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4. Dépôt des échantillons et contrôles : déposer 5µl d’extrait ADN par puits PCR (standards, témoins négatif/positif, échantillons, etc...).
L e g i o n e l l a p n e u m o p h i l a
5. Lancement du run qPCR : placer les tubes, barrettes ou la plaque dans le thermocycler. Sélectionner le thermoprofil pré-enregistré et le plan de plaque.
1. Enregistrement du thermoprofil : à l’aide du logiciel associé au thermocycler, enregistrer le thermoprofil présenté dans le tableau ci-dessus.
2. Préparation du mix : vortexer les solutions avant utilisation (quelques secondes). À l’aide de la table de pipetage, associer la solution de Master Mix avec la solution Prim’n Prob en fonction du nombre de réactions prévues.
3. Répartition du mix : vortexer quelques secondes la solution de mix préparée précédemment puis répartir dans les puits (15µl).
DNA AMPLI-FLASH
6. Analyse des résultats : vérifier l’efficacité PCR (pente de la droite de calibration, a). Le contrôle interne doit être validé pour chaque réaction PCR.
Cible (canal FAM) Contrôle interne (canal HEX)
Pipettes de précision P10, P100 ou P200 et P1000
• Limite de détection (LD) : 5 UG/puits (5μl).
• Limite de quantification (LQ) : 25 UG/puits (5μl).
• Limite haute de quantification (LHQ) : 25 000 UG/puits (5μl).
• Un thermoprofil commun pour les deux cibles : Legionella spp et Legionella pneumophila.
MATERIEL MINIMUM NECESSAIRE(photos non contractuelles)
PERFORMANCES
7. Calcul des résultats avec : UGPCR = Unités Génomes quantifiées dans 5 μl.Z = facteur de concentration du kit d’extraction et purification.V = volume d’échantillon filtré en litre.
Vortex
Microtubes
Plaque, barrettes ou tubes de qPCR
PROTOCOLE
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TABLE DE PIPETAGE
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