensité lumineuse.
2. Ecologie et Biologie 2.1. Distribution géographique et diversité spécifique
Les Nautiles sont actuellement distribués dans une vaste zone océanique qui s’étend de
l’Océan Indien aux Iles Samoa et à l’Australie (des spécimens vivants ont été récoltés
ponctuellement aux îles Andaman et aux îles Samoa en Polynésie centrale) (Boyle &
Rodhouse, 2005). De nombreuses espèces ont été décrites sur la base de caractères
morphologiques (forme de la région ombilicale, présence ou absence d’un bouchon calcaire,
nombre de stries externes des parois…): Nautilus belauensis, Nautilus macromphalus,
Nautilus pompilius, Allonautilus scrobiculatus, Nautilus stenomphalus, Nautilus repertus
(Figure 15).
N. pompilius
A. scrobitulatus
N. macromphalus
N. belauensis
N. stenomphalus
N. repertus
Figure 15 : Distribution géographique des différentes espèces de Nautile (Würtz, 1989)
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
36
Mais l’identification de certaines espèces a largement été controversée (Saunders, 1981;
Ward, 1984) et seuls trois taxons sont plus communément reconnus: N. macromphalus, N.
pompilius, et A. scrobiculatus (voir Planche photo 1, page 40). L’espèce-type, N. pompilius
possède la plus large répartition géographique (distribution Indo-Pacifique) tandis que les
autres formes sont généralement restreintes à certains archipels (Nouvelle-Calédonie pour N.
macromphalus et Papouasie-Nouvelle-Guinée pour A. scrobitulatus). Des études récentes,
basées sur l’analyse phylogénétique des gènes mitochondriaux (16S et 28S) et de certains
caractères morphologiques, ont suggéré la présence de trois clades géographiques (Figure 16)
et la séparation de l’espèce A. scrobitulatus (Wray et al, 1995) qui a depuis été classée dans
un nouveau genre: Allonautilus (Ward & Saunders, 1997).
2.2. Distribution bathymétrique, nourriture et prédation
D’après les captures à l’aide de casiers et avec le support d’observations menées dans de
nombreux endroits du monde: aux Philippines (pour revue voir Hayasaka et al, 1987), sur l’île
de Palau en Micronésie, en Nouvelle-Calédonie, sur Lizard Island en Australie et aux îles
Fidji (pour revue voir Saunders, 1987), on sait aujourd’hui que le Nautile vit sur les pentes
externes des récifs coralliens à des profondeurs variant de 100 à 800m et qu’il semble
rarement pénétrer dans les lagons (Saunders & Ward, 1987). Des informations détaillées
concernant les pêches de N. macromphalus en Nouvelle-Calédonie de 1970 à 1995 (Le
Terrier, com. pers.) confirment ces gammes de profondeur avec une densité maximale
d’individus péchés entre 300 et 400m et une limite de pêche à environ 800m de profondeur
(Figure 17).
Figure 16 : Reconstruction phylogénétique de cinq espèces de Nautiles représentant les trois clades géographiques identifiés par Wray et ses collaborateurs (1995). La reconstruction est basée sur l’analyse phylogénétique des séquences des gènes mitochondriaux 16S et 18S ainsi que certains caractères morphologiques.
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
37
Profondeur Résultats Nb de casier 112
0-100 Nb de nautiles péchés 58 Nb de nautiles/casier 0.5 Nb de casier 1493
100-200 Nb de nautiles péchés 2937 Nb de nautiles/casier 2 Nb de casier 291
200-300 Nb de nautiles péchés 1092 Nb de nautiles/casier 3.8 Nb de casier 387
300-400 Nb de nautiles péchés 3102 Nb de nautiles/casier 8 Nb de casier 194
400-500 Nb de nautiles péchés 369 Nb de nautiles/casier 1.9 Nb de casier 17
500-600 Nb de nautiles péchés 2 Nb de nautiles/casier 0.118 Nb de casier 169
600-700 Nb de nautiles péchés 3 Nb de nautiles/casier 0.00 Nb de casier 26
700-800 Nb de nautiles péchés 6 Nb de nautiles/casier 0.2 Nb de casier 136
800-900 Nb de nautiles péchés 0 Nb de nautiles/casier 0 Nb de casier 34
900-1000 Nb de nautiles péchés 0 Nb de nautiles/casier 0 Nb de casier 41
1000-1100 Nb de nautiles péchés 0 Nb de nautiles/casier 0
Limite physiologique
100m
200m
300m
400m
500m
0m
Figure 17 : Tableau de données et schéma illustrant la répartition bathymétrique de N. macromphalus à partir des collectes réalisées en Nouvelle-Calédonie entre 1970 et 1995. La limite physiologique est indiquée d’après Ward & Martin (1978).
0 Nautiles/casier 0-1 Nautiles/casier 4-8 Nautiles/casier 1-4 Nautiles/casier
Figure 18 : Schéma illustrant les migrations verticales diurnes observées par O’Dor et ses collaborateurs à l’aide d’émetteurs d’ultrasons disposés sur les coquilles de Nautile en Papouasie Nouvelle-Guinée (O’Dor et al, 1993).
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
38
Dans les années 1980 et 1990, des études scientifiques ont permis d’acquérir de nouvelles
informations concernant les migrations verticales réalisées par les Nautiles à l’aide
notamment d’expériences de suivi acoustique et télémétrique (Saunders, 1985 ; Ward et al,
1984 ; O’Dor et al, 1993). Ainsi, d’après les déplacements journaliers observés chez quelques
individus à l’aide d’un émetteur ultrason, O’Dor et ses collaborateurs (1993) suggèrent que
les Nautiles ont un rythme migratoire assez régulier comprenant une remontée vers les eaux
superficielles chaque nuit (à une vitesse d’environ 2m/min) et une descente vers les eaux plus
profondes pendant la journée (à une vitesse d’environ 3m/min) (Figure 18). Ces migrations
verticales semblent essentielles au Nautile à plusieurs niveaux :
Tout d’abord, les migrations permettent au Nautile d’explorer tout le tombant du
récif à la recherche de ses proies qu’il repère par chimio-détection (O’Dor, 1993).
A cet égard, les crustacés décapodes (vivants ou morts) jouent un rôle fondamental
dans l’alimentation du Nautile (ils peuvent représenter près de 75% de son contenu
stomacal) puisqu’ils représentent une source riche en protéines mais aussi en
calcium pour la sécrétion de la coquille (voir Planche photo 1, page 40).
Dans un deuxième temps, le rythme migratoire diurne observé par O’Dor et ses
collaborateurs (1993) permet au Nautile d’éviter le contact avec certains
prédateurs (Norman, 2000). En effet, en remontant la nuit vers la surface, les
Nautiles diminuent le risque d’être attaqués par les poissons et d’autres prédateurs
chassant à vue (requins, balistes et tortues principalement).
2.3. Reproduction et développement
Contrairement à la plupart des céphalopodes qui ne se reproduisent qu’une seule fois
pendant leur vie, le Nautile se reproduit plusieurs fois (polycyclique) et possède une période
reproductrice qui peut durer plusieurs années (Hamada et al, 1978). La période de ponte
semble s’étendre sur toute l’année durant laquelle un Nautile peut pondre en moyenne entre
un et deux œufs par mois (Norman, 2000). Pendant l’accouplement, qui peut durer jusqu’à
24h, le mâle et la femelle s’enlacent aux moyens de leurs tentacules (voir Planche photo 1,
page 40) tandis que l’organe copulateur du mâle (le spadix : un tentacule interne buccal qui
est différencié), s’introduit dans la cavité palléale de la femelle pour y placer les
spermatophores (Mikami et al, 1980). La ponte survient une à deux semaines après
l’accouplement.
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
39
Les œufs, particulièrement volumineux (25 à 35 mm pour 4g), sont alors déposés
individuellement à des intervalles de quelques jours. Ils sont
accrochés au substrat (cavités rocheuses généralement) par
une membrane souple qui est perforée à son sommet. Cette
membrane laisse l’eau de mer circuler entre la gaine externe
et la capsule ovale qui contient le vitellus (voir Planche
photo 1, page 40 et Figure 19).
Depuis 1985, de nombreux œufs ont été pondus en aquarium et ont permis des
observations détaillées du développement embryonnaire de N. pompilius (pour revue voir
Arnold & Carlson, 1986). Le développement de l’embryon dure environ un an et son éclosion
ne semble se produire que lorsque sa coquille possède 7 loges et a atteint la taille d’environ 25
mm de diamètre. Bien que des oeufs n’aient jamais été observés dans l’environnement
naturel, des analyses de la composition isotopique de la coquille de juvéniles ont permis de
suggérer que leur ponte se déroule en eaux peu profondes. Après un développement
embryonnaire à une température d’environ 22-24°C, les juvéniles semblent migrer vers des
eaux plus froides et profondes (Landman et al, 1994). Les avancées dans le maintien et la
reproduction des Nautiloides en aquarium sont donc d’autant plus importantes pour l’étude
des interactions symbiotiques qu’elles permettent l’unique accès aux stades de développement
les plus précoces des Nautiloides et peuvent ainsi permettre de préciser le mode de
transmission des populations symbiotiques (voir Chapitre I.2.1, page 21).
3. Physiologie 3.1. « Un métabolisme à toute épreuve» (Boutilier et al, 1996)
Les niveaux d'activité mesurés dans la nature (O’Dor, 1993), ainsi que les caractéristiques
des systèmes respiratoire et circulatoire, suggèrent que les Nautiles sont adaptés à un style de
vie peu coûteux en énergie et qu’ils peuvent survivre à des concentrations d'oxygène très
faibles sans pour autant dépendre d’un métabolisme anaérobie (Boutilier et al 1996). En effet,
lorsqu’ils se retrouvent dans des conditions hypoxiques, les Nautiles réalisent d’importantes
« pauses » ventilatoires et circulatoires durant lesquelles le sang semble avoir une très haute
affinité pour l’oxygène.
Figure 19 : Dessin représentant un embryon de Nautile dans son œuf (dessin d’après Würtz, 1989)
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
40
Planche photo 1: Morphologie externe de différentes espèces de Nautile et de différents stades de développement (la plupart des photos sont tirées de Norman, 2000) A : N. pompilius, B : N. scrobitulatus, C : N. macromphalus D : Deux individus de N. macromphalus dévorant une mue de langouste (Joannot P) E : Deux individus de N. belauensis en reproduction, F : Oeufs de N. macromphalus en aquarium G : Dissection d’un œuf de N. belauensis montrant l’embryon à 4 mois H : Eclosion d’un juvénile de N. belauensis, I : Remontée d’un casier contenant un dizaine de spécimens de N. macromphalus au large de la Nouvelle-Calédonie (Pernice M)
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
41
Cette prodigieuse capacité de quasi-suppression du métabolisme aérobie (dans des
conditions d’hypoxie sévère le taux métabolique aérobie ne représente qu’environ 4 à 8% de
celui en conditions normales), semble notamment permettre à l’animal de recharger le sang
présent dans la veine cave ventrale en oxygène par diffusion (Boutilier et al, 1996).
3.2. Digestion
La présence d’un jabot important (voir Figure 11, page 32) permet au Nautile de conserver
d’importants fragments de nourriture pendant plusieurs jours. Comme pour l’ensemble des
céphalopodes, son régime alimentaire est majoritairement constitué de protéines. Le processus
digestif qui se déroule en trois phases (digestive, absorptive, et éliminatrice) aboutit
principalement à l’élimination des déchets inattaquables qui sont libérés par l’anus ainsi qu’à
la production de déchets ammoniacaux qui seront ensuite l’objet des processus d’excrétion
(pour revue voir Boucaud-Camou & Boucher-Rodoni, 1983 et Mangold & Bidder, 1989).
En utilisant des techniques de tomographie assistées par ordinateur, Westermann et al
(2002) ont pu suivre dans le temps le trajet des aliments dans le tube digestif de N. pompilius.
La durée moyenne de la digestion totale qui comprend donc les trois phases, digestive,
absorptive et éliminatrice, semble être d’environ 12 h. Cette durée pourrait cependant être
revue à la hausse dans le milieu naturel à cause des températures plus faibles de
l’environnement.
3.3. Excrétion
La fonction d’excrétion, chez le Nautile comme chez les autres céphalopodes et les
Mollusques en général, comprend trois processus successifs:
• L’ultrafiltration qui consiste à filtrer les plus petites molécules contenues dans le sang
dans le but de les éliminer (l’hémocyanine et les autres molécules plus grosses sont
retenues par le système circulatoire).
• La réabsorption qui permet de réalimenter le sang en composés variés (glucose, acides
aminés…) par transport actif contre un gradient de concentration (Martin, 1965).
• La sécrétion qui consiste à faire passer les déchets, surtout des substances azotées
(principalement de l’ammoniac), dans le fluide qui sera ensuite excrété.
Les expériences concernant la physiologie de l’excrétion sont assez difficiles à réaliser
chez le Nautile (notamment de par la présence de la coquille externe) mais des études
ultrastructurales et cytochimiques réalisées dans les années 1980 ont largement fait avancer
les connaissances dans ce domaine (Martin, 1983 ; Schipp et al, 1985 ; voir ci-dessous).
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
42
3.3.1. Le système excréteur
D’une manière générale chez les céphalopodes, plusieurs organes entreprennent les
différents processus liés à la fonction d’excrétion : les appendices rénaux, les cœurs
branchiaux, et les branchies (Mangold & Bidder, 1989). Pourtant chez le Nautile, les
appendices rénaux étant spécialisés dans la rétention du calcium (utilisé par la suite par
l’animal pour la croissance de sa coquille), seuls les homologues des cœurs branchiaux,
appelés appendices péricardiques, jouent un rôle dans l’évacuation des déchets métaboliques
(Figure 20 ; Schipp & Martin, 1981).
Les appendices péricardiques du Nautile assument donc, à eux seuls, les trois processus
excréteurs communs aux céphalopodes: ultrafiltration, réabsorption et sécrétion (Schipp et al,
1985). Ces organes sont élaborés à partir de la paroi postérieure de chaque veine cave du
Nautile et forment deux paires de glandes contractiles qui s’ouvrent sur la cavité palléale
(Figures 20 A et C ; Mangold, & Bidder, 1989).
Figure 20 : A : Schéma illustrant une section longitudinale de Nautile montrant le système excréteur (encart). B : Schéma simplifié du système excréteur et des structures circulatoires associées. ABV, veines branchiales afférentes; DA, aorte dorsale; EBV, veines branchiales efférentes; G, branchies; H, coeur; PA, appendices péricardiques; RA, appendices rénaux; RS, sac rénal; VC, veine cave. C : Dissection de N. pompilius montrant les quatre appendices péricardiques (flèches)
C
Pernice M
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
43
3.3.2. Fonctionnement du système excréteur
Les appendices péricardiques du Nautile sont composés de nombreux villis (Figure 21)
qui collectent et filtrent le sang (à l’intérieur de l’organe) puis sécrètent un liquide d’excrétion
(à l’extérieur de l’organe) acide et riche en ammoniac. Cet ammoniac est directement
transformé en ions ammonium (jusqu'à 200 ppm : Schipp et Martin, 1987) par l’acidité du
milieu et le fluide excréteur est finalement rejeté dans le milieu environnant par
l’intermédiaire de la cavité palléale. Chaque villus constitue une unité d’excrétion à part
entière et son ultrastructure, observée en microscopie électronique par Schipp et al (1985),
reflète une organisation correspondant aux trois processus excréteurs (Figure 21):
• Les cellules ovoïdes (podocytes) forment
une barrière filtrante dans la partie baso-
médiane interne du villus qui semble active
dans le processus d’ultrafiltration de
molécules de petite taille
• L’épithelium plissé en périphérie de la
région baso-médiane entreprend les
processus de transport actifs liés à la
réabsorption
• L’épithelium de la région apicale secrète le
fluide d’excrétion riche en ammoniac
3.3.3. Une originalité physiologique, évolutive et …symbiotique?
C’est sans aucun doute la multiplicité des processus physiologiques pris en charge par les
appendices péricardiques du Nautile qui a contraint leur organisation structurale (Schipp et al,
1985). Cette organisation fonctionnelle des appendices péricardiques est particulièrement
intéressante pour différentes raisons. Dans un contexte évolutif, elle est unique au sein des
céphalopodes mais aussi des Gastéropodes et des Bivalves chez qui ces organes existent mais
n’ont aucune implication dans la fonction d’excrétion (rôle dans la circulation sanguine
uniquement) (Martin, 1983). En outre, d’un point de vue physiologique, cette structure
Figure 21 : Diagramme d’un villus péricardique de Nautile (modifié de Schipp et al, 1985)
Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part
44
excrétrice semble avoir d’importantes répercussions sur la gestion des déchets azotés du
Nautile dont le taux d’excrétion d’ammonium est 3 à 4 fois plus faible que celui de la plupart
des autres céphalopodes (Boucher-Rodoni & Mangold, 1994). Enfin, en accord avec les
hypothèses de certains auteurs, (Denton, 1974 ; Clarke, 1988, Mangold & Bidder, 1989, voir
Encadré 3, page 32), cette faible quantité d’ammonium excrétée par les appendices
péricardiques pourrait être impliquée dans la gestion de la flottabilité du Nautile. En effet,
Boucher-Rodoni et Mangold, (1994) suggèrent qu’une partie de l’ammonium non excrété par
les appendices péricardiques, pourrait être directement transformé en azote gazeux par les
bactéries symbiotiques hébergées dans ces organes. Ainsi les caractéristiques évolutives et
physiologiques du Nautile font des appendices péricardiques, et des populations bactériennes
qui leurs sont associées (Schipp et al, 1990, Grigioni et al, 1999 voir Chapitre I, 2.3.2, page
26), un modèle d’étude particulièrement intéressant dans un contexte d’interactions
symbiotiques.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
45
Chapitre III :
Identification, Localisation et Quantification des
symbiotes bactériens chez deux espèces de Nautiles :
implications physiologiques et évolutives
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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Chapitre III – Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
bactériens chez 2 espèces de Nautiles : implications physiologiques et
évolutives
1. Objectifs généraux de l’étude En impliquant des échanges génétiques, l'acquisition et le maintien d'un ou plusieurs
organismes par un autre aboutit généralement à la formation de nouvelles structures et de
nouveaux métabolismes. De telles interactions sont beaucoup plus complexes et plus fluides
que les simples concepts écologiques de mutualisme, commensalisme ou parasitisme qui leur
sont généralement associés (Douglas, 1994). De cette complexité résulte le besoin d’une
approche pluridisciplinaire (évolution, écologie, physiologie…) afin de définir un système
symbiotique, notamment au niveau de la spécificité des symbiotes impliqués, avant de
pouvoir discuter du rôle de chacun des partenaires engagés (Graf et al, 2006). Le travail
présent se propose d’étudier de manière intégrée la diversité des symbiotes bactériens présents
au sein des organes excréteurs de deux espèces de Nautile, afin de pouvoir déterminer la
spécificité de cette interaction symbiotique. Cette étude s'inscrit donc dans une problématique
visant à préciser la physiologie et le fonctionnement métabolique de ce « micro écosystème »
hautement spécialisé en fournissant des informations nouvelles concernant l’évolution, la
distribution spatiale, la transmission et la fonction potentielle des bactéries symbiotiques.
Les bactéries présentes dans les différents organes ont été (1) identifiées par
séquençage et analyse du gène codant pour la sous unité 16S de l’ARN ribosomique (ARNr
16S), (2) localisées dans les tissus par la technique d’hybridation in situ, (3) quantifiées par
cytomètrie en flux, puis finalement (4) testées pour leur potentiel nitrifiant et dénitrifiant ainsi
que (5) leur activité antimicrobienne. Les résultats ont fait l’objet de trois articles dont un
publié, un soumis et un autre à soumettre.
Cette étude a donc nécessité une approche en plusieurs phases concernant tout d’abord
la caractérisation du système symbiotique chez N. macromphalus :
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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- Caractérisation des bactéries par séquençage de leur ARNr 16S afin de préciser leur identité
et de donner une première suggestion de leur potentiel métabolique
- Détection des différents types de symbiotes dans les tissus de l’hôte par hybridation in situ
en vue d’examiner leur répartition et d’éventuelles relations spatiales
- Quantification des bactéries par cytomètrie en flux et développement d’un modèle cellulaire
de l’association Nautile-bactérie dans la perspective d’étudier les mécanismes moléculaires
mis en jeu dans cette interaction.
-Test d’une implication des symbiotes dans le métabolisme azoté de N. macromphalus à
l’aide de différentes techniques: (i) incubation et analyses isotopiques des organes concernés
(ii) recherche et séquençage de gènes bactériens impliqués dans la nitrification et
dénitrification (Chapitre III. 4.3)
Enfin, une étude comparative de la diversité bactérienne a été réalisée chez N. pompilius
sur deux sites de collectes distants afin de préciser la spécificité de la symbiose et l’influence
potentielle des facteurs biogéographiques. De plus, le potentiel antimicrobien de souches
isolées de différentes espèces de Nautile a été déterminé dans le but de suggérer les
mécanismes pouvant être impliqués dans la colonisation des organes.
Chapitre III. 4.2: Article publié dans Marine Biology (sous presse):
Primary co-culture as a complementary approach to explore the diversity of bacterial symbionts in marine invertebrates: the example of Nautilus macromphalus (Cephalopoda:Nautiloidea). Pernice, M., Pichon, D., Domart-Coulon, I., Favet, J., Boucher-Rodoni, R.
Chapitre III. 4.1: Article à soumettre:
Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of Nautilus macromphalus (Cephalopoda:Nautiloidea). Pernice, M., Wetzel, S., Gros, O., Boucher-Rodoni, R., Dubilier, N.
Chapitre III. 4.4 et 4.5: Article soumis à Reviews in Fish Biology & Fisheries: Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial agents in the excretory organs of Nautilus pompilius (Cephalopoda, Nautiloidea). Pernice, M., Destoumieux-Garzón, D., Peduzzi, J., Rebuffat, S., Boucher-Rodoni,R.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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2. Origine des échantillons et campagnes Quatre campagnes ont permis la collecte de Nautiles en vue de la caractérisation de leurs
bactéries symbiotiques par séquençage des gènes marqueurs et hybridation in situ. Les
récoltes portent sur deux espèces : Nautilus macromphalus et Nautilus pompilius, collectées
avec l’aide de différents partenaires (Aquarium et centre IRD de Nouméa, affaires maritimes
de Nouvelle Calédonie, Maritime college de Luganville-Vanuatu, Aquascapes Philippines).
Les sites de ces différentes campagnes sont illustrés dans la figure 22.
L’espèce endémique de Nouvelle Calédonie, N. macromphalus a fait l’objet de l’étude
la plus exhaustive avec trois sites de collecte le long de la côte ouest et des observations
complémentaires concernant certaines caractéristiques des spécimens (taille, poids, sexe, voir
Annexe 1).
3. Méthodes
La taxonomie des procaryotes est longtemps restée complexe et mal définie au niveau
spécifique car basée sur des caractéristiques cellulaires et physiologiques (morphotype,
coloration Gram, tests physiologiques), dans la mesure où seules les bactéries cultivables
étaient accessibles aux microbiologistes. Depuis maintenant plus de vingt ans, le
développement des techniques moléculaires, a eu un impact extraordinaire dans la
classification du monde bactérien (Woese et al, 1990). Ces techniques, qui ne nécessitent pas
de phase de croissance des bactéries sur un milieu de culture, permettent d’explorer la
Figure 22 : Sites des quatre campagnes de pêche des espèces N. pompilius (en rouge) et N. macromphalus (en bleu) réalisées lors de cette étude. Encart : détails des sites concernant l’espèce N. macromphalus en Nouvelle-Calédonie.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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diversité spécifique et fonctionnelle, et de quantifier des populations bactériennes. Ces
approches moléculaires ont ainsi permis de totalement renouveler la microbiologie en révélant
l'existence d'une importante diversité bactérienne dont les conditions de culture in vitro n'ont
pas été encore définies (Joux & Lebaron, 2000).On estime ainsi que le pourcentage d’espèces
« cultivables » oscille entre 0,001 et 15% de la diversité bactérienne totale selon
l’environnement (Amann et al, 1995 ; Pace, 1997).
Un certain nombre de techniques de biologie moléculaire ont été utilisées lors de ce travail
afin d’identifier, quantifier et localiser la diversité bactérienne associée aux appendices
péricardiques de Nautile. Ces techniques sont souvent employées de manière cyclique (« top-
to-bottom approach » ; Amann et al, 1995), le séquençage et l’analyse du gène codant pour
l’ARNr 16S permettant de cibler les régions spécifiquement conservées qui peuvent être
utilisées ensuite pour localiser les bactéries dans les tissus à l’aide de sondes fluorescentes
(Figure 23).
Figure 23 : Aspect cyclique (top-to-bottom approach, Amann et al, 1995) des différentes techniques de biologie moléculaire utilisées.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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3.1. Caractérisation de la diversité
3.1.1. L’ARNr 16S comme marqueur moléculaire
L’analyse comparative des séquences de gènes isolés chez les bactéries permet
l'évaluation de leur position phylogénétique (Muyser & Ramsing, 1995 ; voir Encadré 4,
page52). Dans ce but, le gène codant pour l’ARN ribosomal 16S s’est révélé être un excellent
marqueur moléculaire pour plusieurs raisons :
• Il est universellement distribué puisqu’il participe à la traduction des ARN en
protéines (Gutell et al, 2002)
• Il ne présente pas de transfert horizontal entre espèces
• Sa fonction exerce une contrainte importante sur son évolution et sa structure
secondaire, ce qui permet de l’utiliser pour établir des relations entre procaryotes
phylogénétiquement éloignés (Woese, 1987)
• Enfin, les séquences sont suffisamment longues (1500 paires de bases) pour dresser
des phylogénies robustes.
Cette molécule est donc désormais considérée comme le marqueur standard pour l’étude
de la diversité des procaryotes et plusieurs dizaines de milliers de séquences sont disponibles
dans les banques de données comme RDP (Ribosomal Database Project ; Cole et al, 2005).
Dans le but d’identifier les symbiotes bactériens impliqués, l’ADN total a tout d’abord été
extrait des appendices péricardiques de Nautile à partir d’échantillons congelés à -80°C selon
le protocole décrit précédemment par Zhou et al (1996). Puis le gène codant pour l’ARNr 16S
bactérien a été amplifié par PCR grâce à différentes amorces universelles (Annexe 2). Les
fragments PCR ont été clonés après purification en utilisant le TOPO-TA cloning kit
(Invitrogen). L’étude concernant la campagne de collecte de septembre 2005 en Nouvelle
Calédonie a permis de séquencer une centaine de clones chez quatre individus, afin de
déterminer de manière exhaustive la diversité bactérienne associée à N. macromphalus.
Durant les autres campagnes de collecte, un nombre plus faible de clones (10-20) par
individus a été séquencé et le degré de significativité des banques de clones obtenues a alors
été testé statistiquement.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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Encadré 4 : Diversité des bactéries
La classification des procaryotes est complexe : leur reproduction clonale est soumise à des contraintes encore peu connues (Williams & Embley, 1996) et leur morphologie est trop simple pour servir d’outil de classification (Olsen & Woese, 1993). Ainsi, le concept d’espèce généralement admis pour les Métazoaires ne leur est pas directement applicable. En intégrant la ressemblance génotypique dans la notion d’espèce chez les procaryotes, les travaux de Carl Woese (1990) ont apporté un nouveau regard sur la diversité microbienne en proposant une séparation des procaryotes en deux groupes distincts : Bacteria et Archae. L’arbre phylogénétique universel basé sur les séquences d’ARNr (Olsen & Woese, 1993) reflète cette vision des choses en suggérant une division du monde vivant en trois grands domaines : Bacteria, Archae et Eucarya (Figure 24).
Aucune définition stricte de l’espèce bactérienne n’est, aujourd’hui universellement acceptée et parmi les différents concepts disponibles, celui reposant sur le critère de similarité entre séquences d’ARNr 16S (Ward, 1998) est le plus communément utilisé (une même espèce étant définie par un pourcentage de similitude entre deux séquences supérieur à 97% ou 99% selon les cas). Toutefois, vu les difficultés inhérentes à la notion d’espèce chez les bactéries, l’emploi du mot phylotype lui est préféré pour décrire les séquences nucléotidiques identifiées et le domaine des bactéries est aujourd’hui généralement considéré comme un ensemble de procaryotes extraordinairement varié composé de 23 phylums (Figure 25).
Figure 24 : Arbre phylogénétique universel basé sur l’ARNr 16S représentant deux domaines procaryotiques et un domaine eucaryotique (Olsen & Woese, 1993)
Figure 25 : Arbre phylogénétique basé sur l’ARNr 16S représentant les principaux phylums bactériens (Madigan et al, 2002).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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3.1.2. Tests statistiques
Les différentes séquences obtenues par séquençage de l’ARNr 16S ont été regroupées en
unités taxonomiques (OTUs) en fonction de leur pourcentage de similarité : 97% de similarité
définissant le genre bactérien (Stackebrandt & Goebel, 1994). Puis, l’indice de recouvrement
de la librairie de séquences analysée a alors été calculé par la formule:
[1-(n/N)]*100
n définissant le nombre d’OTUs comportant une seule séquence et N le nombre total de
séquences (Good, 1953).
L’indice de recouvrement ainsi calculé permet d’estimer la significativité de la diversité
bactérienne mesurée sur une échelle de 0 à 100.
La fréquence relative des différentes OTUs est aussi calculée pour chaque spécimen puis
l’homogénéité des données entre les différents spécimens est testée par un test Chi2 avec 5%
de significativité (p<0,05) (Zar, 1999).
3.1.3. Analyses phylogénétiques
Les séquences d’ARNr 16S obtenues ont été, dans un premier temps, analysées afin de
détecter la présence d’éventuelles séquences chimériques par l’intermédiaire de deux
programmes : Chimera check program (version 2.7 ; Maidak et al, 1997) et Bellerophon
(Huber et al, 2004). Seules les séquences sans aucun artefact (score inférieur à 1) ont été
incluses dans les analyses comparatives des banques de données en ligne en utilisant
différents algorithmes : BLAST (Altschul et al, 1994), FASTA3 (Pearson & Lipman, 1988) et
RDP (Cole et al, 2005). Les séquences des taxons bactériens les plus similaires ont alors été
incluses dans l’analyse et l’ensemble des séquences a été aligné à l'aide des logiciels
CLUSTALW (Thompson et al, 1994 ; www.ebi.ac.uk/clustalw) ou ARB (Ludwig et al, 2004 ;
http://www.mikro.biologie.tu-muenchen.de). Ce dernier permet un alignement plus précis en
prenant en compte l’information concernant la structure secondaire de l’ARNr 16S (Figure
26). Cette information liée à la fonction de l’ARNr 16S peut s’avérer déterminante,
notamment pour affiner la position phylogénétique d’une séquence d’un nouveau taxon
supérieur (l'ordre, la classe, le phylum). Les méthodes Neighbor-Joining avec la correction
Kimura " deux paramètres " (Kimura, 1980), Maximum de Parcimonie et Maximum de
vraisemblance (Olsen et al, 1994) ont été ensuite utilisées pour la construction d'arbres
phylogénétiques, à partir des alignements, dans le logiciel Phylip 3.6.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
54
Le calcul des bootstraps sur l’alignement a permis de tester la robustesse de la topologie sur
1000 réplicats (Felsenstein, 2002). Enfin, les arbres obtenus ont été visualisés avec le logiciel
Treeview (Page,1996).
3.1.4. Gènes fonctionnels
Outre l’ARNr 16S, certains gènes associés au métabolisme azoté (Figure 27) ont été
recherchés à partir des échantillons dans le but de confirmer le potentiel métabolique des
symbiotes.
Figure 26 : Structure secondaire de l’ARNr 16S d’Escherichia coli. Les quatre couleurs indiquent les différents domaines fonctionnels de la molécule (extrait de : http://www.nd.edu/~aseriann/rna.html).
Figure 27 : Les différentes étapes du cycle de l’azote en milieu marin avec les différents gènes fonctionnels représentatifs des enzymes impliquées (les gènes étudiés sont encadrés) (schéma de Lam P).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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L’étude s’est focalisée sur les gènes fonctionnels représentatifs (1) de l’enzyme catalysant
la réaction de nitrification (forme A de la monooxygenase de l’ammonium, gène amoA)
(Holmes et al, 1995 ; Rotthauwe et al, 1997 ; Purkhold et al, 2000) et (2) de deux autres
enzymes reconnues comme déterminantes dans le processus de dénitrification chez les
bactéries (forme S et K de la réductase du nitrite, gènes nirS et nirK ainsi que la réductase de
l’oxyde nitreux, gène nosZ) (Braker et al, 1998 ; Scala et al, 1998 ; voir aussi Encadré 1, page
19). Les amorces employées pour amplifier ces différents gènes fonctionnels par PCR sont
indiquées dans l’Annexe 2.
3.2. Etude de la distribution des bactéries par la technique de CARD-FISH
La détection des cellules procaryotes in situ a connu un développement sans précèdent
avec la technique de Fluorescent in situ hybridization (FISH) permettant la caractérisation
morphologique, le dénombrement et la localisation des populations bactériennes in situ.
(Olsen, 1986 ; Amann et al, 1990, 1995 ; Amann & Kuehl, 1998). Les séquences obtenues au
cours du séquençage de l’ARN ribosomal 16S permettent la réalisation de sondes plus ou
moins spécifiques (depuis l’embranchement jusqu’à la lignée bactérienne selon le niveau de
conservation de la région ciblée). Ces sondes sont ensuite marquées par un fluorochrome et,
après perméabilisation de la membrane des cellules actives, elles sont hybridées à l’ARNr 16S
contenu dans chacun des nombreux ribosomes, aboutissant à un signal identifiable sous un
microscope à épifluorescence (Figure 28).
Figure 28 : Principe de l’hybridation in situ avec une sonde oligonucleotidique monomarquée par un fluorochrome. Après une étape de perméabilisation, la sonde s’hybride à la séquence complémentaire présente en quantité variable dans la cellule et permet sa détection sous un microscope à épifluorescence.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
56
Toutefois, dans certaines conditions, l’efficacité de cette technique peut parfois être
largement diminuée. Ainsi, la majeure partie des bactéries présentes dans l’environnement
aquatique étant de petite taille et possédant une faible croissance en réponse à la pauvreté
nutritive du milieu (Morita, 1997), le signal spécifique émis par hybridation de telles sondes
sur ces bactéries est souvent bien inférieur au seuil requis pour leur détection. De plus, dans le
cas des systèmes symbiotiques, l’autofluorescence naturelle du tissu de l’hôte peut largement
contribuer à ces difficultés de détection en créant un fort bruit de fond dans lequel le signal
spécifique des symbiotes se trouve alors rapidement perdu (Pernthaler et al, 2002).
Pour combler cette perte d’efficacité, les oligonucléotides marqués avec la horseradish
peroxidase (HRP), une enzyme d'environ 40 KDa isolée du raifort, sont de plus en plus
utilisées comme sonde fluorescente dans la technique de FISH. En effet, la combinaison des
oligonucléotides marqués avec la HRP et du système d'amplification de signal par le
complexe Tyramide-Streptavidine (TSA) (Figure 29) conduit à un signal amplifié de plus de
20 fois comparé aux sondes mono marquées (Sekar et al, 2004). Cette méthode dite
"Catalyzed Reporter Deposition - Fluorescent In-Situ Hybridization" (CARD-FISH)
représente un outil puissant pour la détection des micro-organismes (Sekar et al, 2003). Au
cours de ce travail, pour pallier à l’autofluorescence naturelle du tissu de l’hôte, les symbiotes
bactériens ont donc été détectés au sein des tissus de Nautile à l’aide de cette technique de
CARD-FISH avec des sondes diverses (universelles ou spécifiques de certains groupes
bactériens), dans des conditions stringentes (voir Annexe 3) et en suivant une adaptation du
protocole proposé par Pernthaler et al (2002).
Figure 29 : Principe de la technique de CARD-FISH. La réaction d’amplification du signal utilise la HRP liée à la sonde oligonucleotidique pour catalyser le dépôt de tyramide marquée par un fluorophore sur la séquence complémentaire ce qui permet d’augmenter le signal spécifique et la résolution sous microscope à épifluorescence. F:Fluorophore, T:Tyramide, SA: Streptavidin, HRP : Horseadish peroxidase.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
57
Dans le but de contrôler la spécificité du signal obtenu, une sonde anti-sens
(NONEUB388) a aussi été utilisée lors de chaque hybridation. Enfin, afin d’avoir une vision
globale des cellules composant les tissus étudiés, une coloration totale du matériel génomique
a été réalisée sur chaque coupe avec du 4’,6-diamino2’phenylindole (DAPI), colorant
intercalant de l’ADN.
3.3. Quantification des bactéries par cytométrie en flux
La densité bactérienne présente dans les appendices péricardiques des Nautiloides a été
estimée par une approche semi-quantitative : la cytomètrie en flux (collaboration C. Courtis,
Observatoire de Banyuls-sur-mer). La cytomètrie en flux offre la possibilité d'analyser
plusieurs paramètres sur d'importantes populations bactériennes en solution (Servais et al,
1999). En effet, les bactéries passent une à une devant un faisceau laser d'une longueur d'onde
spécifique. Deux paramètres sont ensuite analysés par l'appareil : la diffusion lumineuse à
angle droit (SSC-H), corrélée à la taille de la bactérie et la fluorescence émise (Fl1-H) liée au
contenu des bactéries en acides nucléiques. Les tissus fixés au PFA 2%, ont été broyés, puis
centrifugés pendant 15 min à 3000 g, le surnageant a ensuite été récupéré pour être analysé.
Le liquide ponctionné dans les différents organes, fixé au PFA 2% est analysé en parallèle.
Afin de marquer le contenu en acides nucléiques des bactéries, des aliquots de 1 ml des
différents échantillons ont été colorés à l'aide de SYBR green I (colorant intercalaire des
acides nucléiques, 5 µM en solution finale).
Les analyses ont été réalisées à l'aide d'un cytomètre en flux FacsCalibur (Becton
Dickinson, San José, Ca) équipé d'un laser argon refroidi par air (488 nm, 15 mW). Des billes
fluorescentes (Polysciences Inc, Warrington, PA, diamètre 0,94 µm) ont systématiquement été
ajoutées à chaque échantillon analysé afin de normaliser la fluorescence émise (Fl1-H) et la
diffusion lumineuse à angle droit (SSC-H). Les bactéries ont pu ainsi être discriminées et
comptées selon leur SSC-H et la fluorescence liée à leur contenu en acides nucléiques
(mesurée à 530 nm ; Marie et al, 1997).
3.4. Isolement des bactéries en culture pure
Afin d’étudier la fraction « cultivable » de la diversité bactérienne associée aux
appendices péricardiques du Nautile, des isolements ont été mis en culture sur milieu artificiel
(collaboration J. Favet, Université de Genève). Une fois isolées, les souches bactériennes
pures ont été soumises à une série de tests physiologiques puis identifiées par séquençage du
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
58
gène codant pour l’ARNr 16S. Enfin, une phase de stockage à -80°C a été effectuée dans
l’attente de nouvelles analyses.
L’isolement sur milieu de culture artificiel peut fournir un matériel intéressant dans le
but d’étudier les interactions existant entre les différentes souches associées aux appendices
péricardiques de Nautile (compétition, amensalisme…). Ces interactions peuvent être
influencées par la quantité de nourriture disponible mais aussi par la production de substances
bioactives par les bactéries.
Certains exemples de relations d’amensalisme impliquent une production microbienne
de composés organiques spécifiques (Encadré 5, page 59) qui peuvent notamment causer des
ruptures dans la paroi cellulaire ou la membrane plasmique des autres colonisateurs (Walls et
al, 1993 ; James et al, 1996). Ce type d’activité physiologique, déjà observée dans de
nombreuses associations bactériennes chez les invertébrés marins (Barbieri et al, 2001 ;
Hentschel et al, 2001), peut être impliquée dans la protection des tissus de l’hôte contre des
agents pathogènes potentiels (Gram et al, 1999 ; Gomez-Gil et al, 2000) ou encore dans la
sélection des bactéries actives dans la compétition pour l’espace vital (Holmström et al,
1992). La découverte et la caractérisation de ces nouvelles substances bioactives permet, par
ailleurs, la création de nouveaux champs de recherche à forte valeur biotechnologique
(Holmström & Kjelleberg, 1999 ; voir Encadré 5, page 59).
Dans le but d’évaluer le potentiel antimicrobien des souches isolées du Nautile, un test
issu de la méthode de double couche, modifiée de Schilinger & Lucke (1989), a été
développée en collaboration avec l’UMR 5154 Chimie et Biochimie des Substances
Naturelles (MNHN).
3.5. Screening des souches à activité antimicrobienne et caractérisation des substances
bioactives
3.5.1. Détection des activités antimicrobiennes
Le principe du test consiste à inoculer par piqûre les souches isolées de Nautile sur un film
homogène de micro-organismes de référence en croissance. Un disque d'antibiotique est
ensuite ajouté sur chaque boîte de test comme contrôle positif. Puis l’activité antimicrobienne
est mesurée par l’intermédiaire du diamètre d’inhibition formé par chaque souche après
incubation du milieu test pendant 24 à 48 h à 24°C. Ce protocole fait l’objet d’une description
plus détaillée dans le Chapitre III.4.4 (voir l’article page 117).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
59
Encadré 5 : Les interactions microbiennes, source de substances bio-actives
Certaines interactions impliquant des micro-organismes entraînent la production de composés spécifiques qui peuvent inhiber ou tuer un organisme qui y est sensible (amensalisme, compétition…). Un exemple classique concerne la relation mutualiste entre la fourmi Attine (Acromyrmex) et une bactérie filamenteuse (streptomycète). En effet, grâce à la production d’un antibiotique, cette bactérie filamenteuse contrôle Escovopsis, un mycète parasite persistant qui peut détruire le jardin fongique des fourmis (Currie, 2001 ; Poulsen et al, 2005 ; Figure 30).
Les micro-organismes peuvent empêcher la prolifération non contrôlée de microbes
étrangers en produisant des protéines et peptides antimicrobiens d’une grande diversité de structures et de modes d’action (pour revue consulter Yeaman &Yount, 2003). Certaines de ces molécules causent des ruptures dans la paroi cellulaire ou la membrane plasmique des bactéries et entraînent leur mort. C’est notamment le cas des bactériocines qui sont synthétisées selon la voie de biosynthèse ribosomique et sont généralement létales pour des espèces bactériennes voisines (Klaenhammer, 1988). Elles avantagent ainsi les cellules productrices par rapport aux autres bactéries. La plupart des bactériocines qui ont été identifiées sont des protéines et sont produites par des bactéries Gram-négatives (Klaenhammer, 1993). Les travaux récents s’intéressent de plus en plus à ces substances en réponse au développement croissant des résistances. En effet, comme des milliers de tonnes d’antibiotiques sont utilisés dans le traitement de maladies, mais aussi comme additifs dans la nourriture du bétail, un nombre croissant de maladies résistent aux traitements suite à la propagation d’une résistance à ces substances. Cette augmentation de la résistance aux antibiotiques est un problème d’avenir et les microbiologistes se doivent donc de trouver de nouvelles solutions. Pour beaucoup d’entre eux, le fourmillement de vie microbienne océanique et plus particulièrement les bactéries associées aux invertébrés marins, représente une source de nouveaux métabolites bioactifs d’une incroyable richesse (Thakur et al, 2002), notamment pour certaines toxines qui ne se trouvent pas chez les micro-organismes terrestres. Seul un faible pourcentage de ces symbiotes bactériens a été étudié jusqu’ici pour leur potentiel antimicrobien. Les premiers travaux ont permis de découvrir divers composés exposant une grande variété de structures chimiques et d’activités biologiques (Austin, 1989 ; Faulkner, 1993) ouvrant ainsi un champ de recherche prometteur pour l’avenir (Holmström & Kjelleberg, 1999). Parmi les découvertes récentes, on peut citer la didemnine B, un puissant antiviral isolé du genre Prochloron.
A B
Figure 30 : A : Schéma décrivant l’emploi par des fourmis attines de streptomycètes producteurs d’antibiotique pour contrôler les mycètes parasites dans leur jardin fongique B : Production d’antibiotique et inhibition de croissance d’une bactérie sensible sur un milieu gélosé (extrait de Prescott et al, 2003).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
60
Lors de ce travail, ce test a été réalisé entre les différentes souches isolées et contre
différents micro-organismes de référence : Escherichia coli 363 (collection du laboratoire de
Chimie et Biochimie des Substances Naturelles), Vibrio harveyi CIP 103192, Candida
albicans (collection du laboratoire de Chimie et Biochimie des Substances Naturelles) et
Micrococcus luteus CIP 5345. Un protocole a ensuite été développé dans le but de caractériser
les substances antimicrobiennes produites par les souches actives isolées des Nautiles
3.5.2. Extraction, concentration et caractérisation des substances bioactives
Le protocole mis en place lors de cette étude (Figure 32) utilise la comparaison des
cultures bactériennes incubées à 28 et 38°C afin de ne purifier que les composés actifs
(Annexe 4 et 5). Les peptides antimicrobiens étant la plupart du temps des composés
hydrophobes (Tossi & Sandri, 2002), une purification a été réalisée sur la base des propriétés
hydrophobes des molécules à l’aide d’une colonne de phase inverse suivie d’une
concentration par évaporation rotative (Annexe 6) puis d’une séparation par chromatographie
liquide à haute performance (HPLC) (Annexe 7). L’isolement a été bio guidé par la mesure de
l’activité antimicrobienne des fractions de purification (voir ChapitreIII.3.5.1, ci-dessus et
page 58, Annexe 5) et une première caractérisation des composés actifs a ensuite été réalisée
en spectrométrie de masse simple (MS) et spectrométrie de masse en tandem (MS-MS)
(Annexe 8).
Figure 31 : A : Principe des tests antimicrobiens réalisés par analyse de diffusion sur Agar B : illustration d’un test antimicrobien réalisé contre M. luteus
A B
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
61
Figure 32 : Les différentes étapes du protocole menant à la caractérisation des substances actives produites par les souches bactériennes isolées de Nautile
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
62
3.6. Etude du métabolisme du complexe symbiotique par la méthode d’incubations et
analyses isotopiques
L’étude des aspects fonctionnels des micro-organismes est longtemps restée limitée aux
souches isolées en culture pure. Dans ce contexte, l'utilisation de traceurs isotopiques a
récemment fourni une approche puissante pour évaluer les capacités métaboliques de
populations bactériennes non cultivées (Boschker & Middelburg, 2002 ; Kuypers et al, 2005).
Cette approche consiste à maintenir les populations bactériennes étudiées dans un milieu
d’incubation avec un traceur isotopique (15N, 13C…) en concentration connue. Après un temps
d’incubation donné, l’analyse du milieu en spectrométrie de masse permet de déterminer
l’assimilation mais aussi la transformation du traceur isotopique par les populations
bactériennes et donc de préciser leur métabolisme (Dalsgaard et al, 2003).
Dans le cadre de cette étude (collaboration avec G. Lavick, Institut Max Plank de
Bremen), un protocole consistant à incuber le complexe symbiotique organe-bactéries dans de
l’eau de mer stérile contenant différents composés (ammonium, nitrate) marqués à l’aide du
traceur isotopiques N15, a ainsi été développé (Figure 33).
Deux lots d’expériences ont ainsi été réalisés en conditions hypoxiques (O2<20µM) afin
de préciser les capacités métaboliques des bactéries symbiotiques. Lors de chaque expérience
un contrôle négatif a été réalisé à l’aide d’un organe bouilli puis incubé dans les mêmes
conditions. Deux types d’analyses ont alors été réalisées sur les échantillons incubés.
• Analyse en spectrométrie de masse afin de mesurer le gaz 15N2 produit par les
bactéries
Figure 33 : Protocole suivi pour les incubations isotopiques du complexe symbiotique bactéries- organe excréteur de Nautile.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
63
• Analyse des concentrations totales de NO3- et NO2
- à l’aide de la réaction de réduction
du Vanadium Chloride (« chemiluminescence », Braman & Hendrix, 1989) afin de
mesurer l’assimilation des composés azotés par les bactéries.
Ces analyses doivent ainsi permettre de tester l’hypothèse d’une implication des
symbiotes dans le métabolisme azoté du Nautile (Schipp, 1990) et plus particulièrement dans
la transformation de ses déchets azotés en diazote (Boucher-Rodoni & Mangold, 1994).
3.7. Co-culture des cellules de Nautile et bactéries associées
Malgré le développement des techniques moléculaires, l'absence de cultures pures
présente aujourd’hui encore un défi sérieux dans l’étude de l’écologie des bactéries
symbiotiques. L’isolement et la maintenance de ces micro-organismes sur milieu artificiel
peuvent permettre une compréhension plus complète de leur physiologie et des processus
complexes dans lesquels ils sont engagés (Zengler et al, 2002). Récemment, plusieurs auteurs
ont montré que des micro-organismes précédemment reconnus comme
« incultivables » pouvaient être cultivés en culture pure en présence des composants
chimiques de leur environnement. (Kaberlein et al, 2002 ; Rappé et al, 2002). De la même
manière, le maintien de bactéries symbiotiques en culture paraît envisageable grâce aux
facteurs de croissance présents dans le tissu hôte. Lors de cette étude, un protocole de mise en
culture et maintenance des cellules d’appendices péricardiques de Nautile, a été développé
(collaboration I. Domart–Coulon, UMR 5178 BOME, MNHN) afin d’étudier les interactions
pouvant exister entre les bactéries symbiotiques et leur hôte au niveau cellulaire. Ce protocole
fait l’objet d’une description plus détaillée dans le Chapitre III.4.2 (voir l’article page 97).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
64
4. Résultats
4.1. Mise en évidence et caractérisation d’une double symbiose dans les organes
excréteurs de N. macromphalus
Article: Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of Nautilus macromphalus
(Cephalopoda:Nautiloidea).
Pernice, M., Wetzel, S., Gros, O., Boucher-Rodoni, R., Dubilier, N.
Article à soumettre
La définition d’un système symbiotique passe par l’identification de la diversité
bactérienne associée mais aussi par l’étude de son intégration, sa persistance et de son
fonctionnement au sein même de l’organe hôte. Ainsi, l’étude du rôle des bactéries et de leurs
interactions symbiotiques doit bénéficier des connaissances sur la physiologie de l’hôte. Les
nombreux villis composant les appendices péricardiques du Nautile, collectent le sang et
sécrètent un liquide d’excrétion. Ce liquide d’excrétion acide et riche en ammonium (jusqu'à
200 ppm, Schipp & Martin, 1987) est finalement rejeté dans la cavité de palléale par
l’intermédiaire du coelome péricardique. Chaque villus constitue de plus une unité
d’excrétion à part entière organisée en trois grandes structures fonctionnelles (Schipp et al,
1985, voir Chapitre II.3.3.2, et Figure 21, page 43).
Les objectifs de cette étude consistaient donc, d’une part à identifier les symbiotes
bactériens associés aux appendices péricardiques de Nautilus macromphalus afin de préciser
leur spécificité vis-à-vis de ce système et leur histoire évolutive. D’autre part l’analyse de leur
répartition spatiale devait permettre de tester l’hypothèse d’une structuration des populations
symbiotiques en fonction de l’organisation fonctionnelle de l’organe hôte. Les symbiotes
bactériens ont donc été identifiés par séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S et leur
distribution spatiale a été déterminée en relation avec la structure fonctionnelle de l’organe
par hybridation de sondes spécifiques (CARD-FISH) et analyse des tissus en microscopie
électronique à transmission (MET).
L’étude a permis de confirmer l’existence d’une importante densité de bactéries associées
aux appendices péricardiques de N. macromphalus. Contrairement aux précédentes
observations en microscopie électronique qui avaient suggéré la présence d’un seul groupe
bactérien (Schipp et al, 1990), l’emploi des techniques moléculaires a prouvé que la
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
65
population bactérienne est composée de deux phylotypes (beta protéobactéries et spirochètes).
L’hybridation de sondes spécifiques par CARD-FISH parallèlement à l’analyse en MET a
confirmé le statut symbiotique ainsi que la forte structuration de la population bactérienne
avec deux niveaux d’organisation présents au sein de l’organe hôte :
• Un premier niveau d’organisation générale étroitement lié à la structure fonctionnelle
de l’organe avec une concentration des symbiotes dans la région baso-médiane des
villi (fonctions d’ultrafiltration et de réabsorption) et leur absence totale de la partie
apicale (fonction de sécrétion)
• Un deuxième niveau d’organisation interspécifique qui semble lié aux contraintes
biotiques et à l’écologie au sein de ce « microécosystème » avec une prédominance
des beta protéobactéries dans les cavités profondes des villis et une présence des
spirochètes plus en périphérie.
Enfin, l’importante distance génétique des deux symbiotes vis-à-vis des souches
référencées dans les banques de données témoigne de leur spécificité vis-à-vis de N.
macromphalus et suggère l’hypothèse d’une co-évolution hôte-bactéries.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
66
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
67
Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of
Nautilus macromphalus (Cephalopoda:Nautiloidea)
PERNICE Mathieu a,*, WETZEL Silke b, GROS Olivier c, BOUCHER-RODONI Renata a,
DUBILIER Nicole b
Affiliations:
a UMR 5178 Biologie des Organismes Marins et Ecosystèmes, Département Peuplements et
Milieux Aquatiques, Muséum National d’Histoire Naturelle, 55 rue Buffon, 75005 Paris,
France. b Max Planck Institute for Marine Microbiology, Bremen, Germany. c UMR 7138 Systématique, Adaptation, Evolution, Département de Biologie, Université des
Antilles et de la Guyane B. P. 592, 97159 Pointe à Pitre Cedex, Guadeloupe, France.
KEYWORDS: Bacteria-host interaction; 16S rRNA gene; Cephalopods; Nautilus
macromphalus; Excretion
* Corresponding author: PERNICE Mathieu
Muséum National d’Histoire Naturelle. Département Peuplements et Milieux Aquatiques,
Biologie des organismes marins et Ecosystèmes (UMR 5178 CNRS). 55 rue Buffon, 75005
Paris, France.
Tel. : +331 40 79 30 97.
Fax. : +331 40 79 57 34.
Email : [email protected]
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
68
INTRODUCTION
It is now well accepted that symbiosis is a pivotal component in the existence of many
animals and plants by providing various indispensable functions. The acquisition and
maintenance of one or more organisms by another often leads to novel structure and
metabolism. Hence, the study of pioneering symbiotic systems has resulted in many exciting
discoveries such as the role of symbiotic bacteria in the morphegenesis of luminescent light
organ in a squid (Euprymna scolopes/Vibrio Fisheri association; McFall-Ngai and Ruby,
2000) or in the achievement of sulphur cycle in an oligochaete worm (Olavius algarvensis
with its sulphur oxidizing and sulphur reducing symbionts; Dubilier et al, 2001). But
symbiotic systems are in reality more fluid and less linear than categorization into mutualism,
parasitism and commensalism (Douglas, 1994). Such complexity often causes difficulties in
addressing new symbiotic systems and more particularly in the identification of the partners
involved, the examination of their specificity and the elucidation of their functional roles
(Graf et al, 2006).
The evolutionary history of both partners is also a major component of the symbiotic
relation, symbiosis being an important driving force of metazoan evolution (McFall-Ngai,
2002). Therefore, the study of symbiotic associations in ancient lineages might provide
further insight into the origin of major physiological adaptations. In this respect, the symbiotic
associations in the excretory organs of the “living fossils” Nautiluses (Schipp et al, 1985) are
of particular interest, Nautiluses being of Cambrian origin (542-500 mya). They are also the
only extant cephalopods with an external chambered shell (filled with about 90% of Nitrogen
gas) resembling that of extinct ammonoids (fig 1A) (Norman, 2000). A better comprehension
of their life history, behaviour, ecology, physiology and metabolism has been suggested by
many authors as a mean of understanding the success and eventual demise of the ammonoids
(Boutilier et al, 1996; Staples et al, 2000).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
69
Conversely to other extant Cephalopods in which various organs undertake the
excretory function, in Nautilus, only pericardial appendages assume most of the three
excretory processes (ultrafiltration, reabsorption and secretion) (Martin, 1983). The main end
product of excretion is ammonia (Boucher-Rodoni, 1989) and the numerous contractile villi
forming the four pericardial appendages collect the blood from capacious sinuses (Fig 1B)
and secrete the acid ammonia rich excretory fluid (up to 200 ppm, Schipp and Martin, 1987)
in the pericardial coelom to be finally rejected in the mantle cavity (fig 1A) (Mangold et al,
1989). Nautilus pericardial appendages bacteria were described and characterized as
Pseudomonodales by isolation on artificial culture media. (Schipp et al, 1990). However,
since this previous study, it has been widely acknowledged that cultivating methods reveal
only a small fraction of the total bacterial diversity (Amann et al, 1990, Pace 1997). Indeed,
molecular approach has shown an unexpected microbial diversity suggesting potential
multiple partners’ interaction in N. macromphalus pericardial appendages (Pernice et al.,
2006). The presence of bacteria in pericardial appendages, an ecological niche rich in
ammonia, has raised several hypothesis concerning their potential implication in Nautilus
Nitrogen metabolism such as (i) a putative detoxification by oxidizing ammonia (Schipp et al,
1990) or (ii) the use of nitrogenous wastes by bacteria to produce the Nitrogen gas filling
Nautilus shell and involved in its neutral buoyancy (Boucher-Rodoni and Mangold, 1994).
The aim of the present study was thus to define Nautilus macromphalus
(Cephalopoda: Nautiloidea) excretory organs as a new symbiotic system. The phylogenetic
position of bacteria associated to the pericardial appendages was investigated by 16S rRNA
gene analysis and their localization within the cellular structure of the organ was determined
by Fluorescent in situ hybridization (CARD-FISH) and transmission electron microscopy
(TEM). The specificity of this bacterial-invertebrate interaction and its possible implications
in Nautilus metabolism are discussed.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
70
MATERIALS AND METHODS
Specimens’ collection
Four Nautilus macromphalus individuals were collected on the outer shelf of New-
Caledonia in september 2005. All specimens were dissected aseptically and for each specimen
the four pericardial appendages were processed as follows: two organs were divided in two,
one part was immediately frozen in liquid Nitrogen and stored at -80°C for DNA extraction
and the other fixed in 2% paraformaldehyde for CARD-FISH (see below). The two last
pericardial appenages were fixed for transmission electron microscopy (see below).
Transmission electron microscopy
Pericardial appendages pieces from 4 individuals were fixed at 4°C for 12h in a
fixative solution containing 3.2 % glutaraldehyde in sterile sea water (pH 7.4) and washed in
0.05% of NaN3 in sterile sea water (pH 7.4). After a brief rinse in 0.1M pH 7.2 caccodylate
buffer, adjusted to 900 mOsM with NaCl and CaCl2 in order to improve membrane
preservation, samples were fixed 45 minutes in 1% osmium tetroxide at room temperature,
then rinsed in distilled water, and post-fixed with 2% aqueous uranyl acetate for one more
hour before embedding in epon-araldite. Semithin sections (0,5µm thick) and ultra-thin
sections (60nm thick) were obtained using an Ultracut E microtome (LEICA). Transmission
electron microscopy observations were performed on a Philips 201 operated at 75 kV
accelerating voltage.
DNA extraction
DNA was extracted from Pericardial Appendages (PA) of 4 Nautilus, by the method
described by Zhou et al. (1996) by using proteinase K for cell digestion and a standard
chloroform-isoamyl alcohol extraction procedure. DNA was precipitated in isopropanol,
washed with 70 % ethanol, resuspended in 1X TE buffer, and stored in aliquots at -20°C prior
to 16S rRNA gene amplification and sequence analysis.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
71
16S rRNA gene PCR amplification
Bacterial 16S rRNA gene PCR amplification was performed using GM3 (5'-
AGAGTTTGATCMTGGC-3') and GM4 (5'-TACCTTGTTACGACTT-3') bacterial primers
(respectively Escherichia coli position 8 to 23 and 1492 to 1477) (Muyzer et al, 1995). The
reaction mixture contained 50 pmol of each primer, 6 µg of bovine serum albumin, 2.5 µmol
of each of deoxynucleoside triphosphate, 1X SuperTaq buffer and 0.2 U of eppendorf Master
Taq (Eppendorf, Hamburg, Germany) and the volume was adjusted with sterile water to 20
µl. PCR were conducted in a thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Germany) with an initial
denaturing step (96 °C for 5 min) followed by 25 cycles of 94 °C for 1 min, 45 °C for 1 min
and 72 °C for 3 min and a final elongation step at 72 °C for 5 min. PCR bias was minimized
by using only 25 amplification cycles (Duperron et al, 2005) and pooling four separate PCRs
for each Nautilus. Amplified DNA was checked by 1.5% agarose gel electrophoresis and
purified with a QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany).
Cloning and sequencing
A 16S rRNA clone library was constructed for each of the 4 Nautilus. Purified PCR
products were cloned by insertion into plasmid vector PCR4 TOPO TA Cloning (Invitrogen,
Carlsbad, Calif.) following the manufacturer’s instructions. Positive clones were grown
overnight in Luria-Bertani medium and the insert of Escherichia coli colonies was amplified
by a 35 cycles PCR using M13F and M13R primers. The reaction mixture contained 50 pmol
of each primer, 6 µg of bovine serum albumin, 2.5 µmol of each deoxynucleoside
triphosphate, 1X SuperTaq buffer, 1X Enhancer and 0.2 U of eppendorf Master Taq
(Eppendorf, Hamburg, Germany) and the volume was adjusted with sterile water to 20 µl.
The size of PCR products was controlled by 1.5% agarose gel electrophoresis.
For each of the 4 individuals, 87 to 105 clones were sequenced partially in a variable
region of the 16S rRNA (E. coli positions 518 to ca. 1,000). After contig assembly and
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
72
alignment with Sequencher 4.5 (Gene Codes Corporation, Michigan), putative Chimeric
sequences were eliminated by checking with Bellerophon (Huber et al., 2004). A total of 81
representative clones were fully sequenced in both directions. Sequencing reactions were
performed by using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit from Applied Biosystems
on the ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Calif.).
Phylogenetic reconstruction
Sequences were compared to various databases by using BLAST (Altschul et al, 1994),
FASTA (Pearson and Lipman, 1988) and RDP (Cole et al., 2005), highly similar sequences
were included in the analysis. The sequence data were analyzed using the ARB software
package (Ludwig et al, 2004; www.arb-home.de) and assigned to a database of approximately
40000 16S rRNA sequences. Only sequences >1300 nt were used for alignment and tree
construction. Sequences alignment was performed according to the 16S rRNA secondary
structure with the Integrated Editor and then corrected manually. Preliminary analysis of 35
full sequences of Nautilus symbionts was performed by quick parsimony methods integrated
to ARB to select an appropriate data set. Finally, phylogenetic trees were then reconstructed
using Maximum-Parsimony (Sanderson, 1990), and Maximum-Likelihood (Olsen, et al 1994)
analyses with different filter sets (none, termini, eubacteria, β−proteobacteria). Bootstrap
analyses (1000 replicates) were performed for both analyses to test the robustness for each
topology.
CARD-FISH
Nautilus PAs from 4 specimens were fixed for CARD-FISH in 2% formaldehyde in
sterile seawater at 4°C for 4 h. After two washes in 1X phosphate buffered saline (PBS:10mM
sodium phosphate, 130 mM NaCl), samples were stored at -20°C in 0.5X phosphate-buffered
saline–50% ethanol (1:1). Fixed PAs were dehydrated in an increasing series of ethanol and
xylene before being embedded into paraffin. Histological sections (4 µm) were collected on
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
73
gelatine coated slides. Paraffin was removed from the sections with xylene (three 10-min
treatments), and the sections were rehydrated in a decreasing ethanol series. Hybridization
was performed in preheated chambers containing tissue wetted with hybridization buffer (0.9
M NaCl, 0.02 M Tris-HCl, 0.01% SDS, 1% blocking reagent, 10% Dextran sulphate, 35%
formamide). The sections were covered with a mixture containing 50 ng of HRP-probe in 150
µl of hybridization buffer and then hybridized as described by Pernthaler et al. (2002). The
slides were washed with 1X PBS for 10 min, MilliQ water for 1 min, 96% ethanol for 1 min,
air dried, and covered with an antibleaching agent (e.g. Citifluor AF1, Citifluor Ldt, London)
amended with DAPI (final concentration 1µg/ml) and a coverslip. A total of about 120 PA
sections obtained from 4 Nautilus were visually examined for differences in symbiont’s
repartition and relative abundance by using a DMLB epifluorescence microscope (Leica
Microsystèmes SAS, France).
A specific probes was designed for each of the two 16S rRNA phylotypes found in
Nautilus macromphalus by using the PROBE_DESIGN function of ARB and the 16S rRNA
accessibility information provided by Behrens et al. (2003). The specificity was checked by
using BLAST (Altschul et al., 1994). The probe specific for the β−proteobacteria symbiont,
NauBet66 (5’-AAGCTTCTCTCGTTCCG-3’) was revealed with Alexa488 (Invitrogen,
Carlsbad, Calif) and the probe specific for the spirochete symbionts and NauSpiro255 (5’-
TGGTACGCTCTTACCCTA-3’), was revealed with Alexa546 (Invitrogen, Carlsbad, Calif).
The stringency conditions were evaluated with a gradient of formamide (10-50%). Thirty five
percent of formamide gave the optimal images (high specific signal and low background
fluorescence) and was chosen for all hybridizations. The general Bacteria probe EUB338
(Amann et al., 1990) was used as a positive control, and the NON338 (Wallner et al., 1993)
probe was used as a negative control.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
74
RESULTS
Bacterial diversity and phylogeny
Comparative bacterial 16S rRNA gene sequence analysis of a total of 385 partially
sequenced and 81 fully sequenced clones from four Nautilus macromphalus pericardial
appendages revealed two distinct bacterial phylotypes (Table 1) with a low sequence variation
within each phylotype (0 to 0,4%). Phylogenetic analysis by using Parsimony and Maximum-
likelihood with a variety of data sets (Fig. 2) clustered the two phylotypes within two
phylogenetic distinct bacterial groups, respectively β−Proteobacteria and Spirochaeta. But
the bacterial phylotypes associated to N. macromphalus are not closely related to symbionts
from other hosts species or of free-living bacteria (<90% in 16S rRNA gene sequence
similarity) and they appear thus to be specific to their host. .
N. macromphalus β−proteobacteria symbiont is phylogentically associated to a clade
of free-living, ammonia-oxidizing bacteria from the family Nitrosomonads with Nitrosospria
multiformis and Nitrosospira briensis [Teske et al, 1994] as its closest relatives (respectively
87.5 and 87.4% identity). This phylogenetic affiliation is not clearly supported by bootstrap
values (<60%), but remained stable after the application of different tree-building algorithms
(Maximum of parcimony and Maximum likelihood) with different filter sets supporting its
relevance (Hillis and Bull, 1993).
The 16S rRNA sequence of the N. macromphalus spirochete symbiont belongs to a
monophyletic group including free-living spirochetes and gutless oligochaetes
endosymbionts. Inside this group, it forms a highly supported clade (bootstrap value >99%
with all treeing methods) with two free living strains: Spirochaeta bajacaliforniensis [Magot
et al, 1997] and Spirochaeta smaragdinae [Fracek et al, 1985] (respectively 89.8 and 89.3%
identity).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
75
In situ identification
Examination of pericardial appendage longitudinal section hybridized with the
universal Eub388 probe confirmed the presence of associated bacteria in the baso-medial
region of N. macromphalus pericardial villi whereas the apical part of these villi was devoided
of any bacteria (Fig. 3A). Hybridization by using specific probes established the coexistence
of the two ectosymbiotic bacterial phylotypes in all examined specimens (Fig. 3B). The probe
specific to the β−proteobacteria related sequence (NauBet66) revealed a thin, rod shaped
bacteria distributed in both the peripheric as well as the invaginated epithelial areas (Fig 3C
and D). The NauSpiro255 probe specific to the spirochete related symbiont hybridized a small
coccoid bacteria generally assigned to peripheric areas, deeply associated to the pericardial
epithelium (Fig. 3C and D). A nonquantitative, visual comparison of pericardial appendages
from the 4 N. macromphalus specimens revealed similarly the coexistence and distribution of
the two symbiont phylotypes in most of the 120 sections examined. The hybridization patterns
of the probes specific to the β−proeteobacteria and spirochete symbionts of N. macromphalus,
corresponded to those from the general eubacterial probe Eub388.
Transmission electron microscopy
Ultrastructural observations of pericardial villi in the baso-medial region showed an epithelial
layer of excretory cells (Fig. 4A and B) filled with a branched lacunar system. This epithelium
was characterized by polar organization with (i) “labyrinth structures” characteristic of active
transporters abutting blood lacunae in the basal part, (ii) high content of mitochondria in the
medial part (Fig. 4C) and (iii) an apical border of high microvilli (Fig. 4A and B). Higher
magnification confirmed a high density of extracellular bacteria associated to the actual
microvilli with the coexistence of, at least, two bacterial morphotypes (Fig. 4D). In almost all
the tissue sections examined, the coccoid shaped bacterium (1.53±0.20 µm by 0.8±0.07 µm)
was reported basally within the microvilli (Fig. 4E) while the rod shaped bacterium
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
76
(0.23±0.06 µm by 2.2±0.39 µm) appeared more apically attached by fine filamentous material
to these microvilli (Fig. 4F).
DISCUSSION AND CONCLUSION
Cephalopods are known to be ammonotelic, (i.e) more than 70% of their Nitrogen
metabolic wastes are rejected as ammonia (Boucher-Rodoni, 1989). Transformation of the
waste products of Nitrogen metabolism in relation to buoyancy appears to be one of the major
adaptations to life-style and environmental changes during the course of evolution of
cephalopods (Denton, 1974; Boucher-Rodoni and Mangold, 1994). Here, we report that N.
macromphalus harbors a high density of β−proteobacteria and spirochete phylotypes in its
pericardial appendages, organs assuming most of the excretory processes. While it is now
well accepted that symbioses for recycling nitrogenous wastes products have evolved in a
number of terrestrial invertebrates lineages (Cochran, 1985; Sasaki et al, 1996, Van borm et
al, 2002, Schramm et al, 2003) such symbioses have never been found among marine
invertebrates, so far. The N. macromphalus bacterial symbiotic association reported here is
thus the first evidence that such association can exist among marine invertebrates. It concerns
a highly specialized organ, unique among cephalopods, and assuming most of the excretory
processes. The bacteria associated to the pericardial appendages are not closely related to any
known bacteria and appear to be specific to N. macromphalus host. In addition, the
β−proteobacteria related symbionts are phylogenetically affiliated to Nitrosomonads, an
ammonia oxidizing lineage that have never been, to our knowledge, shown to enter
associations with animals.
The exact mechanisms by which the symbionts are involved in N. macromphalus
excretion remain to be studied. However, these bacteria must be implied in such a symbiotic
function for several reasons: (i) the attachment and concentration of symbionts to the outer
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
77
epithelium in the baso-medial region of pericardial villi suggest that they could be active in
the ultrafiltration and reabsorption processes (Fig. 3A); (ii) the ultrastructure of this outer
epithelium and its polar organization are characteristic of an energy requiring, transport active
tissue (Martin, 1983, Fig. 4A and B); (iii) the β−proteobacteria symbionts are
phylogenetically related to ammonia oxidizing bacteria from Nitrosomonads radiation (Fig.
2), a bacterial group able to convert ammonia to nitrite (Hooper et al, 1997). Nevertheless,
although it has been inferred that any 16S rRNA gene sequence that falls within
Nitrosomonads radiation was originally carried by ammonia oxidizing bacteria (Kowalchuck
and Stephen, 2001), it is now well accepted that 16S rRNA gene might not be sufficient as
single molecular marker to assume bacterial metabolic capabilities and to finely investigate
close phylogenetic relations (Rotthauwe et al, 1997; Duperron et al, 2006). In this respect, the
amoA gene coding for the alpha-unit of ammonia monooxygenase could be much more
informative as it contains a greater level of sequence variation (Kowalchuck and Stephen,
2001). Preliminary attempts to amplify this gene by using several set of primers (Holmes et al,
1995; Rotthauwe et al., 1997; Purkhold et al, 2000) didn’t allow us to confirm the presence of
this gene among the N. macromphalus symbiotic population (Pernice, unpublished data).
Spirochetes are widespread in several environments, either as free living cells, mainly
in marine and limnic sediments, or host associated as commensals or parasites of animals and
humans (Dubilier et al, 1999; Cabello et al, 2001; Prescott et al, 2003; Dröge et al, 2006). By
comparison of 16S rRNA gene sequence, one of the closest relative to N. macromphalus
spirochete symbionts is Spirochaeta smaragdinae, a free living, obligate anaerobe that
ferment carbohydrates (Magot et al, 1997), suggesting fermentation as one possible metabolic
pathway of the N. macromphalus spirochetes. However, these symbionts could also have a
completely different metabolism, just as the spirochete symbionts in termites do not have
properties of their closest free-living relatives, but, interestingly, are involved in the Nitrogen
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
78
nutrition of their host by the recycling of excretory Nitrogen (Breznak, 2002) and the
acquisition of new Nitrogen through N2 fixation (Tayasu et al, 1994; Breznak et al, 2001).
Further investigations are then needed to understand the exact functions by which the
β−proteobacteria and spirochete symbionts are involved in N. macromphalus excretion. This
may include the use of 15N tracer experiments coupled with multiple-isotope imaging mass
spectrometry (MIMS) in order to measure the assimilation of various Nitrogen compounds by
symbionts directly in N. macromphalus pericardial appendages tissue at a cellular scale
(Luyten et al, 2006).
An interesting future direction concerning N. macromphalus symbiosis will be the
understanding of key factors that contribute to the distribution patterns inside pericardial
appendages of β−proteobacteria and spirochete symbionts. Indeed, even if some TEM
observations allowed to reveal some spirochetes symbionts in the cavities of pericardial
appendages, the predominance of the β−proteobacteria symbionts in these regions was clearly
observed in CARD-FISH (Fig. 3 B, C, D). This spatial distribution allows to consider the N.
macromphalus pericardial appendages as a micro-ecosystem harboring two bacterial species
that have established their own ecological niche. Additional examination of N. macromphalus
pericardial appendages by combining CARD-FISH with microsensor technology will thus
permit us to inspect the relative distribution of β−proteobacteria and spirochete symbionts
with respect to the microscale gradients of key factors such as oxygen, ammonia, nitrite and
nitrate (De Beer et al, 1997).
Finally, symbiosis being an important driving force of metazoan evolution (McFall-
Ngai, 2002), it would be of great interest to explore the N. macromphalus dual symbiosis
from an evolutionnary point of view to apprehend where and when this symbiosis evolved.
In this respect, according to the most reliable rate of base substitution in the 16S rRNA gene
for prokaryotes (1% per 50 MA; Ochman and Wilson, 1987, Moran et al, 1993; Dröge et al,
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
79
2006), the large genetic distance (>10%) observed in comparative 16S rRNA gene analysis
can lead to speculate (i) that the last common ancestors to N. macromphalus symbionts must
have existed earlier than 500 MA ago (515 to 630 mya) and (ii) that the diversification of
these symbionts may have started with the acquisition by the common ancestor of Nautiloidea
(cambrian origin: 542 to 500 mya). In congruence with these results, preliminary comparison
to 16S rRNA gene sequences obtained from Nautilus pompilius specimens collected in
Philippines (Pernice et al, in prep), showed that N. macromphalus and N. pompilius, share
highly similar symbiont phylotypes (>99,5% identity), supporting that this symbiosis is
independent of geographic or environmental factors and could be widespread among Nautilus
species.
Acknowledgments
We thank the Aquarium and the centre IRD of Nouméa for their help in providing Nautilus
macromphalus specimens from New-Caledonia. We are grateful to those who commented on
the presentation of the study at the 5th ISS meeting in Vienna and to the “Service de
Microscopie Electronique” of the “IFR Biologie Intégrative” for the electron microscope
supply. P. M. was granted by the French Ministry for National Education and Research and
by the Max Planck Institute for Marine Microbiology with a Fellowship EST Marie Curie.
This work was supported by the Max Planck society, University Pierre-et-Marie Curie,
Muséum National d’Histoire Naturelle and CNRS (UMR5178).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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Table 1: Number of partial (from nucleotide 518 to nucleotide ca.1,000 based on E. coli
numbering) and nearly full 16S rRNA gene sequences (ca.1,450 nucleotides) obtained from
cloned PCR products amplified from Pericardial Appendage DNA of four Nautilus
macromphalus specimens.
Number of partial sequences Number of full sequences
Specimen source β-Proteobacteria Spirochaeta Total β-Proteobacteria Spirochaeta Total
N1 49 54 103 14 8 22
N2 52 35 87 13 7 20
N3 76 29 105 12 6 18
N4 68 21 89 13 8 21
Total 245 139 384 52 29 81
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
88
Figure1: The major morphological components of the shell and the central circulatory system
of Nautilus macromphalus.
A: Diagrammatic scheme of a longitudinal section of Nautilus (modified from Martin, 1983;
Ward, 1988; Mangold et al, 1989).
B: Simplified diagram of the excretory system and associated circulatory structures of
Nautilus.
A BV, afferent branchial vein; D A, dorsal aorta; E BV, efferent branchial vein; G, gill; H,
heart; PA, pericardial appendage; RA, renal appendage; RS, renal sac; VC, vena cava.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
89
Figure 2: The phylogenetic relationships of the spirochete and β−proteobacteria symbionts of
N. macromphalus (Bold face type) inferred from 16S rRNA (1411 sites analysed, Negative
log likelihood= - 11,857). Tree was constructed by the ML method. Numbers at each branch
point are the bootstrap values for percentages of 1,000 replicate trees calculated by MP
(upper) and ML (lower) methods. Only values > 60% are shown. Two Cyanobacteria species
(Trichodesmium thiebautii: AF013027 and Merismopedia glauca: AJ781044) were used as
outgroup. AOB: Ammonia Oxidizing Bacteria in β−proteobacteria.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
90
Figure 3: Schematic diagram (modified from Schipp et al., 1985) and distribution of N.
macromphalus symbionts in a pericardial appendage villus.
A: Schematic diagram of longitudinal section of a villus and general distribution of
symbiontic bacteria (CARD-FISH with universal eubacterial probe EUB388 in green).
Direction of blood flow: secretion (white arrow), filtration (black arrow) and reabsorption
processes (grey arrows). Scale bar= 500 µm.
B, C, D: Multicolor CARDFISH images of Nautilus macromphalus symbionts in transversal
section of a pericardial villus. The spirochete symbionts (NauSpiro255 probe in red) are
deeply associated to the pericardial epithelium in peripheric areas. The β−proteobacteria
symbionts (NauBet66 probe in green) are distributed in peripheric and invaginated areas, less
strictly associated to the epithelium. In blue, Nautilus tissue stained with DAPI.
(B) Scale bar= 500 µm, (C) and (D) Scale bar = 10 µm
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
91
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
92
Figure 4: Transmission electron micrographs of Nautilus macromphalus pericardial
appendages sections with ectosymbiotic bacteria.
A: Transverse section of epithelial invaginations of a pericardial villus. The basal pole of each
epithelial cell (EC) constituting the outer excretory epithelium is in contact with a blood
lacuna which is also in contact with ovoid cells (OC) characterized by numerous spherical
electron dense bodies. The apical pole of such cells presents bacteria which are located in the
pericardial lumen (lu). Inset: see D
B: Higher magnification of the excretory epithelium. Epithelial cells are characterized by
numerous mitochondria (m) and by the presence of basal infoldings (mp) in contact with the
blood lacuna (BL). Bacteria (small arrows) are observed either in contact with the microvilli
(mv) of the apical pole or in the pericardial lumen (lu). HC: haemocyte; N: nucleus;
OC: ovoid cells.
C: Details of active transporters abutting to the blood lacunae. The basal pole of the epithelial
cells possess numerous podocyte-like structure (p) in contact with a strong basal lamina
surrounded by mitochondria (m). Such structure should represent an active ultra-filtration
barrier consuming a large amount of energy provided by the mitochondria. BL: blood lacuna.
D: Distribution of symbiotic bacteria in the pericardial lumen. Two morphotypes of bacteria
can be observed in TEM sections. The first one, represents large bacteria (white straight
arrows) sometimes located between the microvilli differentiated by the epithelial cells (EC),
the second one represents bacteria that could be observed as small transverse sections in the
lumen (black arrows) or as elongated bacteria with a parallel orientation to the microvilli
(curved arrows).
E: Details of the spirochete symbionts. Such bacteria (b) possess the typical double-membrane
of Gram negative bacteria and are located between the microvilli of the epithelial cells (EC).
m: mitochondria.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
93
F: The betaproteobacteria symbionts are attached to the apical part of the brush border. Such
bacteria have parallel orientation to microvilli (mv) of the epithelial cells. They are
characterized by a bipolar appendages (black arrows). The outer membrane of the bacterial
wall of this Gram negative bacteria is indicated by a white arrow. insert: detail of the polar
appendage with a dense central “filament”. This appendage seems to be maintained in contact
to the microvilli by glycocalix fibers.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
94
D
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
95
4.2. Développement d’un modèle cellulaire de l’association N. macromphalus-bactérie
Article: Primary co-culture as a complementary approach to explore the diversity of bacterial
associations in marine invertebrates: the example of Nautilus macromphalus
(Cephalopoda:Nautiloidea)
Pernice, M., Pichon, D., Domart-Coulon, I., Favet, J., Boucher-Rodoni, R.
Article sous presse dans Marine Biology (2006).
L'application récente des outils moléculaires pour caractériser les populations bactériennes
associées aux invertébrés marins a fourni l'accès à une diversité immense de microbes non
identifiés et résistants à la culture (Holmström & Kjelleberg, 1999). Cependant, le rôle de
bactéries dans la physiologie de l’hôte reste souvent, comme nous l’avons vu lors de l’étude
précédente, difficile à élucider en l’absence de conditions adéquates de croissance et de
prolifération. L’isolement et la maintenance des symbiotes bactériens sur milieu artificiel
peuvent permettre une compréhension plus fine de leur physiologie et des processus
complexes qui régissent la reconnaissance hôte/symbiotes (Zengler et al, 2002). Dans ce
contexte, la culture des bactéries symbiotiques en présence du tissu hôte est une solution
envisageable pour maintenir le système symbiotique in vitro. Au cours de cette étude, un
protocole de mise en culture et maintenance des bactéries symbiotiques en présence des
cellules d’appendices péricardiques de N. macromphalus a donc été développé.
Afin de valider cette approche pour l’étude de la symbiose bactérie-N. macromphalus,
l’analyse du gène codant pour l’ARNr 16S a ensuite été réalisée. Nous avons pu alors
comparer la diversité bactérienne associée aux appendices péricardiques de N. macromphalus
à l’aide des trois approches suivantes :
Extraction directe d'ADN à partir des tissus de l’hôte
Isolation des souches bactériennes associées sur un milieu de culture artificiel
(microbiologie classique)
Culture des bactéries en présence des cellules d’appendices péricardiques (co-
culture).
Les résultats ont montré que l'analyse de la diversité bactérienne par extraction
directe d’ADN confirmait la présence spécifique de deux groupes bactériens (beta
protéobactéries et spirochètes), retrouvés chez tous les spécimens de N. macromphalus
étudiés. L’existence d’un troisième groupe bactérien (Pseudoalteromonadales) n’a pas pu être
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
96
vérifié (présence d’une seule séquence d’ARNr 16S chez un individu) et semble lié à une
contamination par l’environnement. L’estimation de la diversité bactérienne associée à N.
macromphalus par l’approche de microbiologie classique a mis en évidence un biais
important avec une isolation sélective de souches appartenant aux gammaproteobactéries qui
ne représentaient pas plus de 0.2% de la population bactérienne totale. Enfin, l’utilisation de
la technique de co-culture a favorisé la détection des deux groupes de bactéries symbiotiques
(beta protéobactéries et spirochètes) jusqu’ici non cultivés.
Ce travail souligne donc le potentiel de la méthode de co-culture comme un nouvel
outil prometteur pour de futures études visant à préciser les mécanismes physiologiques et
moléculaires mis en jeu dans la relation symbiotique chez N. macromphalus.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
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4.3. Activité métabolique des symbiotes bactériens chez N. macromphalus
Les travaux précédents ont permis de confirmer la forte structuration de la population
symbiotique en étroite liaison avec l’organisation fonctionnelle des organes excréteurs de N.
macromphalus, ce qui suggère une implication des bactéries symbiotiques dans la physiologie
de cet organe. Cependant, la phylogénie de ces symbiotes, basée sur l’ARNr 16S comme
simple marqueur moléculaire, ne permet pas d’élucider leurs réelles capacités métaboliques ni
les mécanismes exacts par lesquels ils sont impliqués dans la fonction d’excrétion de N.
macromphalus. À cet égard, les progrès récents de la biologie moléculaire permettent
d'identifier les gènes codant pour les enzymes clés du métabolisme azoté et de les utiliser
comme bio marqueurs pour détecter le potentiel ou la présence de ces processus dans
l'environnement (Lam et al, 2004). Cette approche a donc été utilisée dans un premier temps
afin d’examiner l’hypothèse d’une implication des symbiotes bactériens dans la
transformation des déchets azotés de N. macromphalus.
4.3.1. Recherche et séquençage de gènes fonctionnels codant pour des enzymes
impliquées dans la nitrification et la dénitrification bactérienne
Différents couples d’amorces ont été utilisés (voir Annexe 2) mais seul le couple
d’amorces nirK1F/nirK5R a permis d’amplifier un fragment d’ADN d’une taille équivalente à
celle du gène nirK (470 kDa) (Figure 34).
.
Cependant, après séquençage et analyse comparative sur les banques de données, le
fragment d’ADN amplifié a été identifié comme codant pour une enzyme active dans le
catabolisme des acides aminés (> 93 % de similarité avec la déshydrogénase de
l’oxobutanoate de différentes beta protoéobactéries).
L’absence de résultats positifs concernant les gènes fonctionnels représentatifs des
processus de nitrification et dénitrification ne permet pas de préciser les mécanismes exacts
par lesquels les symbiotes bactériens sont impliqués dans la fonction d’excrétion du Nautile.
De plus, il est possible que les couples d’amorces employées n’aient pas permis d’amplifier
ces gènes spécifiquement. En effet, il est aujourd’hui largement reconnu que la variation
M + - N1 N2
( )
M + - N1 N2
( )470 bp
Figure 34: Gel de migration des produits d’amplification obtenus à l’aide des amorces nirK1F/nirK5R. M : Marqueur de poids moléculaire 1kb ; + : contrôle positif (N. europea); - : contrôle négatif, N1, N2 : amplicons obtenus à partir des extraits individu 1 et 2 de N. macromphalus.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
107
génétique concernant ces gènes est bien supérieure à celle du gène codant pour l’ARNr 16S
(Rotthauwe et al, 1997 ; Kowalchuck & Stephen, 2001). Ce qui permet de spéculer une
distance génétique très importante vis-à-vis de souches référencées laissant envisager des
problèmes de spécificité des amorces employées. Une approche complémentaire utilisant des
traceurs isotopiques a donc été envisagée afin de déterminer les réelles capacités métaboliques
de ces populations bactériennes vis-à-vis des composés azotés.
4.3.2. Implication des symbiotes bactériens dans le métabolisme azoté
La physiologie des appendices péricardiques et des cavités coelomiques dans lesquelles
sont rejetés les déchets azotés, n’étant connue que partiellement (Mangold et al, 1989), l’étude
a donc été élargie à l’assimilation par le complexe symbiotique organe-bactéries de deux
composés azotés (ammonium et nitrate) marqués à l’aide du traceur isotopique 15N. Malgré
une importante variabilité sans doute liée à l’échantillonnage, les résultats ont permis de
suggérer des tendances métaboliques chez les bactéries symbiotiques.
4.3.2.1.Mesure de l’activité métabolique des symbiotes bactériens dans un milieu
enrichi en nitrates (NO3-)
La diminution de la concentration totale en nitrates (NO3-) (mesurée par la méthode de
chemiluminescence, voir Chapitre III.3.6, page 62) dans le milieu d’incubation a permis de
suggérer leur assimilation avec un taux assez élevé et constant (~1 µM/h) (Figure 35 A). De
plus, la comparaison des concentrations en NO3- dans les appendices péricardiques et dans le
contrôle négatif a semblé confirmer que cette assimilation était bien due au complexe
symbiotique vivant (Figures 35 A et B). La diminution similaire des concentrations en nitrites
(NO2-) (mesurée par la méthode de chemiluminescence, voir Chapitre III.3.6, page 62) dans
les appendices péricardiques et dans le contrôle négatif est probablement liée à une erreur de
dilution lors de l’échantillonnage (Figure 35 A et B).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
108
Deux hypothèses peuvent être émises pour justifier une assimilation potentielle des NO3-
(nitrates) par les symbiotes bactériens :
• (1) La réduction catabolique du nitrate en nitrite qui conduit à une accumulation
des NO2- (nitrites) en produit final.
NO3- + 2 e- + 2 H+ NO2
- + H2O
L’analyse de la concentration en NO2- (nitrite) dans les milieux d’incubations (Figure 35
A) n’a pas été congruente avec cette hypothèse puisqu’elle a indiqué non pas une
accumulation mais plutôt une diminution des NO2-(nitrites) dans le temps.
• (2) La dénitrification du NO3- (nitrate) en N2 (diazote gazeux) qui conduit donc à
l’accumulation de ce gaz en produit final
NO3- + 10 e- + 12 H+ N2 + 6 H2O
En accord avec cette hypothèse, l’analyse en spectrométrie de masse a montré une
accumulation de 15N2 (diazote gazeux) (R2= 0,8722, Figure 35 C) dans ces échantillons
confirmant ainsi une transformation du 15NO3 (nitrate) en 15N2 (diazote gazeux). Pourtant, le
faible taux d’accumulation de 15N2 (diazote gazeux) observé (~ 0,0002 µM/h) n’a pas permis
d’expliquer la forte diminution des NO3- (nitrate) (~1 µM/h). Ces résultats suggèrent plutôt
Figure 35 : Concentrations en nitrates (courbe rouge), nitrites (courbe verte), dans les milieux d’incubations des appendices péricardiques (A), du contrôle négatif (B). Analyse en spectrométrie de masse des concentrations en 15N2 dans les milieux d’incubations des appendices péricardiques (courbe rose) et du contrôle négatif (courbe bleue) (C).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
109
l’hypothèse d’une dénitrification lente et/ou incomplète conduisant principalement à
l’accumulation d’un produit intermédiaire dans la chaîne de réactions réductrices.
NO3- NO2
- NO N2O N2
Une telle dénitrification incomplète est connue chez certaines bactéries, avec la réduction
des NO3- (nitrites) en N2O (oxyde nitreux gazeux) (Albrecht & Benckiser, 1997 ; Hunt et al,
2003, Lavick, com. pers.) et pourrait ainsi expliquer ces observations.
4.3.2.2.Mesure de l’activité métabolique des symbiotes bactériens dans un milieu
enrichi en ammonium (NH4+) et en nitrates (NO3
-)
Les analyses des milieux d’incubations ont indiqué une forte accumulation des nitrites
(NO2-) dans un premier temps, avec une augmentation de la concentration jusqu’à 188 µM à
6h (Figure 36 A), puis une stabilisation jusqu’à 14h et enfin une diminution avec un retour à
la concentration initiale en fin d’expérience (129µM à 18h). La concentration en nitrates
(NO3-) est quant à elle apparue constante dans le temps contrairement aux incubations
précédentes en milieux enrichis en nitrates marqués (15NO3-).
Le contrôle négatif a confirmé que ces variations de la concentration en NO2- semblaient
liées aux bactéries symbiotiques vivantes (Figure 36 B).
dénitrification incomplète
Figure 36 : Concentrations en nitrates (courbe rouge), nitrites (courbe verte), dans les milieux d’incubations des appendices péricardiques (A), du contrôle négatif (B). Analyse en spectrométrie de masse des concentrations en 15N2 (diazote gazeux) dans les milieux d’incubations des appendices péricardiques (courbe rose) et du contrôle négatif (courbe bleue) (C).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
110
Cette production suivie d’une assimilation, différentielles dans le temps des NO2- (nitrites)
pourrait suggérer l’hypothèse d’une combinaison des réactions de nitrification et
dénitrification oxydant ainsi l’ammonium (15NH4+) directement en diazote (15N2) avec les
nitrites (NO2-) pour accepteur d’électron.
NH4+ + NO2
- N2 + H2O
Ce processus métabolique appelé anammox a récemment été démontré chez certaines
bactéries vivant en conditions hypoxiques (Strous et al, 1999 ; Tahmdrup & Dalsgaard, 2002 ;
Kuypers et al, 2003 voir Encadré 1, page 19). En accord avec cette hypothèse, l’analyse en
spectrométrie de masse a montré une accumulation de diazote gazeux (15N2) (R2= 0,8841,
Figure 36 C) dans ces échantillons confirmant ainsi une transformation de l’ammonium en
diazote gazeux. Pourtant, comme lors des incubations en milieux enrichis en nitrate (15NO3-),
le faible taux d’accumulation de diazote gazeux (15N2) observé (~ 0,0003 µM/h) ne permet
pas d’expliquer les fortes variations observées dans la concentration en nitrite (accumulation
et diminution avec des taux d’environ 8 µM/h). Là encore, un arrêt intermédiaire dans la
chaîne de réactions de réduction du nitrite (15NO2-) en diazote gazeux (15N2) peut être
envisagé et pourrait conduire à l’accumulation d’un produit intermédiaire tel que l’oxyde
nitreux gazeux (15N2O).
NO2- NO N2O N2
Les expériences d’incubations isotopiques ont donc montré que l’addition de certains
composés azotés semblait induire le déclenchement d’une série de réponses métaboliques
(notamment dans le cas des incubations avec le 15NH4+, avec une différence très nette entre
l’échantillon et le contrôle négatif). Ces réponses métaboliques semblent donc confirmer
l’hypothèse d’un métabolisme azoté des symbiotes bactériens confirmant leur implication
potentielle dans la transformation des déchets azotés de N. macromphalus. L’analyse de la
concentration en oxyde nitreux gazeux (15N2O) dans les différents échantillons, actuellement
en cours à l’institut Max Planck de Bremen, permettra de confirmer ou non les hypothèses
émises concernant les processus métaboliques réellement mis en jeu.
dénitrification incomplète
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
111
4.4. Etude comparative de la diversité bactérienne associée à N. pompilius sur deux
sites de collecte : spécificité de la symbiose et influence des facteurs
biogéographiques
Les travaux précédents ont démontré l’existence d’une double symbiose étroitement liée à
la structure et la physiologie des organes excréteurs de N. macromphalus, espèce endémique
de la Nouvelle-Calédonie. Avant de pouvoir préciser les mécanismes exacts impliqués dans
cette interaction symbiotique, il paraît nécessaire d’examiner s’il s’agit d’une règle générale
au sein du genre Nautilus ou d’un caractère local de N. macromphalus. A cet égard, l’espèce
Nautilus pompilius présente un intérêt particulier puisque sa distribution, la plus large au sein
du genre, couvre la majeure partie de la zone Indo-Pacifique (depuis la mer d’Andaman
jusqu’aux Iles Fidji ; Norman, 2000). Ainsi l’analyse comparative de la diversité bactérienne
associée à N. pompilius dans différentes zones géographiques peut permettre non seulement
de confirmer l’existence d’une relation symbiotique similaire à celle décrite chez N.
macromphalus mais aussi tester l’influence des facteurs environnementaux sur les populations
symbiotiques.
Les objectifs de cette étude concernaient donc l’analyse de la diversité bactérienne
associée aux appendices péricardiques de N. pompilius dans deux sites distants (Figure 37)
afin (1) de savoir s’il s’agissait des mêmes bactéries symbiotiques, et (2) d’examiner
l’hypothèse d’une structuration de la population symbiotique identique à celle observée chez
N. macromphalus.
Les symbiotes ont été caractérisés par le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S et
leur distribution dans les organes de l’hôte a été examinée par hybridation des sondes
spécifiques (CARD-FISH).
Figure 37 : Sites des collectes de N. pompilius (en rouge) réalisées lors de cette étude.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
112
4.4.1. Influence des facteurs biogéographiques sur la caractérisation moléculaire des
symbiotes de N. pompilius
La caractérisation des symbiotes bactériens associés aux organes excréteurs de N.
pompilius a porté sur l’étude de six individus collectés sur deux sites géographiquement
distants de plus de 4000 kms (Figure 37):
Philippines : côte Est de l’île de Cebu (trois spécimens)
Vanuatu : côte Sud de l’île de Santo (trois spécimens)
L’analyse comparative du gène codant pour l’ARNr 16S a montré la présence de trois
phylotypes bactériens dominants: spirochètes, beta protéobactéries et vibrios avec une
variation intra-spécifique faible (entre 0 et 0.3%). (Tableau 3)
Les séquences représentatives des beta protéobactéries et spirochètes ont été retrouvées
dans les spécimens de N. pompilius collectés sur les deux sites et présentent plus de 99.5 %
d’identité avec les symbiotes bactériens présents dans les appendices péricardiques de N.
macromphalus ce qui suggère une double symbiose commune aux deux espèces. Cependant,
l’analyse des trois individus de N. pompilius collectés près de l’île de Cebu (Philippines) a
montré la présence d’un troisième phylotype bactérien qui n’avait jamais été retrouvé en
association avec N. macromphalus ou N. pompilius jusqu’ici et qui semble génétiquement
proche de souches environnementales (97 à 98 % d’identité avec Vibrio pelagius X74722). Ce
Tableau 3: Nombre de séquences partielles (~800 paires de bases) du gène codant pour l’ARNr 16S obtenues après PCR et clonage à partir de l’ADN des appendices péricardiques de six spécimens de N. pompilius collectés sur deux sites (Philippines, Vanuatu).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
113
dernier résultat semble indiquer une influence ponctuelle de l’environnement sur la population
bactérienne associée à N. pompilius, avec une infection environnementale potentielle des
vibrios.
4.4.2. Les symbiotes bactériens présents chez N. pompilius aux Philippines et au
Vanuatu possèdent la même distribution spatiale
L’hybridation de sondes universelles et spécifiques (Eub388, Gam42a, NauSpiro255,
NauBet66) a permis de révéler une structuration de la population bactérienne symbiotique
identique à celle observée chez N. macromphalus avec deux niveaux d’organisations présents
au sein des appendices péricardiques (Figure 38):
Figure 38: Distribution générale des symbiotes bactériens (CARD-FISH avec la sonde généraliste EUB388 en vert) dans les villis péricardiques de N. pompilius (sections longitudinales, A et C). Distribution spécifique des spirochètes (sonde NauSpiro255 en rouge) et des beta protéobactéries symbiotiques (sonde NauBet66 en vert) (sections transversales, B et D). (A), (C) Barre d’échelle = 500 µm. (B), (D) Barre d’échelle = 50 µm.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
114
• Un premier niveau d’organisation générale lié à la structure fonctionnelle de l’organe
et observé en coupe longitudinale à l’aide de la sonde universelle Eub388 (Figures 38
A et C) avec, une concentration des symbiotes dans la région baso-médiane des villis
et leur absence totale de la partie apicale
• Un deuxième niveau d’organisation interspécifique observée en coupe transversale à
l’aide des sondes spécifiques NauSpiro255 et NauBet66 avec une prédominance des
β-proteobactéries dans les cavités profondes des villis et une présence des spirochètes
plus en périphérie (Figure 38 B et D).
Les hybridations de la sonde Gam42a, spécifique du groupe des gamma-proteobactéries et
englobant donc le genre Vibrio, ont été négatives et n’ont pas permis de confirmer la présence
des vibrios en association avec le tissu des individus de N. pompilius collectés dans les
Philippines. Ce dernier résultat remet donc en question le statut symbiotique des vibrios qui
pourraient être simplement présentes dans le fluide coelomique entourant les appendices
péricardiques. Des observations concernant un nombre plus grand d’individus provenant de
cette zone des Philippines sont donc à envisager afin de déterminer si ces souches
bactériennes sont présentes de manière ponctuelle ou permanente au sein des Nautiles de cette
zone géographique.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
115
4.5. Activités antimicrobiennes des souches isolées de N. pompilius (Philippines):rôle
potentiel dans la colonisation et l’écologie microbienne des organes symbiotiques
Article : Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial agents in the excretory
organs of Nautilus pompilius (Cephalopoda, Nautiloidea).
Pernice, M., Destoumieux-Garzón, D., Peduzzi, J., Rebuffat, S., Boucher-Rodoni,R.
Article soumis à Reviews in Fish Biology & Fisheries
Les travaux précédents ont permis d’établir la coexistence d’une double symbiose au sein
des organes excréteurs de N. macromphalus et N. pompilius, impliquant les mêmes groupes
bactériens. L’examen d’individus de N. pompilius collectés aux Philippines a cependant
montré la présence d’un troisième phylotype bactérien dont l’ARNr 16S est proche de
souches environnementales de vibrios, suggérant une infection des organes excréteurs de N.
pompilius par l’environnement. Dans la perspective d’une compétition entre les différentes
souches cohabitant dans ce système complexe, il paraît donc intéressant de déterminer les
facteurs qui ont pu favoriser la sélection de cette souche bactérienne au sein du système
excréteur de N. pompilius. En effet ce type de sélection peut être influencé par la quantité de
nourriture disponible dans l’organe hôte mais aussi par la production de substances bioactives
par les bactéries.
Les objectifs de cette étude étaient donc d’examiner l’activité antimicrobienne des
bactéries isolées des différents individus de N. macromphalus et N. pompilius collectés afin
de pouvoir suggérer l’influence potentielle de cette propriété physiologique sur l’écologie de
la population bactérienne associée. Le potentiel antimicrobien des souches isolées a donc été
évalué à l’aide d’un test issu de la méthode de double couche, modifiée de Schilinger &
Lucke (1989).
Les résultats des tests soulignent une activité antimicrobienne du groupe de bactéries
vibrios isolées de N. pompilius (Philippines), avec des inhibitions de croissance aussi bien
contre les bactéries Gram positive que contre les bactéries Gram négatives. En revanche, les
mêmes tests réalisés à partir de toutes les autres bactéries isolées de N. macromphalus et N.
pompilius n’ont pas permis de détecter une quelconque activité antimicrobienne. La mise en
évidence de ce groupe bactérien uniquement chez les individus de N. pompilius collectés aux
Philippines (Chapitre III. 3.4.1) souligne de plus l’hypothèse d’une transmission/infection
environnementale des vibrios dans cette population de Nautiloides. Le potentiel
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
116
probiotique/virulent de ces souches bactériennes vibrios pourrait alors être à la base de leur
transmission/infection chez N. pompilius aux Philippines. L’ensemble de ces résultats semble
suggérer un statut opportuniste des vibrios. Cependant, ce groupe bactérien n’a apparemment
pas affecté la présence des deux groupes de symbiotes spécifiques (beta protéobactéries et
spirochètes) qui ont été retrouvées chez tous les Nautiloides.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
117
Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial
agents in the excretory organs of Nautilus pompilius
(Cephalopoda, Nautiloidea)
Pernice Mathieu a,*, Destoumieux-Garzón Delphine b, Peduzzi Jean b,
Rebuffat Sylvie b and Boucher-Rodoni Renata a.
Affiliations :
(a) UMR 5178 CNRS-MNHN-UPMC, Biologie des Organismes Marins et Ecosystèmes,
Département Milieux et Peuplements Aquatiques, Muséum National d’Histoire Naturelle, CP
51, 55 rue Buffon, 75005 Paris, France.
(b) Laboratoire de Chimie et Biochimie des Substances naturelles, UMR 5154 CNRS-MNHN,
Département Régulations, Développement et Diversité Moléculaire, Muséum National
d’Histoire Naturelle, CP 54, 57 rue Cuvier, 75005 Paris, France
KEY WORDS: 16S rDNA, bacteria, antimicrobial activity, Cephalopods, Nautilus
* Corresponding author: Mathieu PERNICE
Muséum National d’Histoire Naturelle. Département Peuplements et Milieux Aquatiques,
Biologie des Organismes Marins et Ecosystèmes (UMR 5178 CNRS). 55 rue Buffon, 75005
Paris, France.
Tél. : +33 1 40 79 30 97
FAX : +33 1 40 79 57 34
E-Mail : [email protected]
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
118
ABSTRACT
The aim of the present study was to identify and characterize bacteria producing antimicrobial
compounds in the excretory organs of Nautilus pompilius. Culture-dependent and culture-
independent complementary approaches were used for bacterial identification such as: culture
on selective media, Gram staining, CARD-FISH, direct DNA extraction from host tissue,
PCR amplification and sequencing of the bacterial 16S rRNA gene. Results show presence of
three bacterial groups: γ-Proteobacteria with three clusters (Pseudomonadales, Vibrionales,
Alteromonadales), β-Proteobacteria and spirochetes. In order to screen for active strains,
antimicrobial activity was tested by diffusion agar assay against Micrococcus luteus,
Escherichia coli, Vibrio harveyi and Candida albicans. Nautilus isolates showed
antimicrobial activities against both Gram-positive and Gram-negative reference strains. Most
of the active strains were phylogenetically related to environmental Vibrionaceae. These
strains were always abundant in N. pompilius PA but were absent from Nautilus
macromphalus from other geographical area. Therefore, we suggest that antimicrobial active
Vibrionaceae infect N. pompilius by environmental transmission.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
119
INTRODUCTION
In the marine environment, pathogenic bacterial infections are a significant issue in
aquaculture (Macian et al., 2000; Montes et al., 2006), but they also affect non cultured
organisms (Martin et al., 2002; Farto et al., 2003). Indeed, some bacteria present in the host
can produce protective substances (Ruiz-Ponte et al., 1999) while others can become
pathogenic (Olafsen, 2001). A contribution of microorganisms to the secondary metabolism
of hosts is tempting to speculate, but the actual proof is difficult to acquire (Hentschel et al.,
2001). In order to provide unequivocal evidence, the microorganism has to produce the
compound of interest under laboratory conditions. However, once outside its natural habitat,
bacteria can change their metabolism because of altered growth conditions or modified
selective pressures (Holmström et al., 1999).
Among marine invertebrates, Cephalopods belong to a molluscan group comprising ca. seven
hundred species in which bacterial associations have been known for a long time (Pierantoni,
1917; Bloodgood, 1977) and can include the reproductive organs (accessory nidamental
glands) of myopsids, sepiolids and sepiids (Kaufman et al., 1998; Grigioni et al., 2000;
Pichon et al., 2005) and the light organ of sepiolids (Nishiguchi, 2002; McFall-Ngai and
Ruby, 1991). In nautiloids, a high density of one bacterial morphotype has been observed by
Transmission Electron Microscopy in the brush border of the excretory organs (Pericardial
Appendages:PA) epithelium of Nautilus macromphalus and Nautilus pompilius (Schipp et al.,
1985; Schipp et al., 1990). However, a recent identification using comparison of 16S rRNA
gene sequences has shown an unexpected microbial diversity in N. macromphalus PA
(Pernice et al., 2006).
In the present paper, we focused on bacteria associated with PA of Nautilus pompilius Linné,
1758 (Cephalopoda-Nautiloidae). Nautilus is a scavenger, inhabiting the outer shelf of barrier
reefs in the Indo-Pacific area, generally at a depth of 300 to 500 meters (Boucher-Rodoni and
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
120
Mangold, 1994). In spite of its evolutionary interest (Cambrian origin, last representative of
ectocochleate cephalopods), very few studies focus with bacterial associations in this
ancestral genus.
In this study, we used a multidisciplinary approach to investigate the association of bacteria
with N. pompilius PA. First, we localized the bacteria in the organ by Fluorescent In Situ
Hybridization (FISH) with horseradish peroxidase (HRP)-labelled oligonucleotide probes and
tyramide signal amplification, also known as CARD-FISH (Bobrow et al., 1989;
Pernthaler et al., 2001). This method led to a significant improvement in detection rates
compared to current protocols for FISH with monolabelled probes (Pernthaler et al., 2002).
Subsequently, the identity and phylogenetic relationships of N. pompilius bacteria were
determined for the first time using comparative 16S rRNA gene analysis. Bacterial DNA was
obtained via two complementary approaches: classical culture on artificial media (culture-
dependent approach) and bacterial DNA extraction from Nautilus organ (culture-independent
approach). The environment within Nautilus PA may be suitable for production of
antimicrobials and other defence compounds. Therefore, the isolated strains were screened for
antimicrobial activity in order to investigate the interaction of bacteria against each other and
the eventual protective action against pathogens.
MATERIALS AND METHODS
Nautilus collection
Three N. pompilius specimens were collected on the East coast of Cebu Island
(Philippines) and shipped live to Paris (France). Individuals were kept for 2 days in seawater
tanks where activity and viability could be observed. All specimens were dissected
aseptically, and the four pericardial appendages were processed as follows: two were stored at
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
121
-80°C for DNA extraction by culture independent approach, a third was dilacerated in 1ml
sterile sea-water for bacterial cultivation and the last was fixed in paraformaldehyde (PFA) for
CARD-FISH.
Bacterial cultivation
For the three specimens, 250 mg of PA tissue were ground in 1 ml sterile sea-water,
and serial dilutions (10 and 100) were spread onto marine agar culture media (Difco
laboratories, Detroit, USA). Plates were incubated at 24°C for 48 to 72 h in order to obtain a
collection of cultivable bacteria. Cell titration was estimated by counting colony forming units
(CFUs). Ten colonies were arbitrarily selected for each Nautilus specimen, based on their
morphology on marine agar. Each isolated strain was stained to determine Gram reactivity
and identified by 16S rRNA gene sequencing. All selected strains were cryopreserved at -
80°C in marine agar 2216 medium containing 25% glycerol for further analyses.
Antimicrobial screening
Thirty isolates were tested for their antimicrobial activity against Escherichia coli 363
(laboratory collection), Vibrio harveyi CIP 103192, Candida albicans (laboratory collection)
and Micrococcus luteus CIP 53.45. Antimicrobial activity of Nautilus isolates was assayed by
the double layer method modified from Schilinger and Lucke (1989). The medium used was
modified from Ivanova et al. (1998) and contained 2 g bactopeptone (Difco)/ 2g casamino
acids (Difco) / 2g yeast extract (BD Biosciences)/ 0.2 g KH2PO4/ 1 g glucose/ 17.5g NaCl/ 1.1
g KCl/ 0.9 g MgSO4/ 1.5 g CaCl2/0.1 g KBr pH 7.8 per 1 l of deionized H2O. Briefly, 10 ml
of 0.65% agar (w/v) medium was inoculated with the target strain in exponential-phase of
growth (100 cells/ml final concentration, measured by optical density at 620 nm), and then
poured into plates. A second inoculation of the agar plates was then performed with N.
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
122
pompilius bacterial isolates by perforation with a Pasteur pipette. Plates were incubated
overnight at 25°C and inspected to detect the formation of inhibition zones around the
perforation. Isolates were also assayed for antimicrobial activity against each other.
Experiments were performed in triplicates, and an antibiotic disk (Ceftazidime for Gram-
negative bacteria, Cefsulodin for M. luteus and Primocin for C. albicans) was added onto each
plate as a positive control.
DNA isolation
DNA was extracted either from bacteria isolates (culture-dependent approach) or
directly from Nautilus PA tissue (culture-independent approach).
– Culture-dependent approach
The method used to prepare bacterial DNA for PCR was derived from Sritharan and
Barker (1991). Colonies grown on marine agar were suspended in 100 µl sterile water, boiled
for 5 min, centrifuged (15000 x g, 5 min) and stored in aliquots at -20 °C prior to 16S rRNA
gene PCR amplification, purification and direct sequencing.
– Culture-independent approach
DNA was extracted from one PA of each specimen according to the DNeasy Tissue
Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) protocol and stored in aliquots at -20 °C prior to cloning
and 16S rRNA gene analysis.
16S rRNA gene analysis
– 16S rRNA gene PCR amplification
PCR was performed using the universal bacterial primers: 27F-1385R pair
(respectively Escherichia coli position 9: 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3’ and position
1385: 5’-CGGTGTGTRCAAGGCCC-3’). The reaction mixture contained 0.3 µmol of each
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
123
primer, 25 µmol of each deoxynucleoside triphosphate, 1X SuperTaq buffer and 1.25 U of
SuperTaq polymerase (ATGC Biotechnologie, Marne la Vallée, France). Volume was
adjusted with sterile water to 50 µl. PCR was conducted in a T personal PCR system (Biolabo
Scientific Instruments) with an initial denaturing step (94° C for 5 min) followed by 32 cycles
of 94°C for 30 s, 55°C for 30 s and 72°C for 1 min and final elongation step at 72°C for 7
min. Amplified DNA was checked by 1.5% agarose gel electrophoresis and purified with a
QIAquick PCR purification kit (Qiagen).
– Cloning and sequencing
Purified PCR products from culture-independent approach were cloned by insertion
into plasmid vector PCR 2.1 TOPO TA Cloning (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)
following the manufacturer instructions. Positive clones were grown overnight in 1.5 ml
Luria-Bertani Lennox culture media (DIFCO laboratories, Detroit, USA) and plasmids were
prepared from pelleted cells with a QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen, Courtaboeuf,
France).
Sixty clones (culture-independent approach) and 30 isolates (culture dependent
approach) were partially sequenced (700 bp) by Genome Express (Meylan, France) in a
variable region of the 16S rRNA gene (E. coli positions 9 to 710 bp). Putative chimeric
sequences were checked with Bellerophon (Huber et al., 2004). Sequences without any PCR
artefacts (score <1) were aligned and corrected with BioEdit (Hall, 1997-2001).
– Phylogenetic reconstruction
Sequences were arbitrary clustered into Operational Taxonomic Units (OTUs) with
similarities >97% (percentage of similarities defining a genus; Stackebrandt and Goebel,
1994.). Sequences were then assigned to a set of hierarchical taxa using a naïve Bayesian
rRNA classifier (RDP Release 9.23 classifier) with confidence indices estimated by levels of
bootstrap based on a 1000 resampling data set (Cole et al., 2005) and highly similar sequences
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
124
were included in the phylogenetic analysis. Sequence alignment was performed with
ClustalW software (Thompson et al., 1994) with manual corrections in order to exclude from
the analysis the leading and tailing regions found in some but not all 16S rRNA gene
sequences (Blazejak et al., 2006).
Phylogenetic trees were calculated using Neighbor-joining algorithms with Kimura “2
parameters” model (Kimura, 1980) and the Maximum-likelihood method with a general time
reversing model in Phylip 3.6 package (Felsenstein, 1993). Bootstrap analyses (1000
replicates) were performed for both analyses to test the robustness for each topology.
CARD-FISH
PA were fixed in a 3% PFA solution as described by Grigioni et al. (2000) and
dehydrated in 100% ethanol overnight before embedding in paraffin. Histological sections (7
µm) were collected on gelatine coated slides. Paraffin was removed from the sections with
xylene (three 10 min treatments) before rehydration in decreasing ethanol series. Tissue
sections were then hybridized as described by Pernthaler et al. (2002) with EUB338 (5’-
GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’; Amann et al., 1990) HRP-labelled probe and NONEUB338
(5’-CGACGGAGGGCATCCTCA-3’; Amann et al., 1995) in order to control non specific
binding. The same sections were then stained with 4,6-Diaminido-2-phenylindole (DAPI) in
order to observe the structure of Nautilus tissue. Ten slides were examined for each specimen
under a Leica DMLB epifluorescence microscope (Leica Microsystèmes SAS, France).
RESULTS AND DISCUSSION
In situ application of the HRP labelled EUB338 probe directed against Eubacteria
groups confirms close association of a high bacterial density to the N. pompilius PA
epithelium (Fig 1). Contrary to the previous TEM results (Schipp et al., 1990) observations of
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
125
tissue sections from the three specimens revealed presence of at least three morphotypes
suggesting some diversity in the bacterial association.
The number of CFUs formed after 48 h growth in marine agar indicated that the total
heterotrophic bacterial flora amenable to artificial culture conditions was about 5 x 105 CFUs
per g of fresh tissue. A total of 30 bacterial isolates (ten per individual) were used for Gram
staining and revealed a diverse community of rod-shaped Gram-negative bacteria. No Gram-
positive strains were present among the cultivable heterotrophic flora. 16S rRNA gene
sequencing was performed in order to identify the 30 isolated strains (culture-dependent
approach). Sequence identity analysis clustered sequences within three OTUs (similarity
>97%): Alteromonadales, Pseudomonadales and Vibrionaceae (100% in RDP confidence
level).
Bacterial diversity was also assessed by random sequencing and analysis of 60 clones
obtained by direct DNA extraction from PA tissue (culture independent approach). Analysis
designated 3 OTUs: β-Proteobacteria, spirochetes, and Vibrionaceae at respectively 88%,
90%, and 100% RDP confidence level, and revealed predominance of the same cluster as in
isolates with ca. 45 % of relative abundance in the clone library (Table 1). It is now well
proved that cultivation methods reveal only a small part of the total bacterial diversity
(Amann et al., 1990; Amann et al., 1995). Moreover, discrepancy in bacterial identification
from isolates and from clones was previously reported from other cephalopods (Barbieri et al.,
2001; Pichon et al., 2005).
Representative sequences of each OTU for both approaches were selected for
phylogenetic reconstruction (Neighbor-joining and Maximum Likehood) which identified one
monophyletic group including the γ-Proteobacteria with three clusters (Vibrionales,
Alteromonadales, Pseudomonadales,), the β-Proteobacteria, and another monophyletic group
formed by the spirochetes (Figure 2). The sequences of β-Proteobacteria and spirochetes
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
126
associated to N. pompilius markedly differ from those of known bacteria (<90% in 16S rRNA
gene sequence similarity). Topology of the phylogenetic tree confirms similarity (>99%)
between sequences of Vibrio isolates and clones. Comparison with database sequences
related these OTU to the free-living V. pelagius X74722 (97.2% of similarity).
When compared to the bacterial diversity in pericardial appendages of N.
macromphalus, a species endemic of New-Caledonia (Pernice et al., 2006), the same clusters
were identified for both species, except for the Vibrionaceae which were not detected in N.
macromphalus. However, as Vibrio were consistently found in N. pompilius, it is conceivable
that Vibrio is a common inhabitant of N. pompilius PA. But is this association host specific or
is it due to environmental conditions? The presence of closely related Vibrio species in the
environment of N. pompilius, as well as in farmed shrimps, in the East coast of Cebu (Lavilla-
Pitogo et al., 1992) suggests environmental transmission. Such transmission has already been
demonstrated in sepiolids where Vibrio are acquired after hatching for each generation
(Nyholm and McFall-Ngai, 2003). However, further experiments with N. pompilius
specimens from different geographical origins and using specific 16S rDNA probes are
necessary to prove the specific association with this Vibrio species and its environmental
transmission.
As far as the activity of the bacteria associated to N. pompilius is concerned, the
particular microbial ecology of the PA, with respect to the presence of taxonomically diverse
bacteria, provides an environment which would be conducive for production of antimicrobial
compounds. Thirty bacterial isolates from N. pompilius PA were tested for antimicrobial
activity against four reference strains: Gram-negative Escherichia coli and Vibrio harveyi,
Gram-positive Micrococcus luteus, and the yeast Candida albicans. Thirteen isolates
exhibited a positive response i.e. significant inhibition zone (Table 2), in which 10 belonged
to the Vibrionaceae and 3 to the Alteromonadales clusters. None of the strains was active
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
127
against the eukaryotic C. albicans cells. Since the bacteria were isolated from the same
environmental niche, the hypothesis was tested whether specific interactions may be observed
among the isolates. However, no activity was observed when testing the isolates against each
other, suggesting that the bacterial species isolated from N. pompilius all cohabit in
harmonious fashion. Moreover, none of the strains displayed autoinhibition. Antimicrobials
are thought to confer a selective advantage to the producing strains when in competition with
other bacteria populating the same ecological niche. Other functions of secondary metabolites
include the establishment of symbiotic interactions with invertebrate hosts (Davidson et al.,
2004; Rieder et al., 2005).
In Nautilus PA, production of antimicrobial substances may serve several different
functions. Bacterial antagonism and/or synergism will likely play a role as phylogenetically
diverse microorganisms are present. Compared to results obtained in N. macromphalus, this
study demonstrated a difference in the microbial diversity associated with PA organs with the
predominance of the Vibrio cluster which was absent in N. macromphalus. This bacterial
group occurs widely in aquatic environments and has also been recognized as opportunistic
pathogen in many marine animals (Austin and Austin, 1993) causing high mortality among
economically important species of farmed marine fish and shrimp. However, Vibrio strains
are also used as probiotic bacteria to control pathogens in hatcheries (Gomez-Gil et al., 2000).
Thus, further investigations are needed to determine if the observed association and
development of this strain is due to its potential virulence or probiotic capabilities.
SUMMARY AND CONCLUSION
The results presented here show presence of a diverse community of bacteria in the excretory
organs of Nautilus pompilius, i.e. γ-Proteobacteria (Pseudomonadales, Vibrionales,
Alteromonadales), β-Proteobacteria and spirochetes. Among these associated bacteria,
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
128
Vibrionaceae are the most abundant and show antimicrobial activities against both Gram-
positive and Gram-negative reference strains. Compared to what is known in N.
macromphalus from New-Caledonia (Pernice et al., 2006), the present study shows: (i)
presence of similar β-Proteobacteria and spirochetes strains in both species with no close
environmental relatives (ii) consistent absence of Vibrionaceae in N. macromphalus from
New-Caledonia (iii) constant presence of Vibrionaceae in N. pompilius from Philippines,
closely related to environmental strains. Therefore, we suggest that this antimicrobial active
Vibrio infects N. pompilius from Philippines by environmental transmission.
ACKNOWLEDGEMENTS
We acknowledge Aquascapes Philippines for collecting N. pompilius specimens. We thank G.
Gastine, A. Bianco and A. Beauchet for their technical help and two anonymous referees
who commented on this manuscript. N. Dubilier is gratefully acknowledged for providing
HRP-probes for CARD-FISH. This work was funded by a grant from MNHN BQR. M.
Pernice is recipient of a doctoral grant from the University Pierre and Marie Curie (Paris 6).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
129
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Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
136
Table 1: Number of partial sequences and mean relative abundance obtained from bacterial
cloned PCR products amplified from Pericardial Appendages tissue (culture-independent
approach) for three replicate N. pompilius specimens.
Number of sequences
Nautilus specimen β- Proteobacteria Spirochaeta Vibrionaceae Chimeras
N1 4 6 10 1
N2 5 5 8 2
N3 5 7 8 0
Culture-independant
approach
(n=60) Relative abundance 24.3 ± 3.9% 30.9 ± 3.7% 44.8 ± 5%
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
137
Table 2: Antimicrobial activities against four reference strains
Inhibition zone size (mm)
Nautilus isolates Escherichia coli Vibrio harveyi Micrococcus luteus Candida albicans
Vibrionaceae
NP2
NP3
NP6
NP9
NP10
NP12
NP14
NP15
NP16
NP18
NP21
NP24
NP27
NP28
10
8
8
8
-
-
8
-
10
-
11
11
9
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
6
6
5
5
-
5
6
-
5
-
6
7
X
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Alteromonadales
NP1
NP4
NP8
NP13
NP19
NP20
NP22
NP23
NP26
NP29
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
5
-
X
6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Pseudomonadales
NP5
NP7
NP11
NP17
NP25
NP30
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
138
Antimicrobial activities were measured in triplicate and determined as inhibition zones around
the perforation after overnight growth. One representative strain for each phylogenetic cluster
is highlighted in bold (see Fig. 2).
- = non significant inhibition observed
X = variable activity
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
139
Figure 1:
Fluoresent in situ hybridization image of N. pompilius associated bacteria in PA section. The
bacteria hybridized by EUB338 horseradish peroxidase-labelled probe (green) occupy the
epithelial region of Nautilus PA tissue stained by DAPI (blue).
Figure 2:
Consensus tree obtained after neighbor-joining analysis of 700-bp of 16S rRNA gene
sequences from representative isolated bacteria (*) and bacterial clones (**) of N. pompilius.
The numbers at the nodes indicate the levels of bootstrap support based on a Neighbor-
Joining analysis of 1000 resampled data sets. Only bootstrap values higher than 600 are
indicated. Black stars point out relations supported by Maximum-Likelihood.
Scale bar = 10% estimated base substitutions
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
140
Figure 1
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
141
Figure 2
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
142
4.6. Caractérisation des substances bioactives responsables de l’activité
antimicrobienne des vibrios isolées de N. pompilius
L’étude précédente a démontré le potentiel antimicrobien à spectre large des vibrios
associées à N. pompilius dans les Philippines. La caractérisation des molécules à l’origine de
cette activité antimicrobienne peut permettre non seulement de préciser les mécanismes
impliqués dans la production de ces substances mais aussi de découvrir de nouveaux
composés bioactifs à fort potentiel biotechnologique (Holmström & Kjelleberg, 1999 ;
Longeon et al, 2000 ). En effet, de nombreux antibiotiques n’étant plus, aujourd’hui,
efficaces, une part de la recherche se dirige actuellement vers les bactéries marines qui
représentent une vaste source quasi inexploitée de substances actives pouvant cibler
efficacement les souches résistantes (voir Encadré 5, page 59). Parmi ces substances actives
produites par les bactéries, les plus largement répandues sont des composés de nature
peptidique qui peuvent causer des ruptures dans la paroi cellulaire ou la membrane plasmique
des autres colonisateurs (Barrière et al, 1998 ; Héchard & Sahl, 2002) entraînant ainsi la
libération de leur contenu cellulaire et leur mort (Baquero & Moreno, 1984).
Dans le cas présent, la production de tels peptides antimicrobiens pourrait servir aux
vibrios à des fins « personnelles » en leur permettant de coloniser le système excréteur de N.
pompilius en diminuant la flore bactérienne déjà présente.
Le but de ce travail était donc de purifier et de caractériser les substances actives produites
par cette bactérie afin d’examiner l’hypothèse d’une présence d’un ou plusieurs peptides
antimicrobiens.
4.6.1. Mise en évidence de la présence de plusieurs fractions avec une activité
antimicrobienne par purification sur HPLC
La mesure de l’activité antimicrobienne à partir des extraits de culture bactérienne pure a
permis de confirmer une sécrétion permanente des molécules actives ne nécessitant donc pas
la présence de bactéries compétitrices. La purification des extraits sur HPLC suivi des tests
d’activité antimicrobienne a mis en évidence la présence de plusieurs fractions actives (une
fraction correspondant à un pic détecté sur le chromatogramme) suggérant donc la présence
de plusieurs molécules actives chez cette souche bactérienne (Figure 39).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
143
Il faut cependant tenir compte du fait qu’une molécule présente dans une fraction HPLC
peut également se trouver à l’état de trace dans la fraction HPLC suivante et peut donc être
responsable d’une activité au niveau de deux fractions HPLC.
4.6.2. Les substances bioactives responsables de l’activité antimicrobienne des
vibrios ne sont pas de nature peptidique
Chaque fraction HPLC active a fait l’objet d’une analyse en spectrométrie MS afin de
déterminer le nombre de molécules présentes dans les différentes fractions ainsi que leur
masse. Les spectres de masse obtenus suggèrent la présence de molécules communes au sein
des différentes fractions actives. L’activité antimicrobienne observée pourrait ainsi être due à
l’existence de molécules communes aux différentes fractions actives et correspondant aux
masses suivantes : 135Da (pour les fractions HPLC I.2 et II.1); 186, 203, 434 Da (pour les
fractions HPLC I.3 et II.2); et les molécules de masse 168, 203, 426 et 444 Da (pour les
fractions HPLC I.4, II.3 et II.4) (Figure 40).
De manière inattendue, les masses moléculaires obtenues par analyse en spectrométrie de
masse sont toutes inférieures à 500 Da et excluent donc l’hypothèse d’une nature peptidique
des substances bio actives (la masse minimale d’un peptide étant d’environ 1000 Da). Les
substances antimicrobiennes produites par cette souche bactérienne semblent donc être des
petites molécules dont la nature n’a pas encore été déterminée.
Figure 39 : Chromatogramme HPLC des fractions obtenues à partir du culot de culture bactérienne à 28 (A) et 38 °C (B) de la souche Vibrio isolée de N. pompilius (les fractions actives sont encadrés en rouge, la courbe de détection 227 nm est en rouge et la courbe de détection 280 nm en noir, la droite noire représente le pourcentage d’acétonitrile dans la phase mobile)
I.2 I.3
I4
II.3
II.4
II.2II.1 A B
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
144
De telles molécules sont assez peu recensées dans la littérature et encore moins concernant
le groupe des vibrios au sein duquel les études se portent principalement sur les peptides
antimicrobiens.
L’analyse en spectrométrie MS/MS a confirmé la nature non peptidique des molécules
actives par l’absence de différences de masse correspondant à des ruptures de liaisons
peptidiques. L’étude plus approfondie de certaines molécules communes nous a cependant
Figure 40 : Spectres de masses obtenus après analyse des fractions HPLC actives (A : fraction II.1, B : I.2, C : II.2, D : I.3, E : II.3, F : I.4, G : II.4) (les molécules de masse identiques sont encadrées en bleu). L’ionisation est en mode positif et il n’y a que des espèces portant une charge. Le rapport m/z (en thomson) correspond donc à des espèces protonées [M + H+] on peut donc en déduire la masse des espèces par : M= m/z -1.
I.3
C D
G
II.1 I.2
II.2
II.4
II.3 I.4
A B
E F
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
145
fourni quelques informations supplémentaires concernant leur structure. En effet, l’analyse
des spectres des molécules de 444 et 426 Da suggère qu’il s’agit d’une seule et même
molécule qui aurait été fragmentée au niveau de la source (Figure 41).
De plus, la différence de 18 Da entre ces deux fragments et le suivant (408 Da) correspond
au départ de deux molécules d’H2O et permet donc de supposer la présence de groupements
hydroxyles dans cette molécule. De la même manière, les molécules de 203 Da et 186 Da
semblent être issue de la fragmentation à la source d’une même molécule. En effet, la
différence de masse de 17 Da entre les deux fragments correspond à un groupement NH3 et
suggère la présence d’un groupement NH2 au sein de cette même molécule. La structure
précise de ces molécules de petite taille à potentiel biotechnologique reste inconnue et devra à
l’avenir, bénéficier de techniques d’analyse plus précises telles que la Résonance Magnétique
Nucléaire.
A B
C D
Figure 41 : Spectres MS/MS des molécules communes aux différentes fractions actives (A : molécule de 426 Da ; B : molécule de 444 Da ; C : molécule de 204 Da ; D : molécule de 187 Da).
Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes
146
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
147
Chapitre IV
Discussion générale, conclusions et perspectives
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
148
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
149
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
Les différentes approches utilisées au cours de ce travail ainsi que l’analyse d’échantillons
de provenances géographiques variées ont permis, dans un premier temps, de confirmer
l’existence d’un système symbiotique spécifique dans les organes excréteurs des Nautiloides
du genre Nautilus et de caractériser les partenaires impliqués puis, dans un deuxième temps
d’aborder les aspects évolutifs et physiologiques de cette interaction. L’analyse de la diversité
bactérienne, réalisée au moyen du séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S, a permis de
proposer l’hypothèse nouvelle d’une « double symbiose » impliquant deux groupes bactériens
présents chez tous les spécimens de Nautiloides étudiés. En accord avec la distribution
spatiale des symbiotes, l’examen de leur potentiel métabolique suggère un rôle dans la
fonction d’excrétion de l’hôte. Les résultats exposés lors des différents volets de cette étude
sont donc discutés de manière globale afin de suggérer de nouvelles hypothèses concernant
l’évolution, la transmission et la fonction de cette double symbiose.
1. Diversité bactérienne associée à différentes espèces de Nautiloides
Avant ce travail, les symbiotes bactériens hébergés par les organes excréteurs des
Nautiloides n’avaient jamais été caractérisés en détails à l’aide de diverses approches
moléculaires. Les caractères physiologiques de certaines bactéries cultivées à partir de
fragments d’organes avaient permis à Schipp et al (1990) de suggérer leur appartenance au
groupe des Pseudomonadales. Au cours de cette étude, l’amplification par PCR, puis le
séquençage et l’analyse du gène codant pour l’ARNr 16S, ont permis d’identifier les
populations bactériennes associées à deux espèces de trois provenances géographiques: N.
macromphalus de Nouvelle-Calédonie et N. pompilius des Philippines et du Vanuatu. La
localisation des bactéries détectées par PCR au sein des tissus de Nautile, indépendamment de
toute phase de culture, a été vérifiée par hybridation in situ (CARD-FISH). Cette approche
moléculaire a permis de mettre en évidence le statut symbiotique de deux groupes bactériens
appartenant aux beta protéobactéries et aux spirochètes (Tableau 4). Ces deux phylotypes ont
été détectés de manière persistante par PCR et leur association étroite avec les tissus de l’hôte
a été confirmée par CARD-FISH chez tous les spécimens étudiés.
Deux autres groupes de bactéries ont été détectés ponctuellement par PCR : les
Pseudoalteromonadales chez un individu de N. macromphalus (Nouvelle-Calédonie) et les
Vibrionales chez les trois individus de N. pompilius des Philippines. Cependant une étroite
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
150
association de ces deux groupes bactériens avec le tissu de l’hôte n’a jamais été observée par
la technique d’hybridation in situ (CARD-FISH), ce qui remet en question leur statut
symbiotique.
Betaproteobacteria Spirochaetes Vibrios Pseudoalteromonadales RéférencesPCR 16S rRNA x x - x
CARD-FISH x x - -Symbiotic status X X - ?
PCR 16S rRNA x x x -CARD-FISH x x - -
Symbiotic status X X ? -
PCR 16S rRNA x x - -CARD-FISH x x - -
Symbiotic status X X - -
N. macromphalus (New-Caledonia)
N. pompilius (Philippines)
N. pompilius (Vanuatu)
ChapitreIII, 4.1 & 4.2
ChapitreIII, 4.4 & 4.5
ChapitreIII, 4.4
En effet, les organes excréteurs des Nautiloides étant indirectement reliés au milieu
extérieur par l’intermédiaire de la cavité palléale, ces bactéries pourraient provenir d’une
contamination par l’environnement. Les analyses comparatives des séquences d’ARNr 16S
supportent cette hypothèse puisque, dans les deux cas, elles montrent plus de 97% de
similitude avec des séquences de bactéries présentes dans l’environnement sous forme libre
(Pseudoalteromonas sp. ANG AF022407 et Vibrio pelagius X74722). Toutefois, au vu de la
proportion importante de clones correspondant aux vibrios obtenues chez N. pompilius (26
clones soit environ 44 % de la diversité, voir Chapitre III.4.4.1, page 112), des observations
en hybridations in situ (CARD-FISH) sur un nombre plus grand d’individus provenant des
Philippines doivent être envisagées afin de déterminer précisément le statut de ce groupe
Vibrio. La suite de la discussion se concentrera sur les groupes bactériens dont le statut
symbiotique a été confirmé chez tous les spécimens étudiés c'est-à-dire les beta
protéobactéries et les spirochètes.
2. Evolution des symbioses des Nautiloides
Le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S des symbiotes bactériens fournit de
nouvelles informations qui pourraient permettre de mieux comprendre l’histoire évolutive des
symbioses chez les Nautiloides. A cet égard, l’importante distance génétique des symbiotes
appartenant aux betaproteobacteries et aux spirochètes vis-à-vis des souches référencées dans
Tableau 4 : Les principaux groupes de bactéries détectés dans les organes excréteurs des deux espèces de Nautile à l’aide : -de l’amplification par PCR du gène codant pour l’ARNr 16S -de la technique de CARD-FISH Le statut symbiotique est déduit d’une détection par PCR suivie d’une vérification de la présence des bactéries dans le tissu par CARD-FISH.
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
151
les banques de données témoigne, dans un premier temps, de leur spécificité vis-à-vis des
Nautiloides et semble, dans un deuxième temps, suggérer l’hypothèse d’une co-évolution
hôte-symbiote (voir Chapitre III.4.1, article page 78-79). En effet, la grande distance
génétique (> 10 %) observée par analyse comparative des séquences d’ARNr 16S peut
conduire à spéculer (i) que les derniers ancêtres communs aux symbiotes bactériens des
Nautiloides et aux groupes bactériens référencés les plus proches devraient avoir existé il y a
plus de 500 millions d’années : environ 515 millions d’années pour les spirochètes et 630
millions d’années pour les beta protéobactéries (le taux de substitution communément admis
pour l’ARNr 16S étant d’environ 1 % pour 50 millions d’années, Moran et al, 1993) et (ii)
que la diversification de ces symbiotes pourrait avoir commencé avec leur acquisition par
l’ancêtre commun des Nautiloides dont l’origine remonte au Cambrien (500 à 542 millions
d’années). En congruence avec ces hypothèses, les analyses comparatives préliminaires (sur
près de 950 paires de bases de l’ARNr 16S) montrent que les Nautiloides des trois
provenances géographiques étudiées (N. macromphalus de Nouvelle-Calédonie et N.
pompilius des Philippines et du Vanuatu) hébergent des symbiotes évolutivement très
proches : leurs séquences possèdent plus de 99,5% de similitude entre elles. (Figure 42).
Figure 42 : Arbre phylogénétique présentant les symbiotes bactériens de N. pompilius (Philippines en rouge; Vanuatu en vert) et de N. macromphalus (Nouvelle-Calédonie en bleu). L’arbre est construit à partir de la méthode de maximum de vraisemblance (954 sites analysés). Les valeurs de bootstrap indiquées donnent un pourcentage calculé à partir de 100 réplicats en analyse de maximum de parcimonie (haut) et maximum de vraisemblance (en bas). Seules les valeurs supérieures à 60% sont indiquées.
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
152
Cette forte similitude génétique observée entre les symbiotes bactériens supporte de plus
l’hypothèse proposée par Wray et al (1995) selon laquelle N. macromphalus et N. pompilius
appartiennent en fait à une seule espèce. Toutefois, il est aujourd’hui communément admis
que le gène codant pour l’ARNr 16S ne possède pas une résolution suffisante pour mettre en
évidence des relations phylogénétiques des bactéries au niveau intra spécifique (Kowalchuck
& Stephen, 2001). L’utilisation potentielle des symbiotes bactériens comme marqueur
d’évolution des Nautiloides (co-phylogénie) devra donc passer par l’emploi de marqueurs
moléculaires plus variables tels que certains gènes fonctionnels. A cet égard, le gène codant
pour la déshydrogénase du glycéraldéhyde phosphate (gapA) des bactéries a déjà été utilisé
dans l’association sépiolides-Vibrio pour reconstruire les relations phylogéographiques des
hôtes et des symbiotes (Nishiguchi & Jones, 2006) et pourrait donc permettre une analyse
phylogénétique plus fine.
Afin d’étendre l’existence de la « double symbiose » mise en évidence chez N.
macromphalus et N. pompilius à l’ensemble du genre Nautilus, il semble nécessaire à l’avenir
de confirmer la présence de ces symbiotes bactériens chez les autres espèces du genre
Nautilus: N. belauensis, N. stenomphalus, N. repertus. En outre, la recherche et la
caractérisation de ces symbiotes devra être élargie à la seule espèce du genre Allonautilus, A.
scrobitulatus (Ward & Saunders, 1997 ; Bonnaud et al, 2004), afin de pouvoir étendre cette
hypothèse de double symbiose à toute la sous classe des Nautiloides. Ces espèces n’ont,
jusqu’ici, jamais fait l’objet d’observations concernant des populations symbiotiques
potentielles.
3. Transmission des symbiotes bactériens
La grande similitude génétique observée entre les symbiotes bactériens des différents
Nautiloides étudiés supporte l’hypothèse d’indépendance de cette « double symbiose » vis-à-
vis des facteurs biogéographiques, ce qui peut apporter de nouveaux éléments de discussion
concernant la transmission des symbiotes aux Nautiloides. En effet, la présence de symbiotes
(beta protéobactéries et spirochètes) phylogénétiquement très proches chez tous les individus
de Nautiloides étudiés suggère deux possibilités quant à leur transmission :
• La transmission se fait par l’environnement (transmission horizontale) et nécessite
alors la présence des mêmes symbiotes sous forme libre dans l’environnement et ce,
sur une aire géographique très large (plus de 4000kms)
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
153
• La transmission se fait par héritage parental (transmission verticale), ce qui implique
l’acquisition de ces symbiotes par l’ancêtre commun aux différentes espèces de
Nautiloides.
Des analyses préliminaires réalisées sur un embryon de N. macromphalus (fourni par
l’Aquarium de Nouméa en Septembre 2005) sont en faveur de l’hypothèse d’une transmission
verticale au moins pour l’un des deux groupes de symbiotes. En effet, la présence de bactéries
génétiquement très proches des beta protéobactéries symbiotiques (>99,5% de similitude sur
environ 1000 paires de bases de l’ARNr 16S, illustré par la Figure 43) dans la gaine interne
entourant l’embryon indique l’association de ce groupe de symbiotes dès les stades les plus
précoces du développement de N. macromphalus. De plus, cet embryon provenait d’un œuf
pondu en captivité, en dehors de son environnement naturel, ce qui appuierait l’hypothèse
d’un mode de transmission vertical des beta protéobactéries.
Figure 43 : Arbre phylogénétique regroupant les séquences d’ARNr 16S de bataproteobactéries détectées chez les Nautiloides adultes (N. pompilius des Philippines en rouge; N. pompilius du Vanuatu en vert ; N. macromphalus de Nouvelle-Calédonie en bleu) ainsi que dans un embryon de N. macromphalus en jaune. L’arbre est construit à partir de la méthode de maximum de vraisemblance (1022 sites analysés). Les valeurs de bootstrap indiquées donnent un pourcentage calculé à partir de 100 réplicats en analyse de maximum de parcimonie (haut) et en maximum de vraisemblance (bas). Seules les valeurs supérieures à 60% sont indiquées. Une cyanobactérie : Trichodesmium thiebautii AF013027 a été utilisé pour enraciner l’arbre.
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
154
Concernant le deuxième groupe de symbiotes, aucune séquence proche de celles des
spirochètes n’a pu être mise en évidence lors des analyses réalisées sur l’embryon de N.
macromphalus (sur un total d’environ 35 séquences partielles) ce qui semblerait suggérer une
transmission différente pour les deux groupes de symbiotes :
• Transmission verticale pour les beta protéobactéries
• Transmission horizontale pour les spirochètes.
Pourtant, cette hypothèse de transmission horizontale des spirochètes peut paraître
étonnante, car les symbiotes mis en évidence chez les Nautiloides diffèrent clairement des
souches de spirochètes connues dans l’environnement à deux niveaux. Tout d’abord au niveau
génétique, puisque leur séquence d’ARNr16S semble distante de celle des spirochètes vivant
sous forme libre dans l’environnement (similitude < 90%). De plus, la morphologie de ce
groupe de symbiote observée dans les tissus des
Nautiloides par hybridation in situ et en microscopie
électronique (Figure 44) montre, de manière
inattendue, une forme coccoïde extrêmement rare
chez les spirochètes (Dröge et al, 2006). En effet, les
spirochètes sont généralement caractérisées par leur
forme spiralée et par leurs filaments axiaux qui sont
à l’origine de leur mobilité. Toutefois, l’existence de
formes coccoïdes a récemment été mise en évidence
dans des sédiments fluviaux anoxiques (Ritalahti &
Loffler, 2004) et dans le tube digestif de certaines
espèces de termites (Dröge et al, 2006).
D’autres expériences sont à envisager à l’avenir afin de tester ces hypothèses
concernant une transmission différentielle des deux groupes de symbiotes aux Nautiloides. A
cet égard, il faut souligner la très faible disponibilité de matériel biologique concernant les
juvéniles et les stades de développement précoces chez les Nautiloides. En effet,
l’environnement naturel de leur ponte reste inconnu et les techniques de collecte mises en
œuvre jusqu’ici n’ont permis que de très rares accès à des juvéniles issus du milieu naturel. Le
matériel fourni par les aquariums (souvent en quantité très faible…) peut permettre
d‘examiner les hypothèses concernant la transmission verticale des symbiotes dans le carde de
la reproduction, mais il rend difficile toute investigation concernant les hypothèses de
transmission horizontale. L’analyse des échantillons d’eau prélevés lors d’une collecte en
Nouvelle-Calédonie (site de la passe de Dumbéa, 330 m de profondeur) est en cours et devrait
Figure…: Section d’appendice péricardique de N. macromphalus vue en Microscopie électronique montrant la forme coccoide des spirochetes (white arrows). Scale bar: 1 µm
Figure 44: Section d’appendice péricardique de N. macromphalus vue en microscopie électronique montrant la forme coccoide des spirochètes (flèches blanches). Barre d’échelle: 1 µm
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
155
permettre de vérifier ou non la présence des symbiotes dans l’environnement naturel des
individus adultes de N. macromphalus.
4. Eco-physiologie du système symbiotique
Au cours de ce travail, l’analyse de la répartition spatiale des symbiotes a permis de
révéler la nette structuration de la population bactérienne dans les tissus de l’organe hôte des
Nautiloides (voir Chapitre III.4.1, page 64 et article page 67 ; Chapitre III.4.4.2, page 113). En
effet, chez les deux espèces de Nautiloides étudiées, les symbiotes semblent avant tout
concentrés dans la région baso-médiane des villis péricardiques et paraissent totalement
absents de la partie apicale. De plus, un deuxième niveau d’architecture spatiale, spécifique à
chaque groupe de symbiotes est observable avec une prédominance des beta protéobactéries
dans les cavités profondes des villis et une présence des spirochètes plus en périphérie (voir
Chapitre III.4.1, page 64 et article page 67). En accord avec l’organisation fonctionnelle
révélée par l’ultrastructure des villis péricardiques (Schipp et al, 1985), cette répartition des
populations symbiotiques peut permettre de reconsidérer l’éco-physiologie de ce micro-
écosystème. En effet, la partie symbiotique des villis est principalement active dans
l’ultrafiltration (filtration des molécules sanguines de petite taille) ainsi que dans la
réabsorption (réincorporation active de certains composés présents à l’extérieur de l’organe).
La partie apicale des villis, dépourvue de symbiotes, est, quant à elle, active dans la sécrétion
du fluide excréteur acide et riche en ammonium (Schipp & Martin, 1987).
L’éco-physiologie de ce système symbiotique semble donc régie par plusieurs facteurs
connus (pH et ammonium principalement) mais d’autres facteurs abiotiques pourraient aussi
entrer en jeu dans ce système, notamment les faibles concentrations en oxygène présentes
dans les cavités des villis (Schipp et al, 1990) ainsi que de fortes teneurs en métaux lourds
détectées dans les appendices péricardiques (Bustamante et al, 2000). La répartition précise
des populations symbiotiques, extracellulaires et concentrées dans la région baso-médiane,
pourrait refléter des interactions métaboliques hôte-bactéries basées sur un processus en trois
étapes: (1) sécrétion de composés par l’hôte, (2) assimilation et dégradation de certains de ces
composés par les symbiotes puis (3) ré-assimilation active des produits de dégradation par le
tissu hôte (réabsorption, Figure 45).
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
156
Chez les Nautiloides, la présence de pompes ioniques de taille importante ainsi que le
grand nombre de mitochondries dans la région symbiotique des villis (voir Chapitre III.4.1,
article page 67) suggère une dépense énergétique importante pour assurer le transport de
composés qui seraient ainsi réabsorbés par l’hôte après une première dégradation par les
symbiotes bactériens. Etant donné la forte densité de bactéries que nous avons quantifiée dans
les quatre appendices péricardiques par cytomètrie en flux (~150 x 106 bactéries/g de tissu
frais, voir Chapitre III.4.2, article page 97) leur contribution à la physiologie de l’hôte pourrait
se révéler déterminante. En effet, de telles interactions symbiotiques essentielles sont connues
par exemple dans le tube digestif des ruminants (Stevens & Hume, 1998), des termites (voir
Encadré 2, page 23), ou encore des mollusques bivalves de la famille des terenidés (Distel et
Figure 45: Modèle éco-physiologique d’un villi péricardique de Nautiloide. Les principaux processus métaboliques suggérés sont indiqués par des flèches : Rouge : filtration des molécules circulant dans le sang. JJaauunnee : sécrétion du fluide excréteur par l’hôte. Noire : dégradation métabolique par les symbiotes bactériens. Bleu : réabsorption active par l’hôte.
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
157
al, 2002), où elles permettent l’exploitation de l’énergie stockée dans des composés non-
assimilables par l’hôte (exemple de la cellulose chez les termites) ou la production
symbiotique de molécules indispensables et non synthétisables par l’hôte (vitamines, acides
aminés…). Une analyse plus fine est donc nécessaire, à l’avenir, afin de pouvoir préciser
quels sont les composés engagés dans ces processus métaboliques.
Lors de ce travail, nous nous sommes concentrés sur la physiologie des symbiotes et plus
particulièrement sur leur potentiel de métabolisation des composés azotés car ces composés
sont abondants dans les produits d’excrétion (Martin, 1983 ; Boucher-Rodoni, 1989) et leur
transformation pourrait avoir un rôle important dans la gestion de la flottabilité chez les
Nautiloides (voir Encadré 3, page 32). L’approche moléculaire, basée sur la recherche de
gènes fonctionnels codant pour des enzymes impliquées dans la nitrification et la
dénitrification bactérienne n’a pour l’instant pas permis de préciser le métabolisme azoté des
symbiotes.
Cependant, une approche isotopique, basée sur l’incubation ex-vivo de l’organe, c'est-à-
dire du complexe hôte-bactéries dans un milieu contrôlé, pour suivre dans le temps les
concentrations de nitrates (NO3-) et nitrites (NO2
-) ainsi que la production d’azote gazeux
(N2), a mis en évidence une série de réponses métaboliques des symbiotes dans un milieu
enrichi en ammonium et en nitrate (voir Chapitre II. 4.3.2.2, page 109). Outre la production
d’azote gazeux, ces activités métaboliques pourraient conduire à la production d’un autre
composé gazeux intermédiaire (oxyde nitreux gazeux : N2O) à partir d’ammonium (NH4+).
L’oxyde nitreux, comme l’azote gazeux, pourrait être produit soit directement par une
réaction du type « anammox » réalisée par un des deux groupes de symbiote (voir Encadré 1,
page 19), soit par l’action combinée d’un symbiote nitrifiant et d’un symbiote dénitrifiant.
Cette activité symbiotique pourrait fournir un apport non négligeable en gaz qui, en accord
avec l’hypothèse suggérée par Boucher-Rodoni & Mangold (1994), permettrait aux
Nautiloides de conserver leur flottabilité neutre tout au long de leur vie. Dans l’avenir cette
hypothèse devra donc être approfondie en utilisant l’approche isotopique, en priorité par des
analyses complémentaires en spectrométrie de masse des différents composés, y compris
l’oxyde nitreux gazeux dans le milieu d’incubation des organes et dans l’hémolymphe.
De plus, parallèlement à cette approche originale d’incubation ex-vivo du système
symbiotique que nous avons développée au cours de ce travail, nous pourrions dans le futur
utiliser une sonde d’analyse multi-isotopique par spectromètrie de masse (MIMS pour
multiple-isotope imaging mass spectrometry) afin de mesurer l’assimilation symbiotique de
composés azotés mais aussi carbonés in situ dans le tissu des Nautiloides. Ce type d’approche,
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
158
utilisé très récemment pour démontrer la fixation symbiotique d’azote dans le cadre
d’interactions symbiotiques chez les terenidés (Luyten et al, 2006), semble très prometteur
pour l’étude des échanges métaboliques intervenant à un niveau cellulaire.
Le modèle de co-culture mis au point au cours de ce travail (voir Chapitre II.4.2) est un
outil qui permet d’envisager l’échelle cellulaire des processus physiologiques en maintenant
au moins partiellement l’interaction des symbiotes avec les cellules hôtes et en suivant
l’activité métabolique globale de ce complexe symbiotique à court terme. Cette approche
cellulaire pourrait de plus se révéler particulièrement pertinente pour étudier la nature des
facteurs permettant la reconnaissance des cellules hôtes et des symbiotes. De tels facteurs de
reconnaissance sont déjà connus chez un autre céphalopode dans un contexte évolutif et
physiologique différent, dans la symbiose concernant les glandes lumineuses d’Euprymna
scolopes (Nyholm & McFall-Ngai, 2004).
5. Synthèse
L’ensemble des questions soulevées au cours de cette thèse a fourni les principaux
résultats suivants:
• L’association symbiotique spécifique de deux groupes bactériens (beta protéobactéries
et spirochètes) est clairement établie par analyse moléculaire (séquençage 16S
bactérien, CARD-FISH) dans les appendices péricardiques de deux espèces de
Nautiloides provenant de trois zones géographiques différentes (N. macromphalus de
Nouvelle Calédonie, N. pompilius des Philippines, N. pompilius du Vanuatu).
• Un statut opportuniste est proposé pour un groupe de bactéries Vibrio, présent chez les
individus de N. pompilius des Philippines uniquement et produisant un composé
bioactif de nature non peptidique.
• Les deux symbiotes bactériens (beta protéobactéries et spirochètes) sont présents en
grande densité au sein des appendices péricardiques des Nautiloides (~150 x 106
bactéries/g de tissu frais) et leur répartition paraît liée à la structure fonctionnelle de
ces organes.
• L’ultrastructure tissulaire des appendices péricardiques montre une activité importante
dans la zone de présence des symbiotes qui pourrait être liée aux processus de
réabsorption.
• Le statut symbiotique des beta protéobactéries et des spirochètes est confirmé par leur
survie en co-culture avec les cellules provenant de l’organe hôte.
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
159
• Le rôle individuel de chaque symbiote est difficile à établir, mais le système
symbiotique dans son ensemble pourrait participer au métabolisme azoté des
Nautiloides (production d’azote gazeux à partir d’ammonium en incubation ex vivo de
l’organe hôte et de ses symbiotes bactériens).
Les Nautiloides sont des organismes d’origine Cambrienne et leurs symbiotes sont des
formes très éloignées de leurs proches parents actuels : le rôle de telles associations dans
l’histoire évolutive des deux partenaires est discuté.
Enfin, la caractérisation de ce système symbiotique souligne un peu plus l’intérêt des
céphalopodes comme modèle d’avenir pour l’étude des symbioses bactériennes. Au sein de ce
groupe plusieurs fonctions concernent des systèmes symbiotiques: nutrition et comportement
dans les glandes lumineuses, reproduction dans les glandes nidamentaires accessoires,
excrétion dans les appendices péricardiques. La recherche des molécules impliquées dans les
dialogues hôte-bactéries au sein de ces différents systèmes symbiotiques (glandes lumineuses,
glandes nidamentaires accessoires et appendices péricardiques) pourrait ainsi permettre
d’aborder la question des convergences moléculaires dans les processus de reconnaissance et
d’interaction céphalopodes-bactéries.
Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives
160
Bibliographie
161
Bibliographie
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Diversité bactérienne associée aux organes excréteurs des Nautiloides : caractérisation du système symbiotique, implications évolutives et physiologiques Parmi les nombreux exemples d’association invertébrés marins-bactéries, la symbiose hébergée par les organes excréteurs des Nautiloides s’avère d’un intérêt particulier d’un point de vue évolutif et physiologique. En effet, ce groupe de céphalopodes , dont l’origine remonte au Cambrien (~500 MA) présente un système excréteur hautement spécialisé qui cumule les trois processus liés à la fonction d’excrétion (filtration, réabsorption, secrétion) au sein d’un seul et même organe appelé appendice péricardique. Au cours de cette thèse, les bactéries symbiotiques abritées dans les appendices péricardiques de deux espèces de Nautiloides : Nautilus macromphalus (endémique de Nouvelle-Calédonie) et Nautilus pompilius (distribution indo-pacifique) ont été caractérisées par différentes approches complémentaires. L’analyse de la diversité bactérienne par séquençage de l’ARNr 16S a permis de proposer l’hypothèse nouvelle d’une « double symbiose» spécifique impliquant deux groupes bactériens (beta protéobactéries et spirochètes) présents chez tous les spécimens de Nautiloides dans les trois zones géographiques étudiées (N. macromphalus en Nouvelle-Calédonie, N. pompilius aux Philippines et au Vanuatu). L’importante similitude génétique entre les symbiotes bactériens des différents Nautiloides souligne l’indépendance de cette double symbiose vis-à-vis des facteurs biogéographiques et suggère son extension au genre Nautilus. L’hybridation de sondes spécifiques par CARD-FISH, réalisée parallèlement à l’observation du tissu en microscopie électronique, a confirmé le statut symbiotique de ces deux groupes bactériens et a permis de révéler que leur distribution était en étroite liaison avec l’ultrastructure fonctionnelle de l’organe hôte. Cette répartition précise suggère des échanges essentiels entre l’hôte et les symbiotes. De plus, une approche isotopique, basée sur l’incubation ex-vivo du complexe symbiotique dans un milieu contrôlé, semble indiquer une contribution des symbiotes dans le métabolisme azoté de l’hôte par production d’azote gazeux. L’interaction symbiotique Nautiloides-bactéries permet ainsi d’envisager l’étude de l’influence de la symbiose bactérienne dans la gestion des déchets azotés, une adaptation physiologique majeure au cours de l’évolution des céphalopodes. Mots clés : symbiose, céphalopodes, Nautiloides, Nautilus, excrétion, beta protéobactéries, spirochètes, vibrios, ARNr 16S, CARD-FISH, co-culture, métabolisme azoté, isotopes stables, activité antimicrobienne, Nouvelle-Calédonie, Philippines, Vanuatu. Bacterial symbioses in Nautiloids excretory organs: characterisation of the symbiotic system, evolutionary and physiological aspects Symbiosis is an important driving force of metazoan evolution and the study of symbiotic associations in ancient lineages might provide further insight into the origin of several major physiological adaptations. In this respect, symbiotic associations concerning the excretory organs of the “living fossil” Nautilus (Cambrian origin: ca 500 mya), are of particular interest. Indeed, conversely to what is known in others cephalopods, in Nautilus most of the excretory processes (filtration, reabsorption, secretion) are assumed by the highly specialized pericardial appendages. In this study, we report that nautiluses from various geographical areas (Nautilus macromphalus from New Caledonia, and Nautilus pompilius from Philippines and from Vanuatu) harbour a high density of betaproteobacteria and spirochete phylotypes in their pericardial appendages. They were characterized by using various molecular approaches (16S rRNA phylogeny, CARD-FISH) and electron microscopy (TEM). This dual symbiosis concerns the genus Nautilus as it is not related to geographical origin of the specimens. CARD-FISH analyses relate bacteria distribution to the functional ultrastructure of the host organ, suggesting a symbiotic contribution to the excretory metabolism. Ex-vivo incubation of the symbiotic complex in controlled medium suggests a bacterial implication in nitrogen metabolism of the host (gaseous nitrogen production). Such symbiosis being unknown so far among marine invertebrates, Nautilus bacterial symbiosis provides a unique opportunity to investigate the influence of host-microbes interactions in a major physiological adaptation during the course of marine invertebrates evolution. Key-words: symbiosis, cephalopods, Nautiloids, Nautilus, excretion, betaproteobacteria, spirochetes, vibrios, ARNr 16S, CARD-FISH, co-culture, Nitrogen metabolism, labelled isotopes, antimicrobial activity, New-Caledonia, Philippines, Vanuatu.